JP2022538974A

JP2022538974A - 免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体およびその方法

Info

Publication number: JP2022538974A
Application number: JP2021573179A
Authority: JP
Inventors: アーバイン，ダレル，ジェー．; ウィットラップ，カール，デイン; モイヤー，タイソン; アガーワル，ヤシュ
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2022-09-07
Also published as: US20230302128A1; EP3990491A1; WO2020263399A1; US11642409B2; US20200405850A1

Abstract

本開示は、配位子交換により金属水酸化物に吸着された免疫調節ドメインを含む免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。本開示はまた、例えば、がんを治療するために免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を使用する組成物および方法を特徴とする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年６月２６日に出願された米国仮出願第６２／８６７，１６２号の利益を主張する。上記仮特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

政府の資金提供
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１７４７９５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

免疫チェックポイント遮断療法は、非小細胞肺癌、転移性黒色腫などに罹患した患者の無増悪生存期間を大幅に延長することができる（Ｈｏｄｉｅｔａｌ（２０１０）３６３：７１１－７２３；Ｒｉｂａｓｅｔａｌ（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３５９：１３５０－１３５５）。しかしながら、これらの治療計画は通常、一部の患者でしか改善を示さない。これらの療法とＩＬ－２のような免疫調節サイトカインとの組み合わせはマウスで有望であることが示されているが（Ｍｏｙｎｉｈａｎ，ＫｅｌｌｙＤ．，ｅｔａｌＮａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２２：１４０２（２０１６））、強力なサイトカインの用量制限毒性のため、これらを前臨床モデルから臨床研究に変換することは困難であった（Ｍｉｌｌｉｎｇ，ｅｔａｌＡｄｖａｎｃｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｒｅｖｉｅｗｓ１１４：７９－１０１（２０１７））。したがって、有効性を維持しながら毒性を制限することに大きな関心が寄せられている。インビボ保持の新規メカニズムとともに代替の投与経路は、毒性の副作用を防ぎながら、すべての治療された個人の抗腫瘍免疫応答を高めるための鍵となる可能性がある（Ａｚｎａｒｅｔａｌ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９８：３１－３９（２０１７））。提案されているいくつかのインビボ保持戦略には、ペイロードを他の高半減期タンパク質に融合させ、タンパク質をヒドロゲルのような分解性生体材料に結合させることが含まれる（Ｚｈｕ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ２７：４８９－５０１（２０１５）；Ｃｈａｏ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２：６１１（２０１８））。しかしながら、これらでさえ、タンパク質の持続性を短期間しか延長することができず、有効性のためには複数回の療法に頼る可能性がある。

したがって、新規の免疫療法アプローチに対する必要性が依然として存在する。

本開示は、少なくとも部分的に、水酸化アルミニウム（ミョウバン）と結合するように設計された免疫調節ドメイン（例えば、サイトカイン、抗免疫受容体抗体、抗腫瘍関連抗原抗体など）が、腫瘍内注射によって送達された場合、コンジュゲートしていない免疫調節ドメインと比較して増加した抗腫瘍効果を有するという驚くべき発見に基づいている。ミョウバンは、前臨床モデルの注射部位で何週間も持続することが知られている粒子状足場を提供する。理論に拘束されることなく、ミョウバンは腫瘍内注射の部位に免疫調節ドメインを保持し、それにより、免疫療法の全身曝露を望ましくない毒性をもたらすレベル未満に制限しつつ、腫瘍微小環境内の免疫療法の持続性を高める粒子状足場を提供する。リン酸化タンパク質抗原は、配位子交換によりミョウバンへのより強い吸着を示すことがよく理解されている。この発見は、ミョウバンへの吸着によってワクチン接種部位に局在することができるホスホン酸化ＴＬＲアゴニストなどのホスホン酸化小分子アジュバントの開発につながっている。しかしながら、がんの治療のための免疫調節ポリペプチドを局在させるためのミョウバンへの吸着の使用は実証されていない。したがって、本明細書で提供されるのは、がん免疫療法での使用のための免疫調節ドメインの腫瘍保持および抗腫瘍効力を改善する目的で、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）との配位子交換による吸着のためのヒドロキシル置換基（例えば、ホスフェート基）を含む免疫調節融合タンパク質である。

いくつかの態様において、本開示は、免疫調節ドメインの効力を改善するための方法を提供し、免疫調節ドメインは、１つ以上のホスホセリン残基を介して金属水酸化物（例えば、ミョウバン）への緊密な結合を提供するように修飾される。いくつかの態様において、本開示は、リン酸化残基を含むペプチドで修飾された免疫調節ドメインを含む方法および組成物を提供し、リン酸化ペプチドは、ミョウバンの表面との配位子交換反応を受けて、免疫調節ドメインを金属水酸化物（例えば、ミョウバン）に固定する。そのような連結の結果として、修飾された免疫調節ドメインは、ミョウバンに非特異的に吸着する修飾されていない免疫調節ドメインと比較して、インビトロでミョウバンへの結合を増加させることが発見された。さらに、配位子交換によってミョウバンに吸着されたときの修飾免疫調節ドメインは、腫瘍において２９日以上持続するが、ミョウバンがない場合、免疫調節ドメインは３日以内に腫瘍から除去されることが発見された。追加的に、保持の改善は抗腫瘍効力の改善に対応し、配位子交換によってミョウバンに吸着された修飾免疫調節ドメインは、修飾されていない免疫調節ドメインまたは非特異的相互作用によりミョウバンに吸着された免疫調節ドメインと比較して、担腫瘍動物の生存および腫瘍クリアランスの増加を促進することが見出された。したがって、配位子交換によって媒介される金属水酸化物（例えば、ミョウバン）への強い結合は、免疫調節療法の改善された腫瘍保持および抗腫瘍効力を促進する。

したがって、いくつかの態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、免疫調節ドメイン、ホスフェート基で修飾される分泌経路キナーゼの少なくとも１つの標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質と、（ｂ）金属水酸化物（例えば、ミョウバン）と、を含み、免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのホスフェート基を介した配位子交換により、金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体およびその使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む分泌経路キナーゼの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および
（ｉｉｉ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を介した配位子交換により、金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含み、キナーゼ標的モチーフが、Ｆａｍ２０Ｃ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、細胞外調節キナーゼ－２、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ－２、アベルソンマウス白血病ウイルスチロシンキナーゼ、ラウス肉腫ウイルスチロシンキナーゼ、インスリン受容体チロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＤ、プロウイルス統合部位キナーゼ１～３、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、またはＮｉｍＡ関連キナーゼからなる群から選択されるキナーゼによってリン酸化されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含み、少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフは、Ｆａｍ２０Ｃによってリン酸化されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフは、ホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニンを含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフは、Ｓ－Ｘ－Ｅ、Ｓ－Ｘ－ｐＳ、またはＳ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｘ－Ｄ－Ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、セリンはリン酸化されている。いくつかの態様において、Ｘは、Ｅ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、ＱおよびＧから選択される。いくつかの態様において、ＸはＥである。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および
（ｉｉｉ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフがホスホセリンを含み、免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのホスホセリンを介した配位子交換により、金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結される金属水酸化物結合ペプチドを含む。

いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、安定化ドメインは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインまたは安定化ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結されている。

いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、安定化ドメインは、任意選択的にリンカーを介して、金属水酸化物結合ペプチドまたは免疫調節ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結されている。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、約３～６個、約６～１５個、約１０～２５個、または約１０～５０個のアミノ酸を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、リン酸化アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上のキナーゼ標的モチーフを含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、キナーゼ標的モチーフは、ホスホセリンであるリン酸化アミノ酸を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、２つ以上のキナーゼ標的モチーフは、同じまたは異なるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、２つ以上のキナーゼ標的モチーフは、ペプチドリンカーによって分離されている。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフはアミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、セリンはリン酸化されている。いくつかの態様において、Ｘは、Ｅ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、ＱおよびＧから選択される。いくつかの態様において、ＸはＥである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは少なくとも１つ、２つ、または３つのキナーゼ標的モチーフを含み、任意選択的に、キナーゼ標的モチーフは連続的である。前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、および配列番号１２５から選択されるアミノ酸配列を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドはアミノ酸配列ＸＸＳＸＥＸＸ（配列番号１２７）またはＸＸＳＥＥＸＸ（配列番号１２８）を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。

前述のまたは関連の態様のいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５（配列番号１２７）を含み、Ｘａａ_１はＦ、Ｍ、またはＧであり、Ｘａａ_２はＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３はＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４はＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＱ、Ｎ、またはＧである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_１はＦであり、Ｘａａ_２はＱである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_１はＭであり、Ｘａａ_２はＥである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_１はＧであり、Ｘａａ_２はＧである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_４はＱであり、Ｘａａ_５はＱである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_４はＥであり、Ｘａａ_５はＳである。いくつかの態様において、Ｘａａ_３はＥであり、Ｘａａ_４はＧであり、Ｘａａ_５はＧである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列ＦＱＳＥＥＱＱ（配列番号１２９）、ＭＥＳＥＥＳＮ（配列番号１３０）、またはＧＧＳＥＥＧＧ（配列番号１３１）を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－［Ｌ］－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_６－Ｘａａ_７（配列番号１３３）を含み、
Ｘａａ_１はＦ、ＭまたはＧであり、Ｘａａ_２はＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３はＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４はＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＱ、Ｎ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＧであり、Ｘａａ_６はＧであり、Ｌはペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは、Ａで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｂ］）_Ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘは、［Ａ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Ｌは、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは、［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、Ｌは、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、Ｌは、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘは、［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、Ｌは、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ｃ］_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ｃは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、または配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ｃ］_ｘ－［Ｄ］_ｙを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＣおよびＤは、同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ＣおよびＤは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択され、ｘは、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｙはＤで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、ｙは１～４であり、ｘおよびｙは同じまたは異なる。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号配列番号配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、約１～５、１～１０、１～１５、１～２０個のホスホセリン残基を含み、免疫調節融合タンパク質は、ホスホセリン残基の配位子交換により、金属水酸化物に吸着される。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）任意選択的に安定化ドメインに連結された免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）タンパク質反応性部分によって、任意選択的にリンカーを介してカップリングされる１つ以上のヒドロキシル置換基を含む末端金属水酸化物結合ペプチド、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのヒドロキシル置換基を介した配位子交換により、金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、タンパク質反応性部分が、スルフヒドリル反応性部分を含み、任意選択的に、スルフヒドリル反応性部分が、マレイミドである、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、タンパク質反応性部分が、ソルターゼ認識モチーフを含む、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物結合ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のヒドロキシル置換基を含む。いくつかの態様において、ヒドロキシル置換基は、フッ化物基、シトレート基、ホスフェート基、カーボネート基、およびスルフェート基からなる群から選択され、任意選択的に、ヒドロキシル置換基が、ホスフェート基である。いくつかの態様において、ヒドロキシル置換基は、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸残基を含み、任意選択的に、リン酸化アミノ酸残基は、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホスレオニンから選択される。いくつかの態様において、リン酸化アミノ酸残基は、ホスホセリンである。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、金属水酸化物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、および水酸化ジルコニウムから選択される。いくつかの態様において、金属水酸化物は、水酸化アルミニウム（ミョウバン）である。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質であって、
（ａ）免疫調節ドメイン、
（ｂ）アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および
（ｃ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含み、
金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、ホスフェート基で修飾されたセリンを含み、免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのホスホセリンを介したミョウバンとの配位子交換を受け、それにより、免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質を提供する。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質であって、
（ａ）任意選択的に安定化ドメインに連結された免疫調節ドメイン、および
（ｂ）タンパク質反応性部分によって、任意選択的にリンカーを介してカップリングされる１つ以上のリン酸化アミノ酸を含む金属水酸化物結合ペプチド、を含み、
免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのヒドロキシル置換基を介したミョウバンとの配位子交換を受け、それにより、免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質を提供する。

いくつかの態様において、金属水酸化物結合ペプチドは、タンパク質反応性部分によって免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端にカップリングされている。

いくつかの態様において、本開示は、免疫調節ドメイン、安定化ドメイン、および金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を提供し、安定化ドメインは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、Ｎ末端または免疫調節ドメインのＣ末端であり、金属水酸化物結合ペプチドは、タンパク質反応性部分によって免疫調節ドメインまたは安定化ドメインの末端にカップリングされている。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させるための方法であって、
（ａ）
免疫調節ドメイン、
１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、
任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）
ＥＲ標的化リーダー配列、それと作動可能に連結された
キナーゼドメイン、それと作動可能に連結された
アンカーペプチド、を含むキナーゼをコードするヌクレオチド配列に、細胞を接触させることを含み、
キナーゼが分泌経路に局在し、金属水酸化物結合ペプチドの１つ以上のキナーゼ標的モチーフが分泌経路内でキナーゼによってリン酸化され、それにより、免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる、方法を提供する。

前述の方法のいくつかの態様において、キナーゼは、キナーゼを分泌経路に向けるＥＲ標的化リーダー配列を含み、任意選択的に、キナーゼは、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、細胞外調節キナーゼ－２、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ－２、アベルソンマウス白血病ウイルスチロシンキナーゼ、ラウス肉腫ウイルスチロシンキナーゼ、インスリン受容体チロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＤ、プロウイルス統合部位キナーゼ１～３、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、またはＮｉｍＡ関連キナーゼからなる群から選択されるキナーゼドメインを含む。

前述の方法のいくつかの態様において、キナーゼはＦａｍ２０Ｃを含み、Ｆａｍ２０Ｃは配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む。

前述の方法のいくつかの態様において、キナーゼはキナーゼの分泌を阻害するアンカーペプチドを含み、任意選択的に、アンカーペプチドはアミノ酸配列ＫＤＥＬまたはＨＤＥＬを含む。

前述の方法のいくつかの態様において、細胞は、免疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる。

前述の方法のいくつかの態様において、細胞は、キナーゼをコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる。

前述の方法のいくつかの態様において、細胞は、キナーゼをコードする核酸および免疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる。

他の態様において、本開示は、免疫調節ドメイン、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および任意選択的に安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる方法であって、免疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターおよびアンカーペプチドに作動可能に連結された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃをコードする核酸を含む発現ベクターと、細胞を接触させることを含み、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃが、アンカーペプチドによって分泌経路に局在され、１つ以上のキナーゼ標的モチーフが、分泌経路内でＦａｍ２０Ｃによってリン酸化され、それにより、免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる、方法を提供する。

いくつかの態様において、本方法は、免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を維持することを含む。いくつかの態様において、本方法は、免疫調節融合タンパク質を単離することをさらに含む。

本開示の他の態様は、本開示の方法によって産生される免疫調節融合タンパク質であって、免疫調節融合タンパク質が、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含み、免疫調節融合タンパク質が、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を介したミョウバンとの配位子交換により吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質を特徴とする。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を活性化、増強、または促進するポリペプチドを含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を阻害、低減、または抑制するポリペプチドを含む。

前述または関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫細胞は、自然リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるリンパ球様細胞である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫細胞は、単球、好中球、顆粒球、肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの組み合わせから選択される骨髄細胞である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫細胞による応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞毒性の増加、ならびにそれらの組み合わせを含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、サイトカイン、ケモカイン、活性化配位子／受容体、阻害性配位子／受容体、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つ以上のサイトカインを含む。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡ、ＩＬ－２１、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトガンマ共通鎖受容体インターロイキンである。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ－２である。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ－１５／ＩＬ１５ＲＡである。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＬ－１２（ｐ３５）、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ３５）／ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩＬ－１２ファミリーメンバーである。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＬ－１２（ｐ３５）／ＩＬ－１２（ｐ４０）の一本鎖融合物である。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩＬ－１ファミリーメンバーである。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ－１８である。いくつかの態様において、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、およびそれらの組み合わせから選択される。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つ以上のケモカインを含む。いくつかの態様において、ケモカインは、ＬＩＦ、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ－１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸ、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様において、ケモカインは、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシン、およびそれらの組み合わせから選択される。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つ以上の活性化配位子／受容体を含む。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、Ｂ７配位子ファミリー、およびＴ細胞受容体から選択される。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体は、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０、およびそれらの組み合わせから選択されるＴＮＦスーパーファミリー配位子である。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体であり、免疫調節ドメインは、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４－１ＢＢ抗体、および抗ＯＸ４０抗体から選択される抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体は、ＩＣＯＳ配位子、ＣＤ８０、およびＣＤ８６、ならびにそれらの組み合わせから選択されるＣＤ２８スーパーファミリーメンバーまたはＢ７ファミリーメンバーである。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、活性化配位子／受容体はＴ細胞受容体であり、免疫調節ドメインは、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体、およびＣＤ３ε抗体から選択される抗体またはその抗原結合断片を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節ドメインは、１つ以上の阻害性配位子／受容体を含む。いくつかの態様において、阻害性配位子／受容体は、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびチェックポイント阻害剤から選択される。いくつかの態様において、阻害性配位子／受容体は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体から選択される抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、阻害性配位子／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＢＴＬＡ抗体から選択される抗体または抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、阻害性配位子／受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、免疫調節ドメインは、抗ＴＩＧＩＴ抗体である抗体または抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、阻害性配位子／受容体はチェックポイント阻害剤であり、免疫調節ドメインは、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗－ＣＤ４７抗体、および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される抗体または抗原結合断片を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、安定化ドメインは、ヒト血清アルブミンまたはその断片を含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、安定化ドメインは、ＦｃドメインまたはＦｃＲ相互作用が低減された変異体Ｆｃドメインを含む。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、インビボでの投与時に注射部位からのサイズ依存性拡散を低減するのに十分な質量のものである。

他の態様において、本開示は、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。他の態様において、本開示は、本開示の免疫調節融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。

他の態様において、本開示は、本開示の免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。他の態様において、本開示は、本開示の核酸を含む、発現ベクターを提供する。他の態様において、本開示は、本開示の発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。

他の態様において、本開示は、免疫調節融合タンパク質を産生するための方法であって、免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を維持することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、免疫調節融合タンパク質を取得することと、免疫調節融合タンパク質を金属水酸化物に吸着させ、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成することと、をさらに含む。

他の態様において、本開示は、対象における免疫細胞による応答を活性化、増強または促進するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物を、免疫細胞による応答の活性化、増強または促進を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における免疫細胞による応答を活性化、増強または促進するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合物またはその薬学的組成物を、免疫細胞による応答の活性化、増強または促進を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

他の態様において、本開示は、対象における免疫細胞による応答を阻害、低減または抑制するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物を、免疫細胞による応答の阻害、低減または抑制を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における免疫細胞による応答を阻害、低減または抑制するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質またはその薬学的組成物を、免疫細胞による応答の阻害、低減または抑制を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、免疫細胞は、自然リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるリンパ球様細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、単球、好中球、顆粒球、肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの組み合わせから選択される骨髄細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞による応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞毒性の増加、ならびにそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、免疫細胞による応答は、腫瘍微小環境において起こる。

他の態様において、本開示は、腫瘍成長を低減または阻害するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物を、腫瘍成長の低減または阻害を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、腫瘍成長を低減または阻害するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質またはその薬学的組成物を、腫瘍成長の低減または阻害を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

他の態様において、本開示は、対象におけるがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、抗腫瘍免疫応答は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または薬学的組成物の投与後に、対象において誘導される。いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または薬学的組成物は、腫瘍内に投与される。

他の態様において、本開示は、対象におけるがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質または本開示の薬学的組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、抗腫瘍免疫応答は、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物の投与後に、対象において誘導される。いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物は、腫瘍内に投与される。

他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物、を含む容器と、融合タンパク質または薬学的組成物を投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、本開示の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物、を含む容器と、融合タンパク質または薬学的組成物を投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物、を含む容器と、抗体または薬学的組成物を単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、本開示の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物、を含む容器と、抗体または薬学的組成物を単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

本開示の他の態様は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の減少または阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造のための、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物の使用を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の減少または阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造のための、本開示の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物の使用を提供する。

さらに他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の減少または阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物を提供する。

他の態様において、本開示は、がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の減少または阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、本開示の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物を提供する。

他の態様は、薬剤として使用するための、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、薬剤として使用するための、本開示の免疫調節融合物、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または本開示の薬学的組成物を提供する。

他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物、および有効量の、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合断片を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質または本開示の薬学的組成物、および有効量の、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合断片を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、または腫瘍新生抗原である。いくつかの態様において、腫瘍抗原標的化抗体は、ヒトＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、またはＣＤ３８と特異的に結合する。

他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示のいずれか１つの免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物、および有効量の、がんワクチンを含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示のいずれか１つの免疫調節融合タンパク質または本開示の薬学的組成物、および有効量の、がんワクチンを含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、がんワクチンは、腫瘍抗原でインビトロで免疫化され、対象に投与される細胞の集団である。いくつかの態様において、がんワクチンは、１つ以上の腫瘍関連抗原を含むペプチドである。いくつかの態様において、がんワクチンは、腫瘍関連抗原、脂質、および任意選択的にリンカーを含む両親媒性ペプチドコンジュゲートであり、両親媒性ペプチドコンジュゲートは、生理学的条件下でアルブミンと結合する。いくつかの態様において、がんワクチンは、アジュバントをさらに含む。

本開示のさらに他の態様は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物、および有効量の、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質または本開示の薬学的組成物、および有効量の、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、またはＴＩＭ３と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。

本開示の他の態様は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または本開示の薬学的組成物、および有効量の、養子細胞療法を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、本開示の免疫調節融合タンパク質または本開示の薬学的組成物、および有効量の、養子細胞療法を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法を提供する。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、養子細胞療法は、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、疾患に関連する腫瘍抗原に結合する。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０、およびＢＣＭＡから選択される。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または薬学的組成物は、腫瘍内に投与される。いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体もしくは薬学的組成物、および第２の組成物は、同時にまたは連続して投与される。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物は、腫瘍内に投与される。いくつかの態様において、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物、および第２の組成物は、同時にまたは連続して投与される。

前述のまたは関連する態様のうちのいずれかにおいて、本明細書に記載の方法は、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物を投与することを含み、免疫調節ドメインは異なる。いくつかの態様において、免疫調節ドメインは、異なるサイトカインである。いくつかの態様において、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物は、一緒に配合される。いくつかの態様において、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物は、別々に配合される。いくつかの態様において、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物は、同時にまたは連続して投与される。

ミョウバン結合タンパク質を生成するために使用される代表的なプラスミドを示す概略図を提供する。図示されているプラスミドを使用して、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と、インターロイキン－２（ＩＬ２）、ならびにＮ末端分泌リーダー配列およびＣ末端Ｈｉｓタグを有するＦａｍ２０Ｃ標的化モチーフＡＢＰ１０との融合物（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、配列番号１４７）を生成した。変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供し、精製ＭＳＡ－ＩＬ２、およびＡＢＰ３（配列番号９１）、ＡＢＰ４（配列番号９３）、ＡＢＰ５（配列番号９５）、ＡＢＰ６（配列番号９７）、ＡＢＰ７（配列番号９９）、ＡＢＰ８（配列番号１０１）、ＡＢＰ１０（配列番号１０３）、またはＡＢＰ１１（配列番号１０５）のいずれかであるＣ末端ＡＢＰを有するＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質バリアントの分子量を示す。精製ＭＳＡ－ＩＬ２、およびＣ末端ＡＢＰ１０を有するＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、配列番号１４６）について、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって測定されたタンパク質溶出ピークを示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（「Ｋ」の注釈で示される）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（「ＩＫ」注釈で示される）との同時トランスフェクション後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０の分子量を示す変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ｃおよび図３Ｄそれぞれ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ａおよび図３Ｂそれぞれ）との同時トランスフェクション後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるタンパク質分子量の測定を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ｃおよび図３Ｄそれぞれ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ａおよび図３Ｂそれぞれ）との同時トランスフェクション後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるタンパク質分子量の測定を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ｃおよび図３Ｄそれぞれ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ａおよび図３Ｂそれぞれ）との同時トランスフェクション後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるタンパク質分子量の測定を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ｃおよび図３Ｄそれぞれ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（図３Ａおよび図３Ｂそれぞれ）との同時トランスフェクション後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによるタンパク質分子量の測定を示す線グラフを提供する。Ｃ末端ＡＢＰに融合し、単独で発現あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現した、目的の精製タンパク質の分子量（ＭＷ）を示す変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供する。図４Ａは、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＡＢＰ１０（配列番号１６２、ＫおよびＩＫ）、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（配列番号１６０、ＫおよびＩＫ）、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（配列番号１４６、ＫおよびＩＫ）、ならびにＭＳＡ－ＩＬ２（配列番号２０４、ＫおよびＩＫ）のＭＷ比較を提供する。図４Ｂは、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＫおよびＩＫ）、リゾチーム、ならびにリゾチーム－ＡＢＰ１０（配列番号１５６）のＭＷ比較を提供する。Ｃ末端ＡＢＰに融合し、単独で発現あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現した、目的の精製タンパク質の分子量（ＭＷ）を示す変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供する。図４Ａは、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＡＢＰ１０（配列番号１６２、ＫおよびＩＫ）、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（配列番号１６０、ＫおよびＩＫ）、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（配列番号１４６、ＫおよびＩＫ）、ならびにＭＳＡ－ＩＬ２（配列番号２０４、ＫおよびＩＫ）のＭＷ比較を提供する。図４Ｂは、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＫおよびＩＫ）、リゾチーム、ならびにリゾチーム－ＡＢＰ１０（配列番号１５６）のＭＷ比較を提供する。Ｃ末端ＡＢＰに融合し、単独で発現（Ｆａｍ２０Ｃを伴わない）あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現した精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２バリアントのマラカイトグリーンアッセイを用いたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。図５Ａは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ３（配列番号９１）、ＡＢＰ４（配列番号９３）、ＡＢＰ５（配列番号９５）、ＡＢＰ６（配列番号９７）、ＡＢＰ７（配列番号９９）、ＡＢＰ８（配列番号１０１）、ＡＢＰ１０（配列番号１０３）、またはＡＢＰ１１（配列番号１０５）に融合したものの定量を提供し、図５Ｂは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ８（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８、配列番号１５０）に融合したものの定量を提供し、図５Ｃは、ＭＳＡ－ＩＬ２単独、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、またはＡＢＰ１７に融合したＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７、配列番号１５２）の定量を提供する。Ｃ末端ＡＢＰに融合し、単独で発現（Ｆａｍ２０Ｃを伴わない）あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現した精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２バリアントのマラカイトグリーンアッセイを用いたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。図５Ａは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ３（配列番号９１）、ＡＢＰ４（配列番号９３）、ＡＢＰ５（配列番号９５）、ＡＢＰ６（配列番号９７）、ＡＢＰ７（配列番号９９）、ＡＢＰ８（配列番号１０１）、ＡＢＰ１０（配列番号１０３）、またはＡＢＰ１１（配列番号１０５）に融合したものの定量を提供し、図５Ｂは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ８（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８、配列番号１５０）に融合したものの定量を提供し、図５Ｃは、ＭＳＡ－ＩＬ２単独、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、またはＡＢＰ１７に融合したＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７、配列番号１５２）の定量を提供する。Ｃ末端ＡＢＰに融合し、単独で発現（Ｆａｍ２０Ｃを伴わない）あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現した精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２バリアントのマラカイトグリーンアッセイを用いたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。図５Ａは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ３（配列番号９１）、ＡＢＰ４（配列番号９３）、ＡＢＰ５（配列番号９５）、ＡＢＰ６（配列番号９７）、ＡＢＰ７（配列番号９９）、ＡＢＰ８（配列番号１０１）、ＡＢＰ１０（配列番号１０３）、またはＡＢＰ１１（配列番号１０５）に融合したものの定量を提供し、図５Ｂは、ＭＳＡ－ＩＬ２を単独で、またはＡＢＰ８（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８、配列番号１５０）に融合したものの定量を提供し、図５Ｃは、ＭＳＡ－ＩＬ２単独、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、またはＡＢＰ１７に融合したＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７、配列番号１５２）の定量を提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）のいずれかとの共発現後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０タンパク質のマラカイトグリーンアッセイを使用したホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。これらの図は、別々に精製を実行して単離されたタンパク質について収集したデータを表している。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）のいずれかとの共発現後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０タンパク質のマラカイトグリーンアッセイを使用したホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。これらの図は、別々に精製を実行して単離されたタンパク質について収集したデータを表している。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）との共発現後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０のセリンリン酸化を測定するイムノブロットの画像を提供する。キナーゼを伴わない発現と比較して、野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（「Ｋ」と表示されたレーン）との共発現後の、精製ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（６０ｋＤａ）またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（９０ｋＤａ）のセリンリン酸化を測定するイムノブロットの画像を提供する。Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）またはキナーゼを伴わずに発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０）についての、ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したタンパク質溶出ピークを示すグラフである。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）のいずれかとの共発現後の、精製ＭＳＡ－ＩＬ２もしくはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡタンパク質単独、またはＣ末端ＡＢＰ１０に融合した精製ＭＳＡ－ＩＬ２もしくはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡタンパク質の、マラカイトグリーンアッセイによって測定されたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現したか、あるいはキナーゼを伴わない精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０またはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０の分子量（ＭＷ）を示す変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像を提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現したか、あるいはキナーゼを伴わない精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、もしくはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（図１１Ｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）について、または野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現したか、あるいはキナーゼを伴わない精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７、およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１７（図１１Ｃ）について、マラカイトグリーンアッセイによって測定されたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。精製ＭＳＡ－ＩＬ２およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋと比較される。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現したか、あるいはキナーゼを伴わない精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、もしくはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（図１１Ｂ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）について、または野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現したか、あるいはキナーゼを伴わない精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７、およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１７（図１１Ｃ）について、マラカイトグリーンアッセイによって測定されたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。精製ＭＳＡ－ＩＬ２およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋと比較される。Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）との共発現後の精製ＭＳＡ－ＩＬ２バリアントについて、マラカイトグリーンアッセイにより測定されたホスフェート含有量の定量を示す棒グラフを提供する。ＭＳＡ－ＩＬ２バリアントは、機能的リン酸化モチーフを備えたＣ末端ＡＢＰ（ＡＢＰ１０）、Ｆａｍ２０Ｃリン酸化を防ぐようにモチーフが改変されたＣ末端ＡＢＰ１０（ＡＢＰ１３）、またはトリプシン切断部位を含むＣ末端ＡＢＰ１０（ＡＢＰ１５）に融合する。＊＊ｐ＜０．０１。経時的に蛍光分光法で測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物の上清中の非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現している蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。リン酸を含まない緩衝液中の１０％マウス血清（ＭＳ）（図１３Ａ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ＭＳ（図１３Ｂ）とのインキュベーション後のタンパク質：ミョウバン混合物について、上清中の非結合タンパク質の存在を測定した。経時的に蛍光分光法で測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物の上清中の非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現している蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。リン酸を含まない緩衝液中の１０％マウス血清（ＭＳ）（図１３Ａ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ＭＳ（図１３Ｂ）とのインキュベーション後のタンパク質：ミョウバン混合物について、上清中の非結合タンパク質の存在を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１３Ａ～１３Ｂに示され、リン酸を含まない緩衝液中の１０％ＦＢＳ（図１４Ａ～Ｃ）またはＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ（図１４Ｄ～Ｆ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。タンパク質単独のサンプル（列１）中またはミョウバンと混合したタンパク質の上清（列２～６）中の非結合タンパク質を測定するために使用されるイムノブロットの画像を提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）または不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。上清中の非結合タンパク質の存在は、マウス血清の添加前（列２）またはマウス血清の添加後の特定の時間間隔（列３～６＝０、１、２、または２４時間）で測定した。ＰＢＳ中の１０％ＭＳへの曝露後に蛍光分光法によって経時的に測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物の上清中の非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）、および野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ）または単独で発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８を含む蛍光標識融合タンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ＰＢＳ中の２０％ＭＳまたは４０％ＭＳへの１７時間の曝露の前後に蛍光分光法によって測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物のミョウバン結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。単独で発現した蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、または野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現した蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）、および野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７Ｋ）について、ミョウバンへの吸着を測定した。経時的に蛍光分光法で測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物の上清中の非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）との共発現後の蛍光標識ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＡＢＰ１０またはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１８Ａ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１８Ｂ）とともにインキュベートしたタンパク質：ミョウバン混合物について、上清中の非結合タンパク質の存在を測定した。経時的に蛍光分光法で測定した、ミョウバンおよびタンパク質の混合物の上清中の非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）との共発現後の蛍光標識ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＡＢＰ１０またはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１８Ａ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１８Ｂ）とともにインキュベートしたタンパク質：ミョウバン混合物について、上清中の非結合タンパク質の存在を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１８Ａ～１８Ｂに示され、リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ａ～Ｂ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ｃ～Ｄ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１８Ａ～１８Ｂに示され、リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ａ～Ｂ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ｃ～Ｄ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１８Ａ～１８Ｂに示され、リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ａ～Ｂ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ｃ～Ｄ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバンおよびタンパク質の混合物（実線）またはタンパク質を単独で（破線）を含むサンプルの上清中のサンドイッチＥＬＩＳＡによる非結合タンパク質の定量を示す線グラフを提供する。図１８Ａ～１８Ｂに示され、リン酸を含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ａ～Ｂ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳ（図１９Ｃ～Ｄ）とともにインキュベートしたタンパク質について、ミョウバンへの吸着を測定した。血清処理前（図２０Ａ）または１０％ＭＳを含むＰＢＳ中での１７時間のインキュベーション後（図２０Ｂ）のいずれかで蛍光分光法によって測定される、ミョウバンに結合したタンパク質のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。単独で発現したか、あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現した精製融合タンパク質ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。血清処理前（図２０Ａ）または１０％ＭＳを含むＰＢＳ中での１７時間のインキュベーション後（図２０Ｂ）のいずれかで蛍光分光法によって測定される、ミョウバンに結合したタンパク質のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。単独で発現したか、あるいは野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現した精製融合タンパク質ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０について、ミョウバンへの吸着を測定した。ミョウバン単独、蛍光ホスホセリンペプチド（ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７）単独、またはミョウバン＋ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７の錯体を腫瘍内注射によって注射したマウス腺癌（ＭＣ３８）側腹腫瘍について、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって経時的に測定した蛍光強度を示す線グラフを提供する。野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）もしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現した蛍光標識ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０タンパク質を単独（破線）で、またはミョウバンと錯体化して（実線）注射したマウスＭＣ３８側腹腫瘍について、ＩＶＩＳによって経時的に測定した蛍光強度を示す線グラフを提供する。蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを遊離タンパク質として、またはミョウバンと錯体化して注射したか、あるいは蛍光標識ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（コラーゲン固定タンパク質ルミカンのＣ末端に融合したＭＳＡ－ＩＬ２）を注射したマウスＢ１６Ｆ１０－Ｔｒｐ２ノックアウト腫瘍の、ＩＶＩＳによって経時的に測定した蛍光強度を示す線グラフを提供する。挿入図に示されているＩＶＩＳによって測定した、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを注射した犠牲後（「犠牲後（ｐｏｓｔ－ｓａｃ）」）腫瘍の偽色画像。遊離（図２４Ａ）またはミョウバンと錯体化した（図２４Ｂ）蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの腫瘍内注射を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスから調製したＢ１６Ｆ１０腫瘍スライスの共焦点顕微鏡画像を提供する。注射後５日目に腫瘍の単離を実行した。腫瘍境界を輪郭で示し、共焦点顕微鏡で検出した蛍光ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋシグナルを白色で示した画像を提供する。スケールバー：５００μｍ。遊離（図２４Ａ）またはミョウバンと錯体化した（図２４Ｂ）蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの腫瘍内注射を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスから調製したＢ１６Ｆ１０腫瘍スライスの共焦点顕微鏡画像を提供する。注射後５日目に腫瘍の単離を実行した。腫瘍境界を輪郭で示し、共焦点顕微鏡で検出した蛍光ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋシグナルを白色で示した画像を提供する。スケールバー：５００μｍ。蛍光ミョウバン－ｐＳｅｒ４と錯体化した蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの腫瘍内注射を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスから調製したＢ１６Ｆ１０腫瘍スライスの共焦点顕微鏡画像を提供する。注射の１時間後に腫瘍の単離を実行した。共焦点顕微鏡イメージングによって検出されるような蛍光ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（左パネル）または蛍光ミョウバン－ｐＳｅｒ４（右パネル）のいずれかを示す腫瘍スライスの画像が提供され、腫瘍境界が輪郭で示され、シグナルが灰色で示されている。スケールバー：５００μｍ。蛍光ミョウバン－ｐＳｅｒ４と錯体化した蛍光標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの腫瘍内注射を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスから調製したＢ１６Ｆ１０腫瘍スライスの高解像度共焦点顕微鏡画像を提供する。注射後５日目に腫瘍の単離を実行した。共焦点顕微鏡イメージングによって検出されるような腫瘍細胞（左パネル）、蛍光ミョウバン－ｐＳｅｒ４（中央パネル）、または蛍光ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（右パネル）のいずれかを示す腫瘍スライスの画像が提供され、シグナルが灰色で示されている。スケールバー：１００μｍ。ＭＳＡ単独、ＭＳＡ－ＩＬ２、またはＣ末端もしくはＮ末端のＡＢＰ１０に融合し、野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したＭＳＡ－ＩＬ２（それぞれ、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫおよびＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２）を含む、ミョウバン結合について評価されたタンパク質構成を示す概略図を提供する。図２５Ａに示し、細胞のみに投与され（図２５Ｂ）か、あるいはミョウバンに吸着した（図２５Ｃ）異なるＩＬ２濃度のタンパク質での処理後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイで測定されるＣＴＬＬ－２細胞の増殖を示す線グラフを提供する。図２５Ａに示し、細胞のみに投与され（図２５Ｂ）か、あるいはミョウバンに吸着した（図２５Ｃ）異なるＩＬ２濃度のタンパク質での処理後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイで測定されるＣＴＬＬ－２細胞の増殖を示す線グラフを提供する。ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ（図２６Ａ）、およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ－ＡＢＰ１７Ｋ（図２６Ｂ）を含む、異なるＩＬ２濃度のミョウバン結合融合タンパク質での処理後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイによって測定されるＣＴＬＬ－２細胞の増殖を示す線グラフを提供する。ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ（図２６Ａ）、およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ－ＡＢＰ１７Ｋ（図２６Ｂ）を含む、異なるＩＬ２濃度のミョウバン結合融合タンパク質での処理後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイによって測定されるＣＴＬＬ－２細胞の増殖を示す線グラフを提供する。リン酸化ＡＢＰ１０に対するｓｃＩＬ１２およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡの融合タンパク質（それぞれ、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫおよびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ）の概略図を提供する。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ１２レポーター細胞におけるＩＬ１２シグナル伝達のインビトロ活性化によって測定される、遊離タンパク質としてのまたはミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫおよびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋの生物活性を定量する棒グラフを提供する。示されているのは、陽性対照としてのｓｃＩＬ１２－ＭＳＡおよび陰性対照としてのＭＳＡとの比較である。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫側腹腫瘍を接種し、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した腫瘍標的化抗体（ＴＡ９９）と腫瘍内（ｉ．ｔｕ．）注射によって投与したＭＳＡ－ＩＬ２融合タンパク質の単回投与で処理したマウスについての、治療スケジュールを示す概略図を提供する。ＴＡ９９単独または遊離ＭＳＡ－ＩＬ２、コラーゲン結合ドメイン（ルミカン）に融合したＭＳＡ－ＩＬ２、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、またはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２との組み合わせでの図２８Ａによる治療後のマウス生存を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。ＴＡ９９単独（図２８Ｃ）で、またはＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｄ）、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｅ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｆ）、ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ（図２８Ｇ）、もしくはミョウバンに吸着したＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２（図２８Ｈ）との組み合わせによる、図２８Ａによる治療後に一定間隔で測定された腫瘍面積を示す線グラフを提供する。Ｂ１６Ｆ１０側腹腫瘍を接種し、腹腔内注射により投与されたＴＡ９９および腫瘍内注射により投与されたＭＳＡ－ＩＬ２融合タンパク質の単回投与で処理されたマウスの治療スケジュールを示す概略図を提供する。ＴＡ９９単独、または遊離ＭＳＡ－ＩＬ２、ＭＳＡ－ＩＬ２とミョウバン、遊離ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２、もしくはミョウバンのみとの組み合わせによる、図２９Ａによる治療後のマウス生存を示すグラフを提供する。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される、１００万個の脾細胞当たりのＢ１６Ｆ１０反応性スポット形成単位（ＳＦＵ）の数を定量したグラフを提供する。脾細胞は、腫瘍接種後１２日目に、図２９Ａに従って処理されたマウスから単離された。、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ、またはミョウバンのみと組み合わせたＴＡ９９による、図２９Ａに示すスケジュールに従った治療後のマウス生存を示すグラフを提供する。Ｂ１６Ｆ１０側腹腫瘍を接種し、腹腔内注射により投与された抗ＰＤ－１抗体および腫瘍内注射により投与された単回投与ＩＬ１２融合タンパク質で処理したマウスの治療スケジュールを示す概略図を提供する。ＩＬ１２融合タンパク質は、ＡＢＰ１０に直接融合したｓｃＩＬ１２（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０）またはＡＢＰ１０に融合したｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ（ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０）のいずれかであった。マウスは、ミョウバンのみと錯体化したＩＬ１２融合タンパク質、ミョウバンおよび抗ＰＤ－１抗体と錯体化したＩＬ１２融合タンパク質、または遊離ＩＬ１２融合タンパク質および抗ＰＤ－１抗体を投与された。対照マウスは、腫瘍内注射によりミョウバンを投与され、腹腔内注射により抗ＰＤ－１抗体を投与された。ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０融合タンパク質（図３０Ｂ）またはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０融合タンパク質（図３０Ｃ）のいずれかを用いた、図３０Ａによる投与後のマウス生存を示すグラフを提供する。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０融合タンパク質（図３０Ｂ）またはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０融合タンパク質（図３０Ｃ）のいずれかを用いた、図３０Ａによる投与後のマウス生存を示すグラフを提供する。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１図３０Ａに示す治療スケジュールに従って、抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ１２融合タンパク質を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおける腫瘍接種後の経時的な腫瘍面積を示すグラフを提供する。ＩＬ１２融合タンパク質は、ＡＢＰ１０に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ａ）、またはＡＢＰ１７に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ｂ）のいずれかであった。ミョウバンを含まないｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０（図３１Ｃ）およびミョウバンのみ（図３１Ｄ）による処理を対照群として使用した。図３０Ａに示す治療スケジュールに従って、抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ１２融合タンパク質を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおける腫瘍接種後の経時的な腫瘍面積を示すグラフを提供する。ＩＬ１２融合タンパク質は、ＡＢＰ１０に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ａ）、またはＡＢＰ１７に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ｂ）のいずれかであった。ミョウバンを含まないｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０（図３１Ｃ）およびミョウバンのみ（図３１Ｄ）による処理を対照群として使用した。図３０Ａに示す治療スケジュールに従って、抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ１２融合タンパク質を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおける腫瘍接種後の経時的な腫瘍面積を示すグラフを提供する。ＩＬ１２融合タンパク質は、ＡＢＰ１０に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ａ）、またはＡＢＰ１７に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ｂ）のいずれかであった。ミョウバンを含まないｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０（図３１Ｃ）およびミョウバンのみ（図３１Ｄ）による処理を対照群として使用した。図３０Ａに示す治療スケジュールに従って、抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ１２融合タンパク質を投与したＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおける腫瘍接種後の経時的な腫瘍面積を示すグラフを提供する。ＩＬ１２融合タンパク質は、ＡＢＰ１０に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ａ）、またはＡＢＰ１７に融合し（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２（図３１Ｂ）のいずれかであった。ミョウバンを含まないｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０（図３１Ｃ）およびミョウバンのみ（図３１Ｄ）による処理を対照群として使用した。Ｂ１６Ｆ１０側腹腫瘍を接種し、腹腔内注射により投与された抗ＰＤ－１抗体、ならびに腫瘍内注射により投与された単回投与ＩＬ１２および／またはＩＬ２融合タンパク質で処理したマウスの治療スケジュールを示す概略図を提供する。マウスに、（ｉ）遊離ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋおよび遊離ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ、（ｉｉ）それぞれがミョウバンに錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫおよびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ、または（ｉｉｉ）ミョウバンに錯体化したｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋと組み合わせて、抗ＰＤ－１抗体を投与した。対照マウスはミョウバンの腫瘍内注射を受けた。治療前の体重（図３２Ｂ）および図３２Ａによる治療後のマウスの生存（図３２Ｃ）に対して正規化された経時的な体重変化率を示すグラフを提供する。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。治療前の体重（図３２Ｂ）および図３２Ａによる治療後のマウスの生存（図３２Ｃ）に対して正規化された経時的な体重変化率を示すグラフを提供する。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

免疫調節融合タンパク質および金属水酸化物錯体
本開示は、脊椎動物への免疫調節融合タンパク質の投与から生じる腫瘍に対する免疫応答（例えば、がん特異的免疫応答）を増強することに関する新規の組成物および方法を提供する。本開示によれば、免疫応答は、免疫調節融合タンパク質を、免疫応答へのその提示が応答を増強する形態で投与することによって増強される。例えば、免疫調節融合タンパク質が腫瘍もしくは腫瘍排出リンパ節で利用可能である期間を促進、増加、もしくは増強するか、または腫瘍細胞に対する免疫細胞（例えば、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞）の活性化を促進、増加、もしくは増強する。本開示は、静電力および他の二次力のみによって金属水酸化物（例えば、ミョウバン）に吸着された免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）に高度に吸着されたままの状態ではないという発見から生じる。しかしながら、配位子交換によって金属水酸化物（例えば、ミョウバン）に吸着された抗原は、しっかりと結合したままの状態であり、腫瘍部位への注射後、長期間注射部位に留まり、強力ながん特異的免疫応答をもたらす。したがって、本明細書で提供されるのは、インビボでの投与後にがん特異的免疫応答を生成するのに使用するための金属水酸化物（例えば、ミョウバン）への配位子交換を介した吸着のための免疫調節融合タンパク質を生成するための方法および組成物である。

したがって、本明細書で提供されるのは、免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させて、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）からの吸着を増加させる、またはそれからの放出を減少させるための方法である。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、免疫調節ドメイン、金属水酸化物結合ペプチド、および任意選択的に安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質であって、金属水酸化物結合ペプチドが、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む、免疫調節融合タンパク質を提供する。分泌経路キナーゼを含む宿主細胞で発現される場合、１つ以上のキナーゼ標的モチーフはリン酸化され、ホスフェート基との組換え発現中に修飾された免疫調節融合タンパク質を提供する。得られた免疫調節融合タンパク質は、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）とさらに接触させられ、金属水酸化物結合ペプチドのリン酸化キナーゼ標的モチーフは、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）への配位子交換を介した吸着を可能にし、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する。そのような方法は、例えば、当業者に知られている組換えタンパク質の発現および精製の方法を使用して、より簡単な製造様式を可能にすることによって有用である。

