JP2016526536A - 修飾されたキメラ抗原受容体による腫瘍新生血管構造の標的化 - Google Patents
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Abstract
キメラ抗原受容体を形質導入したT細胞を宿主に投与して、がん細胞を死滅させることができる。キメラ抗原受容体は、エキスタチンポリペプチドを含むがこれに限定されない、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むことができる。標的化部分は、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することもできる。一局面において、がん細胞を死滅させるための化合物が提供され、上記化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)を移植したT細胞を含み、上記CARは、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む。
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関連出願への相互参照
この出願は、2013年6月14日に出願された米国仮出願第61/835,147号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
この出願は、2013年6月14日に出願された米国仮出願第61/835,147号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
政府による財政上の支援:
NIH参照番号R01CA132792。
NIH参照番号R01CA132792。
数種の有望な免疫療法が、がんと戦うために開発されている。例えば、ある種の免疫療法は、細胞媒介性免疫における抗原特異的T細胞の利益を活用する。T細胞は、がん細胞表面に見いだされる主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に提示される抗原性ペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)を介してその標的を認識する。共起刺激分子の存在下で、この結合は、T細胞の活性化と、その後の結合した標的細胞の溶解をもたらす(Van der Merwe PAら、Molecular interactions mediating T cell antigen recognition、Annu. Rev. Immunol.21巻:659〜84頁(2003年))。しかし、大部分の腫瘍関連抗原は、自己タンパク質であり、免疫系は、これに対する耐容性を発達させてきた。よって、がん免疫療法に直面する主な課題の1つは、十分な数の高結合親和性腫瘍特異的T細胞の作製における困難である(Kammertoens Tら、Making and circumventing tolerance to cancer、Eur. J. Immunol.39巻:2345〜53頁(2009年))。
研究者らは、近年、T−CARと呼ばれる、グラフトによってキメラ抗原受容体(CAR)によりT細胞を遺伝子改変することにより、がん細胞抗原に対する免疫系の寛容に対抗しようと試みた(Jena Bら、Redirecting T−cell specificity by introducing a tumor specific chimeric antigen receptor、Blood 116巻:1035〜44頁(2010年))。CARは、通常、単鎖抗体(scFv)を、細胞内シグナル伝達ドメイン、通常、TCR/CD3複合体のゼータ鎖へと連結することにより作製される。CARの最新の構築は、エフェクター細胞生存および増殖を改善し得る、CD28または41BB等、共起刺激分子も含有する(Carpenito Cら、Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106巻:3360〜5頁(2009年))。がん療法のため、T−CARは、天然のT細胞受容体に優る少なくとも3種の主な利点を有する。第一に、scFvの抗原結合親和性は、典型的に、大部分のTCRの結合部分よりもはるかに高い。高い親和性の結合は、効率的T細胞活性化に望まれる。第二に、scFv媒介性抗原結合の性質により、T−CAR認識は、非MHC拘束性であり、抗原プロセシングとは無関係である。このことは、異なるMHCハプロタイプを有する患者へのT−CARの使用を広げる。第三に、T−CAR認識は、非MHC拘束性であるため、がん細胞を標的化するその能力は、MHCを下方調節するがん細胞の能力(腫瘍細胞が、がん免疫療法を逃れる重要な機構)によって妨害されない。
CARは、様々な腫瘍関連抗原に結合するscFvにより以前に構築されている(Davies DMら、Adoptive T−cell immunotherapy of cancer using chimeric antigen receptor−grafted T cells、Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz)58巻:165〜78頁(2010年))。励みとなる前臨床データは、メラノーマ、リンパ腫、神経芽細胞腫および結腸直腸がんを含む、異なる組織起源を有する腫瘍の処置のために、これらのCARを移植したT細胞の養子移入を使用した一連の臨床治験を促した(Davies DMら、Adoptive T−cell immunotherapy of cancer using chimeric antigen receptor−grafted T cells、Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz)58巻:165〜78頁(2010年);Robbins PFら、Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY−ESO−1、J. Clin. Oncol.29巻:917〜24頁(2011年);Kochenderfer JNら、Eradication of B−lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19、Blood 116巻:4099〜102頁(2010年);Porter DLら、Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.、N. Engl. J. Med.365巻:725〜33頁(2011年);Pule MAら、Virus−specific T cells engineered to coexpress tumor−specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma、Nat. Med.14巻:1264〜70頁(2008年);Parkhurst MRら、T cells targeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastatic colorectal cancer but induce severe transient colitis.、Mol. Ther.19巻:620〜6頁(2011年))。これらの治験の多くは、有望な結果、さらには場合によっては、確立された腫瘍の完全寛解を示した。
ネイティブTエフェクター細胞を上回るT−CARの目覚ましい改善にもかかわらず、顕著な欠点が存在する。例えば、T−CARは、腫瘍部位へと能動的に遊走せず、腫瘍組織へと血管外遊出するための能動機構を欠く。細胞遊走問題を回避するために開発された戦略の1つは、腫瘍関連ケモカイン環境に応答し得るケモカイン受容体を発現するようT細胞を操作することを含んだ(Jena Bら、Redirecting T−cell specificity by introducing a tumor specific chimeric antigen receptor、Blood 116巻:1035〜44頁(2010年);Di Stasi Aら、T lymphocytes coexpressing CCR4 and a chimeric antigen receptor targeting CD30 have improved homing and antitumor activity in a Hodgkin tumor model、Blood 113巻:6392〜402頁(2009年))。しかし、この戦略は、腫瘍へと遊走するエフェクター細胞の能力を改善したが、腫瘍組織に血管外遊出するその能力の促進には殆ど効果がなかった。
