KR20090125840A - 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

Abstract

인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 관련 항체-기재의 조성물 및 분자를 개시한다. 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 인간 모노클로날 항체의 여러 이소타입을 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산될 수 있다. 또한, 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 상기 인간 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 동물 및 하이브리도마 및 상기 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법도 개시한다.

EGFR, 항체, 조성물, 이소타입, 트랜스제닉

Description

표피 성장 인자 수용체 (ＥＧＦＲ)에 대한 인간 모노클로날 항체 {Human Monoclonal Antibodies to Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)}

본 발명은 EGFR의 발현과 관련이 있는 질환, 특히 EGFR-발현 종양 및 자가면역 질환을 치료 및 예방하기 위한 개선된 항체 치료제를 제공한다.

관련 출원

본 출원은 2001년 6월 13일자로 출원된 미국 가출원 제60/298,172호를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

EGF 수용체 (EGFR)는 170 kDa의 제1형 막횡단 분자이다. 이의 발현은 두부(頭部) 및 목, 유방, 결장, 전립선, 폐 및 난소의 암종 등을 비롯한 많은 인간 종양에서 상승조절되는 것으로 밝혀졌다. 과발현 정도는 불량한 임상적 예후와 상관관계가 있다 ([Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154], [Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology 4:277-296]). 추가로, 이의 발현은 EGFR-발현 종양 세포에 의한 EGFR 리간드, 특히 TGF-α 및 EGF의 생산을 종종 수반하는데, 이는 자가분비 루프가 이들 세포의 발병에 관여함을 시사한다 ([Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154], [Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology. 4:277-296]). 따라서, 이러한 EGFR 리간드와 EGFR 사이의 상호작용 차단은 종양 성장 및 생존을 억제할 수 있다 [Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154].

EGFR의 리간드-결합 도메인에 대해 지시된 모노클로날 항체 (MAb)는 EGF 및 TGF-α와의 상호작용 및 이에 따른 세포내 신호전달 경로를 차단할 수 있다. 이러한 시험관내 차단을 달성하는 여러가지 뮤린 (murine) 모노클로날 항체를 생성하여 마우스 이종이식편 모델에서 종양 성장에 대한 영향력을 평가하였다 ([Masui, et al. (1986) Cancer Res. 46:5592-5598], [Masui, et al. (1984) Cancer Res. 44:1002-1007], [Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:1311-1318]). 인간 종양 세포에 투여한 경우, 대부분의 항-EGFR MAb는 무흉선 마우스에서의 종양 형성 예방에 효능이 있었다 [Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154]. 그러나, 확립된 인간 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에 주사한 경우, 이들 뮤린 MAb (예를 들어 MAb 225 및 528)는 단지 부분적 종양 퇴행만을 초래했다. 종양을 완전히 근절하기 위해서는 화학요법제의 공동투여가 필요하다 ([Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154], [Fan, et al. (1993) Cancer Res. 53:4322-4328], [Baselga, et al. (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85:1327-1333]).

이와 같이, 최근까지 얻은 결과들은 EGFR를 면역요법을 위한 표적으로서 명백하게 확립하였으나, 이들은 또한 뮤린 항체가 이상적인 치료제를 구성하지 않음 을 나타냈다. 또한, 뮤린 항체를 사용한 치료법은 환자에서 심각한 면역 반응을 촉발한다. 마우스 항체의 면역원성을 피하기 위해서, 상기 치료제가 이상적으로는 완전한 인간 항체여야 한다. 이러한 목표 달성을 위한 단계로서, 마우스 항체 가변 영역이 인간 불변 영역에 연결된 키메라 버전의 225 MAb (C225)가 개발되었다. C225는 생체내에서 확립된 이종이식편 종양의 치료시에 개선된 항-종양 활성을 나타냈지만, 이는 오직 높은 투여량에서만 달성되었다 [Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:1311-1318]. 최근, C225는 각종 유형의 충실성 종양 치료를 위한 임상 시험에서 평가되고 있다 ([Baselga, J. (2000) J. Clin. Oncol. 18:54S-59S], [Baselga, J. (2000) Ann. Oncol. 11 Suppl 3:187-190, 2000]).

따라서, 낮은 투여량으로 투여될 경우에 EGFR의 과발현과 관련된 질환의 치료 및(또는) 예방에 효과적이지만 환자에서의 면역 반응은 유발하지 않는, EGFR에 대한 개선된 치료 항체가 필요하다. 상기 기재한 바와 같이, 모노클로날 항체 (MAb)는 질환에 대한 많은 진단 및 치료 접근법에서 중요한 역할을 수행하고, 완전한 인간 항체를 개발할 수 있게 하는 최근의 기술 도약과 함께 훨씬 더 관심을 끌게 되었다. 항체 및 항체 유도체는 최근 개발중인 생물학적 약물의 25％를 차지하고, 이들 중 많은 것들이 암 치료제로서 개발되고 있다. 항체는 표적 특이성 및 면역계를 효과적으로 유발할 수 있는 능력을 겸비한다. 이러한 성질의 겸비 및 이들의 장기간의 생물학적 반감기로 인해, 연구가들은 항체의 치유적 잠재력에 대해 주목하게 되었다. 최근, 미국 식약청 (FDA)은 암 치료를 위한 여러가지 항체에 대해 집중적으로 승인하고 있다.

발명의 요약

본 발명은 EGFR의 발현과 관련이 있는 질환, 특히 EGFR-발현 종양 및 자가면역 질환을 치료 및 예방하기 위한 개선된 항체 치료제를 제공한다. 상기 항체는 완전한 인간 항체 (본원에서 "HuMAb (등록상표)"라고 지칭함)여서, 환자에서의 면역원성이 덜하다는 점에서 개선된 것이다. 또한, 상기 항체는 기존에 보고된 다른 항-EGFR 항체의 투여량보다 더 낮은 투여량에서 치료 효과적이다 (예를 들어 EGFR-발현 세포의 성장 및(또는) 기능을 저해함). 또한, 특정 실시양태에서, 상기 항체는 보체를 활성화시키지 않아서 (예를 들어 표적 세포의 보체-매개 용해를 유도하지 않음) 치료 동안의 불리한 부작용을 감소시킨다는 추가의 이점이 있다.

따라서, 본 발명은 한 실시양태에서에서 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 뿐 아니라 이러한 항체 1종 또는 이들의 배합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 인간 항체는 EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합, 예를 들어 EGF 및 TGF-α의 결합을 억제 (예를 들어 차단)한다. 예를 들면, EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합이 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％ 억제될 수 있어서, 바람직하게는 세포의 EGFR-매개 신호전달이 저해된다.

본 발명의 바람직한 인간 항체는 인간 이펙터 (effector) 세포 (예를 들어 다형핵 세포, 단핵구, 대식세포 및 수상돌기세포)의 존재하에서 EGFR-발현 세포의 성장을 억제하고(하거나) 그의 사멸 (예를 들어 용해 또는 식작용)을 매개 (시험관내 또는 생체내)하지만, EGFR-발현 세포의 보체-매개 용해는 활성화시키지 않는다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내 및 시험관내 진단제 또는 치료제로서 사용할 수 있다.

본원에 예시한 한 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 보유한 IgG1 (예를 들어 IgG1κ) 항체이다. 그러나, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 등을 비롯한 다른 항체 이소타입 (isotype)도 본 발명에 포함된다. 상기 항체는 온전한 항체일 수 있고, 또는 Fab, F(ab')₂, Fv 및 Fv쇄 단편 등을 비롯한 상기 항체의 항원-결합 단편일 수 있다.

특별한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 가변 영역에 서열 1 및 서열 3 각각에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩된다. 다른 실시양태에서, 인간 항체는 서열 2 및 서열 4 각각에 나타낸 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 특별한 실시양태에서, 인간 항체는 항체 2F8에 상응하거나 항체 2F8과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 (예를 들어 2F8과 경쟁하는 항체)에 상응하거나, 또는 항체 2F8과 동일한 기능적 결합 특성을 갖는다.

본 발명의 인간 항체는 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 트랜스펙토마 (transfectoma) (예를 들어 불멸화 CHO 세포 또는 림프구성 세포 로 구성된 트랜스펙토마) 등과 같은 숙주 세포에서 재조합적으로 생산할 수 있고, 또는 상기 항체를 발현하는 하이브리도마 (예를 들어 상기 항체를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 수득하여 불멸화 세포에 융합시킨 B 세포를 포함함)로부터 직접 수득할 수도 있다. 특별한 실시양태에서, 상기 항체는 본원에서 2F8이라고 지칭하는 하이브리도마 또는 가변 영역에 서열 1 및 서열 3 각각에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산을 함유하는 숙주 세포 (예를 들어 CHO 세포) 트랜스펙토마에 의해 생산된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항-EGFR 항체는 하기의 성질 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다:

a) EGFR에 대한 특이성;

b) EGFR에 대한 결합 친화도가 평형 결합 상수 (K_A) 약 10⁷ M^-1 이상, 바람직하게는 약 10⁸ M^-1 이상, 약 10⁹ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10¹⁰ M^-1 내지 10¹¹ M^-1 이상;

c) EGFR로부터의 해리 상수 (K_D) 약 10^-3 s^-1, 바람직하게는 약 10^-4 s^-1, 더욱 바람직하게는 10^-5 s^-1, 가장 바람직하게는 10^-6 s^-1;

d) EGFR-발현 세포를 옵소닌화시키는 능력 또는

e) 약 10 ㎍/mL 이하 농도에서 인간 이펙터 세포 존재하에 EGFR-발현 세포 (예를 들어 종양 세포)의 성장을 억제하고(하거나) 그의 식작용 및 사멸을 매개 (예를 들어 시험관내)하는 능력.

본 발명의 인간 항체에 의해 표적화 (예를 들어 옵소닌화)될 수 있는 EGFR-발현 종양 세포의 예로는 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신(腎) 세포, 편평 세포, 폐 (비-소 (non-small) 세포) 또는 두부 및 목의 종양 세포 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 EGFR-발현 세포로는 예를 들어 관절염 및 건선의 치료에 있어서 각각의 표적 세포로서 사용될 수 있는 활액 섬유아세포 및 각질세포 등이 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 EGFR 항원에 약 10⁸ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10⁹ M^-1 또는 10¹⁰ M^-1 이상의 친화도 상수로 결합하고, 인간 이펙터 세포, 예를 들어 다형핵 세포 (PMN), 단핵구 및 대식세포에 의한 EGFR-발현 세포의 성장 억제 및(또는) 식작용 및 사멸 매개를 약 1 ×10^-7 M 이하의 IC₅₀으로 달성하거나 약 10 ㎍/mL 이하의 시험관내 농도에서 달성할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 EGFR에 의해 매개되는 세포의 신호전달을 억제한다. 예를 들면, 상기 항체는 EGFR 리간드 (예를 들어 EGF 또는 TGF-α)에 의해 유도된 EGFR의 자가인산화를 억제할 수 있다. 또한, 상기 항체는 자가분비 EGF 또는 TGF-α로 유도된 세포 활성화를 억제하거나 인간 다형핵 세포의 존재하에서 EGFR-발현 세포의 용해 (ADCC)를 유도할 수 있다. EGFR-발현 세포로는 특히 방광 세포, 유방 세포, 결장 세포, 신장 세포, 난소 세포, 전립선 세포, 신 세포, 편평 세포, 비-소 폐 세포, 활액 섬유아세포 및 각질세포 등이 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 이러한 벡터로 형질감염된 숙주 세포 및 이러한 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 포함되며, 예를 들어 하이브리도마에 의해 생산된 항체 2F8의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 항-EGFR 항체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물로부터의 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 단리된 B 세포는 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화된 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 수득한다. 상기 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스는 본 발명의 항체 전체 또는 그의 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 것이 바람직하다. 그 후, 단리된 B-세포를 불멸화시켜 인간 항-EGFR 항체의 공급원 (예를 들어 하이브리도마)을 제공한다.

따라서, 본 발명은 EGFR에 특이적으로 결합하는 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 하 이브리도마는 본 발명의 항체 전체 또는 그의 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 수득하여 불멸화 세포에 융합시킨 B 세포를 포함한다. 본 발명의 특정 하이브리도마는 2F8을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 EGFR에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 (본원에서 "HuMAb"라고도 지칭함) 등의 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 특별한 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 비-인간 동물은 본 발명의 항체 전체 또는 그의 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스이다. 상기 트랜스제닉 비-인간 동물은 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환 (switching)을 통해 EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소타입 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어 고전적 또는 비-고전적 이소타입 전환에 의한 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 EGFR과 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 항체 전체 또는 그의 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물을 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화시키는 단계를 포함한다. 그 후에, 상기 동물의 B 세포 (예를 들어 비장 B 세포)를 수득하고 골수종 세포와 융합시켜 EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성한다.

다른 측면에서, 본 발명의 인간 항-EGFR 항체는 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어 Fab' 단편)으로 유도체화되거나, 그에 연결되거나 또는 그와 동시발현된다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분은 1개 이상의 다른 분자적 인자, 예를 들어 다른 항체 (예를 들어 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산하기 위함), 사이톡신 (cytoxin), 세포의 리간드 또는 항원에 기능적으로 연결 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 결합 등을 통한 연결)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 매우 다양한 항체 접합체, 이중특이적 분자, 다중특이적 분자 및 융합 단백질을 포함하며, 이들 모두가 EGFR-발현 세포에 결합하고 다른 분자를 상기 세포에 표적화시키거나 EGFR 및 다른 분자 또는 세포에 결합한다.

특별한 실시양태에서, 본 발명은 EGFR에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 (예를 들어 인간 항-EGFR 항체 또는 그의 단편 또는 모방체) 및 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα 수용체 또는 항원 제시 세포 (APC)상의 다른 항원에 대한 제2 결합 특이성을 보유하는 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자를 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 1종 이상의 항체 또는 그의 단편 (예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 단일쇄 Fv), 바 람직하게는 인간 항체 또는 그의 일부를 포함하거나, 또는 "키메라" 또는 "인간화" 항체 또는 그의 일부 (예를 들어 가변 영역 또는 적어도 상보성 결정 영역 (CDR)은 비-인간 항체 (예를 들어 뮤린)로부터 유래하고, 나머지 부분(들)은 인간에서 기원함)를 포함한다.

따라서, 본 발명은 인간 EGFR 및 Fc 수용체 (예를 들면, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 같은 Fc-감마 수용체 (FcγR) 등의 인간 IgG 수용체) 모두에 결합하는 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 포함한다. 다른 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgA 수용체 (예를 들어 FcαRI)도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 활성화된 다형핵 세포의 표면상에 위치하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 Fc (예를 들어 IgG 또는 IgA) 결합 부위와는 별개의 부위에서 상기 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자의 결합은 생리적 수준의 이뮤노글로불린에 의해서는 차단되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 세포독성 약물, 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 방사성동위원소 또는 소분자 항암 약물 등과 같은 치료 성분에 연결된 본 발명의 인간 항-EGFR 항체를 포함하는 접합체를 제공한다.

별법으로, 본 발명의 인간 항체는 치료제 및 세포독성제와 연결되지 않은 채로 공동투여될 수 있다. 이들은 상기 작용제와 동시에 공동투여 (예를 들어 단일 조성물 중에 또는 따로)될 수도 있고 또는 상기 작용제의 투여 전 또는 이후에 투 여될 수도 있다. 이러한 작용제로는 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스프아미드 히드록시우레아와 같은 화학요법제 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 항체는 방사능 요법을 병행하면서 투여할 수도 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물/키트 및 진단용 조성물/키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 배합물을 포함하며, 바람직하게는 이들 각각이 별개의 에피토프에 결합한다. 예를 들면, 이펙터 세포의 존재하에서 표적 세포의 고도로 효과적인 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 EGFR-발현 세포의 성장을 억제하는 다른 인간 모노클로날 항체와 배합될 수 있다. 따라서, 상기 배합물은 최대의 치료 이점을 제공하도록 조절된 여러 요법을 제공한다. 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 본 발명의 1종 이상의 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자의 배합물을 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물도 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 본 발명의 인간 항체 및 관련 조성물을 사용하여 EGFR-발현 세포의 증식 및(또는) 성장을 억제하고(하거나) EGFR-발현 세포의 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 인간 이펙터 세포의 존재하에 EGFR-발현 세포를 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 인간 모노클로날 항체 중 하나 또는 이들의 배합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 시험관내 또는 생체외 배양물 (예를 들어 EGFR-발현 세포 및 이펙터 세포를 포함하는 배양물)에 이용할 수 있다. 예를 들면, EGFR-발현 세포 및 이펙터 세포를 함유하는 샘플을 시험관내 배양하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 (또는 본 발명의 이중특이적 분자 또는 다중특이적 분자)과 합할 수 있다. 별법으로, 상기 방법은 대상체에서 예를 들어 생체내 (예를 들어 치료 또는 예방적) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.

EGFR-발현 (예를 들어 과발현)과 관련이 있는 질환의 생체내 치료 및 예방에 사용하기 위해서, 본 발명의 인간 항체를 환자 (예를 들어 인간 대상체)에게 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 주사 및 항체-기재의 임상용 제품 업계에 공지된 다른 투여 경로를 통해 치료 유효 투여량 (예를 들어 EGFR를 발현하는 종양 세포의 성장 억제, 식작용 및(또는) 사멸을 초래하는 투여량)으로 투여한다.

본 발명의 인간 항체를 사용하여 치료하고(하거나) 예방할 수 있는 전형적인 EGFR-관련 질환으로는 자가면역 질환 및 암 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 치료하고(하거나) 예방할 수 있는 암의 예로는 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 난소암, 전립선암, 신 세포암, 편평 세포암, 폐암 (비-소 세포암), 두부암(頭部癌) 및 목암 등이 있다. 치료할 수 있는 자가면역 질환의 예로는 건선 및 염증성 관절염, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스-관련 관절염 및 건선 관절염 등이 있다.

한 실시양태에서, 환자를 화학요법제, 방사능 또는 Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체 등과 같은 Fc 수용체의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제, 예를 들어 상기 발현 또는 활성을 강화시키거나 억제하는 작용제 (예를 들어 사이토킨)으로 추가로 처치한다. 치료하는 동안 투여하기 위한 전형적인 사이토킨으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 등이 있다. 전형적인 치료제는 특히 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스프아미드 히드록시우레아 등과 같은 항-신생물제를 포함한다.

EGFR를 고도로 발현하지 않는 암 세포에 대한 본 발명의 인간 항-EGFR 항체의 치료 효능을 증가시키기 위해서, 상기 항체를 EGFR의 발현을 상승조절하거나 달리 영향을 미치는 작용제, 예를 들어 종양 세포상에서 EGFR를 상승조절하고 그를 더욱 균질 발현되도록 하는 림포킨 (lymphokine) 제제와 공동투여할 수 있다. 투여에 적합한 림포킨 제제로는 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 및 이들의 배합물 등이 있다. 이들은 정맥내 투여될 수 있다. 전형적으로, 림포킨의 적합한 투여량은 환자 당 10,000 내지 1,000,000 유닛의 범위이다.

다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 EGFR-관련 질환을 진단하기 위해서 샘플 중 EGFR 항원의 존재를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 부분)과 EGFR 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건하에서 시험할 샘플을 임의로는 대조군 샘플과 병용하여 상기 항체와 접촉시킴으로써 달성된다. 그 후, 복합체 형성을 검출 (예를 들어 ELISA를 사용하여 검출함)한다. 시험 샘플과 병용하여 대 조군 샘플을 사용할 경우에는 이들 2가지 샘플 모두에서 복합체를 검출하는데, 이들 샘플 사이에서 복합체 형성에 임의의 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것이 시험 샘플 중에 EGFR 항원이 존재한다는 지표이다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기하는 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백하다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 표피 성장 인자 수용체 항원 (본원에서 "EGFR"이라고 지칭함)의 발현, 특히 과발현을 특징으로 하는 질환을 치료하고 진단하기 위한 새로운 항체-기재의 요법을 제공한다. 본 발명의 요법은 EGFR상에 존재하는 에피토프에 결합하는 단리된 인간 IgG 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 사용한다. 본 발명에 포함되는 다른 단리된 인간 모노클로날 항체로는 IgA, IgG1-4, IgE, IgM 및 IgD 항체 등이 있다. 한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통하여 EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소타입 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스 등의 비-인간 트랜스제닉 동물에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 측면은 항체, 그의 항체 단편 및 제약 조성물 뿐만 아니라 모노클로날 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 동물, B-세포, 숙주 세포 트랜스펙토마 및 하이브리도마도 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 EGFR-발현 세포 또는 관련된 교차-반응성 성장 인자 수용체를 검출하거나 EGFR-발현 세포의 성장, 분화 및(또는) 운동성을 시험관내 또는 생체내 억제하는 방법도 본 발명에 포함된다.

본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 먼저 특정 용어들을 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.

"표피 성장 인자 수용체", "EGFR" 및 "EGFR 항원"이라는 용어는 본원에서 서로 바꿔 사용되며, 인간 EGFR의 변형체, 이소형 (isoform) 및 종 상동체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, EGFR-항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합을 억제하거나 차단함으로써 EGFR-발현 세포 (예를 들어 종양 세포)의 성장을 억제한다. "EGFR 리간드"라는 용어는 EGF, TGF-α, 헤파린 결합 EGF (HB-EGF), 암피레귤린 (AR) 및 에피레귤린 (EPI) 등을 비롯하여 EGFR에 대한 모든 (예를 들어 생리적) 리간드를 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, EGFR 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 EGFR-발현 세포의 이펙터 세포 식작용 및(또는) 사멸을 매개한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "성장 억제" (예를 들어 세포를 언급할 때 사용됨)라는 용어는, 항-EGFR 항체와 접촉하지 않은 세포의 성장에 비교하여 항-EGFR 항체와 접촉한 동일 세포의 성장에 있어서의 임의의 측정가능한 감소를 포함하는 것이며, 예를 들어 세포의 성장이 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 99％ 또는 100％만큼 억제되는 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "결합 억제" 및 "결합 차단" (예를 들어 EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합 억제/차단을 언급할 때 사용됨)이라는 용어는 서로 바꿔 사용되며, 부분적 및 완전한 억제/차단 모두를 포함한다. EGFR에 대한 EGFR 리간드의 억제/차단은, EGFR 리간드가 이렇게 억제 또는 차단되지 않은 상태로 EGFR에 결합할 경우에 일어나는 세포 신호전달의 정상적인 수준 또는 유형을 감소시키거나 변경시키는 것이 바람직하다. 또한, 억제 및 차단은 항-EGFR 항체와 접촉하지 않은 리간드와 비교하여 항-EGFR 항체와 접촉한 경우에 EGFR에 대한 EGFR 리간드의 결합 친화도에 있어서의 임의의 측정가능한 감소를 포함하는 것이며, 예를 들어 EGFR에 대한 EGFR 리간드가 적어도 약 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 99％ 또는 100％만큼 차단되는 것이다.

