CN109952309B - 用于细胞治疗的组成型活性细胞因子受体 - Google Patents

Abstract

本公开内容的实施方案包括用于增强免疫细胞扩增的方法和组合物，所述免疫细胞用于免疫治疗。在具体实施方案中，免疫细胞(例如T细胞)表达组成型活性细胞因子受体，其中跨膜和胞内结构域能够提供分别从任何输入到与它们可操作地连接的相应胞外结构域的活化信号。在具体实施方案中，来自IL‑7Rα的跨膜和胞内结构域与CD34的胞外结构域一起使用。

Description

用于细胞治疗的组成型活性细胞因子受体

本申请要求2016年8月26日提交的美国临时专利申请系列号62/380,021的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域，至少包括癌症医学。

背景

使用抗原特异性T细胞的细胞治疗已经在临床前模型和早期临床试验中显示出前景，但是很少有患有巨大肿块疾病的患者已被治愈。这种功效的缺乏是由于几个因素，包括输注后有限的体内T细胞扩增。在T细胞转移之前用化学治疗和/或放射对患者进行淋巴细胞清除大大增强了体内T细胞扩增，然而这些药剂具有不希望的副作用。需要一种在没有这种有毒药剂的情况下实现T细胞扩增的方法。

本公开内容满足了本领域对提供用于安全地增强体内T细胞扩增的方法和组合物的需要。

简要概述

本公开内容的实施方案涉及用于增强免疫细胞扩增和/或增殖的方法和组合物，包括输注后的体内扩增和/或增殖。在具体情况下，T细胞表达特定的组成型活性细胞因子受体分子以促进T细胞的体内扩增，用作医学病症包括癌症的治疗。在具体实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含至少一个胞内结构域、跨膜结构域和至少一个胞外结构域。

在第一方面，本文提供了工程化的细胞因子受体多肽，其同源二聚化并促进下游信号传导，而无需结合相关的细胞因子。这种工程化细胞因子受体的共同特征是它们被改造成(例如在跨膜结构域中)包含一个或多个突变，其在不存在结合的同源细胞因子的情况下引起或促进同源二聚化并因此进行信号传导。因此，就细胞因子信号传导而言，它们是组成型活性的(即，突变是“功能获得”突变)。

在具体情况下，工程化细胞因子受体多肽具有组成型活性，因为受体的跨膜结构域包含允许受体同源二聚化的一个或多个突变，使得不需要外部信号(例如细胞因子)来活化跨膜结构域和胞内结构域。在至少一些情况下，跨膜结构域中的一个或多个突变赋予跨膜结构域/胞内结构域结构构型，其使分子更靠近其信号起作用所需的靶分子。在具体实例中，跨膜结构域中的突变是或包括在跨膜结构域氨基酸序列中插入至少一个半胱氨酸以允许形成二硫键(从而促进多肽的同源二聚化)和/或包括插入至少一个脯氨酸以诱导构象变化(例如，使分子围绕通过受体分子的轴扭结(kink)或扭转(twist)或旋转(rotate))，这两种突变将在结构上影响分子的性质并因此影响其信号传导。

在具体的实施方案中，跨膜结构域是IL-7细胞因子受体α跨膜结构域，其与相应的野生型IL-7细胞因子受体α跨膜结构域相比包含一个或多个突变。在一个具体实施方案中，当跨膜结构域来自IL-7细胞因子受体α时，突变位于序列LLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQID NO：25)中。在特定方面，突变将至少一个半胱氨酸引入跨膜结构域和/或突变将脯氨酸引入跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域的长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸。

在跨膜结构域的特定实施方案中，结构域是自二聚化的，并且在特定情况下，跨膜结构域是本公开内容的一个或多个细胞因子受体胞内结构域的内源跨膜结构域或其自活化衍生物。与相应的野生型跨膜结构域相比，自活化衍生物可以包含一个或多个突变，并且该一个或多个突变使得该受体能够同源二聚化。在特定情况下，突变使受体能够通过跨膜和胞内结构域组分同源二聚化。在具体的实施方案中，例如，所述一个或多个突变使得跨膜和结构域能够在结构上定向(例如扭转)，使得janus激酶能够磷酸化和活化胞内结构域/多肽。在具体的实施方案中，所述一个或多个突变使得跨膜和胞内结构域能够以螺旋方式在结构上共同扭转。

在某些实施方案中，工程化细胞因子受体多肽包含至少一个胞内结构域、至少一个跨膜结构域和至少一个胞外结构域，并且任选地包含一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中，胞内结构域是野生型，即在细胞因子信号传导方面具有功能活性。在一个具体实施方案中，工程化细胞因子受体多肽包含正常(野生型)胞外结构域；在该实施方案中，在存在或不存在同源细胞因子的情况下，多肽同源二聚化并传递信号。在另一个具体的实施方案中，工程化细胞因子受体多肽包含胞外结构域，其不是这种受体的野生型胞外结构域。在更具体的实施方案中，胞外结构域结合通常对受体所在的细胞有害的配体(例如，通常会下调细胞或引起细胞无能或引起细胞凋亡的配体)。例如，这种非野生型胞外结构域能够为或能够作为例如检查点蛋白的诱饵受体，例如，胞外结构域包含检查点蛋白PD-1的受体。在一些情况下，非野生型胞外结构域是抗体(当与胞外结构域结合时，其靶向包含工程化细胞因子受体多肽的细胞用于进行破坏)的靶标。在另一个具体实施方案中，工程化细胞因子受体多肽缺乏胞外结构域。在某些实施方案中，细胞因子是白细胞介素，例如IL-7、IL-21、IL-23或IL-12。

在本公开内容的具体方面，组成型活性细胞因子受体诱导组成型IL-7受体活性。在某些实施方案中，IL-7Rα的跨膜结构域中的一个或多个突变或改变使得该受体能够以同源二聚化状态诱导信号传导。在一个具体实施方案中，白细胞介素是IL-7。在一个具体实施方案中，工程化细胞因子受体多肽是工程化IL-7受体多肽。

在其他实施方案中，本文提供了编码此类工程化细胞因子受体多肽的多核苷酸，包含此类多核苷酸的细胞，表达此类多肽的细胞，例如另外表达嵌合抗原受体的细胞，以及此类细胞用于治疗疾病例如癌症(例如，血癌或实体瘤)的用途。

在一个实施方案中，存在编码工程化细胞因子受体多肽的多核苷酸，并且所述多肽包含以下可操作地连接的组分：a)一个或多个细胞因子受体胞内结构域；b)跨膜结构域，其包含促进工程化受体同源二聚化的一个或多个突变；和c)任选地或非任选地，一个或多个细胞外结构域，其不是组分a)中相应的一个或多个细胞因子受体胞内结构域的内源细胞外结构域，其中细胞外结构域不是源自细胞因子受体。在某些实施方案中，存在包含这种多核苷酸的一种或多种细胞。

在某些实施方案中，一个或多个细胞因子受体胞内结构域引发细胞中通过STAT5途径或细胞中通过STAT3途径的信号传导。在特定情况下，细胞因子受体胞内结构域来自IL-7受体α、IL-21受体α、CD122、IL-23受体α、IL-12受体α或其组合。

在一个实施方案中，细胞外结构域是球形的。细胞外结构域可以是缺乏信号传递活性的诱饵受体。细胞外结构域可以是细胞毒性抗体的靶标。在特定情况下，细胞外结构域是至少70个氨基酸和/或不超过2000个氨基酸。细胞外结构域的长度可以是70-2000个氨基酸、100-1000个氨基酸、500-2000个氨基酸、50-500个氨基酸、100-750个氨基酸、200-2000个氨基酸或500-2000个氨基酸。在一些情况下，细胞外结构域是CD34的细胞外结构域。在某些实施方案中，细胞外结构域来自CD30、HER2、EGFR、CD19、CD34、TGF-β受体、IL-4受体、IL-13受体α1和α2、IL-8受体、IL-10受体、PD-1、LAG3、TIGIT、CTLA4、FAS、CD19、CD27、CD28、CD52、CD134、CD137、HER2、EGFR、NGFR或其组合。

在特定实施方案中，表达组成型活性细胞因子受体的细胞是免疫细胞。细胞可以是T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβ细胞、γδT细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT T细胞)、先天淋巴细胞、干细胞或祖细胞。在具体的实施方案中，细胞包含赋予细胞抗原特异性的非天然分子。细胞还可包含至少一种另外的工程化受体，例如另一种组成型活性细胞因子受体、嵌合抗原受体、重组T细胞受体、双特异性T细胞衔接器(BiTE或T细胞ENG)、双亲和力重新靶向(DART)蛋白质或其组合。

在与表达组成型活性细胞因子受体的细胞有关的一些实施方案中，细胞含有表达受体多肽的多核苷酸。多核苷酸可进一步定义为表达载体，例如病毒载体或非病毒载体。病毒载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。例如，非病毒载体可以是质粒。

在实施方案中，存在多个本公开内容的细胞，其表达组成型活性细胞因子受体，其中所述细胞包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT T细胞)、先天淋巴细胞、干细胞、祖细胞或免疫效应细胞中的一种或多种的混合物。

在一个实施方案中，存在扩增细胞群的方法，其包括在本公开内容所涵盖的细胞中表达多核苷酸的步骤。细胞可以是体外或体内的，例如在哺乳动物包括人中。在具体的实施方案中，向人提供有效量的细胞外结构域的一种或多种抑制剂，其在结合细胞外结构域后靶向细胞用于进行破坏。抑制剂可以是任何种类的一种或多种抗体。在某些实施方案中，人需要治疗并且向人提供治疗有效量的细胞。在具体方面，人患有癌症、传染病、自身免疫疾病、免疫缺陷，或者是实体器官移植或干细胞移植前或后的。

在某些实施方案中，组成型活性细胞因子受体利用用作库(sink)或配体捕获的胞外结构域，例如通过结合对表达组成型活性细胞因子受体的细胞有害的一种或多种分子。这样的配体可以是免疫抑制性的，例如，因为它通常会活化信号传导途径以关闭T细胞，如免疫抑制一样。在一些这样的情况下，胞外结构域结合有害配体作为诱饵受体，但跨膜/胞内结构域仍然能够独立地产生阳性细胞因子信号。在一些实施方案中，诱饵受体阻止相应的配体抑制T细胞(如在正常情况下将发生的)。例如，诱饵受体的胞外结构域可以结合抑制性细胞因子。诱饵受体可结合的有害配体的实例包括TGF-β、PD-L1、IL-4、IL-13、IL-8和IL-10。在一些实施方案中，诱饵受体胞外结构域是通常由T细胞表达的抑制性受体之一，例如但不限于LAG3、TIGIT、CTLA4、FAS。

前面已经相当充分地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的本发明的详细描述。在下文中将描述本发明的其它特征和优点，其形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这种等同构造不脱离所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述将更好地理解被认为是本发明的特征的新颖特征(关于其组织和操作方法)，以及其他目的和优点。然而，应该清楚地理解，提供每个附图仅仅是为了说明和描述的目的，而不是作为对本发明的限制的定义。

附图的简要说明

为了更完整地理解本发明，现在参考以下结合附图考虑的描述。

图1：正常IL-7细胞因子/受体信号传导的示意图。

图2：IL7RP2受体的信号传导的示意图。

图3：Δ34.IL7RP2蛋白中的信号传导的示意图。

图4A和4B：STAT5在IL7RP2转导的T细胞中是组成型活性的。图4A是来自代表性供体的数据。图4B是三个供体的平均结果。

图5：在抗原特异性刺激后，IL7RP2转导的抗原特异性T细胞具有比未修饰的抗原特异性T细胞更大的增殖潜力。

图6A、6B和6C：共表达Δ34.IL7RP2的GD2.CAR T细胞在体内具有比GD2.CAR T细胞更大的扩增和抗肿瘤功效。GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞在体内显著扩增，并且与GD2.CART细胞相比，在肿瘤部位显示出延长的T细胞持久性(图6A)。LAN-1肿瘤在接受GD2.CAR T细胞的小鼠中增长，而肿瘤在GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞中消除(图6B)。这导致在接受GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞的小鼠中显著增强的存活优势(图6C)。

图7：Δ34.IL7RP2转导的T细胞在没有抗原刺激的情况下具有有限的持久性。

图8：Δ34.IL7RP2延长EphA2.CAR T细胞的细胞毒性能力和扩增。

图9：Δ34.IL7RP2在体内增强EphA2.CAR T细胞的抗胶质瘤活性。

图10A、10B和10C：Δ34.IL7RP2蛋白能够与IL-21Rα胞质结构域融合，以产生组成型活性的组合细胞因子受体。Δ34.IL7RP2-接头-IL21Rα的活化的示意图(图10A)。通过Δ34.IL7RP2和Δ34.IL7RP2-接头-IL21RαT细胞对STAT5的组成型活化(图10B)和仅通过Δ34.IL7RP2-接头-IL21Rα对STAT3的组成型活化(图10C)。

图11：IL7RP2增强NK细胞的抗原介导的增殖。

图12：一个实施方案的举例说明，其中组成型活性细胞因子受体包含两个胞外结构域。

图13：一个实施方案的举例说明，其中组成型活性细胞因子受体利用胞外结构域作为诱饵受体以将有害或潜在有害的配体结合到表达该受体的细胞上。

图14A-14I：来自C7R的组成型信号传导活化T细胞中的STAT5，但不支持自主细胞扩增。(14A)与工程化的C7R同源二聚化受体相比，与包含异二聚化的IL7Rα和γc的天然IL-7受体结合的IL-7的示意图比较。(14B、14C)相对于未转导的(NT)细胞，(14B)CD4和(c)CD8T细胞中Δ34和C7R(代表3)的转导效率。(14D、14E)用Δ34或C7R转导的(14D)CD4和(14E)CD8 T细胞中磷酸化STAT5(pSTAT5)的代表性流式细胞术比较。在分析之前，在没有IL-15和IL-7的情况下培养细胞24-72小时。(14F、14G)当在14D和14E中用多个供体重复实验时的平均pSTAT5 MFI值。(14H、14I)在PBMC活化后9-12天开始，在没有进一步抗原刺激的情况下，在无细胞因子的完全细胞培养基中培养的Δ34或C7R转导的(14H)CD4或(14I)CD8T细胞的定量的体外持久性。使用台盼蓝排除法每周计数活细胞。X轴表示IL-15和IL-7从培养基中取出后的天数。将曲线下面积(AUC)值与双尾t检验进行比较：10.5±0.6616(CD8Δ34)，56.37±7.972(CD8 C7R)，p<0.05；10.22±1.694(CD4Δ34)和31.36±2.590(CD4 C7R)，p<0.05。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(双尾配对t检验，14F-14I)。图14F-14I表示来自不同供体的平均值±SEM(n＝3)。

