MX2010013236A - Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. - Google Patents

Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.

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MX2010013236A
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MX
Mexico
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antibody
sec
disease
abeta
binding
Prior art date
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MX2010013236A
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Tariq Ghayur
Alfred Hahn
Bernhard Mueller
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Abbott Lab
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas por ingeniería, métodos de fabricación, y específicamente a sus usos en la prevención, diagnóstico, y/o tratamiento de enfermedades.

Description

JMUNOGLOBULINAS DE DOMINIO VARIABLE POBLE Y LAS MISMAS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADA Esta solicitud en 1 una solicitud no provisional q oridad de la Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. sentada el 3 de Junio del 2008 y Solicitud Provisiona ríe No. 61/132,951, presentada el 24 de Junio del ntenidos de las cuales se incorporan aquí para referenc CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteínas nivalentes y multiespecíficas, métodos de prep pecíficamente a sus usos en el diagnóstico, prev :écnicas de ADN recombinante.
Se han producido anticuerpos biespecíf icos enología de cuadroma (ver, Milstein, C. y A.C. Cu iture 305(5934):537-40) basándose en la fusión somá erentes líneas de célula de hibridoma expresando nocionales de murino (rrtAbs) con las especificidade I anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aléa erentes cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina (I línea de célula de h íbrido-hibridoma (o cuadroma) re eran hasta diez diferentes especies de Ig, de las cual el anticuerpo biespecífico funcional. La presenci oductos no apareados, y rendimientos de nificativamente reducidos, significa que se re cedimientos sofisticados de purificación.
Los anticuerpos biespecíf icos también son producid conjugación química de dos diferentes mAbs (ver, Sta igida al sitio. Para obtener preparaciones más hom ticuerpos biespecíf icos, dos diferentes fragmentos de F ímicamente entrelazados en sus residuos de cisteína a forma dirigida al sitio (ver, Glennie, MJ., et al. munol. 139(7): 2367-75).
Se ha desarrollado una amplia variedad de otros ticuerpo biespecífico recombinante (ver, Kriangkum, 01) Biomol. Eng, 18(2): 31-40). Entre ellos, las cuerpos de Fv de cadena individual en tándem, y vario los mismos, son los más ampliamente utilizados. P nstrucción de estas moléculas empieza a partir de dos Fv (scFv) de cadena individual que reconoce diferente r, Economides, A.N., et al. (2003) Nat. Med. 9(1): léculas scFv en tándem representan un formato plemente conecta las dos moléculas scFv con u ptídico adicional. Los dos fragmentos scFv presente Meados para producir moléculas scFv en tándem solu tudio reciente, se reportó la expresión a través de nado transgénicos de un agonista dirigido de scFv 28, y un proteoglícano asociado a melanoma (ver, Gra (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). En esta c dos moléculas scFv se conectaron a través de un enl e encontraron concentraciones, en suero, de hasta 1 ticuerpo biespecíf ico. Varias estrategias, incluyendo i orden de dominio o uso de enlazadores medios con xibilidad variables, se emplearon para permitir la uble en bacterias. Ahora pocos estudios han r presión de moléculas scFv en tándem en bacterias (ve , et al. (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., Immunol. 170(9): 4802-9; Kami, A., et al. (2002) J. Ne 5(1-2): 134-40) utilizando ya sea un enlazador Ala3 r azadores ricos en glicina/serlna largos. En otro estud mostró que la presentación de fago de moléculas scFv combinación con mutagénesis dirigida, es una rramienta para estas moléculas, que pueden ser exp cterías en una forma activa.
Los diacuerpos biespecíf icos (Db) utilizan el cuerpo para expresión. Los diacuerpos son expresados gmentos scFv reduciendo la longitud del enlazador que minio VH y VL a aproximadamente 5 residuos (ver, Pei lerius (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4): 507-11). Est l tamaño de enlazador facilita la dimerízación de dos lipéptido a través de apareamiento cruzado de los do . Los diacuerpos biespecíf icos son producidos a tr presión de dos cadenas de polipéptido con, ya sea l A-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL), o VLA-VHB nfiguración VL-VH) dentro de la misma célula. En el p ducido una gran variedad de diferentes diacuerpos bie terodímeros activos. Esto necesita de la ímplementaci purificación adicionales con el fin de obtener pr rriogéneas de diacuerpos biespecíficos. Un aspecto pa neración de diacuerpos biespecíficos es ia pro cuerpos de "perilla en el agujero" (ver, Holliger, P.f T.