"항체"라는 용어는 본원에서 지칭하는 바와 같이 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉,"항원-결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 중쇄 (H) 및 2개 이상의 경쇄 (L) 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 과가변 영역들로 더 나눌 수 있는데, 이들에는 프레임워크 (framework) 영역 (FR)이라 불리는 더욱 보존된 영역이 존재한다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음과 같은 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 각종 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (C1q) 등을 비롯 한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항체 (또는 단순히 "항체 부분")의 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원 (예를 들어 EGFR)에 대한 특이적 결합력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀진 바 있다. 항체의 "항원결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합으로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 등이 있다. 추가로, Fv 단편의 2개 도메인들인 VL 및 VH는 별개의 유전자들에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 이용하여 VL 및 VH 영역들이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음, 예를 들어 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 만들 수 있게 하는 합성 링커 (linker)에 의해 이들을 연결시킬 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득하고, 이들 단편을 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다.

"에피토프"라는 용어는 항체에 대한 특이적 결합이 가능한 단백질 결정부위를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄 등과 같은 분자들이 모여있는 화학적 활성 표면으로 구성되고, 일반적으로 특정한 3차원적 구조 특성 및 특정 전하 특성을 갖는다. 구조적 에피토프와 비-구조적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 구조적 에피토프에 대한 결합은 소실되는데 반해 비-구조적 에피토프에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

"이중특이적 분자"라는 용어는 2가지의 상이한 결합 특이성을 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드 또는 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들면, 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체에 결합하거나 그들과 상호작용할 수 있다. "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"라는 용어는 2가지 초과의 상이한 결합 특이성을 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드 또는 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들면, 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면상의 Fc 수용체 및 (c) 1종 이상의 다른 성분에 결합하거나 그들과 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 EGFR 등과 같은 세포 표면 항원 및 이펙터 세포상의 Fc 수용체 등과 같은 다른 표적에 대해 지시된 이중특이적 분자, 삼중특이적 분자, 사중특이적 분자 및 기타의 다중특이적 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또한, "이중특이적 항체"라는 용어는 디아바디 (diabody)를 포함한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄상에서 발현되지만, 동일 쇄상의 2개 도메인 사이에서 쌍을 이루기에는 너무 짧은 링커를 사용하기 때문에 상기 도메인 들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, "이종항체"라는 용어는 함께 연결되어 있는 2종 이상의 항체, 항체 결합 단편 (예를 들어 Fab), 그로부터의 유도체 또는 항원 결합 영역으로서 이들 중 둘 이상은 서로 다른 특이성을 갖는 것을 지칭한다. 이러한 상이한 특이성은 이펙터 세포상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성 및 표적 세포, 예를 들어 종양 세포상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 보유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"라는 용어는 인간 배선 (germline) 이뮤노글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"라는 용어는 마우스 등과 같은 다른 포유동물 종의 배선에서 유래된 CDR 서열을 인간 프레임워크 서열로 이식한 항체는 포함하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, "인간 모노클로날 항체"라는 용어는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열으로부터 유래한 가변 영역 및 불변 영역을 보유하는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 수득하여 불멸화 세포에 융합시킨 B 세포 등을 비롯한 하이브리도마에 의해 생산된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 인간 항체"라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 모든 인간 항체를 포함하며, 예를 들어 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어 마우스)로부터 단리하거나 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리한 항체 (하기 단락 I에서 추가로 기재함), (b) 형질전환되어 항체를 발현하는 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리한 항체, (c) 재조합 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리한 항체 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱하는 것을 비롯한 임의의 다른 수단으로 제조되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 항체이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래한 가변 영역 및 불변 영역을 보유한다. 그러나, 특정 실시양태에서는 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용할 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)시키기 때문에, 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래하며 이와 관련이 있지만 생체내 인간 항체 배선 레파토리 (repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이종 항체"는 그러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 상기 트랜스제닉 비-인간 동물을 구성하는 것이 아닌 유기체, 일반적으로는 상기 트랜스제닉 비-인간 동물이 아닌 다른 종에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 보유하는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이종하이브리드 항체"는 경쇄 및 중쇄가 서로 다른 유기체에서 기원한 항체를 지칭한다. 예를 들면, 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 보유하는 항체가 이종하이브리드 항체이다. 이종하이브리드 항체의 예로는 상기 문헌에서 논의한 키메라 항체 및 인간화 항체 등이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 상태의 항체를 지칭한다 (예를 들어 EGFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 EGFR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 인간 EGFR의 에피토프, 이소형 또는 변형체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 관련 항원 (예를 들어 EGFR 종 동족체)와의 교차-반응성을 보유할 수 있다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포내 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 특이성을 보유하는 "단리된" 모노클로날 항체들의 배합물을 잘 규정된 조성물 중에 포함시킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 예정된 항원에 대한 항체 결합 을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 예정된 항원에 약 1 ×10⁷ M^-1 이상의 친화도로 결합하고, 예정된 항원 또는 밀접한 관계가 있는 항원이 아닌 비-특이적 항원 (예를 들어 BSA, 카제인)에 대한 결합 친화도보다 적어도 2배 초과의 친화도로 예정된 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체"와 "항원에 특이적인 항체"라는 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 서로 바꿔 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고 친화도"라는 용어는 약 10⁷ M^-1 이상, 바람직하게는 약 10⁸ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10⁹ M^-1 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1, 10¹² M^-1 이상, 예를 들어 10¹³ M^-1 이하 또는 초과의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, "고 친화도" 결합은 다른 항체 이소타입에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, IgM 이소타입에 대한 "고 친화도" 결합은 약 1 ×10⁷ M^-1 이상의 결합 친화도를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "K_A"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "K_D"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이소타입 전환"은 항체 클래스 또는 이소타입 을 어떠한 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스 중 하나로 변화시키는 현상을 지칭한다

본원에서 사용된 바와 같이, "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않고 생산된 중쇄의 이소타입 클래스를 지칭하며, 전환되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자 바로 하류의 첫번째 CH 유전자인 것이 전형적이다. 이소타입 전환은 고전적 또는 비-고전적 이소타입 전환으로 분류되어 왔다. 고전적 이소타입 전환은 트랜스진 중 1개 이상의 전환 서열 영역을 포함하는 재조합 사건에 의해 일어난다. 비-고전적 이소타입 전환은 예를 들어 인간 σ_μ 및 인간 ∑_μ (δ-관련 결실) 사이의 상동성 재조합에 의해 일어날 수 있다. 특히 트랜스진 사이의 재조합 및(또는) 염색체 사이의 재조합 등과 같은 별법의 비-고전적 전환 메카니즘이 일어나서 이소타입 전환을 달성할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "전환 서열"이라는 용어는 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 지칭한다. "전환 공여자" 서열, 전형적으로 μ 전환 영역은 전환 재조합 동안 결실된 구조물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실된 구조물 영역과 대체 불변 영역 (예를 들어 γ, ε 등) 사이일 것이다. 재조합이 항상 발생하는 특정 부위는 없기 때문에, 최종 유전자 서열은 구조물로부터 예측할 수 없는 것이 전형적이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "글리코실화 양상"은 단백질, 더욱 구체적으로 는 이뮤노글로불린 단백질에 탄수화물 단위들이 공유결합으로 부착된 양상으로 정의된다. 당업자가 이종 항체의 글리코실화 양상이 트랜스진의 CH 유전자가 유래된 종보다 비-인간 트랜스제닉 동물 종에서의 글리코실화 양상에 더욱 유사하다고 인식할 경우에는, 이종 항체의 글리코실화 양상이 비-인간 트랜스제닉 동물 종이 생산하는 항체상에서 천연적으로 발생하는 글리코실화 양상과 실질적으로 유사하다고 특징지을 수 있다.

본원에서 어떤 대상물에 대하여 적용시켜 사용한 바와 같이, "천연 발생"이라는 용어는 그 대상물이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들면, 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있으며 인간이 실험 중에 고의로 변형시킨 것이 아닌, 유기체 (바이러스를 포함함) 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재배열"이라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위에서 V 절편이 D-J 또는 J 절편에 바로 인접하게 위치하여 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 구조인 형상을 지칭한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자의 좌위는 배선 DNA와의 비교를 통해 확인할 수 있고, 재배열된 좌위는 1종 이상의 재조합된 7량체/9량체 상동성 요소를 보유할 것이다.

본원에서 V 절편과 관련하여 사용된 바와 같이, "재배열되지 않은" 또는 "배선 형상"이라는 용어는 V 절편이 D 또는 J 절편에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 형상을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자 를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

본원에서 EGFR에 결합하는 항체 또는 항체 부분 (예를 들어 VH, VL, CDR3)을 코딩하는 핵산과 관련하여 사용된 바와 같이, "단리된 핵산 분자"라는 용어는 상기 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 EGFR 이외의 항원과 결합하는 항체 또는 항체 부분을 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산 분자를 지칭하며, 상기한 다른 뉴클레오티드 서열은 인간 게놈 DNA 중에서 상기 핵산을 천연적으로 플랭킹 (flank)하고 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항-EGFR 항체 또는 그의 일부는 2F8의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 뿐 아니라 서열 1과 서열 3 및 서열 2와 서열 4 각각에 나타낸 서열의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다.

본원에 개시하고 청구한 바와 같이, 서열 1 내지 서열 4에 기재한 서열은 "보존적 서열 변형", 즉, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나 상기 특성을 유의하게 변경시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형으로는 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실 등이 있다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법에 의해 서열 1 내지 서열 4에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 어떠한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유한 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기들의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이들 군으로는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등이 있다. 따라서, 인간 항-EGFR 항체에서 불필수 아미노산 잔기라고 예측되는 것은 동일 측쇄 군에 속하는 다른 아미노산 잔기로 바람직하게 대체된다.

별법으로, 다른 실시양태에서는 예를 들어 포화 돌연변이유발법 등을 통해 항-EGFR 항체 코딩 서열의 전체에 걸쳐 또는 그의 일부에 돌연변이를 무작위로 도입할 수 있고, 이로 인한 변형된 항-EGFR 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.

따라서, 본원에서 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고(되거나) 본원에서 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열 (즉, 서열 1 내지 서열 4)을 함유하는 항체는 보존적으로 변형된 유사 서열에 의해 코딩되거나 이를 함유하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 이러한 실질적으로 유사한 항체를 본원에서 서열 1 내지 서열 4로 개시한 부분적 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 서열에 기초하여 생성할 수 있는 방법에 관한 추가의 논의는 하기에 제공한다.

핵산의 경우, "실질적 상동성"이라는 용어는 2가지 핵산 또는 그의 지정된 서열이 적당한 뉴클레오티드를 삽입 또는 결실시키면서 최적으로 정렬되고 비교될 경우에 그 뉴클레오티드의 약 98％ 이상, 일반적으로는 약 90％ 내지 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 98％ 내지 99.5％ 이상에서 동일함을 가리킨다. 별법으로, 절편들이 선택적 혼성화 조건하에서 그 가닥의 상보체와 혼성화될 경우에는 실질적 상동성이 존재한다.

2가지 서열 사이의 동일성(％)은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 그 서열들이 공유하는 동일 부위의 수에 관한 함수 (즉, 상동성(％) = 동일 부위의 수/부위의 총 수 ×100)로서, 그들 2개 서열의 최적 정렬을 도입할 필요가 있다. 2가지 서열 사이에서의 서열 비교 및 동일성(％) 측정은 하기한 비제한적인 예에 기재한 바와 같은 수학적 알고리즘을 통해 달성할 수 있다.

2가지 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(％)은 GCG 소프트웨어 패키지 (package)에서의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)을 이용하여 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 중량 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 측정할 수 있다. 2종의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은 ALIGN 정렬 프로그램 (버전 2.0)에 도입되었던 이. 메이어스 (E. Meyers)와 더블유. 밀러 (W. Miller)의 알고리즘 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]을 이용하여 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4로 측정할 수도 있다. 또한, 2종의 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 도입되었던 니들맨 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch)의 알고리즘 [J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]을 이용하여 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 측정할 수도 있다.

추가로, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "쿼리 (query) 서열"로서 이용하여 공개 데이터베이스에서 검색을 수행함으로써, 예를 들어 관련 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램 (스코어 = 100, 워드 길이 = 12)을 이용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행함으로써 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 워드 길이 = 3)을 이용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적의 갭 정렬을 얻기 위해서는, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우에는 각 프로그램 (예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.

핵산은 부분적으로 정제된 형태이거나 실질적으로 순수한 형태로 온전한 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산이 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 그 외 당업계에 공지되어 있는 다른 기술 등을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 세포성 핵산 또는 단백질 등과 같은 다른 오염물질로부터 정제된 경우, 상기 핵산은 "단리된" 것이거나 또는 "실질적으로 순수한 형태로 된" 것이다 (문헌 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조).

cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한 효소 부위 등은 제외함), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이는 원하는 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 본원에서는 특히 천연 V 서열, D 서열, J 서열, 불변 서열, 전환 서열, 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유래한 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유래"은 한 서열이 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것임을 의미함).

핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 위치하고 있을 때, 이 핵산은 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 전사 조절 서열과 관련하여 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열들이 인접해 있고, 필요에 따라서는 2개의 단백질 코딩 영역들이 인접하여 리딩 프레임으로 연결된다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 일으킬 수 있음을 가리킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"라는 용어는 그와 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 유형이 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편들이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 유형은 추가의 DNA 절편들이 바이러스 게놈에 라이게이션되어 있을 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터들은 그들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어 박테리아 복제 기점 및 에피솜 포유동물 벡터를 보유하는 박테리아 벡터인 경우). 다른 벡터 (예를 들어 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입된 후에 상기 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로 인해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터들은 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수도 있다. 이러한 벡터를 본원에서는 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")라고 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 널리 사용되는 형태의 벡터이기 때문에, 본 명세서에서는 "플라스미드"와 "벡터"가 서로 바꿔 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 등과 같이 동등한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐 아니라 그러한 세포의 자손까지도 지칭하는 것임을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 차후 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때 문에, 이러한 자손은 사실상 모(母) 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같이 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포의 예로는 CHO 세포 및 림프구성 세포 등이 있다.

본 발명의 다양한 측면을 하기의 서브단락에서 더욱 상세히 기재한다.

I. EGFR에 대한 인간 항체의 생산

본 발명의 모노클로날 항체 (MAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 따른 표준 체세포 세포 혼성화 기술 등을 비롯한 다양한 기술로 생산할 수 있다. 원칙적으로는 체세포 세포 혼성화 방법이 바람직하지만, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 형질전환 또는 종양원성 형질전환 등과 같이 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술을 이용할 수 있다.

하이브리도마 제조에 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산법은 매우 잘 확립된 방법이다. 융합용 면역화 비장세포를 단리하는 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, EGFR에 대해 지시된 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아닌 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 본원에서 "HuMAb" 마우스라고 지칭하는 이들 트랜스제닉 마우스는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 면역글로블린 서열을 코딩하는 인간 면역글로블린 유전자의 미니좌위 (miniloci)를 함유하면서 내인성 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적화 돌연변이를 함께 함유한다 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859]. 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현이 감소되고 면역화에 대한 반응이 저하되며, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고 친화도 인간 IgGκ 모노클로날 항체가 생성된다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌] (문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 고찰됨), [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조 방법은 하기 단락 II 및 문헌 ([Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295], [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656], [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci USA 90:3720-3724], [Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123], [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830], [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920], [Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474):856-859], [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101], [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93], [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851])에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌 모두의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 추가로, 미국 특허 제5,545,806호, 동 제 5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,789,650호, 동 제5,877,397호, 동 제5,661,016호, 동 제5,814,318호, 동 제5,874,299호 및 동 제5,770,429호 (이상 모두가 론베르그 (Lonberg) 및 카이 (Kay) 및 젠팜 인터내셔널 (GenPharm International)에게 허여됨); 수라니 (Surani) 등에게 허여된 미국 특허 제5,545,807호; 1998년 6월 11일자로 공개된 국제 공개 WO 98/24884; 1994년 11월 10일자로 공개된 동 WO 94/25585; 1993년 6월 24일자로 공개된 동 WO 93/1227; 1992년 12월 23일자로 공개된 동 WO 92/22645; 1992년 3월 19일자로 공개된 WO 92/03918을 참조하며, 이들 모두의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 별법으로, 실시예 2에 기재한 HC012 트랜스제닉 마우스를 사용하여 인간 항-EGFR 항체를 생성할 수 있다.

인간 항체 면역화

문헌 ([Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] 및 WO 98/24884)에 기재된 바와 같이, HuMAb 마우스를 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화시켜 EGFR에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 최조 주입한 지 6 내지 16주 후일 것이다. 예를 들면, EGFR 항원의 정제되거나 풍부한 제제 (5 내지 20 ㎍, 예를 들어 EGFR-발현 LNCaP 세포로부터 정제함)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내 면역화시킬 수 있다. EGFR 항원의 정제되거나 풍부한 제제를 사용한 면역화로 항체가 생성되지 않을 경우에는, 상기 마우스를 EGFR-발현 세포, 예를 들어 종양 세포주로 면역화시켜 면역 반응을 촉진시킬 수도 있다.

다양한 항원을 사용한 경험의 누적으로부터, HuMAb 트랜스제닉 마우스는 이를 먼저 완전 프로인트 (Freund's) 아쥬반트 중의 항원으로 복강내 (IP) 면역화시킨 후에 매주마다 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 항원으로 i.p. 면역화 (총 6회 이하)시킬 경우에 가장 잘 반응하는 것으로 밝혀졌다. 면역 반응은 안와후방 채혈을 통해 얻은 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜 전반에 걸쳐 모니터링할 수 있다. 상기 혈장을 ELISA (하기 기재한 바와 같음)로 스크리닝할 수 있고, 충분한 역가의 항-EGFR 인간 이뮤노글로불린을 보유하는 마우스를 융합에 이용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에, 마우스에게 항원을 정맥내 주입하여 부스팅시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2 내지 3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있다. 수 마리의 마우스가 각 항원에 대해 면역화될 것이다. 예를 들면, HC07 및 HC012 계통의 총 12 마리 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.

EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

표준 프로토콜에 따라, 마우스 비장세포를 단리하고 PEG를 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 그 후, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝한다. 예를 들면, 면역화 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6에 상응하는 수의 세포와 융합시킨다. 약 2 ×10⁵개 세포를 평평한 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈 청 (Fetal Clone Serum), 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN 제품), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/mL 페니실린, 50 mg/mL 스트렙토마이신, 50 mg/mL 젠타마이신 및 1 ×HAT (시그마 (Sigma) 제품; HAT는 융합으로부터 24시간 후에 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 2주 후, HAT를 HT로 교체한 배지에서 세포를 배양한다. 그 후, 각각의 웰을 인간 항-EGFR 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대한 ELISA로 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 일반적으로 10 내지 14일 후에 배지를 관찰한다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-EGFR 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성인 경우에는 제한 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에서 소량의 항체를 생성시켜 특성화한다.

EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

본 발명의 인간 항체는 예를 들어 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법을 조합하여 이용함으로써 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수도 있다 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202].

예를 들면, 한 실시양태에서는 관심 유전자(들), 예를 들어 인간 항체 유전자를 진핵 세포 플라스미드와 같은 발현 벡터에 라이게이션시킬 수 있다. 그 후, 상기 플라스미드를 박테리아 세포 (예를 들어 대장균) 등의 숙주 세포에 도입하여 그 세포를 성장시킬 수 있다. DNA가 통합된 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 선별하고 리소자임을 처리하여 세포벽을 제거할 수 있다. 생성된 구형질 (spheroplast)을 골수종 세포 등의 불멸화 세포와 융합 ("형질감염"이라 지칭함)시킬 수 있다. 융합 후에는 안정한 세포 (형질감염체)를 확인하고 선별할 수 있다. 이들 세포가 이후에 복수(腹水) 또는 조직 배양으로 성장시켜 증폭시킬 수 있는 트랜스펙토마이며, 이를 사용하여 재조합 인간 항체를 생산할 수 있다.

무손상 항체 발현을 위한 부분적 항체 서열의 이용

항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 각 항체들 사이에서 CDR 바깥쪽의 서열보다 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 성질이 상이한 다른 항체의 프레임워크 서열상에 특정 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열이 이식된 발현 벡터를 구축함으로써, 특정 천연 발생 항체가 지닌 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어 [Riechmann, L. et al., 1988, Nature 332:323-327], [Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525] 및 [Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 배선 서열에는 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성된 완전하게 조립된 가변 유전자가 포함되어 있지 않기 때문에, 상기 배선 서열은 성숙 항체 유전자 서열과 상이할 것이다. 또한, 배선 유전자 서열은 가변 영역에 각각 균등하게 분포되어 있는 고 친화도의 제2 레파토리 항체의 서열과도 다를 것이다. 예를 들면, 체세포 돌연 변이는 프레임워크 영역의 아미노-말단 부분에서 비교적 낮은 빈도로 발생한다. 예를 들면, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 비교적 낮은 빈도로 발생한다. 추가로, 많은 체세포 돌연변이가 항체의 결합 성질을 유의하게 변경시키지는 않는다. 이러한 이유로, 결합 특성이 원래의 항체와 유사한 무손상 재조합 항체를 재생성하기 위해서 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요는 없다 (1999년 3월 12일자로 출원한 PCT/US99/05535를 참조하며, 이는 모든 목적상 본원에 참고로 도입됨). 전형적으로, CDR 영역에 걸쳐있는 (spanning) 부분적 중쇄 및 경쇄 서열은 이러한 목적에 충분하다. 상기 부분적 서열은 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는 배선 가변 및 연결 유전자 절편을 결정하는 데 이용된다. 그 후, 배선 서열은 가변 영역의 결실 부분을 채워넣는 데 이용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안에 절단되어, 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 이러한 이유로, 발현 구조물을 위해 상응하는 배선 리더 서열을 사용할 필요가 있다. 결실 서열을 부가하기 위해서는, 클로닝된 cDNA 서열을 라이게이션 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 결합시킬 수 있다. 별법으로, 전체 가변 영역을 한 세트의 짧은 중첩된 올리고뉴클레오티드로서 합성하고 PCR 증폭에 의해 결합시킴으로써, 전체 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 방법은, 특정 제한 효소 부위를 제거하거나 포함시키고, 또는 특정 코돈을 최적화시키는 등의 몇가지 이점이 있다.

