JP5897035B2 - 汎用の抗タグキメラ抗原受容体発現ｔ細胞及びがんを治療する方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｔ細胞ベースの抗がん治療薬及び該治療薬をがんの治療に使用する方法に関する。

［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立がん研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１４０９１７−０１及びＲ０１ＨＬ０８８９５４による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。

様々なタイプのがんを認識することが可能なＴ細胞を生成するための汎用であり多用途の系を作製可能であることは、Ｔ細胞ベースの療法の使用にとって重要な臨床的意義を有する。現行の一戦略は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞上に発現させるための遺伝子工学の使用を伴う。典型的なＣＡＲの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体の抗原結合部位に由来するＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメイン（一本鎖可変フラグメント（single-chain fragment variable）（ｓｃＦｖ））からなる。ｓｃＦｖはフレキシブルな膜貫通ドメインに連結し、続いて例えばＣＤ３ζに由来するようなチロシンベースの活性化モチーフに連結する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。いわゆる第二世代及び第三世代のＣＡＲは、Ｔ細胞の生存及び増殖を向上させる働きがある、ＣＤ２８及びＣＤ１３７（４１ＢＢ）等の共刺激分子に由来する付加的な活性化ドメインを含む。ＣＡＲ Ｔ細胞は、がん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識することによってがん細胞を見つけ出し、破壊する機会を提供する（非特許文献１）。そのため、腫瘍細胞の認識はＭＨＣ非依存性機構によって行われる。様々な前臨床試験及び初期臨床試験から、固形腫瘍及び造血器悪性腫瘍を有するがん患者を治療するためのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性が浮かび上がる（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。

ＣＡＲ Ｔ細胞ががん患者の治療において有し得る有望性にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞の一般的臨床応用には幾つかの制限がある。第一に、単一の腫瘍抗原が全てのがんタイプによって普遍的に発現されるわけではないため、ＣＡＲ内のｓｃＦｖは標的とする腫瘍抗原毎に構築する必要がある。第二に、様々な腫瘍抗原に対するｓｃＦｖの同定及び操作に伴う金銭的コスト及び労働集約的作業は大きな課題をもたらす。第三に、ＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原は治療に応じて下方制御又は突然変異し、腫瘍回避（tumor evasion）を引き起こす場合がある。現行のＣＡＲ Ｔ細胞は１つの標的抗原しか認識しないため、腫瘍におけるかかる変化は治療効果を打ち消すこととなる。したがって、多数の腫瘍抗原を認識することが可能なＣＡＲ Ｔ細胞の生成が非常に望ましい。最後に、ＣＡＲ Ｔ細胞は非腫瘍細胞で弱く発現される標的抗原と反応し、重大な有害作用を引き起こす可能性がある（非特許文献６）。かかる「標的に対するが、腫瘍外の（on-target off-tumor）」反応を回避するために、腫瘍抗原に対してより高い特異性を有するｓｃＦｖの使用が必要となる。また、進行中の研究がＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで遮断する方法を創出することに焦点を合わせているが、この系は未だ開発されておらず、付加的な固有の課題をもたらし得る。

Sadelain et al. Curr. Opin. Immunol. 21, 215-223 (2009) Gross et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10024-10028 (1989) Ertl et al. Cancer Res. 71, 3175-3181 (2011) Kershaw et al. Clin. Cancer Res. 12, 6106-6115 (2006) Lamers et al. J. Clin. Oncol. 24, e20-e22 (2006) Morgan et al. Mol. Ther. 18, 843-851 (2010) Pule et al. Nat. Med. 14, 1264-1270 (2008) Till et al. Blood 112, 2261-2271 (2008)

したがって、有効なｉｎ ｖｉｖｏ治療手段への既存のＣＡＲ Ｔ細胞系の発展を妨げている障害に対処し克服する、この系の変更が必要とされている。

本発明は、現行の系の欠陥に完全に対処する、汎用であり適応性のある抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞系を提供する。この系は、様々ながんタイプを認識することが可能であり、Ｔ細胞ベースの療法の使用にとって広範かつ有益な臨床的意義を有する免疫細胞を生成するために遺伝子療法プラットフォームを用いる。本明細書中で開示されるように、抗体等のタグ付きタンパク質を認識し、それと結合する特異性をＴ細胞に与える多用途のＡＴ−ＣＡＲ系を開発した。

例えば、本明細書中に更に記載するように、様々なヒトがん細胞を、これらの細胞にがん反応性ＦＩＴＣ標識抗体が結合している場合に特異的に認識するαＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現ヒトＴ細胞を開発した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化は、効率的な標的溶解、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン／ケモカイン産生をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで誘導することが示されている。ｉｎ ｖｉｖｏでは、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞＋ＦＩＴＣ−セツキシマブ（Ｃｔｘ）は、結腸がん腫瘍の確立を遅らせるが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）陰性がん細胞の選択を引き起こす。一様なＴＡＡ発現を有する膵臓腫瘍モデルを用いて、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が確立された腫瘍を根絶し、腫瘍の成長を抑えることが観察されている。この「汎用の（off-the-shelf）」系は、がん患者の治療において様々なタグ付きタンパク質を標的とするその可能性から既存のＣＡＲ技術を進展させたものである。

或る特定の実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、（ａ）治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合するタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、（ｂ）被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法に関する。

関係する実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、（ａ）治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、（ｂ）被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することと、を含む、方法に関する。

更に関係する実施の形態では、本発明は、被験体内のがんを治療する方法であって、（ａ）治療を必要とする被験体に、被験体内のがん細胞に結合する少なくとも２つのタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、（ｂ）被験体に、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する少なくとも２つの治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を投与し、それにより被験体内のがんを治療することとを含む、方法に関する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のタグ付きタンパク質の配合物のタグは同じであるか又は異なり、タグはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びマルトース結合タンパク質からなる群から選択される。

本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のタグ付きタンパク質の配合物のタンパク質は同じであるか又は異なり、タンパク質は抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、又はそのいずれかの抗原結合フラグメントである。

本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＡＴ−ＣＡＲは同じであるか又は異なり、ＡＴ−ＣＡＲはタグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含む。好ましい態様では、タグ結合ドメインは抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、タグ結合ドメインはＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合する。タグ結合ドメインが抗原結合フラグメントである好ましい態様では、抗原結合フラグメントは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、例えばＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジン又はストレプトアビジンに特異的に結合するｓｃＦｖである。好ましい態様では、膜貫通ドメインはヒトＣＤ８α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域である。好ましい態様では、活性化ドメインはＣＤ２８の細胞質領域、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）の細胞質領域、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ及びＦｃＲεのうち１つ又は複数を含む。

本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＴ細胞は同じであるか又は異なり、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する任意のＨＬＡバックグラウンドのＴ細胞、被験体の腫瘍移植片から単離されたＴ細胞、及び被験体の腫瘍内Ｔ細胞からなる群から選択される。

本発明の実施の形態の特定の態様では、各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる。

本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）を、治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の投与の前に被験体に投与する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）を、治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の投与と同時に被験体に投与する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）を、治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の投与の後に被験体に投与する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）及び治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）を、任意の順序で被験体に投与する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、タグ付きタンパク質に結合するＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞活性化を誘導する。