他の実施形態において、本開示の方法は、免疫調節ドメイン、任意選択的に、それと作動可能に連結された安定化ドメインと、を含む、ポリペプチドであって、安定化ドメインが、ポリペプチド反応性部分を介して、１つ以上のヒドロキシル置換基（例えば、リン酸化アミノ酸残基）を含む金属水酸化物結合ペプチドにさらに架橋される、ポリペプチドを提供する。したがって、本方法は、ポリペプチドの組換え発現後の、免疫調節ドメインを含むポリペプチドの修飾を可能にする。得られた免疫調節融合タンパク質は、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）とさらに接触させられ、金属水酸化物結合ペプチドの１つ以上のヒドロキシル置換基（例えば、リン酸化アミノ酸残基）は、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）への配位子交換を介した吸着を可能にし、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する。そのような方法は、当業者にとって有用である。例えば、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）へのより高い親和性結合を与える非天然アミノ酸残基を含む金属水酸化物結合ペプチドの共有結合を可能にすることによって。

金属水酸化物
いくつかの実施形態において、本開示は、免疫調節融合タンパク質が、金属水酸化物に吸収される、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。金属水酸化物への吸着は、配位子交換メカニズムによって起こり、置換は、免疫調節融合タンパク質および金属水酸化物を含む内圏表面錯体の形成をもたらし、それにより、免疫調節融合タンパク質はアジュバント粒子に強く吸着される。本明細書で使用される場合、「配位子交換」という用語は、別の配位子、この場合はヒドロキシル置換基を含む抗原、による表面ヒドロキシルの置換または交換として定義される。配位子交換により吸着を測定するための方法は、当業者に知られている。例えば、吸着は、楕円偏光法（ＥＬＭ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、光導波路光モード分光法（ＯＷＬＳ）、減衰全内部反射赤外分光法（ＡＴＲ－ＩＲ）、円二色性分光法（ＣＤ）、全内部反射赤外分光法（ＴＩＲＦ）、およびその他の高解像度顕微鏡技術によって測定できる。いくつかの実施形態において、これらの方法は、免疫調節融合タンパク質のドメイン間の空間的配置を示す。

本明細書で使用される場合、「金属水酸化物」という用語は、金属に結合した少なくとも１つのヒドロキシル基を含み、ヒドロキシル置換部分を有する免疫調節融合タンパク質を吸着することができ、脊椎動物に送達されたときにがん特異的免疫応答を誘発する際に免疫調節融合タンパク質を支援することができる物質を指すために使用される。いくつかの実施形態において、金属水酸化物は、ヒトおよび非ヒトに対して生体適合性であるものとして選択される。本発明に従って使用するための好ましい金属水酸化物アジュバントは、アルミニウム含有金属水酸化物である。「アルミニウム含有金属水酸化物」という用語は、アルミニウムに結合した少なくとも１つのヒドロキシル基を含む物質として定義される。アルミニウム含有金属水酸化物の例は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムである。

関連分野の当業者は、「水酸化アルミニウム」という用語が、結晶性オキシ水酸化物化合物を識別するためにこの分野で使用されることを理解するであろう。水酸化アルミニウムは、表面にヒドロキシル基のみを有し、アルミニウムに共有結合している。「リン酸アルミニウム」という用語は、この分野でアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムを識別するために使用される。リン酸アルミニウムは、表面にホスフェート基およびヒドロキシル基を有し、アルミニウムに共有結合している。

本発明の原理は、アルミニウム含有金属水酸化物以外の金属水酸化物にも同様に適用可能である。金属水酸化物のさらなる代替の非限定的な例として、本発明は、水酸化鉄またはリン酸カルシウムが本発明による使用に好適であることを企図している。

本発明はまた、修飾ヒドロキシル置換免疫調節融合タンパク質を送達するための免疫原性配合物における、例えば、修飾アルミニウム含有金属水酸化物などの修飾金属水酸化物の使用を企図する。本明細書で使用される場合、「修飾金属水酸化物」という用語は、配位子交換に利用可能な表面ヒドロキシル基の数が減少するように、表面ヒドロキシル基の一部が置換または修飾されている金属水酸化物を指すために使用される。本発明に従って金属水酸化物アジュバントを修飾する１つの例示的な方法は、表面ヒドロキシル基のホスフェート置換を生じさせるのに十分な時間、金属水酸化物をホスフェート含有溶液と接触させることによる（本明細書では一部の表面ヒドロキシル基のリン酸化とも呼ばれる）。例えば、水酸化アルミニウムがホスフェートに曝露されると、ホスフェートは表面ヒドロキシルを置換し、表面アルミニウムと内圏表面錯体（共有結合）を形成し、それにより水酸化アルミニウムアジュバントの表面構造を修飾することができる。リン酸アルミニウムアジュバントの表面ヒドロキシル基は、同様の方法でリン酸化することができる。

配位子交換に利用可能な金属水酸化物粒子の表面上のヒドロキシル基の密度を改変するために、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）を記載のように修飾することができる。代替的に、または追加的に、本方法での金属水酸化物（例えば、ミョウバン）の修飾は、他の理由で望ましい場合がある。例えば、本開示は、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）粒子の表面上のヒドロキシル基の密度の変更が、それに応じて、免疫原性組成物の吸着またはカップリングの程度を変更することを企図している。

ヒドロキシル置換基の非限定的な例には、フッ化物基、シトレート基、ホスフェート基、スルフェート基、およびカーボネート基が含まれる。水酸化アルミニウムは、ホスフェートに対して高い親和性を有しており、配位子交換反応において表面ヒドロキシルを置換することができる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合は、ホスフェート基を含む１つ以上のヒドロキシル置換基を含む。アルミニウムはフッ素に対してさらに高い親和性を有する。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合は、フッ素基を含む１つ以上のヒドロキシル置換基を含む。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物への配位子交換により吸着された免疫調節融合タンパク質は、組織（例えば、腫瘍）内の注射部位からのサイズ依存性拡散を防ぐのに十分な質量のものである。組織からの拡散を測定するための方法は、当業者に知られている。例えば、拡散は、インビボイメージングによって、または経時的な組織切片の顕微鏡検査を介して測定することができる。例示的な方法は、少なくともＳｃｈｍｉｄｔ＆Ｗｉｔｔｒｕｐ，ＭｏｌＣａｎｃＴｈｅｒ．２００９’およびＷｉｔｔｒｕｐｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ２０１２に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

キナーゼ標的モチーフ
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。プロテインキナーゼは、ＡＴＰからタンパク質中の特定のアミノ酸へのγ－リン酸の転移を触媒する。キナーゼ標的モチーフは、キナーゼ（例えば、キナーゼホスホアクセプター）によってリン酸化されるアミノ酸を含む。真核生物では、一般にキナーゼによってリン酸化されるアミノ酸は、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）残基である。追加的に、多くのキナーゼは、キナーゼが特定のキナーゼ標的モチーフのホスホアクセプターアミノ酸をリン酸化するような特異性を与える構造要素を含む。キナーゼ標的モチーフは、キナーゼの認識およびリン酸化に必要なホスホアクセプターアミノ酸残基のすぐＮ末端およびＣ末端のアミノ酸配列を指す。細胞キナーゼによって認識されるキナーゼ標的モチーフは大きく異なる。所与のキナーゼのキナーゼ標的モチーフを識別する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｋｅｍｐ，ｅｔａｌ，（１９７５）ＰＮＡＳ７２：３４４８－３４５２，Ｄａｉｌｅ，ｅｔａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５７：４１６－４１８，およびＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔａｌ（１９９１）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２００：６２－８１によって記載されているように、既知のキナーゼ基質の突然変異分析を使用してキナーゼ標的モチーフを決定する。別の例では、ペプチドライブラリスクリーンを使用してキナーゼ標的モチーフを決定し、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，ｅｔａｌ（１９９４）ＣｕｒｒＢｉｏｌ４：９７３－９８２によって記載されるように、目的のキナーゼを、ＡＴＰとともに、リン酸化可能な残基が１つしかない１０^９のペプチドの可溶性混合物に添加する。リン酸化ペプチドを非リン酸化ペプチドから分離し、混合物を配列決定する前に、キナーゼ反応を短期間生じさせる。各位置での好ましいアミノ酸の識別は、出発混合物と比較したリン酸化画分における各位置でのアミノ酸の存在量を比較することによって得られる。別の例では、Ｈｕｔｔｉ，ｅｔａｌ（２００４）ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１：２７－２９によって記載されているように、第１の固定位置および第２の固定アミノ酸にＳｅｒおよび／またはＴｈｒ残基を含むビオチン化二重配向ペプチドライブラリ。ペプチド混合物は、９６ウェルプレート構成においてキナーゼとともにインキュベートし、オートラジオグラフィーによるリン酸化の分析のためにアビジンでコーティングされた膜に転写される。そのような方法を使用して、表１に列挙され、列挙された参考文献またはＰｉｎｎａ，ｅｔａｌ（１９９６）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１３１４：１９１－２２５によってさらに記載されたものなどの特定の細胞キナーゼのキナーゼ標的モチーフが特定されている。

いくつかの実施形態において、本開示は、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。分泌経路とは、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、およびそれらの間を移動する小胞、ならびに細胞膜およびリソソーム貯蔵区画を指す。分泌経路は、細胞がタンパク質を細胞外環境に分泌する経路となる。ＥＲに進入することによって、多くのタンパク質が合成され、分泌経路に振り分けられる。これは、翻訳中、タンパク質を合成するリボソームが粗いＥＲに結合し、合成されるタンパク質が同時翻訳的に（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）ＥＲ膜を通過するときに起こる。分泌経路への進入は、ＥＲ標的化リーダー配列によって指示される。疎水性アミノ酸のストレッチを含むＥＲ標的化リーダー配列は、一般にタンパク質のＮ末端に存在し、タンパク質のＥＲ内腔への移行を指示する。

分泌経路に振り分けられた可溶性のタンパク質は、ＥＲ内腔に局在し、その後、他の細胞小器官の内腔に振り分けられるか、細胞から分泌される。分泌される予定のタンパク質は、小さな輸送小胞に組み込まれ、シス－ゴグリ（Ｇｏｇｌｉ）小胞体に移動する。タンパク質はＥＲにリサイクルされるか、または槽移動（ｃｉｓｔｅｒｎａｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によってトランス－ゴルジに移動する。ゴルジのトランス面から、分泌タンパク質は、分泌のために輸送小胞に、または細胞内に貯蔵するために分泌小胞に振り分けられる。

細胞質ゾルまたは核に局在する細胞内タンパク質は、タンパク質を分泌経路に向けるように、ＥＲ標的化リーダー配列で修飾できることが当技術分野で知られている。したがって、いくつかの実施形態において、表１に列挙されるものなどの、細胞質ゾルまたは核に局在するキナーゼは、キナーゼを分泌経路に向けるように、ＥＲ標的化リーダー配列で修飾され、それにより「分泌経路キナーゼ」を生成する。さらに、Ｃ末端アンカーペプチド（例えば、ＫＤＥＬ、例えば、ＨＤＥＬ）を含むポリペプチドは、分泌経路における保持が増加していることが当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、キナーゼは、分泌経路における保持および／または分泌の減少を促進または増加させるために、アンカーペプチドでさらに修飾される。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメイン、金属水酸化物結合ペプチド、および任意選択的に本明細書に記載の安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用してトランスフェクト宿主細胞において作製され、金属水酸化物結合ペプチドは、表１に列挙されている細胞キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫調節融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、ならびにＥＲ標的化リーダー配列、表１のキナーゼに由来するキナーゼドメインおよびアンカーペプチドを含むキナーゼをコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされ、キナーゼは、ＥＲ標的化リーダー配列およびアンカーペプチドによって分泌経路に局在し、金属水酸化物結合ペプチドの１つ以上のキナーゼ標的モチーフは、分泌経路のキナーゼによってリン酸化され、それにより免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる。

ほとんどのキナーゼは、細胞の核または細胞質ゾルに局在している。しかしながら、一部のキナーゼは分泌経路に存在し、分泌される予定のタンパク質をリン酸化するように機能する。天然に存在する分泌経路キナーゼが識別され、記載されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔａｌ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１：４０１－４０４；Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ，（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６：１１５０－１１５３；Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉ，ｅｔａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１６１９－１６３２；Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ（２０１３）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ３８：１２１－１３０）。説明したように、分泌経路キナーゼは、キナーゼを分泌経路に向けるためのＮ末端ＥＲ標的化リーダー配列およびＣ末端キナーゼドメインを含む。追加的に、分泌経路キナーゼは、予測される膜貫通ヘリックスを欠いており、キナーゼドメインが、分泌経路のタンパク質に近接してＥＲおよび／またはゴルジ内腔内に配向することを可能にする。天然に存在するヒト分泌経路キナーゼには、４接合型ボックスキナーゼ１、Ｆａｍ２０Ａ、Ｆａｍ２０Ｂ、Ｆａｍ２０Ｃ（ゴルジカゼインキナーゼとも呼ばれる）、Ｆａｍ１９８Ａ、Ｆａｍ１９８Ｂ、Ｆａｍ６９Ａ、Ｆａｍ６９Ｂ、Ｆａｍ６９Ｃ、および脊椎動物孤立キナーゼ（ＶＬＫ）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本開示は、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。Ｆａｍ２０Ｃは、細胞外リンプロテオームのかなりの部分を含む、１００を超える分泌リンタンパク質のリン酸化について同定されているヒトキナーゼである（Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉ，ｅｔａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１６１９－１６３２）。Ｆａｍ２０Ｃはカゼインをリン酸化し、しばしばゴルジ富化画分カゼインキナーゼと呼ばれる。追加的に、Ｆａｍ２０Ｃはセリンをリン酸化し、アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｘ－Ｇｌｕ（例えば、Ｓ－Ｘ－Ｅ）、Ｓｅｒ－Ｘ－ｐＳｅｒ（例えば、Ｓ－Ｘ－ｐＳ）、およびＳｅｒ－Ｘ－Ｇｌｎ－Ｘ－Ｘ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ（Ｓ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｘ－Ｄ－Ｅ－Ｅ）を含むキナーゼ標的モチーフをリン酸化することが示されており、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｐＳはリン酸化セリンである（Ｍｅｒｃｉｅｒ，ｅｔａｌ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６３：１－１７；Ｍｅｒｃｉｅｒｅｔａｌ（１９７１）ＥｕｒＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：４１－５１；Ｌａｓａ－Ｂｅｎｉｔｏ（１９９６）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３８２：１４９；Ｂｒｕｎａｔｉ，ｅｔａｌ（２０００）３：７６５，Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉ，ｅｔａｌ（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１６１９－１６３２；Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉ，ｅｔａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６：１１５０－１１５３）。例えば、アミノ酸配列を含むβ－カゼインに由来するペプチド基質

（β２８－４０、配列番号９９）は、Ｓ－Ｘ－Ｅキナーゼ標的モチーフを含み、セリンはＦａｍ２０Ｃによってリン酸化されている。

いくつかの実施形態において、本開示は、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質であって、キナーゼ標的モチーフが、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、セリンがリン酸で修飾されている、免疫調節融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘは、Ｅ、Ｓ、Ｖ、またはＧであり、セリンはリン酸で修飾されている。いくつかの実施形態において、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフは、アミノ酸配列Ｓ－Ｅ－Ｅを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質であって、キナーゼ標的モチーフが、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｓを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、一方または両方のセリン残基がリン酸で修飾されている、免疫調節融合タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１つ、２つ、または３つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、キナーゼ標的モチーフは連続的である。

金属水酸化物結合ペプチド
いくつかの実施形態において、本開示は、金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも２つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも３つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも４つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも５つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも６つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも７つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも８つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも９つのリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１０個のリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１１個のリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１２個のリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１３個のリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１４個のリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１５個のリン酸化アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、ホスホセリン、ホスホチロシン、またはホスホスレオニンからなる群から選択されるリン酸化アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、少なくとも１つのホスホセリンを含む。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、ホスホセリン残基を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、１～１５個の連続するホスホセリン残基を含む。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約６～１５個、約１０～２５個、約１０～５０個、約１０～１００個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約１０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約１５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約２０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約３０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約３５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約４０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約４５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約５０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約５５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約６０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約６５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約７０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約７５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約８０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約８５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約９０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約９５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、長さが約１００個のアミノ酸である。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上の標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの２つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの３つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの４つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの５つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの６つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの７つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの８つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの９つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１０個のキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１１のキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１２のキナーゼ標的モチーフを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、２つ以上のキナーゼ標的モチーフのアミノ酸配列は同じである。いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、２つ以上のキナーゼ標的モチーフのアミノ酸配列は異なる。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの２つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの３つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの４つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの５つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの６つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの７つのキナーゼ標的モチーフを含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーを伴わずに連続的である分泌経路キナーゼの８つのキナーゼ標的モチーフを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーとともに分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、アミノ酸リンカーは、約１～５個、約１～１０個、約１～１５個、約１～２０個、約１～２５個、約１～３０個、約１～３５個、約１～４０個、約１～４５個、約１～５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、介在するアミノ酸リンカーとともに分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、アミノ酸リンカーは、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、約２個、または約１個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。

いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列（［Ａ］－［Ｌ］）_ｘを含み、式中、Ａは、本明細書に開示される分泌経路キナーゼのキナーゼ標的モチーフのアミノ酸配列を含み、Ｌは、アミノ酸リンカーのアミノ酸配列を含み、ｘ＝１～１５である。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＮ末端に配置される。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、約１～５個、約１～１０個、約５～１０個、約５～１５個、約１０～１５個、約１０～２０個、約１０～３０個、約１０～４０個、約１０～５０個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、約２個、約１個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、１個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、２個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、３個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、４個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、第１のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｎ末端キナーゼ標的モチーフ）は、５個のアミノ酸分だけＮ末端から離れている。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの１つのキナーゼ標的モチーフを含み、キナーゼ標的モチーフは、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの２つのキナーゼ標的モチーフを含み、第２のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｃ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの３つのキナーゼ標的モチーフを含み、第３のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｃ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの４つのキナーゼ標的モチーフを含み、第４のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｃ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの５つのキナーゼ標的モチーフを含み、第５のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｃ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、分泌経路キナーゼの６つのキナーゼ標的モチーフを含み、第６のキナーゼ標的モチーフ（例えば、Ｃ末端キナーゼ標的モチーフ）は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端またはその近くに配置される（例えば、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個のアミノ酸分だけ離れている）。

例示的な金属水酸化物結合ペプチド
いくつかの実施形態において、本開示は、分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質であって、１つ以上のキナーゼ標的モチーフが、配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、セリンがリン酸で修飾されている、免疫調節融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む２つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む３つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む４つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む５つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む６つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む７つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む８つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む９つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む１０個のキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む１１個のキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む１２個のキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸配列であり、セリンはリン酸で修飾され、キナーゼ標的モチーフは同じまたは異なる。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、セリンはリン酸で修飾されている。いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、Ｘは、Ｅ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、およびＱからなる群から選択され、少なくとも１つのセリンはリン酸で修飾されている。いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、ここで、ＸはＥであり、セリンはリン酸で修飾されている。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、ＸＸＳＸＥＸＸ（配列番号１２７）またはＸＸＳＥＥＸＸ（配列番号１２８））からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、少なくとも１つのセリンはリン酸で修飾されている。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５（配列番号１２７）を含み、Ｘａａ_１はＦ、ＭまたはＧであり、Ｘａａ_２はＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３はＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４はＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＱ、Ｎ、またはＧであり、少なくとも１つのセリンはリン酸で修飾されている。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_３はＥである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_１はＦであり、Ｘａａ_２はＱである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_１はＭであり、Ｘａａ_２はＥである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_１はＧであり、Ｘａａ_２はＧである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_４はＱであり、Ｘａａ_５はＱである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_４はＥであり、Ｘａａ_５はＳである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ_４はＧであり、Ｘａａ_５はＧである。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、少なくとも１つのセリンはリン酸化されている。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｅ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのセリンはリン酸化されている。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－［Ｌ］－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_６－Ｘａａ_７を含み、Ｘａａ_１はＦ、ＭまたはＧであり、Ｘａａ_２はＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３はＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４はＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＱ、Ｎ、またはＧであり、Ｘａａ_５はＧであり、Ｘａａ_６はＧであり、Ｌは、ペプチドリンカー、任意選択的にｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは、Ａで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～１５である。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｂ］）_Ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０または配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘは、［Ａ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～８である。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、Ｌは本明細書に記載されているもののようなアミノ酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態において、Ｌはアミノ酸配列ＧＧＧＳを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、Ｌは本明細書に記載のもののようなアミノ酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態において、Ｌはアミノ酸配列ＧＧＧＳを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、Ｌは以下を含む本明細書に記載のもののようなアミノ酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態において、Ｌはアミノ酸配列ＧＧＧＳを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘは［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、Ｌは本明細書に記載のもののようなアミノ酸リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態において、Ｌはアミノ酸配列ＧＧＧＳを含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、表３に示すような配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ｃ］_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ｃは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘは、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４である。

いくつかの実施形態において、式［Ｃ］_ｘを含む金属水酸化物結合ペプチドであって、式中、Ｃが配列番号９１によって示されるアミノ酸配列であり、ｘが２である、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１１５によって示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、式［Ａ］_ｘを含む金属水酸化物結合ペプチドであって、式中、Ａが配列番号８によって示されるアミノ酸配列であり、ｘが２である、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１０７によって示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、式［Ｃ］_ｘ－［Ｄ］_ｙを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＣおよびＤは、同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ＣおよびＤは、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択され、ｘは、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｙは、Ｄで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘは１～４であり、ｙは１～４であり、ｘおよびｙは同じまたは異なる。

いくつかの実施形態において、式［Ｃ］_ｘ－［Ｄ］_ｙを含む金属水酸化物結合ペプチドであって、式中、Ｃが、配列番号９１によって示されるアミノ酸配列であり、Ｄは、配列番号９３によって示されるアミノ酸配列であり、が１であり、ｙが１である、金属水酸化物結合ペプチドは、配列番号１０３によって示されるアミノ酸配列を含む。

ポリペプチド反応性部分
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含むポリペプチドは、金属水酸化物結合ペプチドに連結されたポリペプチド反応性部分で修飾され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

本開示により提供されるいくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、アミン反応性基、カルボキシルからアミンへの反応性基、スルフヒドリル反応性基、アルデヒドもしくはカルボニル反応性基、ヒドロキシル反応性基、アジド反応性基、および光反応性基からなる群から選択される反応性または官能基を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、アミン反応性基を含む。アミン反応性基の非限定的な例には、イソチオシアネート、イソシアネート、塩化スルホニル、アルデヒド、カルボジイミド、アシルアジド、無水物、フルオロベンゼン、カーボネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、イミドエステル、エポキシド、およびフルオロフェニルエステルが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、スルホ－ＮＨＳエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびヒドロキシメチルホスフィンからなる群から選択されるアミン反応性基を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、カルボジイミドを含むカルボキシルからアミンへの反応性基を含む。いくつかの実施形態において、カルボジイミドはＥＤＣである。他の実施形態において、カルボジイミドはＤＣＣである。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、スルフヒドリル反応性基を含む。スルフヒドリル反応性基の非限定的な例には、マレイミド、ハロアセチル（ブロモ－またはヨード－）、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、およびビニルスルホンが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性基を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、アルデヒドまたはカルボニル反応性基を含む。アルデヒドまたはカルボニル反応性基の例には、ヒドラジドおよびアルコキシアミンが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、ヒドロキシル反応性基を含む。ヒドロキシル反応性基の非限定的な例は、イソシアネートである。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、アジド反応性基を含む。アジド反応性基の非限定的な例はホスフィンである。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、光反応性基を含む。光反応性基の例には、フェニルアジド、オルトヒドロキシフェニルアジド、メタヒドロキシフェニルアジド、テトラフルオロフェニルアジド、オルトニトロフェニルアジド、メタニトロフェニルアジド、ジアジリン、アジドメチルクマリン、およびソラレンが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、一級アミン基（－ＮＨ２）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル基（－ＳＨ）、カルボニル基（－ＣＨＯ）、アジド基（－Ｎ３）からなる群から選択される反応性または官能基を標的とし、それと反応する。

本開示によって提供されるいくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、ポリペプチドが折り畳まれた状態に維持される条件（例えば、生理学的条件）下で、目的のポリペプチドを含む１つ以上の反応性または官能基と反応し得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、抗原のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＨｉｓもしくはＡｒｇアミノ酸残基の側鎖基などの、抗原の１つ以上の反応性または官能基と反応する。ポリペプチド反応性部分は、アミノ反応性、チオール反応性、ヒドロキシル反応性、イミダゾリル反応性、またはグアニジニル反応性であり得る。ポリペプチド反応性部分に好適なさらなる例示的な反応性または官能基およびそれを使用する方法は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ“ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，２０１３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分は、ソルターゼ認識モチーフを含み、この部分は、ソルターゼの触媒作用により、免疫調節融合タンパク質の末端アミノ酸残基（例えば、グリシンおよび／またはアラニン残基）と反応する。タンパク質のＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基（例えば、グリシンおよび／またはアラニン残基）とソルターゼ認識モチーフとの間の架橋を媒介するためのソルターゼの使用方法は、当技術分野で知られており、Ｔｈｅｉｌｅ，ｅｔａｌ（２０１３）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ８：１８００－１８０７およびＧｕｉｍａｒａｅｓ，ｅｔａｌ（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１７８７－１７９９、ならびにそれらに列挙されている参考文献によってさらに記載されている。手短に言えば、ＬＰＸＴＧまたはＬＰＸＴＡアミノ酸配列（Ｘが任意のアミノ酸である）などのソルターゼ認識モチーフを含むペプチド（例えば、金属水酸化物結合ペプチド）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅａｓに由来するソルターゼＡなどのソルターゼとともにグリシンおよび／またはアラニン残基を含む末端アミノ酸配列で修飾された目的のポリペプチド（例えば、免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含み、グリシンおよび／またはアラニン残基の末端ストレッチをさらに含む免疫調節融合タンパク質）に付加される。ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフのスレオニンとグリシンまたはアラニン残基との間を切断し、ペプチド（例えば、金属水酸化物結合ペプチド）を含むチオエステル中間体を形成する。目的の末端修飾ポリペプチド（例えば、免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質）による求核性付着により、ペプチド（例えば、金属水酸化物結合ペプチド）と目的のポリペプチドの末端との共有結合が形成される。

追加的に、いくつかの実施形態において、目的のポリペプチド（例えば、免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質）は、金属水酸化物結合ペプチドに付着したグリシンおよび／またはアラニン残基を含むアミノ酸リンカーに、ソルターゼ媒介反応を介して反応するソルターゼ認識モチーフを含む。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、金属水酸化物結合ペプチドに付着したグリシンおよび／またはアラニン残基を含むアミノ酸リンカーに、ソルターゼ媒介反応を介して反応する末端ソルターゼ認識モチーフ（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）を含む。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドは、金属水酸化物結合ペプチドに付着したグリシンおよび／またはアラニン残基を含むアミノ酸リンカーに、ソルターゼ媒介反応を介して反応するソルターゼ認識モチーフを含む内部ループを含む。

リンカー
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含むポリペプチドは、金属水酸化物結合ペプチドに連結されたポリペプチド反応性部分で修飾され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、リンカーを用いてポリペプチド反応性部分にカップリングされている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインおよび金属水酸化物結合ペプチドを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、ポリペプチド反応性部分によって、免疫調節ドメインの末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に作動可能に連結し、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、安定化ドメインは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、ペプチド反応性部分によって、免疫調節ドメインまたは安定化ドメインのいずれかの末端（Ｎ末端またはＣ末端）に作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分および／もしくはリンカーを任意選択的に含む金属水酸化物結合ペプチドは、金属水酸化物（例えば、ミョウバン）のヒドロキシル基を置換するのに有効であり、それにより、配位子交換を介した金属水酸化物への吸着を促進、増加、または増強する少なくとも１つのヒドロキシル置換基（例えば、ホスフェート基）を提供する。

例えば、いくつかの実施形態において、１～１５個の連続するホスホセリン残基を含む金属水酸化物結合ペプチドが、短いポリ（エチレングリコール）リンカーおよびＮ末端マレイミド官能基に付着している。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドのＮ末端のマレイミド官能基は、チオエーテル連結を介して、少なくとも１つの免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含むポリペプチド上のチオール基に共有結合的に連結され、それにより、免疫調節融合タンパク質を形成する。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、金属水酸化物結合ペプチドの１～１５個の連続するホスホセリン残基を介して金属水酸化物に吸着される。

さらなる例として、いくつかの実施形態において、１～１５個の連続するホスホセリン残基を含む金属水酸化物結合ペプチドは、短いアミノ酸リンカーを介して、Ｎ末端ソルターゼ認識タグに付着している。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドのＮ末端のソルターゼ認識タグは、ソルターゼ媒介反応によって切断されて、少なくとも１つの免疫調節ドメイン、および任意選択的に安定化ドメインを含むポリペプチド上に末端グリシンを有するアミド結合を形成し、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリペプチドリンカー、エチレングリコールリンカー、またはオリゴヌクレオチドリンカーである。

さらに別の実施形態において、金属水酸化物結合ペトピドを含むリンカーは、アジド官能基を介して免疫調節融合タンパク質にコンジュゲートされ、ＤＢＣＯ修飾免疫調節融合タンパク質にカップリングされている。好ましくは、本発明と適合性のあるリンカーは、比較的非免疫原性であり、結合タンパク質（例えば、抗体）の単量体サブユニット間の非共有結合を阻害しないであろう。例示的なリンカードメインは、米国特許第６，６６０，８４３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

いくつかの実施形態において、リンカーは、切断不可能なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。切断不可能なリンカーは、アミド結合またはリン酸結合を含み得、切断可能なリンカーは、二硫化物結合、酸切断可能連結、エステル結合、無水物結合、生分解性結合、または酵素切断可能連結を含み得る。

ポリペプチドリンカー
いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、スルフヒドリル反応性部分を含むポリペプチド反応性部分を、１つ以上のヒドロキシル置換基を含む金属水酸化物結合ペプチドに共有結合的に連結するために使用され、ヒドロキシル置換基は、ホスフェート基を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは合成である。本明細書で使用される場合、ポリペプチドリンカーに関する「合成」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列において反応性物質に連結されたアミノ酸配列（天然に存在する場合も存在しない場合もある）を含むペプチド（またはポリペプチド）を含む。例えば、ポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換または欠失などの突然変異を含む）、または第１のアミノ酸配列（天然に存在する場合も存在しない場合もある）を含む非天然に存在するポリペプチドを含み得る。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含むか、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である。特定の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_１である。特定の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２である。特定の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３である。特定の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４である。特定の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_５である。特定の実施形態において、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの他の２つの配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドリンカー配列のうちのいずれか）の間に挿入され得る。他の実施形態において、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列（例えば、本明細書に記載のポリペプチドリンカー配列のうちのいずれか）の一端または両端に付着している。さらに他の実施形態において、２つ以上のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーに直列に組み込まれる。

本明細書に記載のポリペプチド反応性部分に連結された金属水酸化物結合ペプチドを調製するために使用するのに好適な他のリンカーは当技術分野で知られており、例えば、ＵＳ５，５２５，４９１に開示されたセリンリッチリンカー、Ａｒａｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ２００１；１４：５２９－３２に開示されているヘリックス形成ペプチドリンカー（例えば、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５））、およびＣｈｅｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＰｈａｒｍ２０１１；８：４５７－６５に開示されている安定なリンカー、すなわち、ジペプチドリンカーＬＥ、トロンビン感受性ジスルフィドシクロペプチドリンカー、ならびにアルファ－ヘリックス形成リンカーＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥである。

他の例示的なリンカーには、ＧＳリンカー（すなわち、（ＧＳ）ｎ）、ＧＧＳＧリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧ）ｎ）、ＧＳＡＴリンカー、ＳＥＧリンカー、およびＧＧＳリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ）が含まれ、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である。ポリペプチド反応性部分に連結された金属水酸化物結合ペプチドを調製するために使用するための他の好適なリンカーは、ＬｉｎｋｅｒＤａｔａｂａｓｅ（ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｌｉｎｋｅｒｄｂｗｗｗ）などの公的に利用可能なデータベースを使用して見出すことができる。ＬｉｎｋｅｒＤａｔａｂａｓｅは、多機能酵素のドメイン間リンカーのデータベースであり、新規融合タンパク質の潜在的なリンカーとして機能する（例えば、Ｇｅｏｒｇｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２００２；１５：８７１－９を参照）。

これらの例示的なポリペプチドリンカーのバリアント形態は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がポリペプチドリンカーに導入されるように、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製できることが理解されるであろう。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技術によって導入され得る。

本発明のポリペプチドリンカーは、長さが少なくとも１個のアミノ酸であり、様々な長さであり得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約１個～約５０個のアミノ酸である。この文脈で使用される場合、「約」という用語は、＋／－２個のアミノ酸残基を示す。リンカーの長さは正の整数でなければならないので、長さが約１個～約５０個のアミノ酸の長さは、長さが１個～４８～５２個のアミノ酸の長さを意味する。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約１～５個のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約５～１０個のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約１０～２０個のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約１５個～約５０個のアミノ酸である。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約２０個～約４５個のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、長さが約１５個～約２５個のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のポリペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、または６１個以上のアミノ酸の長さである。

ポリペプチドリンカーは、当技術分野で知られている技術を使用してポリペプチド配列に導入することができる。修飾は、ＤＮＡ配列分析によって確認できる。プラスミドＤＮＡを使用して宿主細胞をトランスフェクトし、産生されたポリペプチドを安定して産生させることができる。

エチレングリコールリンカー
いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のエチレングリコール（ＥＧ）単位、より好ましくは２つ以上のＥＧ単位（すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを含むか、またはそれからなる。ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは、繰り返しのエチレングリコール単位で構成される化合物を指す。例示的な「ＰＥＧリンカー」は、式：Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨの化合物を含み、式中、ｎは正の整数（例えば、１、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００）である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ１０００である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ２０００である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ３０００である。

いくつかの実施形態において、本開示によって提供されるポリペプチド反応性部分に連結された金属水酸化物結合ペプチドは、任意のタンパク質反応性部分を、本明細書に記載されている１つ以上のヒドロキシル置換基を含む任意の金属水酸化物結合ペプチドに接合する任意のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを使用して、スルフヒドリル反応性部分を含むタンパク質反応性部分を、１つ以上のヒドロキシル置換基を含む金属水酸化物結合ペプチドに共有結合的に連結することができ、ヒドロキシル置換基は、ホスフェート基を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分に連結された金属水酸化物結合ペプチドを含むエチレングリコール（ＥＧ）単位の正確な数は、約１～約１００、約２０～約８０、約３０～約７０、または約４０～約６０個のＥＧ単位の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、エチレングリコールリンカーは、約４５～５５個のＥＧ単位を有する。例えば、一実施形態において、エチレングリコールリンカーは、４５個のＥＧ単位を有する。例えば、一実施形態において、エチレングリコールリンカーは、４８個のＥＧ単位を有する。

オリゴヌクレオチドリンカー
いくつかの実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチドである。リンカーは任意の配列を有することができ、例えば、オリゴヌクレオチドの配列は、ランダム配列、またはその分子的もしくは生化学的特性のために特定的に選択された配列であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、一連の連続するアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそれらの類似体を１つ以上含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、一連の連続するアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそれらの類似体からなる。

一実施形態において、リンカーは、１つ以上のグアニン、例えば、１～１０個のグアニンである。いくつかの実施形態において、ＡＢＰコンジュゲート中のリンカーは、０、１、または２つのグアニンを含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートサブユニット間連結を含む。

免疫調節ドメイン
本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫調節ドメインを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの免疫調節ドメインを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質中に複数の免疫調節ドメインが存在する場合、免疫調節ドメインは同じである。いくつかの実施形態において、融合タンパク質中に複数の免疫調節ドメインが存在する場合、免疫調節ドメインは異なる。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫調節ドメインと、１つ以上のリン酸化アミノ酸を含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、安定化ドメインは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインまたは安定化ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、安定化ドメインは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、金属水酸化物結合ペプチドまたは免疫調節ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫調節ドメインおよび金属水酸化物結合ペプチドを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、ポリペプチド反応性部分によって、少なくとも１つの免疫調節ドメインの末端（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）に作動可能に連結し、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つの免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、安定化ドメインは、任意選択的にリンカーを介して、少なくとも１つの免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、ペプチド反応性部分によって、少なくとも１つの免疫調節ドメインの残りの末端（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端）に、または安定化ドメインの末端に作動可能に連結し、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、免疫系の細胞の活性を活性化する。例えば、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、インターロイキン、ケモカイン、ＴＮＦファミリーのメンバー、アゴニスト抗体、免疫チェックポイントブロッカー、またはそれらの組み合わせなどのサイトカインなどであるが、これらに限定されない免疫応答刺激性である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、免疫応答を増強する。いくつかの実施形態において、免疫応答の増強は、Ｔ細胞の刺激、Ｂ細胞の刺激、樹状細胞応答の刺激、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、免疫応答の増強は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞）産生、Ｉ型インターフェロン応答の刺激、またはそれらの組み合わせをもたらす。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を活性化、増強または促進するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、免疫細胞による応答を阻害、低減、または抑制するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および自然リンパ球を含むがこれらに限定されないリンパ組織である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、単球、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞および顆粒球を含むがこれらに限定されない骨髄細胞である。

いくつかの実施形態において、免疫細胞の応答は、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、またはそれらの組み合わせである。

インターロイキン
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、インターロイキン（ＩＬ）である。インターロイキンは、それらの特定の受容体に結合し、白血球間のコミュニケーションに役割を果たす分泌タンパク質である。免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインとして使用するのに好適なインターロイキンには、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ＳＡ）、ＩＬ－２１、ＩＬ－６、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－７、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１８、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、およびＩＬ－９が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインとして使用するのに好適なインターロイキンは、配列番号１～５および９～２４から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－２ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１２ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１５ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１５ＳＡポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、共通ガンマ鎖受容体に結合するインターロイキンポリペプチドである。共通ガンマ鎖受容体に結合するインターロイキンには、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα、およびＩＬ－２１が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１２ファミリーに属するポリペプチドである。ＩＬ－１２ファミリーは、ヘリックス構造を有するαサブユニット（例えば、ＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－２７ｐ２８）およびβサブユニット（例えば、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－２３ｐ４０（ＩＬ－１２ｐ４０と同一である）、ＥＢＩ３）から構成されるヘテロ二量体配位子を含む。例示的なメンバーには、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７およびＩＬ－３５が含まれる。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１スーパーファミリーに属するポリペプチドである。インターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーは、１１個の構造的に関連するファミリーメンバー（ＩＬ－１α、ＩＬ－１－β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３およびＩＬ－１Ｆ５～ＩＬ－１Ｆ１０）からなり、これらは、密接に関連する受容体のグループを介して作用する、最も強力な免疫系シグナル伝達分子である。すべてのＩＬ－１受容体は同様の活性化モードを有する。配位子が一次受容体サブユニット（すなわち、ＩＬ－１αおよびβの場合はＩＬ－１Ｒ１、ＩＬ－１８の場合はＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－３３の場合はＳＴ２）に結合すると、第２の受容体サブユニットが動員され（すなわち、ＩＬ－１αおよびβの場合はＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＬ－１８の場合はＩＬ－１８ＲＡＰ、ＩＬ－３３の場合はＩＬ－１ＲＡＰ）、並置された受容体サブユニットの細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ－１受容体（ＴＩＲ）ドメインを介してシグナル伝達が開始される。二量体化ＴＩＲドメインは、ＭＹＤ８８アダプタータンパク質のドッキングプラットフォームを提供する。これは、他の中間体の動員により、炎症誘発性核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化につながる。ＩＬ－１ファミリーのメンバーは、主に自然免疫細胞によって産生され、免疫応答中に様々な細胞型に作用する。したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＬ－１８ポリペプチドである。

インターロイキン－２（ＩＬ－２）
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－２ファミリーのメンバーを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２ファミリーのメンバーは、ＩＬ－２である。インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ－２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニットのマルチサブユニットＩＬ－２受容体錯体（ＩＬ－２Ｒ）を介して媒介され、これらのＩＬ－２受容体錯体（ＩＬ－２Ｒ）は、ｐ５５（ＩＬ－２Ｒα、アルファサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても知られている）、ｐ７５（ＩＬ－２Ｒβ、ベータサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても知られている）およびｐ６４（ＩＬ－２Ｒγ、ガンマサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても知られている）である。ＩＬ－２に対するＴ細胞の応答は、次のような様々な要因：（１）ＩＬ－２の濃度、（２）細胞表面上のＩＬ－２Ｒ分子の数、（３）ＩＬ－２が占めるＩＬ－２Ｒの数（すなわち、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒとの間の結合相互作用の親和性（Ｓｍｉｔｈ，“ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｓＱｕａｎｔａｌ”ＩｎＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙＡｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ７６６：２６３－２７１，１９９５））に依存する。ＩＬ－２：ＩＬ－２Ｒ錯体は、配位子結合時に内部移行し、様々な構成要素が様々な振り分けを受ける。ＩＬ－２Ｒαは細胞表面にリサイクルされるが、ＩＬ－２：ＩＬ－２ＲＰγ錯体に関連するＩＬ－２はリソソームに送られ、分解される。静脈内（ｉｖ）ボーラスとして投与された場合、ＩＬ－２は、急速な全身クリアランス（半減期が１２．９分の初期クリアランス段階、およびそれに続く半減期が８５分のより遅いクリアランス段階）を有する（Ｋｏｎｒａｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０：２００９－２０１７，１９９０）。

がん患者における全身ＩＬ－２投与の結果は理想からほど遠い。患者の１５～２０％は高用量のＩＬ－２に客観的に応答するが、大多数は応答せず、多くは吐き気、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックなどの重篤で生命を脅かす副作用に罹患している。高用量ＩＬ－２治療に関連する重度の毒性は、主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に起因する。ＮＫ細胞は、中間親和性受容体ＩＬ－２ＲＰγ_ｃを発現し、したがって、ＩＬ－２のナノモル濃度で刺激され、実際には、高用量のＩＬ－２治療中に患者の血清が生成される。投与量を低減し、投薬計画を調整することによって血清濃度を低減し、したがってＩＬ－２ＲａＰγ_ｃを有する細胞を選択的に刺激する試みがなされており、そのような治療はまた、低毒性ではあるが、あまり有効ではなかった。高用量のＩＬ－２がん治療に関連する毒性の問題を考えると、多くのグループが、治療用抗体を同時に投与することによってＩＬ－２の抗がん効果を改善しようと試みてきた。しかしながら、そのような努力はほとんど成功しておらず、ＩＬ－２療法単独と比較して追加のまたは限定された臨床的利益をもたらさない。したがって、様々ながんとより効果的に戦うためには、新規のＩＬ－２療法が必要である。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）などのヒト組換えＩＬ－２である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されるヒト組換えインターロイキン－２製品である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、以下の点で天然のインターロイキン－２とは異なる：ａ）グリコシル化されていない、ｂ）Ｎ末端アラニンを有しない、ｃ）アミノ酸位置１２５にシステインを置換するセリンを有する。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、生物学的に活性な非共有結合の微小凝集体として存在し、平均サイズは２７個の組換えインターロイキン－２分子である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２（例えば、その前駆体形態のヒトＩＬ－２、または成熟ＩＬ－２）である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、ＩＬ－２は、修飾されていないＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒアルファ受容体に対して改変された親和性（例えば、より高い親和性）を有するように変異されている。部位特異的変異誘発は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５への高親和性結合を示すＩＬ－２変異体、すなわちＩＬ－２Ｒαを単離するために使用できる。細胞表面でのＩＬ－２Ｒαに対するＩＬ－２の親和性を高めると、限られたＩＬ－２濃度範囲内で受容体の占有率が高まり、細胞表面でのＩＬ－２の局所濃度が高まる。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ－２変異体を特徴とし、これは、必ずしもではないが、実質的に精製される場合があり、高親和性ＣＤ２５結合剤として機能し得る。ＩＬ－２は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖とＮＫ細胞の刺激を誘導するＴ細胞成長因子である。高親和性結合剤である例示的なＩＬ－２変異体には、ＷＯ２０１３／１７７１８７Ａ２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれる。ＣＤ２５に対する親和性が増加したさらなる例示的なＩＬ－２変異体は、ＵＳ７，５６９，２１５（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

いくつかの実施形態において、本開示は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５への結合親和性が低減されたＩＬ－２変異体を特徴とする。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異体は、ＣＤ２５に結合しない。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異体は、ＣＤ２５と結合する配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体のアルファサブユニットに対する親和性を高める少なくとも１つの突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を有する。マウスＩＬ－２で同定された突然変異は、全長ヒトＩＬ－２（核酸配列（アクセッション：ＮＭ０００５８６）、アミノ酸配列（アクセッション：Ｐ６０５６８））、またはシグナルペプチドを伴わないヒトＩＬ－２の対応する残基で行われる可能性があることを理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ－２はヒトＩＬ－２である。他の実施形態において、ＩＬ－２は変異体ヒトＩＬ－２である。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２（その前駆体形態、もしくは好ましくは成熟形態）と、アミノ酸配列が少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９９％同一である。突然変異は、アミノ酸残基の数または含有量の変化からなる可能性がある。例えば、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２よりも多いまたは少ない数のアミノ酸残基を有することができる。代替的に、または追加的に、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２に存在する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含有することができる。

例示として、配列番号１の参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号１の参照アミノ酸の最大５つの改変を含むことを除いて、参照配列と同一である配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列中の最大５％のアミノ酸残基を削除するか、または別のアミノ酸で置換してもよく、あるいは参照配列中の全アミノ酸残基の最大５％のいくつかのアミノ酸を参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ－）もしくはカルボキシ（Ｃ－）末端位置、またはそれらの末端位置の間のどこかで起こり得、参照配列内の残基間に個々に、または参照配列内の１つ以上の連続した基に散在している。