하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩 세트를 고안하고, 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩력을 이용하여 합성 V 서열을 생성한다. 상기 합성 중쇄 및 카파쇄의 서열은 다음의 3가지 방식으로 천연 서열과 달라질 수 있다: 반복된 뉴클레오티드 염기 서열을 개재시켜 올리고뉴클레오티드의 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 함; 코작 (Kozak) 규칙 [Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870]에 따라 최적의 번역 개시 부위를 혼입함; 및 HindⅢ 부위가 번역 개시 부위의 상류에 위치하도록 유전자조작함.

중쇄 및 경쇄 가변 영역에 있어서, 최적화된 코딩 가닥 서열 및 이에 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중앙 부근에서 30 내지 50개의 뉴클레오티드로 절단된다. 따라서, 각각의 쇄에서 상기 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400개 뉴크레오티드 절편에 걸쳐있는 중첩된 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 그 후, 상기 풀 (pool)을 주형으로 사용하여 150 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 제조한다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 2개의 풀로 나누어질 것이며, 이들을 따로 증폭시켜 2개의 중첩 PCR 생성물을 생성한다. 그 후, 이들 중첩 생성물을 PCR 증폭에 의해 결합시켜 완전한 가변 영역을 형성시킨다. 또한, 발현 벡터 구조물 내로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위해서는, PCR 증폭시에 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (카파 경쇄의 BbsI 부위 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위를 포함함)의 중첩 단편을 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다.

그 후, 재구축된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터 서열, 번역 개시 서열, 불변 영역 서열, 3' 비번역 서열, 폴리아데닐화 서열 및 전사 종결 서 열과 결합시켜 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물을 단일 벡터에 결합시키거나, 숙주 세포 내로 동시형질감염시키거나 순차적으로 형질감염시키거나 또는 따로 형질감염시킨 후에 융합시켜 상기 2가지 쇄 모두를 발현하는 숙주 세포를 형성할 수 있다.

인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 구축에 사용되는 플라스미드를 하기에 기재한다. 이 플라스미드를 구축함으로써, PCR로 증폭시킨 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자 (minigene)의 재구축에 사용될 수 있다. 이들 플라스미드를 사용하여 완전한 인간 항체 또는 키메라 IgG1κ 항체 또는 IgG4κ 항체를 발현시킬 수 있다. 다른 중쇄 이소타입을 발현시키거나 람다 경쇄를 포함하는 항체를 발현시키기 위해서, 유사한 플라스미드를 구축할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명의 인간 항-EGFR 항체, 예를 들어 2F8의 구조적 특징을 이용하여 EGFR에 결합하는 것과 같은 본 발명 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 항-EGFR 항체를 생성한다. 더욱 구체적으로, 2F8의 1개 이상의 CDR 영역을 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 결합시켜, 추가의 재조합으로 유전자조작된 본 발명의 인간 항-EGFR 항체를 생성할 수 있다.

따라서, 다른 실시양태에서 본 발명은 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역 및 인간 중쇄 CDR (여기서, 1개 이상의 인간 중쇄 CDR은 도 15에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 2의 상응하는 아미노산 잔기)을 포함함) 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역 및 인간 경쇄 CDR (여기서, 1개 이상의 인 간 경쇄 CDR은 도 15에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열 (또는 서열 4의 상응하는 아미노산 잔기)을 포함함)을 포함하며 EGFR에 대한 결합력을 보유하는 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항-EGFR 항체의 제조 방법을 제공한다.

EGFR에 대한 항체의 결합력은 실시예에 기재한 바와 같은 표준 결합 분석법 (예를 들어 ELISA)을 이용하여 측정될 수 있다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 수행한다는 것은 당업계에 공지되어 있기 때문에, 상기한 바와 같이 제조한 본 발명의 재조합 항체는 2F8의 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 항체는 2F8의 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 2F8의 CDR1을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역 (여기서, 인간 중쇄 CDR3 영역은 도 15에 나타낸 2F8의 CDR3 (또는 서열 2의 상응하는 아미노산 잔기)임); 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역 (여기서 인간 경쇄 CDR3 영역은 도 15에 나타낸 2F8의 CDR3 (또는 서열 4의 상응하는 아미노산 잔기)임)을 포함하며 EGFR에 결합하는 항-EGFR 항체를 추가로 제공한다. 상기 항체는 2F8의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 2F8의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 기재한 유전자조작된 항체의 CDR1, CDR2 및(또는) CDR3은 본원에 개시한 2F8의 아미노산 서열(들)과 정확하게 동일한 아미노산 서열(들) 을 포함한다. 그러나, 당업자는 항체가 2F8의 정확한 CDR 서열에서 약간 벗어나면서도 EGFR에 대한 효과적인 결합력을 여전히 보유하는 것 (예를 들면, 보존적 치환)이 가능할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 상기 유전자조작된 항체는 2F8의 1개 이상의 CDR에 예를 들어 90％, 95％, 98％ 또는 99.5％ 동일한 1개 이상의 CDR로 구성될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이 유전자조작된 항체는 단순히 EGFR에 결합하는 것 이외에도 하기에 예시한 바와 같이 본 발명의 항체의 다른 기능적 성질 보유 여부에 대해 선별될 수도 있다:

1) 살아있는 EGFR-발현 세포에 대한 결합;

2) EGFR에 대한 높은 결합 친화도;

3) EGFR 상의 독특한 에피토프에 대한 결합 (상보적 활성을 보유한 모노클로날 항체와 배합되어 사용할 경우, 동일 에피토프와의 결합에 대하여 경쟁할 가능성을 배제하기 위함);

4) EGFR-발현 세포의 옵소닌화; 및(또는)

5) 인간 이펙터 세포의 존재하에서 EGFR-발현 세포의 성장 억제, 식작용 및(또는) 사멸을 매개함.

EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체 결합의 특성화

본 발명의 인간 모노클로날 EGFR 항체의 결합을 특성화하기 위해, 면역화된 마우스의 혈청을 예를 들어 ELISA로 시험할 수 있다. 간략하게 설명하면, 미량역가 플레이트를 PBS 중의 정제된 EGFR 0.25 ㎍/mL로 코팅한 후에 PBS 중의 5％ 소 혈청 알부민으로 블로킹한다. EGFR로 면역화된 마우스의 혈장 희석액을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 이 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 mg/mL)로 발색시키고, 405 내지 650의 OD에서 분석한다. 가장 높은 역가를 나타내는 마우스를 융합에 사용하는 것이 바람직할 것이다.

또한, 상기 기재한 바와 같은 ELISA 분석법을 사용하여 EGFR 면역원에 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝할 수도 있다. EGFR에 높은 결합력으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 추가로 특성화할 것이다. 각 하이브리도마로부터 모 세포의 반응성을 보유하는 (ELISA로 분석함) 1개의 클론을 선택하여 5 내지 10개의 바이알 세포 뱅크 (-140℃에 저장함)를 제조할 수 있고 항체를 정제할 수 있다.

인간 항-EGFR 항체를 정제하기 위해서, 선별된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제용 2 L 회전-플라스크 중에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과하고 농축한 후에 단백질 A-세파로스 (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파르마샤 (Pharmacia) 제품)로 친화도 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교체할 수 있고, 농도는 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에서 측정할 수 있다. 모노클로날 항체는 분주하여 -80℃에 저장할 수 있다.

선별된 인간 항-EGFR 모노클로날 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지 여부 를 결정하기 위해, 시판되는 시약 (미국 일리노이주 록크포드에 소재하는 피어스 (Pierce) 제품)을 사용하여 각 항체를 바이오티닐화할 수 있다. 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 상기 기재한 바와 같은 EGFR 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 바이오티닐화된 MAb는 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.

정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 미량역가 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새 10 ㎍/mL 의 항-인간 Ig로 코팅할 수 있다. 5％ BSA로 블로킹한 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 10 ㎍/mL 의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기 기재한 바와 같이 발색시켜 분석한다.

EGFR을 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 유식 세포 계수법을 이용할 수 있다. 간략하게 설명하면, EGFR을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건하에 성장시킴)를 0.1％ Tween 80 및 20％ 마우스 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 광 및 측면 산란 성질을 이용하여 단일 세포를 게이팅 (gating)하는 FACScan 기기로 샘플을 분석할 수 있다. 이러한 유식 세포 계수법 이외에도 (또는 이를 대신하여) 형광 현미경을 사용하는 벌볍의 분석 법을 이용할 수 있다. 세포를 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색하여 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법은 개개의 세포를 가시화하지만, 항원의 밀도에 따라 감도가 저하될 수 있다. 항-EGFR 인간 IgG를 EGFR 항원과의 반응성은 웨스턴 블롯팅을 통해 추가로 시험할 수 있다. 간략하게 설명하면, EGFR-발현 세포로부터 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킬 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 20％ 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙 (probing)한다. 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 인간 IgG 결합을 검출하고, BCIP/NBT 기질 타블렛 (tablet) (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chem. Co.) 제품)을 사용하여 발색시킬 수 있다.

EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체의 식작용 및 세포 사멸 활성

인간 모노클로날 항-EGFR 항체는 EGFR에 대한 특이적 결합 뿐만 아니라 EGFR-발현 세포의 식작용 및 사멸을 매개하는 능력에 대하여도 시험할 수 있다. 시험관내 모노클로날 항체 활성의 시험은 생체내 모델의 시험에 앞서 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 간략하게 설명하면, 피콜 하이페이크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리 및 이후의 오염성 적혈구 용해를 통해 건강한 공여자 유래의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터 세포를 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10％ 가열-불활성화된 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI 중에 현탁시킬 수 있으며, EGFR을 발현하는 ⁵¹Cr 표지된 세포와 이펙터 세포 대 종양 세포 (즉, 이펙터 세포:종양 세포)가 다양 한 비율이 되도록 혼합할 수 있다. 이어서, 정제된 인간 항-EGFR IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관련성이 없는 인간 IgG는 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 상기 분석법은 37℃에서 0분 내지 120분 동안 수행할 수 있다. 샘플에서 배양 상등액 중으로의 ⁵¹Cr 방출량을 측정함으로써 세포용해에 대하여 분석할 수 있다. 또한, 항-EGFR 모노클로날 항체를 서로 배합하여 여러 모노클로날 항체에 의해 세포용해가 증가되었는지를 결정할 수 있다.

EGFR에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예를 들어 마우스)에서 시험하여 EGFR-발현 세포, 예를 들어 종양 세포의 식작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 효능을 결정할 수도 있다. 이들 항체는 예를 들어 하기 기준을 기초로 하여 선별할 수 있으나 이에 제한되지 않는다:

1) 살아있는 EGFR-발현 세포에 대한 결합;

2) EGFR에 대한 높은 결합 친화도;

3) EGFR 상의 독특한 에피토프에 대한 결합 (상보적 활성을 보유한 모노클로날 항체와 배합되어 사용할 경우, 동일 에피토프와의 결합에 대하여 경쟁할 가능성을 배제하기 위함);

4) EGFR-발현 세포의 옵소닌화;

5) 인간 이펙터 세포의 존재하에서 EGFR-발현 세포의 성장 억제, 식작용 및(또는) 사멸을 매개함.

본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준을 하나 이상, 바람직 하게는 모두 충족시킨다. 특별한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 배합되어 사용되며, 예를 들어 2종 이상의 항-EGFR 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물로서 사용된다. 예를 들면, 상이하지만 상보적 활성을 갖는 인간 항-EGFR 모노클로날 항체를 단일 요법과 병행하여 원하는 치료 또는 진단 효과를 달성할 수 있다. 이러한 일례가 EGFR-발현 세포의 성장을 억제하는 다른 인간 항-EGFR 모노클로날 항체와 배합된, 이펙터 세포의 존재하에서 표적 세포의 고도로 효과적인 사멸을 매개하는 항-EGFR 인간 모노클로날 항체를 함유하는 조성물이다.

II. 인간 모노클로날 항-EGFR 항체를 생성하는 트랜스제닉 비-인간 동물의 생산

다른 측면에서, 본 발명은 EGFR에 바람직하게는 고 친화도로 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (HuMAb 마우스)는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유한다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물을 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화하였다. 바람직하게는, 트랜스제닉 마우스 등의 트랜스제닉 비-인간 동물는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소타입 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어 고전적 또는 비-고전적 이소타입 전환으로 일어날 수 있다.

이종 항체 레파토리에 의해 외부 항원 자극에 반응하는 트랜스제닉 비-인간 동물의 고안시에는 트랜스제닉 동물 내에 함유된 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 B-세포 발생 경로를 통해 정확하게 기능할 것이 요구된다. 바람직한 실시양태에서, 이종 중쇄 트랜스진의 정확한 기능은 이소타입 전환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 트랜스진은 이소타입 전환 및 하기 중 하나 이상을 나타내도록 구축된다: (1) 세포-유형에 특이적인 고 수준 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 이에 대한 반응, (4) 1차 레파토리의 충분한 발현, (5) 신호도입, (6) 체세포 과다 돌연변이 및 (7) 면역 반응 동안 트랜스진 항체 좌위의 우세.

상기 기준 모두가 충족될 필요는 없다. 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 내인성 이뮤노글로불린 좌위가 기능적으로 파괴된 실시양태에서, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화시킬 필요가 없다. 추가로, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 실시양태에서, 두번째 기준인 기능적 유전자 재배열은 적어도 이미 재배열된 트랜스진의 경우에서는 불필요하다. 분자 면역학 분야의 배경지식에 대하여는 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 비-인간 동물은 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 상기 트랜스제닉 동물의 배선에서 포함한다. 각각의 중쇄 트랜스진은 1개 이상의 C_H 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 여러 C_H 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 전환을 보조할 수 있는 기능적 이소타입 전환 서열을 함유할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 C_H 유전자의 공급원으로서 작용하는 종에서 유래한 배선 이뮤노글로불린 좌위에서 천연 발생하는 것일 수 있거나, 이러한 전환 서열은 트랜스진 구조물을 수용하게 되는 종 (트랜스제닉 동물)에서 발생하는 것으로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 트랜스제닉 마우스 생산에 사용되는 인간 트랜스진 구조물은, 마우스 전환 서열이 마우스 전환 재조합효소 시스템과 기능하도록 최적화되어 있을 것이라 추정되지만 인간 전환 서열은 그렇지 않기 때문에, 마우스 중쇄 좌위에서 천연 발생하는 것과 유사한 전환서열을 혼입하는 경우일지라 하더라도 높은 빈도의 이소타입 전환 반응을 나타낼 수 있다. 전환 서열은 통상적인 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝할 수 있으며, 이뮤노글로불린 전환 영역 서열과 관련하여 공개된 서열 정보에 기초하여 고안된 중첩 합성 올리고뉴클레오티드로부터 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있다 (본원에 참고로 도입되는 문헌 [Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)] 참조). 상기 각각의 트랜스제닉 동물의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 유의한 비율 (10％ 이상)로 발견된다.

본 발명의 트랜스제닉 동물 생성에 사용되는 트랜스진은 1개 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 다양성 (diversity) 유전자 절편, 하나의 연결 (joining) 유전 자 절편 및 1개 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 이 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 1개 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 연결 유전자 절편 및 1개 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 절편을 코딩하는 유전자 절편은 그가 트랜스제닉 비-인간 동물을 구성하는 것이 아닌 다른 종의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 절편을 코딩하는 DNA로부터 유도되거나, 그에 상응한다는 점에서 트랜스제닉 비-인간 동물에 대해 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개개의 유전자 절편이 재배열되지 않도록, 즉, 재배열되어 기능적 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하게 되지 않도록 구축된다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 절편의 재조합 (기능적 재배열)을 보조하며, 바람직하게는 EGFR 항원에 노출된 트랜스제닉 비-인간 동물 내에서 D 영역 유전자 절편 전체 또는 그의 일부가 생성된 재배열 이뮤노글로불린 중쇄로 혼입되는 것을 보조한다.

별법의 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 전형적으로 C, D 및 J 절편의 실질적인 일부 뿐 아니라, V 유전자 절편의 서브세트도 포함한다. 이러한 트랜스진 구조물에서, 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱의 스플라이스 (splice) 공여자 및 스플라이스 수용자 서열, 재조합 신호 등은 이종 DNA에서 유래한 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용되는 비-인간 동물과 동일하거나 관련된 종에서 유래한 트랜스진에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 인간 이뮤노글로불린 유전자 절편은 트랜스제닉 마우스에 사용되는 설치류 이뮤노 글로불린 인핸서 서열을 보유하는 트랜스진 내에 결합될 수 있다. 별법으로, 합성 조절 서열이 트랜스진에 혼입될 수 있는데, 이러한 합성 조절 서열은 포유동물의 게놈에서 천연적으로 발생한다고 공지된 기능적 DNA 서열에 상동성이 아니다. 컨센서스 (consensus) 규칙에 따라 합성 조절 서열, 예를 들어 스플라이스 수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용가능한 서열을 특정하는 서열을 고안하였다. 예를 들면, 미니좌위는 천연 발생 배선 Ig 좌위에 비해 불필수 DNA 부분 (예를 들어 개입 (intervening) 서열, 인트론 또는 그의 일부)에 대해 1개 이상의 내부 (즉, 이 부분의 말단에서는 아님) 결실을 갖는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, EGFR에 대한 인간 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 동물은 WO 98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진 (예를 들어 pHC1 또는 pHC2)의 카피 1개 이상, 전형적으로는 2개 내지 10개, 때로는 25개 내지 50개 이상을 함유하고, WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 함유하는 동물과 교배되었으며, 그의 자손은 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 J_H 결실 동물과 교배되었다 (상기 문헌들의 내용은 본원에 참고로 도입된다). 동물들을 이들 세가지 특질의 각각에 대하여 동형접합성 (homozygosity)으로 교배하였다. 이러한 동물은 다음과 같은 유전자형을 보유한다: 인간 중쇄의 재배열되지 않은 미니좌위 (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨)의 단일 카피 (염색체 반수체 (haploid) 세트 당), 재배열된 인간 Κ 경쇄 구조물 (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨)의 단일 카피 및 기능적 J_H 절편 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨)의 모두를 제거하는 각각의 내인성 마우스 중쇄 좌위에서의 결실. 이 동물을 J_H 절편 (WO 98/24884의 실시예 10)의 결실에 대하여 동형접합성인 마우스와 교배하여 J_H 결실에 대하여 동형접합성이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대해 반접합성 (hemizygous)인 자손을 생산한다. 생성된 동물에게 항원을 주사하고, 이를 사용하여 이들 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.

상기 동물로부터 단리된 B 세포는 그가 각 유전자의 단일 카피만을 함유하기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대해 단일특이적이다. 추가로, 상기 B 세포는 내인성 마우스 중쇄 유전자의 두 카피가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 J_H 영역에 걸쳐있는 결실에 의해 비기능적이기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대해 단일특이적일 것이다. 추가로, 실질적 비율의 B 세포는 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피 발현이 유의한 비율의 B-세포에서 내인성 마우스 κ및 람다쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적 및 이소타입성으로 배제할 것이기 때문에 인간 또는 마우스 경쇄에 대해 단일특이적일 것이다.

바람직한 실시양태의 트랜스제닉 마우스는 이상적으로는 천연 마우스의 이뮤노글로불린 생산과 실질적으로 유사한 유의한 레파토리를 나타낼 것이다. 따라서, 예를 들어 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청 1 mL 당 약 0.1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 5 mg, 이상적으로 약 1.0 mg 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 트랜스제닉 마우스에 도입된 경우, 성체 마우스의 혈청 중 IgG 대 IgM 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 비성숙 마우스에서 훨씬 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10％ 초과, 바람직하게는 40％ 내지 80％는 인간 IgG 단백질만을 발현한다.

이상적으로, 상기 레파토리는 비-트랜스제닉 마우스에서 나타난 것과 일반적으로 약 10％ 이상만큼 고도로 유사할 것이며, 바람직하게는 25％ 내지 50％ 이상 유사할 것이다. 일반적으로, 주로 마우스 게놈 내에 도입된 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라 약 1,000개 이상의 상이한 이뮤노글로불린 (이상적으로 IgG), 바람직하게는 10⁴개 내지 10⁶개 이상의 이뮤노글로불린이 생산될 것이다. 이들 이뮤노글로불린은 전형적으로 약 50종 이상의 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 스타필로콕쿠스 (staphylococcus) 단백질 A를 인식할 것이다. 전형적으로, 상기 이뮤노글로불린은 미리 선택된 항원에 대한 친화도가 약 10⁷ M^-1 이상, 바람직하게는 약 10⁹ M^-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1, 10¹² M^-1 이상, 예를 들어 10¹³ M^-1 이상일 것이다.

몇몇 실시양태에서, 예정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하는 예정된 레파토리를 갖는 마우스를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 예정된 레파토리를 갖는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 예정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 주로 사용되는 인간 V_H 유전자를 포함할 수 있다. 별법으로, 일부 V_H 유전자는 여러가지 이유 (예를 들어 예정된 항원에 대한 고 친화도 V 영역을 코딩할 가능성이 낮거나, 체세포 돌연변이 및 친화도 엄격화가 일어날 경향이 낮거나, 또는 특정 인간에 대해 면역원성이 있음)로 인해 한정된 레파토리로부터 배제될 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 절편을 함유하는 트랜스진의 재배열에 앞서서, 이러한 유전자 절편은 상기 트랜스제닉 동물이 아닌 다른 유기체 종으로부터 알 수 있는 것처럼, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열분석에 의해 쉽게 확인할 수 있다.

본 발명의 트랜스제닉 마우스는 상기 기재한 바와 같이 EGFR 항원 및(또는) EGFR-발현 세포의 정제되거나 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 이 마우스는 트랜스진 전환 재조합을 통한 클래스-전환 (cis-전환)을 수행하며 EGFR과 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 연결에 의해 유도되는 서열 및 배선에서 코딩되는 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 보유하는 인간 서열 항체일 수 있으며, 이들 인간 서열 이뮤노글로불린은 다른 비-배선 서열이 체세포 돌연변이 및 차별적 V-J 및 V-D-J 재조합 연결되어 존재할 수 있다 하더라도 인간 V_L 또는 V_H 유전자 절편 및 인간 J_L 또는 J_L 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일하다고 말할 수 있다. 이러한 인간 서열 항체에 대해, 각 쇄의 가변 영역은 전형적으로 인간 배선 V, J, 및 중쇄의 경우, 80％ 이상이 D 유전자 절편에 의해 코딩되고, 종종 가변 영역의 85％ 이상은 트랜스진에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90％ 또는 95％ 이상은 트랜스진에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-배선 서열이 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 종종 마우스의 배선에서 인간 트랜스진(들)에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 절편에 의해 코딩되지 않는 몇몇 가변 영역 서열 (및 덜 빈번하게는 불변 영역 서열)을 보유할 것이다. 전형적으로, 이러한 비-배선 서열 (또는 개개의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 클러스터 (cluster)된다고 공지된 영역 내에 클러스터될 것이다.