改善を必要とする別の治療様式は、ナノ粒子媒介性薬物送達である。ここ数年、ナノ粒子は、化学療法薬のための有望な送達ビヒクルとして広範に探索されてきた。ナノ粒子は、多くの小分子薬物の不十分な生物製剤特性を打ち消し、その薬物動態を変更する潜在力を有する。しかし、その驚異的な見込みにもかかわらず、ナノ粒子媒介性抗腫瘍性薬物送達は、期待したほど最適ではなかった。悪性組織へのナノ粒子の優先的体内分布および保持は、血管透過性・滞留性亢進(EPR)効果と命名された特色である、固形腫瘍内における不十分に組織化された、多くの場合漏出性の血管と、リンパ管の欠如に頼る(Greish K、Enhanced permeability and retention (EPR) effect for anticancer nanomedicine drug targeting、Methods Mol. Biol.624巻:25〜37頁(2010年))。しかし、固形腫瘍へのナノ粒子送達を容易にするEPRの能力は、依然として議論の余地がある。腫瘍組織へのナノ粒子の分布を容易にすることができる明確に定義された機構は、臨床適用におけるその有用性を大幅に改善するであろう。
Van der Merwe PAら、Annu. Rev. Immunol.(2003年)21巻:659〜84頁
Kammertoens Tら、Eur. J. Immunol.(2009年)39巻:2345〜53頁
よって、本技術分野において、修飾されたT細胞が、全身性投与後に腫瘍細胞にアクセスできるように、血管壁の障壁を克服することができる修飾されたT細胞の必要がある。本技術分野において、腫瘍血管の透過性を増加させて、腫瘍組織へのナノ粒子の優先的沈着を可能にするための方法および組成物の必要もある。
実施形態において、T細胞は、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むキメラ抗原受容体を移植することができる。別の実施形態において、標的化部分は、エキスタチンポリペプチドとなり得る。さらに別の実施形態において、標的化部分は、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することができる。
一実施形態において、キメラ抗原受容体を形質導入したT細胞を宿主に投与して、がん細胞を死滅させることができる。キメラ抗原受容体は、エキスタチンポリペプチドを含むがこれに限定されない、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含むことができる。一実施形態において、標的化部分は、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有するように修飾することができる。
前述の概要および次の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解できるであろう。単なる図解目的のために、ある特定の実施形態が図面に示されている。しかし、本明細書に開示されている発明概念が、図面に示されている正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
少なくとも一実施形態を詳細に説明する前に、本明細書に示されている発明概念が、その適用において、次の記述に示されているまたは図面に図解されている構築の詳細または構成成分の配置に限定されないことを理解されたい。本明細書に用いられている表現および用語法が、単なる説明目的のものであり、限定的に考慮するべきではないことも理解されたい。
記載されている特色のうちいずれか1種を別々に、または他の特色と組み合わせて使用することができることをさらに理解されたい。他の考案されたシステム、方法、特色および利点は、本明細書における図面および詳細な説明を検討することによって、当業者に明らかである、または明らかとなろう。このような追加的なシステム、方法、特色および利点は全て、添付の特許請求の範囲によって保護されることが企図される。
本願に引用されている全ての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
ほぼ全てのキメラ抗原受容体(CAR)は、腫瘍細胞の表面に発現される腫瘍関連抗原に結合するよう構築される。実施形態において、代替案は、腫瘍関連新生血管構造(neovasculature)を標的化するCARを作製することである。このアプローチは、他のT−CARに伴う非効率的な腫瘍実質浸透問題を克服する。例えば、一実施形態において、CARは、標的化部分としてエキスタチンを含む(以後「eCAR」)。別の実施形態において、CARは、エキスタチン由来のペプチド配列を、T細胞のゼータ鎖に連結することにより構築することができる。エキスタチンは、Echis carinatus毒液に見出すことができる49アミノ酸ディスインテグリンである(配列番号001)。これは、腫瘍新生血管構造の内皮細胞の表面に豊富に発現されるαvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する(Kumar CCら、Biochemical characterization of the binding of echistatin to integrin alphavbeta3 receptor、J. Pharmacol. Exp. Ther.283巻:843〜53頁(1997年);Cai Wら、Chen X.、Anti−angiogenic cancer therapy based on integrin alphavbeta3 antagonism、Anticancer Agents Med. Chem.6巻:407〜28頁(2006年))。
別の実施形態において、選択されたエキスタチンは、α5β1へのその結合を低下するために、28番目のアミノ酸のメチオニンがロイシンに置き換えられた、修飾されたDNA配列を含む(配列番号002)(Wierzbicka−Patynowski Iら、Structural requirements of echistatin for the recognition of alpha(v)beta(3) and alpha(5)beta(1) integrins、J. Biol. Chem.274巻:37809〜14頁(1999年))。αvβ3とは異なり、α5β1は一般的に、多くの健康な組織において発現されるため、α5β1へのエキスタチン結合を回避することが重要である。
別の実施形態において、T細胞にeCARを移植する(T−eCAR)。In vitroにおいて、T−eCARは、αvβ3インテグリンを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞および腫瘍細胞を効率的に溶解することができる。さらに別の実施形態において、腫瘍組織に明らかな出血があり、正常組織血管への損傷の証拠がないことによって判断される通り、全身性T−eCAR投与は、腫瘍血管の大規模破壊をもたらし得る。また別の実施形態において、腫瘍血管のT−eCARによる破壊は、確立された巨大腫瘍の成長を有意に阻害することができる。
実施形態において、戦略的に設計された時間的順序でナノ粒子と同時送達されたT−eCARは、腫瘍細胞におけるナノ粒子沈着を劇的に増加させることができる。別の実施形態において、T−eCARは、ナノキャリアと同時送達して、抗腫瘍性薬物を腫瘍組織に選択的に送達するその能力を増加させることができる。
腫瘍新生血管構造を標的化するためのCAR
実施形態において、CARは、腫瘍新生血管構造を標的化するよう構築される。例えば、一実施形態において、エキスタチン配列は、T細胞のゼータ鎖に連結することができる(T−eCAR)。別の実施形態において、エキスタチンは、28番目のアミノ酸のメチオニンをロイシンに置換することにより修飾することができる。この修飾は、T−eCARが健康な組織を破壊することを実質的に防止することができる。例えば、野生型エキスタチンは、インテグリンファミリーの3種のメンバー、αvβ3、α5β1およびαIIbβ3に対し強い結合親和性を有する。αvβ3およびαIIbβ3の両方は、狭い分布を有する。例えば、αvβ3は主に、活性化された内皮細胞の表面に発現される一方、αIIbβ3は、血小板によって発現される。しかし、α5β1は、より広く分布する(Cox Dら、Integrins as therapeutic targets: lessons and opportunities、Nat. Rev. Drug Discov.9巻:804〜20頁(2010年))。修飾されたエキスタチンにおけるロイシンによるメチオニンの置き換えは、α5β1に対するエキスタチンの結合親和性を減少させる(Wierzbicka−Patynowski Iら、Structural requirements of echistatin for the recognition of alpha(v)beta(3) and alpha(5)beta(1) integrins、J. Biol. Chem.274巻:37809〜14頁(1999年))。さらに、この修飾は、αvβ3またはαIIbβ3に対するT−eCAR結合親和性に有意な影響を与えない。