本発明の実施の形態の特定の態様では、被験体はヒトである。

以下の発明を実施するための形態をよりよく理解することができるように、上記に幾らか広範に本発明の特徴及び技術的利点を概説した。本発明の特許請求の範囲の対象となる本発明の付加的な特徴及び利点を本明細書中で記載する。当業者であれば、本明細書中で開示される任意の概念及び具体的な実施形態を、本発明の同じ目的を遂行するために、他の配合物の変更又は設計の基礎として容易に利用することができることを理解するであろう。かかる均等な配合物が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲を逸脱するものではないことも当業者には認識されるであろう。その構成及び操作方法の両方について本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、更なる目的及び利点とともに、添付の図面と関連して検討することによって以下の記載からよりよく理解される。しかしながら、任意の記載、図面、実施例等は例示及び説明のみを目的として提示され、本発明を限定することを決して意図するものではないことが明白に理解されよう。

抗ＦＩＴＣ−ＣＡＲの発現、特性化及びｉｎ ｖｉｔｒｏ機能性を示す図である。（Ａ）抗ＦＩＴＣ−ＣＡＲ（αＦＩＴＣ−ＣＡＲ）の図。左側の箱図は、αＦＩＴＣ−ＣＡＲを発現するように操作されたポリヌクレオチドに含まれる遺伝要素を示し、５’長末端反復から始まり、抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ゼータ鎖（ζ）のコード領域及び３’長末端反復が続く。右側の図は、Ｔ細胞膜を横断するαＦＩＴＣ−ＣＡＲポリペプチド、及びＦＩＴＣで標識された腫瘍反応性抗体の結合位置を示す。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２^＋ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体を用いてＩＬ−２の存在下で活性化し、続いてαＦＩＴＣ−ＣＡＲレトロウイルスを用いた形質導入を行った。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現を、細胞をＣＤ３及びＦＩＴＣ結合セツキシマブ（ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ）又はＦＩＴＣ結合デキストランビーズ（ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ）で染色することによって決定した。セツキシマブは、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対して結合特異性を有する抗体である。（Ｃ）形質導入Ｔ細胞及び対照Ｔ細胞についてのαＦＩＴＣ−ＣＡＲ機能性を、プレートに結合したＦＩＴＣ−Ｃｔｘ、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ又はＣｔｘを用いる増殖アッセイにおいて検証した。（Ｄ）αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照Ｔ細胞の増殖を、漸増濃度のＦＩＴＣ−Ｃｔｘで染色したＳＷ４８０結腸がん細胞による刺激に応じて測定した。（Ｅ）αＦＩＴＣ−ＣＡＲ及び対照Ｔ細胞によるＴ細胞細胞毒性を、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＦＩＴＣ−マウスＩｇＧで染色したＳＷ４８０結腸がん細胞に対して測定した。（Ｆ）αＦＩＴＣ−ＣＡＲの細胞毒性を、非標識Ｃｔｘ及びＨｅｒ２抗体で染色した、又はＦＩＴＣ−Ｃｔｘ若しくはＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２で染色したＰａｎｃ ６．０３に対して様々なエフェクター対標的比で測定した。代替的に、ＡＵ５６５乳がん細胞をＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２又は非標識Ｈｅｒ２ ｍＡｂで染色した。全てのデータは、各々が同一の傾向を生じる３回以上の独立実験を代表するものである。 αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍の確立を遅らせるが、抗原陰性腫瘍細胞の成長を促進することを示す図である。（Ａ）ＳＷ４８０ヒト結腸がん細胞をＮＳＧマウスに皮下注射し、続いて翌日にＦＩＴＣ−Ｃｔｘを注射（ｉ．ｐ．）した。２４時間後、５×１０^６個のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈に注射した。ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを３週間にわたって毎週注射（ｉ．ｐ．）した。データは２回又は３回の実験を代表するものである（１つの群当たりマウス３匹以上）。＊、Ｐ≦０．０２、ＡＮＯＶＡ；ｎ．ｓ．有意差なし。（Ｂ）ＣＤ３^＋αＦＩＴＣ−ＣＡＲ陽性Ｔ細胞及び陰性Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。注射前又は４匹のマウスの腫瘍移植片に由来するαＦＩＴＣ−ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。（Ｃ）腫瘍移植片を細かく刻み、３７℃で２時間、トリプシン中で培養し、続いて陰性選択キットを用いてＴ細胞濃縮を行った。Ｔ細胞を、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘ（０．５μｇ／１×１０^６細胞）をパルスしたＳＷ４８０結腸がん細胞と共培養した。３日後に、増殖を［^３Ｈ］チミジン取り込み（±ＳＤ）によって決定した。（Ｄ）代替的に、サイトカイン及びケモカインの産生を、刺激の７２時間後にＭｉｌｌｉｐｌｅｘアレイを用いて測定した。（Ｅ）組織培養物から採取したＳＷ４８０腫瘍移植片又はＳＷ４８０細胞でのＥＧＦＲ発現を、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを用いたフローサイトメトリーによって検証した。 αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍の成長を抑え、確立された腫瘍を根絶することを示す図である。（Ａ）ヒト膵臓がん細胞（Ｐａｎｃ ６．０３）でのＥＧＦＲ発現を、細胞をＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又は対照抗体ＦＩＴＣ−ｍＩｇＧで染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）予防的腫瘍モデルでは、Ｐａｎｃ ６．０３細胞をＮＳＧマウス（ｎ＝５）に皮下注射し、続いて翌日にＦＩＴＣ−Ｃｔｘを注射（ｉ．ｐ．）した。２４時間後、５×１０^６個のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈に注射した。２５μｇのＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘを３週間にわたって毎週注射（ｉ．ｐ．）した。腫瘍の成長及びマウスの生存を示す。（Ｃ）治療的モデルでは、Ｐａｎｃ ６．０３腫瘍を３ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２のサイズまで成長させた後、２５μｇのＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘを３週間にわたって毎週注射（ｉ．ｐ．）した。ＦＩＴＣ−Ｃｔｘの最初の注射の翌日に、マウスに５×１０^６個のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射によって投与した。＊、Ｐ≦０．０２、ＡＮＯＶＡ；ｎ．ｓ．有意差なし。

Ｉ．定義
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000（ＩＳＢＮ０１９８７９２７６Ｘ）、Kendrew et al. (編); The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994（ＩＳＢＮ０６３２０２１８２９）、及びRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc. 刊行, 1995（ＩＳＢＮ０４７１１８６３４１）、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。

本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」は１つ又は複数を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」という単語は、「を含む（comprising）」という単語とともに使用される場合に１つ又は２つ以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目又はそれ以上を意味する場合がある。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は複数のものを含み、複数形の用語は単数のものを含む。

本明細書中で使用される場合、「約」は、明示されているか否かを問わず、例えば整数、分数及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は一般に、当業者が列挙した値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考え得る数値の範囲（例えば、列挙した値の±５％〜１０％）を指す。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字まで四捨五入した数値を含み得る。

ＩＩ．本発明
個別のＴ細胞ベースの免疫療法の広範な使用を可能にする、適応性のあるＣＡＲの生成方法を開発した。ヒトＴ細胞を、抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ−ＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ（αＦＩＴＣ−ＣＡＲと称される）を発現するように操作した。このプラットフォームは、抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ（細胞表面上）とＦＩＴＣとの高親和性相互作用、並びにＦＩＴＣ分子（又は他のタグ）を、様々なタイプのがんを有する患者の治療に使用されるセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）及びハーセプチン（抗Ｈｅｒ２）等の任意の抗がん型（anti-cancer-based）モノクローナル抗体に安価かつ容易に結合させる能力を利用するものである。この系は抗原に対する極めて高い特異性を可能にし、「自己抗原」に対する交差反応性なしに、強力なエフェクター機能及び増殖能を伴う。