예정된 항원에 결합하는 인간 서열 항체는 이소타입 전환으로부터 생성되어, 인간 서열 γ쇄 (예를 들어 γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예를 들어 Κ)를 포함하는 인간 항체가 생산될 수 있다. 흔히, 이러한 이소타입-전환된 인간 서열 항체는 항원에 의해, 특히 2차 (또는 그 이후의) 항원 접종 (challenge) 이후에 B 세포가 친화도 성숙 및 선택되어, 전형적으로는 가변 영역 내, 및 종종 CDR의 약 10개 잔기에서 또는 그 내부에서 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)을 함유한다. 이들 고 친화도 인간 서열 항체의 결합 친화도는 1 ×10⁹ M^-1 이상, 전형적으로는 5 ×10⁹ M^-1 이상, 종종 1 ×10¹⁰ M^-1 초과, 때로는 5 ×10¹⁰ M^-1 내지 1 ×10¹¹ M^-1 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 EGFR에 고 친화도 (예를 들어 2 ×10⁹ M^-1 초과)로 결 합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 생성에 사용될 수 있는 마우스 유래의 B 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서는 이들 하이브리도마가, EGFR에 2 ×10⁹ M^-1 이상의 친화도 상수 (K_A)로 결합하고

(1) 인간 V_L 유전자 절편 및 인간 J_L 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 가변 영역 및 (2) 인간 C_L 유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 불변 영역으로 구성된 인간 서열 경쇄 및

(1) 인간 V-유전자 절편, 임의로는 D 영역, 및 인간 J_H 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 중쇄 가변 영역 및 (2) 인간 C_H 유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 불변 영역으로 구성된 인간 서열 중쇄

를 포함하는 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물 생성에 사용된다.

EGFR에 대한 고 친화도 인간 모노클로날 항체의 개발은 인간 이뮤노글로불린 트랜스진이 통합되어 있는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 절편의 레파토리를 확장시키는 방법에 의해 용이해지며, 이 방법은 상기 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 절편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈 내에 도입하는 단계를 포함한다. 흔히, V 영역 트랜스진은, 인간 게놈에서 천연적으로 발생하거나 재조합 방법에 의해 따로 스플라 이싱될 수 있는 바와 같이, 순서를 벗어나거나 생략된 V 유전자 절편을 포함할 수 있는 인간 V_H 또는 V_L (V_K) 유전자 절편 배열체의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이다. 흔히, YAC는 5개 이상의 기능적 V 유전자 절편을 함유한다. 이러한 변형법으로, V 레파토리 확장 방법에 의해 생산되는 트랜스제닉 마우스를 만들 수 있는데, 이 마우스는 V 영역 트랜스진에 존재하는 V 영역 유전자 절편에 의해 코딩되는 가변 영역 서열 및 인간 Ig 트랜스진에서 코딩되는 C 영역을 포함하는 이뮤노글로불린을 발현한다. V 레파토리 확장 방법에 따라 약 24개 이상의 V 유전자를 함유하는 마우스를 생성시킬 수 있기 때문에, 5개 이상의 별개의 V 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 생성시킬 수 있다. 몇몇 V 유전자 절편은 비-기능적일 수 있는데 (예를 들어 슈도-유전자 (pseudogene) 등), 이들 절편은 보유될 수도 있고, 또는 원한다면 당업자가 이용할 수 있는 재조합 방법에 의해 선택적으로 결실시킬 수 있다.

일단 상기 마우스 배선이 J 및 C 유전자 절편을 함유하는 인간 Ig 트랜스진에 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 절편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 함유하도록 유전자조작되면, 확장된 V 절편 레파토리를 갖는 기능적 YAC가 상이한 인간 Ig 트랜스진을 보유하는 마우스 배선내로 도입된 배경 (background)을 비롯한 다른 유전적 배경을 갖도록 상기 특질이 교배되고 전파될 수 있다. 확장된 V 절편 레파토리를 갖는 여러 기능적 YAC를 인간 Ig 트랜스진 (또는 여러 인간 Ig 트랜스진)과 작동하도록 배선 내에 도입할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스진이라고 지칭하지 만, 이 트랜스진은 게놈 내에 통합된 경우에 효모 서열, 예를 들어 효모에서의 자율 복제에 필요한 서열이 실질적으로 결여될 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서 복제된 후에 더 이상 필요하지 않게 되었을 때 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 프로자이고트 (prozygote)로의 도입 전) 유전자의 유전자조작 (예를 들어 제한 효소에 의한 소화 및 펄스장 (pulsed-field) 겔 전기영동 또는 기타의 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 서열 이뮤노글로불린 발현 특질을 전파시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들) 및 임의로 확장된 V 절편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 사육하는 것을 포함한다. V_H 및 V_L 유전자 절편 모두가 YAC 상에 존재할 수 있다. 당업자라면 상기 트랜스제닉 마우스를, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 다른 인간 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 다른 인간 트랜스진을 보유하는 배경을 비롯한 원하는 임의의 배경을 갖도록 교배할 수 있다. 또한, 본 발명은 확장된 V 영역 레파토리 YAC 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산된 고 친화도 인간 서열 이뮤노글로불린을 제공한다. 상기에서는 본 발명의 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시양태를 기재하고 있지만, 하기하는 4가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태들도 고려된다:

I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,

II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,

III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물 및

IV. 재배열된 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물.

이러한 트랜스제닉 동물 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순위는 II > I > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 Κ 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 녹-아웃 (knock out)됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자는 녹-아웃되지 않았으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.

III. EGFR에 결합하는 이중특이적/다중특이적 분자

본 발명의 다른 실시양태에서, EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 유도체화하거나 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어 Fab' 단편)에 연결하여 여러 결합 부위 또는 표적 에피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분을 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결할 수 있다.

따라서, 본 발명은 EGFR에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 보유하는 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 보유한다. 본 발명의 특별한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발 명은 FcyR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 표적 EGFR-발현 세포 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이들 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 EGFR-발현 세포를 이펙터 세포로 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 유사하게 Fc 수용체-매개된 이펙터 세포 활성, 예를 들어 EGFR-발현 세포의 식작용, 항체 의존적-세포-매개된 세포독성 (ADCC), 사이토킨 방출 또는 수퍼옥시드 (superoxide) 음이온의 발생을 촉발한다.

본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-EGFR 결합 특이성 이외에도 제3의 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 결합 특이성은 항-강화 (anti-enhancement) 인자 (EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-강화 인자 부분"은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하여 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정부위의 효과를 강화시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-강화 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 별법으로, 항-강화 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 부분과는 상이한 부위에 결합할 수 있다. 예를 들면, 항-강화 인자 부분은 세포독성 T-세포에 결합 (예를 들어 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1을 통해 결합하거나 표적 세포에 대하여 증가된 면역 반응을 나타내는 다른 면역 세포에 결합함)할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 결합 특 이성으로서 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 단일쇄 Fv를 포함한다. 항체는 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일쇄 구조물 (1990년 8월 7일자로 허여된 라드너 (Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)일 수도 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포의 표면상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이성 및 표적 세포 항원, 예를 들어 EGFR에 대한 제2 결합 특이성을 보유한다.

한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되며, 그의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "IgG 수용체"라는 용어는 1번 염색체 상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 임의의 유전자를 의미한다. 이들 유전자는 3가지 Fcγ 수용체 클래스인 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)으로 분류되는 총 12개의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 한 바람직한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간 고 친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체 IgG에 대해 고 친화도 (10⁸ M^-1 내지 10⁹ M^-1)를 나타내는 72 kDa 분자이다.

이들 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특성화에 대하여는 팽거 (Fanger) 등의 PCT 출원 국제공개 제WO 88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 교시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 이들 항 체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 별개인 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하기 때문에, 이러한 결합은 생리적 수준의 IgG에 의해서는 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 및 MAb 197이다. MAb 32를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 ATCC 기탁 번호 HB9469로서 입수가능하다. 항-FcγRI MAb 22, MAb 22의 F(ab')₂ 단편은 뉴저지주 아난데일 소재의 메다렉스 인크. (Medarex, Inc.)사로부터 얻을 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특성화에 대하여는 문헌 [Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002] 및 PCT/US93/10384에 기재되어 있다. H22 항체를 생산하는 세포주는 1992년 11월 4일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 명칭 HA022CL1로 기탁되어 기탁 번호 CRL 11177을 부여받았다.

다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이 결합은 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는다. "IgA 수용체"라는 용어는 19번 염색체 상에 위치한 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 생성물을 포함한다. 이 유전자는 여러가지로 달리 스플라이싱된 55 kDa 내지 110 kDa 크기의 막횡단 이소형을 코딩한다고 공지되어 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립구에서 구성적으로 (constitutively) 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 그렇지 않다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대해 중간 정도의 친화도 (약 5 ×10⁷ M^-1)를 나타내며, 이 친화도는 사이토킨, 예를 들어 G-CSF 또는 GM-CSF에 노출된 후에 증가한다 [Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 IgA 리간드 결합 도메인 바깥쪽의 FcαRI에 결합하며, 이는 문헌 [Monteiro, R. C. et al., 1992, J Immunol. 148:1764]에 기재되어 있다.

FcαRI 및 FcγRI은 이들이 (1) 주로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수상돌기세포에서 발현되고; (2) 고 수준 (예를 들어 세포 당 5,000개 내지 100,000개)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성 (예를 들어 ADCC, 식작용)의 매개자이고; (4) 자가 항원 등을 비롯한 항원을 이들에게 표적화시키는 항원 제시의 강화를 매개하기 때문에 본 발명에 사용되는 바람직한 촉발 수용체이다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 EGFR 등과 같은 표적 세포 항원을 인식하는 결합 특이성, 예를 들어 그에 결합하는 결합 특이성을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 결합 특이성은 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능적 항체 단편을 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내인성 이뮤노글로불린이 결합하지 않는 부위에서 이펙터 세포 의 Fc 수용체와 결합한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "이펙터 세포"라는 용어는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와는 달리 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 면역 세포의 예로는 골수양 또는 림프양 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예를 들어 B 세포 및 T 세포 (세포용해성 T 세포 (CTL) 포함)), 킬러 (killer) 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염기구 등이 있다. 몇몇 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현하며 특이적인 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있으며, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들면, FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포 등은 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분으로의 항원 제시, 또는 항원 제시 세포와의 결합에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식작용할 수 있다. 이펙터 세포 상에서의 특정 FcR의 발현은 체액성 인자, 예를 들어 사이토킨에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 상기 강화된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식작용하거나 용해시킬 수 있다.

"표적 세포"는 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 대상체 (예를 들어 인간 또는 동물) 내에 존재하는 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미한다. 바람직한 실시 양태에서, 표적 세포는 EGFR을 발현하거나 과발현하는 세포이다. 전형적으로, EGFR-발현 세포의 예로는 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신 세포, 편평 세포, 폐 (비-소 세포) 및 두부 및 목의 종양 세포 등이 있다. 다른 EGFR-발현 세포로는 관절염 및 건선의 치료에서 각각 표적으로 사용될 수 있는 활액 섬유아세포 및 각질세포 등이 있다.

본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에서 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이지만, 인간 모노클로날 항체가 바람직하다.

키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술로 생산할 수 있다. 예를 들면, 뮤린 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 소화시켜 뮤린 Fc의 코딩 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동등한 부분으로 치환시킨다 (문헌 [Robinson et al., 국제 특허 공개 제PCT/US86/02269호], [Akira, et al., 유럽 특허 출원 제184,187호], [Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 제171,496호], [Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173,494호], [Neuberger et al., 국제 출원 공개 WO 86/01533], [Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호], [Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제125,023호], [Better et al. (1988 Science 240:1041-1043)], [Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443], [Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526], [Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218], [Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005], [Wood et al. (1985) Nature 314:446-449] 및 [Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559] 참조).

상기 키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터의 동등한 서열로 대체하여 추가로 인간화시킬 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 일반적인 검토는 문헌 ([Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207] 및 [Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214])에 제시되어 있다. 이들 방법은 1종 이상의 중쇄 또는 경쇄로부터의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역 전체 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 핵산의 공급원은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 7E3, 항-GPII_bIII_a 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 이후, 상기 키메라 항체를 코딩하는 재조합 DNA 또는 그의 단편을 적절한 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 별법으로, 적합한 인간화 항체는 문헌 (미국 특허 5,225,539, [Jones et al. 1986 Nature 321:552-525], [Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534] 및 [Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060])의 CDR 치환법으로 생산할 수도 있다.

특정 인간 항체 CDR의 전부를 비-인간 CDR의 적어도 일부로 대체하거나, 상기 CDR의 일부만을 비-인간 CDR로 대체할 수 있다. CDR은, 인간화 항체가 Fc 수용체에 결합하는 데 필요한 수 만큼만 대체되면 된다.

항체는 인간 항체 CDR의 적어도 일부를 비-인간 항체 유래의 CDR로 대체할 수 있는 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있다. 윈터 (Winter)는 영국 특허 출원 제GB 2188638A호 (1987년 3월 26일 출원) (상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에서 본 발명의 인간화 항체 제조에 사용될 수 있는 방법을 기재하고 있다. 인간 CDR은 국제 출원 공개 제WO 94/10332호 (발명의 명칭: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발법을 이용하여 비-인간 CDR로 대체할 수 있다.

또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체도 본 발명의 범위에 속한다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 프레임워크 영역에서 아미노산이 치환되어, 예를 들어 항체에 대한 결합이 개선된다. 예를 들면, 마우스 CDR을 보유하는 인간화 항체에서 인간 프레임워크 영역에 위치한 아미노산을 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 몇몇 경우에서, 이러한 치환은 항원에 대한 인간화 항체의 결합을 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 본원에서는 변형된 항체 또는 변경된 항체라고 지칭한다.

또한, 변형된 항체라는 용어는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 항체의 일부가 예를 들어 결실, 부가 또는 치환에 의해 변형된 인간화 항체를 포함한다. 예를 들면, 항체는 불변 영역을 결실시키고, 이를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도가 증가되도록 의도된 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 1개 이상의 항원 결합 영역을 보유하거나, 하나 이상의 이펙터 기능 을 촉발하기만 하면, 그러한 임의의 변형은 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 (예를 들어 문헌 [D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5807] 참조), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (미국 특허 제4,474,893호 참조) 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

특히, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본원에 제공된 실시예에 기재된 방법을 이용하여 성분 결합 특이성, 예를 들어 항-FcR 및 항-EGFR 결합 특이성을 접합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자 각각의 결합 특이성을 따로 생성시킨 후에 서로와 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제를 사용하여 공유 접합시킬 수 있다. 가교제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) 등이 있다 (예를 들어 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법으로는 문헌 ([Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132)], [Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83)] 및 [Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139:2367-2375)])에 기재된 방법 등이 있다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들 모두가 미국 일리노이주 록크포드에 소재하 는 피어스 케미칼 컴파니 (Pierce Chemical Co.)에서 시판된다.

결합 특이성이 항체 (예를 들어 2개의 인간화 항체)인 경우, 이들은 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술피드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 홀수개의 술피드릴 잔기, 바람직하게는 1개의 술피드릴 잔기를 함유하도록 변형시킨 후에 접합시킨다.

별법으로, 상기 2가지 결합 특이성 모두가 동일한 벡터 내에서 코딩되며, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립된다. 이러한 방법은 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자가 MAb ×MAb, MAb ×Fab, Fab ×F(ab')₂ 또는 리간드 ×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일쇄 분자, 예를 들어 단일쇄 이중특이적 항체, 1개의 단일쇄 항체 및 결합 결정부위를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정부위를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 단일쇄 분자일 수도 있고, 또는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수도 있다. 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호, 동 제5,455,030호, 동 제4,881,175호, 동 제5,132,405호, 동 제5,091,513호, 동 제5,476,786호, 동 제5,013,653호, 동 제5,258,498호 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있다.

이중특이적 분자 및 다중특이적 분자가 이들의 특이적 표적에 결합하는 것은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사성면역분석법 (RIA), FACS 분석법, 생물 분석법 (예를 들어 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인할 수 있다. 일반적으로, 이들 분석법 각각은 특정한 관심 단백질-항체 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예를 들어 항체)을 사용하여 상기한 관심 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들면, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하고 그와 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 임의의 다양한 다른 면역분석법을 이용하여 상기 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체를 방사성 표지하여 방사성면역분석법 (RIA)에 사용할 수도 있다 (예를 들어 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성동위원소는 γ계수기 또는 섬광 계수기를 사용하는 수단이나 자기방사법에 의해 검출할 수 있다.

IV. 항체 접합체/면역독소

다른 측면에서, 본 발명은 치료 성분, 예를 들어 세포독소, 약물 또는 방사성동위원소에 접합된 인간 항-EGFR 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 세포독소에 접합되는 경우, 이들 항체 접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해로운 (예를 들어 세포를 사멸시킴) 임의의 작용제가 포함된다. 그 예로는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체 등이 있다. 치료제로는 항-대사물질 (예를 들어 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화 작용제 (예를 들어 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금 (II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신으로 부름) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어 닥티노마이신 (이전에는 액티노마이신으로 부름), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항-유사분열 작용제 (예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체를 방사성동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 접합시켜 EGFR 관련 질환, 예를 들어 암의 치료를 위한 세포독성 방사성약제를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 항체 접합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변형시킬 수 있으며, 약물 성분이 통상적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 여겨서는 안된다. 예를 들면, 약물 성분은 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 효소 활성 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포킨, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 다 른 성장 인자 등이 있다.

상기 치료 성분을 항체에 접합시키는 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 ([Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)], [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)], [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)], ["Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)])을 참조한다.

V. 제약 조성물

다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 1종 또는 이들의 배합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 여러 (예를 들어 2종 이상의) 단리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 배합물을 포함한다. 바람직하게는, 조성물 중 항체 또 는 그의 항원-결합 부분의 각각은 EGFR의 미리 선택된 별개의 에피토프에 결합한다.

한 실시양태에서, 상보적 활성을 보유하는 인간 항-EGFR 모노클로날 항체는 2종 이상의 인간 항-EGFR 모노클로날 항체를 포함하는 배합물, 예를 들어 제약 조성물로서 사용된다. 예를 들면, 이펙터 세포의 존재하에서 표적 세포의 고도로 효과적인 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 EGFR-발현 세포의 성장을 억제하는 다른 인간 모노클로날 항체와 배합할 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자 중 1종 또는 이들의 배합물을 포함한다 (예를 들어 Fc 수용체에 대한 하나 이상의 결합 특이성 및 EGFR에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 함유한다).

본 발명의 제약 조성물은 병행 요법으로, 즉 다른 작용제와 배합하여 투여할 수도 있다. 예를 들면, 병행 요법은 본 발명의 조성물과 1종 이상의 항-종양제 또는 다른 통상적인 요법을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅액, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입에 의한 투여)에 적합한 것이 바람직하다. 투여 경로에 따라, 물질 내의 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 코팅하여 활성 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연적인 조건으로부터 보호할 수 있다.

"제약상 허용가능한 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하면서 바람직하지 않은 임의의 독성학적 효과는 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염을 들 수 있다. 산 부가염에는 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 염, 및 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 염이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 염, 및 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 염이 포함된다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자라면 알 수 있듯이, 투여 경로 및(또는) 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 급속 방출에 맞서 이 화합물을 보호하는 담체, 예를 들어 임플란트 (implant), 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 비롯한 방출 조절 제형과 함께 제조될 수 있다. 생분해가능한 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기 제형의 제조를 위한 많은 방법들이 특허되어 있거나, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해서는 상기 화합물을 코팅하거나, 이 화합물의 불활성화를 방지하는 물질과 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제에 넣어 대상체에게 투여할 수 있다. 제약상 허용가능한 희석제에는 염수 및 완충 수용액이 포함된다. 리포좀은 통상적인 리포좀뿐 아니라, 수중유중수적형 CGF 에멀젼도 포함된다 [Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27].

제약상 허용가능한 담체에는 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 주사 용액 또는 분산액 즉석 제조용 무균 분말이 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용가능하지 않은 경우를 제외하면, 본 발명의 제약 조성물 중 그의 사용이 고려된다. 또한, 보조 활성 화합물을 본 발명의 조성물 중에 혼입시킬 수도 있다.

치료용 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건하에서 무균적이며 안정해야 한다. 본 발명의 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 일정한 구조물로 제제화할 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅물을 사용하거나, 분산액의 경우에는 필요한 입도를 유지하거나, 계면활성제를 사용하여 적절히 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수를 연장시키는 것은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아르산 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 달성할 수 있다.

무균 주사용 용액은 필요량의 활성 화합물을 상기 열거된 성분들 중 1종 또는 이들의 배합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시키고, 이후 필요에 따라 멸균 미세여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 필요한 다른 성분들을 함유하는 무균 비히클 중에 혼입시켜 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 더하여 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 앞서 멸균-여과된 그의 용액으로부터 생성시키는 진공 건조법 및 동결건조법이다.

투여량 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어 치료 반응)을 제공하도록 조절한다. 예를 들면, 단일 농축괴 (bolus)를 투여하거나, 여러회의 분할 투여량을 시간에 따라 투여하거나, 또는 치료 상황의 요구에서 나타난 바에 따라 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 원하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물 및 필요한 제약 담체를 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정 치 료 효과 및 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위해 상기 활성 화합물을 혼합하는 데 있어서 당업계에 고유한 제한사항에 의해 지시되며, 이들에 직접적으로 의존한다.

제약상 허용가능한 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염화물, 나트륨 비술페이트, 나트륨 메타비술피트, 나트륨 술피트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸레이트화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화 작용제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 있다.

치료용 조성물의 경우, 본 발명의 제형은 경구, 비측 (nasal), 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제형은 단위 투여량 형태로 제공되는 것이 편리할 수 있으며, 제약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여량을 제공하도록 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여량 형태를 제조하기 위해서 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 상기 양은 100％를 기준으로 활성 성분 약 0.01％ 내지 약 99％, 바람직하게는 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 1％ 내지 약 30％의 범위일 것이다.