置換されたアミノ酸残基は、必ずしもではないが、保存的置換であり得る。これは、典型的には、以下の基内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。これらの突然変異は、ＩＬ－２Ｒαと接触するアミノ酸残基にある可能性がある。

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－１２ポリペプチドを含む。インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、自然免疫および適応免疫において重要な役割を果たす炎症誘発性サイトカインである。Ｇａｔｅｌｙ，ＭＫｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５－５２１（１９９８）。ＩＬ－１２は、２つのジスルフィド連結したｐ３５およびｐ４０サブユニットからなる７０ｋＤａのヘテロ二量体タンパク質として主に機能する。ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットの前駆体形態（ＮＭ＿００２１８７；Ｐ２９４６０；ＩＬ－１２Ｂ、ナチュラルキラー細胞刺激因子２、細胞傷害性リンパ球成熟因子２とも呼ばれる）の長さは３２８個のアミノ酸であり、一方、その成熟形態の長さは３０６個のアミノ酸である。ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットの前駆体形態（ＮＭ＿０００８８２；Ｐ２９４５９；ＩＬ－１２Ａ、ナチュラルキラー細胞刺激因子１、細胞傷害性リンパ球成熟因子１とも呼ばれる）の長さは２１９個のアミノ酸であり、その成熟形態の長さは１９７個のアミノ酸である。Ｉｄ。ＩＬ－１２ｐ３５およびｐ４０サブユニットの遺伝子は異なる染色体上に存在し、互いに独立して調節されている。Ｇａｔｅｌｙ，ＭＫｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．１６：４９５－５２１（１９９８）。多くの異なる免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびＢ細胞）は、抗原刺激によりＩＬ－１２を産生する。活性型ＩＬ－１２ヘテロ二量体は、タンパク質合成後に形成される。Ｉｄ。

ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方を活性化する能力があるため、ＩＬ－１２タンパク質は、１９９４年以来、有望な抗がん治療薬として研究されてきた。Ｎａｓｔａｌａ，Ｃ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５３：１６９７－１７０６（１９９４）を参照のこと。しかしながら、高い期待にもかかわらず、初期の臨床試験では満足のいく結果が得られなかった。ＬａｓｅｋＷ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６３：４１９－４３５，４２４（２０１４）。ほとんどの患者でＩＬ－１２を繰り返し投与すると、適応応答が起こり、血中のＩＬ－１２誘導性インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベルが徐々に低下した。Ｉｄ。さらに、ＩＬ－１２誘導性の抗がん活性は主にＩＦＮγの二次分泌によって媒介されることが認識されていたが、ＩＬ－１２によって、他のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α）またはケモカイン（ＩＰ－１０もしくはＭＩＧ）とともにＩＦＮγが同時誘導されることにより重度の毒性が引き起こされた。Ｉｄ。

負のフィードバックおよび毒性に加えて、臨床状況でのＩＬ－１２療法のわずかな有効性は、ヒトにおける強力な免疫抑制環境によって引き起こされる可能性がある。Ｉｄ。ＩＦＮγの毒性を最小限に抑え、ＩＬ－１２の有効性を向上させるために、科学者は、ＩＬ－１２療法の様々な用量および時間のプロトコルなど、様々なアプローチを試みた。Ｓａｃｃｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９０：４４７３－４４７９（１９９７）；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９０：２５４１－２５４８（１９９７）；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：２４６０－２４６７（１９９７）；Ａｓｓｅｌｉｎ－Ｐａｔｕｒｅｌ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ９１：１１３－１２２（２００１）；およびＳａｕｄｅｍｏｎｔ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ１６：１６３７－１６４４（２００２）を参照のこと。それにもかかわらず、これらのアプローチは患者の生存に大きな影響を与えていない。Ｋａｎｇ，Ｗ．Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１２：６７１－６８４（２００１）。

ＩＬ－１２の膜固定バージョンは、腫瘍細胞での発現にレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターを使用して、全身投与に関連する毒性を低減する手段として研究されてきた。Ｐａｎ，Ｗ－Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（５）：９２７－９３７（２０１２）を参照のこと。しかしながら、ウイルスベクターの使用は潜在的な健康リスクを示す。これは、根底にあるウイルスががん遺伝子として作用する可能性があり、ウイルスベクターが免疫原性である可能性があるためである。

したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－１２ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２Ａ（例えば、配列番号３）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２Ｂ（例えば、配列番号２）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの両方を含む。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｂは、ＩＬ－１２ポリペプチドにおいてＩＬ－１２ＡのＮ末端に位置している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ａは、ＩＬ－１２ポリペプチドにおいてＩＬ－１２ＢのＮ末端に位置している。「～のＮ末端に位置する」という句は、ポリペプチドのＮ末端に関連するポリペプチドの他の配列に関するポリペプチド内に位置することを示す。例えば、ＩＬ－１２Ａの「Ｎ末端」であるＩＬ－１２Ｂは、ＩＬ－１２ＢがＩＬ－１２ＡよりもＩＬ－１２ポリペプチドのＮ末端に近い位置にあることを意味する。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２ＢおよびＩＬ－１２Ａを含む単一ポリペプチド鎖を含み、これらは、互いに直接融合されるか、またはリンカー（本明細書では「サブユニットリンカー」と呼ばれる）によって互いに連結される。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他の場所に開示されている。

いくつかの実施形態において、本開示のＩＬ－１２ポリペプチドはＩＬ－１２Ａおよび／またはＩＬ－１２Ｂを含み、ＩＬ－１２Ａおよび／またはＩＬ－１２Ｂは、バリアントであるか、機能的断片であるか、あるいは置換、挿入および／もしくは付加、欠失、ならびに／または野生型ＩＬ－１２ＡもしくはＩＬ－１２Ｂ配列に関する共有結合修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドのカルボキシ、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基が削除され、それにより断片が提供される。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２ポリペプチドは、ＩＬ－１２Ａおよび／またはＩＬ－１２Ｂアミノ酸配列の置換バリアントを含み、これは、１つ、２つ、３つ、または３つを超える置換を含み得る。いくつかの実施形態において、置換バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態において、バリアントは挿入バリアントである。他の実施形態において、バリアントは欠失バリアントである。

当業者によって認識されるように、ＩＬ－１２タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、および相同タンパク質（オルソログ）もまた、本開示のＩＬ－１２ポリペプチドの範囲内であると考えられる。本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なＩＬ－１２ポリペプチドの非限定的な例は、配列番号２～３に示されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号２および３に示されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２ポリペプチドを含む。

インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む。ＩＬ－１５は、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであり、効果的な免疫応答の発達に重要な役割を果たす。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：２１９－２２７（２０１５）。ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の適切な成長とメモリＣＤ８＋Ｔ細胞の長期維持に不可欠である。ＩＬ－１５遺伝子は、４８個のアミノ酸のシグナルペプチドを有する１６２個のアミノ酸のプレタンパク質をコードし、成熟タンパク質の長さは１１４個のアミノ酸である。Ｂａｍｆｏｒｄ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２８９７－２９０２（１９９６）。例えば、ホモサピエンスＩＬ１５転写バリアント３ｍＲＮＡ配列についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５８５を、対応するＩＬ１５アイソフォーム１プレプロタンパク質についてはＮＰ＿０００５７６も参照のこと。

ＩＬ－１５は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と特定の構造的類似性を共有している。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）を介してシグナルを伝達する。しかしながら、ＩＬ－２とは異なり、ＩＬ－１５はそれ自体でＣＤ１２２およびＣＤ１３２と効果的に結合することはできない。ＩＬ－１５は、最初にＩＬ－１５アルファ受容体サブユニット（ＩＬ－１５Ｒα）に結合する必要がある。ＩＬ－１５Ｒα遺伝子は、３０個のアミノ酸のシグナルペプチドを有する２６７個のアミノ酸のプレタンパク質をコードし、成熟タンパク質の長さは２３７個のアミノ酸である。例えば、ホモサピエンスＩＬ－１５Ｒα転写バリアント１ｍＲＮＡについてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１８９を、ホモサピエンスＩＬ－１５Ｒαアイソフォーム１前駆体アミノ酸配列についてはＮＰ＿００２１８０を参照のこと。

ヒトＩＬ－１５Ｒαは主に、活性化樹状細胞および単球などの細胞の表面上でＩＬ－１５に結合する膜貫通型タンパク質である。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３：２１９－２２７（２０１５）。次に、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαの膜結合錯体は、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２サブユニットにトランスでＩＬ－１５を提示する。したがって、ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－１５活性の必須構成要素である。

全身注射されたＩＬ－１５の短い半減期を克服するために、ＩＬ－１５と可溶性組換えＩＬ－１５Ｒａとを事前に錯体化して、ＩＬ－１５スーパーアゴニスト（ＩＬ－１５ＳＡ）を生成することは、ＩＬ－１５の全身効力を約５０倍増強することが示されており、全身注射後の血清中のサイトカインの半減期を約２０時間に延長する。（Ｓｔｏｋｌａｓｅｋｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７７（９）：６０７２，２００６；Ｄｕｂｏｉｓｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８０（４）：２０９９，２００８；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎｅｔ．ａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３（２４）：９１６６，２００６。）

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインは、ＩＬ－１５ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５ポリペプチドは、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαを含むＩＬ－１５スーパーアゴニストである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５スーパーアゴニストは、配列番号４および５に示されるアミノ酸配列を含む。

インターフェロン
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、インターフェロン（ＩＦＮ）である。インターフェロンは、トール様受容体（ＴＬＲ）の刺激により、特定の細胞外刺激に応答して誘導される分泌タンパク質のファミリーを含む。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、免疫系の抗ウイルス防御（例えば、抗原提示）を高める。ＩＦＮは、高親和性の細胞表面受容体を介して、シグナル伝達分子を使用して遺伝子を刺激する。免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインとして使用するのに好適なインターフェロンには、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＦＮ－アルファが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＦＮ－ガンマポリペプチドを含む。ＩＦＮ－ガンマは、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの様々な免疫細胞によって産生される。ＩＦＮ－ガンマは細胞表面の特定の受容体と相互作用し、免疫調節効果を生み出すシグナル伝達経路を活性化する。したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＦＮ－ガンマポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－ガンマポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＦＮ－アルファポリペプチドを含む。ＩＦＮ－アルファは、Ｂリンパ球、ヌルリンパ球、およびマクロファージによって産生され、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性とともに、ＮＫ細胞を活性化する。したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＦＮ－アルファポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－アルファポリペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。

免疫細胞分化刺激因子
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、免疫細胞分化刺激因子である。いくつかの実施形態において、免疫細胞分化刺激因子は、造血前駆細胞の分化、発達、および免疫細胞の特定のサブタイプへの増殖を引き起こす細胞内シグナル伝達経路を活性化する。本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫細胞分化刺激因子には、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）およびＦＬＴ３Ｌ（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３配位子）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドである。ＧＭ－ＣＳＦは、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、および線維芽細胞から分泌される単量体糖タンパク質である。ＧＭ－ＣＳＦは、造血前駆細胞の成長刺激と分化の機能に加えて、ＧＭ－ＣＳＦ受容体を発現する免疫細胞に様々な影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＦＬＴ３Ｌポリペプチドである。ＦＬＴ３は、未成熟な造血前駆細胞によって発現される受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＦＬＴ３Ｌは膜貫通型タンパク質または可溶性タンパク質であり、骨髄の造血細胞および間質細胞を含む多数の細胞によって発現される。ＦＬＴ３Ｌは、他の成長因子と組み合わせて、骨髄およびリンパ球前駆細胞、樹状細胞、ならびにＮＫ細胞を含む様々な細胞型の増殖と発達を刺激する。いくつかの実施形態において、ＦＬＴ３Ｌポリペプチドは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、Ｇ－ＣＳＦポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｇ－ＣＳＦは、好中球顆粒球の増殖、分化および機能的活性化を調節する。いくつかの実施形態において、Ｇ－ＣＳＦポリペプチドは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。

ケモカイン
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ケモカインである。いくつかの実施形態において、ケモカインは、応答性細胞（例えば、白血球）の指向性走化性を誘導するタンパク質である。一般に、ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、（Ｘ）Ｃ、およびＣＸ３Ｃの４つのサブファミリーに分類される。ＣＸＣケモカインでは、１つのアミノ酸が最初の２つのシステイン（「ＣＸＣモチーフ」）を分離する。ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２ケモカイン受容体の配位子であり、ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインと特異的に結合するＧタンパク質共役型７回膜貫通ドメイン型受容体である。７つのヒトＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ヒトＧｒｏ－アルファ（ＣＸＣＬ１としても知られる）、ヒトＧｒｏ－ベータ（ＣＸＣＬ２としても知られる）、ヒトＧｒｏ－ガンマ（ＣＸＣＬ３としても知られる）、ヒトＥＮＡ－７８（ＣＸＣＬ５としても知られる）、ヒトＧＣＰ－２（ＣＸＣＬ６とも呼ばれる）、ヒトＮＡＰ－２（ＣＸＣＬ７とも呼ばれる）、およびヒトＩＬ－８（ＣＸＣＬ８とも呼ばれる）である。すべてのＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインはＣＸＣＲ２受容体と結合する。さらに、一部のＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインはＣＸＣＲ１受容体およびＣＸＣＲ２受容体の両方（つまり、ＣＸＣＬ６とＣＸＣＬ８）と結合し、これらはいずれも活性化経路の冗長性に寄与する。５つのマウスＥＬＲ＋ＣＸＣケモカインは、ケラチノサイト化学誘引物質（ＫＣ）（ＣＸＣＬ１としても知られている）、マクロファージ炎症性タンパク質－２（ＭＩＰ－２）（ＣＸＣＬ２としても知られている）、樹状細胞炎症性タンパク質－１（ＤＣＩＰ－１）（ＣＸＣＬ３としても知られている）、リポ多糖誘導性ＣＸＣケモカイン（ＬＩＸ）（ＣＸＣＬ５としても知られている）、および好中球活性化ペプチド－２（ＮＡＰ－２）（ＣＸＣＬ７としても知られている）である。

本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なケモカインには、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－１ベータ、ＫＰ（ＣＸＬＣ１）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＩＰ－１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＣＰ－１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸおよびＭＩＰ－１アルファを含むが、これらに限定されない。

本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質の免疫調節ドメインとして使用するのに好適な例示的なケモカインをコードするアミノ酸を以下に記載する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーの細胞外ドメインである。腫瘍壊死因子スーパーファミリーの配位子および受容体は、配位子－受容体錯体の三量体クラスターの形成によりシグナルを伝達する一連の構造的に相同な細胞表面タンパク質である。ＴＮＦスーパーファミリー受容体を活性化するライゲーションは、増殖、エフェクター機能の増強、ならびにケモカインおよびサイトカインの産生など、幅広い免疫誘発（ｐｒｏ－ｉｍｍｕｎｅ）応答を引き起こす可能性がある。Ｆａｓなどの一部の配位子はアポトーシスの誘導につながる可能性があり、免疫細胞の表面上に発現する。追加的に、他の配位子は免疫応答を弱める阻害性受容体として機能する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ＴＮＦ－アルファ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ－アルファ、ＬＴ－ベータ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２またはＧＩＴＲＬに由来する。細胞外ドメインは、選択されたＴＮＦスーパーファミリーメンバーの受容体と結合し、それにより免疫応答を誘導または刺激することができる。

以下の表は、派生した細胞外ドメインに対応する受容体を示している。

ＣＤ２８ファミリー
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８ファミリーのメンバーの細胞外ドメインである。ＣＤ２８ファミリーは、Ｂ７ファミリーの配位子のメンバーに結合する阻害性（ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４）および活性化（ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）受容体のファミリーである。ＣＤ２８は、（ＴＣＲのライゲーションとともに）ナイーブＴ細胞を活性化するために必要な２番目のシグナルを提供する共刺激受容体であり、ＣＤ８０およびＣＤ８６の２つの天然配位子を有する。ＣＤ２８シグナル伝達は、増殖、エフェクター機能、および抗アポトーシスシグナル伝達を増加させるのに役立ち得る。ＣＤ２８シグナル伝達は、効果的なＰＤ１／ＰＤＬ１遮断に必要であることが最近示された。ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子）は、活性化Ｔ細胞で発現し、ＣＤ２８と同様の機能を示す密接に関連した表面受容体である。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ８０（Ｂ７－１）の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を含む。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ２８と結合することができる、ＣＤ８６（Ｂ７－２）の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含む。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＩＣＯＳＬＧの細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含む。

アゴニスト抗体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、アゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。アゴニスト抗体は、それらの標的の機能を遮断するアンタゴニスト抗体とは対照的に、目的の標的を活性化する。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、免疫活性化受容体に結合する。いくつかの実施形態において、免疫活性化受容体には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、ＣＤ２８ファミリーメンバー、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体、Ｆｃ受容体、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）、および活性化Ｓｉｇｌｅｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。ＴＮＦスーパーファミリーは上記に記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＴＮＦＲ１に結合し、それにより受容体を活性化するアゴニスト抗体または抗原結合断片である。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＴＮＦスーパーファミリーメンバー受容体を列挙している。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、抗４－１ＢＢアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ４０アゴニスト抗体である。

ＣＤ２８受容体スーパーファミリー
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８スーパーファミリー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。ＣＤ２８スーパーファミリーは上記に記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ２８に結合し、それにより受容体を活性化するアゴニスト抗体または抗原結合断片である。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＣＤ２８スーパーファミリーメンバー受容体を列挙している。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）錯体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）錯体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞に抗原特異性を与える役割を担う細胞表面受容体である。各ＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合）またはＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合）のいずれかによって提示される特定のペプチドに特異的である。ナイーブＴ細胞の場合、ＴＣＲのライゲーションは、Ｔ細胞を活性化するために必要な２つのシグナルのうちの最初のものを提供する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲライゲーションは、パーフォリンおよびグランザイムＢなどの可溶性因子の放出、ならびにＦａｓ配位子などのアポトーシス誘導配位子の上方調節により、同族のｐＭＨＣ（および潜在的にバイスタンダー細胞）を表示する細胞の死をもたらす。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の場合、ＴＣＲとその同族のｐＭＨＣをライゲーションすると、サイトカインが放出される。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＴＣＲに結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。例えば、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ３γに結合し、それにより受容体を活性化するアゴニスト抗体または抗原結合断片である。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＴＣＲ錯体のメンバーを列挙している。

キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、主にＮＫ細胞およびＴ細胞の一部のサブセットで発現する受容体のファミリーである。これらの受容体は、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）分子に結合することにより、主に自己の認識（したがって抑制機能）に関与する。これらの受容体は、細胞質尾部の長さに応じて、活性化または阻害性のいずれかになる。阻害性受容体は、尾部が長く、ＩＴＩＭドメインを含有する。活性化ＫＩＲは、細胞質ドメインがより短く、ＤＡＰ１２と結合してシグナル伝達を媒介する。

本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができる活性化ＫＩＲが以下の表に示されている。

白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。ＬＩＲ受容体は、主に自然免疫細胞上で発現する免疫受容体の一種である。それらの主要な配位子はＭＨＣクラスＩ分子であり、活性化機能を有するものもあるが、主に阻害機能を示す。例えば、ＬＩＲＡ２は、微生物プロテアーゼによって切断された免疫グロブリン断片の先天的なセンサーとして機能する。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＬＩＲＡ２に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、ＬＩＲＡ２に結合することができる抗体は、ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＱ８Ｎ１４９に基づいて生成することができる。

ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２は、ＮＫ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の一部のサブセットの表面上で発現するヘテロ二量体Ｃ型レクチン受容体である。それらはＨＬＡ－Ｅ分子（非古典的ＭＨＣクラスＩ分子）に結合し、阻害性シグナルおよび活性化シグナルの両方をＮＫ細胞に伝達することができる。阻害性受容体は細胞質尾部にＩＴＩＭドメインを含有し、活性化受容体はＩＴＡＭドメインを含有するＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０と結合する。

本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができる活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体が以下の表に示されている。

いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２配位子の細胞外ドメインである。以下の表は、派生した細胞外ドメインに対応する受容体を示している。

Ｆｃ受容体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、Ｆｃ受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。Ｆｃ受容体は、主に自然免疫細胞に発現する免疫細胞受容体であり、これらは抗体の定常領域に結合し、幅広い機能を引き出す。Ｆｃ受容体はほぼ独占的に活性化受容体である（阻害性シグナルを伝達するＦｃγＲＩＩＢを除く）。Ｆｃ受容体のライゲーションは、ＡＤＣＣ、食作用、脱顆粒、およびエフェクター機能を高める活性化シグナルの伝達を引き起こす可能性がある。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＦｃ受容体を列挙している。

シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。ＳＬＡＭ受容体は、受容体および配位子の両方として機能する一連の分子である。ＳＬＡＭ分子は、隣接する細胞上で互いに相互作用して、活性化または阻害性シグナルを送信する。ＳＬＡＭ分子は、細胞質尾部に免疫受容体チロシンベースのＳｗｉｔｈモチーフを含有し、細胞内で活性化シグナル伝達分子および阻害性シグナル伝達分子の両方との結合を可能にする。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＳＬＡＭ受容体を列挙している。

いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＳＬＡＭ配位子の細胞外ドメインである。以下の表は、派生した細胞外ドメインに対応する受容体を示している。

Ｓｉｇｌｅｃファミリー受容体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、Ｓｉｇｌｅｃファミリー受容体に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。Ｓｉｇｌｅｃは、レクチンファミリー（糖結合タンパク質）の一部である免疫細胞に主に見られる表面受容体のファミリーである。これらの受容体は、シアル酸含有配位子に結合する。これらの受容体は、主に広範囲の免疫細胞型の阻害性受容体として機能するが、一部（ｓｉｇｌｅｃ１４、１５、および１６）はＩＴＡＭ活性化ドメインを含有する。

本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができる活性化Ｓｉｇｌｅｃ受容体を以下の表に示す。

アンタゴニスト抗体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。アンタゴニスト抗体は、それらの標的の機能を遮断する。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、免疫阻害性受容体に結合し、それにより、免疫応答の誘導を可能にする。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、免疫阻害性配位子に結合し、それにより、免疫応答の誘導を可能にする。いくつかの実施形態において、免疫阻害剤受容体および配位子には、ＣＤ２８受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー受容体、Ｓｉｇｌｅｃ受容体、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、Ｆｃ受容体、アデノシン経路分子、他のチェックポイント阻害剤、およびＬＡＩＲ１が含まれるが、これらに限定されない。

ＣＤ２８分子
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ２８分子と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、ＣＤ２８ファミリーには活性化分子および阻害性分子の両方が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＣＤ２８分子を列挙している。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＰＤ－１と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＰＤ－Ｌ１と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＴＬＡ－４と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。

ＴＮＦスーパーファミリー分子
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーと結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、ＴＮＦスーパーファミリーは、活性化分子および阻害性分子の両方を含む。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＴＮＦスーパーファミリー分子を列挙している。

Ｓｉｇｌｅｃ受容体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、Ｓｉｇｌｅｃ受容体と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、Ｓｉｇｌｅｃファミリーには活性化分子および阻害性分子の両方が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＳｉｇｌｅｃ受容体を列挙している。

ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーには活性化分子および阻害性分子の両方が含まれている。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ２６７１５に基づいて生成される。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂと結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＱ１３２４１に基づいて生成される。

白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、ＬＩＲファミリーには活性化分子および阻害性分子の両方が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＬＩＲを列挙している。

キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、ＫＩＲファミリーには活性化分子および阻害性分子の両方が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができるＫＩＲを列挙している。

Ｆｃ受容体
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、Ｆｃ受容体と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。上記のように、Ｆｃ受容体のファミリーには、活性化分子および阻害性分子の両方が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、阻害性分子に拮抗することにより、免疫応答が誘導または刺激される。

いくつかの実施形態において、阻害剤Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢと結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ３１９９４に基づいて生成される。

アデノシン経路分子
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、アデノシン経路のメンバーと結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。例えば、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、ＡＴＰのアデノシンへのトランスフェクションを触媒する細胞の表面上に発現する酵素である。細胞外ＡＴＰは免疫応答を誘発する危険な分子であるが、アデノシンは免疫抑制剤である。これらの分子は、アデノシンを生成することにより、局所的な免疫抑制環境に貢献する。

したがって、いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ３９と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ４９９６１に基づいて生成される。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ＣＤ７３と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤＰ２１５８９に基づいて生成される。

他のチェックポイント阻害剤
いくつかの実施形態において、本開示の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な免疫調節ドメインは、免疫チェックポイント阻害剤と結合するアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、そのような免疫チェックポイント阻害剤に拮抗することによって、免疫応答が誘導または刺激される。

以下の表は、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を標的として生成することができる免疫チェックポイント阻害剤を列挙している。

安定化ドメイン
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、１つ以上の免疫調節ドメインおよび安定化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、免疫調節融合タンパク質の発現を促進または増加させるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、発現後の免疫調節融合タンパク質の折り畳みを促進または維持することにより、免疫調節融合タンパク質の発現を促進または増加させる。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、発現後の免疫調節融合タンパク質の凝集を防止または減少させることにより、免疫調節融合タンパク質の発現を促進または増加させる。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、発現後の免疫調節融合タンパク質の分解を防止または減少させることにより、免疫調節融合タンパク質の発現を促進または増加させる。

いくつかの実施形態において、安定化ドメインを含む免疫調節融合タンパク質をコードする組換え核酸でトランスフェクトされた宿主細胞は、安定化ドメインを欠く免疫調節融合タンパク質をコードする組換え核酸でのトランスフェクションと比較して発現が増加している。いくつかの実施形態において、発現は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。いくつかの実施形態において、発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍増加する。

いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、発現および単離後の免疫調節融合タンパク質の安定性を促進または増加させるポリペプチドを含む。タンパク質の安定性を測定する方法は当技術分野で知られており、示差走査熱量測定、円二色性分光法、熱シフト分析、質量分析、または活性ベースのアッセイが含まれる。

本開示に有用な安定化ドメインは、治療される患者に免疫応答を誘導しない非免疫原性タンパク質ドメインである。例示的な安定化ドメインを以下にさらに説明する。

血清アルブミン
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、血清アルブミンまたはその断片である安定化ドメインを含む。血清アルブミンをタンパク質に融合する方法は、例えば、ＵＳ２０１０／０１４４５９９、ＵＳ２００７／００４８２８２、およびＵＳ２０１１／００２０３４５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはそのバリアントもしくは断片であり、例えば、ＵＳ５，８７６，９６９、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６、およびＷＯ２０１１／０５１４７８９に開示されているものである。

免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なアルブミンは、ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、またはブタに由来し得る。いくつかの実施形態において、アルブミンは、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（配列番号８８）、霊長類血清アルブミン（例えば、チンパンジー血清アルブミン、ゴリラ血清アルブミン）、げっ歯類血清アルブミン（例えば、ハムスター血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミンおよびラット血清アルブミン）、ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ロバ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミンおよびブタ血清アルブミン。

いくつかの実施形態において、アルブミン、またはそのバリアントもしくは断片は、配列番号８８に示されるような野生型ＨＳＡの配列に対して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態において、アルブミンバリアントにおける改変、例えば、置換、挿入、または欠失の数は、対応する野生型アルブミン（例えば、ＨＳＡ）と比較して、１～２０個、例えば１～１０個および１～５個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の改変である。

いくつかの実施形態において、アルブミンの断片、またはそのバリアントの断片は、免疫調節融合タンパク質での使用に好適である。例示的なアルブミン断片は、ＷＯ２０１１／１２４７１８に開示されている。いくつかの実施形態において、アルブミンの断片（例えば、ＨＳＡの断片）は、少なくとも２０個のアミノ酸、例えば、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、または少なくとも５００個のアミノ酸の長さである。

いくつかの実施形態において、アルブミン断片は、アルブミンの少なくとも１つの全体のサブドメインを含み得る。ＨＳＡのドメインは組換えタンパク質として発現されており（Ｄｏｃｋａｌｅｔａｌ．，ＪＢＣ１９９９；２７４：９３０３－１０）、ドメインＩは、ＨＳＡ（配列番号８８）のアミノ酸１～１９７からなるものとして定義され、ドメインＩＩは、アミノ酸１８９～３８５からなるものとして定義され、ドメインＩＩＩは、アミノ酸３８１～５８５からなるものとして定義された。ドメインの部分的な重複は、ドメインＩとＩＩとの間、およびドメインＩＩとＩＩＩとの間に存在する拡張α－ヘリックス構造（ｈ１０－ｈ１）が与えられた場合に発生する（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９６、前掲書、表２～４）。ＨＳＡは、６つのサブドメイン（サブドメインＩＡ、ＩＢ、ＮＡ、ＮＢ、ＩＮＡ、およびＮＩＢ）も含む。サブドメインＩＡは配列番号８８のアミノ酸６～１０５を含み、サブドメインＩＢはアミノ酸１２０～１７７を含み、サブドメインＮＡはアミノ酸２００～２９１を含み、サブドメインＮＢはアミノ酸３１６～３６９を含み、サブドメインＩＮＡはアミノ酸３９２～４９１を含み、サブドメインＮＩＢは配列番号８８のアミノ酸５１２～５８３を含む。

いくつかの実施形態において、断片は、上記で定義されるような１つ以上のドメインもしくはサブドメインの全体または一部、あるいはそれらのドメインおよび／またはサブドメインの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アルブミン断片は、アルブミンもしくはアルブミンのドメイン、またはそのバリアントもしくは断片の少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％を含む。

Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適な安定化ドメインは、Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、上記のアゴニストまたはアンタゴニスト抗体の構成要素であり、したがって、別個のＦｃドメインは必要とされない。

特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号９０に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含む。本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質に好適なＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から得ることができる。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号９０に示されている。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、変異体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、変異体、ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインにおける１つ以上の突然変異を含む。いくつかの態様において、変異体ＦｃドメインはＤ２６５Ａ変異を含む。

様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒトの定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な沈着物の形態で利用可能である。Ｆｃドメイン配列を含む定常領域ドメインは、特定のエフェクター機能を欠いて、および／または免疫原性を低減するための特定の修飾を伴って選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＦｃドメイン配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその一部分）は、当技術分野で認められた技術を使用してこれらの配列から誘導することができる。次に、前述の方法のうちのいずれかを使用して得られた遺伝物質を改変または合成して、本明細書に開示された方法で使用するのに好適なポリペプチドを得ることができる。さらに、本開示の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアント、および突然変異を包含することが理解されるであろう。

Ｆｃドメイン配列は、例えば、目的のドメインを増幅するために選択されるポリメラーゼ連鎖反応およびプライマーを使用してクローン化することができる。抗体からＦｃドメイン配列をクローニングするには、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ球様細胞からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡに逆転写し、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅する。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、および、例えば、“ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）；Ｈｏｅｔａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．１９９３．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０に詳細に記載されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始することができる。上記のように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブなどのより大きな相同プローブによってスクリーニングしてもよい。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが当技術分野で知られている（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒａｎｄＰａｓｔａｎ．１９９４．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：１５０９）、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７３：３３）、抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９８９；１６０：１２５０））。抗体配列のクローニングは、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。

いくつかの実施形態において、開示される免疫調節融合タンパク質は、１つ以上のＦｃドメイン（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のＦｃドメイン）を含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、異なる種類のものであり得る。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質に存在する少なくとも１つのＦｃドメインは、ヒンジドメインまたはその一部分を含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはその一部分を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、を（例えば、ヒンジ－ＣＨ２配向で）含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分と、を（例えば、ＣＨ２－ＣＨ３配向で）含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部分と、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部分と、を、例えば、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、ヒンジ－ＣＨ３－ＣＨ２、またはＣＨ２－ＣＨ３－ヒンジ配向で含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも１つの完全なＦｃ領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインであるが、これらは同じ抗体に由来する必要はない）を含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも２つの完全なＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、完全なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、完全なＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、完全なＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくともＣＨ３ドメインと、少なくとも１つのヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。

免疫調節融合タンパク質のＦｃドメインを構成する定常領域ドメインまたはその一部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なポリペプチドは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインまたはその一部分と、ＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３領域またはその一部分と、を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、また部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジドメインを含むＦｃドメインを含む。本明細書に記載されるように、Ｆｃドメインは、天然に存在する抗体分子からアミノ酸配列が変化するように改変され得ることが当業者によって理解されるであろう。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、完全なＦｃ領域の１つ以上の定常領域ドメインを欠いている、すなわち、それらは部分的または完全に欠失している。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＣＨ２ドメイン全体を欠いている。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメイン（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照）をコードするベクター（例えば、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）製）に由来するＣＨ２ドメイン欠失Ｆｃ領域を含む。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメインが欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように設計されている。これらの例示的な構築物は、好ましくは、結合ＣＨ３ドメインをそれぞれのＦｃドメインのヒンジ領域に直接融合するように操作されることに留意されたい。

他の構築物では、１つ以上の構成Ｆｃドメイン間にペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合がある。例えば、ペプチドスペーサーは、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインとの間、および／またはＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間に配置されてもよい。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失しており、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成）が１～２０個、１～１０個、または１～５個のアミノ酸のペプチドスペーサーを用いてヒンジ領域に接合されている、互換性のある構築物を発現させることができる。そのようなペプチドスペーサーは、例えば、定常領域ドメインの調節要素が自由でアクセス可能なままであること、またはヒンジ領域が柔軟なままであることを確実にするために添加してもよい。好ましくは、本開示で使用される任意の適合性のある安定化ドメインペプチドは、比較的非免疫原性であり、Ｆｃの適切な折り畳みを妨げないであろう。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質において使用されるＦｃドメインは、例えば、アミノ酸突然変異（例えば、付加、欠失、もしくは置換）によって改変または修飾される。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメインバリアント」という用語は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃと比較して、アミノ酸置換などの少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＦｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、バリアントは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の対応する位置にある野生型アミノ酸と比較して、少なくとも１つのアミノ酸突然変異（例えば、置換）を含む。

特定の実施形態において、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその一部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。特定の実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその一部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。特定の実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその一部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。特定の実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその一部分に位置するアミノ酸位置での置換を含む。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、複数のアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。免疫調節融合タンパク質は、例えば、Ｆｃドメインにおける２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。好ましくは、アミノ酸置換は、少なくとも１つのアミノ酸位置またはそれ以上、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸位置またはそれ以上の間隔で互いに空間的に配置される。より好ましくは、操作されたアミノ酸は、少なくとも５、１０、１５、２０、もしくは２５個のアミノ酸位置またはそれ以上の間隔で互いに空間的に離れて配置されている。

いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの開始部の配列ＬＬＧＧＰを含む、アミノ酸２３４～２３８の領域の変化を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃバリアントは、Ｆｃ媒介エフェクター機能、特にＡＤＣＣを改変し、かつ／あるいはＦｃ受容体に対する結合力を低下させる。いくつかの態様において、Ｋ３２２またはＰ３３１などの位置でのＣＨ２－ＣＨ３接合により近い配列変化により、補体媒介細胞毒性が排除され、かつ／あるいはＦｃＲ結合の結合力が改変され得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、残基Ｐ２３８およびＰ３３１での変化を組み込んでおり、例えば、これらの位置の野生型プロリンをセリンに変化させる。いくつかの実施形態において、これらの残基でＣＣＣ、ＳＣＣ、ＳＳＣ、ＳＣＳ、またはＳＳＳをコードするための、３つのヒンジシステインのうちの１つ以上でのヒンジ領域の改変もまた、折り畳まれたタンパク質を不安定にする可能性のある不対システインの除去などにより、ＦｃＲ結合と分子の均一性にも影響を与える可能性がある。

Ｆｃドメインにおける他のアミノ酸突然変異は、Ｆｃガンマ受容体およびＦｃガンマ受容体サブタイプへの結合を低減することが企図される。例えば、２００４年５月１８日に発行された米国特許第６，７３７，０５６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｆｃ領域の位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２２、３２４、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３５６、３６０、３７３、３７６、３７８、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９での突然変異は、結合を改変することができる。この特許は、ＩｇＧ３中のＰｒｏ３３１をＳｅｒに変更すると、変異していないＩｇＧ３と比較して親和性が６分の１になることを報告しており、これはＦｃガンマＲＩ結合にＰｒｏ３３１が関与していることを示している。加えて、１９９７年４月２９日に発行されたＵＳ５，６２４，８２１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）では、位置２３４、２３５、２３６、および２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２でのアミノ酸修飾が、受容体結合親和性を潜在的に改変するものとして開示されている。

使用が企図されているさらなる突然変異には、例えば、２００６年１０月１９日に公開された米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものが含まれる。追加的に、米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている突然変異は、使用が企図される。変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａは、例えば、２００３年６月１２日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１０８５４８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。実施形態において、記載された修飾は、個々にまたは組み合わせて含まれる。特定の実施形態において、突然変異は、ヒトＩｇＧ１におけるＤ２６５Ａである。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、例えば野生型Ｆｃ領域と比較して、ポリペプチドの抗原依存性エフェクター機能、特にＡＤＣＣまたは補体活性化を改変するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。このような免疫調節融合タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較した場合、ＦｃＲガンマへの結合の低下を示し、したがって、エフェクター機能の低減を媒介する。ＦｃＲガンマ結合親和性が低下したＦｃバリアントは、エフェクター機能を低減すると予想され、そのような分子は、例えば、正常細胞が標的分子を発現する可能性がある場合またはポリペプチドの慢性的な投与が、望ましくない免疫系の活性化をもたらす可能性がある場合など、標的細胞の破壊が望ましくない状態の治療にも有用である。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、活性化ＦｃγＲ（例えば、Ｆｃγ１、Ｆｃγｌｌａ、またはＦｃγＲＩＩＩａ）への改変された結合を示す。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、阻害性ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）に対して改変された結合親和性を示す。ＦｃＲまたは補体結合活性を改変した例示的なアミノ酸置換は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０６３８１５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、融合タンパク質のグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、グリコシル化の低減（例えば、ＮまたはＯ連結型グリコシル化）をもたらす突然変異を含むか、または野生型Ｆｃドメインの改変された糖型（例えば、低フコースまたはフコース不含グリカン）を含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有するＮ連結型グリコシル化モチーフの近くまたは内部にアミノ酸置換を有する。グリコシル化を低減または改変する例示的なアミノ酸置換は、ＷＯ０５／０１８５７２およびＵＳ２００７／０１１１２８１（それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、溶媒に曝された表面に位置する、操作されたシステイン残基またはその類似体を有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、第２のシステイン残基とのジスルフィド結合を実質的に含まない、少なくとも１つの操作された遊離システイン残基またはその類似体を含むＦｃドメインを含む。上記の操作されたシステイン残基またはその類似体のうちのいずれかは、その後、当技術分野で認められた技術を使用して機能ドメインにコンジュゲートされ得る（例えば、チオール反応性ヘテロ二機能安定化ドメインとコンジュゲートされ得る）。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、本明細書に記載のＦｃドメインから独立して選択されるその構成Ｆｃドメインのうちの２つ以上を有する遺伝的に融合されたＦｃドメインを含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは同じである。特定の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２つは異なる。例えば、Ｆｃドメインは、同じ数のアミノ酸残基を含むか、あるいはそれらは、１つ以上のアミノ酸残基（例えば、約５個のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸性残基）、約１０個の残基、約１５個の残基、約２０個の残基、約３０個の残基、約４０個の残基、または約５０個の残基）分だけ長さが異なる可能性がある。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、１つ以上のアミノ酸位置で配列が異なる。例えば、Ｆｃドメインのうちの少なくとも２つは、約５個のアミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸位置）、約１０個の位置、約１５個の位置、約２０個の位置、約３０個の位置、約４０個位置、または約５０個位置）で異なる可能性がある。

例示的な免疫調節融合タンパク質
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、安定化ドメインは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、免疫調節ドメインまたは安定化ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、金属水酸化物結合ペプチドは、任意選択的にリンカーを介して、免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結され、安定化ドメインは、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、金属水酸化物結合ペプチドまたは免疫調節ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結され、それにより免疫調節融合タンパク質を形成する。

ＩＬ－２融合タンパク質
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－２と、血清アルブミンと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２は、血清アルブミンに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＬ－２または血清アルブミンに作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＮ末端に作動可能に連結されたヒトＩＬ－２を含み、ヒト血清アルブミンのＣ末端またはヒトＩＬ－２のＮ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に作動可能に連結されたヒトＩＬ－２を含み、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはヒトＩＬ－２のＣ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号８８に示されるヒト血清アルブミン配列に作動可能に連結されたヒトＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０３によって示される分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの４つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドをさらに含み、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＬ－２または血清アルブミンに作動可能に連結されている。

ＩＬ－１２融合タンパク質
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ＩＬ－１２と、血清アルブミンと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、血清アルブミンに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＬ－１２または血清アルブミンに作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＮ末端に作動可能に連結されたヒトＩＬ－１２を含み、ヒト血清アルブミンのＣ末端またはヒトＩＬ－１２のＮ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に作動可能に連結されたヒトＩＬ－１２を含み、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはヒトＩＬ－１２のＣ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号８８に示されるヒト血清アルブミン配列に作動可能に連結されたヒトＩＬ－１２を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０３によって示される分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの４つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドをさらに含み、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＬ－１２または血清アルブミンに作動可能に連結されている。

ＩＦＮｇ融合タンパク質
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＦＮｇと、血清アルブミンと、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含む。いくつかの実施形態において、ＩＦＮｇは、血清アルブミンに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＦＮｇまたは血清アルブミンに作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＮ末端に作動可能に連結された２つの作動可能に連結されたヒトＩＦＮｇポリペプチドを含み、ヒト血清アルブミンのＣ末端またはヒトＩＦＮｇのＮ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に作動可能に連結された２つの作動可能に連結されたヒトＩＦＮｇポリペプチドを含み、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはヒトＩＦＮｇのＣ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、２つの作動可能に連結されたヒトＩＦＮｇポリペプチドを含み、２つのＩＦＮｇポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号８８に示されるヒト血清アルブミン配列に作動可能に連結された２つの作動可能に連結されたヒトＩＦＮｇポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０３によって示される分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの４つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドをさらに含み、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＦＮｇまたは血清アルブミンに作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、配列番号１０３によって示される分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの４つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドに作動可能に連結された２つの作動可能に連結されたヒトＩＦＮｇポリペプチドを含み、金属水酸化物結合ペプチドは、ＩＦＮｇまたは血清アルブミンに作動可能に連結されている。

抗体融合タンパク質
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、抗４－１－ＢＢ抗体と、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、抗４－１－ＢＢ抗体は、金属水酸化物結合ペプチドに作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、抗４－１－ＢＢ抗体は、金属水酸化物結合ペプチドのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、抗４－１－ＢＢ抗体は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端に作動可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、抗ＯＸ４０抗体と、ホスフェート基で修飾された分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼモチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、抗ＯＸ４０抗体は、金属水酸化物結合ペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、金属水酸化物結合ペプチドのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、抗ＯＰＸ４０抗体は、金属水酸化物結合ペプチドのＣ末端に作動可能に連結されている。

免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を作製する方法
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、キナーゼ、サイトカイン、抗体、安定化ドメイン、金属水酸化物結合ペプチド）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、トランスフェクトされた宿主細胞において作製される。そうするために、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、ポリペプチドをコードする配列は、好適な制限酵素を使用してＤＮＡから切り出すことができる。代替的に、ホスホルアミデート法などの化学合成技術を使用して、ＤＮＡ分子を合成することができる。また、これらの手法を組み合わせて使用することもできる。

ポリペプチドを作製する方法はまた、適切な宿主においてペプチドを発現することができるベクターを含む。ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子がベクターに挿入される前または後のいずれかで、この機能的連結に影響を与える方法はよく知られている。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。

ＤＮＡ分子をその上に有する得られたベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この変換は、当技術分野で周知の方法を使用して実施され得る。

多数の利用可能な周知の宿主細胞のうちのいずれかが、本明細書に開示される方法での使用に好適である可能性がある。特定の宿主の選択は、当技術分野で認識されている多くの要因に依存している。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収し容易さ、発現特徴、生物学的安全性およびコストが含まれる。すべてのホストが特定のＤＮＡ配列の発現に等しく効果的であるとは限らないことを理解して、これらの要素のバランスをとる必要がある。これらの一般的なガイドラインの範囲内で、有用な微生物宿主には、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉｓｐ．など）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．など）、およびその他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳動物（ヒトを含む）細胞、または当技術分野で知られている他の宿主が含まれる。

次に、形質転換された宿主を培養および精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で培養され得る。そのような発酵条件は当技術分野でよく知られている。最後に、ペプチドを、当技術分野で周知の方法によって培養物から精製する。

化合物はまた、合成法によって作製され得る。例えば、固相合成技術を使用することができる。好適な技術は、当技術分野でよく知られており、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５－６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓａｎｄＰａｎａｙｏｔｉｓｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．（１９８５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４－４１４；ＳｔｅｗａｒｔａｎｄＹｏｕｎｇ（１９６９），ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，９４１，７６３；Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：１０５－２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎｅｔａｌ．（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：２５７－５２７に記載されるものを含む。固相合成は、小さなペプチドを作製する最も費用効果的な方法であるため、個々のペプチドを作製する好ましい手法である。誘導体化されたペプチドを含有するか、または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成してもよい。

他の方法は、分子の発現／合成の方法であり、一般に、当技術分野では通常のスキルの１つとして知られている。

上記の核酸分子は、例えば、ベクターで形質導入された細胞においてそれらの発現を指示することができるベクター内に含有され得る。したがって、ポリペプチド変異体に加えて、変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターおよびこれらのベクターでトランスフェクトされた細胞は、特定の実施形態の中にある。

使用するのに好適なベクターには、細菌で使用するためのＴ７ベースのベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ５６：１２５，１９８７を参照）、哺乳動物細胞で使用するためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅａｎｄＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５２１，１９８８）、および昆虫細胞で使用するためのバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ）製の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫＳ）が含まれる。そのようなベクターにおいて目的のポリペプチドをコードする核酸インサートは、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択されるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、Ｔ７プロモーターは細菌で使用でき、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞で使用でき、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳動物細胞で使用できる。また、高等真核生物の場合、組織特異的および細胞型特異的プロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内の特定の組織または細胞型で核酸分子の発現を指示する能力にちなんで名付けられた。当業者は、核酸の発現を指示するために使用することができる多数のプロモーターおよび他の調節要素をよく知っている。