エフェクター細胞
本発明の方法に使用されるエフェクター細胞は自家、同系又は同種異系であってもよく、その選択は治療対象の疾患及び治療に利用可能な手段によって決まる。本方法に使用することができる好適なエフェクター細胞の集団は、Ｔ細胞等の細胞溶解活性を有する任意の免疫細胞を含む。例示的なＴ細胞の亜集団としては、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ３^＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞を含むＣＤ３^＋を発現するＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるが、Ｔ細胞はＰＢＭＣに由来する任意のＨＬＡバックグラウンドのものであってもよく、自家、同系又は同種異系の系で利用することができる。また、Ｔ細胞は治療を受ける被験体の腫瘍移植片、又は治療を受ける被験体の腫瘍内Ｔ細胞に由来するものを含む任意の供給源から単離することができる。便宜上、エフェクター細胞は本明細書中でＴ細胞と一般に称されるが、任意のＴ細胞への言及は、他に指示のない限り、本明細書中で規定される全てのエフェクター細胞タイプへの言及であることを理解されたい。

抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）
当業者であれば、本発明の方法に使用されるＴ細胞によって発現される抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）が高い柔軟性を可能にすることを理解するであろう。本方法に使用されるＡＴ−ＣＡＲの唯一の要件は、（ｉ）ＡＴ−ＣＡＲが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するタンパク質（抗体等）に結合させることができる特定のタグに対して結合特異性を有すること、及び（ｉｉ）Ｔ細胞をＡＴ−ＣＡＲを発現するように操作することができることである。要求されるわけではないが好ましい付加的な特徴としては、（ｉ）ＡＴ−ＣＡＲが、Ｔ細胞の結合及び活性化の際に効率的な標的溶解を誘導する活性化ドメインを含むこと、並びに（ｉｉ）ＡＴ−ＣＡＲのｓｃＦｖ部分を、ｉｎ ｖｉｖｏで使用される抗体等の標的（すなわち腫瘍）反応性タンパク質に結合させることができる他のタグ、例えばビオチン又はフィコエリトリンに対して特異性を有するものに置き換えることが可能であることが挙げられる。

特定の態様では、ＡＴ−ＣＡＲは３つのドメインを含む。第１のドメインはタグ結合ドメインである。このドメインは通常、ＡＴ−ＣＡＲを含むポリペプチドのアミノ末端に存在する。タグ結合ドメインがアミノ末端に位置することにより、タグ結合ドメインが標的細胞に結合するタグ付きタンパク質に自由にアクセスすることが可能となる。本明細書中で使用される場合、タグ結合ドメインは通常、抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗体又はフラグメントの同一性は、タグ付きタンパク質のタグの同一性によってのみ制限される。例えば、抗体は好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ又はネコ等の哺乳動物から得るのが好ましいが、任意の種の動物から得ることができる。好ましくは、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。使用することができる抗体も特定のクラスに限定されず、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ１抗体、ＩｇＡ２抗体、ＩｇＤ抗体及びＩｇＥ抗体が挙げられる。抗体フラグメントとしては、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが挙げられ、唯一の限定は抗体フラグメントが選択されたタグに結合する能力を保持していることである。

抗体は、例えば非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）２又は超可変領域）を、組換えＤＮＡ法によってヒト抗体のフレームワークに移入して、実質的にヒトの分子が産生される場合のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はキメラ抗体であってもよい。ｓｃＦｖ等の抗原結合フラグメントをそれから調製することができる。

本発明のＡＴ−ＣＡＲの利点の１つは、市販の抗体を用いて産生することができることである。代替的に、選択されたタグに対する抗体を産生することができる。抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含むが、これらに限定されない様々な宿主を特定のタンパク質、又は該タンパク質の免疫特性を保持する任意の部分、フラグメント若しくはオリゴペプチドの注射によって免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫応答を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。かかるアジュバントとしては、大腸菌（E. coli）に由来する解毒易熱性毒素、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のゲル状鉱物（mineral gels）、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン及びジニトロフェノール等の界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）も潜在的に有用なアジュバントである。

抗体及びそのフラグメントは、抗体分子の産生をもたらす任意の技法を用いて、例えばモノクローナル抗体の産生のための培養における連続細胞株によって調製することができる。かかる技法としては、Koehler and Milsteinによって初めて記載されたハイブリドーマ法（Nature 256:495-497 (1975)）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983)、Cote et al., Proc Natl. Acad. Sci 80:2026-2030 (1983)）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96 (1985)）が挙げられるが、これらに限定されない。

「キメラ抗体」の産生のために開発された技法、すなわち適切な抗原特異性及び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングも用いることができる（Morrison et al., Proc Natl. Acad. Sci 81:6851-6855 (1984)、Neuberger et al., Nature 312:604-608(1984)、Takeda et al., Nature 314:452-454(1985)）。代替的に、例えば米国特許第４，９４６，７７８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示される一本鎖抗体の産生について記載される技法を、タグ特異的一本鎖抗体を産生するように適応させて用いることができる。

一態様では、タグ結合ドメインは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、通常１０アミノ酸〜約２５アミノ酸の短ペプチドによって連結した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む。リンカーはＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを接続するか、又はその逆であり得る。

上記で示したように、タグ結合ドメインの結合特異性は、標的細胞に結合するために使用されるタンパク質に結合させるタグの同一性によって決まる。例えば、タグがＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）である場合、タグ結合ドメインは抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖを構成し得る。代替的に、タグがビオチン又はＰＥ（フィコエリトリン）である場合、タグ結合ドメインは抗ビオチンｓｃＦｖ又は抗ＰＥ ｓｃＦｖを構成し得る。

第２のドメインは膜貫通（ＴＭ）ドメインである。ＴＭドメインはＣＡＲをＴ細胞の細胞膜に固定する。例示的なＴＭドメインとしては、ヒトＣＤ８α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域が挙げられるが、これらに限定されない。

第３のドメインは、存在する場合、Ｔ細胞活性化ドメインである。このドメインは、標的細胞に結合するタグ付きタンパク質にＣＡＲが結合する際のＴ細胞活性化を助ける。Ｔ細胞活性化には、サイトカイン及びケモカインの産生の誘導、並びに細胞の細胞溶解活性の活性化が含まれる。例示的なＴ細胞活性化ドメインとしては、Ｔ細胞の生存及び増殖を向上させる働きがあるＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＯＸ４０及びＨＶＥＭの細胞質領域、並びにＴ細胞活性化を誘導するＣＤ３ζ及びＦｃＲεが挙げられるが、これらに限定されない。１つ又は２つ以上のＴ細胞活性化ドメイン、例えば２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＴ細胞活性化ドメインがＣＡＲに含まれ得る。

ＡＴ−ＣＡＲ Ｔ細胞産生
Ｔ細胞は、当業者に容易に知られる手段によってＡＴ−ＣＡＲを発現するように操作することができる。一般に、ＡＴ−ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドベクターを構築し、このベクターをＴ細胞集団にトランスフェクトする。次いで、細胞をＴ細胞によるＡＴ−ＣＡＲの発現を促進する条件下で成長させる。良好なトランスフェクション（すなわちウイルス媒介性の遺伝子組込みを指す形質導入）及びＴ細胞によるＡＴ−ＣＡＲの提示は、従来の手段によって行われ、その幾つかを本明細書の実施例で開示する。