또한, 질 투여에 적합한 본 발명의 제형으로는 당업계에서 적절하다고 공지되어 있는 상기 담체를 함유하는 질좌제, 탐폰, 크림제, 겔제, 페이스트제, 포움 (foam)제 또는 분무제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위 한 투여 형태로는 산제, 분무제, 연고제, 페이스트제, 크림제, 로션제, 겔제, 용액제, 패치 및 흡입제 등이 있다. 활성 화합물은 무균 조건하에 필요에 따라 제약상 허용가능한 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"이라는 어구는 장 투여 및 국소 투여 이외의, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내 (intracapsular), 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관 (transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지하거나, 계면활성제를 사용하여 적절히 유지할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 아쥬반트, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수도 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 문헌의 멸균 방법과, 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 사용 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 제약 제제의 흡수를 연장시키는 것은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노 스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 화합물을 의약품으로서 인간 및 동물에게 투여하는 경우, 이들은 화합물 단독으로 제공되거나, 예를 들어 활성 성분 0.01％ 내지 99.5％ (더욱 바람직하게는 0.1％ 내지 90％)을 제약상 허용가능한 담체와 함께 함유하는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.

적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물은 선택된 투여 경로와는 무관하게 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용가능한 투여 형태로 제제화된다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준을 변화시켜 환자에 대한 독성 없이 특정 환자에 대한 원하는 치료 반응, 조성물 및 투여 방식을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 알아낼 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 분비 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 배합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 전체적인 건강 및 기존의 병력, 및 의학 분야에 공지되어 있는 유사 인자를 비롯한 다양한 약물동태학 인자에 따라 달라질 것이다.

당업계의 통상의 기술을 가진 의사 및 수의학자라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정 및 처방할 수 있을 것이다. 예를 들면, 의사 및 수의사는 제약 조성물 중 사용된 본 발명의 화합물의 투여량을 원하는 치료 효과의 달성에 필요한 것보다 적은 수준에서 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진 적으로 늘릴 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내는 데 효과적인 가장 낮은 투여량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 투여량은 일반적으로 상기 기재된 인자들에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여인 것이 바람직하며, 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 원한다면, 치료용 조성물의 일일 유효 투여량을 하루 동안 적절한 간격으로 2회, 3회, 4회, 5회 이상의 분할 투여량으로 나누어서, 임의로는 단위 투여량 형태로 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 이 화합물은 제약 제제 (조성물)로 투여하는 것이 바람직하다.

치료용 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시양태에서 본 발명의 치료용 조성물을 바늘없는 피하 주사 장치, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호, 동 제5,383,851호, 동 제5,312,335호, 동 제5,064,413호, 동 제4,941,880호, 동 제4,790,824호 또는 동 제4,596,556호에 개시된 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 공지된 임플란트 및 모듈의 예로는 미국 특허 제4,487,603호 (약물을 조절된 속도로 분배하기 위한 이식가능한 미세주입 펌프를 개시함), 동 제4,486,194호 (피부를 통해 약물을 투여하는 치료 장치를 개시함), 동 제4,447,233호 (약물을 정밀한 주입 속도로 전달하는 약물 주입 펌프를 개시함), 동 제4,447,224호 (지속적인 약물 전달을 위한, 유속 변화성의 이식가능한 주입 장치를 개시함), 동 제4,439,196호 (다수개의 챔버 분획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함) 및 동 제4,475,196호 (삼투성 약물 전달 시스템을 개시함)가 포함된다. 상기 특허 문헌들은 본원에 참고로 도입된다. 많은 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들면, 혈뇌장벽(血腦障壁) (BBB)은 고도로 친수성인 다수의 화합물을 배제한다. 본 발명의 화합물이 (바람직하게는) BBB를 통과하는 것을 보장하기 위해, 상기 화합물을 예를 들어 리포좀으로 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호, 동 제5,374,548호 및 동 제5,399,331호 등을 참조한다. 리포좀은 특이적 세포 또는 기관으로 선택적으로 전달되어 표적화된 약물 전달을 강화시키는 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다 (예를 들어 문헌 [V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 표적화 성분의 예로는 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어 미국 특허 제5,416,016호 (Low et al.) 참조), 만노시드 [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038], 항체 ([P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357:140], [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180], 계면활성제 단백질 A 수용체 [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134] (그의 다른 종들은 본 발명의 제제 및 본 발명의 분자 성분들을 포함할 수 있음), p120 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090] (또한, 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123], [J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조)이 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서 본 발명의 치료용 화합물은 리포좀으로 제제화되며, 보다 바람직한 실시양태에서 리포좀은 표적화 성분을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리포좀내 치료용 화합물은 농축괴 주사에 의해 종양 또는 감염 근처의 부위로 전달된다. 본 발명의 조성물은 주사하기 쉬울 정도로 유동적이어야 한다. 이 조성물은 제조 및 보관 조건하에 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다.

"치료 유효 투여량"은 비처리된 대상체에 비해 종양 성장을 바람직하게는 약 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 40％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 60％ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 80％ 이상 억제한다. 화합물의 암 억제력은 인간 종양에서의 효능이 예측되는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 성질은 화합물의 억제력, 예를 들어 시험관내 억제력을 당업자에게 공지된 분석법으로 조사하여 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료용 화합물은 종양의 크기를 감소시키거나, 대상체에서 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자라면 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자를 기준으로 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물은 무균 처리되어 있어야 하며, 조성물이 주사에 의해 전달될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 담체는 물 이외에도 등장성 완충 염용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅물을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지하거나, 계면활성제를 사용하여 적절히 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것 이 바람직하다. 주사용 조성물을 장기간 흡수시키는 것은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 상기 조성물 중에 포함시켜 달성할 수 있다.

활성 화합물이 상기 설명된 바와 같이 적합하게 보호된 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 흡수가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다.

VI. 본 발명의 용도 및 방법

본 발명의 조성물 (예를 들어 EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체 및 그의 유도체/접합체)은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들면, 이들 분자를 배양, 예를 들어 시험관내 또는 생체외 배양 중의 세포에 투여하거나, 대상체, 예를 들어 생체내 투여하여 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 바람직한 인간 동물로는 EGFR의 발현, 전형적으로는 비정상적 발현 (예를 들어 과발현)을 특징으로 하는 질환에 걸린 인간 환자 등이 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 조성물은 종양발생성 질환, 예를 들어 EGFR을 발현하는 종양 세포, 예를 들어 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신 세포, 편평 세포, 폐 (비-소 세포) 및 두부 및 목의 종양 세포 등을 특징으로 하는 질환에 걸린 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 다른 질환, 예를 들어 자가면역 질환, 암, 건선 또는 염증성 관절염, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스-관련 관절염 또는 건선 관절염의 치료에 사용될 수도 있다. 본 발명의 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들 어 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.

본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)을 먼저 치료 또는 진단과 관련된 시험관내 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 ELISA 및 유식 세포 계수법을 이용하여 본 발명의 조성물을 시험할 수 있다. 또한, 이들 분자가 EGFR-발현 세포의 세포용해를 비롯한 1종 이상의 이펙터-매개된 이펙터 세포 활성을 촉발하는 능력을 분석할 수 있다. 이펙터 세포-매개된 식작용을 분석하는 프로토콜은 하기 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)은 EGFR 관련 질환의 치료 및 진단에 있어서 추가의 유용성을 갖는다. 예를 들면, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 다음과 같은 생물학적 활성의 하나 이상을 생체내 또는 시험관내 유발할 수 있다: EGFR-발현 세포에 대한 옵소닌화; 인간 이펙터 세포의 존재하에 EGFR-발현 세포의 식작용 또는 세포용해의 매개; EGFR-발현 세포에서 EGF 또는 TGF-α에 의해 유도되는 자가인산화의 억제; EGFR-발현 세포의 자가분비 EGF 또는 TGF-α에 의해 유도되는 활성화의 억제; 또는 예를 들어 낮은 투여량에서 EGFR-발현 세포의 성장 억제.

다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 세포의 보체-매개 용해를 유도할 수 없으며, 따라서 보체-활성화 통증을 촉발하는 데 있어서의 부작용, 예를 들어 여드름을 더 적게 유발한다. 여드름의 주요 원인은 피지를 생산하는 소 피막내의 각질화 양상의 변화이다. 각질세포는 EGFR을 발현하기 때문에, 피부에서 EGFR 신호전달 경로를 방해하는 것은 소포에서의 각질세포 성장 및 분화 및 이로 인한 여드름의 형성을 변경시킬 수 있한다. 직접적인 면역형광 연구 결과는 초기 비-염증성 및 염증성 여드름 병소 내에서 고전적인 다른 보체 경로가 활성화됨을 나타낸다.

특별한 실시양태에서, 인간 항체 및 그의 유도체는 생체내에서 다양한 EGFR-관련 질환의 치료, 예방 또는 진단에 사용된다. EGFR-관련 질환의 예로는 다양한 암, 예를 들어 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 난소암, 전립선암, 신 세포암, 편평 세포암, 폐 (비-소 세포)암 및 두부암 및 목암 등이 있다. 다른 EGFR-관련 질환으로는 특히 자가면역 질환, 건선 및 염증성 관절염을 들 수 있다.

본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)의 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용된 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 사용된 특정 약물에 따라 달라질 것이다. 상기 분자를 문헌 [Goldenberg, D. M. et al. (1981) Cancer Res. 41:4354-4360] 및 유럽 특허 제EP 0365 997호에 기재된 바와 같이 방사성핵종, 예를 들어 131I, 90Y, 105Rh 등에 연결할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)을 항-감염성 작용제에 연결할 수도 있다.

다른 실시양태에서, 인간 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 치료제, 예를 들어 화학요법제와 공동투여하거나, 다른 공지의 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선과 공동투여할 수 있다. 이러한 치료제로는 특히 항신생물제, 예 를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스프아미드 히드록시우레아를 들 수 있으며, 이들 자체만으로는 환자에 대해 독성이거나 아독성인 수준에서만 효과적인 뿐이었다. 시스플라틴은 4주에 1회 100 mg/m²의 투여량으로 정맥내 투여되며, 아드리아마이신은 21일에 1회 60 mg/m² 내지 75 mg/m²의 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-EGFR 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공동투여는 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공동투여에 의해, 약물에 대한 종양 세포의 내성 발생 또는 종양 세포의 항원성 변화 (이는 종양 세포가 항체에 대해 비반응성이 되게 함)로 인한 문제를 해결할 수 있다.

또한, 표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포를 치료제로 사용할 수도 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 천연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원한다면, 이펙터 세포를 치료될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리적으로 허용가능한 용액 중 세포의 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 10⁸개 내지 10⁹개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이 양은 표 적 세포, 예를 들어 EGFR을 발현하는 종양 세포에서의 국소화 달성에 충분한 양이며, 예를 들어 식작용에 의한 세포 사멸 수행에 충분한 양이다. 또한, 투여 경로는 달라질 수도 있다.

표적-특이적 이펙터 세포를 이용한 요법은 표적화된 세포를 제거하는 다른 기술을 병행하면서 수행할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자) 및(또는) 이들 조성물로 보강된 이펙터 세포를 사용하는 항종양 요법은 화학요법과 병행하여 이용할 수 있다. 추가로, 조합 면역요법을 이용하여 종양 세포 거부에 대하여 2가지 별개의 세포독성 이펙터 집단을 지시할 수 있다. 예를 들면, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 연결된 항-EGFR 항체는 IgG-수용체 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 사용하여 이펙터 세포 상에서 FcγR 또는 FcαR 수준을, 예를 들어 세포 표면 상의 수용체를 캡핑 및 제거함으로써 조정할 수도 있다. 이러한 목적을 위해 항-Fc 수용체의 혼합물을 사용할 수도 있다.

또한, 보체와 결합하는 보체 결합 부위, 예를 들어 IgG1, -2 또는 -3 또는 IgM 유래의 부분을 보유하는 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)을 보체의 존재하에 사용할 수도 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 작용제 및 적절한 이펙터 세포를 사용하는, 표적 세포를 포함하는 세포 집단의 치료는 보체 또는 보체 함유 혈청의 부가에 의해 보충할 수 있 다. 본 발명의 결합 작용제로 코팅된 표적 세포의 식작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포를 보체로 용해시킬 수도 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)은 보체와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위에 속한다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자에 밀접하게 근접하여 위치한다는 점에서 유리하다. 별법으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 따로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자) 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위에 속한다. 상기 키트는 1종 이상의 추가의 시약, 예를 들어 보체, 또는 1종 이상의 추가의 본 발명의 인간 항체 (예를 들어 EGFR 항원에서 제1 인간 항체와는 별개의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 보유하는 인간 항체)를 추가로 함유할 수 있다.

다른 실시양태에서, 예를 들어 대상체를 사이토킨으로 처리하는 것에 의해 Fcγ 또는 Fcα 수용체의 발현 또는 활성을 조정, 예를 들어 강화 또는 억제하는 작용제로 대상체를 추가로 처리할 수 있다. 다중특이적 분자로의 처리 동안 투여 에 바람직한 사이토킨은 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.

다른 실시양태에서, 대상체를 림포킨 제제로 추가로 처리할 수 있다. EGFR를 고도로 발현하지 않는 암 세포는 림포킨 제제를 사용하여 그렇게 하도록 유도할 수 있다. 림포킨 제제는 보다 효과적인 요법을 유도할 수 있는 종양 세포 중에서 EGFR의 보다 상동성인 발현을 야기할 수 있다. 투여에 적합한 림포킨 제제는 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 및 이들의 배합물을 포함한다. 이들은 정맥내 투여될 수 있다. 림포킨의 적합한 투여량은 환자 당 10,000 내지 1,000,000 유닛의 범위이다.

또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자)을 사용하여, 예를 들어 FcγR 또는 EGFR-발현 세포를 표지하기 위해 이들 세포를 표적화할 수 있다. 이러한 용도를 위해, 결합제를 검출할 수 있는 분자에 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 EGFR 등과 같은 Fc 수용체-발현 세포를 생체외 또는 시험관내에서 국소화시키는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어 방사성동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 EGFR에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 EGFR 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건하에서 샘플 및 대조군 샘플을 상기 항체 또는 그의 일부와 접촉시키는 단계를 포함하 는, EGFR 항원의 존재를 검출하거나 EGFR 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 복합체 형성을 검출하는데, 이때 시험 샘플에서의 복합체 형성이 대조군 샘플과 차이가 있는 것이 상기 샘플 내 EGFR 항원의 존재에 대한 지표이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 Fc-발현 세포의 존재를 검출하거나 Fc-발현 세포의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상체에게 검출가능한 마커에 접합된 본 발명의 조성물 (예를 들어 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 투여하는 단계 및 (ii) 대상체를 상기 검출가능한 마커 검출용 수단에 적용시켜 Fc-발현 세포를 함유하는 영역을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명을 하기의 실시예로 추가로 예시하지만, 본 발명이 이에 추가로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 언급된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 참고로 명백하게 도입된다.

재료 및 방법

항원: 트랜스제닉 마우스를 A431 인간 유표피 암종 세포주 (미국 버지니아주 마나사스에 소재하는 ATCC, CRL-1555, 제품 번호 203945) 및 시그마 케미칼 컴파니로부터 구입한 가용성 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) (제품 E 3641 제품 번호 109H4108 및 20K4079)로 면역화시켰다. 가용성 EGFR는 사용할 때까지 -20 내지 -80℃에서 저장하였다.

배지 제조: (A) 10％ FBS, 페니실린-스트렙토마이신 (시그마 P-7539) 및 2- 메르캅토에탄올 (깁코 (Gibco) BRL 21985-023)을 함유하는 고 글루코스 DMEM (메디아테크 (Mediatech) 제품, 셀그로 (Cellgro) # 10013)를 사용하여 A431 세포 및 골수종 세포를 배양하였다. 추가의 배지 보충물을 하이브리도마 성장 배지에 첨가하며, 이는 오리진-하이브리도마 클로닝 인자 (이겐 (Igen) 21001), OPI 보충물 (시그마 O-5003), HAT 또는 HT (시그마 H 0262, H 0137)를 포함하였다. (B) 무혈청 배지는 DMEM, 항생제 및 2-메르캅토에탄올만을 함유하였다.

면역화용 세포: 면역화용 세포를 T-75 세포 배양 플라스크상에서 전면생장에 이르도록 DMEM (상기 참조) 내에서 성장시켜, 플라스크 당 트립신 EDTA (셀그로우 (Cellgrow), 카탈로그 번호 25-053-Cl) 용액 5 내지 10 mL를 사용하여 수거하였다. 플라스크로부터 회수된 세포를 완전 배지 50 mL에 재현탁시킨 다음, 3회 원심분리 (1000 G)하여 멸균 PBS 50 mL 중에 재현탁시켰다. 마우스에게 멸균 PBS 50 mL에 현탁된 1 ×10⁷개 세포를 주사하였다.

EGFR: 가용성 EGFR를 멸균 PBS 중의 Ribi 아쥬반트 (시그마, M 6536)와 25 ㎍ EGFR/100 ㎕의 농도로 혼합하였다. 멸균 PBS 중의 가용성 EGFR를 사용하여 최종 꼬리 정맥 면역화를 수행하였다.

트랜스제닉 마우스: 마우스를 필터 케이지에 수용하고 융합일에 양호한 신체 조건인지를 평가하였다. 선택된 하이브리도마를 생산하는 마우스는 6 내지 8주령의 수컷 (CMD)++; (HCo7)11952+; (JKD)++; (KCo5)9272+ 유전자형이었다 (표 1 참조).

유전자형 데이터*
마우스	성별	출생일	유전자형
20241	수컷	9/21/99	CMD++	(HCo7)11952+	(JKD)++	(KCo5)9272
20242	수컷	9/21/99	CMD++	(HCo7)11952+	(JKD)++	(KCo5)9272
20243	수컷	9/21/99	CMD++	(HCo7)11952+	(JKD)++	(KCo5)9272
*개개의 트랜스진 명칭은 괄호 내의 무작위로 통합된 트랜스진에 대한 일련 번호를 따른다. 기호 ++ 및 +는 동형접합성 또는 반접합성임을 나타내지만, 마우스는 통상적으로 무작위로 통합된 인간 Ig 트랜스진에 대해 이종접합성 (heterozygosity) 및 동형접합성 사이를 구별할 수 없는 PCR계 분석법을 이용하여 스크리닝되기 때문에, + 기호가 이들 요소에 대해 실질적으로 동형접합성인 마우스를 제시할 수 있다.

항체: 하기의 항-EGFR MAb를 시험관내 및 생체내에서 사용하였다: 2F8 ("Humax-EGFR"라고도 지칭함), 인간 IgG1 항-EGFR 항체 (네덜란드 우트레흐트에 소재하는 젠맵 (Genmab) 제품); 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 메릴랜드주 록빌에 소재하는 ATCC, HB-8508)로부터 수득한, 하이브리도마 생산 m225, 마우스 IgG2a 항-EGFR 항체; 무관한 IgG1 항체로서 사용된 무관한 인간 IgG 이소타입 대조군 (젠맵 제품); 및 간접 면역형광체 (미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재하는 프로토스 (Protos) 제품)에 대한 2차 항체로서 사용된 염소 항-마우스 IgG (H+L)의 형광성 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 F(ab')₂ 단편, FITC-접합된 F(ab')₂ 토끼-α-인간 IgG (덴마크 글로스트루트에 소재하는 DAKO 제품).

2F8 하이브리도마를 10％ 소 태아 혈청 (FBS) (미국 유타주 로간에 소재하는 히클론 (Hyclone) 제품) 및 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신 (둘다 깁코 BRL 제품) (pen/strep)이 보충된 DMEM (깁코 BRL, 영국 스코틀랜드 페이즐리에 소재하는 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies) 제품)에서 배양하였다. m225 하이브리도마를 15％ FBS (히클론 제품) 및 pen/strep (둘다 깁코 BRL 제품)가 보충된 RPMI1640 (깁코 BRL)에서 배양하였다. 모든 세포주를 5％ 이산화탄소 함유 습윤 분위기하에 37℃에서 유지시켰다. Humax 항체를 단백질-A 친화도 크로마토그래피한 후에 HR200 컬럼 (미국 뉴저지주에 소재하는 파르마샤 제품)상에서의 크기 배제를 이용하여 정제하였다. 마우스 항체를 단백질-G 크로마토그래피한 후에 HR200 컬럼상에서의 크기 배제를 이용하여 정제하였다. 모든 항체의 순도는 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 95％ 초과인 것으로 측정되었다. F(ab') 단편을 펩신 또는 β-메르캅토에탄올로 처리한 후에, 단백질-A/G 정제에 의해 제조하였다. 단리된 F(ab') 단편은 SDS-PAGE에 의해 측정된 바 95％ 순도를 초과하였다.

세포주: EGFR를 고도로 과발현하는 유표피 암종인 A431를 ATCC (미국 메릴랜드주 록빌에 소재, CRL-155)로부터 수득하였다. 세포를 10％ 열-불활성화 FBS (히클론 제품), 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 50 IU/mL 페니실린 및 4 mM L-글루타민 (모두 깁코 BRL 제품)이 보충된 RPMI 1640 배지 (깁코 BRL)에서 배양하였다. 세포들은 유착 성장하기 때문에, 이들을 PBS 중의 트립신-EDTA (영국 스코틀랜드 페이즐리에 소재하는 라이프 테크놀로지 제품)를 사용하여 분리하였다. 종양 모델에 있어서, 세포는 항상 대수기 상태로 사용하였다. 세포를 각각의 실험 전에 안정한 EGFR-발현 및 미코플라스마 오염에 대해 시험하였다.

융합 절차: 갓 안락사한 마우스로부터 비장을 멸균 수거하여, 페트리 플레이트 내의 20 내지 30 mL 냉 무혈청 배지 (SFM)에서 유지시켰다. 유착 조직을 제거하고, 비장을 SFM로 2회 세정하였다. 비장 세포를 SFM 중에서 조직 분쇄기로 균질화시킴으로써 완만하게 수거하였다.

세포를 1000 g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 비장 세포 펠렛을 빙냉 0.17 M NH₄Cl에 2 내지 5분 동안 현탁시킴으로써 세포 펠렛 중의 적혈구를 용해시켰다. 세포 혼합물을 SFM 20 mL 중에 희석시킨 다음, 1000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 골수종 세포를 50 mL 원심분리 튜브에 수거하였다. 비장 세포 및 골수종 세포를 1000 g에서의 원심분리 3회에 의해 세척한 다음, SFM 30 내지 40 mL에 재현탁시켰다.

세포 계수 후에, 비장 및 골수종 세포를 비장/골수종 1:1 내지 4:1 비로 혼합하였다. 비장 세포/골수종 세포 혼합물을 원심분리에 의해 펠렛화시키고 상등액을 흡인에 의해 제거하였다. 융합을 PEG 용액 (시그마 # P-7181) 1 내지 2 mL를 세포 펠렛에 45초에 걸쳐 적가하고 용액을 75초 동안 완만하게 혼합함으로써 융합을 수행하였다. 추가 2 mL의 SFM을 사용하여 이를 반복한 다음, 용액을 1분 동안 유지시켰다.