挿入された核酸分子の転写を促進する配列に加えて、ベクターは、複製起点と、選択可能なマーカーをコードする他の遺伝子と、を含有することができる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ^ｒ）遺伝子は、それが発現される細胞にＧ４１８耐性を付与し、したがって、トランスフェクトされた細胞の表現型の選択を可能にする。当業者は、所与の調節要素または選択可能なマーカーが特定の実験的状況での使用に好適であるか否かを容易に決定することができる。

使用するのに好適なウイルスベクターには、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ならびにウシ乳頭腫ウイルスベクター（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．），ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ、ＣＳＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）を参照）が含まれる。

ポリペプチド変異体をコードする核酸分子を含有し、発現する原核細胞または真核細胞もまた、使用するのに適している。細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば、変異体ポリペプチドをコードする核酸分子が、組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞である。そのような細胞の子孫もまた、本明細書に開示される方法での使用に好適であると考えられる。

発現系の正確な構成要素は、重要ではない。例えば、ポリペプチド変異体は、細菌Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主、または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主において産生され得る。これらの細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）を含む多くの供給源から入手できる。発現系を選択する際に、唯一重要なのは、構成要素が互いに互換性を有することである。職人または通常のスキルは、そのような決定を下すことができる。さらに、発現系を選択する際にガイダンスが必要な場合、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）およびＰｏｕｗｅｌｓｅｔａｌ．（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８５Ｓｕｐｐｌ．１９８７）を参照し得る。

発現されたポリペプチドは、通常の生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、本明細書に記載されるように、例えば、治療薬として使用することができる。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインと、１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、任意選択的に本明細書に記載の安定化ドメインと、を含む免疫調節融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用してトランスフェクト宿主細胞において作製される。そうするために、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。本方法は、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を発現することができるベクターをさらに含む。組換えＤＮＡ分子を含む得られたベクターは、適切な宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させるための本開示によって提供される方法は、免疫節融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、ならびにＥＲ標的化リーダー配列、キナーゼに由来するキナーゼドメインおよびアンカーペプチドを含むキナーゼをコードする組換えＤＮＡ分子で細胞をトランスフェクトすることを含み、キナーゼは、ＥＲ標的化リーダー配列およびアンカーペプチドによって分泌経路に局在し、金属水酸化物結合ペプチドの１つ以上のキナーゼ標的モチーフは、分泌経路のキナーゼによってリン酸化され、それにより免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる。いくつかの実施形態において、キナーゼは、キナーゼを分泌経路に局在させるＥＲ標的化リーダー配列を含む天然に存在するキナーゼである。いくつかの実施形態において、天然に存在するキナーゼは、分泌経路への局在を増加、促進、もしくは改善するため、および／または分泌を減少もしくは防止するために、末端（例えば、Ｃ末端）アンカーペプチドで修飾される。いくつかの実施形態において、本開示のキナーゼは、分泌経路への局在を増加、促進、もしくは改善するため、および／または分泌を低減または防止するために、ＥＲ標的化リーダー配列で修飾された任意のキナーゼドメインと、アンカーペプチドと、を含む。

いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、およびＥＲ標的化リーダー配列、キナーゼドメイン、および細胞をトランスフェクトするために使用されるアンカーペプチド、を含むキナーゼをコードする組換えＤＮＡ分子は、同じまたは異なる。

したがって、いくつかの実施形態において、本開示のそのような方法に従って調製される免疫調節融合タンパク質は、免疫調節ドメインと、リン酸化アミノ酸を含む分泌経路キナーゼの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドと、任意選択的に安定化ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質は、金属水酸化物結合ペプチドの少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を介した金属水酸化物（例えば、ミョウバン）との配位子交換を受け、それにより、免疫調節融合タンパク質を金属水酸化物（例えば、ミョウバン）にカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインと、任意選択的に安定化ドメインと、を含む、免疫調節融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用してトランスフェクト宿主細胞中で作製され、少なくとも１つのヒドロキシル置換基と、ポリペプチド反応性部分と、任意選択的にリンカーと、を含む金属水酸化物結合ペプチドとさらにカップリングされ、それにより、免疫調節ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、任意選択的に安定化ドメインと、を含み、少なくとも１つのヒドロキシル置換基を介して金属水酸化物（例えば、ミョウバン）との配位子交換を受けて、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質を調製する。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインと、任意選択的に安定化ドメインと、を含む免疫調節融合タンパク質は、免疫調節融合タンパク質がポリペプチド反応性部分と反応する能力を作製するか、または増加させるために、天然形態では存在しない１つ以上のアミノ酸（例えば、システイン）を含むように修飾される。

いくつかの実施形態において、ポリペプチド反応性部分に、任意選択的にリンカーを介して、作動可能に連結される少なくとも１つのヒドロキシル置換基（例えば、リン酸化アミノ酸）を含む本開示の金属水酸化物結合ペプチドは、免疫調節ドメインと、任意選択的に安定化ドメインと、を含む免疫調節融合タンパク質と反応し、ポリペプチド反応性部分は、任意選択的にリンカーを含む金属水酸化物結合ペプチドを免疫調節融合タンパク質に架橋する。

ポリペプチドを修飾するのに特によく適している、当技術分野で知られているこの修飾を達成する１つの非限定的な方法は、反応性部分（例えば、システイン、－ＳＨ）を提供する免疫調節融合タンパク質にアミノ酸を含めることによる、および反応性部分を含む修飾免疫調節融合タンパク質を、任意選択的にリンカーを介して金属水酸化物結合ペプチドに作動可能に連結されたポリペプチド反応性部分とさらに接触させることによるものである。当技術分野で知られているこの修飾を達成する別の非限定的な方法は、ソルターゼ認識モチーフであるポリペプチド反応性部分を含む金属水酸化物結合ペプチドを有する組換えソルターゼによって触媒される反応を可能にする免疫調節融合タンパク質に、末端アミノ酸の短い配列（例えば、グリシンまたはアラニンアミノ酸の配列）を含め、それにより、免疫調節融合タンパク質と金属水酸化物結合ペプチドとの間に共有結合的連結を形成することによるものである。

いくつかの実施形態において、本開示は、その天然形態で１つ以上のヒドロキシル置換部分を含む免疫調節融合タンパク質が、配位子交換吸着の速度を増加させるか、または金属水酸化物への免疫調節融合タンパク質の吸着の強度を増加させるために本発明に従って修飾され得ることを企図する。

薬学的組成物および投与様式
特定の実施形態において、本開示は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントを有する免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、医薬的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントを有する免疫調節融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。

特定の実施形態において、許容可能な配合物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒である。特定の実施形態において、配合物材料は、ｓ．ｃ．および／またはＩ．Ｖ．投与用である。特定の実施形態において、配合物材料は、局所投与、例えば、腫瘍内投与用である。特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着もしくは浸透を修正、維持または保存するための配合物材料を含有することができる。特定の実施形態において、好適な配合物材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ボラート、バイカーボネート、トリス－ＨＣｌ、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸など）；増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；フィラー；単糖；二糖類；およびその他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）；着色剤、香料および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩を形成する対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなどのポリソルベートなど）；安定性向上剤（ショ糖もしくはソルビトールなど）；張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬品アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９９５）。特定の実施形態において、配合物は、ＰＢＳ；２０ｍＭのＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２；５０ｍＭのＮａＣｌ；および／または１０ｍＭのＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。特定の実施形態において、最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（前掲）を参照のこと。特定の実施形態において、そのような組成物は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む配合物は、対象に投与される場合、４℃～３７℃である。

特定の実施形態において、薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、特定の実施形態において、適切なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与用組成物に一般的な他の材料が補充される可能性がある。特定の実施形態において、生理食塩水は、等張性リン酸緩衝生理食塩水を含む。特定の実施形態において、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の実施形態において、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これは、ソルビトールまたはそれ故に適切な代替物をさらに含むことができる。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｇｅｎｔｓ）（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（前掲））と混合することによって貯蔵のために調製される。さらに、特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として配合される。

特定の実施形態において、薬学的組成物は、非経口送達のために選択される。特定の実施形態において、組成物は、経口などの消化管を介した吸入または送達のために選択される。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。

特定の実施形態において、配合物の構成要素は、投与部位に許容される濃度で存在する。特定の実施形態において、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。

特定の実施形態において、非経口投与が企図される場合、治療用組成物は、製薬上許容されるビヒクル中の、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態である。特定の実施形態において、非経口注射のためのビヒクルは、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質が、適切に保存された無菌の等張液として配合される滅菌蒸留水である。特定の実施形態において、調製は、デポー注射を介して送達できる製品の制御放出または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤を用いた所望の分子の配合を含み得る。特定の実施形態において、ヒアルロン酸を使用することもでき、このヒアルロン酸は循環中の持続時間の持続を促進する効果を有することができる。特定の実施形態において、移植可能な薬物送達デバイスは、所望の分子を導入するために使用され得る。

特定の実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために配合される。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、吸入用の乾燥粉末として配合される。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む吸入溶液は、エアロゾル送達のための噴射剤とともに配合される。特定の実施形態において、溶液を噴霧することができる。肺内投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺への送達について記載しているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されている。

特定の実施形態において、配合物を経口投与することが企図される。特定の実施形態において、この様式で投与される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の配合において通常使用されるこれらの担体の有無にかかわらず配合される。特定の実施形態において、カプセルは、生物学的利用能が最大となり、全身に入る前（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ）の分解が最小となるときに、胃腸管内の場所（ｐｏｉｎｔ）で配合物の活性部分を放出するように設計されている。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質の吸収を促進するために、少なくとも１つの追加の薬剤が含まれる。特定の実施形態において、希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用することができる。

特定の実施形態において、薬学的組成物は、錠剤を製造するのに好適な非毒性賦形剤との混合物中の有効量の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、溶液は単位剤形で調製される。特定の実施形態において、好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、あるいはデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定されない。

持続送達または制御送達配合物中の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む配合物を含む、追加の薬学的組成物は、当業者には明らかであろう。特定の実施形態において、リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射などの様々な他の持続送達または制御送達手段を配合するための技術もまた、当業者に知られている。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出を記載しているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。特定の実施形態において、持続放出型調製物には、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが含まれ得る。持続放出型マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸およびガンマエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７－５５６（１９８３））、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．、前掲）、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が含まれ得る。特定の実施形態において、持続放出型組成物は、当技術分野で知られているいくつかの方法のうちのいずれかによって調製され得るリポソームを含む。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８－３６９２（１９８５）、ＥＰ０３６，６７６、ＥＰ０８８，０４６、およびＥＰ１４３，９４９を参照のこと。

インビボ投与に使用される薬学的組成物は、通常、無菌である。特定の実施形態において、これは、滅菌濾過膜による濾過によって達成される。組成物が凍結乾燥される特定の実施形態において、本方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われる。特定の実施形態において、非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液中に保存され得る。特定の実施形態において、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。

特定の実施形態において、薬学的組成物が配合されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保存され得る。特定の実施形態において、そのような配合物は、すぐに使用できる形態、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。

特定の実施形態において、キットは、単回投与投与ユニットを製造するために提供される。特定の実施形態において、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性配合物を有する第２の容器の両方を含むことができる。特定の実施形態において、シングルチャンバーおよびマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅｓ））を含むキットが含まれる。

特定の実施形態において、治療に使用される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の状況および目的に依存するであろう。したがって、当業者は、特定の実施形態による、治療のための適切な投薬量レベルが、送達される分子、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面もしくは器官のサイズ）および／または状態（年齢および健康全般）に部分的に依存して変化することを理解するであろう。特定の実施形態において、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し、投与経路を変更することができる。

特定の実施形態において、投薬の頻度は、使用される配合物中の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質の薬物動態学的パラメータを考慮に入れるであろう。特定の実施形態において、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、特定の実施形態において、組成物は、単回投与として、または経時的に２回以上の投与（同量の所望の分子を含有する場合も含有しない場合もある）として、あるいは移植デバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として投与することができる。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって日常的に行われ、当業者が日常的に実行するタスクの範囲内にある。特定の実施形態において、適切な用量反応データを使用することにより、適切な投薬量を確認することができる。

特定の実施形態において、薬学的組成物の投与経路は、既知の方法と一致しており、例えば、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内もしくは病巣内経路、持続放出型システム、または移植デバイスによるものである。特定の実施形態において、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。特定の実施形態において、併用療法の個々の要素は、異なる経路によって投与してもよい。

特定の実施形態において、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収されるか、もしくはカプセル化された別の適切な材料の移植により、局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される特定の実施形態において、デバイスは、任意の好適な組織または器官に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放ボーラスまたは連続投与を介して行うことができる。特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質をエクスビボ様式で含む薬学的組成物を使用することが望ましい場合がある。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織および／または器官を、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体もしくは免疫調節融合タンパク質を含む薬学的組成物に曝露し、その後、細胞、組織および／または器官を患者に移植して戻す。

特定の実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、ポリペプチドを発現および分泌するために、本明細書に記載されるような方法を使用して、遺伝子操作された特定の細胞を移植することによって送達される。特定の実施形態において、そのような細胞は、動物またはヒトの細胞であり得、自家細胞、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）細胞、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）細胞であり得る。特定の実施形態において、細胞は不死化することができる。特定の実施形態において、免疫応答の可能性を減らすために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するべくカプセル化され得る。特定の、カプセル化材料は、典型的には、タンパク質産物実施形態においての放出を可能にするが、患者の免疫系もしくは周囲の組織からの他の有害な要因による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャまたは膜である。

治療の方法
本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、および／もしくは免疫調節融合タンパク質を発現する核酸、または本明細書に記載されるそれらの組成物は、異常なアポトーシスもしくは分化プロセス（例えば、細胞増殖性障害（例えば、過剰増殖性障害）もしくはがんなどの細胞分化性障害）に関連する障害を治療するために有用である。本開示の方法による治療に適しているがんの非限定的な例を以下に説明する。

細胞増殖性および／または分化性障害の例には、がん（例えば、がん腫、肉腫、転移性障害または造血性新生物性障害（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、例えば、白血病）が含まれる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓の腫瘍を含むがこれらに限定されない、多数の原発腫瘍型から発生する可能性がある。したがって、例えば、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を含む、本明細書で使用される組成物は、がんを有する患者に投与することができる。

本明細書で使用される場合、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」、および「新生物性」という用語は、自律成長（すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状態または状況）の能力を有する細胞を指す。過剰増殖性および新生物性の病状は、病的（すなわち、病状を特徴付けるまたは構成する）として分類され得るか、または非病的（すなわち、正常からの逸脱であるが病状とは関連しない）として分類され得る。この用語は、組織病理学的種類または浸潤性の段階に関係なく、すべての種類のがん性成長もしくは発がん過程、転移性組織、または悪性形質転換細胞、組織もしくは器官を含むことを意味する。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍の成長を特徴とする病状で発生する。非病理学的過剰増殖細胞の例には、創傷修復に関連する細胞の増殖が含まれる。

「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ組織、胃腸器官、および泌尿生殖器に影響を与えるものを含む様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがんおよび食道のがんなどの悪性腫瘍を含むと一般に考えられている腺癌を指すために使用される。

「がん腫」という用語は、当技術分野で認識されており、呼吸器系がん腫、胃腸系がん腫、泌尿生殖器系がん腫、精巣がん腫、乳がん腫、前立腺がん腫、内分泌系がん腫、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質またはそれらの組成物は、腎がん腫もしくは黒色腫、または任意のウイルス性疾患を含むあらゆるがん腫を有する、有することが疑われる、または発症するリスクが高い可能性がある患者を治療するために使用することができる。例示的ながん腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるがん腫が含まれる。この用語には、がん性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含むがん肉腫も含まれる。「腺癌」は、腺組織に由来するがん腫、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。

増殖性障害の追加の例には、造血性新生物性障害が含まれる。本明細書で使用される場合、「造血性新生物性障害」という用語は、例えば、骨髄、リンパ球もしくは赤芽球系統、またはそれらの前駆細胞から生じる造血起源の過形成／新生物性細胞を含む疾患を含む。好ましくは、疾患は、低分化型急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。追加の例示的な骨髄性障害には、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎＯｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７－９７で概説されている）が含まれるが、これらに限定されない。リンパ性悪性腫瘍には、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）、およびウォルデンストロムマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫の追加の形態には、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリードスタンバーグ（Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）病が含まれるが、これらに限定されない。

腫瘍の成長およびサイズを低減するのに十分な免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質もしくはそれらの組成物の量、または治療有効量は、選択された特定の化合物または組成物だけでなく、投与経路、治療される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態に応じて変化し、最終的には患者の医師もしくは薬剤師の裁量に委ねられることが当業者によって理解されるであろう。本発明の方法で使用される化合物が与えられる時間の長さは、個人ごとに異なる。

本明細書で使用されるＢ１６黒色腫モデルは、固形腫瘍の一般化されたモデルであることが当業者によって理解されるであろう。つまり、このモデルでの治療の有効性は、他の非黒色腫固形腫瘍での治療の有効性も予測する。例えば、Ｂａｉｒｄｅｔａｌ．（ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０１３；１９０：４６９－７８；ＥｐｕｂＤｅｃ７，２０１２）に記載されているように、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対する抗腫瘍免疫を媒介する際に適応免疫応答を誘導する寄生虫株であるｃｐｓの有効性は、肺がん腫および卵巣癌のモデルを含む他の固形腫瘍に一般化できることが見出された。別の例では、リンパ球を標的とするＶＥＧＦに関する一連の研究の結果は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における結果が、研究された他の腫瘍型に一般化できることも示している（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＪＣＩ２０１０；１２０：３９５３－６８；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２；１８：１６７２－８３）。さらに別の例では、ＬＡＧ－３およびＰＤ－１を含む免疫療法により腫瘍負荷が低減し、線維肉腫および結腸腺癌細胞株において一般化可能な結果が得られた（Ｗｏｏｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２０１２；７２：９１７－２７）。

特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、またはそれらの組成物は、がんを治療するために使用される。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、またはそれらの組成物は、黒色腫、白血病、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、および脳癌を治療するために使用される。

特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、またはそれらの組成物は、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害する。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、またはそれらの組成物は、腫瘍サイズを低減する。特定の実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質、またはそれらの組成物は、原発腫瘍の転移を阻害する。

本明細書での治療への言及は、記載されたがんおよび症状の予防ならびに治療にまで及ぶことが当業者には理解されるであろう。

併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、他の療法と組み合わせて使用される。例えば、いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、別の免疫療法と組み合わせて使用される。例示的な免疫療法には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、腫瘍関連抗原標的化抗体、免疫チェックポイント阻害剤、およびがんワクチンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、異なる免疫調節ドメインを有する別の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）エフェクター細胞
いくつかの態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）エフェクター細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞）と併せて使用または実行される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を提供する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、遺伝子操作された人工膜貫通受容体であり、これらは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、または他の免疫細胞）に配位子に対する任意の特異性を付与し、認識され、配位子に結合すると、エフェクター細胞を活性化する。通常、これらの受容体は、モノクローナル抗体の抗原特異性をＴ細胞に付与するために使用される。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、３つのドメイン：１）典型的にはシグナルペプチド、配位子または抗原認識領域（例えば、ｓｃＦｖ）、および可撓性スペーサーを含むエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、２）膜貫通（ＴＭ）ドメイン、３）典型的には１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）（代替的に「活性化ドメイン」として知られている）を含む。ＣＡＲのエクトドメインは細胞外に存在し、細胞外空間に曝露しているため、その同族の配位子との相互作用にアクセスできる。ＴＭドメインにより、ＣＡＲをエフェクター細胞の細胞膜に固定することができる。３番目のエンドドメイン（「活性化ドメイン」としても知られている）は、ＣＡＲがその特定の配位子に結合すると、エフェクター細胞の活性化を助ける。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞活性化は、サイトカインおよびケモカイン産生の誘導、ならびに細胞の細胞溶解活性の活性化を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍細胞に対して細胞毒性をリダイレクトする。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、特定の標的配位子もしくは抗原に結合する配位子または抗原特異的認識ドメイン（結合ドメインとも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態において、結合ドメインは、単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）、補助受容体の繋留配位子または細胞外ドメインであり、膜貫通ドメインに融合され、次に、シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃＲγに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢとしても知られている）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０としても知られている）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られている）などのタンパク質に由来する１つ以上の共刺激ドメインを含む。

ＣＡＲの抗原結合ドメインと標的細胞の表面上のその標的抗原との係合により、ＣＡＲがクラスター化され、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激が送達される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞特異性をリダイレクトし、それにより、増殖、サイトカイン産生、食作用、または主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）に依存しない様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することができる分子の産生を誘発し、モノクローナル抗体、可溶性配位子または細胞特異的補助受容体の細胞特異的標的化能力を活用する、それらの能力である。ＣＤ３ζまたはＦｃＲγからのシグナル伝達ドメインを含むように操作されたｓｃＦｖベースのＣＡＲは、Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能に強力なシグナルを送達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルがない場合に、Ｔ細胞の生存と拡大を促進するシグナルを引き出すのに十分ではない。結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通、およびＣＤ３ζまたはＦｃＲγに由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４に由来する細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ２７８）とともに含有する新生代のＣＡＲは、動物モデルおよびがん患者において、抗腫瘍活性をより効果的に指示し、かつサイトカイン分泌、溶解活性、インビトロでのＣＡＲ発現Ｔ細胞の生存および増殖を増加させることが示されている（Ｍｉｌｏｎｅｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２００９；１７：１４５３－１４６４；Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２０１０；１８：４１３－４２０；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９；１０６：３３６０－３３６５）。

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体発現エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、疾患または状態を有する患者に由来し、配位子に対して任意の特異性を有する少なくとも１つのＣＡＲを発現するようにインビトロで遺伝子修飾された細胞である。細胞は、ＣＡＲへの配位子の特異的結合によって刺激または誘導され、同じ患者の疾患または状態の治療に有用な少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、サイトカインの誘導）を実行する。エフェクター細胞はＴ細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞）であり得る。当業者は、他の細胞型（例えば、ナチュラルキラー細胞または幹細胞）がＣＡＲを発現し得ること、およびキメラ抗原受容体エフェクター細胞がＴ細胞以外のエフェクター細胞を含み得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、標的または標的細胞（例えば、がん細胞）に接触または近接したときに、標的細胞に対してそのエフェクター機能（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を発揮するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）である（例えば、ＣｈａｎｇａｎｄＣｈｅｎ（２０１７）ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ２３（５）：４３０－４５０を参照）。

Ｔ細胞をそれらの同族の抗原に長時間曝露すると、エフェクター機能が枯渇し、感染細胞または形質転換細胞の持続が可能になる。免疫チェックポイント遮断を誘導する薬剤を使用して宿主エフェクター機能を刺激または活性化するための最近開発された戦略は、いくつかのがんの治療で成功を収めている。新たな証拠は、Ｔ細胞の枯渇がキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）による長寿命の抗腫瘍活性の維持における重大な障害となる可能性があることを示唆している。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ形質導入前の患者から採取したＴ細胞の分化状態、およびＣＡＲ－Ｔ細胞を再導入する前に患者が受ける移植前処理（例えば、アルキル化剤、フルダラビン、全身照射の適用または排除）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および細胞傷害能に大きく影響し得る。Ｔ細胞集団を刺激（抗ＣＤ３／ＣＤ２８または刺激細胞を介して）および拡大（ＩＬ－２などのサイトカインを介して）するインビトロ培養条件も、ＣＡＲ－Ｔ細胞の分化状態およびエフェクター機能を改変する可能性がある（Ｇｈｏｎｅｉｍｅｔａｌ．，（２０１６）ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ２２（１２）：１０００－１０１１）。

いくつかの実施形態において、特にＡＬＬおよび／またはＮＨＬの治療のために、好適なＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とする。非限定的な例には、以下の構造を含むＣＡＲが含まれる：（ｉ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８Ｈ／ＴＭドメイン、４－１ＢＢＣＳドメイン、およびＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン、（ｉｉ）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン、（ｉｉｉ）抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ、ＩｇＧヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８／４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ ＴＣＲシグナル伝達ドメイン。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組み合わせおよび方法との組み合わせに好適なＣＡＲエフェクター細胞は、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、以前はＣＴＬ０１９）およびＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（アキシカブタジンシロルーセル、ＫｉｔｅＰｈａｒｍａ）を含むがこれらに限定されないＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とする。

再標的化されたＣＡＲＴ細胞
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体と組み合わせて使用するのに好適なＣＡＲ－Ｔ療法は、再標的化されたＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ユニバーサル免疫受容体、タグ、スイッチまたは免疫グロブリン上のＦｃ領域に結合するＣＡＲを発現するように修飾されたエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本明細書に記載の方法に好適である。

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ユニバーサル免疫受容体またはＵｎｉｖＩＲを発現するように修飾される。ＵｎｉｖＩＲの１つの種類は、ビオチン結合免疫受容体（ＢＢＩＲ）である（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２３４３４８（Ａ１）号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。ユニバーサルキメラ受容体および／またはユニバーサルキメラ受容体を発現するエフェクター細胞に関連する方法および組成物の他の例は、国際特許出願ＷＯ２０１６／１２３１２２（Ａ１）、ＷＯ２０１７／１４３０９４（Ａ１）、ＷＯ２０１３／０７４９１６（Ａ１）、米国特許出願ＵＳ２０１６／０３４８０７３（Ａ１）（すべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ユニバーサルでモジュール式の抗タグキメラ抗原受容体（ＵｎｉｃＡＲ）を発現するように修飾される。このシステムは、複数の抗原に対するＵｎｉＣＡＲ移植免疫細胞の再標的化を可能にする（例えば、米国特許公開ＵＳ２０１７／０２４０６１２（Ａ１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉｅｔａｌ．，（２０１６）ＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌ６，ｅ４５８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、切り替え可能なキメラ抗原受容体およびキメラ抗原受容体エフェクター細胞（ＣＡＲ－ＥＣ）スイッチを発現するように修飾される。このシステムでは、ＣＡＲ－ＥＣスイッチは、ＣＡＲ－ＥＣ上のキメラ抗原受容体によって結合される第１の領域と、標的細胞上の細胞表面分子と結合する第２の領域を有し、それにより、結合した標的細胞に対して細胞毒性があるＣＡＲ－ＥＣからの免疫応答を刺激する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－ＥＣはＴ細胞であり、ＣＡＲ－ＥＣスイッチは、ＣＡＲ－ＥＣ活性のための「オンスイッチ」として機能し得る。スイッチの管理を低減するか、または中止することで、活性を「オフ」にすることができる。これらのＣＡＲ－ＥＣスイッチは、がんなどの疾患または状態の治療のために、本明細書に開示されるＣＡＲ－ＥＣ、ならびに既存のＣＡＲＴ細胞とともに使用することができ、標的細胞は悪性細胞である。そのような治療は、本明細書では切り替え可能な免疫療法と呼ばれることがある（米国特許公開ＵＳ９６２４２７６（Ｂ２）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ヒト免疫グロブリン（例えば、ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ）のＦｃ部分と結合する受容体を発現するように修飾される（Ｋｕｄｏｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７４（１）：９３－１０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。

いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）と結合するユニバーサル免疫受容体（例えば、切り替え可能なＣＡＲ、ｓＣＡＲ）を発現するように修飾される。いくつかの実施形態において、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）は、抗原を標的とする抗体内の定義された異なる位置に組み込まれている（抗体スイッチ）。したがって、ｓＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性はＰＮＥに対してのみリダイレクトされ、ヒトのプロテオームでは生じないため、ｓＣＡＲ－Ｔ細胞と抗体スイッチの間の直交相互作用が可能になる。このように、ｓＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗体スイッチの存在に厳密に依存して完全に活性化されるため、抗体スイッチがない場合の内因性組織または抗原のＣＡＲＴ細胞オフ標的認識は除外される（Ａｒｃａｎｇｅｌｉｅｔａｌ．，（２０１６）ＴｒａｎｓｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ５（Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ１７４－Ｓ１７７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。切り替え可能なＣＡＲの他の例は、米国特許出願ＵＳ２０１６／０２７２７１８（Ａ１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって提供される。

本明細書で使用される場合、「タグ」という用語は、上記のように、ユニバーサル免疫受容体、タグ、スイッチ、または免疫グロブリンのＦｃ領域を包含する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、タグ結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように修飾される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質錯体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカラニンホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはマルトースタンパク質と結合する。

抗ＴＡＧキメラ抗原受容体（ＡＴ－ＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用するのに好適なＣＡＲ－Ｔ療法は、抗タグＣＡＲＴ細胞である。ＣＡＲＴ細胞の一般化された臨床応用にはいくつかの制限がある。例えば、すべてのがん腫によって普遍的に発現される単一の腫瘍抗原は存在しないため、ＣＡＲの各ｓｃＦｖは、目的の腫瘍抗原に特異的に操作する必要がある。加えて、ＣＡＲの標的となる腫瘍抗原は、治療に応じて下方調節または変異されて、腫瘍回避をもたらす可能性がある。

別の方法として、ユニバーサルな抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ－ＣＡＲ）およびＣＡＲ－Ｔ細胞が開発されている。例えば、ヒトＴ細胞は、抗フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ＣＡＲ（抗ＦＩＴＣ－ＣＡＲと呼ばれる）を発現するように操作されている。このプラットフォームは、抗ＦＩＴＣｓｃＦｖ（細胞表面上）とＦＩＴＣの間の高い親和性相互作用、およびセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、レツキシマブ（抗ＣＤ２０）、ハーセプチン（抗Ｈｅｒ２）などの抗がんベースのモノクローナル抗体にＦＩＴＣ分子（または他のタグ）をコンジュゲートさせる能力を利用する。

したがって、いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、少なくともＷＯ２０１２／０８２８４１およびＵＳ２０１６／０１２９１０９（Ａ１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ユニバーサル抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ－ＣＡＲ）を発現するように修飾される。このようなＡＴ－ＣＡＲシステムでは、Ｔ細胞は抗体などのタグ付きタンパク質を認識して、それと結合する。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＴ－ＣＡＲＴ細胞は、ＦＩＴＣ標識抗体などのタグ標識抗体を認識する。いくつかの実施形態において、抗腫瘍抗原抗体は、タグ（例えば、ＦＩＴＣ）にコンジュゲートされ、ＡＴ－ＣＡＲ療法の前、同時、または後に投与される。抗腫瘍抗原抗体は当業者に知られている。

示されているように、タグ結合ドメインの結合特異性は、標的細胞を結合するために使用されるタンパク質に結合されているタグの同一性に依存する。例えば、本開示のいくつかの態様において、タグはＦＩＴＣであり、タグ結合ドメインは抗ＦＩＴＣｓｃＦｖである。代替的に、本開示のいくつかの態様において、タグはビオチンまたはＰＥ（フィコエリトリン）であり、タグ結合ドメインは抗ビオチンｓｃＦｖまたは抗ＰＥｓｃＦｖである。

いくつかの実施形態において、タグ付きタンパク質の各配合物のタンパク質は同じまたは異なるものであり、タンパク質は抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、レツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オマリズマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、およびベバクジマブ（抗ＶＥＧＦ）である。

したがって、いくつかの実施形態において、タグ付けされたタンパク質は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗体、ビオチンコンジュゲート抗体、ＰＥコンジュゲート抗体、ヒスチジンコンジュゲート抗体、およびストレプトアビジンコンジュゲート抗体を含み、抗体は、標的細胞によって発現されるＴＡＡまたはＴＳＡに結合する。例えば、タグ付けされたタンパク質には、ＦＩＴＣコンジュゲートセツキシマブ、ＦＩＴＣコンジュゲートレツキシマブ、ＦＩＴＣコンジュゲートハーセプチン、ビオチンコンジュゲートセツキシマブ、ビオチンコンジュゲートレツキシマブ、ビオチンコンジュゲートハーセプチン、ＰＥコンジュゲートセツキシマブ、ＰＥコンジュゲートレツキシマブ、ＰＥコンジュゲートハーセプチン、ヒスチジンコンジュゲートセツキシマブ、ヒスチジンコンジュゲートレツキシマブ、ヒスチジンコンジュゲートハーセプチン、ストレプトアビジンコンジュゲートセツキシマブ、ストレプトアビジンコンジュゲートレツキシマブ、およびストレプトアビジンコンジュゲートハーセプチンが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ＡＴ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の各集団のＡＴ－ＣＡＲは、同じまたは異なるものであり、ＡＴ－ＣＡＲは、タグ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、タグ結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、タグ結合ドメインは、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジンまたはストレプトアビジンと特異的に結合する。いくつかの実施形態において、タグ結合ドメインは抗原結合断片であり、抗原結合断片は、ＦＩＴＣ、ビオチン、ＰＥ、ヒスチジンまたはストレプトアビジンと特異的に結合するｓｃＦｖなどの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖のヒンジおよび膜貫通領域である。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、ＣＤ２８の細胞質領域、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）の細胞質領域、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζおよびＦｃＲεのうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態において、タグ付きタンパク質の各配合物のタグは同じまたは異なるものであり、タグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質錯体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカラニンホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびマルトース結合タンパク質からなる群から選択される。

タグは、化学的カップリングおよび化学的架橋剤などの技術を使用してタンパク質にコンジュゲートさせることができる。代替的に、タグ付きタンパク質を融合タンパク質としてコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。次に、細胞株は、タグ付きタンパク質を発現させるために操作することができ、タグ付きタンパク質は、培地から単離し、精製して、本明細書に開示される方法で使用することができる。

いくつかの実施形態において、タグ付けされたタンパク質は、ＡＴ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の前、または同時、または後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）タグ付けされたタンパク質の配合物を治療を必要とする対象に投与することであって、タグ付けされたタンパク質が対象におけるがん細胞と結合する、投与することと、（ｂ）抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞の治療効果のある集団を対象に投与し、それによりがんを治療することであって、ＡＴ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞がタグ付きタンパク質と結合してがん細胞死を誘導する、投与し、それによりがんを治療することと、を含む、対象におけるがんを治療する方法を提供する。

タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）エフェクター細胞
いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質と組み合わせて使用するのに好適なＣＡＲ－Ｔ療法は、タンデムＣＡＲエフェクター細胞である。がん治療にＣＡＲアプローチを使用すると、腫瘍の不均一性および免疫編集が、ＣＡＲ治療からの逸脱を引き起こす可能性があることが観察されている（Ｇｒｕｐｐｅｔａｌ．，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ（２０１３）３６８：１５０９－１５１８）。別のアプローチとして、タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして知られる二重特異性ＣＡＲが、複数のがん特異的マーカーを同時に標的とする試みにおいて開発されている。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーによって接合された２つの抗原結合特異性をタンデムで含む。したがって、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は、両方とも単一の膜貫通部分に連結されている。一方のｓｃＦｖは膜に並置し、もう一方は遠位の位置にある。例示的なＴａｎＣＡＲとして、Ｇｒａｄａｅｔａｌ．（ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖとそれに続くＧｌｙ－ＳｅｒリンカーおよびＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖを含むＴａｎＣＡＲについて説明している。ＨＥＲ２－ｓｃＦｖは膜に並置する位置にあり、ＣＤ１９－ｓｃＦｖは遠位の位置にあった。ＴａｎＣＡＲは、２つの腫瘍制限抗原のそれぞれに対して明確なＴ細胞反応性を誘導することが示されている。

したがって、本開示のいくつかの態様は、Ｔ細胞の二重特異性活性化および標的化を媒介するタンデムキメラ抗原受容体に関する。本開示は、ＣＡＲの二重特異性に言及しているが、いくつかの態様において、ＣＡＲは、３つ、４つ、またはそれ以上の腫瘍抗原を標的とすることができる。ＣＡＲＴ細胞を使用して複数の抗原を標的とすることは、Ｔ細胞の活性化を増強し、かつ／あるいは抗原喪失による腫瘍エスケープを相殺する可能性がある。ＴａｎＣＡＲはまた、複数の発現された抗原を標的とし、広範な特異性を有する同じ細胞産物を使用して様々な腫瘍を標的とし、かつ／あるいは複数の特異性のために同じ結果を達成するより弱いシグナル伝達ＣＡＲでより良好な毒性プロファイルを提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、２つの標的化ドメインを含むＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、３つ以上の標的化ドメインを含む多重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。別の実施形態において、本開示は、細胞表面に第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを提供し、各ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含み、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、第１の腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＥＲ２）に結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、別の（異なる）腫瘍抗原に結合する。ＴａｎＣＡＲは、ＵＳ２０１６／０３０３２３０（Ａ１）およびＵＳ２０１７／０３４０７０５（Ａ１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

いくつかの実施形態において、本開示のＴａｎＣＡＲは、２つ以上の腫瘍抗原を標的とする。例示的な腫瘍抗原には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、がん胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ配位子、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体α２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ＬｅｗｉｓＹ、Ｇ２５０／ＣＡＬＸ、ＨＬＡ－ＡＩＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ－Ａ２ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄ配位子、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、および／またはＴＥＭ８のうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ１９および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ２２および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＥＲ２および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ１３Ｒ－アルファ２および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＶＥＧＦ－Ａおよび別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、Ｔｅｍ８および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＦＡＰおよび別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＥｐｈＡ２および別の腫瘍抗原を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、以下の腫瘍抗原の１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ以上を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する：ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、ＩＬ１３Ｒ－アルファ２、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｔｅｍ８、ＦＡＰ、もしくはＥｐｈＡ２、およびそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＥＲ２およびＩＬ１３Ｒ－アルファ２を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ１９およびＣＤ２２を標的とする二重特異性ＴａｎＣＡＲを提供する。

キメラ抗原受容体およびＣＡＲエフェクター細胞を生成するための方法
いくつかの実施形態において、対象のエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体で遺伝子修飾される（Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．３：３８８－３９８，２０１３）。例えば、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供され、キメラ抗原受容体をコードする組換え核酸が、ＣＡＲ細胞を生成するために患者由来のエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入される。いくつかの実施形態において、対象に由来しないエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体で遺伝子修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓによって開発されたユニバーサルキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ）などの「既製の」養子細胞療法として使用されるように操作されている同種異系細胞である。ＵＣＡＲＴは、特定のがん腫を有する最大数の患者を治療するために使用されるように操作されている同種異系のＣＡＲＴ細胞である。Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓが開発中のＵＣＡＲＴの非限定的な例には、腫瘍抗原ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＳ１、およびＣＤ３８を標的とするものが含まれる。

当技術分野で知られている様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示される核酸または発現ベクターのいずれかをエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に核酸を導入するための方法の非限定的な例には、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマーベースのトランスフェクション、光トランスフェクション、粒子ベースのトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用したトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インパレフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、およびヌクレオフェクションが含まれる。さらに、当技術分野で知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、ＣＡＲ核酸をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入し、かつ／あるいは他の遺伝子修飾（例えば、以下に記載されるような）をエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入してＣＡＲ細胞活性を増強する（ＣＡＲＴ細胞に関連するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用については、例えば、ＵＳ９，８９０，３９３；ＵＳ９，８５５，２９７；ＵＳ２０１７／０１７５１２８；ＵＳ２０１６／０１８４３６２；ＵＳ２０１６／０２７２９９９；ＷＯ２０１５／１６１２７６；ＷＯ２０１４／１９１１２８；ＣＮ１０６７５５０８８；ＣＮ１０６５９１３６３；ＣＮ１０６４８００９７；ＣＮ１０６３９９３７５；ＣＮ１０４８９４０６８を参照）。

本明細書に提供されるのは、各細胞がＣＡＲ（例えば、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか）を発現することができる、本明細書に記載の細胞または組成物のうちのいずれかを生成するために使用できる方法である。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）には、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および抗原結合ドメインが抗原に結合するときにＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζ配列の細胞質配列を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびに、任意選択的に、抗原結合ドメインが抗原に結合するときにＴ細胞を共刺激する１つ以上（例えば、２、３、または４）の共刺激タンパク質の細胞質配列（例えば、Ｂ７－Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、およびＣＤ８３に特異的に結合する配位子のうちの１つ以上の細胞質配列）、が含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、リンカーをさらに含むことができる。ＣＡＲの非限定的な態様と機能を以下に説明する。例示的な抗原結合ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ細胞の追加の態様は、例えば、Ｋａｋａｒｌａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１５１－１５５，２０１４；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．３６：４９４－５０２，２０１５；Ｎｉｓｈｉｏｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４（２）：ｅ９８８０９８，２０１５；Ｇｈｏｒａｓｈｉａｎｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１６９：４６３－４７８，２０１５；Ｌｅｖｉｎｅ，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２２：７９－８４，２０１５；Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９－１５，２０１５；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２２：９５－１００，２０１５；Ｌｉｅｔａｌ．，ＺｈｏｎｇｇｕｏＳｈｉＹａｎＸｕｅＹｅＸｕｅＺａＺｈｉ２２：１７５３－１７５６，２０１４；Ｇｉｌｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６３：６８－８９，２０１５；Ｍａｇｅｅｅｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１８：２６５－２７１，２０１４；Ｇａｒｇｅｔｔｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：２３５，２０１４；Ｙｕａｎｅｔａｌ．，ＺｈｏｎｇｇｕｏＳｈｉＹａｎＸｕｅＹｅＸｕｅＺａＺｈｉ２２：１１３７－１１４１，２０１４；Ｐｅｄｇｒａｍｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１２７－１３３，２０１４；Ｅｓｈｈａｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１２３－１２６，２０１４；Ｒａｍｏｓｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＪ．２０：１１２－１１８，２０１４；Ｍａｕｓｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２３：２６２５－２６３５，２０１４；Ｊｅｎａｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．９：５０－５６，２０１４；Ｍａｈｅｒｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４：３５－４３，２０１４；Ｒｉｃｈｅｓｅｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１６：２９５－３０２，２０１３；Ｃｈｅａｄｌｅｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：８３－９０，２０１４；Ｄａｖｉｌａｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９９：３６１－３７１，２０１４；Ｘｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．３４３：１７２－１７８，２０１４；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：２６７－２７６，２０１３；Ｈｏｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．８：６０－７０，２０１３；Ｈｏｍｂａｃｈｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３：１０７９－１０８８，２０１３；Ｘｕｅｔａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ５４：２５５－２６０，２０１３；Ｇｉｌｈａｍｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．１８：３７７－３８４，２０１２；Ｌｉｐｏｗｓｋａ－Ｂｈａｌｌａｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１：９５３－９６２，２０１２；Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１：１２６９－１２７７，２０１３；Ｊｅｎａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１６：１０３５－１０４４，２０１０；Ｄｏｔｔｉｅｔａｌ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ２５７（１）：１０７－１２６，２０１３；Ｄａｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ１０８（７）：ｄｊｖ４３９，２０１６；ＷａｎｇａｎｄＲｉｖｉｅｒｅ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ－Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ３：１６０１５，２０１６；米国特許出願公開第２０１８／００５７６０９号；同第２０１８／００３７６２５号；同第２０１７／０３６２２９５号；同第２０１７／０１３７７８３号；同第２０１６／０１５２７２３，２０１６／０２０６６５６，２０１６／０１９９４１２，２０１６／０２０８０１８，２０１５／０２３２８８０，２０１５／０２２５４８０号；同第２０１５／０２２４１４３号；同第２０１５／０２２４１４２号；同第２０１５／０１９０４２８号；同第２０１５／０１９６５９９号；同第２０１５／０１５２１８１号；同第２０１５／０１４００２３号；同第２０１５／０１１８２０２号；同第２０１５／０１１０７６０号；同第２０１５／００９９２９９号；同第２０１５／００９３８２２号；同第２０１５／００９３４０１号；同第２０１５／００５１２６６号；同第２０１５／００５０７２９号；同第２０１５／００２４４８２号；同第２０１５／００２３９３７号；同第２０１５／００１７１４１号；同第２０１５／００１７１３６号；同第２０１５／００１７１２０号；同第２０１４／０３７００４５号；同第２０１４／０３７００１７号；同第２０１４／０３６９９７７号；同第２０１４／０３４９４０２号；同第２０１４／０３２８８１２号；同第２０１４／０３２２２７５号；同第２０１４／０３２２２１６号；同第２０１４／０３２２２１２号；同第２０１４／０３２２１８３号；同第２０１４／０３１４７９５号；同第２０１４／０３０８２５９号；同第２０１４／０３０１９９３号；同第２０１４／０２９６４９２号；同第２０１４／０２９４７８４号；同第２０１４／０２８６９７３号；同第２０１４／０２７４９０９号；同第２０１４／０２７４８０１号；同第２０１４／０２７１６３５号；同第２０１４／０２７１５８２号；同第２０１４／０２７１５８１号；同第２０１４／０２７１５７９号；同第２０１４／０２５５３６３号；同第２０１４／０２４２７０１号；同第２０１４／０２４２０４９号；同第２０１４／０２２７２７２号；同第２０１４／０２１９９７５号；同第２０１４／０１７０１１４号；同第２０１４／０１３４７２０号；同第２０１４／０１３４１４２号；同第２０１４／０１２０６２２号；同第２０１４／０１２０１３６号；同第２０１４／０１０６４４９号；同第２０１４／０１０６４４９号；同第２０１４／００９９３４０号；同第２０１４／００８６８２８号；同第２０１４／００６５６２９号；同第２０１４／００５０７０８号；同第２０１４／００２４８０９号；同第２０１３／０３４４０３９号；同第２０１３／０３２３２１４号；同第２０１３／０３１５８８４号；同第２０１３／０３０９２５８号；同第２０１３／０２８８３６８号；同第２０１３／０２８７７５２号；同第２０１３／０２８７７４８号；同第２０１３／０２８０２２１号；同第２０１３／０２８０２２０号；同第２０１３／０２６６５５１号；同第２０１３／０２１６５２８号；同第２０１３／０２０２６２２号；同第２０１３／００７１４１４号；同第２０１２／０３２１６６７号；同第２０１２／０３０２４６６号；同第２０１２／０３０１４４８号；同第２０１２／０３０１４４７号；同第２０１２／００６０２３０号；同第２０１１／０２１３２８８号；同第２０１１／０１５８９５７号；同第２０１１／０１０４１２８号；同第２０１１／００３８８３６号；同第２００７／００３６７７３号；および同第２００４／００４３４０１号に記載されている。例示的な抗原結合ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ細胞の追加の態様は、ＷＯ２０１６／１６８５９５；ＷＯ１２／０７９０００；２０１５／０１４１３４７；２０１５／００３１６２４；２０１５／００３０５９７；２０１４／０３７８３８９；２０１４／０２１９９７８；２０１４／０２０６６２０；２０１４／００３７６２８；２０１３／０２７４２０３；２０１３／０２２５６６８；２０１３／０１１６１６７；２０１２／０２３０９６２；２０１２／０２１３７８３；２０１２／００９３８４２；２０１２／００７１４２０；２０１２／００１５８８８；２０１１／０２６８７５４；２０１０／０２９７０９３；２０１０／０１５８８８１；２０１０／００３４８３４；２０１０／００１５１１３；２００９／０３０４６５７；２００４／００４３４０１；２０１４／０３２２２５３；２０１５／０１１８２０８；２０１５／００３８６８４；２０１４／００２４６０１；２０１２／０１４８５５２；２０１１／０２２３１２９；２００９／０２５７９９４；２００８／０１６０６０７；２００８／０００３６８３；２０１３／０１２１９６０；２０１１／００５２５５４；および２０１０／０１７８２７６に記載されている。