一態様では、Ｔ細胞は、選択されたＡＴ−ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを初めに構築することによってＡＴ−ＣＡＲを産生するように操作することができる。例示的なレトロウイルスベクターとしては、ｐＭＳＧＶ（マウス幹細胞ウイルスベースのｓｐｌｉｃｅ−ｇａｇベクター）に由来するベクター骨格ｐＭＳＧＶ１−ＣＤ８−２８ＢＢＺが挙げられるが、これに限定されない。ＤＮＡシークエンシングを、Ｔ細胞のトランスフェクション前に適当なベクターの構築を確認するために用いることができる。レトロウイルス形質導入は既知の技法、例えばJohnson et al.（Blood 114, 535-546 (2009)）の技法を用いて行うことができる。形質導入したＴ細胞でのＡＴ−ＣＡＲの表面発現は、例えば細胞をタグ結合タンパク質又はタグ結合デキストランビーズで染色した後のフローサイトメトリーによって決定することができる。タンパク質又はビーズのタグ部分には、細胞によって発現されるＣＡＲのタグ結合ドメインが結合する。

ＡＴ−ＣＡＲ Ｔ細胞投与
ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団は、被験体に投与するために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含む配合物には、薬学的に許容される添加剤（単数又は複数）が含まれ得る。配合物に含まれる添加剤は、例えばＡＴ−ＣＡＲを含むタグ結合ドメインの性質、使用されるＴ細胞の亜集団、及び投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される添加剤の例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含む配合物は、通常は動物血清（例えばウシ血清アルブミン）等の任意の非ヒト構成要素の非存在下で調製及び培養される。

配合物は、１つのＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団、又は２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含み得る。種々のＡＴ−ＣＡＲ Ｔ細胞集団はタグ結合ドメインの同一性、活性化ドメインの同一性、Ｔ細胞の亜集団の同一性、又はそれらの組合せに基づいて異なり得る。例えば、配合物は１つ、又は２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の異なるタグ付きタンパク質を認識し、それと結合するＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含み得る。一例として、配合物はＦＩＴＣ、ビオチン及びＰＥを認識し、それと結合するＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含み得る。このため、この例では、配合物はＦＩＴＣ結合抗体、ビオチン結合抗体及びＰＥ結合抗体によってタグ付けられた細胞を認識し、それと結合する３つの異なるＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含む。この配合物は、したがってαＦＩＴＣ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞、αビオチン−ＣＡＲ発現Ｔ細胞及びαＰＥ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。

ＡＴ−ＣＡＲ Ｔ細胞集団（単数又は複数）を含む配合物は、当業者に既知の様式及び技法を用いて被験体に投与することができる。例示的な様式としては、静脈内注射が挙げられるが、これに限定されない。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、ハイポ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液領域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）の様式が挙げられるが、これらに限定されない。配合物の非経口注射又は注入に有用な既知の任意のデバイスを、かかる投与を行うために使用することができる。

被験体に投与されるＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び／又は予防に有効な多数のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。このため、本発明の方法を実施する場合、治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団が被験体に投与される。概して、約１×１０^４個〜約１×１０^１０個のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む配合物を投与する。大抵の場合、配合物は約１×１０^５個〜約１×１０^９個のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０^５個〜約５×１０^８個のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞、又は約１×１０^６個〜約１×１０^７個のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。しかしながら、被験体に投与されるＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の数は、がんの位置、原因、同一性、程度及び重症度、治療を受ける個体の年齢及び状態等に応じて広い範囲で変化する。医師によって使用すべき適切な投与量が最終的に決定される。

タグ付きタンパク質
タグ付きタンパク質は、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の前、又はそれと同時、又はその後に被験体に投与される。タグ付きタンパク質は被験体内の標的細胞に結合する。概して、タグ付きタンパク質の「タンパク質」部分は標的細胞に結合する分子の部分である。例えば、タンパク質は、標的細胞によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に結合する抗体であり得る。しかしながら、「タンパク質」は標的細胞に結合する任意の分子であってもよい。例示的なタンパク質としては、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オマリズマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）及びベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）等の抗がん型のモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

タグ付きタンパク質の「タグ」部分は、ＡＴ−ＣＡＲ、具体的にはＡＴ−ＣＡＲのタグ結合ドメインが認識し、特異的に結合することができる分子であることによってのみ制約される。例示的なタグとしては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ストレプトアビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、及び量子ドットナノ結晶を含む任意のタイプの蛍光物質が挙げられるが、これらに限定されない。

このため、一部の態様では、タグ付きタンパク質はＦＩＴＣ結合抗体、ビオチン結合抗体、ＰＥ結合抗体、ヒスチジン結合抗体及びストレプトアビジン結合抗体を含み、抗体は標的細胞によって発現されるＴＡＡ又はＴＳＡに結合する。例えば、本発明のタグ付きタンパク質としては、ＦＩＴＣ結合セツキシマブ、ＦＩＴＣ結合リツキシマブ、ＦＩＴＣ結合ハーセプチン、ビオチン結合セツキシマブ、ビオチン結合リツキシマブ、ビオチン結合ハーセプチン、ＰＥ結合セツキシマブ、ＰＥ結合リツキシマブ、ＰＥ結合ハーセプチン、ヒスチジン結合セツキシマブ、ヒスチジン結合リツキシマブ、ヒスチジン結合ハーセプチン、ストレプトアビジン結合セツキシマブ、ストレプトアビジン結合リツキシマブ、及びストレプトアビジン結合ハーセプチンが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、ＡＴ−ＣＡＲ細胞を、腫瘍に栄養を与える血管細胞を標的とし、及び／又はそれを破壊するように再指向化することができる。例えば、ＡＴ−ＣＡＲとしてαＦＩＴＣ−ＶＥＧＦを発現するＴ細胞は、ＦＩＴＣタグ付きＶＥＧＦが結合する血管内皮細胞を標的とすることができ、この場合、ＦＩＴＣタグ付きＶＥＧＦにＶＥＧＦ受容体が結合する。

一部の態様では、タグを欠いたタンパク質をタグ付きタンパク質として使用することができる。例えば、標的細胞上のＴＡＡ又はＴＳＡに結合する裸の（タグの付いていない）タンパク質（抗体等）をタグ付きタンパク質として使用することができる。かかる状況下では、ＡＴ−ＣＡＲはタンパク質を認識し、それと特異的に結合する。一例として、タグ結合ドメインは第２の抗体を認識し、それと結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよく、この場合、第２の抗体はタグ付きタンパク質として機能し、第２の抗体はタグを欠いている。

タグは、化学カップリング及び化学架橋剤等の技法を用いてタンパク質に結合させることができる。代替的に、融合タンパク質としてタグ付きタンパク質をコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。次いで、細胞株をタグ付きタンパク質を発現するように操作することができ、タグ付きタンパク質を培養培地から単離し、精製し、本明細書中で開示される方法に使用することができる。

タグ付きタンパク質は、被験体に投与するために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。タグ付きタンパク質の配合物には、薬学的に許容される添加剤（単数又は複数）が含まれ得る。配合物に含まれる添加剤は、例えばタグの性質、タンパク質、及び投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される添加剤の例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。

タグ付きタンパク質の配合物は、１つのタイプのタグ付きタンパク質、又は２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のタイプのタグ付きタンパク質を含み得る。種々のタイプのタグ付きタンパク質はタグの同一性、タンパク質の同一性、又はその両方に基づいて異なり得る。例えば、３つのタイプのタグ付きタンパク質を含む配合物は、ＦＩＴＣ結合セツキシマブ、ＦＩＴＣ結合リツキシマブ及びＦＩＴＣ結合ハーセプチン、又はＦＩＴＣ結合セツキシマブ、ビオチン結合セツキシマブ及びＰＥ結合セツキシマブを含み得る。