Winter (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 90(14): te aspecto se demostró para un diacuerpo biespecíf tra HER2 y CD3. Se introdujo una gran perilla en el ercambiando Va!37 con Phe y Leu45 con Trp y se ujero complementario en el dominio VL mutando Phe r87 a Ala, ya sea en los dominios variables anti-HER2 utilizar este aspecto, la producción de diacuerpos b ede ser incrementada de 72% por el diacuerpo parent % por el diacuerpo de perilla en el agujero. De manera producción da como resultado solo una ligera redu ultado de estas mutaciones. Sin embargo, se o a farmacocínética no deseable.
Los diacuerpos de cadena individual (scDb) repre trategia alternativa para mejorar la formación de moléc cuerpo biespecífico (ver, Holliger, P. y G. Winter (1 munol. Immunother. 45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et munotechnology 2(1): p. 21- 36). Los diacuerpos bies dena individual son producidos conectando las dos lipéptido formadoras de diacuerpo con un enlaz icional con una longitud de aproximadamente 15 r inoácido. Consecuentemente, todas las moléculas c lecular que corresponde a diacuerpos de cadena noméricos (50-60 kDa) son biespecíf ¡cas. Varios e mostrado que los diacuerpos biespecíficos de caden n expresados en bacterias en forma soluble y ac yoría de las moléculas purificadas presentes como r, Holliger, P. y G. Winter (1997 Cáncer Immunol. I ser ito la construcción de anticuerpo multi valente co s repeticiones Fab en la cadena pesada de una IgG y ir cuadro moléculas de antígeno (ver, WO 0177342A1, al. (2003) J. immunol. 170(9): 4854-61).
Existe la necesidad en la técnica de proteína nivalentes mejoradas capaces de unir dos o más an licitud de Patente de E.U.A. Serie No. 11/507,050 prop iiia novedosa de proteínas de unión capaces de unir tígenos con alta afinidad, las cuales se unoglobulinas de dominio variable doble (DVD-lg™). ención proporciona proteínas de unión novedosas paces de unir dos o más antígenos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención se refiere a proteínas de unión m dalidad, VDJ y VD2 en la proteíha de unión so fiables de cadena pesada. En otra modalidad, el domi cadena pesada se selecciona del grupo que cons minio variable de cadena pesada de murino, un domi cadena pesada humano, un dominio variable de cad ertado a CDR, y un dominio variable de cade manizado. En otra modalidad más, VD1 y VD2 son cap mismo antígeno. En otra modalidad, VD1 y VD2 son lr diferentes antígenos. En otra modalidad más, C es stante de cadena pesada. Por ejemplo, X1 es u mpre que X1 no sea CH1. Por ejemplo, X1 es u eccionado del grupo que consiste de AKTTPKLEEGE NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEC ID NO: 2); EC ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP ( ; RADAAP (SEC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC l DAAAAGGPGS (SEC ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEC NO: 26). En una modalidad, X2 es una región F dalidad, X2 es una región Fe variante.
En una modalidad, la proteína de unión de mprende una cadena de polipéptido, en donde la l i péptid o comprende VD1 ~(X1 )n~VD2-C-(X2)n, en donde imer dominio variable de cadena pesada, VD2 es minio variable de cadena pesada, C es un dominio c dena pesada, X1 es un enlazador siempre que no sea C a región Fe. En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteí n dominios variables de cadena ligera. En una m minio variable de cadena ligera se selecciona del nsiste de un dominio variable de cadena ligera de minio variable de cadena ligera humano, un dominio dena ligera injertado en CDR, y un dominio variable era humanizado. En una modalidad, VD1 y VD2 son ir el mismo antígeno. En otra modalidad, VD1 y VD2 AAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID AAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC I KAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); A TTPP (SEC I TTPPSVTPLAP (SEC ID NO:' 18); AKTTAP (SEC I TTAPSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC I TKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGG : 23); GENKVEYAP ALMAL S (SEC ID AKELTPLKEAKVS (SEC ID NO: 25); GHE AAAVMQ VQ NO: 26). En una modalidad, la proteína de unión no .
En una modalidad, tanto la cadena pesada varia dena ligera variable comprenden el mismo enlazad dalidad, la cadena pesada variable la cadena líg mprenden diferentes enlazadores. En otra modalida dena pesada variable como la cadena ligera variable enlazador corto (aproximadamente 6 aminoácidos lipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde mer dominio variable de cadena ligera, VD2 es minio variable de cadena ligera, C es un dominio c dena ligera, X1 es un enlazador siempre que no sea C mprenda una región Fe.