実施形態において、CARは、腫瘍新生血管構造を標的化するよう構築される。例えば、一実施形態において、エキスタチン配列は、T細胞のゼータ鎖に連結することができる(T−eCAR)。別の実施形態において、エキスタチンは、28番目のアミノ酸のメチオニンをロイシンに置換することにより修飾することができる。この修飾は、T−eCARが健康な組織を破壊することを実質的に防止することができる。例えば、野生型エキスタチンは、インテグリンファミリーの3種のメンバー、αvβ3、α5β1およびαIIbβ3に対し強い結合親和性を有する。αvβ3およびαIIbβ3の両方は、狭い分布を有する。例えば、αvβ3は主に、活性化された内皮細胞の表面に発現される一方、αIIbβ3は、血小板によって発現される。しかし、α5β1は、より広く分布する(Cox Dら、Integrins as therapeutic targets: lessons and opportunities、Nat. Rev. Drug Discov.9巻:804〜20頁(2010年))。修飾されたエキスタチンにおけるロイシンによるメチオニンの置き換えは、α5β1に対するエキスタチンの結合親和性を減少させる(Wierzbicka−Patynowski Iら、Structural requirements of echistatin for the recognition of alpha(v)beta(3) and alpha(5)beta(1) integrins、J. Biol. Chem.274巻:37809〜14頁(1999年))。さらに、この修飾は、αvβ3またはαIIbβ3に対するT−eCAR結合親和性に有意な影響を与えない。
図1Aは、単なる一例として、eCARの構築(配列番号003)の実施形態を図解する。レトロウイルスベクターの5’および3’末端反復配列が標識されている。エキスタチン、CD28(膜貫通ドメインを含有)およびゼータ鎖のコード配列も標識されている。エキスタチンのDNA配列(Echi)は、エキスタチンの修飾型をコードし得る。例えば、28番目のアミノ酸のメチオニンをロイシンに置き換えて、非αvβ3インテグリンに対するその結合親和性を低下させることができる(Wierzbicka−Patynowski Iら、Structural requirements of echistatin for the recognition of alpha(v)beta(3) and alpha(5)beta(1) integrins、J. Biol. Chem.274巻:37809〜14頁(1999年))。配列を合成し、T細胞の安定的トランスフェクションのためにレトロウイルスベクターに挿入することもできる。シグナルペプチド(SP)は、融合遺伝子の5’端に付加することができる。CD28ドメインは、共起刺激(co−simulation)機能の目的で、エキスタチンおよびゼータ鎖の間に挿入することができる。c−Mycタグは、エキスタチンおよびCD28の間に挿入して、eCAR発現の検出を容易にすることができる。一実施形態において、c−Mycタグは、ベクター構築の際に挿入される。
実施形態において、eCARの形質導入効率を測定することができる。脾細胞は、eCARまたはGFP含有レトロウイルス(SFG−GFP)のいずれかを形質導入することができる。実施形態において、脾細胞は、GFPマーカー遺伝子を含むことにより構築することができる。模擬(mock)形質導入細胞は、陰性対照として含まれてよい。細胞は、GFPおよびeCARの両方を検出するための二色フローサイトメトリーによって解析される前に、PE結合体化抗c−Myc抗体で染色することができる。単なる一例として図1Bを参照すると、eCAR形質導入脾細胞のほぼ半分が、PE陽性である一方、SFG−GFP形質導入細胞も対照細胞も、いかなる有意なPE染色も示さなかった。他方では、高いパーセンテージのSFG−GFP形質導入細胞が、GFP陽性である一方、eCAR形質導入細胞も対照細胞も検出不能であった。結果として、一実施形態において、脾細胞は、レトロウイルス構築物によりeCARを効率的に移植することができる。
eCARを移植したT細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を選択的かつ効率的に死滅させることができる
一実施形態において、eCARの有効性を決定するために、これを、αvβ3インテグリンを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と共インキュベートすることができる。図2Aに示す通り、HUVECは、同様にαvβ3インテグリンに対する高い結合親和性を有するFITC結合体化RGDペプチドで染色することができる。フローサイトメトリー解析は、αvβ3インテグリンが、大部分のHUVECにおいて高度に発現されることを示す。別の実施形態において、図2Bに図解される通り、活性T−eCARおよび対照SFG−GFP構築物を、異なる比でHUVECと24時間の期間混合して、αvβ3インテグリンを発現する標的細胞を死滅させるT−eCARの能力を検査することができる。脾細胞は、C57BL/6ドナーから得ることができ、T−eCARまたは対照SFG−GFP構築物のいずれかを含むレトロウイルスを形質導入することができる。次に、T細胞は、洗浄することにより除去することができ、残る単層は、クリスタルバイオレットで染色して、HUVECの細胞生存率を決定することができる。対照ウェルは、HUVAC単独を表すことができる。一実施形態において、SFG−GFPを移植した脾細胞は、HUVECにおけるいかなる有意な毒性も示さない。さらに別の実施形態において、T−eCARは、最も低いエフェクター対標的比を有するウェル内であっても、あらゆる細胞を完全に溶解することができる。
一実施形態において、eCARの有効性を決定するために、これを、αvβ3インテグリンを発現するヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と共インキュベートすることができる。図2Aに示す通り、HUVECは、同様にαvβ3インテグリンに対する高い結合親和性を有するFITC結合体化RGDペプチドで染色することができる。フローサイトメトリー解析は、αvβ3インテグリンが、大部分のHUVECにおいて高度に発現されることを示す。別の実施形態において、図2Bに図解される通り、活性T−eCARおよび対照SFG−GFP構築物を、異なる比でHUVECと24時間の期間混合して、αvβ3インテグリンを発現する標的細胞を死滅させるT−eCARの能力を検査することができる。脾細胞は、C57BL/6ドナーから得ることができ、T−eCARまたは対照SFG−GFP構築物のいずれかを含むレトロウイルスを形質導入することができる。次に、T細胞は、洗浄することにより除去することができ、残る単層は、クリスタルバイオレットで染色して、HUVECの細胞生存率を決定することができる。対照ウェルは、HUVAC単独を表すことができる。一実施形態において、SFG−GFPを移植した脾細胞は、HUVECにおけるいかなる有意な毒性も示さない。さらに別の実施形態において、T−eCARは、最も低いエフェクター対標的比を有するウェル内であっても、あらゆる細胞を完全に溶解することができる。
さらに別の実施形態において、図2C〜図2Dに図解される通り、HUVECのT−eCAR媒介性死滅の際に放出されるサイトカインを測定することができる。結果は、Her2発現腫瘍細胞のHer2−CAR媒介性死滅と比較することもできる。実施形態において、2種の免疫活性シグナル伝達分子である、IL−2およびインターフェロン−γ(IFN−γ)の両方は、これら2種のCARによって媒介される細胞溶解の際に、殆ど等価なレベルで放出される。これは、2種のCARが、同じ死滅機構を共有することを示す。さらに、以前の研究は、抗原特異的TCRを移植されたCD4およびCD8 T細胞の両方が、エフェクター細胞として作用して、腫瘍細胞を効率的に死滅させ得ることを示した(Frankel TLら、Both CD4 and CD8 T cells mediate equally effective in vivo tumor treatment when engineered with a highly avid TCR targeting tyrosinase、J. Immunol.184巻:5988〜98頁(2010年);Kerkar SPら、Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies、J. Immunother.34巻:343〜52頁(2011年))。したがって、別の実施形態において、eCARを移植したCD4およびCD8 T細胞は、エフェクター細胞として作用して、標的細胞を効率的に死滅させ得る。
活性化された内皮細胞に加えて、腫瘍転移に関連することが見出された一部の腫瘍細胞は、上昇したレベルのαvβ3インテグリンを発現することも報告された(Hieken TJら、Beta3 integrin expression in melanoma predicts subsequent metastasis.、J. Surg. Res.63巻:169〜73頁(1996年);Duan Xら、Association of alphavbeta3 integrin expression with the metastatic potential and migratory and chemotactic ability of human osteosarcoma cells、Clin. Exp. Metastasis 21巻:747〜53頁(2004年))。より高レベルのαvβ3インテグリン発現を有する腫瘍細胞株の1つは、B16マウスメラノーマ細胞株である(Gong Wら、IFN−gamma withdrawal after immunotherapy potentiates B16 melanoma invasion and metastasis by intensifying tumor integrin alphavbeta3 signaling、Int. J. Cancer 123巻:702〜8頁(2008年))。一実施形態において、図3Aに図解される通り、B16−F0(B16−GFplucの親株)におけるαvβ3インテグリンの発現は、FITC結合体化RGDペプチドで細胞を染色した後に、フローサイトメトリーにより決定することができる。実施形態において、高パーセンテージのB16−F0が、αvβ3インテグリンを発現する。