タグ付きタンパク質は、当業者に既知の様式及び技法を用いて被験体に投与することができる。例示的な様式としては、静脈内注射、腹腔内注射及び腫瘍内注射が挙げられるが、これらに限定されない。他の様式としては、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、ハイポ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液領域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）の様式が挙げられるが、これらに限定されない。配合物の非経口注射又は注入に有用な既知の任意のデバイスを、かかる投与を行うために使用することができる。

タグ付きタンパク質を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び／又は予防に有効な量で被験体に投与される。概して、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）のタグ付きタンパク質を含む配合物を治療を必要とする被験体に投与する。大抵の場合、投与量は投与経路、症状等を考慮して１日当たりタグ付きタンパク質約１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。一例としては、タグ付きベバシズマブを約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。更なる例としては、タグ付きセツキシマブを約１００ｍｇ／ｍ^２〜約４００ｍｇ／ｍ^２の投与量で投与する。しかしながら、被験体に投与される配合物中のタグ付きタンパク質の量は、がんの位置、原因、同一性、程度及び重症度、治療を受ける個体の年齢及び状態等に応じて広い範囲で変化する。医師によって使用すべき適切な投与量が最終的に決定される。

がん
本発明は、がんを有する被験体を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、がん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を投与することと、タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を投与することと、を含む、方法に関する。「がん」という用語は広範に解釈されることを意図し、異常な細胞成長及び／又は細胞分裂の全ての側面を包含する。例としては、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌を含むが、これらに限定されない癌、及び皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、頸部、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、結腸、小腸、胃、食道、胆嚢のがん；軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫を含むが、これらに限定されない肉腫、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがん；成熟Ｂ細胞新生物、例えば慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ腫及び形質細胞新生物、成熟Ｔ細胞新生物及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、例えばＴ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び免疫不全関連リンパ増殖異常症を含むが、これらに限定されないリンパ腫及び白血病；精巣がん及び卵巣がんを含むが、これらに限定されない胚細胞腫瘍；肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫及び網膜芽腫を含むが、これらに限定されない芽腫が挙げられる。この用語は良性腫瘍も包含する。

本明細書中で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」及び「治療（treatment）」という用語は、それらの通常及び慣例の意味を有し、被験体におけるがんの症状の重症度及び／又は頻度の抑止、改善若しくは軽減、及び／又は被験体におけるがん細胞の成長、分裂、拡散若しくは増殖、若しくはがんの進行（例えば新たな腫瘍の発生）の抑制の１つ又は複数を含む。治療とは、本発明の方法を実施していない被験体に対する約１％〜約１００％の抑止、改善、軽減又は抑制を意味する。好ましくは、抑止、改善、軽減又は抑制は、本発明の方法を実施していない被験体に対する約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は１％の抑止、改善、軽減又は抑制である。

ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を含む配合物及びタグ付きタンパク質の配合物のどちらの投与頻度も、治療対象の疾患、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞及びタグ付きタンパク質を含む要素、並びに投与様式を含む因子によって異なる。各々の配合物を１日４回、３回、２回又は１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回及び月２回独立して投与することができる。

治療期間は治療対象の疾患に基づき、担当医によって最良のものが決定される。しかしながら、治療の継続は数日、数週間又は数ヶ月の間続けられることが企図される。

本発明は治療方法に柔軟性をもたらし、その結果として、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）及びＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）を被験体に任意の順序で投与することができる。このため、タグ付きタンパク質の配合物（単数又は複数）を、ＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の前、後又はそれと同時に被験体に投与することができる。代替的に、２つ以上のタグ付きタンパク質の配合物及び／又は２つ以上のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を被験体に投与する場合、投与を調整することができる。例えば、第１のタグ付きタンパク質の配合物の投与に続いて第１のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を投与することができ、これに続いて第２のタグ付きタンパク質の配合物、次いで第２のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団を投与することができる。

本発明は、被験体へのＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の前にＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団をタグ付きタンパク質でコーティングする方法も含む。

本発明の実施形態の各々において、治療を受ける被験体はヒト又は非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、鳥類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコ若しくは齧歯類等、又は他の哺乳動物である。

本発明は、１つ又は複数のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団及び１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物を充填した１つ又は複数の容器を含むキットも提供する。キットは使用説明書も含み得る。医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって指定される形式の、機関によるヒト投与のための製造、使用又は販売の認可を反映する通知もキットに更に付属し得る。

ＩＶ．実施例
マウス及び細胞株
ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME，USA）から購入し、メリーランド大学ボルチモア校の特定病原体除去動物施設に収容し、養子免疫療法のレシピエントとして使用した。実験はメリーランド大学ボルチモア校の動物管理使用委員会によって審査され、承認された。ヒトＥＧＦＲ＋結腸腺癌細胞株ＳＷ４８０（ATCC，Manassas，VA）は、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA，USA）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）で維持した。ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２＋膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ ６．０３は、Elizabeth Jaffee博士（ジョンズホプキンス大学シドニーキンメルがんセンター）の厚意で提供され、２０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）、１％ピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１００ＩＵ／ｍｌのインスリンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）で培養した。ＨＥＲ−２＋乳腺癌細胞株ＡＵ５６５（ATCC）は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａｍｐｈｏパッケージング細胞株は、Orbigen（San Diego，CA，USA）から購入し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤ１０培地で維持した。ＳＷ４８０細胞株、Ｐａｎｃ ６．０３細胞株及びＡＵ５６５細胞株でのＥＧＦＲ又はＨＥＲ２の表面発現は、ＦＩＴＣ結合セツキシマブ（Ｃｔｘ）又はＦＩＴＣ結合ハーセプチン（Ｈｅｒ２）を用いたフローサイトメトリーによって決定した。

レトロウイルスベクターの構築
レトロウイルスベクター骨格ｐＭＳＧＶ１−ＣＤ８−２８ＢＢＺ（Hughes M.S. et al., Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther 2005 Apr;16(4):457-72）は、Richard Morgan博士（米国国立がん研究所）の厚意で提供され、ｐＭＳＧＶ（マウス幹細胞ウイルスベースのｓｐｌｉｃｅ−ｇａｇベクター）に由来するものである。図１Ａは、ベクター構築物及び５’末端から３’末端へのフレーム単位の構成要素の配置順序の概略図である。ＦＩＴＣに対するマウスｓｃＦｖはαＦＩＴＣ−ＣＡＲと称され、ヒトＣＤ８α鎖（ヌクレオチド配列１２７１〜１５１９、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００１７６８．６）のヒンジ領域及び膜貫通領域、並びにヒトＣＤ２８分子（ヌクレオチド配列７６０〜８８２、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００６１３９．２）、４−１ＢＢ分子（ヌクレオチド配列８８６〜１０２６、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００１５６１．５）及びＣＤ３ζ分子（ヌクレオチド配列２９９〜６３７、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ０００７３４．３）の細胞質領域に連結する。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ配列は、BlueHeron（Bothell，WA）によって合成されている。