En otra modalidad, la invención proporciona una ión que comprende dos cadenas de polipéptido. en imera cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-V donde VD1 es un primer dominio variable de cadena p un segundo dominio variable de cadena pesada, C es nstante de cadena pesada, X1 es un enlazador siempre 1 , y X2 es una región Fe; dicha segunda cadena de mprende VD1 -(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es minio variable de cadena ligera, VD2 es un segun riable de cadena ligera, C es un dominio constante era, X1 es un enlazador siempre que no sea CH1 donde VD1 es un primer dominio variable de cadena un segundo dominio variable de cadena ligera, C es nstante de cadena ligera, X1 es un enlazador siempre 1, y X2 no comprenda una región Fe. Dicha proteína riable Doble (DVD) tiene cuatro sitios de unión a antíg En otra modalidad, las proteínas de unión descrit paces de unir uno o más objetivos. En una modalidad, selecciona de! grupo que consiste de citocinas, perficie celular, enzimas y receptores. En otra rn oteína de unión es capaz de modular una función bioló más objetivos. En otra modalidad, ia proteína de unión utralizar uno o más objetivos. La proteína de unión de capaz de unir citocinas seleccionadas del grupo que focinas, monocinas, hormonas peptídicas, rec rcadores de tumor. Por ejemplo, la DVD-lg de la i paz de unir dos o más de los siguientes: beta Amil leccionados del grupo que consiste de Abeta (sec. 1) y ; TNF-a y Abeta (sec. 2); I L- 1 ß y Abeta (sec. 2); Abet eta (sec. 2); IGF1.2 y Abeta (sec. 2); Abeta (sec. 2) y I eta (sec. 2); TNF-a y Abeta (sec.3); IL-?ß y Abeta (se c. 1) y Abeta (sec. 3); IGF1,2 y Abeta (sec. 3); Abet 18; IL-6 y Abeta (sec. 3); TNF-a y Abeta (sec. 1); IL c. 1); IGF1,2 y Abeta (sec. 1); Abeta (sec. 1) y IL-18; I c. 1); Abeta (sec. 1) y RAGE; NGF e IL-18; NGF y I 6; TNF-a y EGFR (sec. 2); TNF-a y RAGE; CD-20 y EG -20 y EGFR (sec. 2); RGMA y TNF-a (ver Ejemplos 2.1 En una modalidad, la proteína de unión capaz de c, 1) y Abeta (sec.3) comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que cons NO. 62 y SEC ID NO. 64; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 63 y SEC ID NO. 65. En una modalidad, la proteí En una modalidad, la proteína de unión capaz de u eta (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de y SEC ID NO. 68; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada de! grupo que consiste de SE SEC ID NO. 69. En una modalidad, la proteína de uni ir TNF-a y Abeta (sec. 2) comprende una secuencia de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 66 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO. dalidad, la proteína de unión capaz de unir TNF- y A ne una orientación inversa y comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de En una modalidad, la proteína de unión capaz de eta (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia dé aminoácido de cadena ligera de DVD de .
En una modalidad, la proteína de unión capaz de c. 1) y Abeta (sec. 2) comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 74 y SEC ID NO. 76; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 75 y SEC ID NO. 77. En una modalidad, la proteí paz de unir Abeta (sec. 1) y Abeta (sec. 2) com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 75. En otra modalidad, la proteína de unión ca eta (sec. 1) y Abeta (sec. 2) tiene una orientació mprende una secuencia de aminoácido de cadena pes SEC ID NO. 76 y una secuencia de aminoácido de ca inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: dalidad, la proteína de unión capaz de unir IGF1,2 y tiene una orientación inversa y comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de .
En una modalidad, la proteína de unión capaz de c. 2) e IL-18 comprende una secuencia de aminoácid sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de y SEC ID NO. 84; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de SE SEC ID NO, 85. En una modalidad, la proteína de uni ir Abeta (sec. 2) e IL-18 comprende una secuencia de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 82 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: dalidad, la proteína de unión capaz de unir Abeta (se SEC ID NO. 89. En una modalidad, la proteína de uni ir iL-6 y Abeta (sec. 2) comprende una secuencia de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 86 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: dalidad, !a proteína de unión capaz de unir IL-6 y Ab ne una orientación inversa y comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de En una modalidad, la proteína de unión capaz de eta (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de y SEC ID NO. 92; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de SE SEC ID NO. 93. En una modalidad, la proteína de uni ir TNF-ct Abeta (sec. 3) comprende una secuencia de sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de - y SEC ID NO. 96; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de SE SEC ID NO. 97. En una modalidad, la proteína de uni ir I L - 1 p y Abeta (sec. 3) comprende una secuencia de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. 94 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: daiidad, la proteína de unión capaz de unir i L- 1 ß y Ab ne una orientación inversa y comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de .