图15A-15I：C7R在连续肿瘤攻击期间增强GD2-CAR T细胞活性。(15A)通过ELISA测定与LAN-1肿瘤细胞共培养24小时后由GD2-CAR T细胞或GD2-CAR.C7R T细胞分泌的细胞因子。(15B)T细胞杀伤LAN-1肿瘤细胞的4小时基于荧光素酶的细胞毒性测定。(15C)连续共培养示意图。在缺乏IL-15或IL-7的情况下，用1x10⁶ GD2-CAR或GD2-CAR.C7R T细胞与0.5x10⁶LAN-1GFP-FFluc肿瘤细胞一起开始第一次共培养(CC1)7天。对于第二和第三共培养物(CC2和CC3)，从先前的共培养物中收获T细胞，然后以相同的2：1E：T比例在具有新鲜肿瘤细胞的新培养基中重新铺板。(15D)连续共培养期间GD2-CAR或GD2-CAR.C7R T细胞的累积扩增。箭头表示用肿瘤细胞重新刺激T细胞的时间点。(15E)CC3后分别用GD2-CAR T细胞和GD2-CAR.C7R T细胞保留LAN-1肿瘤细胞。(15F、15G)对于增殖分析，在CC1结束时收集的GD2-CAR和GD2-CAR.C7R T细胞用Cell Trace Violet标记，然后在CC2期间再次攻击。(15F)直方图叠加表示来自代表性供体的数据。(15G)用多个供体重复F中的实验，并且从GD2-CAR和GD2-CAR.C7R增殖直方图汇编分裂指数。(15H)对于存活分析，在用LAN-1肿瘤细胞进行2次连续肿瘤攻击后，用膜联蛋白V和7-AAD对GD2-CAR和GD2-CAR.C7R T细胞染色。条形图显示膜联蛋白V阳性、7-AAD阳性、双阳性或双阴性的T细胞的频率。膜联蛋白V(+)7-AAD(-)和膜联蛋白V(-)7-AAD(+)平均比较为n.s.。(15I)CC2结束后，用GD2特异性抗体标记肿瘤，并与CAR T细胞磁性分离。从T细胞中分离总RNA，随后使用Human Immunology Panel Version 2和nCounter Analysis System(Nanostring)进行基因表达分析。展示的热图显示具有log2倍数变化的基因(GD2-CAR.C7R/GD2-CAR)，其P值小于0.02。数据生成自5个供体(10个配对样品)。*P<0.05，**P<0.01，(双尾配对t检验，15A、15B、15D、15E、15G、15H)。图15A、15B、15C、15E、15G、15H表示来自不同供体的平均值±SEM(n＝6，15A、15D、15E；n＝3，15G、15H)。

图16A-16F：C7R增强针对转移性和颅内恶性肿瘤的过继性T细胞免疫治疗。(16A)和(16B)1x10⁶个CHLA-255FFluc细胞静脉内注射入雌性NSG小鼠，7天后静脉内注射1×10⁶个表达无关CAR、GD2-CARΔ.C7R、GD2-CAR或GD2-CAR.C7R的T细胞。(16A)神经母细胞瘤随时间生长的代表性生物发光图像。(16B)CHLA-255FFluc攻击小鼠的Kaplan Meier存活分析。(16C、16D)为了追踪T细胞迁移和持久性，在平行实验中，将1x10⁶个CHLA-255细胞静脉内注射到NSG小鼠中，7天后静脉内注射1x10⁶个共表达GD2-CAR或GD2-CAR.C7R的GFP-FFluc T细胞。(16C)T细胞的顺序生物发光成像(16D)T细胞随时间的定量生物发光信号(16E)将1x10⁵个U373 GFP-FFluc细胞颅内注射到雄性SCID小鼠中。7天后，将1×10⁴个表达EphA2-CARΔ.C7R、EphA2-CAR或EphA2-CAR.C7R的T细胞颅内注射到肿瘤中。随着时间的推移显示来自每个处理组的定量U373 GFP-FFluc生物发光。(16F)用T细胞处理后U373 GFP-FFluc攻击小鼠的Kaplan Meier存活分析。*P<0.05，**P<0.01(Welch t检验，D；配对双尾t检验)。所有组均使用5只小鼠。图D表示来自实验重复的平均值±SEM。在D中描述的实验中，GD2-CAR.C7R组中的一只小鼠在第5天的成像期间由于与肿瘤负荷无关的原因而死亡，因此GD2-CAR.C7R中第9-16天的平均生物发光信号由n＝4计算。

图17A-17D：使用iC9自杀开关能够除去C7R-CAR T细胞。(17A)使用CD19特异性Miltenyi珠选择用GD2-CAR.C7R和iC9-CD19t载体双重转导的T细胞用于iC9表达。然后将细胞与AP20187在完全培养基中培养24小时，然后用膜联蛋白V和7-AAD染色。条形图显示膜联蛋白V阳性、7-AAD阳性、双阳性或双阴性的T细胞的相对频率。膜联蛋白V(+)7-AAD(-)和膜联蛋白V(-)7-AAD(+)比较是n.s.。(17B、17C)在静脉输注1x10⁶个用GFP-FFluc和用GD2-CARΔ.C7R、GD2-CAR.C7R或GD2-CAR.C7R+iC9-CD19t转导的T细胞之前，在NSG小鼠中皮下建立LAN-1肿瘤8天。GD2-CARΔ.C7R在17B和17C中用作相同的对照。随时间的推移测量肿瘤体积。由于肿瘤负荷，在第21天后GD2-CARΔ.C7R组中的2只小鼠被安乐死，并且在第24天，将剩余3只小鼠的肿瘤大小与GD2-CAR.C7R和GD2-CAR.C7R+iC9-CD19t组中的小鼠进行比较。T细胞输注后32天的平均肿瘤体积：GD2-CAR.C7R为236±11mm³，GD2-CAR.C7R+iC9-ΔCD19t为196±18mm³，n.s.(p＝0.1857)。(17D)随时间定量来自肿瘤部位的GD2-CAR.C7R T细胞(有和没有iC9-CD19t)的生物发光信号。红色箭头表示在第28天开始AP20187给药，间隔24小时，总共3个剂量。*P<0.05，**P<0.01(双尾t检验，17A、17D；Welch t检验，17B、17C)。n＝每组5只小鼠。17A中的图表示来自不同供体的平均值±SEM(n＝3)。

图18A-18D：CD34-IL7R*(C7R)在T细胞中稳定表达，并相对于IL7R*增强组成型STAT5活化。(18A)IL7R*融合构建体和Δ34的示意图。所有IL7R*构建体含有修饰的IL-7Rα跨膜结构域(在IL-7Rα中Thr244和Ile245之间插入半胱氨酸、脯氨酸和苏氨酸)和未修饰的IL-7Rα胞内结构域。Δ34构建体含有CD34的胞外结构域和跨膜结构域，但仅保留一部分胞内结构域。(18B)将转导的细胞用对QBEND10特异的抗CD34抗体(其检测Q8中使用的CD34表位)染色，以相对于NT细胞比较构建体在a中的转导效率。由于IL-7Rα在培养的NT细胞上的背景表达，通过双顺反子载体中的Q8标签间接检测到IL7R*转导。当比较Δ34与IL7R*(p＝0.2951)和比较IL7R*与C7R(p＝0.1736)时转导效率的差异是n.s.。(18C)从B比较不同构建体的MFI。Δ34和IL7R*以及Δ34和C7R之间的MFI比较是n.s.。(18D)T细胞对STAT5磷酸化的比较。在分析之前，在没有IL-15和IL-7的情况下培养细胞24-72小时。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(双尾t检验，18B-18D)。图18B-18D表示来自不同供体的平均值(n＝3)±SEM。

图19A-19B：CD4和CD8选择的T细胞中C7R和Δ34的有效逆转录病毒转导。通过流式细胞术评估CD34表达，以检测(19A)CD4和(19B)CD8T细胞中相对于NT T细胞对照的C7R和Δ34转导。用双尾t检验(n＝3)比较时，差异是n.s.。

图20A-20D：在培养期间C7R信号传导不改变GD2-CAR T细胞的表型组成。(20A)GD2-CAR和GD2-CAR.C7R载体的示意图。GD2-CAR构建体由以下组成：14g2a scFv、CD8细胞外间隔区、CD8跨膜结构域和41BBζ胞内结构域，然后是IRES和截短的NGFR。GD2-CAR.C7R构建体是相同的，除了IRES和截短的NGFR被2A序列后接C7R替换。(20B、20C)比较了表达GD2-CAR或GD2-CAR.C7R的T细胞的记忆表型。条形图显示(20B)CD4 T细胞和(20C)CD8 T细胞的相对频率，其为CD45RO-CCR7-(末端效应子样，TE)、CD45RO+CCR7-(效应子记忆，EM)、CD45RO+CCR7+(中枢记忆，CM)或CD45RO-CCR7+(幼稚的)。对于CD4和CD8 T细胞中的所有四个记忆亚群，GD2-CAR和GD2-CAR.C7R之间的差异是n.s.。(20D)在GD2-CAR和GD2-CAR.C7RT细胞之间比较CD4和CD8百分比。差异是n.s.。图20B-20D表示平均值±SEM(n＝3)，并且使用双尾t检验比较群体。

图21A-21B：C7R不显著增加针对U373肿瘤的颅内EphA2-CAR T细胞扩增。(21A、21B)为了追踪T细胞，将1×10⁵个U373细胞颅内注射到SCID小鼠中，接着7天后注射1×10⁴个表达EphA2-CAR或EphA2-CAR.C7R的T细胞，其共表达GFP-FFluc。(21A)随时间收集生物发光图像并定量。(21B)进行AUC分析，发现在两组之间是n.s.(双尾t检验)。n＝每组5只小鼠。

图22：与GD2-CAR T细胞相比，GD2-CAR.C7R T细胞中的差异基因表达。在CC2结束后，用GD2特异性抗体标记肿瘤并与CAR T细胞磁性分离。从T细胞中分离总RNA，随后使用Human Immunology Panel Version 2和nCounter Analysis System(Nanostring)进行基因表达分析。展示的表格显示P值小于0.02的基因的倍数变化(GD2-CAR.C7R/GD2-CAR)。数据来自5个供体(10个配对样品)。

图23A-23B：用34.IL7RP2-EBVST治疗LCL肿瘤。在图23A中，在用34.IL7RP2-EBVST处理的小鼠中存在荧光素酶的成像。图23B显示34.IL7RP2-EBVST处理的小鼠中肿瘤生长的测量。

本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机械、制造、物质组成、工具、方法和步骤的特定实施方案。

详细描述

根据长期存在的专利法惯例，当在本说明书包括权利要求中与词语包括呼应地使用时，词语“一个(a)”和“一种(an)”表示“一个或多个/一种或多种”。本公开内容的一些实施方案可以由本公开内容的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。考虑了本文所述的任何方法或组合物能够相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施。

如本文所用的术语“细胞因子”是指细胞信号传导分子，其调节免疫系统对炎症和感染的应答并帮助免疫应答中的细胞间通信。实例包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。

I.一般实施方案

本公开内容涉及对细胞免疫治疗剂的改进以增强其扩增，包括在递送至需要其的个体后的体内扩增。这些改进利用了由多种组分组成的组成型活性细胞因子受体，包括细胞因子受体的至少一个胞内结构域、跨膜结构域和至少一个胞外结构域，尽管在某些情况下受体缺乏胞外结构域。在一个实施方案中，组成型活性细胞因子受体利用IL-7细胞因子受体α链的胞内结构域。经遗传修饰以表达非天然嵌合IL7R受体的抗原特异性T细胞在细胞培养研究以及动物模型中显示出稳健的扩增，这与未修饰的T细胞相反。

II.组成型活性细胞因子受体分子

在具体的实施方案中，本公开内容包括组成型活性细胞因子受体(蛋白质和/或核酸形式)，制备它们的方法和使用它们的方法。受体包含至少一个胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中胞内结构域衍生自细胞因子受体，并且其中胞外结构域与跨膜和胞内结构域组分相比衍生自相同或不同的分子。在替代实施方案中，跨膜结构域和胞外结构域来自相同分子，并且胞内结构域来自不同分子，但是该受体仍是组成型活性的，因为该分子包括扭转跨膜结构域和/或胞内结构域的突变。

在特定情况下，组成型活性细胞因子受体是组成型活性的，因为它们的跨膜结构域和/或胞内结构域组分被配置成在没有从它们可操作地连接的胞外结构域接收相应信号的情况下传递活化信号。也就是说，在受体的特定实施方案中，对细胞因子受体没有配体要求。在一些情况下，本公开内容的组成型活性细胞因子受体的跨膜结构域和/或结构域可以配置成使得它们能够以非天然方式或在非天然情况或环境下同源二聚化，从而允许胞外结构域保持在将活化信号传递到信号传导路径中下游的对应实体的状态。在特定的实施方案中，组成型活性细胞因子受体的跨膜/胞内结构域在细胞因子与它们可操作地连接的胞外结构域的结合不存在的情况下独立地产生阳性细胞因子信号。

在某些实施方案中，特定的组成型活性细胞因子受体用于本公开内容的方法中。

在SEQ ID NO：2中提供dCD34.IL7RP2 cDNA序列，相应的蛋白质序列在SEQ ID NO：3中。构建体dCD34.IL7RP2包含整个CD34胞外结构域；具有半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸(CPT)插入的IL7R TM结构域；和正常的IL7R胞内结构域。

在SEQ ID NO：4中提供IL7RP2 cDNA序列，相应的蛋白质序列在SEQ ID NO：5中。构建体IL7RP2包含IL7R胞外结构域；具有CPT插入的IL7R跨膜结构域；和正常的IL7R胞内结构域。

在SEQ ID NO：6中提供Q8E.IL7RP2 cDNA序列，相应的蛋白质序列在SEQ ID NO：7中。构建体Q8E.IL7RP2具有CD34细胞外结构域的片段和CD8茎；具有CPT插入的IL7R跨膜结构域；和正常的IL7R胞内结构域。

在SEQ ID NO：8中提供19AA.IL7RP2 cDNA序列，而相应的蛋白质序列在SEQ IDNO：9中。19AA.IL7RP2构建体包含19个氨基酸的IL7R胞外结构域(衍生自IL7R胞外结构域的在IL7R跨膜结构域起始之前的最后19个氨基酸)；具有CPT插入的IL7R跨膜结构域；和正常的IL7R胞内结构域。