この配列はＤＮＡシークエンシングにより確認され、以下の配列を有するものであった：
ａｇｔｔｇｃｃｔｇｔｔａｇｇｔｔｇｔｔｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｔｔｃｔｇｇａｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇｃａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａａａｃｔｃｃａｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｃｔｃｃａｔｃｔｃｔｔｇｃａｇａｔｃｔａｇｔｃａｇａｇｃｃｔｔｇｔａｃａｃａｇｔａａｔｇｇａａａｃａｃｃｔａｔｔｔａｃｇｔｔｇｇｔａｃｃｔｇｃａｇａａｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａａａｇｇｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃａａａｇｔｔｔｃｃａａｃｃｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｇａｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃａｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃａｃｔｃａａｇａｔｃａｇｃａｇａｇｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇａｔｃｔｇｇｇａｇｔｔｔａｔｔｔｃｔｇｃｔｃｔｃａａａｇｔａｃａｃａｔｇｔｔｃｃｇｔｇｇａｃｇｔｔｃｇｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａａａｔｃａａａａｇｔａｇｔｇｃｔｇａｔｇａｔｇｃｔａａｇａａｇｇａｔｇｃｔｇｃｔａａｇａａｇｇａｔｇａｔｇｃｔａａｇａａｇｇａｔｇａｔｇｃｔａａｇａａｇｇａｔｇｇｔｇａｇｇｔｇａａｇｃｔｇｇａｔｇａｇａｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔｇｃａａｃｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｃａｔｇａａａｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇｔｔｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃａｃｔｔｔｔａｇｔｇａｃｔａｃｔｇｇａｔｇａａｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｔｃｔｃｃａｇａｇａａａｇｇａｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔａｇｃａｃａａａｔｔａｇａａａｃａａａｃｃｔｔａｔａａｔｔａｔｇａａａｃａｔａｔｔａｔｔｃａｇａｔｔｃｔｇｔｇａａａｇｇｃａｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃａａｇａｇａｔｇａｔｔｃｃａａａａｇｔａｇｔｇｔｃｔａｃｃｔｇｃａａａｔｇａａｃａａｃｔｔａａｇａｇｔｔｇａａｇａｃａｔｇｇｇｔａｔｃｔａｔｔａｃｔｇｔａｃｇｇｇｔｔｃｔｔａｃｔａｔｇｇｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃ（配列番号１）。この配列をｐＭＳＧＶ１へとライゲートし、αＦＩＴＣ−ＣＡＲレトロウイルスベクターを生成した。

ヒトＴ細胞のレトロウイルス形質導入
健常ドナーに由来するＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Biological Specialty Corp（Colmar，PA，USA）から購入し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）密度勾配遠心分離によって単離した。単離したＰＢＭＣを、２４ウェル組織培養プレートで５％ヒトＡＢ血清（Sigma-Aldrich）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（BioLegend，San Diego，CA，USA）を添加したＡＩＭ Ｖ培地（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）中、３×１０^６個／ウェルで培養し、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（eBioscience，San Diego，CA，USA）で活性化した。２日後、レトロウイルス形質導入のために細胞を回収した。形質導入のために、２４ウェル非組織培養処理プレート（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）に、１０μｇ／ｍｌの組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ；タカラバイオ株式会社、日本、滋賀県大津市）０．５ｍｌ／ウェルを４℃で一晩コーティングした。インキュベーション後、ウェルを２．５％ヒトＡＢ血清を加えた１ｍｌのハンクス液（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）を用いて室温で３０分間ブロッキングし、２．５％Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ＧＩＢＣＯブランド；Invitrogen）を加えたハンクス液で洗浄した。形質導入は以前に記載されているように行った（Johnson et al. Blood 114, 535-546 (2009)）。簡潔に述べると、およそ２．５ｍｌのレトロウイルス上清を各々のコーティングウェルに添加し、続いて３２℃で２時間、２０００ｇで遠心分離した。１．５ｍｌのウイルス上清を取り出し、１×１０^６個（０．５ｍｌ）の活性化ＰＢＭＣを、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で各々のウェルに添加した。プレートを１０００ｇで１０分間遠心分離した後、３７℃で一晩インキュベートした。形質導入後、細胞を洗浄し、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で維持し、形質導入の５日後に実験に使用した。形質導入ヒトＴ細胞でのαＦＩＴＣ−ＣＡＲの表面発現を、細胞をＣＤ３又はＣＤ８及びＦＩＴＣ結合セツキシマブで染色した後にフローサイトメトリーによって決定した。一部の実験では、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＦＩＴＣ結合デキストランビーズで染色した。ＦＩＴＣ結合精製ヒトＩｇＧ（Invitrogen）で染色した細胞をアイソタイプ対照として使用した。

Ｔ細胞増殖アッセイ、サイトカイン産生及びケモカイン産生のアッセイ
形質導入の３日〜５日後に、１×１０^５個のＴ細胞をセツキシマブ、ＦＩＴＣ結合セツキシマブ又はＦＩＴＣ−デキストランでコーティングした９６ウェル丸底プレートで７２時間培養した。腫瘍細胞に対するＴ細胞特異的反応性のために、ＳＷ４８０細胞に指定の濃度の抗体を３７℃で１時間パルスし、３回洗浄した。１×１０^５個のエフェクターＴ細胞及び１×１０^５個の腫瘍細胞を、９６ウェル丸底プレートで７２時間、２００μｌの培養液量で共培養した。採取の１６時間前に、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各々のウェルに添加した後、１４５０ ＬＳＣ＆ルミネッセンスカウンター（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）を用いてチミジン取り込みを測定した。サイトカイン及びケモカインの産生レベルを、刺激の４８時間後に回収した培養上清からサイトカイン／ケモカインキット（Millipore，Billerica，MA，USA）を用いてメーカーの使用説明書に従って測定した。一部の実験では、腫瘍移植片を細かく刻み、３７℃で２時間トリプシン中で培養し、続いて陰性選択キット（Invitrogen/Life Technologies，Grand Island，NY）を用いてＴ細胞濃縮を行った。２０００００個のＴ細胞をＳＷ４８０結腸がん細胞（５００００個）と共培養し、これにＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘ（０．５μｇ／１×１０^６細胞）をパルスした。３日後に［^３Ｈ］チミジン取り込み（±ＳＤ）によって増殖を決定するか、又はＭｉｌｌｉｐｌｅｘアレイを用いてサイトカイン及びケモカインの産生を測定した。

細胞毒性アッセイ
腫瘍標的細胞に対する細胞毒性活性を、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。１×１０^６個の標的細胞を３７℃で２時間、２００μＣｉの^５１Ｃｒで標識し、３回洗浄し、抗ヒト抗体を３７℃で１時間パルスした。次いで、１×１０^４個の標識標的細胞を９６ウェル丸底プレート、２００μｌの培養液量で漸減数のエフェクターＴ細胞と指定のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。培地単独でインキュベートした標的細胞を使用して自然^５１Ｃｒ放出を決定し、標識標的細胞を１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中でインキュベートすることによって最大放出を決定した。３７℃で５時間後、５０μｌの上清を回収し、^５１Ｃｒ放射活性を１４５０ ＬＳＣ＆ルミネッセンスカウンターで測定した。特異的溶解の平均パーセンテージを以下の方程式に従って算出した：特異的溶解％＝（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００。全ての試験を三連ウェルで行った。結果は平均値±ＳＤとして示す。

腫瘍モデル及び養子免疫療法
予防的腫瘍モデルでは、６週齢〜８週齢の雄ＮＳＧマウス（各群についてｎ＝５）の後肢側面に、１〜２×１０^６個のＳＷ４８０腫瘍細胞又はＰａｎｃ ６．０３腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。翌日、マウスにＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘ（２５μｇ／マウス）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。Ｃｔｘ注射の翌日、マウスに５×１０^６個のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ形質導入ヒトＴ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。養子Ｔ細胞移入の後、マウスに抗体（２５μｇ／マウス）を３週間にわたって毎週ｉ．ｐ．注射した。腫瘍部をデジタルキャリパーを用いて盲検下で週２回〜３回測定し、腫瘍サイズ（ｍｍ^２）を縦径による垂直測定によって算出した。腫瘍サイズが２００ｍｍ^２に達した場合、又はマウスが瀕死状態若しくは歩行困難となった場合にマウスを安楽死させた。全ての実験を独立して少なくとも２回行い、同様の結果を得た。生存データを直接ログランク検定で分析した。