En una modalidad, la proteína de unión capaz de ec. 1) y Abeta (sec.3) comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que cons NO. 98 y SEC ID NO. 100; y una secuencia de am DVD de SEC ID NO: 101.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de u eta (sec. 3) comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 2 y SEC ID NO. 104; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de 3 y SEC ID NO. 105. En una modalidad, la proteína de unir IGF1.2 y Abeta (sec. 3) comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de 3. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de u eta (sec. 3) tiene una orientación inversa y com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 4 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 105.
En una segunda modalidad, la proteína de unión ca ec. 3) e IL-18 tiene una orientación inversa y com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 8 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 109.
En una tercera modalidad, la proteína de unión ca -6 y Abeta (sec, 3) comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que cons NO. 110 y SEC ID NO. 112; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 111 y SEC ID NO. 113. En una modalidad, la ión capaz de unir IL-6 y Abeta (sec. 3) comprende un aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de 1. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de eta (sec. 3) tiene una orientación inversa y com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 4 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 115. En otra modalidad, la proteína de unión ca F-a y Abeta (sec. 1) tiene una orientación inversa y a secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD . 116 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera C ID NO: 1 7.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de eta (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 8 y SEC ID NO. 120; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de 9 y SEC ID NO. 121. En una modalidad, la proteína de unir IL-?ß y Abeta (sec. 1) comprende una se inoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO. cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 123 y SEC ID NO. 125. En una modalidad, la ión capaz de unir I G F 1 , 2 y Abeta (sec. 1) com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 2 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 123. En otra modalidad, la proteína de unión ca F1,2 y Abeta (sec. 1) tiene una orientación inversa y a secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD . 124 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera C ID NO: 125.
En una tercera modalidad, la proteína de unión ca eta (sec. 1) e IL-18 comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 126 y SEC ID NO. 128; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 127 y SEC ID NO. 129. En una modalidad, la y Abeta (sec. 1) comprende una secuencia de ami dena pesada de DVD seleccionada del grupo que cons NO. 130 y SEC ID NO. 132; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 131 y SEC ID NO, 133. En una modalidad, la ió n capaz de unir IL-6 y Abeta (sec. 1) comprende un aminoácido de cadena pesada de DVD de SEC ID NO cuencia de aminoácido de cadena ligera de DVD de 1. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de eta (sec. 1) tiene una orientación inversa y com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 2 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 133.
En una modalidad, la proteína de unión capaz de ec. 1) y RAGE comprende una secuencia de aminoácid sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 6 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 137.
En una segunda modalidad, la proteína de unión c F e IL-18 comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 8 y SEC ID NO. 140; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de 9 y SEC ID NO. 141. En una modalidad, la proteína de unir NGF e IL-18 comprende una secuencia de am dena pesada de DVD de SEC ID NO. 138 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 1 dalidad, la proteína de unión capaz de unir NGF e IL-ientación inversa y comprende una secuencia de am dena pesada de DVD de SEC ID NO. 140 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 141.
En una tercera modalidad, la proteína de unión ca ien tací ón inversa y comprende una secuencia de am dena pesada de DVD de SEC ID NO. 144 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 145.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión ca F e IL-6 comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 6 y SEC ID NO. 148; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de y SEC ID NO. 149, En una modalidad, la proteína de unir NGF e IL-6 comprende una secuencia de ami dena pesada de DVD de SEC ID NO. 146 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 1 dalidad, la proteína de unión capaz de unir NGF e IL- entación inversa y comprende una secuencia de am dena pesada de DVD de SEC ID NO. 148 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 149. 1. En otra modalidad, la proteína de unión capaz de u FR (sec. 2) tiene una orientación inversa y com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 2 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 153.