さらに別の実施形態において、図3B〜図3Cに図解される通り、GFPおよびルシフェラーゼを含有する融合遺伝子を安定的に形質導入したB16細胞株(B16 GFPluc)を死滅させるT−eCARの能力を解析することができる。例えば、細胞溶解性死滅効果は、GFPの直接的な可視化により簡便に評価することができる(図3B)。eCARまたは対照SFG−GFP構築物のいずれかを含有するレトロウイルスを形質導入した脾細胞は、B16−GFplucと10:1、5:1および2.5:1比で混合することができる。細胞は、解析前に48時間培養することができる。実施形態において、蛍光顕微鏡検査による可視化は、T−eCARとB16−GFPluc細胞とのインキュベーション(E:T比=5:1)が、ウェル内のGFP陽性細胞の数を有意に低下させることを示す。さらに別の実施形態において、蛍光顕微鏡検査による可視化は、対照SFG−GFP構築物を形質導入した脾細胞が、細胞単層の完全性に対して影響を殆ど示さないまたは全く示さないことを示す。
また別の実施形態において、細胞溶解性死滅効果は、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、細胞溶解の非放射性定量的アッセイにより簡便に評価することができる(図3C)(Fu Xら、A simple and sensitive method for measuring tumor−specific T cell cytotoxicity.、PLoS One 2010年;5巻:e11867頁(2010年))。eCARまたは対照SFG−GFP構築物のいずれかを含有するレトロウイルスを形質導入した脾細胞は、B16−GFplucと10:1、5:1および2.5:1比で混合することができる。対照ウェルは、腫瘍細胞のみを含有することができる。細胞死滅のパーセンテージは、次式により計算することができる:細胞死滅(%)=[1−(エフェクター細胞を含有するウェルの読み取り値)/(エフェクター細胞を含有しないウェルの読み取り値)]×100。SFG−GFP形質導入エフェクター細胞と比較して*p<0.05。細胞は、解析前に48時間培養することができる。実施形態において、ルシフェラーゼ活性の定量的測定は、T−eCARが、最低E:T比(2.5:1)であってもB16−GFPluc細胞の少なくとも60%を死滅させ得ることを示す。別の実施形態において、ルシフェラーゼ(luceriferase)活性の定量的測定は、SFG−GFP構築物のみを移植したT細胞が、最高E:T比(10:1)でB16細胞の僅かな溶解を引き起こすことを示す。
実施形態において、腫瘍細胞が、上昇したレベルのαvβ3インテグリンを発現する場合、T−eCARは、腫瘍新生血管構造と腫瘍実質を同時に破壊する能力を有する。本明細書に記載されている方法は、αvβ3を発現するいかなる固形腫瘍にも適用可能である。
T−eCARのin vivo投与は、腫瘍における大規模出血を誘導するが、正常組織においては誘導しない
図4Aは、単なる一例として、T−eCARが腫瘍血管においてin vivoで有し得る効果を実証する。一実施形態において、同系のC57BL/6マウスの右側腹部における腫瘍量は、2×105個の新鮮に収集されたB16細胞の皮下植え込みにより確立することができる。腫瘍が、およそ8mmの直径に達したら、マウスに、eCARまたはSFG−GFPのいずれかを形質導入した5×106個の脾細胞の注射(全身性注入)を、尾静脈を介して与えることができる。別の群のマウスに、陰性対照としてPBSのみを与えることができる。次に、養子細胞移入後3日目にマウスを安楽死させることができる。実施形態において、腫瘍および正常臓器組織は、組織学的検査およびH&E染色のために、パラフィン包埋後の組織切片の調製のために採取することができる。一実施形態において、T−eCARで処置した腫瘍において大規模出血が存在する(図4A)。腫瘍実質は、赤血球細胞および他の血液細胞成分で満たされ得る。別の実施形態において、SFG−GFP形質導入脾細胞で処置した腫瘍は、非常に僅かな出血かを示すか出血を示さない。eCARおよびSFG−GFP構築物の間の唯一の差は、後者が、エキスタチンコード配列をGFP遺伝子に置き換えたことである。よって、一実施形態において、T−eCAR投与後の腫瘍血管破壊は主に、eCARにおける取り込まれたエキスタチン配列によるものである。さらに別の実施形態において、T−eCAR投与後の腫瘍血管破壊は主に、新生血管構造関連のαvβ3インテグリンに結合して、T細胞媒介性死滅効果を誘発するT−eCARの能力によるものである。
図4Aは、単なる一例として、T−eCARが腫瘍血管においてin vivoで有し得る効果を実証する。一実施形態において、同系のC57BL/6マウスの右側腹部における腫瘍量は、2×105個の新鮮に収集されたB16細胞の皮下植え込みにより確立することができる。腫瘍が、およそ8mmの直径に達したら、マウスに、eCARまたはSFG−GFPのいずれかを形質導入した5×106個の脾細胞の注射(全身性注入)を、尾静脈を介して与えることができる。別の群のマウスに、陰性対照としてPBSのみを与えることができる。次に、養子細胞移入後3日目にマウスを安楽死させることができる。実施形態において、腫瘍および正常臓器組織は、組織学的検査およびH&E染色のために、パラフィン包埋後の組織切片の調製のために採取することができる。一実施形態において、T−eCARで処置した腫瘍において大規模出血が存在する(図4A)。腫瘍実質は、赤血球細胞および他の血液細胞成分で満たされ得る。別の実施形態において、SFG−GFP形質導入脾細胞で処置した腫瘍は、非常に僅かな出血かを示すか出血を示さない。eCARおよびSFG−GFP構築物の間の唯一の差は、後者が、エキスタチンコード配列をGFP遺伝子に置き換えたことである。よって、一実施形態において、T−eCAR投与後の腫瘍血管破壊は主に、eCARにおける取り込まれたエキスタチン配列によるものである。さらに別の実施形態において、T−eCAR投与後の腫瘍血管破壊は主に、新生血管構造関連のαvβ3インテグリンに結合して、T細胞媒介性死滅効果を誘発するT−eCARの能力によるものである。
実施形態において、肺、肝臓および腎臓由来のものを含む正常臓器組織は、T−eCAR投与後にいかなる有意な出血も現れない(図4B)。別の実施形態において、T−eCAR処置腫瘍における出血は、導入されたT細胞による腫瘍血管の選択的破壊に由来する。
T−eCARの養子移入は、確立された固形腫瘍の成長を有意に阻害する
一実施形態において、T−eCARによる腫瘍血管破壊の結果を決定するために、in vivo実験は、C57BL/6マウス(B16細胞のため)およびSCIDマウス(PC−3細胞のため)の右側腹部に、1×105個のB16腫瘍細胞(同系マウスメラノーマ)またはPC−3ヒト前立腺がん細胞(異種移植腫瘍)を最初に皮下植え込みすることにより行うことができる。5日後、腫瘍が触知できるようになったときに、マウスに、PBS、またはeCARもしくはSFG−GFPのいずれかを形質導入した4×106個の脾細胞の静脈内全身性注入を与えることができる。第3の群におけるマウスに、PBSのみを与えることができる。腫瘍を毎週測定して、腫瘍体積を決定することができる。SFG−GFPおよびPBSと比較して*p<0.05、+p<0.01。
一実施形態において、T−eCARによる腫瘍血管破壊の結果を決定するために、in vivo実験は、C57BL/6マウス(B16細胞のため)およびSCIDマウス(PC−3細胞のため)の右側腹部に、1×105個のB16腫瘍細胞(同系マウスメラノーマ)またはPC−3ヒト前立腺がん細胞(異種移植腫瘍)を最初に皮下植え込みすることにより行うことができる。5日後、腫瘍が触知できるようになったときに、マウスに、PBS、またはeCARもしくはSFG−GFPのいずれかを形質導入した4×106個の脾細胞の静脈内全身性注入を与えることができる。第3の群におけるマウスに、PBSのみを与えることができる。腫瘍を毎週測定して、腫瘍体積を決定することができる。SFG−GFPおよびPBSと比較して*p<0.05、+p<0.01。