용액을 추가 30 mL의 SFM을 90초에 걸쳐 서서히 희석시켰다. 세포를 1000 g에서 10분 동안 원심분리하고 HAT 배지 30 mL에 재현탁시켰다. 융합 혼합물을 3％ 오리진 하이브리도마 클로닝 인자를 함유하는 HAT 보충 배지에 200 내지 300 mL로 희석시키고 96웰 플레이트에 > 200 ㎕/웰 (약 10 내지 15개 플레이트/비장)로 분산시켰다. 하이브리도마 플레이트를 하이브리도마에 대해 3 내지 7일 동안 조사하였다. 각각의 웰 내의 배지 절반을 3％ 오리진이 보충된 신선한 HT 배지로 대체함으로써 플레이트에 7일 동안 공급하였다. 이후에 플레이트에 3일 내지 4일 마다 HT 배지를 공급하였다.

ELISA 시약:

1. 인산염 완충 염수 (PBS), Ca 및 Mg 비함유 D-PBS, 히클론 D-PBS # SH30013.03 또는 시그마 P 3813.

2. PBS-T (세척 완충액), 0.05％ Tween 20 함유 PBS, 시그마 P-1379.

3. PBS-T + 1％ BSA (시그마 A 9647). 이들은 블로킹 완충액 및 샘플 완충액으로서 작용한다.

4. ELISA 플레이트, 넌크 이뮤노-플레이트 F96 맥시소르프 (Maxisorp) 442404.

5. 항-인간 IgG γ-쇄 특이적 항체, 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoRresearch) 제품 #109-006-098.

6. 알칼리성 포스파타제 표지된 염소 항-인간 γ-쇄 특이적 IgG, 잭슨 이뮤노리서치 제품 #109-056-098. 별법은 알칼리성 포스파타제 표지된 항-인간 κ, 시그마 A 3813을 사용하는 것이다.

7. 이소타입 특이적 ELISA에서 사용하기 위한 알칼리성 포스파타제 표지된 항-인간 IgG1 또는 IgG3, 써던 바이오테크놀로지 # 9050-04 & 9210-04.

8. p 니트로페닐 (pNPP), 시그마 N2765, 또는 시그마 고속 정제 키트 N-2770.

9. pNPP 기질 및 완충액 - 하기 2가지 중에서 선택함:

A. 디에탄올아민 완충액: 97 mL 디에탄올아민, 시그마 D-2286 + 0.1 g MgCl₂ㆍ6H₂O 및 800 mL 증류수를 혼합한다. pH를 9.8로 조정하고 최종 용적을 증류수로 1.0 L로 조정한다. 20 mL 디에탄올아민 완충액 당 pNPP, 시그마 N-2765의 하나의 20 mg 정제를 첨가한다.

B. 시그마 고속 pNPP 정제 세트, 시그마 N-2770: 하나의 완충액 정제 및 하나의 pNPP 정제를 20 mL H₂0에 용해시킨다.

10. 405 nm 필터를 사용하는 ELISA 플레이트 판독기.

11. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 시그마 E 3641, 바이오틴 표지된 EGF (EGF-B), 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) E-3477.

12. 바이오틴 표지된 항-EGFR MAb 또는 인간 항체.

13. 음성 대조군용 비-특이적 인간 항체 또는 정제된 인간 IgG1 κ, 시그마 1-13889.

14. 자동화 ELISA 플레이트 세척기: 타이터텍 (Titertek) MAP C.

항 인간 IgG, κ ELISA: MAb를 생산하는 인간 IgG, κ에 대한 하이브리도마 플레이트를 스크리닝하기 위해, ELISA 플레이트를 항-인간 IgG γ-쇄 특이적 항체, 잭슨 이뮤노리서치 제품 #109-006-098 1 ㎍/mL로 밤새 또는 더 오랫동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 플레이트 세척기로 세척하고, PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 플레이트를 15분 이상 인큐베이션한 다음, 세포 배양 상등액 10 내지 50 ㎕를 양성 대조군으로서 IgG 및 음성 대조군으로서 세포 배양 배지가 포함된 각각의 웰 중 수개의 웰과 함께 ELISA 플레이트 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, PBS-T + 1％ BSA 중의 알칼리성 포스파타제 표지된 항-인간 κ 항체 (시그마 A-3813) 1:5000을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트 세척기로 4회 세척한 다음, pNPP 기질을 첨가하였다. 플레이트를 10 내지 60분 동안 인큐베이션하고, 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기로 405 nm에서 판독하였다.

항-EGFR 인간 항체의 특이성을 시험하기 위한 ELISA 절차 - 항체의 EGFR 코팅된 ELISA 플레이트에의 직접 결합: 항-EGFR 항체가 EGFR에 특이적으로 결합하는 것을 입증하기 위해, 넌크 맥시소르프 플레이트를 4℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 PBS 중의 0.4 ㎍/mL에서 EGFR 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰을 첨가하여, 플라스틱 표면상에서 비-특이적 부위를 블로킹하고, 샘플 로딩 전에 15분 이상 인큐베이션하였다. 시험할 샘플의 희석액을 PBS-T + 1％ BSA에 로딩하였다. 상등액을 ELISA 플레이트에 로딩하기 위해 PBS-T + 1％ BSA에 최소 1:3으로 희석시켰다. 샘플 및 표준물을 100 ㎕씩 웰에 로딩하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다. 알칼리성 포스파타제 표지된 염소 항-인간 γ 특이적 항체를 함유하는 PBS-T + 1％ BSA의 1:3000 내지 1:5000 희석액 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 별법으로, 알칼리성 포스파타제 표지된 항-인간 κ를 사용할 수 있다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 4회 세척하고, pNPP 기질을 첨가하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다.

항-EGFR 인간 항체의 특이성을 시험하기 위한 ELISA 절차 - ELISA EGF/EGFR 차단 분석법: 항-EGFR 항체가 EGFR에 결합하여 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 대한 바이오틴 표지된 표피 성장 인자의 결합을 추가로 차단한다는 것을 입증하기 위해, 넌크 맥시소르프 플레이트를 4℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 PBS 중의 0.4 ㎍/mL에서 EGFR 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰을 첨가하여, 플라스틱 표면상에서 비-특이적 부위를 블로킹하고, 샘플 로딩 전에 15분 이상 인큐베이션하였다. 시험할 샘플의 희석액을 PBS-T + 1％ BSA에 로딩하였다. 상등액을 ELISA 플레이트에 로딩하기 위해 PBS-T + 1％ BSA에 최소 1:3으로 희석시켰다. 샘플 및 표준물을 100 ㎕씩 웰에 로딩하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 0.5 ㎍/mL 농도의 바이오틴 표지된 EGF 20㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 배양하였다 (이들을 플레이트상에서 미리 샘플 용액에 첨가함). 별법으로, 샘플을 1시간 동안 배양하고, 세척하고, 0.1 ㎍/mL 농도의 EGF-바이오틴 100 ㎕/웰을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 3회 세척하고, 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제를 함유하는 PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰을 1:2000 희석액으로 첨가한 다음, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 4회 세척하고, pNPP 기질을 첨가하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다.

항-EGFR 인간 항체의 에피토프 특이성을 측정하기 위한 경쟁적 ELISA - 시판용 뮤린 MAb 225, 528, AB5 및 29.1과의 경쟁: 본 분석법을 수행하여 MAb가 항체 225, 528, AB5 및 29.1과 가장 유사한지를 측정하였다. MAb 225, 528 및 AB5가 EGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하고 EGFR의 생체내 내인성 티로신 키나제 활성을 억제하였다. MAb 29.1은 EGFR의 탄수화물 잔기에 결합하는 비-차단 MAb이다. 플레이트를 PBS 중의 EGFR 0.4 ㎍/mL로 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 코팅하고, 세척하고, PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰로 블로킹하였다. 블로킹 용액을 플릭킹시키고, PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰을 플레이트 좌측상의 컬럼 1 내지 6에 첨가하는 동시에 1 ㎍/mL (100 ㎕/웰) 농도의 표지되지 않은 마우스 MAb를 플레이트 우측상의 컬럼 7 내지 12에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세포 배양 상등액 25 ㎕를 플레이트의 각각의 절반의 대등한 위치에 첨가하여 각각의 상등액을 하나의 웰상에는 PBS-T + 1％ BSA와 함께 로딩하고, 다른 하나의 웰상에는 마우스 MAb와 함께 로딩하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 알칼리성 포스파타제 표지된 항-인간 IgG Fc 항체를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 기질을 첨가하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다. MAb로부터의 경쟁률％를 하기 식에 의해 측정하였다: (경쟁 부재하의 OD 상등액 - MAb 경쟁 존재하의 OD 상등액/경쟁 부재하의 OD 상등액) ×100.

항-EGFR 인간 항체의 에피토프 특이성을 측정하기 위한 경쟁적 ELISA - 바이오틴 표지된 인간 항체와의 경쟁적 ELISA: 경쟁적 ELISA 분석법을 또한 수행하여 항-EGFR 인간 항체의 특이성을 측정하였다. 플레이트를 PBS 중의 EGFR 0.4 ㎍/mL로 실온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 PBS-T + 1％ BSA 100 ㎕/웰로 블로킹하였다. 10 내지 30 ㎍/mL의 표지되지 않은 인간 항체 또는 마우스 MAb 50 ㎕를 플레이트의 상부 웰(들)에 첨가하고한 후에 50 ㎕를 옮기고, 각각의 컬럼의 상부에서 하부로 연속 혼합하여 각각의 항체의 3배 희석 계열을 생성하였다. 50 ㎕를 혼합 후에 하부 웰로부터 경사에 의해 제거하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 바이오티닐화된 항-EGFR 인간 항체 또는 표지되지 않은 마우스 항-인간 EGFR 항체 20 ㎕/웰을 전체 플레이트에 첨가하여 경쟁 항체의 최종 농도가 대략 0.1 내지 0.2 ㎍/mL가 되도록 하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 (PBS-T-BSA 중의 1:2000) 또는 알칼리성 포스파타제 표지된 염소 항-마우스 IgG 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 기질을 첨가하였다. 흡광도를 405 nm에서 판독하였다.

항-EGFR 인간 항체의 특이성을 시험하기 위한 FACS 절차 - EGF/EGFR 차단: 본 분석법을 이용하여 항-EGFR 항체가 세포 표면상에서 EGFR에 결합하고, 이러한 결합에 의해 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 대한 바이오틴 표지된 표피 성장 인자 (EGF-B)의 결합을 차단한다는 것을 입증하였다. 본 FACS계 방법은 약 10⁶개 EGFR 분자/세포를 발현하는 인간 표피 암종 세포주 A431을 사용한다.

EGFR FACS 분석법용 재료:

1. 하나 이상의 T-175 플라스크 중의 전면생장된 A431 세포 (ATCC CRL 1555). A431 세포를 DMEM + 10％ FCS 중에서 배양한다.

2. 트립신-EDTA 용액, 시그마 T-3924.

3. 바이오틴 표지된 EGF. 약 5 ㎍/mL의 원액을 제조하고, 10 ㎕/웰을 사용한다.

4. 환저 96웰 플레이트.

5. 멸균 PBS.

6. PBS + 1％ BSA + 0.02％ 나트륨 아지드 (FACS 완충액).

7. PE-표지된 스트렙타비딘, 시그마 S 3402. FACS 완충액 중에서 1:20으로 희석시킨다.

8. PE-표지되거나 FITC-표지된 항 인간 IgG, FCγ 특이적, 파르미니겐 (Pharminigen) 34164X, 34165X.

9. 선회 버킷 및 96웰 플레이트용 어댑터 (벡크만 (Beckman) 제품)를 사용한 저속 원심분리.

10. FACS

11. BD FACS 튜브.

절차: A431 세포를 트립신 EDTA 처리에 의해 수거하였다. 조직 배양 플라스크로부터 배지를 제거하고, 플라스크를 멸균 PBS 또는 HBSS 10 내지 20 mL로 단시간 동안 세정하였다. 트립신 EDTA 5 내지 10 mL를 가하고 플라스크를 재차 수분 동안 인큐베이션하였다. 세포가 플라스틱 표면으로부터 분리되기 시작하면, 10 mL 피펫을 사용하여 세포를 플라스틱 표면으로부터 주사기로 온화하게 주입하고 너무 많은 세포 덩어리 없이 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포 배양 배지 (FBS 함유) 20 내지 30 mL를 함유하는 50 mL 튜브에 세포를 옮기고, 1000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 원심분리 및 세포의 냉 FACS 완충액 중의 재현탁에 의해 2회 세척하였다. 세포 용액을 나일론 메쉬를 통해 여과하여 세포 덩어리를 제거하였다 (이를 위해 BD FACS 튜브의 상부를 장착함). 세포를 계수하고, 용적을 mL 당 1 내지 5 ×10⁶개 세포가 존재하도록 조정하였다. 세포를 환저 96웰 플레이트에 약 200,000개 세포/웰로 분산시키고 1000 g에서 약 1분 동안 원심분리한 다음, 액체를 플릭킹시켰다 (세포는 웰 하부에 존재하여야 함). 플레이트를 빙상 또는 4℃에서 유지시켰다. 별개의 96웰 플레이트에서, 10 ㎍/mL에서 시작하여 4.5 ng/mL로 감소하는 3배 희석 계열을 제조함으로써 FACS 완충액 중의 항체 샘플 희석액을 제조하였다. 항체 희석액, 이소타입 대조군 및 완충액 대조군 각각의 100 ㎕를 환저 플레이트에 첨가하였다. 항체 샘플 및 대조군을 세포와 혼합하여 빙상에서 30분 동안 배양하였다. 바이오틴 표지된 EGF 10 ㎕를 항체 세포 용액과 혼합하여 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리 및 FACS 완충액 중의 재현탁에 의해 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 PE 50 ㎕/웰을 첨가하고, 혼합하여 빙상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 3회 세척하고 50 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시켰다. 각각의 웰의 내용물을 FACS 완충액 300 내지 400 ㎕를 함유하는 튜브에 옮겼다. 각 샘플마다 5000 내지 10000개 세포를 FL-2 채널 중에서의 FACS로 분석하였다. MCF 대 항체 농도를 플롯팅하였다.

인간 또는 동물 유래 물질: A431 인간 유표피 암종 세포주 (미국 버지니아주 마나사스에 소재한 ATCC의 CRL-1555, 제품 번호 203945). 트립신 EDTA (셀그로우 카탈로그 번호 25-053-Cl). P3 X63 ag8.653 골수종 세포주: ATCC CRL 1580, 제품 번호 F-15183 오리진-하이브리도마 클로닝 인자 (이겐 21001). OPI 보충물 (시그마 O-5003) 소 태아 혈청 (SH30071 제품 번호 ALE10321 및 AGH6843) (미국 유타주 로간에 소재하는 히클론 제품). 오리겐 동결 배지 (이겐, # 210002).

ELISA: EGFR에 대한 인간 항체의 결합을 측정하기 위해, EGFR (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 제품)를 PBS 중 1 ㎍/mL의 농도로 밤새 코팅한 96웰 미량역가 플레이트 (독일 프릭켄하우젠에 소재하는 그라이너 (Greiner) 제품)상에서의 ELISA를 이용하였다. 플레이트를 100 ㎕/웰의 농도의 ELISA 완충액 (PBS/.05％ Tween 20 및 1％ 닭 혈청 (깁코 BRL))으로 블로킹한 후, ELISA 완충액 중에 희석된 모노클로날 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 연속적으로 3회 세척하고, 퍼옥시다제 표지된 염소 항-인간 특이적 IgG Fc (펜실베니아주 웨스트 그레이스에 소재하는 잭슨 (Jackson) 제품)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ABTS (독일 만하임에 소재하는 로슈 디아그노스틱스 (Roche Diagnostics) 제품)를 사용하여 분석법을 30분 동안 전개하였다. 흡광도를 미크로플레이트 판독기 (캐나다 위누스키에 소재하는 바이오텍 (Biotek) 제품)로 415 nm에서 측정하였다. 차단 연구와 관련하여, 플레이트를 ELISA 완충액 중의 50 ㎕ 블로킹제와 함께 10분 동안 예비인큐베이션한 후, 완전한 인간 항체 50 ㎕를 첨가하였다. 마우스 혈청 중의 인간 IgG를 측정하기 위해, ELISA 플레이트를 96웰 미량역가 플레이트 (그라이너 제품) 내의 PBS 중에서 토끼 항-인간 카파, 경쇄 (DAKO)로 코팅하였다. 플레이트를 ELISA 완충액 (PBS/.05％ Tween20 및 1％ 닭 혈청) 100 ㎕/웰로 블로킹한 후, ELISA 완충액에 희석된 마우스 혈청을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 연속적으로 3회 세척하고 퍼옥시다제 표지된 토끼 F(ab')₂ 단편 항 인간 IgG (DAKO)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ABTS (로슈 제품)를 사용하여 분석법을 30분 동안 전개하였다. 흡광도를 미크로플레이트 판독기 (캐나다 위누스키에 소재하는 바이오텍 제품)로 415 nm에서 측정하였다.

유식 세포 계수법: EGFR를 과발현하는 종양 세포를 MAb와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1％ 소 혈청 알부민 (로슈 제품) 및 0.01％ 아지드가 보충된 인산염 완충 식염수로 3회 세척하였다. 대조 염색을 염소 항-마우스 항체의 FITC-접합된 F(ab')₂ 단편 또는 토끼 항-인간 IgG 항체의 FITC-접합된 F(ab')₂ 단편을 사용하여 수행하였다. 억제 실험과 관련하여, 세포를 EGF 또는 TGF-α와 함께 4℃에서 10분 동안 예비인큐베이션하였다. 모든 샘플을 FACScan 유식 세포계수기 (미국 캘리포니아주 산호세에 소재하는 벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson) 제품)상에서 분석하였다.

인산화 연구: 24웰 플레이트 (덴마크 캄스트루프에 소재하는 넌크 제품) 내에서 A431 세포의 전면생장에 이르지 못한 배양물을 저 혈청 조건 (0.5％)하에 밤새 처리하였다. 상이한 항체 희석액을 웰에 첨가하여 37℃ 및 5％ 이산화탄소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5 ng/mL EGF (미국 뉴저지주 록키 힐에 소재하는 프리포테크 (Prepotech) 제품)의 존재 또는 부재하에 37℃ 및 5％ 이산화탄소에서 5분 동안 자극시켰다. 세포 추출물을 토믹 등 [Tomic et al, 1995]에 의해 기재된 바와 같이 웰 당 용해 완충액 100 ㎕를 사용하여 제조하였다. A431 세포 추출물 50 ㎕를 나트륨 SDS-PAGE 및 항-포스포-티로신 항체 (PY20, 미국 켄터기주에 소재하는 트랜스덕션 래버러토리즈 (Transduction Laboratories) 제품), 염소 항 마우스 IgG-HRP 항체 (트랜스덕션 래버러토리즈 제품) 및 ECL 검출을 이용하는 면역블롯팅에 의해 분석하였다. TGF-α (미국 뉴저지주 록키 힐에 소재하는 프리포테크 제품)로의 자극을 위해, 24웰 플레이트 (넌크 제품)에서 A431 세포의 전면생장에 이르지 못한 배양물을 저 혈청 배지 (0.5％)로 밤새 처리하였다. 항체를 10 또는 0 ㎍/mL의 고정량으로 첨가하고 상기한 바와 같이 인큐베이션하였다. 세포를 증가하는 양의 TGF-α로 자극시켰다. 세포를 상기한 바와 같이 처리하였다.

시험관내 세포 성장 억제: 완전한 인간 항체의 세포 성장 억제 특징을 비-방사성 억제 분석법으로 평가하였다. 간략하게, 2 ×10⁴개/mL A431 세포 100 ㎕를 평저 조직 배양 플레이트에 첨가하고 세포 배양 인큐베이터 내에서 유지시켰다. 2시간 후에, 100 ㎕ 항체 희석액을 첨가하고 세포 배양 인큐베이터 내에서 다시 유지시켰다. 세포를 6 내지 7일 동안 인큐베이션하고, 상등액을 경사에 의해 제거하고, PBS 중의 0.25％ 글루타르알데히드 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 후에, 웰을 순수 (demi-water)로 2회 세척하였다. 순수 중의 1％ 크리스탈 바이올렛 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 순수로 2회 세척한 후, 플레이트를 플레이트 진탕기상에서 30분 동안 100％ 메탄올로 전개하였다. 흡광도를 650nm 참조 필터와 함께 550nm 필터를 사용하는 미크로플레이트 판독기로 측정하였다. 상대 세포 증식 백분율은 특정한 3벌 항체의 농도로부터의 평균 흡광도를 항체가 첨가되지 않은 웰로부터의 평균 흡광도로 나눈 다음, 100을 곱하여 측정하였다.

이펙터 세포 단리: 문헌 [Repp, et al. (1991) Blood 78: 885-889]에 기재된 방법으로부터 경미하게 변형된 방법에 의해 말초 백혈구를 단리하였다. 간략하게, 헤파린-항응고혈을 피콜 구배상에 층상화시켰다. 원심분리 후에, 이펙터 세포를 간기로부터 수거하고, 잔류하는 적혈구를 저장성 용해에 의해 제거하였다. 사이토스핀 제제를 사용하여 단리된 세포의 순도가 95％보다 높은 것으로 평가하였다. 트리판 블루 배제에 의해 측정된 세포의 생존율은 95％를 초과하였다.

ADCC 분석법: 종양 세포를 용해하는 완전한 인간 항체의 능력을 ⁵¹크롬 방출 분석법 (문헌 [Valerius, et al. (1993) Blood, 82: 931-939] 참조)으로 평가하였다. 단리된 인간 백혈구를 이펙터 공급원으로서 사용하였다. 간략하게, 종양 표적을 100 μCi ⁵¹Cr과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지로 3회 세척한 후에, 50 ㎕의 단리된 이펙터 세포 및 감작화 MAb 세포를 함유하는 환저 배양 플레이트에 5 ×10³개 표적 세포를 첨가하고 배양 배지에 희석시켰다. 최종 용적은 200 ㎕이고, 이펙터 대 표적 세포 비 (E:T)는 80:1이다. 분석법을 37℃에서 밤새 인큐베이션하고 원심분리에 의해 정지시켰다. 크롬 방출을 3벌씩 상등액 중에서 측정하였다. ZAP-오글로빈 (등록상표) (10％ 최종 농도)을 표적 세포에 첨가함으로써 측정된 최대 ⁵¹Cr 방출 및 감작화 항체 및 이펙터 세포의 부재하에 측정된 기초 방출로 하기 식을 이용하여 세포의 세포독성을 계산하였다:

단지 매우 낮은 수준의 항체 매개된 비-세포의 세포독성 (이펙터 세포의 부재하에)을 이들 분석법 조건 ( < 5％ 특이적 용해)하에 관찰하였다.