En una segunda modalidad, la proteína de unión ca JF-oc y RAGE comprende una secuencia de aminoácido sada de DVD seleccionada del grupo que consiste de 4 y SEC ID NO. 156; y una secuencia de aminoácido era de DVD seleccionada del grupo que consiste de 5 y SEC ID NO, 157. En una modalidad, la proteína de unir TNF-a y RAGE comprende una secuencia de am dena pesada de DVD de. SEC ID NO. 154 y una s inoácido de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 1 dalidad, la proteína de unión capaz de unir TNF-a y a orientación inversa y comprende una secuencia de cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 8 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de NO: 159. En otra modalidad, la proteína de unión ca -20 y EGFR (sec. 1) tiene una orientación inversa y a secuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD . 160 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera C ID NO: 161.
En una cuarta modalidad, la proteína de unión ca -20 y EGFR (sec. 2) comprende una secuencia de am dena pesada de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 162 y SEC ID NO. 164; y una secuencia de am dena ligera de DVD seleccionada del grupo que consi NO. 163 y SEC ID NO. 164. En una modalidad, la ??? capaz de unir CD-20 y EGFR (sec. 2) com cuencia de aminoácido de cadena pesada de DVD de 2 y una secuencia de aminoácido de cadena ligera de seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. NO. 169. En una modalidad, la prbteína de unión ca MA y TNF-a comprende una secuencia de aminoácid sada de DVD de SEC ID NO. 166 y una secuencia de cadena ligera de DVD de SEC ID NO: 167. En otra m oteína de unión capaz de unir RGMA y TNF-a tiene una versa y comprende una secuencia de aminoácido de ca DVD de SEC ID NO. 168 y una secuencia de am dena ligera de DVD de SEC ID NO: 169.
En otra modalidad, la invención proporciona una i ó n que comprende una cadena de polipéptido, en dena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2) 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obt imer anticuerpo parental o una proteína de unión a ismo; VD2 es un segundo dominio variable de cad tenido de un segundo anticuerpo parental o una proteí imer anticuerpo parental o porción de unión a antígeno 2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obt gundo anticuerpo parental o porción de unión a a smo; C es un dominio constante de cadena ligera; ( azador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n esente o ausente; y (X2)n no comprenda una región F ho (X2)n está ya sea presente o ausente. En una moda tá ausente de la región de unión.
En otra modalidad, la proteína de unión de l mprende primera y segunda cadenas de polipéptido cha primer cadena de polipéptido comprende un primer 2-C~(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variabl sada obtenido de un primer anticuerpo parental o porci antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio dena pesada obtenido de un segundo anticuerpo parent unión a antígeno del mismo; C es un dominio c dominio constante de cadena ligera; (X1)n es u mpre que no sea CH1, en donde (X1)n está ya sea sente; y (X2)n no comprenda una región Fe, en donde tá ya sea presente o ausente. En otra modalidad, la ión comprende dos primeras cadenas de polipépt gundas cadenas de polipéptido. En otra modalidad más sente del segundo polipéptido. En otra modalidad a ión Fe, si está presente en el primer polipéptido se se upo que consiste de una región Fe de secuencia n gión Fe de secuencia variante. En una modalidad más, selecciona del grupo que consiste de una región Fe 2, lgG3, lgG4, IgA, Ig , IgE, e IgD.
En otra modalidad, la proteína de unión de la inve D-lg capaz de unir dos antígenos que comprenden cua polipéptido, en donde las primera y tercera c lipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en do donde VD1 es un primer dominio variable de ca tenido de un primer anticuerpo parental o porción tígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variabl era obtenido de un segundo anticuerpo parental o porci antígeno del mismo; C es un dominio constante de ca i)n es un enlazador siempre que no sea CH1, en dond sea presente o ausente; y (X2)n no comprenda una re nde dicho (X2)n está ya sea presente o ausente.
La invención proporciona un método para hacer una ión DVD-lg pre-seleccionando los anticuerpos parenta dalidad, el método para hacer una Inmunoglobulina riable Doble capaz de unión dos antígenos, que co sos de, a) obtener un primer anticuerpo parental o un ??? a antígeno del mismo, capaz de unir un primer tener un segundo anticuerpo parental o una porción tígeno del mismo, capaz de unir una segundo a esente o ausente; d) construir segunda y cuarta lipéptido que comprenden VD1 ~(X1 )n-VD2-C~(X2)n, en un primer dominio variable de cadena ligera obtenido d ticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mis segundo dominio variable de cadena ligera obte gundo anticuerpo parental o porción de unión a a smo; C es un dominio constante de cadena ligera; ( lazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n esente o ausente; y (X2)n no comprenda una región F ho (X2)n está ya sea presente o ausente; e) expr imera, segunda, tercera y cuarta cadenas de poli ñera que se genera una Inmunoglobulina de Domin ble capaz de unir dicho primer y segundo antígenos.