抗原結合ドメイン
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に含まれる抗原結合ドメインは、抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）もしくは非がん性細胞で発現されない抗原）またはユニバーサル受容体（例えば、タグ）に特異的に結合することができる。抗原結合ドメインの非限定的な例には、モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）（例えば、完全ヒトまたはキメラ（例えば、ヒト化）抗体）、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）_２断片）（例えば、完全ヒトまたはキメラ（例えば、ヒト化）抗体の断片）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦａｂ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｈｃ－ＩｇＧ、ＢｉＴＥ、単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインまたはＶｈＨドメイン）、ＩｇＮＡＲ、および多重特異性（例えば、二重特異性抗体）抗体が含まれる。これらの抗原結合ドメインを作製する方法は、当技術分野で知られている。

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン分子（例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン分子）および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（抗原結合）断片などの標的抗原に特異的に結合することができる抗体の少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＣＤＲ（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲのうちのいずれか、または免疫グロブリン重鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲのうちのいずれか）を含む。

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、単鎖抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインまたはＶ_ＨＨドメイン、あるいは本明細書に記載されるような単鎖抗体のうちのいずれか）である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、全抗体分子（例えば、ヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗体）または多量体抗体（例えば、二重特異性抗体）である。

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体断片および多重特異性（例えば、二重特異性）抗体または抗体断片を含む。抗体およびその抗原結合断片の例には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で提供される追加の抗原結合ドメインは、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性（多量体、例えば、二重特異性）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、単鎖抗体、細胞内で作製された抗体（すなわち、イントラボディ）、およびそれらの抗原結合断片である。抗体またはその抗原結合断片は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスのものであり得る。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ_１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの例において、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ_４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリンである。

抗原結合ドメインの追加の例は、ＩｇＧの抗原結合断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の抗原結合断片）（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧの抗原結合断片、例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）、ＩｇＡの抗原結合断片（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２の抗原結合断片）（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＡの抗原結合断片、例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤの抗原結合断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＤの抗原結合断片）、ＩｇＥの抗原結合断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＥ）、またはＩｇＭの抗原結合断片（例えば、ヒトもしくはヒト化ＩｇＭの抗原結合断片）である。

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水中で、１×１０^－７Ｍ程度もしくは未満（例えば、１×１０^－８Ｍ程度もしくは未満、５×１０^－９Ｍ程度もしくは未満、２×１０^－９Ｍ程度もしくは未満、または１×１０^－９Ｍ程度もしくは未満）の親和性（Ｋ_Ｄ）で特定の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、腫瘍抗原に結合する（例えば、腫瘍抗原結合ドメインを含む）ＣＡＲ分子を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ分子は、固形腫瘍（例えば、乳癌、結腸癌など）の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ分子は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む、上記のようなタンデムＣＡＲ分子である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ分子は、血液悪性腫瘍（例えば、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（果粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、中枢神経系原発悪性リンパ腫、バーキットリンパ腫および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性多血症、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫など）の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞では発生しない。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＡＡは腫瘍細胞に特有のものではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞に発現する。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こる可能性がある。いくつかの実施形態において、ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できないか、あるいは通常、正常細胞では非常に低いレベルで存在するが、腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される胎児発育中に、正常細胞で発現される。

特定の実施形態において、腫瘍関連抗原は、患者の腫瘍細胞を配列決定し、腫瘍にのみ見られる変異タンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は「新生抗原」と呼ばれる。新生抗原が同定されると、それに対して治療用抗体を産生し、本明細書に記載の方法で使用することができる。

いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、上皮癌抗原（例えば、乳房、胃腸、肺）、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱癌抗原、肺（例えば、小細胞肺）癌抗原、結腸癌抗原、卵巣癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、腎細胞癌抗原、膵癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、頭頸部癌抗原、または結腸直腸癌抗原である。特定の実施形態において、腫瘍抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、Ｂ細胞リンパ腫癌抗原、白血病抗原、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫または形質細胞骨髄腫）抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。

ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）が標的とし得る腫瘍抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ））には、１ＧＨ－ＩＧＫ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アシクロフィリンＣ関連タンパク質、α－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、α－アクチニン－４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ－４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ベータ－カテニン、ベータ－ＨＣＧ、ＢｒＥ３抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ～ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯ－０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ－１ａ、コロン特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１（ＴＲＯＰ－２）、ＥＧＰ－２、ＥＬＦ２－Ｍ、Ｅｐ－ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ－５、Ｆｌｔ－１、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ－β、Ｈ４－ＲＥＴ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ－１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＨＴｇｐ－１７５、Ｉａ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＣ４－抗原、ＫＳＡ、ＫＳ－１抗原、ＫＳ１－４、ＬＡＧＥ－１ａ、Ｌｅ－Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、ＴＲＡＧ－３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ－１／２、ＭＵＭ－３、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ＰＡＭ４抗原、膵癌ムチン、ＰＤ１受容体（ＰＤ－１）、ＰＤ－１受容体配位子１（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤ－１受容体配位子２（ＰＤ－Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅｌ１７前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、ＴＬＰ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＳＰ－１８０、ＴＮＦ－α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＷＴ－１、１７－１Ａ抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１－２、ｂｃ１－６およびＫ－ｒａｓ、腫瘍遺伝子マーカーおよび腫瘍遺伝子産物（例えば、Ｓｅｎｓｉｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００６，１２：５０２３－３２；Ｐａｒｍｉａｎｉｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ２００７，１７８：１９７５－７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ２００５，５４：１８７－２０７）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ヒトの慢性疾患またはがん（子宮頸癌など）に関連するウイルスに由来するウイルス抗原である。例えば、いくつかの実施形態において、ウイルス抗原は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＰＶ抗原Ｅ６および／またはＥ７、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。

例示的ながんまたは腫瘍、およびそのような腫瘍に（排他的にではないが）関連する特定の腫瘍抗原には、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６、ａｍｌ１、シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ－イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆管癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、頸部がん腫（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、結腸がん腫（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－ＣＯ１７－１Ａ／ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、脈絡膜癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（シクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌（α－フェトタンパク質）、ホジキンス（Ｈｏｄｇｋｉｎｓ）リンパ腫（Ｉｍｐ－１、ＥＢＮＡ－１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ－３、ＮＹ－ＥＳＯ－１）、リンパ系細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、がん胎児性抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ－３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００）、真菌腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、鼻咽頭癌（Ｉｍｐ－１、ＥＢＮＡ－１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、前立腺癌（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその抗原性エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、およびＰＳＡ－３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ－ｅｒｂＢ－２）、子宮頸部および食道の扁平上皮癌、精巣癌（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ－１エピトープ）、ならびにウイルス産物またはタンパク質が含まれる。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、メソテリン結合ドメインを含むＣＡＲを発現する（すなわち、ＣＡＲＴ細胞はメソテリンを特異的に認識する）。メソテリンは、卵巣癌、肺癌、膵癌などの様々ながんで過剰発現している腫瘍抗原である。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＨＥＲ２結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＥＧＦＲ結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。

いくつかの実施形態において、ＣＤ１９標的化または結合ドメインを含むＣＡＲを発現するＣＡＲエフェクター細胞は、Ｋｙｍｒｉａｈ（商標）（チサゲンレクロイセル、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＷＯ２０１６／１０９４１０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）またはＹｅｓｃａｒｔａ（商標）（アキシカブタジンシロルーセル、Ｋｉｔｅ、ＵＳ２０１６／０３４６３２６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）である。

リンカー
本明細書で提供されるのは、任意選択的に、（１）抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、および／または（２）膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間にリンカーを含むことができるＣＡＲである。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、約１アミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸、約６個のアミノ酸、約４個のアミノ酸、もしくは約２個のアミノ酸；約２個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸、約６個のアミノ酸、もしくは約４個のアミノ酸；約４個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約８個のアミノ酸、もしくは約６個のアミノ酸；約６個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、もしくは約８個のアミノ酸；約８個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、もしくは約１０個のアミノ酸；約１０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、約１４個のアミノ酸、もしくは約１２個のアミノ酸；約１２個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約１６個のアミノ酸、もしくは約１４個のアミノ酸；約１４個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、もしくは約１６個のアミノ酸；約１６個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、もしくは約１８個のアミノ酸；約１８個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、もしくは約２０個のアミノ酸；約２０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、もしくは約２５個のアミノ酸；約２５個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約３５個のアミノ酸、もしくは約３０個のアミノ酸；約３０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、もしくは約３５個のアミノ酸；約３５個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、もしくは約４０個のアミノ酸；約４０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、もしくは約５０個のアミノ酸；約５０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、もしくは約６０個のアミノ酸；約６０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、もしくは約７０個のアミノ酸；約７０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、もしくは約８０個のアミノ酸；約８０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、もしくは約９０個のアミノ酸；約９０個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、もしくは約１００個のアミノ酸；約１００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、もしくは約２００個のアミノ酸；約２００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、もしくは約３００個のアミノ酸；約３００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸もしくは約４００個のアミノ酸；または約４００個のアミノ酸～約５００個のアミノ酸の長さを有することができる。

リンカーの追加の例および態様は、本明細書で引用された参考文献に記載されており、したがって、その全体が本明細書に組み込まれている。

膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、細胞質ドメインにおける配列と天然に関連している。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、他の膜貫通ドメイン（例えば、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメイン）へのドメインの結合を回避して、受容体錯体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸置換によって修飾され得る。

いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来し得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本明細書で使用できる膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７もしくはＣＤ１５４のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖に由来し（例えば、少なくとも、その鎖の膜貫通配列、もしくはその鎖の膜貫通配列の一部を含み）得る。

いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは合成であり得る。例えば、膜貫通ドメインが合成源に由来するいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、疎水性残基（例えば、ロイシンおよびバリン）を含み（例えば、主に含み）得る。いくつかの実施形態において、合成膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの端部に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）のトリプレットを含むであろう。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインを含むことができる。

膜貫通ドメインの追加の特定の例は、本明細書で引用される参考文献に記載されている。

細胞質ドメイン
また、本明細書で提供されるのは、例えば、抗原結合ドメインが抗原に結合するときにＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζの細胞質配列と、任意選択的に、Ｔ細胞の共刺激を与える１つ以上の共刺激タンパク質の細胞質配列（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＣＤ２４４、ＣＤ８０、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、および本明細書に記載されているか当技術分野で知られているＩＴＡＭ配列のうちのいずれか、のうちの１つ以上の細胞質配列）と、を含む、細胞質シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子である。ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の刺激は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の１つ以上の抗がん活性の活性化をもたらす可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の刺激は、サイトカインの分泌を含む、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性の増加をもたらし得る。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメイン全体が、細胞質シグナル伝達ドメインに含まれる。いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分（例えば、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞においてエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分）を含む。細胞質シグナル伝達ドメインに含めることができる細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例には、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および補助受容体の細胞質配列、ならびに少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）の置換を含み、同じまたはほぼ同じ機能的能力を有するこれらの配列のバリアントが含まれる。

いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含むことができる：ＴＣＲを介して抗原依存性活性化を開始するシグナル伝達配列（一次細胞質シグナル伝達配列）（例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達配列）、および二次または共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用する共刺激タンパク質のうちの１つ以上の細胞質配列（二次細胞質シグナル伝達配列）。

いくつかの、ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの観点で有用な他の任意の所望の細胞質シグナル伝達配列実施形態においてと組み合わせて、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計することができる。いくつかの例では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激性細胞質シグナル伝達配列を含むことができる。共刺激性細胞質シグナル伝達配列は、共刺激性タンパク質（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合する配位子）の細胞質シグナル伝達配列を含むＣＡＲの一部分を指す。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序で配置される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、特定の順序で互いに連結されている。いくつかの実施形態において、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカーのうちのいずれか）を使用して、異なる細胞質シグナル伝達配列間の連結を形成することができる。

いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質ＣＤ２８の細胞質シグナル伝達配列を含むように設計されている。いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質４－ＩＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計されている。いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列ならびに共刺激タンパク質ＣＤ２８および４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計されている。いくつかの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含まない。

ＣＡＲＴ細胞の追加の修飾
別の実施形態において、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の治療効果は、メチルシトシンジオキシゲナーゼ遺伝子（例えば、Ｔｅｔｌ、Ｔｅｔ２、Ｔｅｔ３）の破壊によって増強され、これは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０４９１６６号に記載されているように、増殖の増強、エフェクターサイトカイン産生および脱顆粒の調節に関連して５－ヒドロキシメチルシトシンの総レベルを低下させ、それにより、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の増殖および／または機能を増加させる。したがって、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲを発現するように操作することができ、前述のエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるＴｅｔｌ、Ｔｅｔ２および／またはＴｅｔ３の発現および／または機能は、低減または排除されている。

別の実施形態において、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の治療効果は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１２６６０８号および米国公開第２０１８／００４４４２４号に記載されているように、ＣＡＲ（無条件ＣＡＲと呼ばれる）を構成的に発現し、がんの治療に有用な別の薬剤を条件付きで発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用することによって増強される。そのような実施形態において、条件付きで発現される薬剤は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化、例えば、無条件ＣＡＲの、その標的への結合時に発現される。一実施形態において、条件付きで発現される薬剤は、ＣＡＲ（本明細書では条件付きＣＡＲと呼ばれる）である。別の実施形態において、条件付きで発現される薬剤は、免疫応答のチェックポイント阻害剤を阻害する。別の実施形態において、条件付きで発現される薬剤は、ＣＡＲの効力を改善または増強し、サイトカインを含むことができる。

別の実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の治療効果は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０６９２８２号および米国公開第２０１７／０３３５３３１号に記載されているように、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ベータ２ミクログロブリン、ＨＬＡ分子、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、およびＦＡＳからなる群から選択される内因性遺伝子の発現を改変（例えば、下方修正）することができる核酸でＣＡＲＴ細胞を修飾することによって増強される。

別の実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の治療効果は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／１１２６２６号および米国公開第２０１６／０３４０４０６号に記載されているように、ＣＡＲおよびＴ細胞プライミングの１つ以上の増強剤（「ＥＴＰ」）をＴ細胞において共発現することによって増強される。ＣＡＲＴ細胞へのＥＴＰ構成要素の追加は、増強された「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能を付与する。一実施形態において、ＣＡＲおよび１つ以上のＥＴＰは、Ｔ細胞において一時的に共発現される。したがって、（ＣＡＲ／ＥＴＰ発現の一過性の性質を考えると、）操作されたＴ細胞は安全であり、ＡＰＣ機能によって長期の免疫を誘導する。

別の実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の治療効果は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０５５５５１号および米国公開第２０１７／０２９２１１８号に記載されるように、ＣＡＲと、結合（または二量体化）ドメインを含む阻害膜タンパク質（ＩＭＰ）とをＴ細胞において共発現させることにより増強される。ＣＡＲとＩＭＰは両方とも、特にＣＡＲ内に含まれる第２の結合ドメインを介して、可溶性化合物に反応するようになり、それにより、ＩＭＰによってもたらされる阻害性シグナル伝達ドメインと、ＣＡＲの活性化を低下させる効果を有するＣＡＲによってもたらされるシグナル伝達ドメインとの、二量体化またはリガンド認識による共局在を可能にする。阻害性シグナル伝達ドメインは、プログラム死－１（ＰＤ－１）であることが好ましく、これはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介型の、ＩＬ－２産生およびＴ細胞増殖の活性化を弱める。

別の実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の治療効果は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０３２７７７号に記載されているように、小分子を添加すると、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの細胞外部分のコンフォメーションの変化が制御されるシステムを使用して増強される。この統合されたシステムは、抗原と抗原結合ドメインとの間の相互作用をオン／オフ状態間で切り替える。ＣＡＲの細胞外部分のコンフォメーションを制御できることにより、細胞毒性などのＣＡＲＴ細胞の下流機能を直接調節することができる。したがって、ＣＡＲは、ａ）ｉ）細胞外抗原結合ドメイン、ｉｉ）少なくとも、第１の多量体化配位子結合ドメインと、所定の多価配位子に結合して、前述の２つの結合ドメインおよびそれらが結合する多価配位子を含む多量体を形成することができる第２の多量体化配位子結合ドメインと、を含むスイッチドメイン、を含む少なくとも１つのエクトドメイン、ｂ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン、ならびにｃ）シグナル伝達ドメインおよび任意選択的に共刺激ドメインを含む少なくとも１つのエンドドメインを含むことを特徴とすることができ、スイッチドメインは、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置している。

腫瘍関連抗原標的抗体
いくつかの態様において、本開示は、腫瘍抗原を標的とする抗体と併せて使用または実行される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を提供する。

治療用モノクローナル抗体は、腫瘍選択的抗原またはエピトープを標的とすることによって腫瘍選択的治療を可能にするはずの薬学的に活性な薬剤のクラスとして考えられてきた。

抗体およびその抗原結合断片を生成する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第７，２４７，３０１号、同第７，９２３，２２１号、および米国特許出願第２００８／０１３８３３６号（すべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

本開示の方法で使用することができる治療用抗体には、使用、臨床試験、または臨床使用のための開発において承認されている、当技術分野で認められている抗がん抗体のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、複数の抗がん抗体を本開示の併用療法に含めることができる。

抗がん抗体の非限定的な例には、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ陽性乳癌または転移性乳癌の治療に使用されるトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）によるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）；結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、乳癌、転移性乳癌、非小細胞肺癌、もしくは腎細胞癌の治療に使用されるベバシズマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＡＶＡＳＴＩＮ（商標））；非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病の治療に使用されるリツキシマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＲＩＴＵＸＡＮ（商標））；乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、または卵巣癌の治療に使用されるペルツズマブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標））；結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、脳癌、膵癌、食道癌、腎細胞癌、前立腺癌、頸部癌、または膀胱癌の治療に使用できるセツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ）によるＥＲＢＩＴＵＸ（商標））；結腸直腸癌、頭頸部癌、およびその他の潜在的ながん標的の治療に使用されるＩＭＣ－１Ｃ１１（ＩｍＣｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）；ＣＤ２０陽性で濾胞性の非ホジキンリンパ腫（形質転換の有無にかかわらず、リツキシマブに難治性であり、化学療法後に再発している）である可能性がある非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるトシツモマブおよびトシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ）によるＢＥＸＸＡＲＸＭ）；Ｉｎ^１１１イブリツモマブチウキセタン；Ｙ^９０イブリツモマブチウキセタン；リンパ腫または非ホジキンリンパ腫（再発性濾胞性リンパ腫、再発性もしくは難治性、低悪性度もしくは濾胞性の非ホジキンリンパ腫、または形質転換されたＢ細胞を含むことができる）に使用されるＩｎ^１１１イブリツモマブチウキセタンおよびＹ^９０イブリツモマブチウキセタン（ＢｉｏｇｅｎＩｄｅｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）によるＺＥＶＡＬＩＮ（商標））；非小細胞肺癌または子宮頸癌の治療に使用されるＥＭＤ７２００（ＥＭＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ））；ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるＳＧＮ－３０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ）による、ＣＤ３０抗原を標的とする遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；非小細胞肺癌の治療に使用されるＳＧＮ－１５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ドキソルビシンにコンジュゲートするＬｅｗｉｓｙ関連抗原を標的とする遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療に使用されるＳＧＮ－３３（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ３３抗原を標的とするヒト化抗体）；多発性骨髄腫または非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるＳＧＮ－４０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ４０抗原を標的とするヒト化モノクローナル抗体）；非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるＳＧＮ－３５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、オーリスタチンＥにコンジュゲートするＣＤ３０抗原を標的とする遺伝子操作されたモノクローナル抗体）；腎癌および鼻咽頭癌の治療に使用されるＳＧＮ－７０（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＣＤ７０抗原を標的とするヒト化抗体）；ＳＧＮ－７５（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、ＳＧＮ７０抗体およびオーリスタチン誘導体で構成されるコンジュゲート）；ならびに黒色腫または転移性黒色腫の治療に使用されるＳＧＮ－１７／１９（ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓによる、メルファランプロドラッグにコンジュゲートした酵素および抗体を含有する融合タンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の方法で使用される治療用抗体は、上記のものに限定されないことを理解されたい。例えば、以下の承認された治療用抗体も本開示の方法で使用することができる：未分化大細胞リンパ腫およびホジキンリンパ腫にはブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（商標））、黒色腫にはイピリムマブ（ＭＤＸ－１０１、ＹＥＲＶＯＹ（商標））、慢性リンパ球性白血病にはオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標）、結腸直腸癌にはパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（商標））、慢性リンパ球性白血病にはアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標））、慢性リンパ球性白血病にはオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））、急性骨髄性白血病にはゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標））。

本明細書に開示される方法で使用するのに好適な抗体はまた、免疫細胞によって発現される分子（例えば、ＯＸ４０を標的とし、腫瘍部位で抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させ、腫瘍拒絶を増強する０Ｘ８６；ＣＤ１３７を標的とし、確立された腫瘍の退縮、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大と維持を引き起こすＢＭＳ－６６３５１３；およびＣＤ２５を標的とし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇの一時的な枯渇を引き起こし、腫瘍退縮を増強し、エフェクターＴ細胞の数を増やすダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標））などであるが、これらに限定されない）を標的とすることができる。これらの抗体のより詳細な議論は、例えば、Ｗｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１０；１０：３１７－２７に見出すことができる。

腫瘍抗原（例えば、がん腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、およびそれらの組み合わせなどの異なるがんの種類に関連する腫瘍抗原）を標的とする他の治療用抗体を同定することができる。例えば、以下の腫瘍抗原は、本明細書に開示される方法において治療用抗体の標的となり得る。

腫瘍抗原は、上皮癌抗原（例えば、乳房、胃腸、肺）、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱癌抗原、肺（例えば、小細胞肺）癌抗原、結腸癌抗原、卵巣癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、腎細胞癌抗原、膵癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、頭頸部癌抗原、または結腸直腸癌抗原であり得る。特定の実施形態において、腫瘍抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、Ｂ細胞リンパ腫癌抗原、白血病抗原、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫または形質細胞骨髄腫）抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。記載された腫瘍抗原は単なる例示であり、任意の腫瘍抗原が本明細書に開示された方法での使用を目的とすることができることを理解されたい。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、ほとんどまたはすべてのヒト腺癌（膵臓、結腸、乳房、卵巣、肺、前立腺、頭頸部、多発性骨髄腫および一部のＢ細胞リンパ腫を含む）に見られるムチン－１タンパク質またはペプチド（ＭＵＣ－１）である。クローン病または潰瘍性大腸炎のいずれかの炎症性腸疾患を有する患者は、結腸直腸がん腫を発症するリスクが高くなる。ＭＵＣ－１はＩ型膜貫通型糖タンパク質である。ＭＵＣ－１の主要な細胞外部分は、免疫原性エピトープを構成する２０個のアミノ酸からなる多数のタンデムリピートを有する。一部のがんでは、それは、免疫系によって認識される非グリコシル化形態で曝露される（Ｇｅｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ１９９０；２６５：１５２８６－１５２９３）。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、黒色腫および結腸癌に関連する変異Ｂ－Ｒａｆ抗原である。これらの変異の大部分は、ヌクレオチド１７９６でのＴ－Ａの単一ヌクレオチド変化を表しており、Ｂ－Ｒａｆの活性化セグメント内の残基５９９でバリンからグルタミン酸への変化が生じる。Ｒａｆタンパク質は、活性化されたＲａｓタンパク質のエフェクターとして間接的にがんと関連しており、その発がん形態は、すべてのヒトがんの約３分の１に存在する。通常の変異していないＢ－Ｒａｆは細胞シグナル伝達に関与し、細胞膜から核にシグナルを中継する。タンパク質は通常、シグナルを中継するために必要な場合にのみ活性になる。対照的に、変異体Ｂ－Ｒａｆは常に活性であり、シグナル伝達の中継を妨害することが報告されている（ＭｅｒｃｅｒａｎｄＰｒｉｔｃｈａｒｄ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（２００３）１６５３（１）：２５－４０；Ｓｈａｒｋｅｙｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２００４）６４（５）：１５９５－１５９９）。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、ヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ）抗原である。ＨＥＲ－２／ｎｅｕを過剰発現する細胞を有するがんは、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ^＋がんと呼ばれる。例示的なＨＥＲ－２／ｎｅｕ^＋がんには、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、皮膚癌、肝癌（例えば、肝細胞腺癌）、腸癌、および膀胱癌が含まれる。

ＨＥＲ－２／ｎｅｕの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）は約６４５ａａで、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、疎水性の高い膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）と４０％の相同性があり、カルボキシ末端細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は約５８０ａａで、ＥＧＦＲと８０％の相同性がある。ＨＥＲ－２／ｎｅｕのヌクレオチド配列はＧＥＮＢＡＮＫ（商標）で入手できる。アクセッション番号ＡＨ００２８２３（ヒトＨＥＲ－２遺伝子、プロモーター領域およびエクソン１）、Ｍ１６７９２（ヒトＨＥＲ－２遺伝子、エクソン４）、Ｍ１６７９１（ヒトＨＥＲ－２遺伝子、エクソン３）、Ｍ１６７９０（ヒトＨＥＲ－２遺伝子、エクソン２）、およびＭ１６７８９（ヒトＨＥＲ－２遺伝子、プロモーター領域およびエクソン１）。ＨＥＲ－２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列はＧＥＮＢＡＮＫ（商標）で入手できる。アクセッション番号ＡＡＡ５８６３７。これらの配列に基づいて、当業者は、既知のアッセイを使用してＨＥＲ－２／ｎｅｕ抗原を開発し、効果的な免疫応答を生成する適切なエピトープを見出すことができる。例示的なＨＥＲ－２／ｎｅｕ抗原には、ｐ３６９－３７７（ＨＥＲ－２／ｎｅｕ由来のＨＬＡ－Ａ２ペプチド）、ｄＨＥＲ２（ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｌｉ－ＫｅｙＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッド（ＧｅｎｅｒｅｘＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ペプチドＰ４（アミノ酸３７８～３９８）、ペプチドＰ７（アミノ酸６１０～６２３）、ペプチドＰ６（アミノ酸５４４～５６０）とＰ７の混合物、ペプチドＰ４、Ｐ６およびＰ７の混合物、ＨＥＲ２［９_７５４］などが含まれる。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗原である。ＥＧＦＲ抗原は、ＥＧＦＲバリアント１抗原、ＥＧＦＲバリアント２抗原、ＥＧＦＲバリアント３抗原および／またはＥＧＦＲバリアント４抗原であり得る。ＥＧＦＲを過剰発現する細胞を伴うがんは、ＥＧＦＲ^＋がんと呼ばれる。例示的なＥＧＦＲ^＋がんには、肺癌、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、脳癌、および膀胱癌が含まれる。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）抗原である。ＶＥＧＦＲは、がん誘発性血管新生の調節因子であると考えられている。ＶＥＧＦＲを過剰発現する細胞を伴うがんは、ＶＥＧＦＲ^＋がんと呼ばれる。例示的なＶＥＧＦＲ^＋がんには、乳癌、肺癌、小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、白血病、およびリンパ球性白血病が含まれる。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、アンドロゲン非依存性前立腺癌において一般的に発現される前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および／または前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）である。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、黒色腫に関連する腫瘍特異的抗原である糖タンパク質１００（ｇｐ１００）である。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、がん胎児性（ＣＥＡ）抗原である。ＣＥＡを過剰発現する細胞を伴うがんは、ＣＥＡ^＋がんと呼ばれる。例示的なＣＥＡ^＋がんには、結腸直腸癌、胃癌、および膵癌が含まれる。例示的なＣＥＡ抗原には、ＣＡＰ－１（すなわち、ＣＥＡａａ５７１～５７９）、ＣＡＰ１－６Ｄ、ＣＡＰ－２（すなわち、ＣＥＡａａ５５５～５７９）、ＣＡＰ－３（すなわち、ＣＥＡａａ８７～８９）、ＣＡＰ－４（ＣＥＡａａ１～１１）、ＣＡＰ－５（すなわち、ＣＥＡａａ３４５～３５４）、ＣＡＰ－６（すなわち、ＣＥＡａａ１９～２８）およびＣＡＰ－７が含まれる。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、炭水化物抗原１０．９（ＣＡ１９．９）である。ＣＡ１９．９は、ＬｅｗｉｓＡ血液型物質に関連するオリゴ糖であり、結腸直腸癌に関連している。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、黒色腫癌抗原である。黒色腫癌抗原は、黒色腫の治療に有用である。例示的な黒色腫癌抗原には、ＭＡＲＴ－１（例えば、ＭＡＲＴ－１２６～３５ペプチド、ＭＡＲＴ－１２７～３５ペプチド）、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ、ｐＭｅｌ１７、ｐＭｅｌ１７／ｇｐ１００、ｇｐ１００（例えば、ｇｐ１００ペプチド２８０～２８８、ｇｐ１００ペプチド１５４～１６２、ｇｐ１００ペプチド４５７～４６７）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ１６、ベータカテニン、ｍｕｍ－１などが含まれる。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、変異型または野生型のｒａｓペプチドである。変異体ｒａｓペプチドは、変異体Ｋ－ｒａｓペプチド、変異体Ｎ－ｒａｓペプチド、および／または変異体Ｈ－ｒａｓペプチドである可能性がある。ｒａｓタンパク質の変異は、通常、位置１２（例えば、グリシンを置換するアルギニンまたはバリン）、１３（例えば、グリシンを置換するアスパラギン）、６１（例えば、グルタミンからロイシン）、および／または５９で発生する。変異ｒａｓペプチドは、肺癌抗原、胃腸癌抗原、肝細胞腫抗原、骨髄性癌抗原（例えば、急性白血病、骨髄異形成）、皮膚癌抗原（例えば、黒色腫、基底細胞、扁平上皮細胞）、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、結腸直腸癌抗原、および腎細胞癌抗原として有用であり得る。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、変異体および／または野生型ｐ５３ペプチドである。ｐ５３ペプチドは、結腸癌抗原、肺癌抗原、乳癌抗原、肝細胞癌癌抗原（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ）、リンパ腫癌抗原、前立腺癌抗原、甲状腺癌抗原、膀胱癌抗原、膵癌抗原および卵巣癌抗原として使用することができる。

さらなる腫瘍抗原は、当技術分野で周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、がん胚性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、甲状腺グロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸のカルボキシエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、チロシナーゼ、プロステイン、ＰＳＭＡ、ｒａｓ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＡＧ－７２、ＫＳＡ、ＣＡ－１２５、ＰＳＡ、ＢＲＣＩ、ＢＲＣ－ＩＩ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ｐａｘ３－ｆｋｈｒ、ｅｗｓ－ｆｌｉ－１、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＧＰ－１００、ＭＵＣ－１、ＭＵＣ－２、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、およびメソテリンを含む。

特定の実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能する可能性のある多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫ではＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＧＰ１００などの組織特異抗原、前立腺癌では前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ－２／ＮｅｕＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子のグループに属している。標的抗原のさらに別のグループは、がん胎児性（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性（ｏｎｃｏ－ｆｅｔａｌ）抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫の標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いた受動免疫療法の標的として使用されてきたが、成功は限られている。

腫瘍抗原はまた、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞では発生しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に特有のものではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞に発現する。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こる可能性がある。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できないか、あるいはそれらが通常、正常細胞では非常に低いレベルで存在するが、腫瘍細胞でははるかに高いレベルで発現される抗体であり得る胎児発育中に、正常細胞で発現される。

ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下が含まれる：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、Ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｉ５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現した胚性抗原；過剰発現したがん遺伝子およびｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなどの変異型腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、１ＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲなどの染色体転座に起因する独特の腫瘍抗原；ならびにエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４_（７９１Ｔｇｐ７２_｝アルファ－フェトタンパク質、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｉ、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質、アシクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが含まれる。

治療用抗体は、抗体の断片、抗体を含む錯体、または抗体を含むコンジュゲートである可能性がある抗体は、任意選択的に、キメラ抗体、またはヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体であり得る。

免疫チェックポイント遮断
いくつかの態様において、本開示は、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイントブロッカーと併せて使用もしくは実行される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を提供する。

Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能は、「免疫チェックポイント」と呼ばれる共刺激および阻害性シグナルによってバランスがとられている。Ｔ細胞エフェクター機能を調節する阻害性配位子および受容体は、腫瘍細胞で過剰発現している。続いて、共刺激受容体のアゴニストまたは阻害性シグナルのアンタゴニストにより、抗原特異的Ｔ細胞応答が増幅される。腫瘍細胞を直接標的とする治療用抗体とは対照的に、免疫チェックポイントブロッカーは内因性の抗腫瘍活性を増強する。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用するのに好適な免疫チェックポイントブロッカーは、阻害性シグナルのアンタゴニスト、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、またはＴＩＭ３を標的とする抗体である。これらの配位子と受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２－２６４，２０１２で概説されている。

特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、阻害性免疫調節剤からのシグナル伝達を妨害もしくは阻害する抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、阻害性免疫調節剤からのシグナル伝達を妨害または阻害する小分子である。

特定の実施形態において、阻害性免疫調節剤（免疫チェックポイントブロッカー）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路の構成要素である。したがって、本開示の特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫療法のための方法を提供し、本方法は、治療有効量の、ＰＤ－１受容体とその配位子であるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とその配位子であるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野で知られている抗体は、本明細書に開示される方法での使用に好適である。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ－１を標的とし、臨床試験中の抗体には、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５、Ｍｅｒｃｋ）が含まれる。本明細書に開示される方法で使用するための他の好適な抗体は、米国特許第８，００８，４４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ－１抗体である。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、かつＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、抗腫瘍免疫応答を刺激する、当技術分野で知られている抗体は、本明細書に開示される方法での使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とし、臨床試験中の抗体には、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の適切な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する抗体は、本明細書に開示される方法での使用に好適であることが、当業者によって理解されるであろう。

特定の実施形態において、阻害性免疫調節剤は、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路の構成要素である。したがって、本開示の特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫療法のための方法を提供し、本方法は、ＣＴＬＡ－４を標的とし、治療有効量の、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。ＣＴＬＡ－４を標的とする例示的な抗体には、ＦＤＡ承認のイピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、および現在ヒトでの試験中であるトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が含まれる。ＣＴＬＡ－４を標的とする他の好適な抗体は、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、同第６，６８２，７３６８号、および米国特許出願第２００２／００３９５８１号、同第２００２／００８６０１４号、および同第２００５／０２０１９９４号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示される方法での使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。

特定の実施形態において、阻害性免疫調節剤は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の構成要素である。したがって、本開示の特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫療法のための方法を提供し、本方法は、治療有効量の、ＬＡＧ３を標的とし、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。ＬＡＧ３を標的とする例示的な抗体は、現在、ヒトでの試験が行われているＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ３を標的とする他の好適な抗体は、米国特許出願第２０１１／０１５０８９２号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＬＡＧ３に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示される方法での使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。

特定の実施形態において、阻害性免疫調節剤は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の構成要素である。特定の実施形態において、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４である。したがって、本開示の特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫療法のための方法を提供し、本方法は、治療有効量の、Ｂ７－Ｈ３またはＨ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。Ｂ７ファミリーには定義された受容体はないが、これらの配位子は腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で上方調節される。前臨床マウスモデルは、これらの配位子の遮断が抗腫瘍免疫を増強できることを示している。Ｂ７－Ｈ３を標的とする例示的な抗体は、現在、ヒトでの試験が行われているＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）である。ＬＡＧ３を標的とする他の好適な抗体は、米国特許出願第２０１３／０１４９２３６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。Ｂ７－Ｈ３またはＨ４に結合し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示される方法での使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。

特定の実施形態において、阻害性免疫調節剤は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の構成要素である。したがって、本開示の特定の実施形態は、がんに罹患している対象の免疫療法のための方法を提供し、本方法は、治療有効量の、ＬＡＧ３を標的とし、ガレクチン９とのその相互作用を破壊する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。ＴＩＭ３を標的とする好適な抗体は、米国特許出願第２０１３／００２２６２３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＴＩＭ３に結合し、ガレクチン９との相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する任意の抗体が、本明細書に開示される方法での使用に適していることが、当業者によって理解されるであろう。

本明細書に開示される方法で使用するのに好適な免疫チェックポイントを標的とする抗体は、上記に記載されたものに限定されないことを理解されたい。さらに、標的化が、例えば、Ｔ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２）に反映されるように、抗腫瘍免疫応答の刺激をもたらすという条件で、他の免疫チェックポイント標的もまた、本明細書に記載の方法においてアンタゴニストまたは抗体によって標的化され得ることが当技術分野の当業者によって理解されるであろう。

がんワクチン
いくつかの態様において、本開示は、がんワクチンと併せて使用または実行される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、がんワクチンは、腫瘍関連抗原などの特定の標的に対する特定の免疫応答を刺激する。

特定の実施形態において、がんワクチンは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に組換え遺伝子を送達するためのウイルス、細菌または酵母ベクターを含む。

特定の実施形態において、がんワクチンは、自家または同種異系の腫瘍細胞を使用する。特定の実施形態において、これらの腫瘍細胞は、ＭＨＣ、共刺激分子、またはサイトカインの発現のために修飾され得る。

特定の実施形態において、腫瘍関連抗原は、患者の腫瘍細胞を配列決定し、腫瘍にのみ見られる変異タンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は「新生抗原」と呼ばれる。腫瘍抗原が同定されると、ワクチンの抗原として、または腫瘍抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を開発するために使用できる。

特定の実施形態において、ワクチンは、ＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインで形質導入されたか、またはＧＭ－ＣＳＦ分泌腫瘍細胞ワクチンＧＶＡＸなどのアジュバント化合物を負荷した照射腫瘍細胞を含む（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，２２２（１）：２８７－２９８，２００８）。特定の実施形態において、ワクチンは、免疫原性組成物の形態で、任意選択的にアジュバントと組み合わせて、１つ以上の腫瘍関連抗原を含む。例えば、ＨＰＶ－１６オンコタンパク質に対するワクチン接種により、外陰上皮内新生物に対して陽性の臨床転帰が得られた（ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６１（１９），１８３８－１８４７，２０１２）。また、単回投与シクロホスファミド後のがんワクチンＩＭＡ９０１に対するマルチペプチド免疫応答は、患者の生存期間の延長と関連している（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，１８（８）：１２５４－６１，２０１２）。代替的に、ＤＮＡベースのアプローチを使用して、１つ以上の腫瘍関連抗原で患者を免疫することができる。腫瘍免疫の改善は、マウス黒色腫において抗チロシナーゼ関連タンパク質－１モノクローナル抗体とＤＮＡワクチンを併用して観察される（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６８（２３），９８８４－９８９１，２００８）。

他のワクチンアプローチは、腫瘍関連抗原とともに培養できる樹状細胞などの患者の免疫細胞を利用して、免疫系を刺激し、目的の抗原を標的とする抗原提示細胞を生成する。このアプローチを使用する現在のＦＤＡ承認のがん治療ワクチンはＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）であり、転移性前立腺癌を有する一部の男性での使用が承認されている。このワクチンは、ほとんどの前立腺癌細胞に見られる抗原である前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に対する免疫応答を刺激する。ワクチンは、特定の患者の免疫細胞を単離し、樹状細胞をＰＡＰを用いて培養して、免疫系を刺激し、ＰＡＰを標的とする抗原提示細胞を生成することによって作製される。これらおよび他のがんワクチンは、本明細書に記載されている他の治療法と組み合わせて使用することができる。

両親媒性ワクチン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体とともに使用するのに好適ながんワクチンは、ＵＳ２０１３／０２９５１２９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される両親媒性ワクチンである。両親媒性ワクチンは、アルブミン結合脂質とペプチド抗原または分子アジュバントとを組み合わせて、ペプチドまたはアジュバントをインビボでリンパ節に効率的に標的化する。脂質コンジュゲートは内因性アルブミンに結合し、それらをリンパ管および流入領域リンパ節に標的化し、抗原提示細胞によるアルブミンの濾過により蓄積する。脂質コンジュゲートが抗原ペプチドまたは分子アジュバントを含む場合、コンジュゲートは強力な免疫応答を誘導または増強する。

リンパ節標的化コンジュゲートには、通常、３つのドメインが含まれる：親油性が高いアルブミン結合ドメイン（例えば、アルブミン結合脂質）、分子アジュバントまたはペプチド抗原などのカーゴ、およびコンジュゲートの溶解性を促進し、脂質の細胞原形質膜への挿入能力を低減する極性ブロックリンカー。したがって、特定の実施形態において、コンジュゲートの一般的な構造はＬ－Ｐ－Ｃであり、「Ｌ」はアルブミン結合脂質であり、「Ｐ」は極性ブロックであり、「Ｃ」は分子アジュバントまたはポリペプチドなどのカーゴである。いくつかの実施形態において、カーゴ物自体も極性ブロックドメインとして機能することができ、別個の極性ブロックドメインは必要とされない。したがって、特定の実施形態において、コンジュゲートは、アルブミン結合脂質およびカーゴの２つのドメインのみを有する。

本明細書に開示される方法で使用するのに好適なコンジュゲートのカーゴは、典型的には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドなどの分子アジュバント、またはペプチド抗原である。しかしながら、カーゴは、他のオリゴヌクレオチド、ペプチド、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、または他の免疫調節化合物、色素、ＭＲＩ造影剤、フルオロフォア、またはリンパ節への効率的な輸送を必要とする小分子薬でもあり得る。

特定の実施形態において、脂質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、脂質に直接コンジュゲートされるか、または脂質にコンジュゲートされるリンカーに連結される免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態は、脂質に直接コンジュゲートされているか、または脂質にコンジュゲートされたリンカーに連結された抗原ペプチドを含む脂質－ペプチド結合体に関する。

脂質
脂質コンジュゲートは通常、疎水性脂質を含む。脂質は、直鎖、分岐鎖、または環状である可能性がある。脂質は、好ましくは少なくとも１７～１８個の炭素の長さであるが、良好なアルブミン結合とリンパ節への適切な標的化を示す場合は、より短くなる可能性がある。リンパ節標的化コンジュゲートには、リンパ節を介して送達部位からリンパ節に輸送され得る脂質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび脂質－ペプチドコンジュゲートが含まれる。特定の実施形態において、活性は、部分的に、対象の血液中のアルブミンと会合するコンジュゲートの能力に依存する。したがって、リンパ節を標的とするコンジュゲートには、通常、生理学的条件下でアルブミンに結合できる脂質が含まれている。リンパ節を標的とするのに適した脂質は、脂質または脂質を含む脂質コンジュゲートがアルブミンに結合する能力に基づいて選択することができる。脂質または脂質コンジュゲートがアルブミンに結合する能力を試験するための好適な方法は、当技術分野で知られている。

例えば、特定の実施形態において、複数の脂質コンジュゲートは、水溶液中で自発的にミセルを形成することが可能である。ミセルは、アルブミン、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）などのアルブミンを含む溶液とインキュベートされる。サンプルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィー、または他の方法によって分析して、結合が起こったかどうかを決定することができる。脂質コンジュゲートは、アルブミンの存在下、またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）などのアルブミンを含む溶液の場合、リンパ節標的コンジュゲートとして選択でき、ミセルは解離し、脂質コンジュゲートは上記のようにアルブミンに結合する。

リンパ節標的化脂質コンジュゲートで使用するための好ましい脂質の例には、８～３０個の炭素の脂肪族尾部を有する脂肪酸（直鎖不飽和および飽和脂肪酸、分岐鎖飽和および不飽和脂肪酸を含むがこれらに限定されない）、ならびに脂肪酸エステル、脂肪酸アミドおよび脂肪酸チオエステルなどの脂肪酸誘導体、ジアシル脂質、コレステロール、コレステロール誘導体、ならびに胆汁酸、リピドＡまたはそれらの組み合わせなどのステロイド酸が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、脂質は、ジアシル脂質または２つの尾部を有する脂質（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄｌｉｐｉｄ）である。いくつかの実施形態において、ジアシル脂質の尾部は、約８～約３０個の炭素を含有し、飽和、不飽和、またはそれらの組み合わせであり得る。尾部は、エステル結合連結、アミド結合連結、チオエステル結合連結、またはそれらの組み合わせを介して先端基にカップリングすることができる。特定の実施形態において、ジアシル脂質は、ホスフェート脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、またはそれらの組み合わせである。

好ましくは、リンパ節標的化コンジュゲートは、長さが８炭素単位以上である脂質を含む。脂質単位の数を増やすと、細胞の原形質膜への脂質の挿入を低減することができ、脂質コンジュゲートが自由にアルブミンに結合し、リンパ節に輸送できるようになると考えられている。

例えば、脂質は、２つのＣ１８炭化水素尾部から構成されるジアシル脂質であり得る。

特定の実施形態において、脂質コンジュゲートを標的とするリンパ節を調製する際に使用するための脂質は、一本鎖炭化水素（例えば、Ｃ１８）またはコレステロールではない。コレステロールコンジュゲーションは、ＣｐＧおよびペプチドの免疫原性などの分子アジュバントの免疫調節を増強するために検討されてきたが、リポタンパク質との会合は良好であるが、アルブミンとの会合は不十分なコレステロールコンジュゲートは、最適なアルブミン結合コンジュゲートと比較して、ワクチンのリンパ節標的化が不十分であり、免疫原性が低いことを示している。

分子アジュバント
特定の実施形態において、脂質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートがワクチンにおいて使用される。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、通常、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。

特定の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）のための配位子として機能することができる。ＰＲＲの例には、自然免疫応答の開始に役割を果たし、後のより抗原特異的な適応免疫応答にも影響を与えるＴｏｌｌ様ファミリーのシグナル伝達分子が含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）などのＴｏｌｌ様ファミリーシグナル伝達分子の配位子として機能することができる。

例えば、非メチル化ＣｐＧ部位は、ヒトの形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞上のＴＬＲ９によって検出できる（Ｚａｉｄａ，ｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，７６（５）：２１２３－２１２９，（２００８））。したがって、オリゴヌクレオチドの配列は、１つ以上の非メチル化シトシン－グアニン（ＣＧまたはＣｐＧ、交換可能に使用される）ジヌクレオチドモチーフを含むことができる。「ｐ」は、ＤＮＡのホスホジエステル骨格を指し、以下でより詳細に論じられるように、ＣＧを含む一部のオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有することができる。