実施形態において、図5Aに図解されている通り、PBS、またはSGF−GFPを形質導入した脾細胞で処置したマウスにおける腫瘍成長は、本質的に停止されていない可能性がある。B16メラノーマの処置開始後28日目までに、両群における腫瘍が、大きいサイズに達する場合があり、動物は、予め設定されたエンドポイントに達することにより安楽死される必要がある可能性がある。対照的に、別の実施形態において、T−eCARの投与は、腫瘍成長を有効に減速することができる。処置開始後42日目までに、T−eCAR処置群における腫瘍は、相対的に小さい可能性があり、大部分の動物は生き続けることができる。図5Bにおける別の実施形態において、T−eCAR処置は、処置後11および14日目に有意により小さいサイズの腫瘍をもたらした。よって、両方の実施形態において、T−eCAR媒介性の腫瘍血管破壊は、異なる組織起源の確立された固形腫瘍に対する有意な治療利益をもたらし得る。
図5Aの実施形態において、養子移入されたT−eCARは、腫瘍血管および腫瘍細胞の両方を攻撃し得る。したがって、初期腫瘍血管破壊は、腫瘍細胞と近接して接触した腫瘍実質へのT−eCARの効率的浸潤を可能にし得る。これは、T−eCARが他の仕方では保有することができない特徴である、活性血管外遊出の必要を回避し得る。したがって、また別の実施形態において、腫瘍細胞を直接的に死滅させるための血管破壊およびその後のT−eCAR浸潤の組合せは、どちらかの作用単独よりも優れた治療効果のために協同し得る。
実施形態において、T−eCARの効果は、これを、T−eCAR投与後の新たな腫瘍血管形成を防止し得る、アンジオポエチン2、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、アバスチン、アフリベルセプト(aflibercept)、ソラフェニブ(sorafenib)、スニチニブ(sunitinib)、パゾパニブ(pazopanib)、バンデタニブ(vandetanib)、バタラニブ(vatalanib)、セジラニブ(cediranib)、アキシチニブ(axitinib)等の抗血管新生剤と組み合わせることにより最大化される。別の実施形態において、T−eCAR媒介性腫瘍血管破壊は、腫瘍血管形成の相対的に遅い過程を、抗血管新生化合物に対する治療応答を最大化し得る急性事象へと変換し得るため、このような組合せは、相乗効果を生じ得る。
T−eCARによる腫瘍血管破壊は、ナノ粒子腫瘍浸透を増大し得る
別の実施形態において、図4Aに図解されている通り、T−eCARの注入後に、悪性組織において有意な出血が観察され得る。これは、T−eCARが、その全身性投与後に腫瘍へのナノ粒子送達を増強する手段として使用され得ることを示す。よって、実施形態において、T−eCARをナノ粒子と並行して投与して、腫瘍のナノ粒子透過性を増大させることができる。全ての腫瘍血管は、実質的に高レベルのαvβ3インテグリンを含有し、したがって、T−eCARの効果に対し感受性があるため、これらの方法は、全ての腫瘍血管に適用可能である。
別の実施形態において、図4Aに図解されている通り、T−eCARの注入後に、悪性組織において有意な出血が観察され得る。これは、T−eCARが、その全身性投与後に腫瘍へのナノ粒子送達を増強する手段として使用され得ることを示す。よって、実施形態において、T−eCARをナノ粒子と並行して投与して、腫瘍のナノ粒子透過性を増大させることができる。全ての腫瘍血管は、実質的に高レベルのαvβ3インテグリンを含有し、したがって、T−eCARの効果に対し感受性があるため、これらの方法は、全ての腫瘍血管に適用可能である。
さらに別の実施形態において、T−eCAR、またはSFG−GFP対照構築物を形質導入したT細胞を、マウスに投与することができる(図4A〜図4B)。例えば、実施形態において、マウスメラノーマは、C57BL/6マウスの右側腹部に確立することができる。腫瘍が、およそ8mmの直径に達したら、マウスに、4×106個のT−eCARまたはSFG−GFP形質導入脾細胞の静脈内注入を与えることができる。48時間後に、10mg/kgのローダミン標識リポソームナノ粒子を、マウスに静脈内投与することができる。次に、リポソームナノ粒子投与の1〜2日後に動物を安楽死させることができる。実施形態において、腫瘍および主要臓器を採取して、図6Aに図解されている凍結蛍光顕微鏡検査に使用することができる冷凍切片を調製することができる。一実施形態において、SFG−GFP形質導入T細胞を与えたマウスから調製された組織切片にわたり、ローダミン染色は、低密度にしか見ることができない。対照的に、別の実施形態において、T−eCARを与えたマウスの腫瘍実質全体にわたり、広汎なローダミン染色を見ることができる。目に見える血管は、破壊された区域(白い矢印で示す)を有するものと思われる。さらに別の実施形態において、図6Bに図解されている通り、腫瘍組織におけるローダミンの定量化は、SFG−GFPおよびT−eCAR処置の間に有意差が存在し得ることを確認する。腫瘍組織は、MicroSuite(商標)FIVEソフトウェアを使用して定量化することができる。強度の値としてソフトウェアによってもたらされる結果は、各腫瘍試料から1枚得た3枚のスライドにわたる15個のランダムに選ばれた区域の平均値を表す。*p<0.01、SFG−GFPと比較。
正常臓器の組織切片の検査は、血管がローダミンでやや染色されたようにみえ得る肺を除いて、ローダミン沈着の証拠を殆ど明らかにしなかった。この観察は、リポソームナノ粒子が、全身性送達後に肺に捕捉される傾向を有するという初期の報告と一貫する(Liu Yら、Factors influencing the efficiency of cationic liposome−mediated intravenous gene delivery、Nat. Biotechnol.15巻:167〜73頁(1997年))。肺におけるこの機械的な捕捉にもかかわらず、肺におけるナノ粒子の実質分布の証拠は殆どない。この事実は、肺(および他の正常臓器組織)においていかなる有意な出血も検出できないこと(図4B)と組み合わせて、この仮定を支持する。これらの結果は合わせて、1)腫瘍組織における透過性および滞留の亢進(EPR)効果の存在の報告にもかかわらず、これが、その全身性送達後に腫瘍間隙へと進入するための効率的なナノ粒子沈着を可能にしないこと、2)T−eCARが、腫瘍新生血管構造に対するその強力な破壊的効果にもかかわらず、正常臓器組織における血管への有意な損傷を引き起こさないこと、3)T−eCARによって媒介される腫瘍血管破壊が、全身性送達されたナノ粒子の、腫瘍実質への深く効率的な進入を可能にすることを示唆する。したがって、実施形態において、T−eCARは、5−フルオロウラシル(5−FU)、6−メルカプトプリン(6−MP)、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン(Ara−C(登録商標))、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ペメトレキセド(アリムタ(登録商標))、ペントスタチン、チオグアニン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、クロラムブシル、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標))、イホスファミド、メルファラン、ストレプトゾシン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン、ブスルファン、ダカルバジン(DTIC)、テモゾロミド(テモダール(Temodar)(登録商標))、チオテパ、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン(oxalaplatin)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標))、エピルビシン、イダルビシン、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、イクサベピロン(イグゼンプラ(登録商標))、ビンブラスチン(ベルバン(Velban)(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))、ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、エストラムスチン(エムシット(Emcyt)(登録商標))等、多くの抗腫瘍性小分子のナノ粒子媒介性薬物送達と組み合わせることができる。
さらに、実施形態において、ローダミン標識ナノ粒子の送達後の主要臓器の検査は、いかなる有意な血管漏出も明らかにしない。この観察は、T−eCAR投与から腫瘍血管に有意な損傷を示す同じ動物において為され得る。これは、肺および他の正常臓器組織においていかなる有意な出血も検出できないことと組み合わせて、T−eCARが、正常組織に対し有意な毒性を持たないことを示唆する。別の実施形態において、正常組織の一部の内皮細胞は、がん血液細胞と同様にαvβ3インテグリンを発現するが、発現のレベルは、T−eCARによって容易に検出可能な閾値を下回る。