A.胞外结构域

在具体的实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含一个、两个或更多个胞外结构域。在特定的实施方案中，胞外结构域能够结合配体，但例如由于结构或其他原因信号本身不会被传递。在特定实施方案中，胞外结构域可以来自或可以不来自与其相应的跨膜和/或胞内结构域相同的天然分子。胞外结构域可以来自或可以不来自与其可操作地连接的胞内结构域相同的天然分子。

在一些情况下，胞外结构域是球形的，类似于IL7-受体胞外结构域和CD34胞外结构域的三维几何结构。胞外结构域提供的一个特征可以是提供蛋白质稳定化，因为至少一些数据表明至少某些外部结构域允许高蛋白质表达和伴随的高信号活化(例如pSTAT5活化)。

在一些情况下，胞外结构域包含高糖基化，其稳定蛋白质并可增加信号传导。

在一些实施方案中，胞外结构域允许鉴定转导的细胞。例如，在其中胞外结构域通常不在T细胞上表达的情况下，胞外结构域允许鉴定转导的细胞，例如通过在流式细胞术分析期间进行门控和以及例如磁性选择用于富集(例如使用与相应抗体偶联的磁珠)。

在一些实施方案中，组成型活性细胞因子受体利用赋予库或配体捕获功能的胞外结构域，例如结合一个或多个会对表达组成型活性细胞因子受体的细胞有害的分子。在某些实施方案中，配体是免疫抑制性的，例如，因为它通常会活化信号传导途径以关闭T细胞(免疫抑制)。在一些这样的情况下，胞外结构域结合有害配体作为诱饵受体，但跨膜/胞内结构域仍然能够独立地产生阳性细胞因子信号。在某些实施方案中，诱饵受体阻止相应的配体抑制T细胞(如在正常情况下将发生的)。在特定情况下，例如，诱饵受体胞外结构域能够结合抑制性细胞因子。有害配体的实例包括TGF-β、PD-L1、IL-4、IL-13、IL-8和IL-10。此外，诱饵受体胞外结构域能够编码通常由T细胞表达的抑制性受体的胞外结构域，例如但不限于LAG3、TIGIT、CTLA4、FAS。在某些实施方案中，受体是组成型信号传导的，并且在指定的触发剂存在下信号传导被进一步增强。在替代实施方案中，胞外结构域不是来自细胞因子受体，例如包括不来自IL-4细胞因子受体或IL-13细胞因子受体。在一些情况下，胞外结构域可以包含或不包含抗体，例如scFv。

在特定方面，胞外结构域是用于破坏细胞的靶标。例如，胞外结构域可以用作直接或间接导致表达受体的细胞凋亡的分子的靶标。例如，可以用结合胞外结构域的相应抗体靶向胞外结构域，导致细胞的最终破坏。

在一些情况下，组成型作用的受体具有胞外结构域，其作为抑制性配体的诱饵受体，并且还具有用于自杀靶向的结构域，尽管在一些情况下诱饵受体胞外结构域和自杀靶向胞外结构域是一个并且是相同的。

在具体的实施方案中，胞外结构域包含CD30、HER2、EGFR、CD19、CD34、CD34、TGF-β受体、IL-4受体、IL-13受体α1和α2、IL-8受体、IL-10受体、PD-1、LAG3、TIGIT、CTLA4、FAS、CD19、CD27、CD28、CD52、CD134、CD137、HER2、EGFR或NGFR的细胞外结构域。此外，胞外结构域能够包含单克隆抗体或其衍生物(例如但不限于scFV)或二聚体结构域(例如但不限于FKBP)。

在某些情况下，胞外结构域包含足糖萼蛋白(也称为足糖萼蛋白样蛋白1；PODXL(也称为PCLP1)；血栓粘蛋白；gp135；GCTM2；TRA-1-60；TRA-1-81；或内切聚糖(也称为足糖萼蛋白样蛋白2，PODXL2或PCLP2)。

在一些实施方案中，受体的胞外结构域组分来自天然存在的分子并且是野生型，但在其他情况下，与相应的野生型天然存在的分子相比，胞外结构域包含一个或多个突变。例如，该一个或多个突变可以起到进一步稳定受体的作用。在其中胞外结构域与相应的野生型序列相比包含一个或多个突变的情况下，突变形式可以在部分或全部序列上与相应的野生型蛋白质或核酸序列相比具有一定的百分比同一性，例如至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的同一性。

在一些实施方案中，细胞外结构域具有一定长度。在具体的实施方案中，细胞外结构域的长度为10-275个氨基酸、10-225个氨基酸、10-200个氨基酸、10-175个氨基酸、10-150个氨基酸、10-125个氨基酸、10-100个氨基酸、10-50个氨基酸、50-250个氨基酸、50-225个氨基酸、50-200个氨基酸、50-175个氨基酸、50-150个氨基酸、50-100个氨基酸、90-250个氨基酸酸、90-225个氨基酸、90-200个氨基酸、90-175个氨基酸、90-150个氨基酸、90-125个氨基酸、90-100个氨基酸、100-250个氨基酸、100-225个氨基酸、100-200个氨基酸、100-175个氨基酸、100-150个氨基酸、100-125个氨基酸、125-250个氨基酸、125-225个氨基酸、125-200个氨基酸、125-175个氨基酸、125-150个氨基酸、150-250个氨基酸、150-225个氨基酸、150-200个氨基酸、150-175个氨基酸、175-250个氨基酸、175-225个氨基酸、175-200个氨基酸、200-250氨基酸、200-225个氨基酸等。

在替代实施方案中，受体缺乏胞外结构域。

B.跨膜结构域

在具体的实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含与胞外结构域和胞内结构域可操作地连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以来自或可以不来自与其可操作连接的胞内结构域相同的天然分子。在特定实施方案中，跨膜结构域不是来自与其可操作地连接的胞外结构域相同的天然分子。在特定的实施方案中，跨膜结构域不是天然的，因为它需要引起分子扭转的突变。在至少某些实施方案中，跨膜结构域与其相应的野生型分子相比包含一个或多个突变，其允许跨膜结构域是自身活性的。如本文所用，术语“自活性(self-active)”是指这样的跨膜结构域，其与其可操作地连接的胞内结构域一起在没有来自与其可操作地连接的胞外结构域的相应活化信号的情况下将信号传递至细胞。在某些实施方案中，跨膜结构域包含一个或多个引起或促进同源二聚化的突变。

在特定情况下，跨膜结构域赋予受体功能性构型以允许自活化(self-activation)，例如允许下游胞内结构域以有助于信号传导的方式相对于彼此定向，例如允许与胞内结构域相关联的janus激酶彼此相互作用并彼此交叉活化。在特定方面，跨膜结构域包含一个或多个突变，其允许跨膜结构域和胞内结构域在它们不天然地这样做时以非瞬时方式结合起作用。在至少一些方面，突变使得跨膜和胞外结构域能够人工同源二聚化。例如，跨膜结构域可以包含一个或多个突变，其允许两个分开的分子的同源二聚化，每个分子包含跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中在自然界中不发生这些分子的同源二聚化。在具体的实施方案中，例如，跨膜结构域中的一个或多个突变诱导受体同源二聚体的跨膜和胞内结构域的结构扭转，以形成自活化螺旋结构。在具体的实施方案中，跨膜结构域中的一个或多个突变诱导部分或全部受体分子(或其一个或多个组分)绕垂直轴螺旋扭转。确定特定突变是否会诱导结构构型以使跨膜和胞内结构域自活化的能力可以通过常规方法确定，例如在没有生长因子的情况下在携带被测试的特定受体的细胞生长后测定STAT3或STAT5磷酸化。

在特定实施方案中，具有这种一个或多个功能获得性突变的跨膜结构域组分可用于本公开内容的方法和组合物中。例如，突变可以是取代、插入、缺失或其组合。在具体的实施方案中，一个或多个突变包括包含至少一个半胱氨酸和/或至少一个脯氨酸。在一些情况下，跨膜结构域利用在肿瘤患者中鉴定的突变作为跨膜结构域中的功能获得突变。在至少一些情况下，突变体形式包括诱导跨膜结构域中的二硫键形成的半胱氨酸插入。然而，在其他实施方案中，一个或多个突变缺乏半胱氨酸的插入。例如，可以使用跨膜结构域衍生物，其不具有半胱氨酸插入(并因此没有二硫键)但仍然发出信号并且是组成型活性的，例如因为突变使得跨膜结构域与跨膜结构域的天然形式相比发生了构象变化，从而允许诱导信号传导。例如，氨基酸诸如脯氨酸的插入产生扭转跨膜结构域的“扭结”，其诱导信号传导(参见，例如，Shochat等人,2011,J Exp Med.2011May 9；208(5):901-8；Zenatti等人,2011,Nat Genet.2011Sep 4；43(10):932-9)。

在具体的实施方案中，跨膜结构域来自IL-7Rα受体，跨膜结构域中的突变是在序列PILLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO：1)中。在某些实施方案中，突变是或包括将一个或多个半胱氨酸和/或一个或多个脯氨酸插入SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中所述突变使得受体能够同源二聚化或促进受体的同源二聚化。在某些情况下，突变包括将半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸(CPT)的三聚体肽插入跨膜结构域。这种突变赋予两个分子(作为实例，两个IL7RP2受体α链)的半胱氨酸残基的-SH(巯基)基团之间的二硫键形成，允许在它们之间形成同源二聚体(在具体的实施方案中，紧接着半胱氨酸的脯氨酸有助于将同源二聚体扭转成正确的方向)。在具体的实施方案中，CPT插入的苏氨酸不是苏氨酸而是另一种氨基酸，并且在至少特定情况下，其他氨基酸是或不是半胱氨酸或脯氨酸。

在其中将一个或多个氨基酸插入SEQ ID NO：1以用于受体的实施方案中，插入可以在SEQ ID NO：1的任意两个氨基酸之间。在特定实施方案中，插入位于SEQ ID NO：1中的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三或第二十四个氨基酸之后。

本文描述的示例性构建体(Δ34.IL7RP2)中使用的突变TM序列的实例如下，其中该序列通过添加下划线序列突变：

PILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:2)

其他组成型活性IL-7受体中的突变TM序列

1.PILNPCLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:3)

2.PTCLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:4)

3.PSANCGAISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:5)

4.PILLVSCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:6)

5.PILLIISIQWLSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:7)

6.NSPSCLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:8)

7.PCLEGLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:9)

8.PILLTISILSFFWNLLVILACVLW(SEQ ID NO:10)

9.RFCPHISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:11)

10.IKCILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:12)

11.PIFHPFNCGPISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:13)

12.PILLMCPTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:14)

13.PILLTISILSFFSGPSLALLVILACVLW(SEQ ID NO:15)

14.PILRLGCVTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:16)

15.PIPQGGCILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:17)

16.LQSCILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:18)

17.PIFPHQHCTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:19)

18.PILLTISKCHLSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:20)

19.PILLTCHLISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:21)

20.PIFSCGPLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:22)

21.PILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:23)

22.PILLTPPVCSVTISILSFFSVALLVILACVLW(SEQ ID NO:24)

在具体的实施方案中，一个或多个跨膜结构域突变在结构上改变二聚化的α链(对于示例性IL-7Rα)以使其自身定向为使得结合的Janus激酶现在变得接近，从而允许交叉磷酸化和活化；在具体的实施方案中，这种结构改变源于二聚链的扭转。(Shochat等人,2011；Durum,2014)。

在特定的实施方案中，与其相应的野生型组分相比，跨膜结构域包含一个或多个突变，并且由此与野生型相比具有一定的百分比同一性。在特定情况下，跨膜结构域与相应的野生型跨膜结构域相比至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

跨膜结构域可具有任何合适的长度，但在具体的实施方案中，其长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸。

C.胞内结构域

组成型活性细胞因子受体包含一个或多个胞内结构域。在某些情况下，胞内结构域来自与跨膜结构域相同的分子，但是在其他情况下并非如此。在特定的实施方案中，胞内结构域来自细胞因子受体，包括免疫刺激细胞因子受体。在具体的实施方案中，细胞因子受体在信号传导途径包括STAT5、STAT3等中起作用。可用于本公开内容的受体的免疫刺激细胞因子胞内结构域包括例如IL-7Ra受体α、CD122(IL-2和IL-15的常见受体β)、IL-21受体α、IL-23受体α和IL-12受体α，和IL-6受体。

在一些实施方案中，基于所需的下游途径选择胞内结构域。例如，可以基于通过JAK1、STAT5、STAT4、JAK3、STAT3等传递信号的需求来选择胞内结构域。

在某些情况下，信号传导途径包括STAT5。STAT5是免疫刺激细胞因子IL-15和IL-7的主要下游信号传导节点，已知这两种细胞因子都可用于在免疫治疗的情况下活化T细胞。一些出版物已经使用临床前模型显示绕过细胞因子和细胞因子受体相互作用，和直接活化STAT5(使用组成型活性STAT5突变体)，CD8 T细胞功能通过增加的体内持久性和增强的体内抗肿瘤功效来增强。相同的概念能够扩展到活化其他已知免疫刺激细胞因子下游的STAT蛋白，例如STAT4，其位于IL-12的下游。

在特定实施方案中，胞内结构域包含来自IL7受体α链的胞内结构域，其可以包含或不包含一个或多个突变。在某些情况下，它与跨膜结构域可操作地连接，所述跨膜结构域包含允许引起或促进同源二聚化的突变。

在一些实施方案中，胞内结构域具有一定长度。在具体的实施方案中，胞内结构域的长度为70-250个氨基酸、70-225个氨基酸、70-200个氨基酸、70-175个氨基酸、70-150个氨基酸、70-125个氨基酸、70-100个氨基酸、80-250个氨基酸、80-225个氨基酸、80-200个氨基酸、80-175个氨基酸、80-150个氨基酸、80-100个氨基酸、90-250个氨基酸、90-225个氨基酸、90-200个氨基酸、90-175个氨基酸、90-150个氨基酸、90-125个氨基酸、90-100个氨基酸、100-250个氨基酸、100-225个氨基酸、100-200个氨基酸、100-175个氨基酸、100-150个氨基酸、100-125个氨基酸、125-250个氨基酸、125-225个氨基酸、125-200个氨基酸、125-175个氨基酸、125-150个氨基酸、150-250个氨基酸、150-225个氨基酸、150-200个氨基酸、150-175个氨基酸、175-250个氨基酸、175-225个氨基酸、175-200个氨基酸、200-250个氨基酸、200-225个氨基酸酸，等等。在某些实施方案中，某些长度的这些片段保留信号传导活性。