実験１
末梢血単核細胞をＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３ ｍＡｂによって活性化し、続いて図１Ａに示され、上に記載したようにα−ＦＩＴＣ−ＣＤ２８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−ＣＡＲベクター（αＦＩＴＣ−ＣＡＲと称される）を形質導入した。Ｔ細胞でのαＦＩＴＣ ｓｃＦｖの発現を、細胞を抗ＣＤ８（又は抗ＣＤ３）及びＦＩＴＣ標識セツキシマブビーズ（ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ）又はＦＩＴＣ標識デキストランビーズ（ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ）で染色することによって分析した。平均すると、全Ｔ細胞の６０％がαＦＩＴＣ−ＣＡＲを発現した（図１Ｂ）。それらの機能性及び特異性を確認するために、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞又は対照（モック形質導入）Ｔ細胞を、漸増濃度のプレート結合ＦＩＴＣ−Ｃｔｘビーズ、非結合セツキシマブビーズ、又はＦＩＴＣ−Ｄｅｘビーズを用いて活性化した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘによる刺激を受けて活発かつ用量依存的に増殖したが、Ｃｔｘ単独による刺激に応じて分裂しなかった（図１Ｃ、左パネル）。対照的に、対照Ｔ細胞はＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＦＩＴＣ−Ｄｅｘに対して増殖しなかった（図１Ｃ、右パネル）。また、Ｔ細胞を漸増濃度のＦＩＴＣ−Ｃｔｘで染色したＥＧＦＲ^＋結腸がん細胞（ＳＷ４８０）と共培養した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞によるＦＩＴＣ反応性が、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ染色がん細胞による活性化を受けて分裂するそれらの能力によって実証された（図１Ｄ）。しかしながら、増殖は最低濃度のＦＩＴＣ−Ｃｔｘでの対照の増殖と同様であった。対照Ｔ細胞は、いずれの濃度のＦＩＴＣ−Ｃｔｘ染色がん細胞によっても増殖性を示さなかった（図１Ｄ）。

それらの細胞溶解能を決定するために、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞をＦＩＴＣ−Ｃｔｘ染色ＳＷ４８０結腸がん細胞とともに様々なエフェクター対標的比で培養した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞対標的細胞が１：２０という低いエフェクター対標的比でＳＷ４８０結腸がん細胞を溶解したが（図１Ｅ、左パネル）、ＦＩＴＣ−マウスＩｇＧで標識したがん細胞を溶解しなかった（図１Ｅ、右パネル）。同様に、対照Ｔ細胞は、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ標識ＳＷ４８０がん細胞又はＦＩＴＣ−ＩｇＧ標識ＳＷ４８０がん細胞に対して感知され得るレベルの細胞溶解活性を示さなかった（図１Ｅ）。種々の抗原を発現する様々な標的細胞を認識するそれらの能力を確認するために、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘで染色した又はＦＩＴＣ−ハーセプチン（抗Ｈｅｒ−２ ｍＡｂ；ＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２）で染色した膵臓がん細胞（Ｐａｎｃ ６．０３）及びＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２で染色した乳がん細胞（ＡＵ５６５）と共培養した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２で染色したがん細胞を効果的かつ特異的に溶解した（図１Ｆ）。ＦＩＴＣ−Ｃｔｘで染色した細胞を上回る、ＦＩＴＣ−Ｈｅｒ２染色膵臓がん細胞に対する細胞溶解活性の増大が、ＥＧＦＲと比較してより高いＨｅｒ−２の発現レベルと関連する可能性があるということは注目に値する（データは示さない）。さらに、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞はＴ細胞の生存、拡大及び走化性に有益である多様なサイトカインを産生した（表１）。ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘで染色したがん細胞を用いて活性化した対照Ｔ細胞によって生じるバックグラウンドサイトカインレベルは、それぞれ同一であった。

まとめると、これらのデータは、１）αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の機能性、２）可溶性ＦＩＴＣではなく、ＦＩＴＣ−Ａｂ染色細胞に対するそれらの特異性、３）多様な腫瘍細胞タイプを溶解するそれらの能力、及び４）様々なＦＩＴＣタグ付き抗体の使用を実証するものである。

実験２
αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を再指向化して、腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏで排除する能力を検証した。マウスにＳＷ８４０結腸がん細胞をｓ．ｃ．注射し、続いてＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘをｉ．ｐ．注射によって投与した。翌日、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈へのｉ．ｖ．注射によって投与した。腫瘍成長動態はαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋Ｃｔｘを与えたマウスと、Ｃｔｘ単独を与えたマウスとで同様であった（図２Ａ、左パネル）。全く対照的に、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを与えたマウスにおいて腫瘍成長は著しく抑制された（図２Ａ、左パネル）。同様に、腫瘍消失率（tumor-free occurrence）（図２Ａ、中央パネル）及び全生存（図２Ａ、右パネル）は、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを与えたマウスにおいて対照群と比較して顕著に改善された。しかしながら、この生存利点にもかかわらず、α−ＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを与えたマウスは、腫瘍生着の５５日以内に腫瘍チャレンジのため死亡した。

長期治療におけるαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の減少に寄与する機構を更に調査した。Ｔ細胞はＣＤ３ ｍＡｂ及びＩＬ−２で活性化されたため、ＣＡＲ Ｔ細胞はＣＤ２８又は４１ＢＢから生存促進性シグナルを受けたにもかかわらず短い寿命を示し得る（非特許文献１、Brentjens et al. Nat. Med. 9, 279-286 (2003)）。脾臓、肝臓、骨髄、循環系を含む様々な組織及び腫瘍移植片におけるαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の存在をアッセイした。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は分析した全ての組織において見られた。腫瘍移植片において検出された全てのヒトＴ細胞のおよそ１０％がαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞であった（図２Ｂ）。同様のパーセンテージが他の組織でも見られた（データは示さない）。しかしながら、臓器摘出時（３８日目〜４５日目）のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の全パーセンテージは、注入時の６０％という開始パーセンテージよりも顕著に低かった。４０％〜５０％という開始パーセンテージと比較して、マウスから回収したＴ細胞の６０％〜９０％がＣＤ８^＋であったことも注目に値する。これらのデータから、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＣＤ８^＋サブセットの潜在的な生存利点が示される。ＣＤ４ Ｔ_Ｒｅｇの頻度又は役割は検証しなかったが、これは依然として更に調査する価値がある実行可能な選択肢である。

代替的に、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、おそらくはアナジー又は他の抑制機構のために抗原（ＦＩＴＣ）によって十分に活性化されなかったと考えられる。全Ｔ細胞を腫瘍移植片から濃縮し、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘ単独で染色した組織培養物に由来するＳＷ４８０細胞を用いて即座に再活性化した。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ染色ＳＷ４８０細胞による刺激後に増殖し（図２Ｃ）、様々なエフェクター分子及びケモカインを産生したが（図２Ｄ）、Ｃｔｘで染色したＳＷ４８０細胞に応答しなかった。残念ながら、腫瘍移植片から単離されたαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の数は、それらの殺傷適性を試験するのに十分ではなかった。しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏで分裂し、エフェクター分子を産生するそれらの能力に基づくと、α−ＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞は明らかにＦＩＴＣ刺激に応答することが可能である。