SPR 기법을 이용한 친화도 측정: 항-EGFR 항체의 결합 친화도를 BIAcore 300 (스웨덴 우프술라 소재의 비아코어 (Biacore) 제품)을 이용하여 측정하였다. 시그마에서 구입한 A431 세포로부터 정제된 EGFR를 제조업자의 지시에 따라 CM5 칩상에 고정시켰다. 상이한 농도의 항체 F(ab') 단편을 사용하여 측정을 수행하였다. 결합 및 해리 상수를 BIA 평가 소프트웨어 (버전 3.1)를 이용하여 측정하였다.

마우스 및 종양 모델: 누드 Balb/c 마우스 (NuNu)를 하를란 (Harlan) (네덜란드 호르스트에 소재)으로부터 구입하였다. 기재된 모든 실험을 8 내지 12주령의 암컷 마우스를 사용하여 수행하였다. 마우스를 중앙 실험실 동물 시설 (네덜란드 우트레흐트에 소재)의 트랜스제닉 마우스 시설에 수용하고, 실험은 우트레흐트 대학 동물 윤리 위원회에 의해 승인받았다. 실험에 참가할 경우에, 마우스는 활성 수준, 피부 이상, 설사 및 전반적 외관을 포함한 독성 및 불편함의 징후에 대해 1주 동안 3회 조사하였다. 잘 확립된 피하 (s.c.) 종양 모델을 사용하였다. 간략하게, EGFR를 고도로 발현하는 A431 세포를 마우스의 우측에 3 ×10⁶개 세포의 용량으로 접종시켰다. 종양은 균일하게 성장하였고, 버니어 캘리퍼에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 종양 용적은 길이 ×폭 ×높이 (㎣ 단위)로 기록하였다. 모노클로날 항체를 연구 프로토콜에 따라 복강내 (i.p.) 주사하였다. 종양 세포를 유식 세포 계수법 및 면역조직화학에 의한 생체내 계대 후에 안정한 EGFR-발현에 대해 시험하였다. 약동학을 측정하기 위해, 종양을 보유하는 마우스 및 종양을 보유하지 않는 마우스에게 2F8 항체를 복강내 주사하였다. 주사 전 및 주사 후 6주 동안 1주일 마다 꼬리 정맥을 통해 채혈하였다. 샘플을 인간 IgG ELISA에 의해 분석하였다.

통계학적 분석: 군 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 보고하였다. 군들 사이의 차이는 짝짓지 않은 (또는, 임의로 짝지은) 스투덴트 t-검정에 의해 분석하였다. 유의 수준을 제시하였다. 유의도는 p < 0.05 수준에서 채택하였다.

실시예 1: 항-EGFR 인간 항체 ("HuMAb"로도 불림)의 생성을 위한 Cmu 표적화 마우스의 생산

CMD 표적화 벡터의 구축

플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리 (문헌 [Marcu et al. Cell 22: 187, 1980] 참조)로부터 수득한 mu 유전자에 걸쳐있는 뮤린 Ig 중쇄 좌위의 EcoRI/XhoI 단편을 함유한다. 이들 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H (문헌 [Marsh et al; Gene 32, 481-485, 1984] 참조]의 XhoI/EcoRI 부위에 서브클로닝하였다. pICEmu에 포함된 중쇄 서열은 mu 인트론 강화제의 3'에 바로 위치하는 EcoRI 부위의 하류를 mu 유전자의 최종 막횡단 엑손의 대략 1 kb하류에 위치하는 XhoI 부위까지 연장하지만, mu 전환 반복 영역의 대부분은 대장균 내에서의 계대에 의해 결실되어 있다. 표적화 벡터를 하기와 같이 구축하였다. 1.3 kb HindIII/SmaI 단편을 pICEmu로 절단하고 HindIII/SmaI 소화된 pBluescript (미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스트라타젠 (Stratagene) 제품)에 서브클로닝하였다. 이들 pICEmu 단편은 Cmu1의 대략 1 kb 5'에 위치하는 HindIII 부위를 Cmu1 내에 위치하는 SmaI 부위까지 연장한다. 생성된 플라스미드를 SmaI/SpeI로 소화시키고, Cmu1 3' 내의 SmaI 부위로부터 최종 Cmu 엑손의 바로 하류에 위치하는 XbaI 부위까지 연장하는 pICEmu로부터의 대략 4 kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 생성된 플라스미드, pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화시키고, neo 발현 카세트를 삽입하였다. 이들 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터 (XbaI/TaqI 단편; 문헌 [Adra et al. (1987) Gene 60:65-74] 참조)의 전사 제어하에 존재하고 pgk 폴리아데닐화 부위 (PvuII/HindIII 단편; 문헌 [Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28:299-308] 참조)를 함유하는 neo 유전자로 구성되어 있다. 이들 카세트는 플라스미드 pKJ1 (문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재됨)으로부터 수득하고, 이로부터 neo 카세트를 EcoRI/HindIII 단편으로 절단하고 EcoRI/HindIII 소화된 pGEM-7Zf (+)에 서브클로닝하여 pGEM-7 (KJ1)을 생성하였다. neo 카세트를 EcoRI/SalI 소화에 의해 pGEM-7 (KJ1)로부터 절단하고, 평활 평 말단화시키고 플라스미드 pTAR1의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열의 반대 배향으로 서브클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 Not I로 선형화시키고, 문헌 [Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352]에 기재된 바와 같이 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여 상동성 재조합을 보유하는 ES 클론의 풍부화를 가능하게 하였다. 이들 카세트는 문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재된 바와 같이 마우스 pgk 프로모터 및 폴리아데닐화 부위에 의해 브래킷된 tk 유전자의 코딩 서열로 구성되어 있다. 생성된 CMD 표적화 벡터는 중쇄 좌위에 대한 상동체 총 대략 5.3 kb를 함유하고, 제1 Cmu 엑손의 독특한 SmaI 부위 내의 neo 발현 카세트에 삽입된 돌연변이 mu 유전자를 생성하도록 고안되어 있다. 표적화 벡터를 PvuI로 선형화시키고, 이를 플라스미드 서열 내에서 절단한 다음, ES 세포에 전기천공시켰다.

표적화 ES 세포의 생성 및 분석

AB-1 ES 세포 (문헌 [McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085] 참조)를 유사분열적으로 불활성인 SNL76/7 세포 영양세포층 (상기 문헌 참조)상에서 문헌 [Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112)]에 본질적으로 기재된 바와 같이 성장시켰다. 선형화된 CMD 표적화 벡터를 헤이스티 (Hasty) 등의 문헌 [Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246]에 의해 기재된 방법에 의해 AB-1 세포에 전기천공시켰다. 전기천공된 세포를 100 mm 디쉬에 1-2 ×10⁶개 세포/디쉬의 밀도로 플레이팅시켰다. 24시간 후에, G418 (200 미크로그램/활성 성분 mL) 및 FIAU (5 ×10^-7 M)를 배지에 첨가하고, 약물-내성 클론을 8 내지 9일 동안 발현시켰다. 클론을 채취하고, 트립신화시키고, 두 부분으로 분할하여, 추가로 증식시켰다. 이어서, 각각의 클론으로부터 유래된 세포 중 절반을 동결시키고, 나머지 절반을 벡터 및 표적 서열 사이의 상동성 재조합에 대해 분석하였다.

DNA 분석을 써던 블롯 혼성화에 의해 수행하였다. DNA를 레어드 (Laird) 등의 문헌 [Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic acids Res. 19: 4293]에 기재된 바와 같은 클론으로부터 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI으로 소화시키고, mu 인트론 강화제 및 mu 전환 영역 사이의 서열과 혼성화하는 프로브 A인 915 bp SacI 단편으로 프로빙시켰다. 프로브 A는 야생형 좌위로부터의 9.9 kb SpeI 단편, 및 CMD 표적화 벡터와 상동적으로 재조합된 mu 좌위로부터의 진단 7.6 kb 밴드를 검출하였다 (neo 발현 카세트는 SpeI 부위를 함유함). 써던 블롯 분석에 의해 스크리닝된 G418 및 FIAU 내성 클론 1132개 중 3개는 mu 좌위에서 상동성 재조합의 불활성 7.6 kb SpeI 밴드를 나타내었다. 이들 3개의 클론을 효소 BglI, BstXI 및 EcoRI으로 추가로 소화시켜, 벡터가 mu 유전자에 상동적으로 통합된다는 것을 입증하였다. 프로브 A와 혼성화되는 경우에, BglI, BstXI 또는 EcoRI으로 소화된 야생형 DNA의 써던 블롯은 각각 15.7, 7.3 및 12.5 kb의 단편을 생성하는 반면, 표적화 mu 대립유전자의 존재는 각각 7.7, 6.6 및 14.3 kb의 단편에 의해 지시된다. SpeI 소화에 의해 검출된 모든 3개의 양성 클론은 neo 카세트의 Cmu1 엑손에의 삽입의 예상된 EcoRI 제한 단편 진단을 나타내었다.

돌연변이된 mu 유전자를 보유하는 마우스의 생산

숫자 264, 272 및 4083으로 지칭된 3개의 표적화 ES 클론을 해동시키고 브래들리 (Bradley)의 문헌 [Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151]에 기재된 바와 같은 C57BL/6J 포배에 주사하였다. 주사된 포배를 가임신 암컷의 자궁에 전달하여 도입 ES 세포 및 숙주 포배로부터 유래된 세포의 혼합물을 나타내는 키메라 마우스를 생산하였다. 키메라에의 ES 세포 분포 범위를 흑색 C57BL/6J 배경에 대한 ES 세포주로부터 유래된 아구티 코트 착색의 양에 의해 가시적으로 추정할 수 있다. 클론 272 및 408은 단지 낮은 백분율의 키메라 (즉, 낮은 백분율의 아구티 색소침착)를 생산하지만, 클론 264는 높은 백분율의 수컷 키메라를 생산하였다. 이들 키메라를 C57BL/6J 수컷과 교배시켜, ES 세포 게놈의 배선 전달의 지표인 아구티 자손을 생산한다. 표적화 mu 유전자에 대한 스크리닝을 꼬리 생검으로부터의 BglI 소화된 DNA의 써던 블롯 분석 (ES 세포 DNA의 분석에 대해 상기한 바와 같음)에 의해 수행하였다. 아구티 자손의 대략 50％는 15.7 kb의 야생형 밴드 이외에 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드를 나타내며, 이는 표적화 mu 유전자의 배선 전달을 입증하였다.

mu 유전자의 기능적 불활성화에 대한 트랜스제닉 마우스의 분석

neo 카세트의 Cmu1에의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화시키는지를 측정하기 위해, 클론 264 키메라를 JH 유전자 절편 (문헌 [Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656] 참조)의 결실의 결과로서 중쇄 발현을 불활성화시키는 JHD 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스와 교배시켰다. 4 마리의 아구티 자손을 생산하였다. 혈청을 1개월령의 상기 동물로부터 수득하고, 뮤린 IgM의 존재에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 4 마리 자손 중 2 마리는 완전하게 IgM가 결핍되어 있었다 (표 2 참조). BglI 소화 및 프로브 A와의 혼성화 (도 1 참조), 및 StuI 소화 및 475 bp EcoRI/StuI 단편 (상기 문헌 참조)과의 혼성화에 의한 꼬리 생검으로부터의 DNA의 써던 블롯 분석에 의한 4 마리 동물의 유전자형은 혈청 IgM을 발현하지 못하는 동물은 중쇄 좌위의 한 대립유전자가 JHD 돌연변이를 보유하고, 다른 대립유전자가 Cmu1 돌연변이를 보유하는 동물들인 것으로 입증하였다. JHD 돌연변이에 대해 이종접합성인 마우스는 야생형 수준의 혈청 Ig를 나타내었다. 이들 데이터는 Cmu1 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성화시키는 것을 입증한다.

마우스	혈청 IgM (미크로그램/mL)	Ig H 쇄 유전자형
42	< 0.002	CMD/JHD
43	196	+/JHD
44	<0.002	CMD/JHD
45	174	+/JHD
129 x BL6 F1	153	+/+
JHD	<0.002	JHD/JHD

표 2는 CMD 및 JHD 돌연변이 (CMD/JHD) 둘 다를 보유하는 마우스, JHD 돌연변이 (+/JHD)에 대해 이종접합성인 마우스, 야생형 (129Sv x C57BL/6J) F1 마우스 (+/+) 및 JHD 돌연변이 (JHD/JHD)에 대해 동형접합성인 B 세포 결핍 마우스에 대해 ELISA에 의해 검출된 혈청 IgM의 수준을 제시한다.

실시예 2: 항-EGFR 인간 항체의 생성을 위한 HCO12 트랜스제닉 마우스의 생산

HCO12 인간 중쇄 트랜스진

HCO12 트랜스진을 pHC2 (문헌 [Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591] 참조)의 80 kb 삽입물 및 플라스미드 pVx6의 25 kb 삽입물의 동시주사에 의해 생성하였다. 플라스미드 pVx6을 하기한 바와 같이 구축하였다.

배선 인간 VH1-18 (DP-14) 유전자를 대략 2.5 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 포함하는 8.5 kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 (Promega) 제품)에 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 생산하였다. 배선 인간 VH5-51 (DP-73) 유전자를 대략 5 kb의 5' 플랭킹 및 1 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322계 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f (문헌 [Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295] 참조)에 클로닝하여 플라스미드 p251f를 생성하였다. pGP1f로부터 유래된 신규한 클로닝 벡터인 pGP1k (서열 13)를 EcoRV/BamHI로 소화시키고, 배선 인간 VH3-23 (DP47) 유전자를 대략 4 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 포함하는 10 kb EcoRV/BamHI DNA 단편에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드, p112.2RR.7을 BamHI/SalI로 소화시키고, p251f의 7 kb 정제된 BamHI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드, pVx4를 XhoI로 소화시키고, p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다. 클론은 다른 2개의 V 유전자와 동일한 배향으로 VH1-18 유전자를 사용하여 수득하였다. 이어서, pVx6이라 지칭되는 상기 클론을 NotI로 소화시키고, 정제된 26 kb 삽입물을 -- pHC2의 정제된 80 kb NotI 삽입물과 함께 1:1 몰비로 -- 호간 (Hogan) 등의 문헌 [B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2^nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY]에 기재된 바와 같은 1/2일 (C57BL/6J x DBA/2J) F2 배아의 전핵에 동시주사하였다. Vx6 및 HC2로부터의 서열을 포함하는 트랜스제닉 마우스의 3종의 비의존적 세포주를 주사된 배아로부터 발생된 마우스로부터 확립하였다. 이들 세포주를 (HCO12)14881, (HCO12)15083 및 (HCO12)15087로 지정하였다. 3종의 세포주 각각을 실시예 1에 기재된 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이 (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) 및 (KCo5)9272 트랜스진 (Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851)을 포함하는 마우스와 교배하였다. 생성된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 좌위의 파괴에 대해 동형접합성인 배경에서 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현한다.

실시예 3: EGFR에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성

2종의 상이한 계통의 마우스를 사용하여 EGFR 반응성 인간 모노클로날 항체를 생성하였다. 계통 ((CMD)++; (JKD)++; (HCo7)11952+/++; (KCo5)9272+/++) (본원에서 "HCO7 마우스"라고 지칭함) 및 계통 ((CMD)++; (JKD)++; (HCo12)15087+/++; (KCo5)9272+/++) (본원에서 "HCO12 마우스"라고 지칭함). 이들 계통의 각각은 내인성 중쇄 (CMD) 및 카파 경쇄 (JKD) 좌위의 파괴에 대해 동형접합성이었다. 2가지 계통은 또한 인간 카파 경쇄 트랜스진 (HCo7)을 포함하고, 개개의 동물은 삽입물 #11952에 대해 반접합성 또는 동형접합성이었다. 2종의 계통은 사용된 인간 중쇄 트랜스진에서 상이하였다. 마우스는 HCo7 또는 HCo12 트랜스진에 대해 반접합성이거나 동형접합성이었다. CMD 돌연변이는 상기 실시예 1에 기재되어 있다. (HCo12) 15087 마우스는 실시예 2에 기재되어 있다. JKD 돌연변이 (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) 및 (KCo5)9272 (Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851) 및 (HCo7)11952 마우스는 1998년 6월 23일자로 론베르그 및 카이에게 허여된 미국 특허 제5,770,429호 및 동 제5,545,806호에 기재되어 있다.

사용된 면역화 스케쥴은 하기의 표 3에 기재되어 있다. 마우스를 A431 세포로 2회 면역화시킨 후에 Ribi 아쥬반트 중의 가용성 항원으로 면역화시켰다. EGFR 특이적 혈청 역가를 3차 면역화 후에 ELISA에 의해 측정하였다. 3회의 상이한 면역화를 융합 전에 최종 부스팅을 위해 수행하였다. 이들은 꼬리 정맥으로 통한 50 ㎕ PBS 중의 10 ㎍ 항원으로의 2회 또는 3회 연속 정맥내 (iv) 부스팅 또는 Ribi 아쥬반트 중의 25 ㎍ 가용성 EGFR로의 2회 연속 복강내 (i.p.) 부스팅을 포함한다 (표 3 참조). 융합에 사용된 3 마리의 마우스는 HCo7 및 HCo12 유전자형 둘 다를 포함하는 마우스의 보다 큰 군의 일부이었다.

면역화 스케쥴
			ELISA	EGFR	ELISA		EGFR
	A431 세포	A431 세포	역가	Ribi 중의 복강내	역가	융합	Ribi 중의 복강내	융합
마우스	제1일	제20일	제30일	제33일	제43일	제46일	제50일	제53일
20241	2 ×106	1 ×107	0	25 ㎍	4050		25 ㎍	Ribi 2 ×25 ㎍***
20242	2 ×106	1 ×107	0	25 ㎍	4050		25 ㎍	2 iv ×10 ㎍*
20243	2 ×106	1 ×107	450	25 ㎍	12510	3 iv ×10 ㎍*
* 제-4일, 제-3일 및 제-2일에 PBS (10 ㎍) 중의 EGFR 정맥내
** 제-4일 및 제-3일에 PBS (10 ㎍) 중의 EGFR 정맥내
*** 제-4일 및 제-3일에 Ribi (25 ㎍) 중의 EGFR 복강내

2 내지 10 ×10⁶개의 살아있는 A431 세포의 제1의 2회 복강내 주사에 사용된 면역화 방법은 불량한 항-EGFR 역가를 생성시켰다 (표 2 참조). 그러나, 이들 마우스에게 Ribi 아쥬반트 중의 가용성 EGFR 25 ㎍/마우스로 제3 면역화를 제공할 경우에, 혈청 역가는 30배 이상 증가하였다. 이들 결과는 세포 표면상에서 과량의 EGFR를 과발현하는 세포가 아쥬반트 중의 정제된 항원의 단지 단일 용량으로 매우 강화되는 1차 면역 반응을 개시하는데 매우 효과적이라는 것을 명백하게 입증했다.

마우스 20243에 대한 융합 전의 최종 부스팅을 제-4일, 제-3일 및 제-2일에 PBS 중의 10 ㎍ 가용성 EGFR로 정맥내 꼬리 정맥 부스팅으로서 수행하였다. 가용성 EGFR 중의 Triton X-100은 마우스의 꼬리의 자극을 유발하였다. 따라서, 자극 가능성을 감소시키기 위해, 마우스 20242에게 제-4일 및 제-3일에 가용성 EFGR로 단지 2회의 정맥내 정맥 부스팅을 제공하고, 마우스 20241에게 제-4일 및 제-3일에 Ribi 아쥬반트 중의 25 ㎍ EGFR로 2회의 복강내 면역화를 제공하였다. 3회 융합은 46개의 인간 γ, κ-항원 양성 하이브리도마를 생성하였다 (표 4 참조). 아쥬반트를 복강내 부스팅한 마우스 20241이 단독으로 35개의 항원 특이적 인간 감마 카파 항체를 생성하였다.

		γ/κ+	γ1 κ	γ3κ+
마우스	γκ+	EGFR+	EGFR+	EGFR+
20243	120	14	13	1
20242	35	2	2	0
20241	*	30	28	2

실시예 4: 하이브리도마 제제

P3 X63 ag8.653 골수종 세포주 (ATCC CRL 1580, 제품 번호 F-15183)를 융합에 사용하였다. 원래 ATCC 바이알을 해동시키고 배양물 중에서 증식시켰다. 동결 바이알의 종균 원액을 상기 증식물로부터 제조하였다. 세포의 새로운 바이알을 융합 1 내지 2주 전에 해동시켰다.

10％ FBS, 페니실린-스트렙토마이신 (시그마, P-7539) 및 5.5 ×10^-5 M 2-메르캅토에탄올 (깁코BRL, 21985-023)을 함유하는 고 글루코스 DMEM (메디아테크 제품, 셀그로 # 10013)을 사용하여 A431 세포 및 골수종 세포를 배양하였다. 추가의 배지 보충물을 하이브리도마 성장 배지에 첨가하며, 이는 오리진-하이브리도마 클로닝 인자 (이겐, 21001), OPI 보충물 (시그마, O-5003), 1.1 ×1O^-3 M 옥살로 아세트산, 4.5 ×10⁴ M 피루브산나트륨, 및 24 국제 단위/L 소 인슐린, HAT (시그마, H 0262) 1.0 ×10^-4 M 히포크산틴, 4.0 ×10^-7 M 아미노프테린, 1.6 ×10^-5 M 티미딘 또는 HT (시그마, H0137) 1.0 ×10^-4 M 히포크산틴, 1.6 ×10^-5 M 티미딘을 포함하였다.

특징규명된 소 태아 혈청 (SH30071 제품 번호 AJE10321 및 GH6843)을 미국 유타주 로간에 소재하는 히클론으로부터 구입하였다. 무혈청 배지는 DMEM, 항생제 및 2-메르캅토에탄올만을 함유하였다.

모든 3 마리의 마우스로부터의 비장은 크기가 정상이었고 2 ×10⁷ 내지 1 ×10⁸개 비장세포를 수득하였다. 비장세포를 융합시켰다.