III.包含工程化细胞因子受体的细胞

进一步考虑了本公开内容的药物组合物包含表达组成型活性细胞因子受体的宿主细胞，例如用编码工程化受体的载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可以通过引入编码受体的载体来产生。引入宿主细胞的编码工程化受体的核酸分子或载体可以整合到宿主的基因组中，或者可以在染色体外维持。

宿主细胞能够为任何原核生物或真核细胞，但在具体的实施方案中，它是真核细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞是细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。特别考虑了宿主细胞可以是哺乳动物细胞，更优选人细胞或人细胞系。特别优选的宿主细胞包括免疫细胞，例如T细胞、NK细胞或NKT细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞是包含工程化细胞因子受体的T细胞。在一些情况下，表达工程化细胞因子受体的细胞也表达另一种非天然存在的分子，例如工程化的T细胞受体。天然存在的T细胞受体包含两个亚基，α-亚基和β-亚基，每个亚基是在每个T细胞基因组中通过重组事件产生的独特蛋白质。可以就对特定靶抗原的选择性筛选TCR文库。“工程化的TCR”是指被选择、克隆和/或随后引入用于过继免疫治疗的T细胞群中的对靶抗原具有高亲合力和反应性的天然TCR。在一些情况下，表达工程化细胞因子受体的细胞也表达嵌合抗原受体(CAR)。与工程化TCR相反，CAR被设计成以MHC非依赖性方式结合靶抗原。在特定实施方案中，CAR包含细胞外结合结构域，包括但不限于抗体或其抗原结合片段，例如scFv)；跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号结构域和主要信号传导结构域。

IV.表达受体的宿主T细胞的治疗用途

本文提供了治疗癌症的方法，其包括向患有所述癌症的个体施用有效量的表达对癌症特异的CAR的T细胞，其中CAR T细胞另外表达组成型活性细胞因子受体。在更具体的实施方案中，癌症是实体瘤，包括例如胶质母细胞瘤。在另一个具体实施方案中，CAR T细胞靶向抗原GD2。在更具体的实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含衍生自IL-7受体α的跨膜结构域，其中跨膜结构域包含一个或多个促进细胞因子受体同源二聚化的突变。

在具体的治疗癌症的方法中，细胞是包含细胞因子受体的T细胞，该细胞因子受体具有含有一个或多个突变的跨膜结构域，并且在特定实施方案中，跨膜结构域包括SEQ IDNO：1中的序列。在特定实施方案中，用于治疗的T细胞中的跨膜结构域包括SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：24之一中的序列。

向有此需要的个体提供有效量的表达组成型活性细胞因子受体的细胞。在某些情况下，个体可能患有癌症，但在其他情况下，个体需要治疗非癌性疾病。治疗有效量的细胞向个体提供，并且可以在一次或多次施用中提供。在一些情况下，除了可以同时或可以不同时向个体提供的一个或多个其他类型的治疗以外，还将本公开内容的细胞治疗提供给个体。

举例来说，癌症患者或易患癌症或怀疑患有癌症的患者可如本文所述进行治疗。如本文所述修饰的免疫细胞可以施用于个体并保留延长的时间段。可以使用多种施用途径中的一种。在一些实施方案中，将遗传修饰的细胞包封以抑制免疫识别并局部(例如在肿瘤部位)施用。

在各种实施方案中，表达构建体、核酸序列、载体、宿主细胞和/或包含其的药物组合物用于预防、治疗或改善癌性疾病，例如肿瘤性疾病。在具体的实施方案中，包含本公开内容的细胞的药物组合物可特别用于预防、改善和/或治疗癌症，包括例如具有实体瘤的癌症。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“医治(treating)”包括对疾病或病理病症的症状或病理学的任何有益或期望的作用，并且可包括治疗的疾病或病症(例如，癌症)的一个或多个可测量的标志物的即使最小程度的减少。治疗能够任选地涉及疾病或病症的症状的减轻或改善，或疾病或病症的进展的延迟。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。

如本文所用，“预防(prevent)”和类似的词语，例如“防止(prevented)”、“阻止(preventing)”等，表示用于预防、抑制疾病或病症(例如，癌症)的发生或复发或降低其可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的发作或复发或延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低疾病或病症的强度、效应、症状和/或负担。

本文所述的方法和组合物可应用于广泛的免疫细胞，例如但不限于αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、粘膜相关不变T-细胞(MAIT T细胞)、先天淋巴细胞或其混合物。此外，本发明的受体可以在干细胞和/或祖细胞(其随后分化成上述免疫细胞)中表达。此外，所有上述免疫细胞可以通过第二遗传修饰重定向至肿瘤细胞，该第二遗传修饰是例如但不限于嵌合抗原受体(CAR)、双特异性T细胞衔接器(BiTE或T细胞ENG)、双亲和力重新靶向(DART)蛋白质或αβT细胞受体。在某些实施方案中，细胞是如上定义的CAR表达免疫细胞，或靶向肿瘤的抗原特异性免疫细胞(例如病毒特异性T细胞或肿瘤抗原特异性T细胞)。在其中表达组成型活性细胞因子受体的细胞也表达CAR的实例中，CAR可以针对任何肿瘤抗原，例如EphA2、EphA3、HER2(ERBB2)、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD96、CD123、CD138、CD171、CEA、CLL-1、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、TAG72、TEM8、Tn-O-糖肽、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体、TSHR、CS-1、CMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、FLT3、CD44v6、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PRSS21、VEGFR2、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、ERBB2(Her2/neu)、前列腺素酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B l、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、突变的hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和lGLL1和/或存在于肿瘤的细胞外基质内的其他示例性抗原，例如纤连蛋白、肌腱蛋白的肿瘤变体，或肿瘤的坏死区域和其他肿瘤相关抗原或例如通过基因组分析和/或肿瘤的差异表达研究鉴定的可操作突变。

本文还提供了治疗个体的癌症的方法，其中癌症表达肿瘤抗原，该方法包括向个体施用表达(1)靶向所述肿瘤抗原的嵌合抗原受体；和(2)组成型活性细胞因子受体的免疫细胞。组成型活性细胞因子受体可以是本文所包括的任何组成型活性细胞因子受体。在某些实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含白细胞介素-7(IL-7)受体胞内结构域和促进细胞因子受体同源二聚化的跨膜结构域，使得细胞因子受体是组成型活性的。在某些实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含白细胞介素-21(IL-21)受体胞内结构域和促进细胞因子受体同源二聚化的跨膜结构域，使得细胞因子受体是组成型活性的。在某些实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含白细胞介素-23(IL-23)受体胞内结构域和促进细胞因子受体同源二聚化的跨膜结构域，使得细胞因子受体是组成型活性的。在某些实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含白细胞介素-12(IL-12)受体胞内结构域和促进细胞因子受体同源二聚化的跨膜结构域，使得细胞因子受体是组成型活性的。在具体的实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO：1-24中任一个的序列。在任何前述的具体实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含当同源细胞因子结合细胞外结构域时不传递信号的细胞外结构域。例如，在更具体的实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含IL-7受体胞内结构域，并且同源细胞因子是IL-7。在任何前述的具体实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含细胞外结构域，其是来自CD34的细胞外结构域。在任何前述的另一个具体实施方案中，组成型活性细胞因子受体包含细胞外结构域，其是来自PD-1或B7的细胞外结构域。

在本文提供的任何治疗方法的具体实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤。在本文提供的方法的某些具体实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、脑癌、结肠癌、头颈癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、癌症唾液腺或甲状腺癌。

在本文提供的任何方法的具体实施方案中，肿瘤抗原是GD2。在本文提供的任何方法的另一个具体实施方案中，肿瘤抗原是EphA2。在本文提供的方法的其他具体实施方案中，肿瘤抗原是EphA3、HER2(ERBB2)、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3,5T4,8H9、αvβ6整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD96、CD123、CD138、CD171、CEA、CLL-1、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、TAG72、TEM8、Tn-O-糖肽、VEGFR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体、TSHR、CS-1、CMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、FLT3、CD44v6、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PRSS21、VEGFR2、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、ERBB2(Her2/neu)、前列腺素酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp1OO、bcr-ab1、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、LAGE-1a、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、突变的hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或lGLL1。

在一些实施方案中，将表达组成型活性细胞因子受体的细胞提供给个体用于除癌症之外的医学病症，包括其中淋巴细胞治疗是治疗性的另一种疾病，包括但不限于传染病、自身免疫疾病和实体器官和干细胞移植后的并发症。在这种情况下，期望T细胞具有增强的扩增，因此组成型活性细胞因子受体分子与癌症适应症的那些相同或相似，但可以特异性地修饰细胞用于靶向非恶性适应症。在其中个体患有自身免疫疾病的实施方案中，例如，细胞可以通过其TCR对自身反应性T细胞具有广泛特异性，例如使用自身反应性T细胞作为抗原(如OPEXA Therapeutics；The Woodlands，TX)。

在具体的实施方案中，本公开内容部分地涵盖具有表达构建体、核酸分子和/或载体的细胞，所述细胞能够单独施用或与另一种治疗任意组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。在某些实施方案中，在施用细胞之前，所述核酸分子或载体可以稳定地整合到细胞的基因组中。在具体的实施方案中，可以使用对某些细胞或组织特异并且在所述细胞中持续存在的病毒载体。合适的药物载体和赋形剂是本领域熟知的。根据本公开内容制备的组合物能够用于预防或治疗或延迟上文所述疾病。

此外，本公开内容涉及预防、治疗或改善癌症(包括肿瘤)疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所考虑的和/或通过本文考虑的方法产生的具有组成型活性细胞因子受体、编码其的核酸序列、编码其的载体的细胞的步骤。

用于施用示例性经修饰的免疫细胞的组合物的可能适应症是癌性疾病，包括肿瘤性疾病，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌以及T细胞、B细胞、NK细胞和骨髓细胞或其前体的血液恶性肿瘤。用于施用细胞组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括例如具有表达受体表达细胞所靶向的抗原的细胞的任何恶性肿瘤。此外，它包括异常表达并且也可以被靶向的其他肿瘤抗原的恶性肿瘤。本公开内容的组合物的施用可用于所有阶段和类型的癌症，包括例如用于最小残留疾病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难治性癌症。

本公开内容还包括与其他化合物(例如，通过免疫细胞起作用的双特异性抗体构建体、靶向的毒素或其他化合物)的共同施用方案。用于共同施用本发明化合物的临床方案可包括在施用其他组分之前、之后和/或同时共同施用。特定的组合治疗包括化疗、放射、手术、激素治疗或其他类型的免疫治疗。

实施方案涉及试剂盒，其包含一种或多种如本文所述的免疫细胞、如本文所述的核酸序列、如本文所述的载体和/或如本文所述的宿主。还考虑了本公开内容的试剂盒包含单独的或与待施用于需要医学治疗或干预的个体的其他药物组合的如上文所述的药物组合物。

然后可以在选择性条件下(仅在一些情况下)在培养物中培养已经用构建体修饰的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)和被选择具有该构建体的细胞然后可以被扩增和使用例如用于确定宿主细胞中构建体的存在的聚合酶链反应进行进一步分析。一旦鉴定出修饰的宿主细胞，就可以按计划使用它们，例如，培养扩增或引入宿主生物中。

根据细胞的性质，可以以各种方式将细胞引入宿主生物，例如哺乳动物。在具体实施方案中，细胞可以在肿瘤部位引入，但是在替代实施方案中，细胞归巢至癌症或被修饰为归巢至癌症。使用的细胞数量取决于许多情况，包括引入的目的、细胞的寿命、使用的方案例如施用次数、细胞繁殖的能力、重组构建体的稳定性等。细胞可以作为分散体施用，通常在感兴趣的部位处或附近注射，或者可以静脉内递送。细胞可以在生理学上可接受的介质中。

施用途径包括例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部或皮内施用。在一些情况下，向个体提供特定剂量的细胞，例如总共10⁴至10¹¹个细胞。在具体的实施方案中，可以使用1×10⁵个细胞/kg至1×10⁹个细胞/kg的剂量。特定剂量包括1x10⁶个细胞/mL至1x10⁸个细胞/mL。

载体引入不需要在每种情况下导致整合。在某些情况下，引入的DNA的瞬时维持可能就足够了。以这种方式，可以具有短期效果，其中细胞可以被引入宿主然后在预定时间之后(例如，在细胞已经能够归巢到特定部位之后)开启。

应当理解，该系统可能受到变量(例如表达效率、表达产物的活性、可随时间和环境而变化的患者的特定需要、由于细胞损失导致的细胞活性的损失率，或个体细胞的表达活性等)的影响。因此，预期对于每个个体患者，将监测每个患者个体的适当剂量，并且这种监测患者的实践在本领域是常规的。

V.一般性载体

本公开内容的载体可用于重组工程改造以产生和至少在一些情况下表达组成型活性细胞因子受体。

术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可插入核酸序列用于引入到其中其能够被复制的细胞中。核酸序列能够为“外源的”，这意味着它对于引入载体的细胞是外源的，或者该序列对于细胞中的序列是同源的但处于宿主细胞核酸内通常没有找到该序列的位置。载体包括质粒、粘粒、转座子、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员可以很好地通过标准重组技术构建载体(参见，例如，Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994，两者均通过引用并入本文)。

术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子随后被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列不被翻译，例如，在反义分子或核酶的产生中。表达载体能够含有多种“控制序列”，其指的是可操作连接的编码序列在特定宿主细胞中转录和可能地翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可含有具有其他功能的核酸序列，其在下文中描述。

“启动子”是控制序列，其是核酸序列的区域，在该区域中控制转录的起始和速率。它可以含有调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可以结合的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子处于与核酸序列相关的正确功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。

启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。最广为人知的例子是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子(例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始的位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5'末端定位在所选启动子的“下游”(即3')。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。

启动子元件之间的间隔通常是柔性的，从而当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。取决于启动子，似乎个体元件能够协同或独立地起作用以活化转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'-非编码序列而获得。这种启动子能够称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下，将获得某些优点，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。

自然地，使用有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用(参见例如Sambrook等人，1989，通过引用并入本文)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的，可诱导的和/或在适当条件下可用于指导引入的DNA片段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。

组织特异性启动子或元件的特性以及表征其活性的测定法是本领域技术人员熟知的。在具体的实施方案中，使用环境特异性启动子或元件，例如缺氧特异性调节元件。可以使用组织特异性、谱系特异性和/或活化特异性启动子，并且实例包括活化的T细胞元件、NFAT(谱系限制性活化)、早期生长应答基因(活化)、肝X受体应答元件(活化)、缺氧应答元件(环境性)等。