特定の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、隣接して配置されるか、または介在するヌクレオチドによって分離される、複数のＣＧジヌクレオチドを含むことができる。ＣｐＧモチーフはオリゴヌクレオチド配列の内部にある可能性がある。多数のヌクレオチド配列がＴＬＲ９を刺激し、ＣＧジヌクレオチドの数および位置、ならびにＣＧ二量体に隣接する正確な塩基配列は様々である。

通常、ＣＧＯＤＮは、その配列、二次構造、およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する影響に基づいて分類される。５つのクラスは、クラスＡ（種類Ｄ）、クラスＢ（種類Ｋ）、クラスＣ、クラスＰ、およびクラスＳである（Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｊ＆Ｋｒｉｅｇ，ＡＭ，Ａｄｖａｎｃｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｒｅｖｉｅｗｓ６１（３）：１９５－２０４（２００９）（参照により本明細書に組み込まれる））。ＣＧＯＤＮは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮαなど）の産生を刺激し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導することができる。一部のクラスのＯＤＮは、間接的なサイトカインシグナル伝達を介したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の強力な活性化因子でもある。一部のクラスは、ヒトＢ細胞および単球成熟の強力な刺激因子である（Ｗｅｉｎｅｒ，ＧＬ，ＰＮＡＳＵＳＡ９４（２０）：１０８３３－７（１９９７）；Ｄａｌｐｋｅ，ＡＨ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０６（１）：１０２－１２（２００２）；Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ，ＪｏｆＩｍｍｕｎ．１６４（３）：１６１７－２（２０００）（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる））。

いくつかの実施形態によれば、親油性－ＣｐＧオリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用して、ペプチド抗原に対する免疫応答を増強する。親油性－ＣｐＧオリゴデオキシドは以下のように表され、「Ｌ」はジアシル脂質などの親油性化合物、「Ｇ_ｎ」はグアニンリピートリンカー、「ｎ」は１、２、３、４、または５を表す。
５’－Ｌ－Ｇ_ｎＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’

他のＰＲＲＴｏｌｌ様受容体には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび短い二本鎖ＲＮＡ、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体、すなわちＲＩＧ－Ｉ、ならびに黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）を認識する可能性のあるＴＬＲ３およびＴＬＲ７が含まれ、これらはサイトゾルのＲＮＡ感知受容体として最もよく知られている。したがって、特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、またはＲＩＧ－１様受容体、またはそれらの組み合わせのための機能的配位子を含む。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびそれらを作製する方法の例は、当技術分野で知られている。例えば、Ｂｏｄｅｒａ，Ｐ．ＲｅｃｅｎｔＰａｔＩｎｆｌａｍｍＡｌｌｅｒｇｙＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．５（１）：８７－９３（２０１１）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドカーゴは、２つ以上の免疫刺激配列を含む。

オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが５ヌクレオチド塩基、長さが１０ヌクレオチド塩基、長さが１５ヌクレオチド塩基、長さが２０ヌクレオチド塩基、長さが２５ヌクレオチド塩基、長さが３０ヌクレオチド塩基長さ、長さが３５ヌクレオチド塩基、長さが４０ヌクレオチド塩基、長さが４５ヌクレオチド塩基、長さが５０ヌクレオチド塩基、長さが６０ヌクレオチド塩基、長さが７０ヌクレオチド塩基、長さが８０ヌクレオチド塩基、長さが９０ヌクレオチド塩基、長さが９５ヌクレオチド塩基、長さが９８ヌクレオチド塩基、長さが１００ヌクレオチド塩基またはそれ以上を含む２～１００ヌクレオチド塩基の長さであり得る。

オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は、極性ブロックもしくは脂質にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’末端は、極性ブロックまたは脂質に連結されている。

オリゴヌクレオチドは、典型的には複素環式塩基（核酸塩基）、複素環式塩基に結合した糖部分、および糖部分のヒドロキシル機能をエステル化するホスフェート部分を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであり得る。主要な天然ヌクレオチドは、複素環式塩基としてのウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン、ならびにホスホジエステル結合によって連結されたリボースまたはデオキシリボース糖を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡの対応物と比較して安定性、半減期、または標的受容体に対する特異性もしくは親和性を改善するために化学的に修飾されているヌクレオチド類似体から構成される。化学修飾には、核酸塩基、糖部分、ヌクレオチド結合、またはそれらの組み合わせの化学修飾が含まれる。本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」または「化学修飾ヌクレオチド」は、複素環式塩基、糖部分またはホスフェート部分の構成要素のうちの１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを定義する。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して減少している。例えば、オリゴヌクレオチドは、負電荷が低い、電荷を有しない、または正電荷を有することができる。

典型的には、ヌクレオシド類似体は、標準的なポリヌクレオチド塩基とのワトソンクリック塩基対形成によって水素結合が可能な塩基を支持し、類似体骨格は、標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）におけるオリゴヌクレオチド類似体分子と塩基との間の配列特異的な様式でのそのような水素結合を可能にする方法で塩基を提示する。特定の実施形態において、類似体は、実質的に非荷電のリン含有骨格を有する。

ペプチド抗原
本明細書に開示される方法で使用するのに好適なペプチドコンジュゲートは、典型的には、腫瘍関連抗原もしくはその一部などの抗原性タンパク質またはポリペプチドを含む。

ペプチドは、例えば、５個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、２５個のアミノ酸、３０個のアミノ酸、３５個のアミノ酸、４０個のアミノ酸、４５個のアミノ酸、または５０個のアミノ酸を含む、２～１００個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、５０個のアミノ酸よりも大きい可能性がある。いくつかの実施形態において、ペプチドは、＞１００個のアミノ酸である可能性がある。

タンパク質／ペプチドは、直鎖、分岐鎖、または環状であることができる。ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端で極性ブロックまたは脂質にコンジュゲートさせることができる。

タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質またはペプチドに対する抗体およびＴ細胞応答を発現する免疫系の能力を誘導または増加させることができる任意のタンパク質またはペプチドであり得る。がん抗原は、通常、がん細胞によって優先的に発現される抗原であり（すなわち、非がん細胞よりもがん細胞において、より高いレベルで発現される）、場合によっては、がん細胞によってのみ発現される。がん抗原は、がん細胞内またはがん細胞の表面上に発現し得る。がん抗原は、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、がん胚性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ－１、ＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、ＰＳＡ－３、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖、およびＣＤ２０である可能性があるが、これらに限定されない。がん抗原は、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－０５）、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、腺腫性ポリポーシスコリタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ－イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ－１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード化核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１およびＣＴ－７、ＣＤ２０、またはｃ－ｅｒｂＢ－２からなる群から選択されてもよい。追加のがん抗原には、本明細書に記載の腫瘍抗原が含まれる。

適切な抗原は当技術分野で知られており、商業政府および科学的情報源から入手可能である。特定の実施形態において、抗原は、完全に不活化または照射された腫瘍細胞である。抗原は、腫瘍に由来する精製されたまたは部分的に精製されたポリペプチドであり得る。抗原は、異種発現系においてポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現することによって産生される組換えポリペプチドであり得る。抗原は、抗原性タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態であり得る。

特定の実施形態において、抗原は、単一の抗原として提供され得るか、または組み合わせて提供され得る。抗原はまた、ポリペプチドまたは核酸の複雑な混合物として提供され得る。

極性ブロック／リンカー
コンジュゲートがリンパ節に効率的に輸送されるためには、コンジュゲートは可溶性のままでなければならない。したがって、コンジュゲートの溶解度を高めるために、カーゴと脂質との間に極性ブロックリンカーを含めることができる。極性ブロックは、注射部位に隣接する組織の細胞などの細胞の原形質膜に脂質が挿入される能力を低減または防止する。極性ブロックはまた、ＰＳ骨格を含む合成オリゴヌクレオチドなどのカーゴが、投与部位で細胞外マトリックスタンパク質と非特異的に結合する能力を低減または防止することができる。極性ブロックは、アルブミンへの結合能力を妨げることなく、コンジュゲートの溶解度を高める。この特徴の組み合わせにより、コンジュゲートが血清または間質液に存在するアルブミンに結合し、アルブミンがリンパ節に輸送されて保持されるまで循環し続けることができると考えられている。

極性ブロックの長さと組成は、選択した脂質とカーゴに基づいて調整できる。例えば、オリゴヌクレオチドコンジュゲートの場合、オリゴヌクレオチド自体は、コンジュゲートの溶解性を保証するのに十分に極性であり得、例えば、長さが１０、１５、２０またはそれ以上のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドである。したがって、特定の実施形態において、追加の極性ブロックリンカーは必要とされない。ただし、アミノ酸配列によっては、一部の脂質化ペプチドは本質的に不溶性である可能性がある。これらの場合、極性オリゴヌクレオチドの効果を模倣する極性ブロックを含めることが望ましい場合がある。

極性ブロックは、本明細書に開示される方法で使用するのに好適な脂質コンジュゲート、例えば、細胞膜挿入／アルブミン上の優先的分割を低減する脂質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび脂質－ペプチドコンジュゲート、のうちのいずれかの一部として使用することができる。適切な極性ブロックには、上記のようなオリゴヌクレオチド、ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ：５００Ｄａ～２０，０００Ｄａ）、ポリアクリルアミド（ＭＷ：５００Ｄａ～２０，０００Ｄａ）、ポリアクリルアミドを含むがこれらに限定されない親水性ポリマー；セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、またはデクストラン（ＭＷ：１，０００Ｄａ～２，０００，０００Ｄａ）もしくはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない多糖類の組み合わせなどの一連の親水性アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。

疎水性脂質とリンカー／カーゴは共有結合的に連結している。共有結合は、切断不可能な連結または切断可能な連結であり得る。切断不可能な連結は、アミド結合またはリン酸結合を含み得、切断可能な連結は、二硫化物結合、酸切断可能連結、エステル結合、無水物結合、生分解性結合、または酵素切断可能連結を含み得る。

エチレングリコールリンカー
特定の実施形態において、極性ブロックは、１つ以上のエチレングリコール（ＥＧ）単位、より好ましくは２つ以上のＥＧ単位（すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。例えば、特定の実施形態において、ペプチドコンジュゲートは、タンパク質またはペプチド（例えば、ペプチド抗原）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子またはその誘導体もしくは類似体によって連結された疎水性脂質を含む。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用するのに好適なタンパク質コンジュゲートは、共有結合的にまたはオリゴミセルにハイブリダイズするタンパク質－オリゴコンジュゲートの形成により、次に疎水性脂質または脂質－Ｇｎ－ＯＮコンジュゲートに連結されるＰＥＧに連結されたタンパク質抗原を含有する。ＥＧ単位の正確な数は脂質およびカーゴに依存するが、通常、極性ブロックは約１～約１００個、約２０～約８０個、約３０～約７０個、または約４０～約６０個のＥＧ単位を有し得る。特定の実施形態において、極性ブロックは、約４５～５５個のＥＧ単位を有する。例えば、特定の実施形態において、極性ブロックは４８個のＥＧ単位を有する。

オリゴヌクレオチドリンカー
上記のように、特定の実施形態において、極性ブロックはオリゴヌクレオチドである。極性ブロックリンカーは、任意の配列を有することができ、例えば、オリゴヌクレオチドの配列は、ランダム配列、またはその分子的もしくは生化学的特性のために特別に選択された配列（例えば、高度に極性）であり得る。特定の実施形態において、極性ブロックリンカーは、一連の連続するアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそれらの類似体を１つ以上含む。特定の実施形態において、極性ブロックリンカーは、一連の連続するアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはそれらの類似体からなる。

特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上のグアニン、例えば、１～１０個のグアニンである。ＣｐＧオリゴデオキシドミンなどのカーゴと脂質尾部の間でグアニンの数を変えると、血清タンパク質の存在下でミセルの安定性が制御されることが発見されている。したがって、リンカー中のグアニンの数は、アルブミンなどの血清タンパク質に対するコンジュゲートの所望の親和性に基づいて選択することができる。カーゴがＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドであり、脂質尾部がジアシル脂質である場合、グアニンの数は、水溶液中で形成されたミセルが血清の存在下で解離する能力に影響する：安定化されていないミセル（リポ－Ｇ_０Ｔ_１０－ＣＧ）の２０％は無傷であったが、残りの８０％は破壊され、ＦＢＳ構成要素と結合していた。グアニンの存在下では、無傷のミセルのパーセンテージは３６％（リポ－Ｇ_２Ｔ_８－ＣＧ）～７３％（リポ－Ｇ_４Ｔ_６－ＣＧ）に増加し、最終的に９０％（リポ－Ｇ_６Ｔ_４－ＣＧ）に達した。グアニンの数を８（リポ－Ｇ_８Ｔ_２－ＣＧ）および１０（リポ－Ｇ_１０Ｔ_０－ＣＧに増やしても、ミセルの安定性はそれ以上向上しなかった。

したがって、特定の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用するのに好適なリンパ節標的化コンジュゲート中のリンカーは、０、１、または２つのグアニンを含むことができる。以下でより詳細に議論されるように、３つ以上の連続したグアニンを含むリンカーを使用して、本明細書に開示される方法で使用するのに好適な特性を有するミセル安定化コンジュゲートを形成することができる。

免疫原性組成物
本明細書に開示される方法で使用するのに好適なコンジュゲートは、免疫原性組成物で、またはワクチンの構成要素として使用することができる。典型的には、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバント、抗原、またはそれらの組み合わせを含む。アジュバントと抗原の組み合わせは、ワクチンと呼ばれることがある。対象に組み合わせて投与する場合、アジュバントおよび抗原は、別々の薬学的組成物で投与することができ、あるいはそれらを同じ薬学的組成物で一緒に投与することができる。組み合わせて投与される場合、アジュバントは脂質コンジュゲートであり得るか、抗原は脂質コンジュゲートであり得るか、またはアジュバントおよび抗原は両方とも脂質コンジュゲートであり得る。

本明細書に開示される方法で使用するのに好適な免疫原性組成物は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与される、抗原性ポリペプチド－脂質コンジュゲートなどの抗原である脂質コンジュゲートを含むことができる。アジュバントは、限定されないが、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画により２１番目のピークで溶出する糖脂質；Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ））などのＱ．ｓａｐｏｎａｒｉａの木の樹皮から精製されたサポニン；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー、ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳＡ））、Ｆｌｔ３配位子、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）伸長因子（精製リーシュマニアタンパク質；ＣｏｒｉｘａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ））、ＩＳＣＯＭＳ（混合サポニン、脂質を含有し、かつ、抗原を保持できる細孔を持つウイルスサイズの粒子を形成する免疫刺激複合体、ＣＳＬ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＳＢ－ＡＳ４（ミョウバンとＭＰＬを含有するＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍアジュバントシステム＃４、ＳＢＢ（Ｂｅｌｇｉｕｍ））、ＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー（これらは、ポリオキシエチレンの鎖に隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を含む、Ｖａｘｃｅｌ、Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇａ））、ならびにモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＭＳ（例えば、ＩＭＳ１３１２、可溶性免疫刺激剤と組み合わせた水性ナノ粒子、Ｓｅｐｐｉｃ）であり得る。

アジュバントは、上記のようなＴＬＲ配位子であり得る。ＴＬＲ３を介して作用するアジュバントには、二本鎖ＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。ＴＬＲ４を介して作用するアジュバントには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ、ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ、Ｒｉｂｉ）およびスレオニル－ムラミルジペプチド（ｔ－ＭＤＰ）などのリポ多糖の誘導体；ＯＭ－１７４（リピドＡに関連するグルコサミン二糖、ＯＭＰｈａｒｍａＳＡ（Ｍｅｙｒｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれるが、これらに限定されない。ＴＬＲ５を介して作用するアジュバントには、フラジェリンが含まれるが、これに限定されない。ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介して作用するアジュバントには、一本鎖ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、イミダゾキノリンアミン（例えば、イミキモド（Ｒ－８３７）、レシキモド（Ｒ－８４８））などの合成低分子量化合物が含まれる。ＴＬＲ９を介して作用するアジュバントには、ウイルスもしくは細菌由来のＤＮＡ、またはＣｐＧＯＤＮなどの合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が含まれる。別のアジュバントクラスは、ホスホロチオエートヌクレオチド類似体およびホスホロチオエート骨格結合を含有する核酸などのホスホロチオエート含有分子である。

アジュバントはまた、油エマルジョン（例えば、フロイントアジュバント）；サポニン配合物；ビロソームおよびウイルス様粒子；細菌および微生物誘導体；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ＡＤＰ－リボシル化毒素および無毒化誘導体；ミョウバン；ＢＣＧ；ミネラル含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などのミネラル塩、水酸化物、ホスフェート、硫酸塩など）；生体接着剤および／または粘膜接着剤；微粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル配合物；ポリホスファゼン；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；ならびに界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）であり得る。

アジュバントには、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン－ガンマ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節因子も含まれ得る。

他の免疫調節融合タンパク質または免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体
いくつかの態様において、本開示は、他の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質と併せて使用または実行される免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を提供する。複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質が使用されるいくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは異なる。

いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、異なるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２およびＩＬ－１２）である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、異なるケモカインである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、異なる活性化配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、異なる阻害性配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、サイトカインおよびケモカインである。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、サイトカインおよび活性化配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、サイトカインおよび阻害性配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ケモカインおよび活性化配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、ケモカインおよび阻害性配位子／受容体である。いくつかの実施形態において、免疫調節ドメインは、活性化配位子／受容体および阻害性配位子／受容体である。

いくつかの実施形態において、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、一緒に配合される。いくつかの実施形態において、複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質は、別々に配合され、同時にまたは連続して投与される。

キット
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つの免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質および使用説明書を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、適切な容器内に、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質、１つ以上の対照、ならびに当技術分野で周知の様々な緩衝液、試薬、酵素および他の標準成分を含む。いくつかの実施形態において、キットは、免疫療法と組み合わせて使用するための説明書をさらに含む。

いくつかの実施形態において、容器は、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を入れることができる、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器手段であり、場合によっては、好適に等分される。追加の構成要素が提供される場合、キットには、この化合物を入れることができる追加の容器を含めることができる。キットには、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質を収容するための手段、および商業販売のために密閉されたその他の試薬容器を含めることもできる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される注射またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。容器および／またはキットには、使用説明書および／または警告のラベルを含めることができる。

いくつかの実施形態において、本開示は、免疫療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、がんワクチン、抗腫瘍関連抗原抗体、および／もしくは免疫チェックポイント遮断）を受けている個人においてがんの治療またはその進行の遅延を行うための、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質、任意選択的な薬学的に許容される担体、を含む容器と、組成物の投与に関する説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている個人においてがんの治療またはその進行の遅延を行うための、本明細書に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質、任意選択的な薬学的に許容される担体、を含む薬剤と、薬剤単独の、または免疫療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、がんワクチン、抗腫瘍関連抗原抗体、および／もしくは免疫チェックポイント遮断）と組み合わせた薬剤の投与に関する説明書を含む添付文書と、を含む、キットを提供する。

定義
特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載されるように定義される。

本明細書で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に示されない限り、複数の指示物を含む。さらに、文脈上特に必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。

本明細書で使用される場合、「約」は、通常の技術者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。それが使用される文脈を考えると、当業者には明らかでない用語の使用がある場合、「約」は、特定の値の最大±１０％を意味する。

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、特定の抗原と組み合わせて使用される場合に、抗原特異的免疫応答を増強および／または指示するように作用する任意の物質を指す。ワクチン抗原と組み合わせると、アジュバントは、ワクチン抗原のみによって誘導される応答と比較して、ワクチン抗原に対する免疫応答を増加させる。アジュバントは、免疫学的メカニズムを促進し、ワクチン抗原に対する出力免疫応答を形成するのに役立つ。

本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に促進、増加、または活性化する任意の分子（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。好適なアゴニスト分子には、具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子などが含まれる。いくつかの実施形態において、アゴニストの存在下での活性化が、用量依存的に観察される。いくつかの実施形態において、測定されたシグナル（例えば、生物学的活性）は、同等の条件下で陰性対照を用いて測定されたシグナルよりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％高い。また、本明細書に開示されるのは、本開示の方法で使用するのに好適なアゴニストを同定する方法である。例えば、これらの方法には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（著作権）システム、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、受容体もしくは配位子）と結合するアゴニストの能力を決定し、したがって、ポリペプチドの活性を促進、増加、または活性化するアゴニストの能力を示す。ポリペプチドの機能を活性化または促進するアゴニストの能力などのアゴニストの有効性は、機能アッセイを使用して決定することもできる。例えば、機能アッセイは、ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させ、ポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。アゴニストの効力は通常、そのＥＣ_５０値（アゴニスト応答の５０％を活性化するのに必要な濃度）によって定義される。ＥＣ_５０値が低いほど、アゴニストの効力が高くなり、最大の生物学的反応を活性化するために必要な濃度が低くなる。

「アルブミン」という用語は、ヒトアルブミン（配列番号８８）と同じまたは非常に類似した三次元構造を有し、安定化ドメインとして使用するための長い血清半減期を有するタンパク質を指す。例示的なアルブミンタンパク質には、ヒト血清アルブミン霊長類血清アルブミン（チンパンジー血清アルブミンなど）、ゴリラ血清アルブミンまたはマカク血清アルブミン、げっ歯類血清アルブミン（ハムスター血清アルブミンなど）、モルモット血清アルブミン、マウス血清アルブミンおよびラット血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ウシ血清アルブミンなど）、ウマ血清アルブミン（ウマ血清アルブミンまたはロバ血清アルブミンなど）、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、ならびにブタ血清アルブミンが含まれる。

「改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語は、予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、またはその治癒を含む、病状（例えばがん）の治療における治療上有益な結果を指す。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基｛例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じように機能する化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号のいずれかで表すことができる。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字のコードで表すことができる。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列（開始ポリペプチドのアミノ酸配列）中の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基を、第２の異なる「置換」アミノ酸残基で置換することを指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加のアミノ酸の組み込みを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」（例えば、約３個～約５個、または最大で約１０個、１５個もしくは２０個のアミノ酸残基の挿入）を行うこともできる。挿入された残基は、上記に開示されたように、天然に存在する場合もあれば、非天然に存在する場合もある。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。

本明細書で使用される場合、「アンカーペプチド」という用語は、ポリペプチドの分泌を妨げるポリペプチドの末端に作動可能に連結された末端標的ペプチド配列を指す。例えば、アミノ酸配列ＫＤＥＬを含むアンカーペプチドは、そのＣ末端にアンカーペプチドを含むポリペプチドの分泌を防ぐ。ＫＤＥＬアンカーペプチドは、ＫＤＥＬアミノ酸配列を含むポリペプチドを回収し、ＥＲへのポリペプチドの逆行性輸送を媒介するゴルジ内在性膜タンパク質であるＫＤＥＬ受容体の配位子である（Ｃａｐｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ（２００９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５８３：３８６３－３８７１）。アミノ酸配列ＫＤＥＬは、哺乳動物細胞でのポリペプチド分泌を防ぐアンカーペプチドである。アミノ酸配列ＨＤＥＬは、酵母および植物細胞でのポリペプチド分泌を防ぐアンカーペプチドである。いくつかの実施形態において、アンカーペプチドは、アミノ酸配列ＫＤＥＬまたはＨＤＥＬを含む。いくつかの実施形態において、アンカーペプチドは、分泌を防止するためにポリペプチドのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、アンカーペプチドは、キナーゼの分泌を防ぐために、ＥＲ標的化リーダー配列およびキナーゼドメインを含むキナーゼのＣ末端に作動可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、本明細書に開示される天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的もしくは完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を指す。好適なアンタゴニスト分子には、具体的には、アンタゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子などが含まれる。いくつかの実施形態において、アンタゴニストの存在下での阻害が、用量依存的に観察される。いくつかの実施形態において、測定されたシグナル（例えば、生物学的活性）は、同等の条件下で陰性対照を用いて測定されたシグナルよりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。また、本明細書に開示されるのは、本開示の方法で使用するのに好適なアンタゴニストを同定する方法である。例えば、これらの方法には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（著作権）システム、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは、目的のポリペプチド（例えば、受容体もしくは配位子）と結合するアンタゴニストの能力を決定し、したがって、ポリペプチドの活性を阻害、中和、または遮断するアンタゴニストの能力を示す。ポリペプチドまたはアゴニストの機能を阻害するアンタゴニストの能力などのアンタゴニストの有効性は、機能アッセイを使用して決定することもできる。例えば、機能アッセイは、ポリペプチドを候補アンタゴニスト分子と接触させ、ポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。アンタゴニストの効力は通常、そのＩＣ_５０値（アゴニスト応答の５０％を阻害するのに必要な濃度）によって定義される。ＩＣ_５０値が低いほど、アンタゴニストの効力が高くなり、最大の生物学的反応を阻害するために必要な濃度が低くなる。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む全抗体を指す。全抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む様々な抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、様々な種、例えば、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチマウス、ハムスター、ラット、およびマウスのうちのいずれかにおいて作製するか、またはそれに由来することができる。抗体は、精製抗体または組換え抗体であり得る。

「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、その表面にＭＨＣと錯体化した外来抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの錯体を認識する。ＡＰＣの例には、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球（ＴＨＰ－１など）、Ｂリンパ芽球様細胞（Ｃ１Ｒ．Ａ２、１５１８Ｂ－ＬＣＬなど）および単球由来樹状細胞（ＤＣ）などが含まれるが、これらに限定されない。一部のＡＰＣは、食作用または受容体媒介型エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内在化する。

「抗原提示」という用語は、ＡＰＣが抗原を捕捉し、例えばＭＨＣ－Ｉおよび／またはＭＨＣ－ＩＩコンジュゲートの構成要素としてのＴ細胞によるそれらの認識を可能にするプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「がん特異的免疫応答」という用語は、腫瘍、がん細胞、またはがん抗原の存在によって誘導される免疫応答を指す。特定の実施形態において、応答は、がん抗原特異的リンパ球の増殖を含む。特定の実施形態において、応答は、抗体およびＴ細胞受容体の発現および上方調節、ならびにリンホカイン、ケモカイン、およびサイトカインの形成および放出を含む。自然免疫系と後天性免疫系の両方が相互作用して、腫瘍、がん細胞、またはがん抗原に対する抗原応答を開始する。特定の実施形態において、がん特異的免疫応答は、Ｔ細胞応答である。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という用語、または同様の用語は、標的抗原に結合し、標的抗原の活性を促進、誘導、および／もしくは増加する能力を保持する抗体の断片を指す。このような断片には、例えば、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖および軽鎖の両方の可変領域を含む単一のポリペプチド鎖である。加えて、イントラボディ、ミニボディ、トライアボディ、およびダイアボディも抗体の定義に含まれ、本明細書に記載の方法での使用に適合している。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａｅｔａｌ．（２００１）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２４８（１）：４７－６６；ＨｕｄｓｏｎａｎｄＫｏｒｔｔ（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２３１（１）：１７７－１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２（１２）：１１２１－１１２３；ＲｏｎｄｏｎａｎｄＭａｒａｓｃｏ（１９９７）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５１：２５７－２８３（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語はまた、例えば、ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓｅｔａｌ．（２００１）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ２６：２３０－２３５；Ｎｕｔｔａｌｌｅｔａｌ．（２０００）ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈ１：２５３－２６３；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．（１９９９）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ２３１：２５－３８；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／０４６７８号および第ＷＯ９４／２５５９１号；および米国特許第６，００５，０７９号（すべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。いくつかの実施形態において、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾された２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。

「Ｂ７ファミリー」は、活性化および阻害性配位子を指す。Ｂ７ファミリーは、少なくとも活性化配位子Ｂ７－１およびＢ７－２、ならびに阻害性配位子Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４を包含する。Ｂ７－１とＢ７－２はＣＤ２８に結合し、Ｂ７－Ｈ１（つまり、ＰＤ－Ｌ１）はＰＤ－１に結合し、Ｂ７－Ｈ２はＩＣＯＳに結合する。Ｂ７－Ｈ３とＢ７－Ｈ４は未知の受容体と結合する。さらに、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４は、腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方調節されることが示されている。完全なｈＢ７－Ｈ３およびｈＢ７－Ｈ４配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ５ＺＰＲ３およびＡＡＺ１７４０６（配列番号４７および４８）の下で見出すことができる。

「がん腫」という用語は、当技術分野で認識されており、呼吸器系がん腫、胃腸系がん腫、泌尿生殖器系がん腫、精巣がん腫、乳がん腫、前立腺がん腫、内分泌系がん腫、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。本明細書に記載の抗ＣＤ１３７抗体および腫瘍抗原標的化抗体は、腎癌または黒色腫を含むあらゆるがん腫を有する、有することが疑われる、または発症するリスクが高い可能性がある患者を治療するために使用することができる。例示的ながん腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるがん腫が含まれる。この用語には、がん性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含むがん肉腫も含まれる。「腺癌」は、腺組織に由来するがん腫、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。

本明細書で使用される場合、「架橋する（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」または「架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｓ）」という用語は、共有結合が形成される反応を含む２つ以上の分子を化学的に接合または結合するプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、（ｉ）少なくとも１つの所定のＣＡＲ配位子もしくは抗原、または所定のＣＡＲ配位子および抗原に結合することができる細胞外ドメイン、（ｉｉ）細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１つ以上の細胞質ドメインを含む細胞内セグメント、ならびに（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、を含む人工膜貫通タンパク質受容体を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ体」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。

「ＣＡＲ抗原」と交換可能に使用される「ＣＡＲ配位子」という句は、ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外ドメイン）に特異的に結合することができる任意の天然もしくは合成分子（例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸）、またはその一部もしくは断片を意味する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ配位子は、腫瘍関連抗原またはその断片である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ配位子はタグである。

「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、細胞内の生物学的プロセスの活性化または阻害、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化を引き起こすシグナルを伝達するように機能することが知られている任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドドメインを意味する。例としては、ＩＬＲ鎖、ＣＤ２８および／またはＣＤ３ζがある。

本明細書で使用される場合、「がん抗原」は、（ｉ）腫瘍特異的抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異的抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胚性抗原、（ｖｉ）自己腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）成長因子受容体、（ｘ）成長因子配位子、および（ｘｉ）がんに関連するその他の種類の抗原または抗原提示細胞もしくは物質を指す。

本明細書で使用される場合、「がんワクチン」は、免疫系が１つ以上の腫瘍関連抗原で細胞を攻撃するように誘導する治療を指す。このワクチンは、特定の個人における既存のがんを治療する（例えば、治療用がんワクチン）か、またはがんの発症を予防する（例えば、予防的がんワクチン）することができる。ワクチンは、抗原で腫瘍細胞を認識し、腫瘍の成長を防ぐメモリ細胞を作製する。

本明細書で使用される場合、「ケモカイン」という用語は、指向性走化性を誘導する小さなサイトカインまたはシグナル伝達タンパク質のファミリーのメンバーを指す。ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、（Ｘ）Ｃ、ＣＸ３Ｃの４つのサブファミリーに分類される。

本明細書で使用される場合、「併用療法」は、組み合わせの有益な効果を提供するレジメンでの各薬剤または治療の連続的または同時の投与、および、例えば、活性剤の比率が固定されている単一のカプセルにおいて、または薬剤ごとに複数の別々のカプセルにおいて、これらの薬剤または療法の実質的に同時の共投与を包含する。併用療法はまた、個々の要素が異なる時間および／または異なる経路によって投与され得るが、組み合わせて作用して、併用療法の各薬剤もしくは腫瘍治療アプローチの共作用または薬物動態および薬力学効果による有益な効果を提供する組み合わせを含む。

本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖および／または重要な分子の上方調節もしくは下方調節をもたらすシグナルを指す。

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）」はＴ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することにより免疫系を下方調節する。本明細書で使用される場合、「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）、ｈＣＴＬＡ－４のバリアント、アイソフォームおよび種相同体、ならびにｈＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全なｈＣＴＬＡ－４配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１６４１０の下で見出すことができる。

指定されたポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有する。この部分は、少なくとも１０～２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０～３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０～５０個のアミノ酸からなるか、そうでなければ、配列にその起源を有するものと当業者が同定できるものである。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して１つ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失を有する１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。

ポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を含むことができる。そのようなバリアントは、必然的に、出発分子と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。特定の実施形態において、バリアントは、例えば、バリアント分子の長さにわたって、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％～１００％未満、より好ましくは約８０％～１００％未満、好ましくは約８５％～１００％未満、より好ましくは約９０％～１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、および最も好ましくは約９５％～１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するであろう。

特定の実施形態において、本開示の抗原は、ヌクレオチド配列によってコードされる。本発明のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子治療、タンパク質の発現および精製、突然変異の導入、ＤＮＡワクチン接種を必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種、例えば、受動免疫、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブ生成のための抗体生成を含む、多くの用途に有用であり得る。

本明細書に開示される方法で使用するのに好適な免疫調節ドメイン、安定化ドメイン、およびキナーゼは、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在するか、もしくは天然配列から配列が変化するように改変することができることも当業者によって理解されるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基での保存的置換もしくは変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換を行うことができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技術によって導入され得る。

本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、必須または非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を含み得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、結合ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。特定の実施形態において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似したストリングで置き換えることができる。代替的に、特定の実施形態において、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体は、本発明の結合ポリペプチドに組み込んで、所望の標的に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。

本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞を薬剤（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質ナノ粒子組成物、または本開示の他の薬学的組成物）と接触させることは、細胞と薬剤が物理的接続を共有するようになされることを意味する。インビボ、インビトロ、およびエクスビボの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学の分野でよく知られている。本開示の例示的な実施形態において、哺乳動物細胞を組成物（例えば、組換えＤＮＡ、単離されたＲＮＡ、ナノ粒子、または本開示の薬学的組成物）と接触させるステップは、インビボで実行される。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳動物）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳動物細胞）との接触は、任意の適切な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下投与を含む、生物への非経口投与）によって実行してもよい。インビトロで存在する細胞の場合、組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離されたＲＮＡ）および細胞は、例えば、組成物を細胞の培養培地に添加することによって接触させてもよく、トランスフェクションを伴うか、またはもたらす可能性がある。さらに、複数の細胞が薬剤によって接触され得る。

本明細書で使用される場合、抗原「交差提示」という用語は、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を介したＴ細胞への外因性タンパク質抗原の提示を指す。

本明細書で使用される場合、「有効用量」または「有効投薬量」という用語は、所望の効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。「治療有効用量」という用語は、すでに疾患に罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、治療されている障害の重症度と患者自身の免疫系の全体的な状態によって異なる。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体、または抗原結合断片）が特異的に結合する抗原上の決定基または部位を指す。タンパク質抗原のエピトープは、「線状エピトープ」と「立体構造エピトープ」に区別することができる。本明細書で使用される場合、「線状エピトープ」という用語は、連結アミノ酸の隣接する直鎖状配列から形成されるエピトープを指す。タンパク質抗原の線状エピトープは、通常、化学的変性剤（酸、塩基、溶媒、架橋試薬、カオトロピック剤、ジスルフィド結合還元剤など）または物理的変性剤（例えば、熱（ｔｈｅｒｍａｌｈｅａｔ）、放射能、機械的せん断もしくは応力など）に曝露されたときに保持される。いくつかの実施形態において、エピトープは非線状であり、中断エピトープ（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄｅｐｉｔｏｐｅ）とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「立体構造エピトープ」という用語は、ポリペプチドの三次折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸から形成されたエピトープを指す。立体構造エピトープは通常、変性剤で処理すると失われる。エピトープは通常、特有の空間コンフォメーションにおいて少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含む。一般に、特定の標的分子に特異的な抗体またはその抗原結合断片は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物内の標的分子上の特定のエピトープを優先的に認識して結合する。

本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」または「エフェクター免疫細胞」という用語は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、抗原を特異的に認識する。免疫エフェクター細胞の例には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞はＴ細胞である。本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター機能」または「免疫エフェクター応答」という用語は、標的に対する免疫応答を促進する免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。

本明細書で使用される場合、「小胞体（ＥＲ）標的化リーダー配列」という用語は、リボソーム翻訳中もしくはその後に、分泌経路にタンパク質を標的化するシグナルペプチド、リーダー配列、またはシグナル配列を指す。ＥＲ標的化リーダー配列は、極性Ｎ末端、疎水性アミノ酸の内部ストレッチを含む短い（例えば、１０～５０個のアミノ酸）アミノ酸配列である。ＥＲ標的化リーダー配列は、ポリペプチドがＥＲ内腔に入るとポリペプチドから切断され、したがって、一般に、Ｃ末端切断モチーフを含む。ＥＲ標的化リーダー配列の特定のアミノ酸配列および長さは、大きく異なる可能性がある。ポリペプチド配列中のＥＲ標的化リーダー配列を予測する方法は当技術分野で知られており、Ｍｅｉｎｋｅｎ，ｅｔ．Ａｌ．（２０１２）ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２：１－７によってさらに記載されている。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。いくつかの実施形態において、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分を指す。いくつかの実施形態において、「Ｆｃドメイン」という用語は、Ｆｖドメインも含む単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の部分を指す。そのため、Ｆｃドメインは「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」と呼ばれることもある。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアント、部分もしくは断片、のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いている。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。ヒトＩｇＧ１定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔＰ０１８５７および配列番号８９に見られる。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号９０に見出すことができる。Ｆｃドメインには、天然ＦｃおよびＦｃバリアント分子が含まれる。Ｆｃバリアントおよび天然Ｆｃの場合と同様に、Ｆｃドメインという用語には、全抗体から消化されたのか、他の手段で産生されたのかにかかわらず、単量体または多量体形態の分子が含まれる。Ｆｃドメインへのアミノ酸残基番号の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う。例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＴａｂｌｅｏｆＣｏｎｔｅｎｔｓ，ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｔａｎｔＲｅｇｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓｓｅｃｔｉｏｎｓ），５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＮＩＨｖｏｌ．１：６４７－７２３（１９９１）；Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤｖｏｌ．ｌ：ｘｉｉｉ－ｘｃｖｉ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３（１９８９）（それぞれ、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

本明細書に記載されるように、任意のＦｃドメインは、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインからアミノ酸配列が変化するように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、エフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ結合）が低下している。

本明細書に開示される免疫調節融合タンパク質で使用するのに好適なＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域と、を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、部分的にＩｇＧ１分子に由来し、部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカー」または「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なＧｌｙ－ＳＥＲポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４ＳＥＲ）ｎを含む。特定の実施形態において、ｎ＝１である。特定の実施形態において、ｎ＝２である。特定の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）３である。特定の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）４である。特定の実施形態において、ｎ＝５である。特定の実施形態において、ｎ＝６である。特定の実施形態において、ｎ＝７である。特定の実施形態において、ｎ＝８である。特定の実施形態において、ｎ＝９である。特定の実施形態において、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含む。特定の実施形態において、ｎ＝１である。特定の実施形態において、ｎ＝２である。特定の実施形態において、ｎ＝３である。特定の実施形態において、ｎ＝４である。特定の実施形態において、ｎ＝５である。特定の実施形態において、ｎ＝６である。別の例示的なｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）ｎを含む。特定の実施形態において、ｎ＝１である。特定の実施形態において、ｎ＝２である。特定の実施形態において、ｎ＝３である。特定の実施形態において、ｎ＝４である。特定の実施形態において、ｎ＝５である。特定の実施形態において、ｎ＝６である。

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８（６４７４）：８５６－８５９）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，（１９９４）ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１１３：４９－１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３およびＨａｒｄｉｎｇ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６－５４６を参照のこと）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含まない。

本明細書で使用される場合、「異種抗体」という用語は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物を含まず、一般にトランスジェニック非ヒト動物以外の種に由来する生物に見られるアミノ酸配列またはコード化核酸配列に対応する配列を有する抗体を指す。

本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル置換部分（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｍｏｉｅｔｙ）」または「ヒドロキシル置換部分（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｒｅｐｌａｃｉｎｇｍｏｉｅｔｙ）」という用語は、金属水酸化物を含む表面ヒドロキシル基を置換するのに有効な化学部分または基を指す。

本明細書で使用される場合、「免疫調節融合タンパク質」という用語は、リンカーを介して、１つ以上の免疫調節ドメインと、任意選択的に安定化ドメインと、を含むポリペプチドに作動可能に連結された金属水酸化物結合ペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、「免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体」という用語は、金属水酸化物結合ペプチドを含む免疫調節融合タンパク質を指すために使用され、免疫調節融合タンパク質は、金属水酸化物結合ペプチドを介した配位子交換により金属水酸化物に吸着され、それにより錯体を形成する。

本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に投与されたときに免疫応答を誘導する調製物を指す。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、がんを有する対象において内因性抗腫瘍免疫応答を誘導するための免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を含む。

「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」という用語は交換可能に使用され、特定の抗原に対する免疫応答（すなわち、受動的または適応的のいずれか）の刺激を指す。ＣＤＣまたはＡＤＣＣの誘導に関して使用される場合、「誘導」という用語は、特定の直接的な細胞殺傷メカニズムの刺激を指す。

本明細書で使用される場合、「成長を阻害する」（例えば、細胞について言及する）という用語は、細胞成長の測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％の細胞成長の阻害を含むことを意図する。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、造血起源の細胞であり、免疫応答において役割を果たす。免疫細胞には、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、ならびに骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球）が含まれる。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、免疫細胞を調節する共刺激および阻害性シグナルを指す。特定の実施形態において、免疫チェックポイントは阻害性シグナルである。特定の実施形態において、阻害性シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用である。特定の実施形態において、阻害性シグナルは、ＣＤ２８結合を置換する、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。特定の実施形態において、阻害性シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用である。特定の実施形態において、阻害性シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９との間の相互作用である。

本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイントブロッカー」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を完全にもしくは部分的に低減、阻害、妨害、または調節する分子を指す。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、免疫チェックポイントに関連する阻害性シグナルを防止する。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、免疫チェックポイントに関連する阻害性シグナル伝達を破壊する抗体またはその断片である。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、阻害性シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、チェックポイントブロッカータンパク質間の相互作用を防止する抗体、その断片または抗体模倣物であり、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＬＡＧ３とその配位子、またはＴＩＭ－３とその配位子との間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。

本明細書で使用される場合、「予防を必要とする」、「治療を必要とする」、または「それを必要とする」対象は、適切なメディカルプラクティショナー（例えば、ヒトの場合には医師、看護師またはナースプラクティショナー、非ヒト哺乳動物の場合は獣医）は、所与の治療（ワクチンを含む組成物による治療など）から合理的に利益を得るだろう。

「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物もしくは微生物）内ではなく、人工環境（例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿など）内で発生するプロセスを指す。「インビボ」という用語は、生体内で発生するプロセスを指す。

「インビボ」という用語は、生体内で発生するプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「インターロイキン（ＩＬ）－２」は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を活性化および誘導する多面発現サイトカインを指す。ＩＬ－２は、その受容体であるＩＬ－２Ｒと結合することでシグナルを伝達する。ＩＬ－２Ｒは、アルファ、ベータ、およびガンマサブユニットで構成されている。ＩＬ－２シグナル伝達は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を刺激する。

本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している。しかしながら、エピトープに特異的に結合する単離された抗体は、他のタンパク質または異なる種に由来する目的の抗原に対して交差反応性を有する可能性がある。しかしながら、抗体は、本明細書に記載されるような特異的結合アッセイにおいて、目的の抗原への特異的結合を示し続ける。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。

本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」という用語は、本明細書に開示される融合タンパク質、ポリペプチド、抗体または抗体部分をコードする核酸を指し、融合タンパク質、ポリペプチド、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチドは他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列がヒトゲノムＤＮＡの核酸に天然に隣接し得る核酸分子を指すことを意図している。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。

本明細書で使用される場合、「キナーゼ標的モチーフ」という用語は、ペプチドに見出されたときにキナーゼによるリン酸化の基質として認識されるアミノ酸配列を指すことを意図し、ホスホアクセプターアミノ酸残基（例えば、リン酸化されているアミノ酸残基、およびホスホアクセプターアミノ酸残基に直接隣接しているアミノ酸の両方を含む。哺乳動物細胞では、ホスホアクセプターアミノ酸は一般にセリン、チロシン、またはスレオニンアミノ酸である。

本明細書で使用される場合、「ＫＤ」または「Ｋ_Ｄ」という用語は、例えば、配位子と受容体、抗原と抗体との間の結合反応の平衡解離定数を指す。Ｋ_Ｄ値は、結合タンパク質のオフレート定数（ｋｄ）と結合タンパク質のオンレート定数（ｋａ）との比率を数値で表したものである。Ｋ_Ｄ値は、結合パートナーに対する結合タンパク質の結合親和性に反比例する。Ｋ_Ｄ値が小さいほど、結合パートナーに対する結合タンパク質の親和性が高くなる。親和性は、単一分子のその配位子への結合の強さであり、通常、二分子相互作用の次数の強さを評価およびランク付けするために使用される平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定および報告される。

本明細書で使用する場合、用語「ｋｄ」または「ｋ_ｄ」（代替的に「ｋｏｆｆ」または「ｋ_ｏｆｆ」）は、結合タンパク質／パートナー錯体からの結合タンパク質の解離に関するオフレート定数を指すことを意図している。ｋｄの値は、１秒当たりに減衰または解離する錯体の割合を数値で表したもので、秒^－１の単位で表される。

本明細書で使用される場合、「ｋａ」または「ｋ_ａ」（代替的に「ｋｏｎ」または「ｋ_ｏｎ」）という用語は、結合タンパク質と結合パートナーとの会合に関するオン速度定数を指すことを意図している。ｋａの値は、結合パートナーの１モル（１Ｍ）溶液中で１秒当たりに形成される抗体／抗原錯体の数の数値表現であり、Ｍ^－１秒^－１の単位で表される。

本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段による、さらに２つの要素、基、構成要素、ドメイン、または部分の接合を指す。関連して、本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つ以上の要素、基、構成要素、ドメイン、または部分を接合する化学基またはドメインを指す。化学的コンジュゲーションの方法（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用する）は、当技術分野で知られている。

本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、血管系を介した、組成物または薬剤の、その意図された標的組織もしくは部位への輸送に依存しない送達を指す。例えば、組成物は、組成物もしくは薬剤の注射または移植によって、または組成物もしくは薬剤を含有するデバイスの注射または移植によって送達してもよい。標的組織もしくは部位の近くでの局所投与後、組成物もしくは薬剤、またはその１つ以上の構成要素が、意図された標的組織または部位に拡散し得る。