인간 IgG κ 항체에 대한 초기 ELISA 스크리닝을 융합 후 7 내지 10일째에 수행하였다. 인간 IgG, κ 양성 웰을 가용성 EGFR 코팅된 ELISA 플레이트상에서 스크리닝하였다. 항원 양성 하이브리도마를 24웰 플레이트에 옮기고 궁극적으로 조직 배양 플라스크에 옮겼다. EGFR 특이적 하이브리도마를 제한 희석에 의해 서브클로닝시켜 모노클론성을 확실하게 하였다. 항원 양성 하이브리도마를 DMEM 10％ FBS + 10％ DMSO (시그마, D2650) 또는 오리진 동결 배지 (이겐, # 210002) 중에서 세포를 동결시킴으로써 발생 과정 중 여러가지 기에서 보존되었다. 세포를 -80℃에서 또는 LN₂ 중에서 저장하였다.

초기 EGFR 특이적 하이브리도마를 에피토프 특이성 및 EGFR 수용체에 대한 EGF의 결합을 차단하는 그들의 능력에 대해 후속적으로 평가하였다. 마우스 모노클로날 항-EGFR 항체 225 및 528은 동물 및 인간 연구에 있어서 EGFR에 결합하고, EGFR에 대한 EGF의 결합을 차단하여, 항암 면역치료제인 것으로 이미 제시되어 있다. 따라서, 경쟁적 ELISA 포맷에서 비-블로킹 항체 이외에 이들 항체를 사용하여 면역요법적 특성을 보유하는 인간 항체를 동정하였다.

실시예 5: 결합 친화도

하이브리도마 2F8에 대한 결합 친화도를 BIAcore 3000 (스웨덴 우프술라에 소재하는 비아코어)을 이용하여 측정하였다. 시그마로부터 구입한 A431 세포로부터 정제된 EGFR를 제조업자의 지시에 따라 CM5 칩상에 고정시켰다. 항체 2F8의 평형 결합 상수 (KA)는 5.47 (±0.52) ×10⁸ M^-1이다.

실시예 6: 경쟁적 ELISA 분석법

항원 양성 하이브리도마가 24웰 플레이트에 확립되자 마자 경쟁적 ELISA 분석법을 초기 정량화 분석법으로서 이용하였다. 일반적으로, 강한 경쟁 (80-100％)은 항체가 동일한 에피토프 또는 경쟁 항체와 밀접하게 근접한 항원의 영역에 결합하는 것을 지시한다. 50％ 이하의 보다 약한 경쟁은 항체 및 그의 경쟁자가 밀접하게 근접하지 아니한 항원의 영역에 결합하는 것을 지시한다. 초기 분석법을 다수가 웰 당 하나 이상의 하이브리도마를 함유하는 비클로닝된 하이브리도마로부터의 상등액을 사용하여 수행하였다. 이후의 분석법은 원래 웰의 서브클론을 사용하여 수행하였다. 도 1 및 2는 (도 1 및 2에서의 데이터는 MAb 225와의 경쟁 정도를 기초로 하여 배열되어 있음) 조 세포 배양 상등액을 사용할 경우에도 225 및 528 항체와 유사하거나 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인할 수 있음을 도시한다. 또한, 본 실험에 있어서 마우스 20241로부터 또는 마우스 20242 및 20243로부터 유래된 항체의 경쟁적 결합 패턴에서의 상이한 분포는 명백하다. 예를 들어, #20241 마우스로부터의 제1의 7개 항체 (도 1)는 MAb 225 및 528 둘 다와 강력하게 경쟁하였다. 20241로부터의 항체 나머지는 225 및 528 항체와 온화하게 또는 약하게 경쟁하였다. 20242 및 20243 마우스로부터의 5개의 항체 (1H6, 2F8, 1A8, 5C5 및 8E1)는 항체 225와의 강력한 경쟁 및 MAb 528로부터의 비경쟁 또는 약한 경쟁을 나타내었다 (도 2). 마우스 20242 및 20243으로부터의 항체 2F6, 8A12, 5F12, 6B3 및 6D9는 MAb 225 및 528 둘 다와 경쟁하지만, 경쟁은 225 항체에 대해 보다 강력하였다. 이들 마우스로부터의 다른 항체는 시판용 MAb와 경쟁하지 않거나 약하게 경쟁하였다.

이들 초기 경쟁적 ELISA 결과는 서브클로닝된 세포에 의해 생산된 정제된 항체를 사용하여 입증하였다. 도 3 및 4는 항체 5F12 및 6B3이 MAb 225 및 528와 강력하게 경쟁하는 것을 제시하고, 또한 서로간의 상호 경쟁을 입증한다. 이들 데이터는 이들 항체가 동일한 에피토프 또는 225 또는 528 결합 부위와 밀접하게 근접한 EGFR 분자의 영역에 결합하는 것을 제시한다. 항체 2F8은 MAb 225와 온화하게 경쟁하고, 항체 528과 유의하게 경쟁하지 않는다 (도 3 및 4). 그러나, 항체 2F8, 6B3 및 5F12는 강한 교차 경쟁을 나타낸다. 이들 데이터는 항체 2F8이 225 및 528 항체로부터의 별개의 에피토프에 결합하고, HuMAb 6B3 및 5F12이 결합하는 에피토프에 인접하거나 그에 중첩되는 EGFR 수용체의 영역에 결합하는 것을 제시한다. 항체 2A2 및 6E9는 MAb에 결합하지 않고 225 및 528 MAb의 결합 부위와 비관련된 EGFR 에피토프에 결합하지 않는다 (도 3 및 4).

실시예 7 EGF/EGFR 차단 분석법

항원 양성 서브클론을 EGF/EGFR 차단 분석법으로 추가로 평가하였다. 이들 분석법은 MAb 225 및(또는) 528와 강력하게 경쟁하는 항체 뿐만 아니라 225 또는 528와 약하게 경쟁하거나 경쟁하지 않는 항체의 서브클론을 포함하였다. 여러가지 항체를 배양 배지에서 증식시키고 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 도 5 및 6은 ELISA에서 225 항체의 강력한 경쟁자로 적합한 항체 2F8, 5F12 및 6B3이 EGFR에 대한 EGF의 결합의 강한 블로킹제인 것을 제시한다. 이는 ELISA 포맷으로 수행된 분석법에서 또는 인간 A431 유표피 암 세포상에서의 FACS에 의해 명백하다. 양쪽 분석법에서, 인간 항체는 MAb 225만큼 우수하거나 그보다 우수하였다. 항체 2F8, 5F12, 6B3 및 6E9는 또한 A431 세포의 표면상에서 유사한 결합 특성을 보유한다 (도 7).

시험관내 EGF/EGFR 차단 및 ELISA 경쟁 연구는 2F8, 5F12 및 6B3 항체가 다른 항-EGFR 뮤린 및 면역요법제인 것으로 제시되어 있는 인간 항체 (문헌 [Sato, et al. (1983) Mol. Biol. Med. 511-529; Gill, et al. (1984) J. of Biol. Chem. 259 (12):7755-7760] 참조)와 유사한 성질을 보유한다. 2F8 항체는 다양한 평가에서 전반적으로 6B3 및 5F12 항체와 동등하거나 그보다 우수하였다.

실시예 8: EGF 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체를 사용한 EGF 수용체에 대한 EGF/TGF-α의 결합의 억제

억제 연구는 유식 세포 계수법, ELISA 및 리간드에 의해 유도된 자가인산화의 억제를 이용하여 A431 세포상에서 수행하였다. 뮤린 MAb 225 또는 525를 양성 대조군으로서 사용하였다. 무관한 인간 IgG 이소타입 대조군을 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 단일 인간 항체, 2F8을 모든 추가의 연구를 위해 선택하였다. 당해 항체는 본원에서 "Humax-EGFRT™"라고도 지칭한다. 도 8은 농도 의존적 방식에서의 2F8의 EGF 차단 능력을 도시한다. 2F8 및 m225는 동일한 정도로 차단하는 반면, EGF의 차단 능력은 보다 낮다.

도 9는 2F8의 차단 능력을 추가로 도시하며, 여기서 2F8은 A431 세포 (난소 유표피 암종으로부터 유래되고 그들의 표면상에서 1 ×10⁶개 EGFR 분자의 범위로 발현하는 세포)에 대한 EGF 및 TGF-α의 결합을 효율적으로 억제한다. A431 세포에 대한 2F8의 결합의 억제는 유식 세포 계수법에 의해 측정하였다. 세포를 2F8의 첨가 전에 5 ㎍/mL (백색 막대) 또는 50 ㎍/mL (흑색 막대) 리간드와 함께 예비인큐베이션하였다. 리간드 (PBS 군)의 부재하에서의 항체의 결합을 100％로 지정하였다. 이들 결과는 2F8이 EGFR상에 근접하여 또는 리간드와 동일한 부위에서 결합하는 것을 제시한다.

실시예 9: EGF 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체를 사용한 종양 세포 활성화의 억제

종양 세포 활성화를 억제하는 2F8의 능력을 평가하기 위해, EGF-촉발된 세포 반응, 예를 들어 고유 티로신 키나제 활성 및 부수적인 세포 증식의 활성화에 대한 2F8의 효과를 조사하였다. EGFR에 대한 EGF 또는 TGF-α의 결합 후의 제1 이벤트 중 하나는 수용체의 자가인산화의 유도이다. EGF와 A431 세포와의 인큐베이션은 EGFR (M_r 170,000)의 티로신 인산화를 발생시켰다 (도 10A). 2F8은 단독으로 수용체 키나제 활성을 활성화시키지 않는 반면, 항체는 16.6 nM의 농도에서의 완전 억제와 함께 용량-의존적 방식으로 EGF-촉발된 EGFR 티로신 인산화를 차단하였다 (항체:EGF 몰비, 20:1, 도 1OA). 항체 및 TGF-α로 처리된 세포는 티로신 인산화가 66 nM의 농도에서 2F8에 의해 완전하게 차단된다는 것을 제시하였다 (항체:TGF-α 몰비, 7,3:1, 도 1OB).

EGF/TGF-α와 수용체와의 결합은 세포 증식을 초래하는 세포 활성화를 발생시켰다. 따라서, 종양 세포 (A431, MDA-MD-468 및 HN5 세포)의 성장에 대한 2F8의 억제 효과를 평가하였다. 실험을 외인성 EGF의 부재하에 수해하였다. 마우스 항체를 비교물로서 사용하였다. Humax-EGFR는 농도 의존성 방식으로 A431 세포의 성장을 마우스 항체 225를 사용하여 수득된 것과 유사한 수준인 50％ 최대 억제율로 억제하였다 (도 14). 대조군 항체는 세포 증식에 대해 영향을 미치지 않았다 (도 14). 성장 억제는 또한 유사한 수준에서 2종의 다른 세포 세포주 (HN5 및 MDA-MB468, 패널 B 및 C)를 사용하여 수득하였다. 외인성 EGF를 배양물에 첨가하지 않았기 때문에, 이들 결과는 자가분비 자극을 차단하여 자가분비 EGF/TGF-α 유도된 종양 세포 활성화를 억제하는 2F8의 능력을 제시한다.

실시예 10: EGF 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체는 ADCC를 유도한다.

ADCC는 항체에 의한 종양 세포의 인식에 의해 촉발된 강력한 면역 이펙터 메카니즘이다. 2F8의 존재하에 A431 세포를 사멸시키는 인간 PMN 세포의 능력을 평가하기 위해, A431 세포에 ⁵¹Cr을 로딩한 후에 항체 및 이펙터 세포 (PMN)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 크롬 방출을 측정하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 2F8은 인간 PMN을 사용하여 A431 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있다. 2F8은 A431 표적 세포 중 45％의 PMN-유도된 용해를 매개할 수 있으며, 이는 MAb 225를 사용하여 관찰된 것보다 높다 (도 14).

중요하게는, 면역 이펙터 세포를 보충하고 ADCC를 유도할 수 있는 반면, 2F8은 종양 세포의 보체-매개된 용해를 유도할 수 없다.

실시예 11: EGF 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체는 종양 형성을 예방한다.

무흉선 뮤린 모델에서 종양 형성을 예방하는 HuMAb 2F8의 능력을 제시하기 위해, 제0일에 6 마리 마우스 군에게 200 ㎕ PBS 중의 3 ×10⁶개 종양 세포를 측복부에 피하 주사하였다. 이어서, 마우스에게 제1일 (75 ㎍/200 ㎕), 제3일 (25 ㎍/200 ㎕) 및 제5일 (25 ㎍/200 ㎕) (화살표)에 HuMAb 2F8 (흑색 사각형)의 복강내 주사 또는 대조군으로서의 IgG1-K MAb (백색 원형)를 복강내 주사하였다 (도 14). 데이터는 평균 종양 용적 + SEM으로서 제시하고, 유사한 결과를 산출하는 3회의 별개 실험을 나타낸다.

m225와 비교하여 HuMAb 2F8에 의한 확립된 A431 종양 이종이식편의 근절은 도 14에 도시되어 있다. 제0일에 마우스에게 200 ㎕ PBS 중의 3 ×10⁶개 종양 세포를 측복부에 피하 주사하였다. 제10일에, 마우스를 처리군에 무작위로 할당하고 HuMAb 2F8 (흑색 사각형, 2F8 단기간)로 또는 뮤린 항-EGFR MAb m225 (흑색 삼각형, m225 단기간)로 제12일 (75 ㎍/200 ㎕), 제14일 (25 ㎍/200 ㎕) 및 제16일 (25 ㎍/200 ㎕) (화살표)에 처리하였다. 또한, 군에게 75 ㎍/200 ㎕ HuMAb 2F8 또는 m225를 제12일에 제공하고, 25 ㎍/200 ㎕ HuMAb 2F8 또는 m225를 제14일, 제16일, 제19일, 제22일, 제26일, 제29일, 제33일, 제36일 및 제40일 (백색 사각형, 2F8 장기간; 백색 삼각형, m225 장기간)에 계속 제공하는 것을 포함하였다. 데이터는 종양 용적 + SEM으로서 제시하고, 유사한 결과를 산출하는 3회의 별개 실험을 나타낸다. 흑색 화살표는 단기간 처리 동안의 처리 일수, 백색 화살표는 장기간 처리 동안의 처리 일수를 제시한다.

등가물

당업자는 단지 통상적인 실험 작업을 이용하여 본원에 기재된 본 발명의 특이적 실시양태의 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허 청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.

참고문헌의 도입

본원에서 인용된 모든 특허, 계류 중인 특허 및 다른 특허공보는 전문이 본원에 참고로 도입된다.

도 1은 마우스 20241로부터의 하이브리도마 상등액 대 뮤린 모노클로날 항-EGFR MAb 225, 528 및 AB5를 사용한 경쟁적 ELISA를 나타내는 그래프이다.

도 2는 마우스 20242 및 20243로부터의 인간 항체 상등액 대 뮤린 모노클로날 항-EGFR MAb 225, 528 및 AB5를 사용한 경쟁적 ELISA를 나타내는 그래프이다.

도 3은 정제된 인간 항체 대 뮤린 모노클로날 항-EGFR MAb 225 및 528을 사용한 경쟁적 ELISA를 나타내는 그래프이다.

도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 HuMAb인 (a) 6B3, (b) 5F12, (c) 2F8 및 (d) 2A2를 사용한 경쟁적 ELISA를 나타내는 그래프이다.

도 5a 및 도 5b는 EGFR에 대한 EGF-바이오틴의 결합이 항-EGFR HuMAb 및 뮤린 MAb (ELISA 포맷)에 의해 억제됨을 나타내는 그래프이다.

도 6은 A431 세포상의 EGFR에 대한 EGF-바이오틴의 결합이 항-EGFR HuMAb 및 뮤린 MAb에 의해 억제됨을 나타내는 그래프이다.

도 7은 A431 세포상에서 항-EGFR HuMAb의 역가측정을 나타내는 그래프이다.

도 8은 정제된 EGFR 및 천연 EGFR에 대한 EGF의 결합에 미치는 2F8의 억제력을 나타내는 그래프이다. 2F8 (다이아몬드), 뮤린 225 (사각형), EGF (삼각형) 또는 인간 IgG1 카파 이소타입 대조군 (원형)이 고정시킨 EGFR에 대한 EGF-바이오틴의 결합에 미치는 영향을 측정하였다. 도 8에 도시한 바와 같이, 2F8은 EGF-바이오틴 결합을 17 nM의 IC₅₀으로 억제할 수 있고, 225 (IC₅₀ 30 nM)보다 유의하게 더 낮다.

도 9는 A431 세포에 대한 EGF 및 TGF-α의 결합에 미치는 2F8의 억제력을 나타내는 막대 그래프이다. A431 세포는 난소 유표피(類表皮) 암종에서 유래한 것이며, 그들의 세포 표면에는 1 ×10⁶개의 EGFR 분자가 과량으로 발현된다. A431 세포에 대한 2F8의 결합 억제는 유식 세포 계수법을 사용하여 측정했다. 세포를 리간드 5 ㎍/mL (백색 막대) 또는 50 ㎍/mL (흑색 막대)과 예비인큐베이션시킨 후에 2F8을 첨가했다. 리간드 (PBS 군) 부재하에서의 항체 결합을 100％로 정하였다. 나타낸 바와 같이, A431 세포에 대한 EGF 및 TGF-α의 결합은 2F8에 의해 효율적으로 차단되었다. 이러한 결과는 2F8가 EGFR상에서 가깝거나 동일한 부위에 리간드로서 결합함을 지시한다.

도 10a 및 10b는 A431 세포의 자가인산화에 대한 모노클로날 항-EGFR의 효과를 나타낸다. 혈청 결핍 상태에서 전면생장되기 전의 A431 세포에, 방법란에서 지시된 바와 같은 여러가지 항체 (10 g/mL )를 처리하고 EGF (A) 또는 TGF-α (B)로 자극하여 추출했다. EGFR 인산화는 SDS-PAGE 및 항-포스포티로신 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다.

도 11a, 11b 및 11c는 항-EGFR 인간 항체에 의해 EGFR-발현 종양 세포주의 성장이 억제됨을 나타내는 그래프이다. EGFR-발현 종양 세포주인 A431 (A), HN5 (B) 및 MDA-MB-468 (C)를 다양한 농도의 HuMAb 2F8 (사각형), 5C5 (삼각형), 6E9 (십자형), 2A2 (다이아몬드), 항체 음성 대조군 항-CTLA4 (백색 원형), 항체 양성 대조군 225 (흑색 원형) 또는 배지 단독 (대조군)과 7일 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 고정된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 세포 성장을 평가했다. 7일 동안의 인큐베이션 이후에 남아있는 단백질의 양을 대조군인 배지 단독인 경우에 존재하는 단백질의 양과 비교하여 성장 억제율(％)를 계산하였다. 상기 데이타는 3벌 측정치를 나타내며, 서로 다른 날에 수행한 3회의 실험을 대표하는 것이다.

도 12는 인간 PMN에 의해 매개되는 항체 의존적-세포의 세포독성을 나타내는 그래프이다. PMN은 기재된 바와 같이 단리했다. ⁵¹크롬-표지된 A431 세포를 96웰의 평평한 바닥 플레이트에 플레이팅했다. PMN을 이펙터:표적의 비율이 100:1이 되도록 첨가하고, 여러가지 농도의 항체를 첨가했다. 밤새 인큐베이션한후에, ⁵¹Cr의 방출량을 측정했다.

도 13은 무흉선 뮤린 모델에서 HuMAb 2F8에 의해 종양 형성이 예방됨을 나타내는 그래프이다. 제0일에 마우스 6 마리의 군에 PBS 200 ㎕ 중의 3 ×10⁶개 종양 세포를 측복부에 피하 주사했다. 이어서, 제1일 (75 ㎍/200 ㎕), 제3일 (25 ㎍/200 ㎕) 및 제5일 (25 ㎍/200 ㎕) (화살표)에는 마우스에게 HuMAb 2F8 (흑색 사각형) 또는 대조군으로서의 인간 IgG1-κ MAb (백색 원형)를 i.p. 주사했다. 상기 데이타는 평균 종양 부피 + SEM으로 제시한 것이며, 유사한 결과를 얻은 3회의 별개 실험들을 대표한다.

도 14는 확립된 A431 종양 이종이식편이 HuMAb 2F8에 의해 근절되었음을 뮤린 항-EGFR MAb (m225)와 비교하여 나타내는 그래프이다. 제0일에 마우스에게 PBS 200 ㎕ 중의 3 ×10⁶개 종양 세포를 측복부에 피하 주사했다. 제10일에는 마우스를 처치군에 무작위로 할당하였고, 제12일 (75 ㎍/200 ㎕), 제14일 (25 ㎍/200 ㎕) 및 제16일 (25 ㎍/200 ㎕) (화살표)에는 HuMAb 2F8 (흑색 사각형, 2F8 단기간) 또는 뮤린 항-EGFR MAb 225 (흑색 삼각형, m225 단기간)을 처치하였다. 추가로, 제12일에는 HuMAb 2F8 또는 m225 75 ㎍/200 ㎕를 투여하고, 제14일, 제16일, 제19일, 제22일, 제26일, 제29일, 제33일, 제36일 및 제40일에 HuMAb 2F8 또는 m225를 25 ㎍/200 ㎕씩 계속 투여하는 군 (백색 사각형, 2F8 장기간; 백색 삼각형, m225 장기간)을 포함시켰다. 상기 데이타는 평균 종양 부피 + SEM으로 제시한 것이며, 유사한 결과를 얻은 3회의 별개 실험들을 대표한다. 흑색 화살표는 단기간의 처치에 대한 처치일을 지시히고, 백색 화살표는 장기간의 처치에 대한 처치일을 지시한다.

도 15a 및 도 15b는 2F8의 V_H- 및 V_L-영역의 서열을 나타내며 CDR 영역들의 서열에는 표시를 하였다.

<110> Genmab, Inc. et al. <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFR) <130> GMI-020PC <150> US 60/298,172 <151> 2001-06-13 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatgggatg atggaagtta taaatactat 180 ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggt 300 attactatgg ttcggggagt tatgaaggac tactttgact actggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Val Met Lys Asp Tyr Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggacattagc agtgctttag tctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtgaatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (1)

1. IgG1, IgA, IgE, IgM, IgG4 및 IgD 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 EGFR에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 유효량을 EGFR-발현 세포와 접촉시켜 상기 EGFR-발현 세포의 성장이 억제되도록 하는 단계를 포함하되, 상기 항체는 EGFR 리간드가 인간 EGFR에 결합하는 것을 억제하는 것인, EGFR-발현 세포의 성장을 억제하는 방법.

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