载体能够包括多克隆位点(MCS)，其是含有多个限制酶位点的核酸区域，其中任何一个可与标准重组技术结合使用以消化载体。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置起作用的酶催化切割核酸分子。这些限制酶中的许多是可商购的。本领域技术人员广泛理解这些酶的用途。通常，使用在MCS内切割的限制酶使载体线性化或片段化，以使外源序列能够与载体连接。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以彼此邻接或不邻接。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员所熟知的。

还可以使用剪接位点、终止信号、复制起点和选择标记。

在某些实施方案中，考虑了质粒载体用于转化宿主细胞。通常，含有衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体能够用作与这些宿主相关的转化载体。例如，噬菌体λGEMTM 11可用于制备可用于转化宿主细胞例如大肠杆菌LE392的重组噬菌体载体。

包含表达载体的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)在许多合适的培养基(例如LB)中生长。如本领域技术人员所理解的，通过使宿主细胞与特异于某些启动子的试剂接触，例如通过向培养基中加入IPTG或通过转换孵育到更高的温度，可以诱导重组蛋白在某些载体中的表达。

D.病毒载体

某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞并整合到宿主细胞基因组中并稳定和有效地表达病毒基因的能力使它们成为将外来核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。本公开内容的组分可以是编码乙酰肝素酶的病毒载体。可用于递送本公开内容的核酸的病毒载体的非限制性实例描述如下。

1.腺病毒载体

用于递送核酸的特定方法包括使用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体具有低的整合到基因组DNA中的能力，但这一特征与这些载体提供的基因转移的高效率相抵消。“腺病毒表达载体”意在包括含有腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达已克隆在其中的组织或细胞特异性构建体。对遗传组织或腺病毒(一种36kb的线性双链DNA病毒)的了解允许用高达7kb的外源序列取代大片腺病毒DNA(Grunhaus and Horwitz，1992)。

2.AAV载体

可以使用腺病毒辅助转染将核酸引入细胞中。已经在使用腺病毒偶联系统的细胞系统中报道了增加的转染效率(Kelleher and Vos,1994；Cotten等人,1992；Curiel,1994)。腺病毒相关病毒(AAV)是用于本公开内容细胞的有吸引力的载体系统，因为它具有高的整合频率并且它能够感染非分裂细胞，因此使其可用于将基因递送到哺乳动物细胞中，例如，在组织培养中(Muzyczka，1992)或在体内。AAV具有广泛的感染宿主范围(Tratschin等人,1984；Laughlin等人,1986；Lebkowski等人,1988；McLaughlin等人,1988)。关于rAAV载体的产生和使用的细节描述于美国专利号5,139,941和4,797,368中，其各自通过引用并入本文。

3.逆转录病毒载体

逆转录病毒可用作递送载体，因为它们能够将其基因整合到宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广谱物种和细胞类型和包装在特殊细胞系中(Miller，1992)。

为了构建乙酰肝素酶逆转录病毒载体，将核酸(例如，编码部分或全部乙酰肝素酶的核酸)插入病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起被引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，其随后被分泌到培养基中(Nicolas and Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann等人,1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，其还含有具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的(参见，例如，Naldini等人,1996；Zufferey等人,1997；Blomer等人,1997；美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。已通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体在生物学上是安全的。

重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且能够用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，在美国专利号5,994,136(在此引入作为参考)中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用两种或多种携带包装功能元件(即gag、pol和env，以及rev和tat)的载体转染。可以通过将包膜蛋白与抗体或特定配体连接以靶向特定细胞类型的受体来靶向重组病毒。例如，通过将感兴趣的序列(包括调节区)以及编码特定靶细胞上的受体的配体的另一基因插入病毒载体中，载体现在是靶特异性的。

4.其他病毒载体

其他病毒载体可以用作本公开内容中的疫苗构建体。可以使用衍生自病毒如痘苗病毒(Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986；Coupar等人,1988)、辛德毕斯病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供了几种有吸引力的特征(Friedmann,1989；Ridgeway,1988；Baichwal and Sugden,1986；Coupar等人,1988；Horwich等人,1990)。

E.载体递送和细胞转化

用于转染或转化细胞的核酸递送的合适方法是本领域普通技术人员已知的。这些方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染、通过注射等。通过应用本领域已知的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞。

F.离体转化

用于在离体环境中转染从生物移出的真核细胞和组织的方法是本领域技术人员已知的。因此，考虑了可以移出细胞或组织并使用本公开内容的乙酰肝素酶或其他核酸离体转染。在特定方面，可以将移植的细胞或组织置于生物中。在优选的方面，核酸在移植的细胞中表达。

VI.组合治疗

在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的用于临床方面的方法，例如，向个体施用表达组成型活性细胞因子受体的组成型活性细胞因子受体表达细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)，可以有效治疗个体的医学病症的与一种或多种其他药物(例如过度增殖性疾病，包括抗癌剂)组合。“抗癌”剂能够对受试者的癌症产生负面影响，例如，通过杀死癌细胞，诱导癌细胞凋亡，降低癌细胞的生长速度，减少转移癌的发生率或数量，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答，预防或抑制癌症的进展，或增加患有癌症的受试者的寿命。更一般地，这些其他组合物将以有效杀死细胞或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及同时使癌细胞与表达构建体和药剂或多种因子接触。这可以通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触，或通过使细胞与两种不同的组合物或制剂(其中一种组合物包括表达构建体，另一种包括第二药剂)同时接触来实现。

在其中患有癌症的个体需要组合治疗的本公开内容的实施方案中，除了本公开内容的治疗细胞之外，还向个体提供以下的一种或多种：化学治疗或其他药物、模式相关的分子模式(PAMP)，例如Toll样受体(TLR)配体、免疫治疗、放射、手术、激素治疗及其组合。在向个体提供免疫治疗的情况下，免疫治疗可以是或可以不是组成型细胞因子受体表达细胞的一部分。在一些情况下，组成型活化细胞因子受体表达细胞包含其自身提供个体的治疗(例如结合肿瘤抗原或病毒抗原)的其他受体或分子。

肿瘤细胞对化学治疗和放射治疗剂的抗性代表临床肿瘤学中的主要问题。目前癌症研究的一个目标是找到通过将其与其他治疗组合以提高化疗和放疗疗效的方法。在本公开内容的上下文中，考虑了除了其他促凋亡或细胞周期调节剂以外，细胞治疗可以类似地与化学治疗、放射治疗或免疫治疗干预结合使用。

本公开内容的方法和组合物可以在一种或多种其他药剂治疗之前或之后，以数分钟至数周的间隔进行。在将其他药剂和本公开内容的药剂单独应用于个体的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间一段显著的时间不会到期，以使得药剂和本发明的疗法仍然能够对细胞施加有利的组合效果。在这种情况下，考虑了可以在彼此约12-24小时内更优选彼此约6-12小时内将细胞与两种形式(modality)接触。然而，在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各自施用之间经过了几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

预计将根据需要重复治疗周期。还考虑了各种标准治疗以及外科手术干预可以与本发明的细胞治疗组合应用。

在其中结合本公开内容的细胞提供另一种治疗并且需要多次施用一者或两者的情况下，药剂的施用可以具有不同的施用途径和不同的时间。

A.化疗

癌症治疗还包括各种组合治疗，例如基于化学和辐射二者的治疗。可以与本公开内容的治疗性细胞一起使用的化学治疗的实例包括例如阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡鲁宾；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸埃氟鸟嘌呤；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀(estrarnustine)；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A铵；氟尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨(fluorocitabine)；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；伊立替康盐酸盐；兰瑞肽醋酸盐；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；利那唑盐酸盐；洛美沙星钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托克星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；霉酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸菌素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗铃酮；普利霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼氮芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；嘌呤霉素盐酸盐；吡唑呋喃；利波腺苷；沙芬戈；盐酸安非他酮；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲佐菌素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰索帝；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌吟；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲前列酮；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；长春碱硫酸盐；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；长春瑞滨酒石酸盐；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；20-epi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非科林；凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β-内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycinB；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；bisaziridinylspermine；双奈法德；bistrateneA；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙感光蛋白C；喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；克罗米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；cryptophycin 8；cryptophycin A衍生物；curacin A；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷ocfosfate；细胞溶解因子；cytostatin；dacliximab；地西他滨；dehydrodidenmin B；地洛瑞林；地塞米松；dexifosfamide；右丙亚胺；右维拉帕米；地吖醌：代代宁B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维a铵；非格司亭；非那雄胺；黄酮类抗肿瘤药；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；氟尿嘧啶盐酸盐；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；钆特沙弗林；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；神经生长因子；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊屈孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如，)，咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；异高分泌素B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；lamellarin-Ntriacetate；兰瑞；leinamycin；格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；lombricine；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦新；甘露糖苷A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物；基质溶解素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；丝裂霉素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；艾比特思，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+myobacterium细胞壁sk；莫哌达醇；芥末抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-acetyldinaline；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星：奈立膦酸；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；氧化亚氮抗氧化剂；nitrullyn；奥利默森/>O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培门冬酶；培地辛；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；phenazinomycin；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶血性链球菌制剂；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原活化物抑制剂；铂金复合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；强的松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡啶氧基化血红蛋白聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀；铼Re 186羟乙磷酸盐；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肌植醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；sizofuran；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；spicamycin D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin1；角鲨胺；stipiamide；溶基质素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；菌体胚素；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；锡本紫红素乙酯；替拉扎明；环戊二烯钛二氯化物；topsentin；托瑞米芬；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；维拉雷琐；藜芦明；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；zilascorb；和zinostatin stimarmer，或前述的任何类似物或衍生物变体。

B.放疗

导致DNA损伤并且已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，例如微波和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围是进行延长的时间段(3至4周)的50至200伦琴的日剂量到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。

当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或将其与靶细胞直接并置放置的过程。为了实现细胞杀灭或停滞，将两种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。

C.免疫治疗

在一个实施方案中，将非组成型活性细胞因子受体特异性表达细胞的免疫治疗与本公开内容的方法和组合物一起使用。这种治疗可能是或可能不是细胞本身。

免疫治疗通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应子，或者它可以募集其他细胞以实际实现细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括T细胞、细胞毒T细胞、NKT细胞、NK细胞、树突细胞或巨噬细胞。

因此，免疫治疗可以与本发明的细胞治疗一起用作组合治疗的一部分。下面讨论组合治疗的一般方法。通常，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标记，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任何一种都适合于在本公开内容的背景下进行靶向。常见的肿瘤标志物包括前列腺特异性抗原、尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B、p155、黑素瘤相关抗原(MAGE)、优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、CD19、CD20、CD22、k轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB2、ErbB3/4、ErbB二聚体、EGFrvIII、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体a2、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、CLL-1、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-α、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双抗原、通用、EphA2、EphA3、HER2(ERBB2)、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5T4、8H9、α_vβ₆整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD96、CD123、CD138、CD171、CEA、CLL-1、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、ERBB3、ERBB4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、PSC1、PSMA、ROR1、Sp17、存活素、TAG72、TEM1、TEM8、Tn-O-糖肽、VEGRR2和HMW-MAA。

另一种类型的免疫治疗使用PAMP。这些可以注射到肿瘤中以活化先天免疫，其进而招募和活化适应性免疫，包括本发明的组成型活性细胞因子受体特异性表达细胞。

D.基因

在另一个实施方案中，第二治疗是基因治疗，其中治疗性多核苷酸在本公开内容的临床实施方案之前、之后或同时施用。本公开内容涵盖各种表达产物，包括细胞增殖的诱导物、细胞增殖的抑制剂或程序性细胞死亡的调节剂。

E.手术

大约60％的患有癌症的人将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可以与其他治疗(例如本公开内容的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗)结合使用的癌症治疗。

治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理移除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和微操控制手术(Mohs手术)。进一步考虑了本公开内容可以与浅表癌症、癌前病变或偶然量的正常组织的移除联合使用。

在切除部分或所有癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成腔。治疗可以通过用另外的抗癌治疗灌注、直接注射或局部施用该区域来完成。这种治疗可以重复，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复一次。这些治疗也可以是不同的剂量。

VII.药物组合物

根据本公开内容，术语“药物组合物”涉及用于向个体施用的组合物。在本公开内容的具体方面，药物组合物包含表达一种或多种组成型活性细胞因子受体的多个免疫细胞。在优选的实施方案中，药物组合物包含用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内或静脉内施用或直接注射入癌症的组合物。特别设想所述药物组合物通过输注或注射施用至个体。合适组合物的施用可以通过不同方式进行，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部或皮内施用。

本公开内容的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可以通过已知的传统方法配制。这些药物组合物能够以合适的剂量施用至受试者。

剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如在医学领域中众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况以及同时施用其他药物。用于施用的优选剂量可以在1x10⁷/m²至1x10¹⁰/m²的范围内。通过定期评估能够监测进展。组成型活性细胞因子受体修饰的细胞(例如T细胞)可以通过静脉内输注施用。剂量范围能够为1x10⁷/m²至1x10¹⁰/m²。

本公开内容的组合物可以局部或全身施用。施用通常是肠胃外施用，例如静脉内施用；DNA也可以直接施用于靶位点，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶位点或通过导管递送至动脉中的位点。在一个优选的实施方案中，药物组合物皮下施用，甚至在更优选的实施方案中静脉内施用。肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本公开内容的药物组合物可包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人源的。设想本公开内容的药物组合物除了组成型活性细胞因子受体构建体或编码其的核酸分子或载体(如本公开内容中所述)外，还可包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物的预期用途。

本文所述的任何组合物可包含在用于治疗表达组成型活性细胞因子受体的癌症的试剂盒中。在一个非限制性实例中，用于细胞治疗的一个或多个组成型活性细胞因子受体定向的免疫细胞和/或产生用于细胞治疗的携带重组表达载体的一个或多个细胞的试剂可以包含在试剂盒中。试剂盒组分在合适的容器工具中提供。

试剂盒的一些组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器工具通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器工具，其中可以放置组分，并且优选是适当地等分的。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还包含第二、第三或其他另外的容器，其中可以单独放置另外的组分。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。试剂盒通常还包括用于以紧密封闭的方式容纳组分的装置以用于商业销售。这种容器可包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶保留在其中。

当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别有用的。在一些情况下，容器工具本身可以是注射器、移液管和/或其他类似装置，制剂可以从该装置应用于身体的感染区域，注射到动物中，和/或甚至应用于试剂盒的其他组分/或与试剂盒的其他组分混合。