さらなる実施形態において、T−eCARは、いずれかの抗血管新生薬(AAD)と同時投与されて、後者の治療効果を増強することができる。抗血管新生薬として、アンジオポエチン2、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、アキシチニブ等を挙げることができるがこれらに限定されない。抗血管新生療法は、血管形成が、固形腫瘍の本質的な症状発現であるという確かな命題に基づく。数種の選択的抗血管新生薬(AAD)がここ数年で開発されてきた。しかし、これまでのところ、これらの化合物の枠組みは、大部分は中程度の効果しか生じておらず、これらの化合物のいずれも、全生存に対していかなる改善も示さない。AADの最適ではない治療成績の主な理由の1つは、腫瘍血管形成が、相対的に遅い過程であるからである。これは、延長された処置を必要とし、その間に腫瘍は、治療に対する抵抗性を発達することが多い。AADとT−eCARの組合せは、この課題を解決することができる。例えば、一実施形態において、T−eCARによる腫瘍血管の初期破壊は、腫瘍血管形成の相対的に遅い過程を急性事象へと変換することができ、これは、抗血管新生療法に対する腫瘍の応答性を増大させるであろう。別の例として、実施形態において、また、図7に図解されている通り、腫瘍を有する動物へのT−eCARの前投与は、AAD(例えば、パゾパニブ)の治療効果を劇的に増強させた。一実施形態において、結腸がんは、CT26腫瘍細胞を植え込むことにより、Balb/cマウスの右側腹部に確立することができる。腫瘍が、ほぼ5mmの直径に達したら、腫瘍は、1)PBS、2)T−eCAR単独、3)AAD単独および4)T−eCARプラスAADで処置することができる。別の実施形態において、最良の治療結果は、T−eCARプラスAADによる腫瘍のコンビナトリアル処置から得ることができ、これは、T−eCAR媒介性腫瘍血管破壊が、AADの治療効果を強めることを示す。あらゆるAADは、血管形成を阻害するため、いずれかのAADの治療効果をT−eCARによって強めて、治療効果を強めることができる。
上述は図解目的であって、制限目的ではないと企図されていることが理解される。材料は、当業者であれば、本明細書に記載されている発明概念を作製および使用できるように提示されており、特定の実施形態の文脈において提供されており、その変種は、当業者であれば容易に明らかとなるであろう(例えば、開示されている実施形態の一部は、互いに組み合わせて使用することができる)。多くの他の実施形態は、上述を見直すことにより、当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と共に、このような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲に関して決定されるべきである。添付の特許請求の範囲において、用語「含む(including)」および「in which」は、それぞれの用語「含む(comprising)」および「wherein」の分かりやすい英語(plain−English)の均等物として使用されている。
細胞株。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびマウスメラノーマ細胞株B16−F0をATCC(Manassas、VA)から得た。HUVECは、20%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するATCC処方ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;カタログ番号30−2002)において培養し、B16−F0細胞は、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリンを含有する10%FBS DMEMにおいて成長させた。B16−GFPluc細胞は、以前に記載された通りに、pIR−eGFP−lucおよびpCMV−piggyBacプラスミドをB16−F0にコトランスフェクトし、続いてフローサイトメトリー選別および単一細胞クローニングを行うことにより、本発明者らの研究室において樹立した(Fu Xら、A simple and sensitive method for measuring tumor−specific T cell cytotoxicity.、PLoS One 2010年;5巻:e11867頁(2010年))。
レトロウイルスベクター構築および産生。レトロウイルスベクターの構築は、図1Aに模式的に提示されている。Leu−28−エキスタチン(MECESGPCCRNCKFLKEGTICKRARGDDLDDYCNG KTCDCPRNPHKGPAT;GenBank:M27213.1)およびMyc−タグ(EQKLISEEDL)のコード配列は、IDT(Integrated DNA Technologies、Coralville、Iowa)により、制限部位XhoIおよびNcoIを含有するように合成した。次に、HER2 ScFvコード配列を置き換えることにより、この構築物をベクターSFG6 FRG5−CD28−ゼータへとクローニングした(Ahmed Nら、Regression of experimental medulloblastoma following transfer of HER2−specific T cells、Cancer Res.67巻:5957〜64頁(2007年))。シグナルペプチド(SP)を融合遺伝子の5’に付加した。その上、c−Mycタグ(c−Myc)をエキスタチンおよびCD28の間に挿入して、eCAR発現の検出を容易にした。構築物をeCARと命名した。SFG−GFPを構築するために、GFP遺伝子マイナス終止コドンを同様にSFG−FRG5−CD28−ゼータに挿入した。ウイルスストックを調製するために、レトロウイルスベクター構築物を、FuGENE(登録商標)6トランスフェクション試薬(Roche Applied Science Indianapolis、IN)を使用して、レトロウイルスパッケージング細胞株Platinum−Eにトランスフェクトした(Morita Sら、Plat−E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.、Gene Ther 7巻:1063〜6頁(2000年))。48および72時間後に上清を収集し、0.45μmフィルターを通して濾過した。精製した上清を組み合わせ、293細胞において力価決定して、ウイルス収量を決定した。
レトロウイルスベクターによるマウス脾細胞の形質導入。C57BL/6マウスから脾細胞を収集し、25mM HEPES、200nM L−グルタミン、10%FBS、1%MEM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、50μM β−メルカプトエタノール、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリンを補充したRPMI1640培地により培養した。懸濁物中の細胞(2×106/ml)をコンカナバリンA(2μg/ml;Sigma、St.Louis、MO)およびマウスIL−2(1ng/ml;ProSpec、East Brunswick、NJ)で24時間刺激し、その後、eCARまたはSFG−GFPレトロウイルスの形質導入のためにRetroNectin(Takara Bio.Inc.、Shiga、Japan)コーティングした非組織培養24ウェルプレートに移した。次に、形質導入した脾細胞を、10ng/mlのマウスIL−2を補充した新鮮培地において48時間培養した。
eCARおよびGFP発現のフローサイトメトリー解析。eCARレトロウイルスを形質導入した脾細胞を、2%ウシ胎仔血清を含有するPBSで1回洗浄し、その後、ラット抗マウスCD16/CD32抗体を含有するMouse BD Fc Block(BD Biosciences、San Jose、CA)と共に30分間4℃でインキュベートした。PBSで2回洗浄した後に、PE結合体化Myc−タグマウス抗体(Cell signaling、Danvers、MA)またはアイソタイプ抗体で、30分間4℃で暗所にて細胞を染色した。解析に使用する前に、細胞を2回洗浄した。全く染色することなく解析するために、SFG−GFP形質導入細胞を直接的に使用した。次に、BD FACSAria(商標)II(BD Biosciences、San Jose、California)において両方の細胞調製物を解析し、>10,000事象に対してデータ解析した。αvβ3インテグリン発現を決定するために、HUVECまたはB16−F0細胞を、100μlの1%FBS−PBS中10μgのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合体化アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)ペプチド(AnaSpec、Fremont、CA)で30分間4℃にて染色した。PBSで3回洗浄した後に、同じBD FACSAria(商標)IIにより細胞を解析した。
レトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性アッセイ。可視化または近年報告された非放射性定量的測定(Fu Xら、A simple and sensitive method for measuring tumor−specific T cell cytotoxicity.、PLoS One 2010年;5巻:e11867頁(2010年))のいずれかにより、標的細胞に対するレトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性をアッセイした。可視化検出のため、5×104個の標的細胞ウェルを48ウェルプレートに最初に播種した。レトロウイルス形質導入脾細胞(エフェクター細胞)を、20:1〜2.5:1に及ぶエフェクター対標的(E:T)比で24時間後に添加した。24または48時間後に細胞を固定し、光学顕微鏡下で可視化および画像化するために、20%エタノール中1%クリスタルバイオレットで染色した。レトロウイルス形質導入脾細胞の細胞毒性の定量的測定のため、1×104個の標的細胞を先ず96ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞を、20:1〜2.5:1に及ぶE:T比で24時間後に添加した。48時間後に培地を除去し、細胞をPBSですすいだ。次に、50μlのBright−Glo(商標)(Luciferase Assay System、Promega、Madison、WI)を各ウェルに添加した。細胞が完全に溶解されるように、プレートを穏やかに2分間振盪した。次に、SpectraMax(登録商標)マルチモードマイクロプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)による発光測定のため、細胞溶解産物を96ウェル不透明プレートに移した。細胞毒性活性を次式により計算した:細胞死滅(%)=[1−(エフェクター細胞を含有するウェルの読み取り値)/(エフェクター細胞を含有しないウェルの読み取り値)]×100。
サイトカイン放出の測定。C57BL/6ドナーから脾細胞を得た。この細胞に、形質導入しなかった(UT)またはSFG−GFP、eCAR(T−eCAR)もしくはHer2CAR(T−Her2CAR)を形質導入した。Her2CAR構築の詳細は、本発明者らの以前の刊行物において報告されている(Fu Xら、A simple and sensitive method for measuring tumor−specific T cell cytotoxicity.、PLoS One 2010年;5巻:e11867頁(2010年))。CAR媒介性細胞溶解におけるサイトカイン放出を測定するために、HUVECまたはHer2発現4T1−Her2を、48ウェルプレートにおいて相当するT−CARと1:5比で混合した。全T−CARは、C57BL/6マウスから得られる脾細胞から調製したため、4T1−Her2標的のための同種異系エフェクターT細胞として提示した。24時間インキュベーション後に培養上清を採取した。IL−2およびIFN−γの含量をELISAにより製造者の説明書に従って決定した(R&D Systems、Minneapolis、MN)。
動物実験。腫瘍を確立するため、1×105個のB16−F0マウスメラノーマ細胞を、6〜8週齢雄免疫応答性C57BL/6マウス(Taconic Farms、Hudson、NY)の右側腹部に植え込んだ。腫瘍が触知できるようになったら(5日目前後)、マウスに、eCARもしくはSFG−GFPレトロウイルス形質導入脾細胞(100μlのRPMI1640に4×106個)またはPBS(1群当たりn=10匹のマウス)のいずれかを静脈内注射した。実験終了まで腫瘍サイズを1週間に2回測定した。腫瘍体積を次式により計算した:腫瘍体積(mm3)=[長さ(mm)]×[幅(mm)]2×0.52。
腫瘍血管に対するレトロウイルストランスフェクト脾細胞の効果を決定するために、相当に大きいB16−F0腫瘍(およそ8mmの直径)を有するマウスに、eCARもしくはSFG−GFPレトロウイルス形質導入脾細胞(100μlのRPMI1640に5×106個)またはPBS(各群n=3匹のマウス)のいずれかを静脈内注射した。マウスを3日後に人道的に屠殺し、その腫瘍を切除した。腫瘍を10%ホルマリンにおいて24時間固定し、次に、さらに24時間70%エタノールに置いた。これに続き、Shandon Excelsior ES組織プロセッサ(商標)(Thermo Scientific、Waltham、MA)において一晩脱水した。連続的5μm厚切片を切断し、キシレンおよび減少するエタノール濃度(100%から50%)において脱水した。次に、顕微鏡下での観察および顕微鏡写真のため、ヘマトキシリンおよびエオシンで切片を染色した。
腫瘍血管破壊後のナノ粒子送達を調べるために、eCARまたはSFG−GFPレトロウイルス形質導入脾細胞を、上述通り、腫瘍を有するマウスに静脈内注射した。48時間後、マウスに、ローダミンDHPE(FormuMax Scientific,Inc.Palo Alto、CA)で標識したDSPC/CHOL/mPEG2000−DSPEリポソームナノ粒子(100μmのサイズ)の静脈内注射を、100μlのPBSに希釈した10mg/kgの用量で与えた。リポソーム注射24時間後にマウスを屠殺し、腫瘍ならびに肺、腎臓および肝臓を含む主要臓器を採取した。採取した腫瘍および臓器を4%パラホルムアルデヒドにおいて4℃で24時間固定し、次に25%スクロースでさらに24時間4℃で処理し、その後、OCTに包埋した。蛍光顕微鏡(Olympus BX51)下での観察および顕微鏡写真のため、連続した5μm厚の凍結切片を調製した。ローダミン像の強度をMicroSuite(商標)FIVEソフトウェアにより定量化した。簡潔に説明すると、各スライドにおいて5個の区域をランダムにクリックして、強度値の読み取り値を得た。合計3枚のスライド(各動物から1枚)を定量化に付して、各処置群の平均値を得た。
統計解析。全定量的データは、平均+/−SDとして報告されている。分散分析およびスチューデントt検定を使用して、多重比較のために統計解析を行った。P値<0.05を統計的に有意であるとみなした。
前述の概要および次の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解できるであろう。単なる図解目的のために、ある特定の実施形態が図面に示されている。しかし、本明細書に開示されている発明概念が、図面に示されている正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
がん細胞を死滅させるための化合物であって、上記化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)を移植したT細胞を含み、上記CARは、α v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、化合物。
(項目2)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目1に記載の化合物。
(項目3)
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記T細胞のゼータ鎖に連結している、項目2に記載の化合物。
(項目4)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目1に記載の化合物。
(項目5)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目4に記載の化合物。
(項目6)
T細胞にキメラ抗原受容体(CAR)を移植するための方法であって、上記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをT細胞に形質導入するステップを含み、上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターは、T細胞のゼータ鎖のコード配列、およびα v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。
(項目7)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目6に記載の方法。
(項目9)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、項目6に記載の方法。
(項目11)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記T細胞のゼータ鎖の上記コード配列および上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にCD28ドメインをさらに含む、項目7に記載の方法。
(項目12)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記CD28ドメインおよび上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にc−Mycタグをさらに含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
宿主におけるがん細胞を死滅させる方法であって、上記方法は、
上記宿主に、キメラ抗原受容体(CAR)を形質導入したT細胞を投与するステップを含み、上記CARは、α v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、方法。