本明細書で使用される場合、「金属水酸化物結合ペプチド」という用語は、複数のヒドロキシル置換基（例えば、ホスフェート基）を含むペプチドを指し、ヒドロキシル置換基のそれぞれは、金属水酸化物の表面ヒドロキシル基を置換するのに効果的であり、それによって金属水酸化物に結合する。いくつかの実施形態において、金属水酸化物結合ペプチドは、複数のリン酸化アミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および任意の定常領域を有する抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られ、ヒト重鎖導入遺伝子および不死化細胞に融合された軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

本明細書で使用される場合、物体に適用される「天然に存在する」という用語は、物体を自然界において見出すことができるという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

本明細書で使用される場合、「ナノ結晶」という用語は、寸法が１００ｎｍ未満のサブミクロンの結晶性粒子を指す。いくつかの実施形態において、ナノ結晶が凝集体を形成する場合、凝集体のサイズは１００ｎｍを超える可能性がある。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、ナノ結晶を含む金属水酸化物を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物ナノ結晶を含む免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、インビボでの投与時に注射部位からのサイズ依存性拡散を低減するのに十分な質量である。

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、寸法が１００ｎｍ未満のサブミクロン粒子を指す。いくつかの実施形態において、ナノ粒子が凝集体を形成する場合、凝集体のサイズは１００ｎｍを超える可能性がある。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、ナノ粒子を含む金属水酸化物を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物ナノ粒子を含む免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、インビボでの投与時に注射部位からのサイズ依存性拡散を低減するのに十分な質量である。

本明細書で使用される場合、「凝集体」という用語は、電子顕微鏡法によって決定可能であるように、秩序だった分子間相互作用を欠く分子のアモルファスクラスター、集合または集合体を指す。いくつかの実施形態において、凝集体は、ポリペプチドのクラスター、集合、または集合体を含む。いくつかの実施形態において、骨材は、金属水酸化物などの金属塩のナノ粒子またはナノ結晶のクラスター、集合または集合体を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、凝集体を含む金属水酸化物を含む。いくつかの実施形態において、金属水酸化物凝集体を含む免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体は、インビボでの投与時に注射部位からのサイズ依存性拡散を低減するのに十分な質量ものである。

本明細書で使用される場合、「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞における突然変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾により、対応する野生型の親抗原と区別する少なくとも１つの変化を有する抗原を指す。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含むことができる。突然変異には、フレームシフトまたは非フレームシフト欠失、ミスセンスまたはナンセンス置換、スプライス部位の変化、ゲノム再配列または遺伝子融合、または新抗原のオープンリーディングフレームを生じさせる任意のゲノムまたは発現の代替物が含まれ得る。変異には、スプライスバリアントを含めることもできる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれる場合がある。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、プロテアソームで生成されたスプライス抗原も含まれる。Ｌｉｅｐｅｅｔａｌ．，ＡｌａｒｇｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＨＬＡｃｌａｓｓＩｌｉｇａｎｄｓａｒｅｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｐｌｉｃｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６Ｏｃｔ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照のこと。いくつかの実施形態において、新抗原は「腫瘍新生抗原」であり、これは、対象の腫瘍細胞または組織に存在するが、対象の対応する正常な細胞または組織には存在しない新抗原である。

本明細書で使用される「哺乳動物」または「対象」または「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８，１９８５；およびＣａｓｓｏｌｅｔａｌ，１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８，１９９４）。アルギニンおよびロイシンの場合、２番目の塩基での修飾も保存的である可能性がある。核酸という用語は、遺伝子によってコードされる遺伝子、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと互換的に使用される。

本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、これらは、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成することができる。ポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために修飾された１つ以上の修飾された塩基またはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含み得る。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなどの異常な塩基が含まれる。ＤＮＡとＲＮＡには様々な変更を加えることができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、第１の要素および第２の要素が機能的関係に置かれるような、第１の要素から第２の要素への連結を指す。例えば、第１の反応性部分または基が第２の反応性部分または基に「作動可能に連結」されている場合、第１および第２の部分の機能または反応性が連結されている。例えば、核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列に関して、作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、必要な場合には、隣接し、リーディングフレーム内にある２つのタンパク質コード領域を接合することを意味する。

本明細書で使用される場合、「パラトープ」、また「抗原結合部位」という用語は、可変の重鎖および軽鎖内にある相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含む、抗原上のエピトープを認識して結合する抗体またはその抗原結合断片の一部を指す。

本明細書で使用される場合、「非経口投与」、「非経口投与」、および他の文法的に同等の句は、通常は注射による経腸および局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、鼻腔内、眼内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、予防的または療法的治療のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「パーセント同一性」という用語は、以下に説明する配列比較アルゴリズムのうちの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者が利用できる他のアルゴリズム）を使用して、あるいは目視検査によって測定された場合に、最大の対応のために比較され、アラインメントされたときに、同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、「パーセント同一性」は、比較される配列の領域、例えば、機能的ドメインにわたって存在することができ、代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在することができる。配列比較の場合、通常、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈｆｏｒｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（ｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚検査によって（一般的に、以下のＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．を参照）実施することができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトから公開されている。

本明細書で一般的に使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益／リスク比に見合った他の問題または合併症のないヒトおよび動物の組織、器官および／もしくは体液との接触で使用するのに好適な化合物、材料、組成物、ならびに／または剤形を指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のあるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、それらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる（例えば、Ｂｅｒｇｅｅｔａｌ．（１９７７）ＪＰｈａｒｍＳｃｉ６６：１－１９を参照）。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド反応性部分」という用語は、ポリペプチドのアクセス可能な官能基、またはポリペプチドに付着したペンダント（例えば、オリゴ糖）を含む官能基と直接反応して、共有結合的連結を生成することによって標的とする官能基を含む化学部分を指す。反応は、自発的に、または触媒（例えば、酵素、金属触媒）または刺激（例えば、光、熱）との接触による活性化の後に起こり得る。いくつかの実施形態において、化学部分は、ポリペプチドのアクセス可能な側鎖、例えば、リシンまたはシステイン側鎖と反応して共有結合的連結を形成する官能基を含む。いくつかの実施形態において、化学部分は、末端の側鎖（例えば、Ｃ末端もしくはＮ末端）またはポリペプチドの内部アミノ酸残基と反応して共有結合的連結を形成する官能基を含む。ポリペプチド側鎖と反応して共有結合的連結を形成する例示的なポリペプチド反応性部分が本明細書に記載されており、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、またはシクロアルキンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、化学部分は、末端（例えば、Ｃ末端またはＮ末端）アミノ酸残基のアミノ酸骨格と反応する官能基を含む。例えば、本明細書に記載されるもののような、ソルターゼタグを含むポリペプチド反応性部分は、酵素反応を介してポリペプチドの末端アミノ酸残基と反応して、共有結合的連結を形成する。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。

本明細書で使用される場合、状態に関連して使用される場合の「予防」という用語は、組成物を投与されない対象と比較して、対象における病状の症状（ｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆａｍｅｄｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の頻度を低減するか、またはその発症を遅延させる組成物の投与を指す。

本明細書で使用される場合、本明細書に記載のタンパク質（抗体または断片）のうちのいずれかに適用される「精製（された）」または「単離（された）」という用語は、例えば、タンパク質を発現する原核生物中の他のタンパク質、脂質、および核酸など、天然に付随する構成要素（例えば、タンパク質、または他の天然に存在する生物学的分子もしくは有機分子）から分離または精製されているポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドは、それがサンプル中の総タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、または９９）重量％を構成するときに精製される。

本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すことを意図している。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫を指すことを意図していることを理解されたい。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の修飾が次の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

本明細書で使用される場合、「分泌経路キナーゼ」という用語は、翻訳中または翻訳後にキナーゼを分泌経路に向けるＥＲ標的化配列を含むキナーゼを指す。いくつかの実施形態において、キナーゼは、ＥＲ標的化配列を含む天然に存在する分泌経路キナーゼである。いくつかの実施形態において、キナーゼは、ＥＲ標的化配列をキナーゼドメインのＮ末端に作動可能に連結することによって分泌経路に入るように修飾される。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。例えば、本発明の方法および組成物は、免疫障害を有する対象を治療するために使用することができる。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、および非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳動物を含む。

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」および「選択的に結合する」という用語は、抗体による、所定の抗原上のエピトープへの結合を指す。

「十分な量」または「～するのに十分な量」という用語は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズを縮小するのに十分な量を意味する。

核酸の場合、「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸またはそれらの指定された配列が、最適にアラインメントされ、比較されたときに、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくともヌクレオチドの約９０％～９５％、より好ましくは少なくとも約９８％～９９．５％において、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って同一であることを示す。代替的に、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の補体にハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。

２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（つまり、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。以下の非限定的な例で説明するように、配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量（ｇａｐｗｅｉｇｈｔ）、および１、２、３、４、５または６の長さ重量（ｌｅｎｇｔｈｗｅｉｇｈｔ）を使用して決定できる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓａｎｄＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔｒｅｓｉｄｕｅｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。加えて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量、および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定できる。

本開示の核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連する配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実行するための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行され、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を取得することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較の目的でギャップのあるアラインメントを取得するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているようにＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。

核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたか、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野でよく知られている他のものなどの標準的な手法によって、他の細胞構成要素または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸またはタンパク質から精製されると、「単離」されるか、または「実質的に純粋」になる。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。

本開示の核酸組成物は、しばしば天然配列（修飾された制限部位などを除く）であるが、遺伝子配列を提供するための標準的な技術に従って、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはそれらの混合物のいずれかから変異し得る。コード配列の場合、これらの変異は、必要に応じてアミノ酸配列に影響を与える可能性がある。特に、本明細書に記載の天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定数、スイッチ、および他のそのような配列と実質的に相同であるかまたはそれに由来するＤＮＡ配列が企図される（「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は、配列が別の配列と同一またはそれから修飾されていることを示す）。

本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」は、（ｉ）腫瘍特異的抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異的抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胚性抗原、（ｖｉ）自己腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）成長因子受容体、（ｘ）成長因子配位子、（ｘｉ）新生抗原、および（ｘｉｉ）がんもしくは腫瘍に関連するその他の種類の抗原または抗原提示細胞もしくは物質を指す。

本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、タンパク質などの免疫原性分子を指し、一般に、非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞でより高いレベルで発現され、まったく発現しないか、またはごく低レベルで発現する。いくつかの実施形態において、腫瘍を保有する宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と呼ばれる。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、それがほとんどの腫瘍によって広く発現される場合、ユニバーサル腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、分化抗原、突然変異抗原、過剰発現された細胞抗原またはウイルス抗原である。

本明細書で使用される場合、「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」という用語は、腫瘍細胞に特有のタンパク質などの免疫原性分子を指す。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞でのみ発現する。

本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書に記載される治療的または予防的手段を指す。「治療」の方法は、障害または再発性障害の１つ以上の症状を予防、治癒、遅延、その重症度の低減、または改善するため、またはそのような治療が行われない場合に予想されるよりも対象の生存を延長するための、そのような治療を必要とする対象、例えば、特定の抗原に対する増強された免疫応答を必要とする対象、または最終的にそのようなものを獲得する可能性のある対象への、本開示のヒト抗体の投与を使用する。

「Ｔ細胞」という用語は、細胞表面にＴ細胞受容体が存在することによって他の白血球と区別できる白血球の種類を指す。Ｔヘルパー細胞（別名、Ｔ_Ｈ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞）およびサブタイプ（Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ３、Ｔ_Ｈ１７、Ｔ_Ｈ９、およびＴ_ＦＨ細胞、細胞毒性Ｔ細胞（別名、Ｔ_Ｃ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、Ｔキラー細胞、キラーＴ細胞）を含む）、メモリＴ細胞およびサブタイプ（中央メモリＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）を含む）、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔ_ＥＭおよびＴ_ＥＭＲＡ細胞）、レジデントメモリＴ細胞（Ｔ_ＲＭ細胞）、調節性Ｔ細胞（別名、Ｔ_ｒｅｇ細胞またはサプレッサーＴ細胞）およびサブタイプ（ＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞、ＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３^－Ｔ_ｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞、およびＴ_ｒｅｇ１７細胞を含む）、ナチュラルキラーＴ細胞（別名、ＮＫＴ細胞）、粘膜関連不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）、ならびにガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）（Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞を含む）を含むが、これらに限定されないＴ細胞のいくつかのサブセットがある。前述または言及されていないＴ細胞のうちのいずれか１つ以上は、本明細書に開示される方法の標的細胞型であり得る。

「Ｔ細胞細胞傷害性」という用語には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によって媒介される免疫応答が含まれる。例示的な免疫応答には、サイトカイン産生、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、グランザイムまたはパーフォリン産生、および感染性病原体のクリアランスが含まれる。

「治療用抗体」は、抗体、抗体の断片、または抗体に由来する構築物であり、標的細胞上の細胞表面抗原に結合して治療効果を引き起こすことができる。そのような抗体は、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体であり得る。そのような抗体を産生するための方法が当技術分野で知られている。このような抗体には、抗体の単鎖Ｆｃ断片、ミニボディ、およびダイアボディが含まれる。がん治療に有用であることが当技術分野で知られている治療用抗体のうちのいずれも、本明細書に開示される方法で使用するのに好適な併用療法で使用することができる。治療用抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態において、治療用抗体はがん抗原を標的とする。

「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療有効量は「予防有効量」である可能性がある。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、感染症もしくは疾患を予防および／または改善するため、および／または感染症もしくは疾患の少なくとも１つの症状を低減するため、および／または合成ナノ粒子の別の用量の有効性を高めるための、脊椎動物に投与することができる形態であり、かつ、免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導するアジュバントと組み合わせて、本明細書に記載の免疫原性組成物を含有する配合物を指す。典型的には、ワクチンは、本明細書に記載の組成物が懸濁もしくは溶解されている従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本明細書に記載の組成物は、感染症もしくは疾患を予防、改善、または他の方法で治療するために使用される。宿主に導入されると、ワクチンは、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞および／もしくは他の細胞応答の活性化を含むがこれらに限定されない免疫応答を誘発する。

本明細書で使用される場合、「防御」免疫応答は、疾患もしくは感染を予防または改善する、細胞媒介性および／または液性（抗体）媒介性免疫応答を指す。防御液性免疫応答または液性免疫には、抗原上の特定のエピトープを認識する広く中和する抗体の誘導が含まれることがよくある。ワクチン接種によって防御液性免疫を引き出すためには、Ｂ細胞が活性化されて胚中心に入り、そこで増殖してそれらの抗体遺伝子を変異させ、抗原の認識を高める必要がある。次に、これらの細胞の一部分は、抗体を構成的に分泌する長寿命の形質細胞、または病原体への再曝露時にリコール応答に関与するメモリＢ細胞のいずれかに分化する必要がある。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされる可能性のある環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのそのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を以下に説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

本開示は、その特定の実施形態を参照して記載されているものの、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、その等価物で代用し得ることを当業者は理解すべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップを、本開示の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの修正を行うことができる。そのようなすべての修正は、本開示の範囲内にあることを意図している。以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。以下の例は、例示のみを目的として提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で十分説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋａｎｄＮ．Ｋａｐｌａｎｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ；１９９０）；ＣａｒｅｙａｎｄＳｕｎｄｂｅｒｇＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３^ｒｄＥｄ．（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）ＶｏｌｓＡａｎｄＢ（１９９２）を参照のこと。

実施例１：ミョウバン結合タンパク質を組換え発現させることができる
より多くのホスホネートを含むタンパク質は、配位子交換によりはるかに強くミョウバンに吸着することが知られている（Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，２００５）。したがって、ミョウバンへの強い結合を可能にするために、哺乳動物細胞における分泌発現中にリン酸化されるであろう目的のタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合することができるペプチドが同定された。同定されたペプチドは、キナーゼＦａｍ２０Ｃを標的とする配列を含み、これは、ゴルジカゼインキナーゼであることが最近発見された（Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ．，（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６：１１５０－１１５３）。Ｆａｍ２０Ｃの既知の標的化モチーフ（Ｓ－Ｘ－Ｅ）およびＦａｍ２０Ｃの既知のペプチド基質に基づいて、過剰発現したＦａｍ２０Ｃを標的とするようにミョウバン結合ペプチド（ＡＢＰ）のパネルを設計した（表５）。

これらのＡＢＰ配列のうち、ＡＢＰ５（配列番号９５）、ＡＢＰ６（配列番号９７）およびＡＢＰ７（配列番号９９）は、Ｆａｍ２０Ｃの基質として同定されたＳ－Ｘ－Ｅモチーフを有するペプチド配列であった（Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１６１９－１６３２）。ＡＢＰ７（配列番号９９）は、ウシβ－カゼインに由来するペプチドである。ＡＢＰ８（配列番号１０１）は、ウシおよびマウスのβ－カゼインアミノ酸配列を整列させ、Ｓ－Ｘ－Ｅモチーフを含む配列番号９９によって同定されたウシβ－カゼインペプチドに近接するマウスβ－カゼインの配列を同定することによって設計した。ＡＢＰ３（配列番号９１）およびＡＢＰ４（配列番号９３）は、Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ１６１：１６１９－１６３２に従ってＦａｍ２０Ｃの基質として同定されたペプチドの配列を分析することによって設計した。ペプチドは、式

（配列番号１３４）に従って設計した。式中、ＸＸは、Ｆａｍ２０Ｃの分析されたペプチド基質で頻繁に発生したＳＥＥモチーフに隣接するアミノ酸である。

追加のＡＢＰは、Ｓ－Ｘ－Ｅモチーフを含む短いペプチドを組み合わせることによって設計した。ＡＢＰ１６（配列番号１１５）は、２つの連続するＡＢＰ３（配列番号９１）配列からなるアミノ酸配列を含む。ＡＢＰ１２（配列番号１０７）は、２つの連続するＡＢＰ８（配列番号１０１）配列からなるアミノ酸配列を含む。ＡＢＰ１１（配列番号１０５）は、２つの連続するＡＢＰ４（配列番号９３）配列からなるアミノ酸配列を含む。ＡＢＰ１０（配列番号１０３）は、連続するＡＢＰ３（配列番号９１）およびＡＢＰ４（配列番号９３）配列からなるアミノ酸配列を含む。

ペプチドは、目的のタンパク質、分泌リーダー配列、およびＣ末端ヒスチジンタグとともに、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｔａｋａｒａ）を使用してｇＷｉｚ発現ベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）にクローニングした。マウスＩＬ－２（ＭＳＡ－ＩＬ２）およびＣ末端ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、配列番号１４７）に作動可能に連結されたマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）のヌクレオチド配列をコードする代表的なプラスミド構築物を図１に示す。

タンパク質は、野生型（ＷＴ）Ｆａｍ２０Ｃキナーゼまたは陰性対照としての不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現した。ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼとの共発現のために、細胞を、ゴルジ局在を確実にするために使用したＣ末端ＫＤＥＬ配列に作動可能に連結されたＷＴＦａｍ２０Ｃの配列をコードするｇＷｉｚベクターでトランスフェクトした（Ｆａｍ２０Ｃ－ＫＤＥＬ、配列番号１３６）。不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼとの共発現のために、キナーゼ機能の不活性化をもたらすＤ４５６Ａ突然変異を有するＦａｍ２０ＣキナーゼをコードするｇＷｉｚベクターで細胞をトランスフェクトした（Ｆａｍ２０Ｃ（Ｄ４５６Ａ）－ＫＤＥＬ；配列番号１３９）（例えば、Ｔａｇｌｉａｂｒａｃｃｉｅｔａｌ．，２０１５を参照）。

Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現系（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を一時的にトランスフェクトすることによりタンパク質発現を実行した。細胞を、ＡＢＰに単独で、またはＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼもしくは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ変異体をコードするプラスミドと組み合わせて作動可能に連結された目的のタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。７日後、細胞培養上清を回収し、ＮｉＮＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。単量体タンパク質を単離するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＦＰＬＣによってさらに精製を実行した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、精製タンパク質の濃度を測定した。

Ｃ末端ＡＢＰに融合したＭＳＡ－ＩＬ２の発現を評価した。ＩＬ２は、抗腫瘍免疫応答の強力な誘導因子であることが知られている炎症性サイトカインであるが、ＭＳＡとの融合は、血清半減期を延長しつつＩＬ２の組換え発現を支援する（Ｚｈｕ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ２７．４（２０１５）：４８９－５０１）。異なるＣ末端ＡＢＰに連結されたＭＳＡ－ＩＬ２融合タンパク質を発現させ、精製タンパク質産物を、図２Ａに示すようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを変性および還元することによって評価した。ＡＢＰに融合したＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質のタンパク質バンドは、予想される分子量（８５～９０ｋＤａ）であった。追加的に、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ融合タンパク質は、サイズ排除ＦＰＬＣで精製した場合、主に単量体であると判断された。図２Ｂに示すように、ＭＳＡ－ＩＬ２およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０の単量体タンパク質ピークを１２～１４ｍＬの溶出量で同定した。

Ｃ末端ＡＢＰに融合したＭＳＡ－ＩＬ２が容易に発現および精製できることを実証したので、ＡＢＰをリン酸化できるキナーゼと組み合わせて共発現させた場合にタンパク質を産生できるかどうかを判断した。ＭＳＡ－ＩＬ２およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０を共発現の評価のために選択した。タンパク質をコードするプラスミドを、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼをコードするプラスミドまたは不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼをコードするプラスミドで共トランスフェクトした。ＭＳＡ－ＩＬ２融合物を上記のように精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集について評価し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって予想される分子量を評価した。ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼで共トランスフェクトした融合タンパク質には接尾辞Ｋを付け（すなわち、ＭＳＡ－ＩＬ２ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）、不活性変異体Ｆａｍ２０Ｃキナーゼで共トランスフェクトした融合タンパク質には接尾辞ＩＫを付けた（すなわち、ＭＳＡ－ＩＬ２ＩＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫ）。図２Ｃに示されるように、精製ＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質（ＫまたはＩＫ）およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０タンパク質（ＫまたはＩＫ）の分子量は、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（ＷＴまたは不活性）と共発現した場合、予想値のもの（ＭＳＡ－ＩＬ２の場合には約８５ｋＤａ、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０の場合には９１ｋＤａ）であった。追加的に、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（約６０ｋＤａ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出できず、精製がキナーゼを除去するのに十分であったことを示している。サイズ排除クロマトグラフィーで分析した場合、タンパク質は主に単量体であり（データは示さず）、さらなる分析のために単量体部分のみを収集した。

また、精製タンパク質の分子量を、図３Ａ～３Ｄに示されるように、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによって確認した。ＭＡＬＤＩ－ＭＳによって検出されたピークは、ＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質（図３Ａおよび図３Ｃ）およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０タンパク質（図３Ｂおよび図３Ｄ）について予想される分子量のものであった。しかしながら、分析の分解能は、ＡＢＰのリン酸化による質量差を検出するには低すぎるとみなされた。Ｆａｍ２０Ｃキナーゼとの共発現後のＡＢＰのリン酸化を測定するために、実施例２に記載されているように追加のアッセイを実行した。

この戦略を、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ、およびリゾチームなどの他の目的のタンパク質について評価した。タンパク質をコードするプラスミドは、Ｃ末端ＡＢＰ１０（配列番号１０３）を含み、タンパク質を、単独で、またはＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼをコードするプラスミドまたは変異体Ｆａｍ２０Ｃキナーゼをコードするプラスミドと組み合わせて発現させた。精製タンパク質産物の分子量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。精製タンパク質は、図４Ａ～４Ｂに示されるように、予想される分子量を有することが見出された。ＩＦＮｇを含むタンパク質のサンプルに存在する追加のバンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した精製によって除去できる汚染によるものとみなされた。

ＡＢＰに作動可能に連結された例示的なタンパク質融合物は、以下の表の配列によって同定する。ＡＢＰ１０（配列番号１０３）、ＡＢＰ８（配列番号１０１）、およびＡＢＰ１７（配列番号１１７）に連結された融合タンパク質が示されている。しかしながら、特定のＡＢＰは容易に交換される（例えば、表５に示されているもののような代替ＡＢＰと交換される）。追加的に、タンパク質ドメインのいずれかの末端でのＡＢＰの配置も容易に改変される（例えば、タンパク質のＮ末端またはＣ末端でのＡＢＰの配置）。表６に列挙されているのはマウスタンパク質であるが、ヒト由来のタンパク質ホモログは、マウス構成要素を（例えば、ヒト血清アルブミンまたはヒトサイトカインと）置き換えるために容易に交換される。ＡＢＰをサイトカインまたはＭＳＡ－サイトカイン融合に付着させるために使用されるペプチドリンカーは、通常、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（例えば、－ＧＧＧＳ－）である。しかしながら、リンカーのＳｅｒがＦａｍ２０Ｃキナーゼによってリン酸化される可能性があることを考えると、表６に列挙されるＡＢＰ１７への融合タンパク質を、ＡＢＰの付着のための－ＧＧＧＧ－リンカーを使用して調製し、リンカーの潜在的なリン酸化を制限した。

実施例２：組換え発現されたミョウバン結合タンパク質はリン酸化されている
表５に同定された特定のＡＢＰに融合したタンパク質のリン酸化の程度は、マラカイトグリーンアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定された。マラカイトグリーンアッセイは、既知量の高度にリン酸化されたタンパク質であるフォスビチンから得られた標準曲線に基づいて、各タンパク質についてのホスフェート含有量を半定量的に測定するために使用できる。リン酸化の定量は、単独で、またはＦａｍ２０Ｃキナーゼをコードするプラスミドと組み合わせて発現された異なるＡＢＰに融合したＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質について行った。ＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質ではある程度のリン酸化が検出されたが、タンパク質を単独で、またはＦａｍ２０Ｃキナーゼと組み合わせて発現させた場合も同じであった。異なるＣ末端ＡＢＰに連結されたＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質の場合、リン酸化の程度は、タンパク質を単独で発現させた場合のＭＳＡ－ＩＬ２と同様であった。しかしながら、図５Ａ～５Ｃに示されるように、タンパク質をＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現させた場合、リン酸化は大幅に増加した。特に、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８、およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７は、高レベルで同等レベルのリン酸化を実証した。

特に、タンパク質が変異体Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと発現した場合（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰＩＫ）と比較して、タンパク質がＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと発現した場合（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＰＢ１０Ｋ）には、ＡＢＰ１０に融合したＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０）は、リン酸化が６倍以上増加し、最も高いリン酸化を示した。この結果は、図６Ａ～６Ｂに示すように、別々の精製バッチから単離されたタンパク質で一貫していた。

ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫ、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＩＫ、またはＭＳＡ－ＩＬ２－Ｋと比較してＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋタンパク質のリン酸化が増加していることも、抗ホスホセリン免疫ブロットを使用して確認した。精製タンパク質のサンプルをＮｕＰＡＧＥゲル上で分離し、ｉＢｌｏｔシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。膜をウサギ抗ホスホセリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９３３２）および抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０６４０１）で染色した。ＭＳＡ－ＩＬ２タンパク質融合の予想される分子量は９０ｋＤａである。この分子量では、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋのみがイムノブロットによって検出され、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋのホスホセリンの強いリン酸化を示しているが、試験した他のタンパク質（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫ、ＭＳＡ－ＩＬ２Ｋ、ＭＳＡ－ＩＬ２ＩＫ）では検出されなかった（図７）。

ＡＢＰ１０に融合したＭＳＡ（ＭＳＡ－ＡＢＰ１０）のリン酸化も、上記のようにイムノブロットで評価し、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０と比較し、ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤロバ抗ウサギＩｇＧ（ＬＩ－ＣＯＲ９２６－６８０７３）を使用してウサギ抗ホスホセリン抗体を検出した。図８に示すように、タンパク質がＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼ（図８では「Ｋ」と表示）と共発現された場合にのみ、ＭＳＡ－ＡＢＰ１０（ＭＷ：６０ｋＤａ）およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（９０ｋＤａ）で強いリン酸化バンドが検出され、一方、タンパク質がキナーゼと共発現されなかった場合にのみ、バンドは弱く検出された。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を使用して、リン酸化をさらに測定した。具体的には、野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと組み合わせて（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）、またはキナーゼを伴わずに発現した精製ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０のサンプルを、強陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラム）を使用したＦＰＬＣで分析した。カラムを２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．５緩衝液（緩衝液Ａ）で平衡化し、結合したタンパク質を２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣＬ、１ＭＮａＣｌｐＨ８．５緩衝液（緩衝液Ｂ）の勾配を増やしながら溶出した。リン酸化タンパク質は、タンパク質のホスフェート基とカラムのカチオン性基との相互作用により、カラムの保持が長くなると予想される。実際、図９に示されるように、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋは、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０と比較して後のカラム画分で溶出することが見出され、これは、より高いレベルのリン酸化を示している。

Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現させた場合にホスホセリン含有量が高いとしてＡＢＰ１０へのＭＳＡ－ＩＬ２融合を同定した後、この戦略を他の目的のタンパク質について評価した。すなわち、ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡまたはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇのＡＢＰ１０への融合（表６において同定された配列）を、図１０に示すようにマラカイトグリーンアッセイによってリン酸化について評価した。ＡＢＰ１０に融合した各タンパク質について、タンパク質をＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）と共発現させた場合、不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と比較してリン酸化のレベルが有意に高かった。

追加的に、戦略を、ＩＬ１２融合タンパク質について評価した。具体的には、ＡＢＰ１０またはＡＢＰ１７のいずれかに結合された一本鎖ＩＬ１２を含む融合物を評価した。マウスＩＬ－１２は、ｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニット（ｓｃＩＬ１２）との間に１５個のアミノ酸のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む一本鎖形式で発現された。ｓｃＩＬ１２は、ＡＢＰ１０（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０；配列番号１７２）またはＡＢＰ１７（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７；配列番号１７４）に直接連結された融合タンパク質として発現された。追加的に、ｓｃＩＬ１２は、ＡＢＰ１０（ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０；配列番号１６８）またはＡＢＰ１７（ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１７；配列番号１７０）のいずれかに連結されたＭＳＡへの融合タンパク質として発現された。融合タンパク質ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０、およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１７は、野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現されるか、またはキナーゼを伴わずに発現された。精製タンパク質の分子量を、上記のように決定した。精製タンパク質は、図１１Ａに示されるように、予想される分子量を有することが見出された。リン酸化を、上記のマラカイトグリーンアッセイを介して測定した。キナーゼを伴わずに発現したＭＳＡ－ＩＬ２と野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）を比較のために使用した。図１１Ｂ～１１Ｃに示すように、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼとの共発現により、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋと同様のレベルのリン酸化をそれぞれ有するｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋ、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ、およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１７Ｋを使用して、評価した各融合タンパク質のタンパク質当たりのホスフェート基の数が大幅に増加した。したがって、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼの共発現を伴うＡＢＰ融合を使用する戦略は、高レベルのリン酸化を達成するために、他の目的のタンパク質に広く一般化することができる。

また、ＡＢＰ１０の融合タンパク質がＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したときにリン酸化されるＡＢＰ１０のセリン残基も評価した。そうするために、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼによってリン酸化されると予想される４つのＳ－Ｅ－Ｅモチーフを、セリンをアラニンで置換することによって改変し（Ｓ→Ａ）、ペプチドＡＢＰ１３（配列番号１０９）を生成した。ＡＢＰ１０およびＡＢＰ１３へのＭＳＡ－ＩＬ２融合は、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼとの共発現後、マラカイトグリーンアッセイによってリン酸化について評価した。図１２に示されるように、セリン残基の置換により、リン酸化が実質的に減少した。追加的に、質量分析による分析のための断片化を容易にするために、トリプシン切断部位を用いてＡＢＰ１０のバリアントを調製した（例えば、ＡＢＰ１５、配列番号１１３）。ＡＢＰ１５に融合したＭＳＡ－ＩＬ２は、ＡＢＰ１０と同様のレベルのリン酸化をもたらした（図１２）。その後のＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１５－ＫおよびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１５－ＩＫタンパク質の消化、続いて高選択Ｆｅ－ＮＴＡホスホペプチド富化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したホスホペプチド富化、およびＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析により、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現させた場合のＣ末端ＡＢＰ１５のセリンに対する高いリン酸化活性が明らかになった（データは示さず）。総合すると、これらのデータは、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼによるリン酸化がＡＢＰのＳ－Ｅ－Ｅモチーフで発生することを示している。

実施例３：組換え発現されたミョウバン結合タンパク質は血清中のミョウバンに吸着する
ミョウバンに吸着されたタンパク質は、血清または間質液の存在下でかなり迅速に溶出することができる（Ｗｅｉｓｓｂｕｒｇ，ｅｔａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ１２．１０（１９９５）：１４３９－１４４６）。しかしながら、リン酸化がより大きいタンパク質は、吸着のための配位子交換に依存することにより、血清条件下ではるかに長くミョウバンに保持される傾向がある（Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄ，ｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ２３．１２（２００５）：１５０２－１５０６）。ミョウバンに吸着したときにＡＢＰで操作されたタンパク質の保持は、１０％血清の存在下で評価された。タンパク質の放出は、ミョウバンへのタンパク質の吸着に影響を与えることが知られていない、ホスフェートを含まないトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で評価された（ＨｏｇｅｎＥｓｃｈ，ｅｔａｌ，ｎｐｊＶａｃｃｉｎｅｓ３：５１（２０１８））。比較として、放出はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でも評価された。これは、付着のために静電相互作用のみに依存するミョウバンへのタンパク質の吸着を妨げることが知られている（Ｊｕｌｌｙ，ｅｔａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ１０５：１８２９－１８３６（２０１６））。したがって、ホスフェートを含まない緩衝液またはＰＢＳにおける放出の評価を使用して、ミョウバンへのタンパク質吸着が比較的弱い静電相互作用に依存しているか、より強い配位子交換相互作用に依存しているかを調べた。

放出を評価するために、タンパク質を最初にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７スクシニミジル（ＮＨＳ）エステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、色素：タンパク質のモル比１０：１で標識）で標識し、遠心濾過で精製して、すべてのタンパク質で同様のレベルの標識を生成した。タンパク質をＴＢＳでミョウバン（特に明記しない限り、ミョウバン：タンパク質の質量比１０：１、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合し、室温で３０分間回転させて、最初の結合を可能にした。次に、サンプルを１０，０００×ｇで５分間遠心分離して、ミョウバンと吸着タンパク質をペレット化し、非結合タンパク質を含有する上清を収集し、ペレット化したミョウバンをＴＢＳまたはＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度でマウス血清（ＭＳ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁した。次に懸濁液を３７℃で回転させた。特定の時点で、サンプルを１０，０００ｘｇで５分間遠心分離して、ミョウバンと吸着タンパク質をペレット化し、非結合タンパク質を含む上清を収集した。ミョウバンペレットを新鮮な放出緩衝液（それぞれの緩衝液（ＴＢＳまたはＰＢＳ）中１０％血清）に再懸濁した。これを、必要な数の時点で繰り返した。蛍光標識タンパク質の場合、非結合タンパク質の量を、ミョウバン：タンパク質のサンプルから得られた上清の蛍光を測定し、同じ初期タンパク質濃度でミョウバンを使用せず調製した標識タンパク質のサンプルの蛍光に正規化することによって決定した。非標識タンパク質の場合、主要な読み取り値は、ＥＬＩＳＡベースの測定を使用して決定された目的のタンパク質の濃度であった。

標識タンパク質と蛍光の定量を使用して、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼ（Ｋ）または変異体Ｆａｍ２０Ｃキナーゼ（ＩＫ）と共発現させた標識ＭＳＡ－ＩＬ２またはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０のミョウバンからの放出の動態を評価した。低ホスフェート含有量のタンパク質（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＩＫおよびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０－ＩＫ）は、血清に曝露してもミョウバンに吸着することが分かった（図１３Ａ）。しかしながら、放出緩衝液が静電相互作用を破壊すると予想されるＰＢＳに変更した場合、これらのタンパク質はミョウバンに吸着されたままではなかった（図１３Ｂ）。対照的に、高度にリン酸化されたＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋは、ホスフェートを含まないＴＢＳ中の１０％ＭＳの存在下（図１３Ａ）またはＰＢＳ中の１０％ＭＳの存在下（図１３Ｂ）のいずれかでミョウバンに強く吸着することが見出された。したがって、低ホスフェート含有量のタンパク質（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＩＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＰＢ１０ＩＫ）は、吸着のために静電引力または弱い単量体配位子交換に依存するが、高ホスフェート含有量のタンパク質（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）は、はるかに堅牢な多量体配位子交換メカニズムによって吸着する。

非結合タンパク質の定量のためのＥＬＩＳＡベースの方法を使用して、非標識タンパク質について、ミョウバンからの放出をさらに評価した。タンパク質およびミョウバンをＴＢＳ中、室温で３０分間混合した後、遠心分離して上清を除去し、上記のようにＴＢＳまたはＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度でＦＢＳに再懸濁した。３７℃で２４時間インキュベートした後、ミョウバンおよび結合タンパク質を遠心分離により沈殿させ、非結合タンパク質を含有する上清を回収した。捕捉抗体として抗ＭＳＡ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９１９４）および検出抗体として抗ＨｉｓＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、６５２５０４）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、上清中のタンパク質を定量した。図１４Ａ～１４Ｆに示されるように、ミョウバン：タンパク質混合物から採取された上清中のタンパク質の量（実線）を、同じ初期濃度で調製されたがミョウバンを含有しないタンパク質のサンプル（破線）と比較した。放出アッセイは、リン酸を含まない緩衝液（図１４Ａ～１４Ｃ）またはＰＢＳ（図１４Ｄ～１４Ｆ）中の１０％ＦＢＳの存在下で実行した。図１４Ａ～１４Ｃに示すように、高度にリン酸化されたＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの場合、ホスフェート含有量が少ないＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＩＫと比較して、上清中で測定されたタンパク質が少なく、これはミョウバンへの吸着が強いことを示している。さらに、アッセイをＰＢＳ中で実行した場合、リン酸化が不十分なＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＩＫではミョウバンへの吸着が排除されたが、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋは高度に吸着されたままであった（図１４Ｄ～１４Ｆ）。

ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫおよびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋのミョウバンからの放出もイムノブロットによって評価した。上記のアッセイを使用して放出を実行した。ＴＢＳ中の１０％ＭＳにおいて３７℃でインキュベートした後、タンパク質およびミョウバンの混合物から上清を収集した。上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって泳動させ、ニトロセルロース膜に転写した。タンパク質は、組換え融合タンパク質のＨｉｓタグと結合する抗ＨｉｓＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、６５２５０４）を使用して定量した。また、比較のために測定されたのは、同じ初期濃度で調製されたがミョウバンを含有しないタンパク質であった。図１５に示すように、列１はミョウバンを含まないサンプルから収集された上清を指し、列２～６はタンパク質およびミョウバンを組み合わせたサンプルから収集された上清を指す。列２は、１０％マウス血清を添加する前に収集された上清を示している。列３～６は、それぞれ０時間、１時間、２時間、および２４時間に１０％マウス血清を添加した後に収集された上清を示している。上清へのタンパク質の放出は、マウス血清の添加後のタンパク質およびミョウバンの混合物でのみ観察された。しかしながら、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＩＫの放出は、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの場合よりもはるかに高く、高度にリン酸化されたタンパク質バリアントのミョウバンへのより強い吸着を示している。

リン酸化されたＡＢＰ８に連結したＭＳＡ－ＩＬ２の放出特性を調べた。具体的には、Ｃ末端ＡＢＰ８に融合したＭＳＡ－ＩＬ２を単独で発現させるか（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８）、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現させて（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ）リン酸化ＡＢＰを生成した。ミョウバンの結合は、上記の蛍光ベースのアッセイを使用して評価した。ここでは、融合タンパク質を蛍光標識し、無血清／無リンＴＢＳ（ミョウバン：タンパク質比１０：１）でミョウバンと３０分間室温で事前混合し、次いで、ＰＢＳ中の１０％ＭＳに緩衝液交換した。上清への非結合融合タンパク質の放出を、上記のように異なる時点で評価した。ミョウバンからのＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの放出と比較した。図１６に示すように、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８の放出は血清への曝露後に急速であったが、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８ＫおよびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの両方がミョウバンへの強い吸着を示した。

さらに、リン酸化されたＡＢＰ１７に連結されたＭＳＡ－ＩＬ２の放出特性は、血清曝露のレベルを上げながら評価した。簡単に説明すると、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼ（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７Ｋ）で発現したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７のミョウバン結合を、上記の蛍光ベースのミョウバン結合アッセイを使用して、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０およびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋと比較した。蛍光タンパク質をＴＢＳ中のミョウバンと室温で３０分間事前混合した後、ミョウバンおよび吸着タンパク質をＰＢＳ中の２０％ＭＳまたはＰＢＳ中の４０％ＭＳに交換した。血清曝露の１７時間後、上清中に存在する非結合融合タンパク質の量を上記のように蛍光測定によって定量し、血清曝露前の上清中の非結合タンパク質の量と比較した。図１７に示すように、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０のミョウバン結合タンパク質の量は血清曝露後に劇的に減少したが、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７Ｋの大部分は、高血清条件下でさえ、血清曝露後もミョウバンに結合したままであった。

ＡＢＰに結合し、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現する他の目的のタンパク質の放出特性を評価した。ＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡおよびＩＦＮｇ－ＩＦＮｇをＣ末端ＡＢＰ１０に融合させ、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼまたは変異型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼのいずれかと共発現させた。上記のアッセイに従って放出を実行した。最初に、蛍光ベースのアッセイを使用して標識タンパク質の放出を測定し、リン酸を含まない緩衝液（図１８Ａ）または１０％ＭＳ（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ（図１８Ｂ）のいずれかで測定した。結果は、ＭＳＡ－ＩＬ２融合で観察された結果と同様であり、リン酸化が不十分なタンパク質（つまり、不活性なＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現したタンパク質）は、ＰＢＳで放出を測定したときに除去された、リン酸を含まない緩衝液中でミョウバンへの吸着を示した。しかしながら、高度にリン酸化されたタンパク質（例えば、ＷＴＦａｍ２０Ｃキナーゼと共発現した）は、ＰＢＳ（図１８Ｂ）中でさえミョウバンへの吸着を保持した。

ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して非標識タンパク質についてミョウバンからの放出を測定した場合にも同じ傾向が観察された。図１９Ａ～１９Ｄに示すように、ミョウバンと混合したＩＦＮ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＫまたはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＩＫ（実線）またはミョウバンを含まない同じ濃度のタンパク質（破線）について、上清の定量を比較した。リン酸を含まない緩衝液（図１９Ａ～１９Ｂ）またはＰＢＳ（図１９Ｃ～１９Ｄ）中の１０％ＦＢＳの存在下で放出アッセイを実行し、血清の添加の２４時間後に上清を収集した。図１９Ａ～１９Ｂに示されるように、高度にリン酸化されたＩＦＮ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋについて、ＩＦＮ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＩＫと比較して、ミョウバンへのより強い吸着が観察された。さらに、ＩＦＮ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＩＫはＰＢＳ中でミョウバンに吸着しなかったが、ＩＦＮ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋは高度に吸着されたままであった（図１９Ｃ～１９Ｄ）。

ミョウバンからのＩＬ１２融合物の放出特性も、上記の蛍光ベースのミョウバン放出アッセイを使用して評価された。具体的には、単独で発現したか、または野生型Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現した精製ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０融合タンパク質について、放出を測定した。ミョウバンからのＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋの放出と比較した。融合タンパク質を蛍光標識し、ＴＢＳ中のミョウバンと室温で３０分間事前混合した。遠心分離および上清の除去の後、ミョウバンと結合融合タンパク質をＰＢＳ中の１０％ＭＳに再懸濁し、３７℃で回転させながら１７時間インキュベートした。上清を回収し、非結合タンパク質を蛍光読み取りにより測定した。図２０Ａに示されるように、血清の添加前に、ミョウバンへの吸着は、試験された各融合タンパク質について同等であった。しかしながら、血清中でのインキュベーション後、Ｆａｍ２０Ｃキナーゼと共発現された融合タンパク質について、単独で発現されたものと比較して、実質的に強い吸着が観察された（図２０Ｂ）。

総合すると、これらのデータは、リン酸化されたＡＢＰを有する融合タンパク質が、融合物に含有される免疫調節タンパク質に関係なく、ミョウバンに強く吸着されたままであることを示している。

実施例４：ミョウバンは腫瘍内のタンパク質およびペプチドを保持するために使用できる
腫瘍内注射後のミョウバンの持続性を決定した。そうするために、ミョウバンを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７）に共有結合的にコンジュゲートした４つのホスホセリンアミノ酸を含むペプチドで蛍光標識した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、右脇腹に皮下注射することにより、１００万個のマウス腺癌（ＭＣ３８）腫瘍細胞を接種した。６日後、ミョウバンを含むまたは含まない生理食塩水で調製した０．１ｎｍｏｌのｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７を腫瘍内に注射した（群当たりｎ＝３匹の動物）。腫瘍の蛍光強度は、注射後の様々な時点で、ＩＶＩＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によるインビボイメージングを使用してミョウバン保持の尺度として評価した。ＡＦ６４７の蛍光は、６４０ｎｍの励起波長および６８０ｎｍの発光波長を使用して測定した。総放射効率を腫瘍ごとに計算し、図２１に示している。この図において、実線はミョウバン＋ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７の注射を表し、破線は遊離ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７のみを表す。遊離ｐＳｅｒ４－ＡＦ６４７ペプチドは腫瘍から急速に拡散したが、ミョウバンに固定されたペプチドは投与後少なくとも６日目で腫瘍に残っていた。これは、ミョウバンがマウスで何週間も持続する可能性があるという文献における理解と一致している（Ｆｌａｒｅｎｄ，ｅｔａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ１５：１３１４－１３１８（１９９７））。

次に、ミョウバンと組み合わせた場合のリン酸化ＡＢＰを含む融合タンパク質の腫瘍内持続性を評価した。そうするために、上記のように確立された態様ＭＣ３８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６に、ＡＦ６４７で標識された５μｇのＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＩＫまたはＩＦＮｇ－ＩＦＮｇ－ＭＳＡ－ＡＰＢ１０Ｋを注射した（ＡＦ６４７ＮＨＳエステル、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒを使用）。タンパク質は、生理食塩水中で単独で投与するか、ミョウバンと混合した。投与後、腫瘍の蛍光を、励起波長および発光波長がそれぞれ６４０ｎｍおよび６８０ｎｍのＩＶＩＳを使用してマウスを画像化することによって評価した（群当たりｎ＝３匹のマウス）。平均総放射効率を計算し、図２２に示している。遊離タンパク質は投与後約１日間腫瘍内に保持されるが、ミョウバンに固定されたタンパク質は投与後７日よりも長く、少なくとも１３日まで腫瘍内に残存した（図２２）。