在特定实施方案中，用于细胞治疗的细胞在试剂盒中提供，并且在一些情况下，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。试剂盒可包含制备所需细胞的试剂和材料。在具体的实施方案中，试剂和材料包括用于扩增所需序列的引物、核苷酸、合适的缓冲液或缓冲试剂、盐等，并且在一些情况下，试剂包括编码如本文所述的衔接器分子和/或因此调节元件的载体和/或DNA。

在特定实施方案中，试剂盒中存在一个或多个适于从个体提取一个或多个样品的装置。该装置可以是注射器、手术刀等。

在特定方面，试剂盒包含本公开内容的细胞疗法以及细胞免疫的化学治疗。在一些情况下，除了细胞治疗实施方案之外，该试剂盒还包括第二种癌症治疗，例如化疗、激素治疗和/或免疫治疗。试剂盒可以针对个体的特定癌症进行定制，并且包含针对个体的相应的第二癌症治疗。

实施例

包括以下实施例以举例说明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地起作用的技术，因此能够被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，能够对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

用于细胞治疗的组成型活性细胞因子受体

本实施例证明了组成型活性细胞因子受体的特定具体实施方案的产生和活性。本公开内容涉及组成型活性细胞因子受体，其是非天然的并且与野生型相比已经被修饰，从而导致信号传导性质的变化。图1举例说明了正常IL-7细胞因子/受体信号传导中发生的情况。静息时，IL-7受体α(IL-7Rα)蛋白保持与γ链受体(Υc)蛋白分离。当细胞外IL-7结合两种受体的细胞外结构域时，这会发生变化，诱导IL-7Rα和Υc的异二聚化，其活化JAK1/JAK3信号传导以活化STAT5磷酸化。STAT5是IL-7受体活化的主要下游信号传导节点。图2显示了IL7RP2受体的信号传导。独立于细胞外IL-7，IL7RP2单体蛋白的跨膜结构域中的半胱氨酸残基将与另一种IL7RP2单体中的半胱氨酸残基形成二硫键。这诱导形成同源二聚体蛋白，其组成型活化JAK1/JAK1信号传导，导致STAT5磷酸化。

因此，本公开内容涵盖工程化细胞因子受体的实施方案，其在一些情况下具有特定的细胞外结构域和特定的跨膜结构域，使得即使在不存在受体的初始信号的情况下，工程化的受体也是组成型活性的。在图3中，示出了Δ34.IL7RP2蛋白的特定实例中的信号传导。用CD34的细胞外结构域替换IL7RP2受体的细胞外结构域以形成Δ34.IL7RP2。这消除了对细胞外细胞因子如IL-7的敏感性，同时保持蛋白质的跨膜和细胞质结构域完整以组成型活化STAT5。图4显示STAT5在IL7RP2转导的T细胞中是组成型活性的。产生具有编码Δ34.IL7RP2的表达盒的逆转录病毒载体(SFG.Δ34.IL7RP2)。用RD114-假型SFG.Δ34.IL7RP2逆转录病毒颗粒转导OKT3/CD28活化的T细胞。作为阴性对照，用非信号传导SFG.Δ34载体单独转导T细胞，该载体表达CD34的细胞外和跨膜结构域以及胞质结构域的一部分。在来自一个供体的代表性FAC数据中(图4A)，组成型STAT5活化通过在没有细胞因子的情况下静置24小时的Δ34.IL7RP2转导的T细胞(白色)中相对于用SFG.Δ34转导的T细胞(黑色)较高的磷酸化-STAT5(pSTAT5)信号证明。来自n＝3个供体中的平均结果显示，Δ34.IL7RP2转导的T细胞中pSTAT5的平均荧光强度(MFI)显著高于SFG.Δ34(图4B)。

包含本公开内容的修饰的细胞因子受体并且还包含(例如)嵌合抗原受体的细胞即使在不存在细胞因子的情况下也保持增殖能力。在图5中，显示IL7RP2转导的抗原特异性T细胞在抗原特异性刺激后具有比未修饰的抗原特异性T细胞更大的增殖潜力。水痘带状疱疹病毒(VZV)特异性T细胞(VZVST)用对实体瘤抗原GD2特异的嵌合抗原受体(CAR)进行遗传修饰。评估了IL7RP2在该系统中的益处。VZVST用编码GD2-CAR与CD28.ζ信号传导结构域(SFG.GD2.CAR.CD28ζ)或SFG.GD2.CAR.CD28ζ和SFG.IL7RP2-mOrange(mO)的逆转录病毒载体进行基因修饰。在不存在IL2的情况下，两种T细胞群都反复暴露于GD2+LAN-1肿瘤细胞。虽然L7RP2转导的GD2.CAR VZVST继续增殖，但未修饰的GD2.CAR VZVST没有。

与缺乏受体的细胞相比，本公开内容的组成型活性细胞因子受体允许增加的扩增和癌细胞细胞毒性。图6证明共表达Δ34.IL7RP2的GD2.CAR T细胞在体内具有比GD2.CAR T细胞更大的扩增和抗肿瘤功效。为了评估Δ34.IL7RP2是否在体内增强抗原重定向的T细胞的扩增，用编码GD2.CAR与OX40.CD28.ζ信号传导结构域(SFG.GD2.CAR.OX40.CD28.ζ)的逆转录病毒载体或共表达GD2.CAR.OX40.CD28.ζ和Δ34.IL7RP2(其之间具有2A序列)的双顺反子SFG载体转导OKT3/CD28活化的T细胞。此外，用编码萤火虫荧光素酶的逆转录病毒载体转导两种T细胞群，以允许非侵入性生物发光成像。具有8日龄背部左侧GD2+LAN-1肿瘤的NSG小鼠静脉内注射200万个GD2.CAR T细胞或200万个GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞。GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞在体内显著扩增，并且与GD2.CAR T细胞相比，在肿瘤部位显示出延长的T细胞持久性(图6A)。LAN-1肿瘤在接受GD2.CAR T细胞的小鼠中生长，而肿瘤在GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞中消除(图6B)。这导致在接受GD2.CAR-Δ34.IL7RP2 T细胞的小鼠中显著增强的存活优势(图6C)。

Δ34.IL7RP2-转导的T细胞在不存在抗原刺激的情况下具有有限的持久性。为了评估在没有抗原或细胞因子刺激的情况下Δ34.IL7RP2是否诱导T细胞的组成型扩增，在缺乏人细胞因子补充剂或抗原刺激的完全培养基中培养Δ34.IL7RP2转导的T细胞(PBMC分离和活化后10天)。作为对照，以相同方式培养Δ34-转导的T细胞和未转导的(NT)T细胞。Δ34.IL7RP2转导的T细胞在培养的最初14天期间扩增1倍，之后细胞收缩(图7)。Δ34和NT T细胞在培养过程中没有扩增和收缩。这证明单独的Δ34.IL7RP2不能诱导T细胞中的组成型细胞扩增，并且Δ34.IL7RP2转导的T细胞仍然需要抗原用于增殖。

Δ34.IL7RP2延长EphA2.CAR T细胞的细胞毒性能力和扩增。为了评估Δ34.IL7RP2是否增强了通过EphA2-CAR对表达EphA2的靶标重定向的T细胞的扩增，用编码EphA2.CAR与41BB.ζ信号传导结构域(通过2A序列连接到截短的CD19分子，ΔCD19(SFG.EphA2.41BB.ζ-2A-ΔCD19))的双顺反子SFG载体或共表达SFG.EphA2.41BB.ζ和Δ34.IL7RP2(其之间具有2A序列)(SFG.EphA2.41BB.ζ-2A-Δ34.IL7RP2)的双顺反子SFG载体转导OKT3/CD28活化的T细胞。当CAR T细胞经受连续杀伤测定时，其中每周用EphA2阳性U373胶质母细胞瘤细胞(2个T细胞对1个肿瘤细胞的比例)进行攻击，SFG.EphA2.41BB.ζ-2A-Δ34.IL7RP2T细胞能够消除肿瘤细胞并增殖持续8次刺激(黑色)，而SFG.EphA2.41BB.ζ-2A-ΔCD19T细胞(灰色)在2次刺激后变得功能失调(图8)。

Δ34.IL7RP2在体内增强EphA2.CAR T细胞的抗胶质瘤活性。给小鼠注射表达萤火虫荧光素酶的U373细胞，并在第7天接受和瘤内注射EphA2.CAR T细胞或EphA2.CAR.Δ34.IL7RP2 T细胞。肿瘤生长通过连续生物发光成像来追踪。肿瘤在用EphA2.CAR.Δ34.IL7RP2 T细胞处理的所有四只小鼠中消退并且不再复发(图9)。相比之下，仅有4/5只小鼠在EphA2.CAR T细胞治疗后具有肿瘤消退，并且在T细胞注射后4周内所有四个反应肿瘤复发。

组合的组成型活性细胞因子受体包括在本公开内容的实施方案中。例如，Δ34.IL7RP2蛋白可以与IL-21Rα细胞质结构域融合，以产生组成型活性的组合细胞因子受体。Δ34.IL7RP2在C-末端与IL-21受体的细胞质结构域融合，在两个细胞质结构域之间具有柔性接头，以避免STAT5结合的空间位阻，从而产生Δ34.IL7RP2-接头-IL21Rα(图10A)。为了评估STAT活化能力，将T细胞(NT，Δ34.IL7RP2转导的T细胞或Δ34.IL7RP2-接头-IL21Rα转导的T细胞)在没有细胞因子的情况下静置24小时。Δ34.IL7RP2和Δ34.IL7RP2-接头-IL21RαT细胞能够组成型活化STAT5(图10B)，但仅Δ34.IL7RP2-接头-IL21Rα显示出组成型STAT3活性(图10C)。STAT3是由IL-21受体活化的关键下游信号传导节点。

可以修饰非T细胞的细胞以表达一种或多种组成型活性细胞因子受体。在图11中，IL7RP2增强抗原介导的NK细胞增殖。用IL7RP2-IRES-mOrange(IL7RP2.mO)载体或对照载体IRES-mOrange(空.mO)转导NK细胞，然后在不存在细胞因子的情况下用经辐照的K562靶细胞刺激7天。IL7RP2.mO NK细胞表现出增殖倍数的8倍增加而空.mO NK细胞仅增殖4倍。

实施例2

胞外结构域的具体实施方案

图12举例说明了其中多个胞外结构域用于组成型活性细胞因子受体的具体实施例。其中，PD1胞外结构域与Δ34.IL7RP2的ΔCD34胞外结构域连接，并且该具体PD1胞外结构域与正常PD1竞争PDL1结合(并因此充当诱饵受体)，这将降低PD1免疫抑制。在一些情况下，受体利用这种胞外结构域作为单个胞外结构域(图13)。对于诱饵受体，受体可以或可以不包括CD34或其部分。用于诱饵受体的胞外结构域的其他实施方案包括CTLA4。

实施例3

细胞因子信号转导向淋巴细胞的组成型递送促进增强的抗肿瘤效果

过继性淋巴细胞治疗已显示出抗白血病和淋巴瘤的成功，但对实体瘤的疗效最小。通过检查T细胞活化所需的3种信号范例(信号1(抗原引起的T细胞受体活化)、信号2(共刺激)和信号3(细胞因子活化))，可以了解实体瘤对肿瘤特异性T细胞的挑战。这些信号一起工作以在体内扩增过继转移的淋巴细胞并驱动它们消除肿瘤。实体瘤通过诸如下调将肿瘤抗原呈递给T细胞的MHCI分子、不能表达共刺激配体和产生免疫抑制细胞因子的机制来阻止T细胞的3-信号活化。一种解决方案是遗传修饰T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，其在MHCI非依赖性抗原连接时提供信号1和2，并从IL-2分泌提供一些信号3。然而，这种方法仍未完全活化信号3。通过过表达组成型递送IL-7细胞因子信号传导的遗传构建体来纠正这种缺陷。在没有细胞因子支持的情况下，细胞因子递送策略在体外增强CAR T细胞的抗原依赖性细胞毒性、扩增和持久性。这在体内用异种移植神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤小鼠模型(仅作为实例)再现，证明了补充信号3的过继免疫治疗的针对实体瘤的显著改善的功效。

实施例4

来自工程化IL-7受体的组成型信号传导通过肿瘤重定向T细胞促进持久性肿瘤消除

简介

使用用嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞的过继免疫治疗已经实现了针对难治性白血病和淋巴瘤的显著临床功效，但是在将这些成功转化到实体瘤方面仍然存在挑战。过继转移的T细胞的显著扩增和持久性对于持久的抗肿瘤功效是必需的。在最佳T细胞活化和扩增所需的3种信号中，CAR活化可以概括信号1(T细胞受体(TCR)活化)和信号2(共刺激)，但不能维持来自在肿瘤微环境中很少见的免疫刺激细胞因子的阳性信号3。在异种移植肿瘤模型中，信号3用细胞因子如IL-2的注射进行补充以增强抗肿瘤活性，而没有显著的副作用。然而，对癌症患者全身施用细胞因子已经引起显著的毒性。替代方法，例如T细胞的遗传修饰以分泌或反式呈递细胞因子，存在严重不良事件的风险，包括神经毒性和来自分泌细胞因子的全身积累的细胞因子释放综合征，而过表达细胞因子受体的T细胞不能消除对外源性细胞因子的需求。

本实施例提供了用组成型活性IL-7细胞因子受体(C7R)选择性地向T细胞提供信号3的策略，从而避免了上述问题。这种新型嵌合受体提供信号3而不需要外源性试剂或没有由转基因细胞因子的强制表达引起的非特异性旁观者T细胞活化。表达C7R的CAR T细胞的生长和存活仍然是抗原依赖性的，但在肿瘤存在下，这些细胞在多种模型系统中具有优异的抗肿瘤活性。

C7R组成型活化STAT5并被工程化为对细胞外配体无反应

在本实施例中，IL-7是关注的焦点，因为该细胞因子支持肿瘤特异性T细胞的持久性。携带某些突变的IL-7受体由于跨膜结构域中的半胱氨酸和/或脯氨酸插入而导致功能获得，引起IL-7Rα同源二聚化。一旦形成同源二聚体，JAK1/JAK1的交叉磷酸化活化STAT5，即IL-7下游的核心信号传导节点。