α−ＦＩＴＣ−ＣＡＲがマウスに存在し、ＦＩＴＣ−ＣＡＲ刺激に応答性であるという観察結果に基づいて、腫瘍移植片でのＥＧＦＲ発現を検証した。フローサイトメトリーによって検証されるように、アイソタイプ対照及び組織培養物から採取したＳＷ４８０細胞と比較して、全ての腫瘍移植片が完全にＥＧＦＲ発現を欠いている（図２Ｅ）。加えて、組織培養物から採取したＳＷ４８０細胞の大半がＥＧＦＲを発現するが、その発現はＥＧＦＲを欠く一部の細胞とは異質であった。

総合すると、これらのデータは、αＦＩＴＣ−ＣＡＲがＥＧＦＲ^＋細胞を死滅させるが、やがてαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の標的ではないＥＧＦＲ⁻細胞の成長を許すという主張を裏付けている。また、ＥＧＦＲ発現の欠如、したがってＦＩＴＣ媒介刺激の欠如が、注射前のαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞のパーセンテージと比較して、後の時点で担腫瘍マウスにおいて観察されたαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度の低下に寄与していたと考えられる。さらに、これらのデータは、ＴＡＡが不均一に発現される患者において腫瘍回避が起こる可能性を浮き彫りにする。これらの研究から、幾つかのＴＡＡに対して特異性を有するＣＡＲ Ｔ細胞を使用することの潜在的必要性も強調される。抗タグＣＡＲ Ｔ細胞の使用の利点の１つは、幾つかのＦＩＴＣ「タグ付き」腫瘍反応性抗体を同時に使用することが可能であることである。また、ビオチンに特異的なｓｃＦｖ又はＰＥ結合抗体を発現するＣＡＲの使用は、抗タグＣＡＲの多様性を増大させ得る。

実験３
ＳＷ４８０がん細胞でのＥＧＦＲ発現の不均一性を考慮して、全ての細胞が抗原を発現するがん細胞集団を破壊するαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を検証した。膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ ６．０３を、ＥＧＦＲを一様に発現する細胞として選択した（図３Ａ）。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を、予防的腫瘍モデルにおいて実験２に記載したものと同じ手順を用いて検証した。腫瘍成長は、αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋ＦＩＴＣ−Ｃｔｘを与えたマウスにおいて明らかに抑制され、α−ＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋Ｃｔｘを与えたマウスは急速な腫瘍成長を示した（図３Ｂ、左パネル）。αＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞＋Ｃｔｘを与えた全てのマウスが、腫瘍生着の３５日以内に腫瘍チャレンジのため死亡した（図３Ｂ、右パネル）。ｉ．ｖ．注射、ｉ．ｐ．注射又は腫瘍内注射によるＦＩＴＣ−Ｃｔｘの投与は、全て腫瘍への抗体局在をもたらした（データは示さない）ことは注目に値する。Ｔ細胞を腫瘍に再指向化することの代替的方法は、養子移入前にαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞をＦＩＴＣ−Ｃｔｘでコーティングすることである。

実験４
確立された膵臓腫瘍を破壊するαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を検証した。膵臓腫瘍を腫瘍が十分に血管新生される３ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２のサイズまで成長させた後、ＦＩＴＣ−Ｃｔｘ又はＣｔｘを注射（ｉ．ｐ．）した。翌日、マウスにαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射によって投与した。ＥＧＦＲに対して再指向化された特異性を有するＴ細胞は、全てのマウスにおいて確立された膵臓腫瘍を根絶し（図３Ｃ、左パネル）、Ｃｔｘ及びαＦＩＴＣ−ＣＡＲ Ｔ細胞で処理したマウスと比較して生存を改善した（図３Ｃ、右パネル）。観察期間中に腫瘍の再発は起こらなかった。

要約すると、これらの研究は、Ｔ細胞特異性を、様々ながんタイプに結合して腫瘍破壊を媒介するＦＩＴＣタグ付き抗体に与える汎用であり適応性のあるＣＡＲ系の生成を初めて説明するものである。この報告は、ＴＡＡ陰性腫瘍変異株が生じ、最終的に宿主を死に至らせる可能性があるために、２つ以上のＴＡＡを標的とするためにＣＡＲ Ｔ細胞を使用することの重要性を初めて強調するものでもある。このプラットフォームは、様々ながんタイプを標的とするために、様々なタグ付きタンパク質（すなわち抗体）を標的とするその可能性から既存のＣＡＲ技術を大幅に進展させる「汎用の」系とみなされる。

本発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく、本発明において様々な変更形態及び変形形態を行うことができることが当業者には明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書を検討し、本明細書に開示される本発明を実施することによって当業者に明らかである。本明細書及び実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。

本願全体を通して、様々な刊行物、特許及び／又は特許出願は、本発明が関連する現行の技術水準をより完全に説明するために参照される。これらの刊行物、特許及び／又は特許出願の開示は、各々独立した刊行物、特許及び／又は特許出願が具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすかのように、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

配列番号１：化学的に合成された抗ＦＩＴＣ−ＣＡＲ配列

Claims (18)

1. がん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付き抗体の配合物と同時に又は別々に被験体に投与される、
   前記タグ付き抗体に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞集団
   を含む、抗がん剤であって、
   前記ＡＴ−ＣＡＲが、タグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含み、
   前記タグ結合ドメインが抗体又はその抗原結合フラグメントである、
   抗がん剤。
2. がん細胞に結合する少なくとも２つのタグ付き抗体の配合物と同時に又は別々に被験体に投与される、
   前記タグ付き抗体に結合し、がん細胞死を誘導する少なくとも２つの治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団
   を含む、抗がん剤であって、
   前記ＡＴ−ＣＡＲが、タグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含み、
   前記タグ結合ドメインが抗体又はその抗原結合フラグメントである、
   抗がん剤。
3. 各々のタグ付き抗体の配合物のタグが同じであるか又は異なり、該タグがフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びマルトース結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
4. 各々のタグ付き抗体の配合物の抗体が同じであるか又は異なり、該抗体が全長抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗がん剤。
5. 前記全長抗体又はその抗原結合フラグメントが、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、又はそのいずれかの抗原結合フラグメントである、請求項４に記載の抗がん剤。
6. 各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＡＴ−ＣＡＲが同じであるか又は異なる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗がん剤。
7. 前記タグ結合ドメインがＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、又はストレプトアビジンに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
8. 前記抗原結合フラグメントが一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
9. 前記抗原結合フラグメントが、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、又はストレプトアビジンに特異的に結合する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
10. 前記膜貫通ドメインがヒトＣＤ８α鎖のヒンジ領域及び膜貫通領域である、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
11. 前記活性化ドメインがＣＤ２８の細胞質領域、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）の細胞質領域、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ及びＦｃＲεのうち１つ又は複数を含む、請求項１又は２に記載の抗がん剤。
12. 各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＴ細胞が同じであるか又は異なり、該Ｔ細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する任意のＨＬＡバックグラウンドのＴ細胞、前記被験体の腫瘍移植片から単離されたＴ細胞、及び前記被験体の腫瘍内Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗がん剤。
13. 各々のＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団のＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗がん剤。
14. 前記タグ付き抗体の配合物（単数又は複数）が、前記治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の投与の前に前記被験体に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗がん剤。
15. 前記タグ付き抗体の配合物（単数又は複数）が、前記治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）の投与の後に前記被験体に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗がん剤。
16. 前記タグ付き抗体の配合物（単数又は複数）及び前記治療的に有効なＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団（単数又は複数）が、任意の順序で前記被験体に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗がん剤。
17. 前記タグ付き抗体に結合するＡＴ−ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞活性化を誘導する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗がん剤。
18. 前記被験体がヒトである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗がん剤。

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