リン酸化ＡＢＰとのＩＬ２融合のインビボ腫瘍保持も評価した。Ｂ１６Ｆ１０－Ｔｒｐ２ノックアウト腫瘍は、ＭｏｙｎｉｈａｎｅｔａｌＮＡＴＵＲＥＭＥＤＩＣＩＮＥ（２０１６）２２（１２）：１４０２－１４１０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように確立された。ＡＦ６４７で標識した９μｇ（０．１ｎｍｏｌ）のＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを、生理食塩水中の腫瘍内注射により、遊離タンパク質として、またはミョウバンと錯体化して投与した。投与後、腫瘍の蛍光を上記のようにＩＶＩＳを使用して測定した。総放射効率を経時的に測定し、マウスごとに注射直後の値に正規化した。比較のために、１３μｇ（０．１ｎｍｏｌ）のルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２の腫瘍内注射を行った。このタンパク質は、ＭＳＡ－ＩＬ２とコラーゲンアンカータンパク質ルミカンのＣ末端との融合物である。免疫調節サイトカインのルミカンへの融合は、Ｍｏｍｉｎ，ｅｔａｌＳＣＩ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＥＤ（２０１９）１１：ｅａａｗ２６１４およびＵＳ２０２０／０１０２３７０（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているように、腫瘍内投与後の腫瘍保持および抗腫瘍効果を改善することが示されている。

図２３に示すように、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋは、腫瘍の保持期間が最も長いことを示した。蛍光シグナルは、注射後２４日までにバックグラウンドレベル近くまで減衰したが、２９日目に犠牲にされたマウスから切除された腫瘍が有意な蛍光タンパク質シグナルを保持していたため、これは注射された腫瘍内同胞デポーからの蛍光シグナルを組織が閉塞したためである可能性がある（図２３の「犠牲後」のＩＶＩＳ画像を参照）。

追加的に、ミョウバン結合融合タンパク質の腫瘍保持を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するマウスの顕微鏡検査によって評価した。腫瘍は、皮下注射により、Ｃ５７ＢＬ６マウスの右側腹部にＰＢＳ中の１ＭＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を接種することによって確立された。マウスに、腫瘍接種後６日目に腫瘍内注射により３６μｇのＡＦ６４７標識ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを投与した。融合タンパク質は、遊離タンパク質として投与されるか、またはミョウバンと錯体化され、群当たりｎ＝３であった。ミョウバンを９０μｇの用量で投与し、融合タンパク質との錯体形成の前に、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８を使用して蛍光ｐＳｅｒ４で事前に標識した。マウスはまた、２００μｇの用量で腫瘍標的化抗体ＴＡ９９の腹腔内注射を受けた。腫瘍における融合タンパク質の初期分布を評価するために注射の１時間後、および長期間後の融合タンパク質の保持を評価するために注射の５日後に、犠牲にされたマウスから腫瘍を単離した。分離後、腫瘍を４％パラホルムアルデヒドで固定し、３％アガロースゲルに包埋し、ビブラトームを使用して１００μｍの切片に切断した。腫瘍細胞のマーカーとしてＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ５６８を使用して、腫瘍切片をＦｌｕｏ－ＴＡ９９で染色した。切片は、ＬｅｉｃａＳＰ８レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用した共焦点顕微鏡で画像化した。

図２４Ａ～２４Ｂに示されるように、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを注射した腫瘍（図２４Ｂ）のみが、注射後５日で検出可能なレベルの融合タンパク質を有し、一方、遊離ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを注射した腫瘍（図２４Ａ）では、バックグラウンドを超えるタンパク質シグナルは検出されなかった。追加的に、ミョウバン－ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ錯体を注射した腫瘍は、図２４Ｃに示すように、注射後１時間で腫瘍全体に蛍光ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋおよびミョウバンの分布を示した。この図は代表的な腫瘍画像を示しており、パネル（左）はＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ蛍光シグナルを示し、パネル（右）は腫瘍スライスにおいて検出されたミョウバン－ｐＳｅｒ４蛍光シグナルを示している。しかしながら、注射後５日までに、融合タンパク質は、腫瘍の周辺領域に高度に集中していた（図２４Ｂ）。これらの領域の存在は、ミョウバンとの融合タンパク質の投与が、融合タンパク質－ミョウバン錯体が蓄積する融合タンパク質「デポー」の形成に寄与することを示している。

観察されたデポー効果を考慮して、融合タンパク質が腫瘍の他の領域に存在するかどうかをさらに評価した。そこでは、融合タンパク質濃度が高い領域を画像化するために使用されるレーザー設定では、より低い融合タンパク質濃度が検出されない可能性があった。具体的には、腫瘍切片を高倍率対物レンズ（２５×）を使用して画像化し、融合タンパク質の蛍光強度が高い領域の外側の領域をスキャンした。代表的な画像のセットが図２４Ｄに提供されており、左のパネルにＴＡ９９標識腫瘍細胞による蛍光シグナル、中央のパネルにａｌｕｍ－ｐＳｅｒ４による蛍光シグナル、右のパネルにＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋによる蛍光シグナルが示されている。画像は、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋによる蛍光シグナルが腫瘍全体に分布していることを示している。追加的に、ミョウバンによる蛍光シグナルは、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋシグナルと実質的に重複することが分かった。総合すると、これらのデータは、ミョウバンとの錯体として注射された融合タンパク質が、腫瘍の周辺領域に高濃度で蓄積するが、錯体として腫瘍全体に分布したままであることを示している。

実施例５：ミョウバンに結合したＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質は機能を保持する
潜在的に、ミョウバンへの吸着は、ペイロードをその同族の受容体に結合できなくする可能性がある。理論に縛られることなく、文献における証拠は、タンパク質の二次構造がミョウバンに吸着されたときに一時的にのみ変化し、ミョウバンから放出された後、タンパク質が天然の状態に再度折り畳まれる可能性があることを示している（Ｚｈｅｎｇｅｔａｌ．２００７）。ミョウバンに吸着したときにＡＢＰを含む融合タンパク質が機能を保持するかどうかを判断するために、ＣＴＬＬ－２細胞（ＡＴＣＣ）でインビトロ増殖を誘導するために様々なＭＳＡ－ＩＬ２形式をアッセイした。図２５Ａに示されるように、評価したＭＳＡ－ＩＬ２形式には、ＭＳＡ、ＭＳＡ－ＩＬ２、Ｃ末端リン酸化ＡＢＰを備えたＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ）、およびＮ末端リン酸化ＡＢＰを備えたＭＳＡ－ＩＬ２（ＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２）が含まれる。増殖は、遊離タンパク質（図２５Ｂ）またはミョウバンに吸着されたタンパク質（１０：１のミョウバン：タンパク質の質量比）（図２５Ｃ）のいずれかとして、示された濃度の同等のＩＬ２とともに２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞をインキュベートすることによって測定した。インキュベーションの４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存をアッセイした。ＭＳＡは増殖を誘導しなかったが、各ＭＳＡ－ＩＬ２形式は、タンパク質が遊離しているかミョウバンに結合しているかに関係なく、ＣＴＬＬ－２細胞の強力な増殖を誘導した。さらに、リン酸化されたＡＢＰを含むＭＳＡ－ＩＬ２形式は、増殖を誘導するためにＭＳＡ－ＩＬ２と比較して同様に効果的であった。タンパク質およびミョウバンの高濃度での壊死が注目された。これは、ミョウバンの粒子状の性質が原因である可能性がある（例えば、Ｊａｃｏｂｓｏｎ、ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２８８：７４８１－７４９１（２０１３）を参照）。

Ｃ末端リン酸化ＡＢＰ８（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋ）またはＡＢＰ１７（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７Ｋ）を含むＭＳＡ－ＩＬ２形式も、上記のＣＴＬＬ－２細胞増殖アッセイを使用してミョウバンに吸着したときの機能性を評価した。簡単に説明すると、ミョウバンに吸着したタンパク質（１０：１のミョウバン：タンパク質の質量比）を、様々なＩＬ－２濃度で２０，０００個のＣＴＬＬ－２細胞とインキュベートし、インキュベーションの４８時間後に細胞生存をアッセイした。ミョウバンに吸着したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを陽性対照として増殖を評価した。図２６Ａ～２６Ｂに示すように、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８ＫおよびＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１７Ｋの両方が、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋによって誘導されるものと同等の高レベルの細胞増殖を誘導し、代替ＡＢＰとのＩＬ２融合物がミョウバンの吸着後にも生物活性を保持することを示している。

ミョウバンに結合したときにＩＬ１２融合タンパク質が機能性を保持するかどうかをさらに評価した。評価されたＩＬ１２形式を図２７Ａに示す。これらには、両方ともＣ末端リン酸化ＡＢＰ１０を有するｓｃＩＬ１２およびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ（それぞれｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫおよびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ）が含まれていた。サイトカインの機能性は、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ１２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して評価した。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ１２細胞は、ＳＴＡＴ－４経路の活性化を通じて生物活性マウスＩＬ１２の検出を可能にするＳＴＡＴ４誘導性ＳＥＡＰ（分泌型胎児アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を発現する。細胞を、遊離タンパク質として、または１０ｐＭ、１００ｐＭ、および１０００ｐＭのＩＬ１２濃度でミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫおよびｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋで処理した。融合タンパク質は、細胞処理の前に２０分間、ＴＢＳでミョウバン（１０：１のミョウバン：タンパク質の質量比）と錯体化した。また、細胞を、それぞれ陽性および陰性対照としての同等濃度のｓｃＩＬ１２－ＭＳＡまたはＭＳＡで処理した。ＳＥＡＰ産生は、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ比色分析を使用して定量した。図２７Ｂに示されるように、リン酸化ＩＬ１２融合タンパク質は、単独で、またはミョウバンと錯体化して、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡによって誘導されるものと同様の細胞活性化のレベルを誘導し、これは、ＩＬ１２融合タンパク質が、リン酸化ＡＢＰに連結され、さらにミョウバンに吸着されるときに機能的であることを示している。

実施例６：ミョウバンに結合したＩＬ２融合タンパク質は、単一の治療でＢ１６Ｆ１０腫瘍を治療する
リン酸化ＡＢＰを含み、ミョウバンに結合した免疫調節性ＭＳＡ－ＩＬ２の効力を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍モデルを使用してマウス腫瘍の治療について評価した。評価された治療には、黒色腫関連抗原チロシナーゼ関連タンパク質１（Ｔｒｐ１）として知られるＢ１６Ｆ１０腫瘍抗原を標的とする抗体であるＴＡ９９と組み合わせたＭＳＡ－ＩＬ２が含まれていた。ＭＳＡ－ＩＬ２とＴＡ９９（腹腔内でＩＰを送達）の組み合わせは、Ｂ１６Ｆ１０皮下腫瘍を有するマウスのサブセットを治癒することが報告されている（Ｍｏｙｎｉｈａｎ，ＫｅｌｌｙＤ．，ｅｔａｌＮａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２２：１４０２（２０１６）；Ｚｈｕ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ２７：４８９－５０１（２０１５））。しかしながら、報告によれば、これらの治療には全身性ＩＬ２の複数回投与が必要であるが、治療を受けたマウスのすべてが治癒するわけではない。追加的に、コラーゲンアンカードメイン（例えば、ルミカン）の使用およびＴＡ９９と組み合わせた腫瘍内注射によるルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２の投与は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスの大部分を治癒することが示されている（例えば、Ｍｏｍｉｎ，ｅｔａｌＳＣＩ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＥＤ（２０１９）１１：ｅａａｗ２６１４；ＵＳ２０２０／０１０２３７０を参照）。しかしながら、投薬計画は再び腫瘍内ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２の３回の投与に依存していた。理論に縛られることなく、ミョウバンへの強力な吸着によってＩＬ２滞留時間を延長すると、同等の効果を得るためにＭＳＡ－ＩＬ２とＴＡ９９の単回投与のみを必要とする十分に強力な抗腫瘍免疫応答が促進されると仮定された。

単回投与療法の有効性を、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の処理について評価した。腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＰＢＳの皮下注射によって右脇腹に１００万個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を接種することによって確立した。６日目に０．４ｎｍｏｌＩＬ２の用量でのＭＳＡ－ＩＬ２の腫瘍内注射、およびマウス１匹当たり２００μｇの用量でのＴＡ９９の腹腔内（ｉｐ）注射で腫瘍を処理し、治療群当たりｎ＝５であった。治療スケジュールを図２８Ａに示す。遊離ＭＳＡ－ＩＬ２は、ＭＳＡ－ＩＬ２単独、またはコラーゲン結合ルミカンドメインに融合したＭＳＡ－ＩＬ２（ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２）を含む様々な形式で投与した。ミョウバンに吸着されたＭＳＡ－ＩＬ２形式も評価した。これにはＭＳＡ－ＩＬ２、またはＣ末端もしくはＮ末端リン酸化ＡＢＰを含むＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２）が含まれる。ミョウバンで調製されたタンパク質については、投与前に室温で２０分間回転させた９０μｇのミョウバンと０．４ｎｍｏｌのタンパク質を含む混合物をマウスごとに与えた。治療を受けていない動物には生理食塩水のみを注射した。

動物の生存を図２８Ｂに示し、腫瘍成長曲線を図２８Ｃ～２８Ｈに示す。ミョウバンに固定されたＭＳＡ－ＩＬ２（ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０ＫまたはＡＢＰ１０Ｋ－ＭＳＡ－ＩＬ２）による処理により、遊離ＭＳＡ－ＩＬ２またはコラーゲンに固定されたルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２と比較して生存が劇的に改善された。総合すると、これらの結果は、ミョウバンへの吸着がＭＳＡ－ＩＬ２に対する抗腫瘍免疫応答を劇的に改善することを実証している。

追加的に、併用療法による長期生存（すなわち、腫瘍接種後１００日までの生存）は、より大きなコホートサイズ（ｎ＝１０～１５）を使用して評価した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、上記のように確立され、図２９Ａに示されるレジメンに従って、腫瘍接種後６日目にマウスに投与された。具体的には、腹腔内注射により２００μｇの用量でＴＡ９９をマウスに投与した。マウスコホートにはさらに、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを遊離タンパク質として、またはミョウバンと錯体化して、ＭＳＡ－ＩＬ２を遊離タンパク質として、またはミョウバンと錯体化して、あるいはミョウバンのみの腫瘍内注射を行った。ＩＬ－２融合物は、０．４ｎｍｏｌのＩＬ２に相当する質量で投与した。ミョウバンと錯体化した融合タンパク質の場合、混合物は９０μｇのミョウバンで調製した。投与後のマウスの生存をモニターした。図２９Ｂに示されるように、ミョウバンに吸収したリン酸化ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋと組み合わせてＴＡ９９を投与されたマウスの長期生存は、ルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２との組み合わせを投与されたマウスよりも有意に高かった。残りの治療群では、腫瘍接種後４０日を超えて生存した動物はいなかった。

併用療法によって誘発された全身性抗腫瘍Ｔ細胞応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して評価した。具体的には、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスに上記のように接種した。腫瘍接種後６日目に、マウスに、２００μｇのＴＡ９９を、単独で、あるいは遊離ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋ、またはルミカン－ＭＳＡ－ＩＬ２の腫瘍内注射と組み合わせて、腹腔内注射により投与した。融合タンパク質は、０．４ｎｍｏｌのＩＬ２の用量で投与した。腫瘍接種後１２日目に、脾臓を採取し、脾臓細胞に照射されたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞をプレーティングした。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞による刺激に応答したＩＦＮγ形成単位（ＳＦＵ）の数は、ＥＬＩＳＰＯＴによって定量した。図２９Ｃに示されるように、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋとの併用療法は、最大量の腫瘍反応性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を提供した。

ＡＢＰ８に連結されたＭＳＡ－ＩＬ２融合タンパク質も、併用療法において評価した。簡単に言えば、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は上記のように確立された。腫瘍接種後６日目に、ミョウバンと錯体化したＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ８Ｋまたはミョウバンと錯体化したＭＳＡ－Ｉｌ２－ＡＢＰ１０Ｋの腫瘍内注射をマウスに投与した。融合タンパク質を０．４ｎｍｏｌの用量でＩＬ２を投与し、９０μｇのミョウバンと錯体化した。対照マウスは、９０μｇのミョウバンのみの腫瘍内注射を受けた。追加的に、腫瘍接種後６日目に、腹腔内注射により、２００μｇの用量でＴＡ９９をマウスに投与した。マウスの生存をモニターした。図２９Ｄに示されるように、ＴＡ９９＋ミョウバンを投与されたすべてのマウスは、腫瘍負荷に屈した。対照的に、ミョウバンと錯体化し、リン酸化されたＡＢＰ８またはＡＢＰ１０のいずれかを有するＭＳＡ－Ｉｌ２融合物と組み合わせてＴＡ９９を投与されたマウスの約５０％は、長期生存者であった。

総合すると、これらのデータは、ＴＡ９９腫瘍標的抗体と組み合わせたミョウバン結合ＩＬ２融合タンパク質の腫瘍内投与が、強力な抗腫瘍免疫応答を誘導し、マウスのかなりの部分で治癒を可能にするのに非常に効果的であることを示している。

実施例７：黒色腫腫瘍モデルにおけるＩＬ１２融合タンパク質と免疫チェックポイント阻害の相乗効果
上記のようにミョウバンに吸着したＩＬ２融合タンパク質を用いた抗腫瘍効果の劇的な改善により、ＩＬ１２融合タンパク質の治療効果を評価して、ミョウバンへの吸着による改善を他のサイトカイン形式にまで一般化できるかどうかを決定した。ＩＬ－１２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞でＩＦＮγ産生を誘導することにより、強力な抗腫瘍免疫効果を誘導することが示されている（Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，（２０１７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２９２：１３９２５－１３９３３）。しかしながら、ＩＬ１２の治療ウィンドウは狭く、全身投与は臨床試験で重度の毒性と関連している（Ｌａｓｅｋｅｔａｌ．，（２０１４）ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６３（５）：４１９－４３５）。追加的に、安全性の懸念により、ＩＬ１２の抗腫瘍効果を増強するための組み合わせ（例えば、免疫チェックポイント遮断との組み合わせ）の開発が制限されている。したがって、全身性炎症反応を誘発することなく、ＩＬ１２の抗腫瘍効果を腫瘍微小環境に局在させる必要性が残っている。この目的のために、ミョウバンへのＩＬ１２融合タンパク質の吸着を調べた。

具体的には、抗ＰＤ－１抗体の反復投与と組み合わせた単回投与ＩＬ１２融合タンパク質の有効性を、図３０Ａに示す治療スケジュールに従ってＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスで評価した。腫瘍は、実施例６に記載されているように確立された。マウスに、２００μｇの抗ＰＤ－１抗体（クローンＲＭＰ１．１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を６日目から３日ごとに腹腔内注射で合計４回投与した。マウスにさらに、遊離タンパク質として、またはミョウバンと錯体化して、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫまたはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０ＫのいずれかのＩＬ１２融合タンパク質を投与した。ＩＬ１２融合タンパク質は、腫瘍内注射による腫瘍接種後６日目に、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋについては２．５μｇ（４０ｐモル）、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋについては５μｇ（４０ｐモル）、ミョウバンと錯体化した融合タンパク質については５０μｇの用量で投与した。１つの対照群は、全身性抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて５０μｇの用量でミョウバンの腫瘍内注射を受けた。他の対照群には、ミョウバンと錯体化し、抗ＰＤ－１抗体を伴わずに投与された腫瘍内ＩＬ１２融合タンパク質（ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０ＫまたはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ）を投与した。

図３０Ｂは、ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋ融合タンパク質を投与されたマウスの生存転帰を提供し、図３０Ｃは、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋ融合タンパク質を投与されたマウスの生存転帰を提供する。図３０Ｂに示すように、ミョウバンに吸着したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋを投与したマウスは、対照マウス（抗ＰＤ－１抗体＋ミョウバン）または抗ＰＤ－１抗体を含む遊離ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋを投与したマウスと比較して生存が改善した。ミョウバンに吸着したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋと抗ＰＤ－１抗体の組み合わせは、最高レベルの長期生存を示し、腫瘍接種後１００日目に評価した場合、治療群のマウスの生存が約２０％であった。同様に、図３０Ｃに示すように、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋを抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与したマウスでは、最高レベルの長期生存が観察され、腫瘍接種後１００日目に評価した場合、治療群のマウスの生存は約４０％であった。

さらに、ＡＢＰ１７とのｓｃＩＬ２融合形式は、上記の治療スケジュールに従って評価され、図３０Ａに示されている。簡単に説明すると、腫瘍接種後６日目に、腫瘍内注射によりミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋ（ｎ＝７）またはｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７Ｋ（ｎ＝５）のいずれかを、および腹腔内注射により抗ＰＤ－１療法を、確立されたＢ１６Ｆ１０担腫瘍マウスに投与した。ｓｃＩＬ１２融合物を、４０ｐｍｏｌのｓｃＩＬ１２（２．５μｇｓｃＩＬ１２に相当する質量）および５０μｇのミョウバンの単回用量で投与した。抗ＰＤ－１は、３日ごとに２００μｇの用量で合計４回投与した。対照群は、（１）１回用量の遊離ｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋ（４０ｐｍｏｌ）および４回腹腔内用量の抗ＰＤ－１（ｎ＝５）、または（２）抗ＰＤ１（ｎ＝５）は伴わずに、１回用量５０μｇのミョウバンで処理された担腫瘍マウスであった。腫瘍サイズはキャリパーを使用して測定され、腫瘍面積（腫瘍の長さｘ幅）として評価した。対照群のＢ１６Ｆ１０腫瘍は急速に成長したが（図２８Ｃに示したものと比較して）、ミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１０Ｋ（図３１Ａ）およびミョウバンと錯体化したｓｃＩＬ１２－ＡＢＰ１７Ｋ（図３１Ｂ）の両方について、併用療法を行った腫瘍は大多数のマウスで効果的に制御された。対照群は図３１Ｃ～３１Ｄに示されている。

これらのデータを総合すると、ミョウバンを使用してＩＬ１２サイトカイン融合物を腫瘍に局在させることは、融合物を単独で投与した場合、または免疫チェックポイント遮断と組み合わせて投与した場合の両方で、単回投与後の生存を改善するのに効果的である。

実施例８：黒色腫腫瘍モデルにおけるＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質と免疫チェックポイント阻害の相乗効果
ＩＬ－２およびＩＬ－１２は、相補的なシグナル伝達経路に関与してＮＫ細胞およびＴ細胞を刺激することが知られている（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ＆Ｗｉｌｔｒｏｕｔ（２００２）ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＢｉｏｌＴｈｅｒ２：５１３－５２４）。特に、ＩＬ－２およびＩＬ－１２の組み合わせは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの産生も大幅に増強する。追加的に、ＩＬ－２は、ＩＬ－１２受容体サブユニットベータ２の発現を上方調節し（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ９５：３１８３）、ＩＬ－１２は高親和性ＩＬ－２受容体ＣＤ２５の表面発現を持続させる（Ｓｔａｒｂｅｃｋ－Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（２０１３）ＪＥｘｐＭｅｄ２１１：１０５－１２０）。相互の正のフィードバックによって、ＩＬ－２とＩＬ－１２は互いの効果を増強し、延長する（Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９６）ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８８：３８－４３）。しかしながら、有望な有効性にもかかわらず、サイトカインの全身投与に関連する毒性は、ＩＬ２／ＩＬ１２併用療法の臨床開発を制限してきた（Ｇｏｌｌｏｂｅｔａｌ．，（２００３）ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２１：２５６４－２５７３；Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：９０８；Ｔｏｌｏｚａ，ｅｔａｌ（１９９６）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ３：１１；Ｂｒｕｎｄａ，ｅｔａｌ（１９９３）ＪＥｘｐＭｅｄ１７１：２４９；Ｎａｓｔａｌａｅｔａｌ（１９９４）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５３：１６９７；Ｚｏｕ，ｅｔａｌ（１９９５）ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ７：１１３５）。

したがって、全身性免疫チェックポイント遮断と組み合わせて、ＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質を腫瘍に局在させるためのミョウバンの使用を、毒性を誘発することなく、相乗的な治療効果について評価した。具体的には、併用療法は、図３２Ａに示される治療スケジュールに従って、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスにおいて評価した。腫瘍は、実施例６に記載されているように確立された。抗ＰＤ－１抗体を、腫瘍接種後６日目から、実施例７に記載されているように投与した。６日目に、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋおよび／またはｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋを可溶性融合タンパク質として、またはミョウバンに吸着させてマウスに投与した。融合タンパク質を腫瘍内注射によって投与し、ＭＳＡ－ＩＬ２－ＡＢＰ１０Ｋを２０μｇの用量で投与し、ｓｃＩＬ１２－ＭＳＡ－ＡＢＰ１０Ｋを５μｇの用量で投与した。錯体化した融合タンパク質を、５０μｇのミョウバンの用量で投与した。対照マウスには、５０μｇの腫瘍内注射を介してミョウバンのみを投与した。

併用療法の毒性は、動物の体重を経時的に測定することによって評価した。図３２Ｂに示されるように、遊離ＩＬ２融合タンパク質および遊離ＩＬ１２融合タンパク質の組み合わせを投与されたマウスは、有意な体重減少を示し、腫瘍接種後１２日目までに、処理前の体重と比較して約１５％の平均体重減少を示した。対照的に、ミョウバンに吸着されたＩＬ１２融合タンパク質を投与されたマウスでは、有意な体重減少はなかった。追加的に、ミョウバンに吸着されたＩＬ１２とＩＬ２の融合タンパク質の組み合わせを投与されたマウスは、体重減少がほとんどまたはまったくなかった。追加的に、図３２Ｃに示されるように、ミョウバンに吸着されたＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせは、対照マウス（ミョウバンのみを投与された）と比較して生存が劇的に改善された。生存は、抗ＰＤ－１抗体との遊離ＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質を投与されたマウスと比較して、改善されなかったとしても同様であった。

これらの結果は、免疫チェックポイント遮断と組み合わせたミョウバン結合ＩＬ２およびＩＬ１２融合タンパク質の腫瘍内投与が、治療関連の毒性を誘発することなく、マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルの生存転帰を改善するのに効果的であることを示している。したがって、ミョウバンは、サイトカインの組み合わせを腫瘍に局在し、強力な有効性と低毒性の望ましいバランスを達成するための効果的な治療法を提供する。

配列一覧表

Claims

免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む分泌経路キナーゼの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および
（ｉｉｉ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
前記免疫調節融合タンパク質が、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を介した配位子交換により、前記金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、Ｆａｍ２０Ｃ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、細胞外調節キナーゼ－２、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ－２、アベルソンマウス白血病ウイルスチロシンキナーゼ、ラウス肉腫ウイルスチロシンキナーゼ、インスリン受容体チロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＤ、プロウイルス統合部位キナーゼ１～３、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、またはＮｉｍＡ関連キナーゼからなる群から選択されるキナーゼによってリン酸化されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、Ｆａｍ２０Ｃによってリン酸化されたアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、ホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニンを含む、請求項２または３に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、Ｓ－Ｘ－Ｅ、Ｓ－Ｘ－ｐＳ、またはＳ－Ｘ－Ｑ－Ｘ－Ｘ－Ｄ－Ｅからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む前記分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、および
（ｉｉｉ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフがホスホセリンを含み、前記免疫調節融合タンパク質が、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのホスホセリンを介した配位子交換により、前記金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、任意選択的にリンカーを介して、前記免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、前記安定化ドメインが、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、前記免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、前記金属水酸化物結合ペプチドが、任意選択的にリンカーを介して、前記免疫調節ドメインまたは前記安定化ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、前記金属水酸化物結合ペプチドが、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、前記免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、前記安定化ドメインが、任意選択的にリンカーを介して、前記金属水酸化物結合ペプチドまたは前記免疫調節ドメインのいずれかの末端に作動可能に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、約３～６個、約６～１５個、約１０～２５個、または約１０～５０個のアミノ酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、リン酸化アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上のキナーゼ標的モチーフを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記キナーゼ標的モチーフが、ホスホセリンであるリン酸化アミノ酸を含む、請求項１１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、分泌経路キナーゼの２つ以上のキナーゼ標的モチーフを含み、前記２つ以上のキナーゼ標的モチーフが、同じまたは異なるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記２つ以上のキナーゼ標的モチーフが、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフがアミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、セリンがリン酸化されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが少なくとも１つ、２つ、または３つのキナーゼ標的モチーフを含み、任意選択的に、前記キナーゼ標的モチーフが連続的である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
ＸがＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧから選択される、請求項１４または１５に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
ＸがＥである、請求項１６に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、および配列番号１２５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドがアミノ酸配列ＸＸＳＸＥＸＸ（配列番号１２７）またはＸＸＳＥＥＸＸ（配列番号１２８）を含み、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドがアミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５（配列番号１２７）を含み、Ｘａａ_１がＦ、Ｍ、またはＧであり、Ｘａａ_２がＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３がＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４がＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５がＱ、Ｎ、またはＧである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_３がＥである、請求項２０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_１がＦであり、Ｘａａ_２がＱである、請求項２０または２１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_１がＭであり、Ｘａａ_２がＥである、請求項２０または２１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_１がＧであり、Ｘａａ_２がＧである、請求項２０または２１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_４がＱであり、Ｘａａ_５がＱである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_４がＥであり、Ｘａａ_５がＳである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
Ｘａａ_４がＧであり、Ｘａａ_５がＧである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、アミノ酸配列ＦＱＳＥＥＱＱ（配列番号１２９）、ＭＥＳＥＥＳＮ（配列番号１３０）、またはＧＧＳＥＥＧＧ（配列番号１３１）を含む、請求項２０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、アミノ酸配列Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_４－Ｘａａ_５－［Ｌ］－Ｓ－Ｘａａ_３－Ｅ－Ｘａａ_６－Ｘａａ_７（配列番号１３３）を含み、Ｘａａ_１がＦ、ＭまたはＧであり、Ｘａａ_２がＱ、Ｅ、またはＧであり、Ｘａａ_３がＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、およびＧであり、Ｘａａ_４がＱ、Ｓ、またはＧであり、Ｘａａ_５がＱ、Ｎ、またはＧであり、Ｘａａ_５がＧであり、Ｘａａ_６がＧであり、Ｌがペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ａ］ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘが、Ａで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ａ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式（［Ａ］－［Ｂ］）_Ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘが、［Ａ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Ｌが、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ａが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、または配列番号１３１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘが、［Ａ］－［Ｌ］－［Ａ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４であり、Ｌが、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］を含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、Ｌが、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式（［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］）_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＡおよびＢが、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、もしくは配列番号１３１からなる群から選択される同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ｘが、［Ａ］－［Ｌ］－［Ｂ］で示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４であり、Ｌが、ペプチドリンカー、任意選択的にＧ／Ｓリンカー、任意選択的にＧＧＧＳである、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ｃ］_ｘを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、Ｃが、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ｘが、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４である、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、式［Ｃ］_ｘ－［Ｄ］_ｙを含む連結アミノ酸の配列を含み、式中、ＣおよびＤが、同じまたは異なるアミノ酸配列であり、ＣおよびＤが、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、および配列番号１０１からなる群から選択され、ｘが、Ｃで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｙが、Ｄで示される連結アミノ酸配列の数を示す値の整数であり、ｘが１～４であり、ｙが１～４であり、ｘおよびｙが同じまたは異なる、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記免疫調節融合タンパク質が、約１～５、１～１０、１～１５、１～２０個のホスホセリン残基を含む金属水酸化物結合ペプチドを含み、前記免疫調節融合タンパク質が、前記ホスホセリン残基の配位子交換により、前記金属水酸化物に吸着される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体であって、
（ａ）免疫調節融合タンパク質であって、
（ｉ）任意選択的に安定化ドメインに連結された免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）タンパク質反応性部分によって、任意選択的にリンカーを介してカップリングされる１つ以上のヒドロキシル置換基を含む末端金属水酸化物結合ペプチド、を含む、免疫調節融合タンパク質と、
（ｂ）金属水酸化物と、を含み、
前記免疫調節融合タンパク質が、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのヒドロキシル置換基を介した配位子交換により、金属水酸化物に吸着され、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を提供する。
前記タンパク質反応性部分がスルフヒドリル反応性部分を含み、任意選択的に、前記スルフヒドリル反応性部分がマレイミドである、請求項４２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記タンパク質反応性部分が、ソルターゼ認識モチーフを含む、請求項４２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物結合ペプチドが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のヒドロキシル置換基を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記ヒドロキシル置換基が、フッ化物基、シトレート基、ホスフェート基、カーボネート基、およびスルフェート基からなる群から選択され、任意選択的に、前記ヒドロキシル置換基が、ホスフェート基である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記ヒドロキシル置換基が少なくとも１つのリン酸化アミノ酸残基を含み、任意選択的に、前記リン酸化アミノ酸残基が、ホスホセリン、ホスホチロシン、およびホスホスレオニンから選択され、任意選択的に、前記リン酸化アミノ酸残基が、ホスホセリンである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
前記金属水酸化物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、水酸化鉄、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、および水酸化ジルコニウムから選択され、任意選択的に、前記金属水酸化物が、水酸化アルミニウム（ミョウバン）である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体。
免疫調節融合タンパク質であって、
（ａ）免疫調節ドメイン、
（ｂ）アミノ酸配列Ｓ－Ｘ－Ｅを含む分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチドであって、Ｘが任意のアミノ酸であり、任意選択的に、ＸがＥ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、またはＧである、金属水酸化物結合ペプチド、
（ｃ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含み、
前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのキナーゼ標的モチーフが、ホスフェート基で修飾されたセリンを含み、前記免疫調節融合タンパク質が、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのホスホセリンを介したミョウバンとの配位子交換を受け、それにより、前記免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質を提供する。
免疫調節融合タンパク質であって、
（ａ）任意選択的に安定化ドメインに連結された免疫調節ドメイン、および
（ｂ）タンパク質反応性部分によって、任意選択的にリンカーを介してカップリングされる１つ以上のリン酸化アミノ酸を含む金属水酸化物結合ペプチド、を含み、
前記免疫調節融合タンパク質が、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記少なくとも１つのヒドロキシル置換基を介したミョウバンとの配位子交換を受け、それにより、前記免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質。
免疫調節ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、前記金属水酸化物結合ペプチドが、タンパク質反応性部分によって前記免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端にカップリングされている、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
免疫調節ドメインと、安定化ドメインと、金属水酸化物結合ペプチドと、を含み、前記安定化ドメインが、任意選択的にアミノ酸リンカーを介して、前記免疫調節ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能に連結されており、前記金属水酸化物結合ペプチドが、タンパク質反応性部分により、前記免疫調節ドメインまたは前記安定化ドメインの末端にカップリングされている、請求項５０に記載の免疫調節融合タンパク質。
免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させるための方法であって、
（ａ）
免疫調節ドメイン、
１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、
任意選択的に、安定化ドメイン、を含む、免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
（ｂ）
ＥＲ標的化リーダー配列、それと作動可能に連結された
キナーゼドメイン、それと作動可能に連結された
アンカーペプチド、を含むキナーゼをコードするヌクレオチド配列に、細胞を接触させることを含み、
前記キナーゼが分泌経路に局在し、前記金属水酸化物結合ペプチドの前記１つ以上のキナーゼ標的モチーフが前記分泌経路内で前記キナーゼによってリン酸化され、それにより、前記免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる、方法。
前記キナーゼが、前記キナーゼを前記分泌経路に向けるＥＲ標的化リーダー配列を含み、任意選択的に、前記キナーゼが、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、細胞外調節キナーゼ－２、カゼインキナーゼ１、カゼインキナーゼ２、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ－２、アベルソンマウス白血病ウイルスチロシンキナーゼ、ラウス肉腫ウイルスチロシンキナーゼ、インスリン受容体チロシンキナーゼ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＤ、プロウイルス統合部位キナーゼ１～３、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、またはＮｉｍＡ関連キナーゼからなる群から選択されるキナーゼドメインを含む、請求項５３に記載の方法。
前記キナーゼがＦａｍ２０Ｃを含み、Ｆａｍ２０Ｃが配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
前記キナーゼが、前記キナーゼの分泌を阻害するアンカーペプチドを含み、任意選択的に、前記アンカーペプチドが、アミノ酸配列ＫＤＥＬまたはＨＤＥＬを含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、前記免疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、前記キナーゼをコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、前記キナーゼをコードする核酸および前記疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターと接触させられる、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の方法。
免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させるための方法であって、前記免疫調節融合タンパク質が、
（ｉ）免疫調節ドメイン、
（ｉｉ）前記分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃの１つ以上のキナーゼ標的モチーフを含む金属水酸化物結合ペプチド、
（ｉｉｉ）任意選択的に、安定化ドメイン、を含み、
前記方法が、前記免疫調節融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターおよびアンカーペプチドに作動可能に連結された前記分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃをコードする核酸を含む発現ベクターと、細胞を接触させることを含み、前記分泌経路キナーゼＦａｍ２０Ｃが、前記アンカーペプチドによって前記分泌経路に局在され、前記１つ以上のキナーゼ標的モチーフが、前記分泌経路内でＦａｍ２０Ｃによってリン酸化され、それにより、前記免疫調節融合タンパク質のリン酸化を増加させる、方法。
前記免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で前記細胞を維持することを含む、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質を単離することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を含む、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法によって産生される免疫調節融合タンパク質であって、前記免疫調節融合タンパク質が、前記少なくとも１つのリン酸化アミノ酸を介したミョウバンとの配位子交換により吸着され、それにより、前記免疫調節融合タンパク質をミョウバンにカップリングして、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成する、免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、免疫細胞による応答を活性化、増強もしくは促進するポリペプチドを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、免疫細胞による応答を阻害、低減もしくは抑制するポリペプチドを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞が、自然リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるリンパ球様細胞である、請求項６４または６５に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞が、単球、好中球、顆粒球、肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの組み合わせから選択される骨髄細胞である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫細胞による前記応答が、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／もしくは細胞毒性の増加、ならびにそれらの組み合わせを含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、サイトカイン、ケモカイン、活性化配位子／受容体、阻害性配位子／受容体、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つ以上を含む、請求項１～４８および６４～６８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３～６８のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つ以上のサイトカインを含む、請求項６９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲＡ、ＩＬ－２１、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトガンマ共通鎖受容体インターロイキンである、請求項７０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインがＩＬ－２である、請求項７１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインがＩＬ－１５／ＩＬ１５ＲＡである、請求項７１に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ－１２（ｐ３５）、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ３５）／ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩＬ－１２ファミリーメンバーである、請求項７０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ－１２（ｐ３５）／ＩＬ－１２（ｐ４０）の一本鎖融合物である、請求項７４に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＩＬ－１、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩＬ－１ファミリーメンバーである、請求項７０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインがＩＬ－１８である、請求項７６に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項７０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つ以上のケモカインを含む、請求項６９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＬＩＦ、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ－１、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＸ、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項７９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記ケモカインが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、エオタキシン、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項７９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つ以上の活性化配位子／受容体を含む、請求項６９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリー、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、Ｂ７配位子ファミリー、およびＴ細胞受容体から選択される、請求項８２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、ＴＮＦ－アルファ、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０、およびそれらの組み合わせから選択されるＴＮＦスーパーファミリー配位子である、請求項８２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリー受容体であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗４－１ＢＢ抗体、および抗ＯＸ４０抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項８３に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、ＩＣＯＳ配位子、ＣＤ８０、およびＣＤ８６、ならびにそれらの組み合わせから選択されるＣＤ２８スーパーファミリーメンバーもしくはＢ７ファミリーメンバーである、請求項８３に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＩＣＯＳ抗体および抗ＣＤ２８抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項８３に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記活性化配位子／受容体が、Ｔ細胞受容体であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＣＤ３γ抗体、抗ＣＤ３δ抗体、抗ＣＤ３ζ抗体、および抗ＣＤ３ε抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項８３に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節ドメインが、１つ以上の阻害性配位子／受容体を含む、請求項６９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性配位子／受容体が、ＣＤ２８受容体スーパーファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、およびチェックポイント阻害剤から選択される、請求項８９に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性配位子／受容体が、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項９０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性配位子／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＢＴＬＡ抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項９０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性配位子／受容体が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであり、前記免疫調節ドメインが、抗ＴＩＧＩＴ抗体である抗体もしくは抗原結合断片を含む、請求項９２に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
前記阻害性配位子／受容体が、チェックポイント阻害剤であり、前記免疫調節ドメインが、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＤ４７抗体、および抗ＳＩＲＰα抗体から選択される抗体もしくはその抗原結合断片を含む、請求項９０に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体または免疫調節融合タンパク質。
安定化ドメインを含み、前記安定化ドメインがヒト血清アルブミンもしくはその断片を含む、請求項１～４８および６４～９４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３～９４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
安定化ドメインを含み、前記安定化ドメインが、ＦｃドメインもしくはＦｃＲ相互作用が低減した変異体Ｆｃドメインを含む、請求項１～４８および６４～９２のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３～９４のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
前記免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体が、インビボでの投与時に注射部位からのサイズ依存性拡散を低減するのに十分な質量のものである、請求項１～４８および６４～９６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３～９６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質。
請求項１～４８および６４～９６のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、または請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
請求項４９および６２～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
請求項９９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
請求項１００に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
免疫調節融合タンパク質を産生するための方法であって、前記免疫調節融合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１０１に記載の細胞を維持することを含む、方法。
前記免疫調節融合タンパク質を取得することと、前記免疫調節融合タンパク質を金属水酸化物に吸着させ、それにより、免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体を形成することと、をさらに含む、請求項１０２に記載の方法。
対象における免疫細胞による応答を活性化、増強または促進するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物を、免疫細胞による応答の活性化、増強または促進を必要とする対象に投与することを含む、方法。
対象における免疫細胞による応答を阻害、低減または抑制するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９５のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物を、免疫細胞による応答の阻害、低減または抑制を必要とする対象に投与することを含む、方法。
前記免疫細胞が、自然リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるリンパ球様細胞である、請求項１０４または１０５に記載の方法。
前記免疫細胞が、単球、好中球、顆粒球、肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびそれらの組み合わせから選択される骨髄細胞である、請求項１０４または１０５に記載の方法。
前記免疫細胞による前記応答が、サイトカイン産生、抗体産生、抗原特異的免疫細胞の産生、エフェクター機能および／または細胞毒性の増加、ならびにそれらの組み合わせを含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫細胞による前記応答が、腫瘍微小環境において起こる、請求項１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。
腫瘍成長を低減または阻害するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物を、腫瘍成長の低減または阻害を必要とする対象に投与することを含む、方法。
対象におけるがんを治療するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、方法。
前記免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、前記免疫調節融合タンパク質、または前記薬学的組成物の投与後に、抗腫瘍免疫応答が前記対象内で誘導される、請求項１１０または１１１に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、前記免疫調節融合タンパク質、または前記薬学的組成物が腫瘍内に投与される、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載の方法。
がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、もしくは請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または請求項９８に記載の薬学的組成物、を含む容器と、前記融合タンパク質または薬学的組成物を投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キット。
がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、もしくは請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または請求項９８に記載の薬学的組成物、を含む容器と、前記抗体または薬学的組成物を単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与するための説明書を含む添付文書と、を含む、キット。
がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造のための、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、もしくは請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または請求項９８に記載の薬学的組成物の使用。
がんの治療もしくはその進行の遅延、または腫瘍成長の低減もしくは阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、もしくは請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または請求項９８に記載の薬学的組成物。
薬剤として使用するための、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、もしくは請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、および任意選択的な薬学的に許容される担体、または請求項９８に記載の薬学的組成物。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物、ならびに有効量の、腫瘍抗原標的化抗体またはその抗原結合断片を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法。
前記腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、または腫瘍新生抗原である、請求項１１９に記載の方法。
前記腫瘍抗原標的化抗体が、ヒトＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、またはＣＤ３８と特異的に結合する、請求項１１９または１２０に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物、ならびに有効量の、がんワクチンを含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法。
前記がんワクチンが、腫瘍抗原でインビトロで免疫化され、前記対象に投与される細胞の集団である、請求項１２２に記載の方法。
前記がんワクチンが、１つ以上の腫瘍関連抗原を含むペプチドである、請求項１２３に記載の方法。
前記がんワクチンが、腫瘍関連抗原、脂質、および任意選択的にリンカーを含む両親媒性ペプチドコンジュゲートであり、前記両親媒性ペプチドコンジュゲートが生理学的条件下でアルブミンと結合する、請求項１２３に記載の方法。
前記がんワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物、ならびに有効量の、免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、もしくはＴＩＭ３と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１２７に記載の方法。
対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療するための方法であって、有効量の、請求項１～４８および６４～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、請求項４９～５２および６３～９７のいずれか一項に記載の免疫調節融合タンパク質、または請求項９８に記載の薬学的組成物、ならびに有効量の、養子細胞療法を含む第２の組成物を、腫瘍成長の低減もしくは阻害、またはがんの治療を必要とする対象に投与することにより、前記対象における腫瘍成長を低減もしくは阻害するか、またはがんを治療することを含む、方法。
前記養子細胞療法が、腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む免疫エフェクター細胞を含む、請求項１２９に記載の方法。
前記ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項１２９または１３０に記載の方法。
前記抗原結合ドメインが、前記疾患に関連する前記腫瘍抗原に結合する、請求項１３１に記載の方法。
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０、およびＢＣＭＡから選択される、請求項１３１に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞である、請求項１３０～１３３のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１３０～１３３のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、前記免疫調節融合タンパク質、または前記薬学的組成物が腫瘍内に投与される、請求項１０４～１１３および１１８～１３５のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、前記免疫調節融合タンパク質または前記薬学的組成物、および前記第２の組成物が、同時にまたは連続して投与される、請求項１１９～１３６のいずれか一項に記載の方法。
複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物を投与することを含み、前記免疫調節ドメインが異なる、請求項１０４～１１３および１１８～１３６のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫調節ドメインが、異なるサイトカインである、請求項１３８に記載の方法。
前記複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物が、一緒に配合される、請求項１３８または１３９に記載の方法。
前記複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物が別々に配合される、請求項１３８または１３９に記載の方法。
前記複数の免疫調節融合タンパク質－金属水酸化物錯体、免疫調節融合タンパク質または薬学的組成物が、同時にまたは連続して投与される、請求項１４１に記載の方法。