为了发现这类受体是否能产生一致的信号3以完成对最佳CAR T细胞活性的三信号要求，选择具有显著STAT5活化的组成型活性IL-7受体变体(IL7R*)。为了避免外部配体对受体的额外活化并提供检测转导的细胞的手段，受体的天然细胞外结构域被源自CD34的胞外结构域取代。为了了解胞外结构域大小是否是蛋白质表达和功能的效率的考虑因素，使用了来自Q8(65个氨基酸)和CD34(259个氨基酸)的胞外结构域。Q8胞外结构域包含安装在CD8间隔物顶部的CD34表位，允许通过抗CD34抗体克隆QBEND10进行检测。健康供体T细胞中CD34-IL7R*和Q8-IL7R*构建体的逆转录病毒介导的表达揭示了Q8-IL7R*融合蛋白的差表达和次优的STAT5活化(图18)。相反，CD34-IL7R*在T细胞中强烈表达并且具有功能活性。因此，对于所有后续研究，使用CD34-IL7R*，此后称为C7R(在本文中也称为Δ34.IL7RP2)(图14A)。

为了确定C7R在CD4和CD8 T细胞中的相对作用，使用抗体包被的磁珠分离两个亚群，活化并转导它们，并将T细胞亚群彼此分开培养。C7R由CD4和CD8 T细胞容易地表达(图14B，14C和图19)，并且与由截短的CD34(Δ34)分子组成的对照构建体相比，在T细胞中产生更大的组成型STAT5活化(Quintarelli，2007)(图14D-14G)。重要的是，C7R在体外不促进CD4和CD8 T细胞的抗原非依赖性扩增(图14H、14I)。虽然C7R转导的细胞在体外在抗原和细胞因子耗尽的条件下比对照细胞持续显著更长时间，但C7R群体到第14-21天开始收缩，所有细胞在持续性测定开始后第70天死亡。这证实单独的C7R不能维持自主T细胞扩增，这是CAR T细胞安全性的重要特性。

在连续体外肿瘤细胞攻击期间，C7R促进GD2-CAR T细胞的存活

为了评估C7R是否可以增加CAR T细胞的抗肿瘤功效，我们用表达GD2-CAR的T细胞处理GD2+神经母细胞瘤细胞，所述GD2-CAR包含与CD8α茎和跨膜结构域连接的14g2a scFv和41BB.ζ信号传导胞内结构域(图20A)。基于14g2a的GD2-CAR T细胞在治疗神经母细胞瘤患者的临床试验中显示出安全的特征，并且虽然在选择的患者中实现了完全缓解，但仍然需要更高的功效。在比较表达单独的GD2-CAR或含有GD2-CAR和C7R的双顺反子构建体(GD2-CAR.C7R)的T细胞时，C7R在GD2-CAR T细胞的记忆子集组成或CD4/CD8百分比上没有诱导显著差异(图16B-16D)。在用LAN-1肿瘤刺激后，C7R增加GD2-CAR T细胞中IFN-γ和TNF-α的分泌(图15A)，这与4小时细胞毒性测定期间T细胞杀伤效力的任何增加无关(图15B)。然而，当在体外连续共培养杀伤测定期间测量其在肿瘤反复攻击后维持细胞毒性和扩增的能力时，GD2-CAR.C7R T细胞显著优于GD2-CAR T细胞(图15C)。GD2-CAR T细胞在第三次攻击中失败，丧失了扩增和消除肿瘤细胞的能力(图15D、15E)。相反，表达C7R的GD2-CAR T细胞响应所有3个连续的肿瘤攻击。为了确定增加的增殖与减少的细胞凋亡对GD2-CAR.C7R T细胞的改善的细胞扩增的相对贡献，在第一次共培养后使用Cell Trace Violet标记。在随后用肿瘤细胞再刺激时，GD2-CAR.C7R T细胞显示出比仅表达GD2-CAR的T细胞更大的细胞分裂(图15F、15G)。为了评估C7R是否也减少T细胞凋亡，在第二次肿瘤再刺激后使用膜联蛋白V和7-AAD染色。流式细胞术分析显示，与GD2-CAR.C7R T细胞相比，膜联蛋白V(+)/7-AAD(+)GD2-CAR T细胞的数量更多(图15H)，表明尽管进行了连续肿瘤攻击，C7R仍产生了增加的活力。为了进一步理解这些结果的分子基础，使用Nanostring技术在第二次肿瘤再刺激后进行GD2-CAR和GD2-CAR.C7R T细胞的基因表达分析(图15I和图22)。介导IL-7的抗细胞凋亡作用的BCL2是GD2-CAR T细胞中由C7R上调的最重要基因之一。存在细胞溶解颗粒酶A(GZMA)的上调，和促凋亡FAS和胱天蛋白酶8(CASP8)的下调，去参与细胞凋亡和活化诱导的细胞死亡(AICD)(Krammer，2007)。因此，C7R增强GD2-CAR T细胞的增殖和存活，以增强它们在与肿瘤细胞的连续遭遇期间的表现。

CAR T细胞中的C7R共表达增强了它们针对异种移植肿瘤模型的抗肿瘤活性

测试了C7R增强的GD2-CAR T细胞在异种移植模型中根除转移性神经母细胞瘤的能力。通过静脉注射多药耐药性MYC-N非扩增神经母细胞瘤细胞系CHLA-255(经修饰以表达萤火虫荧光素酶)(CHLA-255FFluc)将神经母细胞瘤细胞植入非肥胖糖尿病(NOD)严重/联合免疫缺陷(SCID)IL-2rγ-/-(NSG)小鼠(Heczey,2014,Blood.2014Oct 30；124(18):2824-33)。与用表达无关CAR的T细胞处理的对照小鼠相比，肿瘤植入后一周用低剂量GD2-CAR T细胞的治疗使中位存活期增加一周。接受表达C7R和具有截短的胞内结构域的非功能性GD2-CAR(GD2-CARΔ.C7R)的T细胞的小鼠具有与对照小鼠相同的存活率。(图16A、16B)。相反，在注入GD2-CAR.C7RT细胞的小鼠中消除了疾病。在其中T细胞而不是CHLA-255细胞被GFP-FFluc转导的平行实验中，输注的有限剂量的GD2-CAR T细胞没有扩增，但观察到GD2-CAR.C7R T细胞的稳健扩增，其中T细胞信号的积累存在于肝脏中，这是广泛神经母细胞瘤转移的部位(图16C、16D)。这些结果表明GD2-CAR T细胞不能在体内持续对抗肿瘤，而表达C7R的GD2-CAR T细胞可以增殖并存活以介导转移性肿瘤清除。

为了研究C7R是否可以增强其他CAR T细胞的性能，将该分子与旨在治疗胶质母细胞瘤的EphA2-CAR共表达。将用GFP-FFluc遗传修饰的U373胶质母细胞瘤细胞颅内注射到SCID小鼠中。7天后，在肿瘤内施用10⁴个EphA2-CAR T细胞，根据以前的经验，这是不能根除胶质瘤的细胞剂量。用共表达C7R和非功能性EphA2-CAR(EphaA2-CARΔ.C7R)的对照T细胞处理的小鼠中胶质母细胞瘤生物发光迅速增加，并且在接受EphA2-CAR T细胞的小鼠中未观察到抗肿瘤控制的显著改善(图16E、16F)。相反，当共表达C7R(EphA2-CAR.C7R)时，在注入低“应激”剂量的EphA2-CAR T细胞的小鼠中完全消除了肿瘤并且这些小鼠在实验结束时保持无病。当使用还用GFPFFluc转导的EphA2-CAR T细胞重复实验时，来自仅表达CAR的T细胞的生物发光信号在输注后4-6天大量消退。相比之下，虽然EphA2-CAR.C7R T细胞缺乏在(颅外)神经母细胞瘤模型中观察到的显著更大的扩增，但是存在更大的T细胞持久性的趋势，如通过EphA2-CAR和EphA2-CAR.C7R T细胞之间的曲线下面积(AUC)比较所确定的(图21)。

在肿瘤清除后使用iC9能够有效地删除GD2-CAR.C7R T细胞

然而，作为另外的安全措施，产生了共表达临床验证的诱导型胱天蛋白酶9(iC9)自杀基因(其能够选择性地消除T细胞)的T细胞(Di Stasi等人，2011)。在用iC9和GD2-CAR.C7R双重转导后，T细胞对iC9信号传导保持敏感，并且在暴露于二聚化AP20187的化学诱导剂(CID)后24小时内在体外经历细胞凋亡(图17A)。考虑iC9是否能在肿瘤消退后在体内有效去除GD2-CAR.C7R T细胞。为了同时评估T细胞活性和肿瘤生长，使用皮下LAN-1神经母细胞瘤模型。将肿瘤细胞注射到NSG小鼠的背部左侧，8天后，静脉内注射1×10⁶个单独的或用iC9双重转导的GD2-CAR.C7R T细胞。对照小鼠接受GD2-CARΔ.C7RT细胞。用GFP-FFluc共转导所有T细胞用于体内可视化。3周后，LAN-1肿瘤在对照小鼠中生长，将对照小鼠实施安乐死。共表达GD2-CAR.C7R T细胞和iC9载体的T细胞表现出与单独的GD2-CAR.C7R T细胞相似的抗肿瘤功效和体内扩增(图17B，17C)。为了模拟在免疫治疗后控制毒性所需的T细胞去除，在相同的实验方法中在T细胞输注后28天开始向小鼠施用3个剂量的CID。在CID施用后立即丢失T细胞生物发光信号(平均93％)(图17D)，并且信号在两周后保持在基线而没有肿瘤复发，此时实验终止。这些结果证实，如果需要，共表达C7R的CAR T细胞能够与iC9一起使用，而不损害功效并允许选择性T细胞去除。

用34.IL7RP2转导的EBV特异性T细胞治疗LCL肿瘤显示出抗肿瘤功效。将LCL肿瘤皮下注射到雌性NSG小鼠的背部左侧。8天后，静脉内注射共表达GFP-萤火虫荧光素酶(GFP-Ffluc)的5×10⁶个EBV特异性T细胞(EBVST)或34.IL7RP2转导的EBVST(34.IL7RP2-EBVST)。将PBS注射到携带肿瘤的小鼠中作为对照。在图23A中，小鼠中荧光素酶信号的成像显示，相对于单独的EBVST，34.IL7RP2-EBVST在肿瘤部位具有延长的持久性。同样，在图23B中，肿瘤生长的测量显示34.IL7RP2 EBVST相对于单独的EBVST具有优异的抗肿瘤功效。

某些实施方案的重要性

结果证明T细胞活化中的信号3显著改善了CAR T细胞对抗实体瘤的活性的维持，并且组成型活性IL-7受体能够用于提供信号3以增强过继性免疫治疗。在T细胞将可能在实体恶性肿瘤中遇到的反复抗原暴露的压力下，只有共表达C7R的GD2-CAR T细胞能够经历多轮扩增并保持抗肿瘤活性。对于两种不同的CAR和肿瘤模型，体内显示了C7R增强的CAR T细胞的优越性，其中以无效剂量施用的功能性CAR T细胞如果与C7R组合，则能够维持根除已建立的肿瘤的能力。

基因表达分析显示，在重复的肿瘤细胞攻击期间，C7R促进的GD2-CAR T细胞的存活与BCL2转录的增加和FAS和CASP8的表达降低相关。这表明C7R在CAR T细胞内发挥广泛的抗细胞凋亡作用，以降低它们对AICD的易感性。C7R的其他潜在益处包括对肿瘤微环境中的免疫抑制剂如TGF-β(Pickup，2013)的抗性，因为相对于单独的GD2-CAR T细胞，GD2-CAR.C7R T细胞中存在TGF-βRII的下调(图22)。

在具体实施方案中，基于观察到的C7R仅适度增强CAR T细胞的抗原驱动的细胞因子分泌，C7R不会显著增加细胞因子释放综合征的严重性。此外，在用脑室内IL-13Rα2CAR T细胞输注成功治疗的胶质母细胞瘤患者中观察到的低毒性(Brown，2016)，以及观察到的C7R功能性增强EphA2-CAR T细胞而基本上不增加我们的原位胶质母细胞瘤模型中的扩增，也表明如果CAR T细胞和C7R组合策略用于胶质母细胞瘤治疗，不良事件的风险较低。没有证据表明C7R能够诱导抗原非依赖性增殖，但是NSG模型在评估体内人T细胞的长期命运方面具有明显的局限性。然而，作为对这两个问题的额外保护，包含可二聚化的iC9介导的安全性开关将允许缺失表达C7R的CAR T细胞。

考虑到C7R有效应用于GD2-CAR T细胞和EphA2-CAR T细胞对抗转移性神经母细胞瘤和原位成胶质细胞瘤，C7R分子(仅作为实例)可用于增强许多其他CAR T细胞。在具体实施方案中，该相同方法增加了癌症的其他过继性细胞治疗的抗肿瘤活性，包括基于天然(Dudley，2008)或转基因TCR(Obenaus，2015)的特异性的那些以及利用NK和NKT细胞(Pellegrini，2009)的特性的那些，因为所有都对IL-7补充有反应。

材料和方法的实例

逆转录病毒载体的产生

pSFG.ΔCD34-IL7R*(pSFG.C7R)：合成了编码在碱基对731和732之间插入TTGTCCCAC的突变体IL-7Rα(Zenatti等人,Nat Genet.2011；43:932-9)的cDNA(IL7R*)(Genscript，Piscataway，NJ)。通过IN-Fusion(Takara，Mountainview，CA)克隆使用XhoI和MluI消化的SFG载体骨架、IL7R*cDNA和CD34的整个细胞外结构域(ΔCD34)产生pSFG.C7R。

pSFG.GD2-CAR、pSFG.GD2-CAR-2A-C7R(GD2-CAR.C7R)和pSFG.GD2Δ-CAR-2A-C7R(GD2-CARΔ.C7R)：合成编码n-末端前导肽、GD2特异性14g2a单链可变片段(scFv)、CD8茎和跨膜结构域以及41BB.ζ胞内结构域的cDNA(Biobasic，Marham，ON，Canada)，并通过IN-Fusion(Takara)克隆将其克隆到SFG逆转录病毒载体中位于内部核糖体进入位点(IRES)和截短的NGFR的上游。对于pSFG.GD2-CAR-2A-C7R，将GD2-CAR亚克隆到SFG载体中位于2A序列和C7R的上游。对于pSFG.GD2Δ-CAR-2A-C7R，将2A-C7R克隆到实验室中可获得的非功能性GD2-CAR(其包含14g2a scFv、短IgG1胞外结构域间隔区、CD28跨膜结构域和截短的CD28胞内结构域(RSKRSRLL；SEQ ID NO：26))的下游。

pSFG.EphA2-CAR-2A-CD19t(EphA2-CAR)、pSFG.EphA2-CAR-2A-C7R(EphA2-CAR.C7R)和pSFG.EphA2-CARΔ-2A-C7R(EphA2-CARΔ.C7R)：pSFG.EphA2-CAR-2A-CD19t编码EphA2特异性CAR，其由EphA2特异性4H5 scFv(参考文献25)、CD8细胞外间隔区、CD8跨膜结构域、41BB.ζ胞内结构域、2A序列和截短的CD19分子(CD19t)组成。通过IN-Fusion(Takara)克隆用2A-C7R替换2A-CD19t来产生pSFG.EphA2-CAR-2A-C7R。对于pSFG.EphA2-CARΔ-2A-C7R，将2A-C7R克隆到非功能性EphA2-CAR(其包含位于外部的EphA2特异性4H5scFv、CD8细胞外间隔区、CD8跨膜结构域和截短的胞内结构域)的下游。

pSFG.iC9-2A-CD19t：如先前在别处所述产生载体(Di Stasi，2011)。

所有限制酶购自New England Biolabs(Ipswich，MA)，并且所有克隆的构建体的序列由Seqwright(Houston，TX)验证。

T细胞生成

来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)在Baylor College of Medicine IRB批准的方案下获得，并具有根据赫尔辛基宣言获得的知情同意书。当单独评估CD4和CD8 T细胞时，按照制造商的说明用CD4或CD8磁选择珠(Miltenyi，Auburn，CA)标记PBMC，并进行阳性选择。对于第0天的T细胞活化，将大量或选择的T细胞悬浮在由90％RPMI 1640(Hyclone，Logan，UT)、10％胎牛血清(Hyclone)和1％Glutamax(Gibco，Grand Island，NY)组成的完全培养基中，并在包被有OKT3(CRL-8001，American Type Culture Collection[ATCC]，Manassas，VA)和CD28抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)的孔中培养以进行活化。在活化后一天加入IL-15和IL-7(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，并在第2天用逆转录病毒转导细胞。在OKT3和CD28活化后9-12天开始将T细胞用于实验。