(項目14)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記T細胞のゼータ鎖に連結している、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目13に記載の方法。
(項目17)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目16に記載の方法。
(項目18)
形質導入した上記T細胞が、1種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与される、項目13に記載の方法。
(項目19)
形質導入した上記T細胞が、1種または複数の抗血管新生剤と同時投与される、項目13に記載の方法。
(項目20)
上記抗血管新生剤が、アンジオポエチン2、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも1種を含む、項目13に記載の方法。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
がん細胞を死滅させるための化合物であって、上記化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)を移植したT細胞を含み、上記CARは、α v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、化合物。
(項目2)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目1に記載の化合物。
(項目3)
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記T細胞のゼータ鎖に連結している、項目2に記載の化合物。
(項目4)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目1に記載の化合物。
(項目5)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目4に記載の化合物。
(項目6)
T細胞にキメラ抗原受容体(CAR)を移植するための方法であって、上記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをT細胞に形質導入するステップを含み、上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターは、T細胞のゼータ鎖のコード配列、およびα v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。
(項目7)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目6に記載の方法。
(項目9)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、項目6に記載の方法。
(項目11)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記T細胞のゼータ鎖の上記コード配列および上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にCD28ドメインをさらに含む、項目7に記載の方法。
(項目12)
上記レトロウイルスベクターまたは上記レンチウイルスベクターが、上記CD28ドメインおよび上記エキスタチンポリペプチドの上記コード配列の間にc−Mycタグをさらに含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
宿主におけるがん細胞を死滅させる方法であって、上記方法は、
上記宿主に、キメラ抗原受容体(CAR)を形質導入したT細胞を投与するステップを含み、上記CARは、α v β 3 インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、方法。
(項目14)
上記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、上記T細胞のゼータ鎖に連結している、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記標的化部分が、α 5 β 1 インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、項目13に記載の方法。
(項目17)
上記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、項目16に記載の方法。
(項目18)
形質導入した上記T細胞が、1種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与される、項目13に記載の方法。
(項目19)
形質導入した上記T細胞が、1種または複数の抗血管新生剤と同時投与される、項目13に記載の方法。
(項目20)
上記抗血管新生剤が、アンジオポエチン2、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも1種を含む、項目13に記載の方法。
Claims (20)
- がん細胞を死滅させるための化合物であって、前記化合物は、キメラ抗原受容体(CAR)を移植したT細胞を含み、前記CARは、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、化合物。
- 前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項1に記載の化合物。
- 前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記T細胞のゼータ鎖に連結している、請求項2に記載の化合物。
- 前記標的化部分が、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項1に記載の化合物。
- 前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、請求項4に記載の化合物。
- T細胞にキメラ抗原受容体(CAR)を移植するための方法であって、前記方法は、
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターをT細胞に形質導入するステップを含み、前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターは、T細胞のゼータ鎖のコード配列、およびαvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分のコード配列を含む、方法。 - 前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記標的化部分が、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記T細胞のゼータ鎖の前記コード配列および前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にCD28ドメインをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記レトロウイルスベクターまたは前記レンチウイルスベクターが、前記CD28ドメインおよび前記エキスタチンポリペプチドの前記コード配列の間にc−Mycタグをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 宿主におけるがん細胞を死滅させる方法であって、前記方法は、
前記宿主に、キメラ抗原受容体(CAR)を形質導入したT細胞を投与するステップを含み、前記CARは、αvβ3インテグリンに対し強い結合親和性を有する標的化部分を含む、方法。 - 前記標的化部分が、エキスタチンポリペプチドである、請求項13に記載の方法。
- 前記エキスタチンポリペプチドにおけるペプチド配列が、前記T細胞のゼータ鎖に連結している、請求項14に記載の方法。
- 前記標的化部分が、α5β1インテグリンに対し低下した結合親和性を有する、変異型エキスタチンポリペプチドである、請求項13に記載の方法。
- 前記変異型エキスタチンポリペプチドが、内因性エキスタチンポリペプチドのアミノ酸28にロイシンでの置換を有する、請求項16に記載の方法。
- 形質導入した前記T細胞が、1種または複数の抗腫瘍性小分子と同時投与される、請求項13に記載の方法。
- 形質導入した前記T細胞が、1種または複数の抗血管新生剤と同時投与される、請求項13に記載の方法。
- 前記抗血管新生剤が、アンジオポエチン2、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、アバスチン、アフリベルセプト、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブおよびアキシチニブのうち少なくとも1種を含む、請求項13に記載の方法。
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