流式细胞术

荧光染料缀合的抗体购自Biolegend(San Diego，CA；CCR7，CD45RO，NGFR)；Abnova，(Taoyuan City,Taiwan,China；CD34)；Thermo Fisher(Life Technologies，Frederick，MD；CD8)；eBioscience(San Diego,CA；CD4)；Beckman Coulter(Indianapolis,IN；CD3)；BD Biosciences(CD8，CD4，CD3，CD34，Stat5(pY694)，膜联蛋白V，7-AAD)。对于表面染色，将细胞与抗体在4℃孵育15分钟。在Beckman Coulter Galios(10,000个事件)上获得细胞，并使用Flowjo 10.0.7r2(Tree Star，Ashland，OR)进行分析。使用Flowjo 9.3.2(Tree Star)进行增殖分析。

细胞毒性测定

基于先前描述的方案并进行微小修改(Liu，2013)使用表达GFP-萤火虫荧光素酶(GFP-FFluc)的LAN-1神经母细胞瘤细胞系进行4小时基于荧光素酶的细胞毒性测定。简言之，将2×10⁴个LAN-1神经母细胞瘤细胞每孔接种在96孔黑色板(Corning，Corning，NY)中。24小时后，以不同的效应子与靶标(E：T)比率加入CAR T细胞。使用通过LAN-1细胞的连续稀释产生的标准曲线确定每孔的LAN-1细胞的存活数。用于计算细胞毒性百分比的公式如下：(未处理孔中的细胞数-测定孔中的细胞数)/(未处理孔中的细胞数)。

连续肿瘤攻击测定

用不含IL-15和IL-7的新鲜培养基在24孔板中共培养0.5×10⁶个LAN-1细胞和1×10⁶个用GD2-CAR或GD2-CAR.C7R转导的T细胞。七天后，收获细胞用于FAC分析或通过台盼蓝排除法进行T细胞定量。然后用新鲜细胞培养基中的新鲜LAN-1细胞以2：1的E：T比例重新铺板CAR T细胞以开始第二和第三肿瘤共培养。在第三次共培养结束时，计数T细胞并通过FACS分析共培养物。

定量流动分析

为了计数抗体染色的细胞，在PBS洗涤后，加入25μL的计数珠(LifeTechnologies)和2μL的7-AAD(用于死细胞排除法)，并立即分析细胞。事件的获取是基于3000个计数珠的收集。

细胞因子产生的分析

表达GD2-CAR或GD2-CAR.C7R的T细胞与LAN-1细胞一起在24孔板中在不含细胞因子的完全培养基中使用1：4的E：T比例培养。24小时后，收获上清液。使用ELISA试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)定量IFN-γ和TNF-α的释放。

磷酸化-STAT5测定

收获转导的T细胞并以0.5×10⁶个细胞/mL的无细胞因子的完全培养基重悬，然后以每孔0.5×10⁶个细胞接种于48孔组织培养板中。24-72小时后，将细胞收获到FAC管中并在冷的流动缓冲液(含有5％FBS的PBS)中洗涤。向细胞中加入100μL Fix&Perm Reagent A(Life Technologies)，轻轻涡旋，并在室温孵育3分钟，然后在恒定涡旋下将3mL冰冷的甲醇缓慢加入管中。然后将管在4℃孵育10分钟。然后，将管离心并弃去甲醇，然后用冷的流动缓冲液进行另一次洗涤步骤。然后将100μL Fix&Perm Reagent B(Life Technologies)和5μL抗STAT5抗体加入细胞中。轻轻涡旋细胞，然后在室温下在黑暗中孵育30分钟。然后，用冷的流动缓冲液再洗涤细胞一次，然后立即分析。

Cell Trace Violet增殖测定

与LAN-1肿瘤细胞单次共培养后，使用购自Thermo Fisher的试剂盒，按照制造商的说明，用Cell Trace Violet标记GD2-CAR T细胞和GD2-CAR.C7R T细胞。然后在分析前用肿瘤细胞再次攻击T细胞1周。添加7-AAD以排除死细胞。

细胞凋亡分析

将细胞与膜联蛋白V抗体和7-AAD一起孵育，并通过流式细胞术分析。对于使用iC9的实验，二聚化的化学诱导剂(CID)AP20187购自Takara Clontech。

细胞系

LAN-1和U373购自ATCC并用于产生LAN-1GFP-FFluc和U373 GFP-FFluc。如前所述建立并维持CHLA-255和CHLA-255FFluc(Liu,2012,J Clin Invest.2012Jun 1；122(6):2221-223)。使用基于酶的测定(Lonza，Rockland，ME)进行常规支原体监测，并且使用STR分析在所述实验的一年内验证细胞。

基因表达分析

使用Qiazol试剂和miRNeasy Micro Kit(Qiagen，Germantown，MD)收集总RNA。基因表达分析使用Baylor College of Medicine Genomic and RNA Profiling Core的利用nCounter分析系统的Immunology Panel版本2(NanoString，Seattle，WA)。使用nSolver3.0软件(NanoString)分析数据。

体内实验

所有动物实验均遵循Baylor College of Medicine Institutional AnimalCare and Use Committee批准的方案。

皮下神经母细胞瘤小鼠模型：将10-14周龄雌性NSG小鼠用在100μL基底膜基质胶(Corning)中的200万个LAN-1神经母细胞瘤细胞皮下植入背部左侧。8天后，基于肿瘤大小将小鼠分组，使得组肿瘤平均值和方差相似。然后向它们静脉内注射100万个GD2-CAR T细胞(PBMC分离后10-12天)。用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并且在每只小鼠腹膜内注射150mg/kg D-荧光素(Xenogen)后10-15分钟使用系统(IVIS，XenogenCorporation，Alameda，CA)在相同时间点对小鼠就来自T细胞的生物发光信号进行成像。当肿瘤直径等于或大于15mm时，或当肿瘤超过小鼠体重的10％时，将小鼠安乐死。

转移性神经母细胞瘤小鼠模型：向10-14周龄雌性NSG小鼠静脉内注射100万个表达萤火虫荧光素酶的CHLA-255细胞(CHLA-255FFluc)。7天后，给小鼠静脉内注射100万个GD2-CAR T细胞(PBMC分离后10-12天)。在平行实验中，通过如上所述的每周生物发光成像间接评估肿瘤生长或T细胞扩增。在跟踪肿瘤生长的实验中，小鼠组没有针对肿瘤负荷进行标准化，因为在T细胞注射时检测不到CHLA-255FFluc发光。

原位胶质母细胞瘤小鼠模型：如前所述(Chow,2013,Mol Ther.2013Mar；21(3):629-637)，在8周龄雄性ICR-SCID小鼠中颅内建立10⁵个U373胶质母细胞瘤细胞。肿瘤移植后7天，将10⁴个T细胞直接注射到肿瘤中。如上所述通过每周生物发光成像评估肿瘤生长或T细胞扩增。肿瘤生长实验中的小鼠针对肿瘤负荷而非方差进行标准化。

统计分析

使用用于Windows的Prism 5.0软件(Graphpad Software Inc.，La Jolla，CA)生成图和统计数据。测量数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用配对双尾t检验测试平均值之间的差异。对于小鼠实验，计算每个时间点的肿瘤辐射度相对于基线的变化，并在适当时使用双尾配对t检验或Welch t检验在组间进行比较。在适当时使用单向ANOVA和针对等方差的Bartlett检验以确保组间相似的肿瘤平均值和方差。通过Kaplan-Meier方法分析从肿瘤细胞注射时间确定的存活率，并通过对数秩检验比较组间存活率的差异。

序列表

<110> Shum, Thomas CTH

Gottschalk, Stephen MG

Omer, Bilal

Rooney, Cliona M.

<120> 用于细胞治疗的组成性活性细胞因子受体

<130> BAYM.P0192WO-11707513

<150> 62/380,021

<151> 2016-08-26

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Pro Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Pro Ile Leu Asn Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Pro Thr Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Pro Ser Ala Asn Cys Gly Ala Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Pro Ile Leu Leu Val Ser Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe

1 5 10 15

Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Pro Ile Leu Leu Ile Ile Ser Ile Gln Trp Leu Ser Phe Phe Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Asn Ser Pro Ser Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 9

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Pro Cys Leu Glu Gly Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Trp Asn Leu Leu

1 5 10 15

Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Arg Phe Cys Pro His Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Ile Lys Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Cys Val Leu Trp

20

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Pro Ile Phe His Pro Phe Asn Cys Gly Pro Ile Ser Ile Leu Ser Phe

1 5 10 15

Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25 30

<210> 14

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Pro Ile Leu Leu Met Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 15

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Gly Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Pro Ile Leu Arg Leu Gly Cys Val Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe

1 5 10 15

Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Pro Ile Pro Gln Gly Gly Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Leu Gln Ser Cys Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile

1 5 10 15

Leu Ala Cys Val Leu Trp

20

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Pro Ile Phe Pro His Gln His Cys Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe

1 5 10 15

Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 20

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Lys Cys His Leu Ser Phe Phe Ser Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 21

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

Pro Ile Leu Leu Thr Cys His Leu Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 22

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Pro Ile Phe Ser Cys Gly Pro Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe

1 5 10 15

Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Pro Ile Leu Leu Pro Pro Cys Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe

1 5 10 15

Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Pro Ile Leu Leu Thr Pro Pro Val Cys Ser Val Thr Ile Ser Ile Leu

1 5 10 15

Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20 25 30

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val

1 5 10 15

Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp

20

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

1 5

Claims (29)

1.多核苷酸，其编码工程化细胞因子受体多肽，其中所述工程化细胞因子受体是组成型活性细胞因子受体，并且其中所述多肽包含以下组分：

a)一个或多个细胞因子受体胞内结构域，其包含IL-7细胞因子受体α胞内结构域；

b)IL-7细胞因子受体α跨膜结构域，其氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成；和

c)一个或多个细胞外结构域，其中每个细胞外结构域来自CD30或CD34。

2.细胞，其包含根据权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞外结构域是CD34的细胞外结构域。

4.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为至少70个氨基酸。

5.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度不超过2000个氨基酸。

6.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为70-2000个氨基酸。

7.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为100-1000个氨基酸。

8.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为500-2000个氨基酸。

9.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为50-500个氨基酸。

10.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为100-750个氨基酸。

11.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为200-2000个氨基酸。

12.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞外结构域的长度为500-2000个氨基酸。

13.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，或者其中所述细胞是αβ细胞、干细胞或祖细胞。

14.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或先天淋巴细胞。

15.根据权利要求14所述的细胞，其中T细胞是NKT细胞、γδT细胞或粘膜相关不变T细胞(MAIT T细胞)。

16.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞包含赋予所述细胞抗原特异性的非天然分子。

17.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞还包含至少一种另外的工程化受体。

18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述另外的工程化受体是组成型活性细胞因子受体、嵌合抗原受体、重组T细胞受体、双特异性T细胞衔接器、双亲和力重新靶向(DART)蛋白质或其组合。

19.根据权利要求2所述的细胞，其中所述细胞是T细胞，其包含至少一种嵌合抗原受体。

20.根据权利要求2所述的细胞，其中所述多核苷酸进一步定义为表达载体。

21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述表达载体是病毒载体。

22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

23.多个细胞，所述细胞是根据权利要求2-15中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含干细胞、祖细胞或免疫效应细胞中的一种或多种的混合物。

24.根据权利要求23的多个细胞，其中免疫效应细胞是T细胞、NK细胞或先天淋巴细胞。

25.根据权利要求23的多个细胞，其中T细胞是NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞或粘膜相关不变T细胞(MAIT T细胞)。

26.扩增细胞群的方法，其包括在权利要求2-22中任一项所述的细胞中表达所述多核苷酸的步骤，其中所述细胞是体外的。

27.多肽，其由根据权利要求1所述的多核苷酸编码。

28.免疫细胞在制备药物中的用途，所述免疫细胞表达(1)靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体；和(2)组成型活性细胞因子受体，所述药物用于治疗个体的癌症的方法，其中所述癌症表达所述肿瘤抗原，并且其中所述方法包括向所述个体施用所述免疫细胞，其中所述组成型活性细胞因子受体包含以下组分：a)一个或多个细胞因子受体胞内结构域，其包含IL-7细胞因子受体α胞内结构域；b)IL-7细胞因子受体α跨膜结构域，其由SEQ ID NO：2组成；和c)一个或多个细胞外结构域，其中每个细胞外结构域来自CD30或CD34。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述肿瘤抗原是GD2、EphA2、EphA3、HER2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD96、CD123、CD138、CD171、CEA、CLL-1、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、TAG72、TEM8、Tn-O-糖肽、VEGFR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体、TSHR、CS-1、CMA、TnAg、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、FLT3、CD44v6、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PRSS21、VEGFR2、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、前列腺素酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、突变的hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或lGLL1，并且其中所述癌症是成胶质细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、皮肤癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌或甲状腺癌。