En otra modalidad más la invención proporciona ra generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable unir dos antígenos con propiedades deseada, que co cadena pesada obtenido de un primer anticuerpo par oteína de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segú riable de cadena pesada obtenido de un segundo rental o una proteína de unión a antígeno del mism minio constante de cadena pesada; (X1)n es un enlaza e no sea CH1, en donde dicho (X1)n está ya sea sente; y (X2)n es una región Fe, en donde dicho (X2)n esente o ausente; d) construir segunda y cuarta lipéptido que comprenden VD 1 -(X 1 )n-VD2-C-(X2)n, en un primer dominio variable de cadena ligera obtenido ticuerpo parental o porción de unión a antígeno del mis segundo dominio variable de cadena ligera obte gundo anticuerpo parental o porción de unión a a smo; C es un dominio constante de cadena ligera; ( lazador siempre que no sea CH1, en donde (X1)n esente o ausente; y (X2)n no comprenda una región F tígeno de los mismos. En otra modalidad, VD2 de la gunda cadenas de polipéptido descritas aquí se o smo anticuerpo parental o porción de unión de antígeno otra modalidad, VD2 de las primera y segunda lipéptido descritas aquí se obtienen de diferentes rentales o porciones de unión de antígeno de los rnism En una modalidad, el primer anticuerpo parental o ??? de antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo rción de unión de antígeno del mismo, son el mismo an ra modalidad, el primer anticuerpo parental o porción tígeno del mismo, y el segundo anticuerpo parental o ??? de antígeno del mismo, son anticuerpos diferentes.
En una modalidad, el primer anticuerpo parental o ión de antígeno del mismo, une un primer antígeno, y ticuerpo parental o porción de unión de antígeno del segundo antígeno. En una modalidad particular, lo rental o porción de unión de antígeno del mismo, une tígeno.
En otra modalidad, el primer anticuerpo parental o ión de antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo rción de unión de antígeno del mismo, se selecciona e consiste de anticuerpo humano, anticuerpo injerta ticuerpo humanizado. En una modalidad, las porciones tígeno se seleccionan del grupo que consiste de un fra fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que gmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en I zne; un fragmento Fd que consiste de los dominios V gmento Fv que consiste de los dominios VL y VH d ividual de un anticuerpo, un fragmento dAb, una re terminación de complementariedad aislada (CDR), un cadena individual, y diacuerpos.
En otra modalidad, la proteína de unión posee al ticuerpo se seleccionan del grupo que consiste de espe tígeno, afinidad a antígeno, potencia, función conocimiento de epítopo, estabilidad, solubilidad! ef oducción, inmunogenicidad, farmacocinétíca, biodis actividad cruzada de tejido, y unión de antígeno ortól dalidad, la proteína de unión es multivalente. En otra proteína de unión es multiespecífica. Las proteína ltívalentes o muitiespecíficas descritas aquí tienen seables, en particular desde un punto de vista tera mplo, la proteína de unión multivalente o una mul ede ser (1) internalizada (y/o catabolizada) más ráp ticuerpo bivalente por una célula que expresa un an al se unen los anticuerpos; (2) puede ser un anticuer o (3) puede inducir muerte celular y/o apoptosís de un presa un antígeno, en donde el anticuerpo multivalen unirse. El "anticuerpo parental" que proporciona por lo nstruyen como una proteína de unión multivalent scribe aquí.
En otra modalidad, la proteína de unión de la inv a constante de velocidad de acción (Kon) para uno o m eccionados del grupo que consiste de: por roximadamente 10 M4S"1; por lo menos aproximadarn "1; y por lo menos aproximadamente 106M4S'\ segú vés de resonancia de plasmón superficial. En otra m oteína de unión de la invención tiene una constante d acción (Kon) para uno o más objetivos de entre 102M" "1; entre 103M-1S"1 y 104 -1S'"1; entre 104M- S"1 y 1 tre 105M-1S"1 y 106M-1S"\ según medido a través de re smón superficial.
En otra modalidad, la proteína de unión tiene una c locidad sin acción (Koff) para uno o más objetivos se grupo que consiste de: por lo menos aproximadam e consiste de: a lo mucho 10*7M; a !o mucho 10*8M; a l ; a lo mucho 10" 0M; a lo mucho 10" 1M; a lo mucho 10 cho 10"13M. En una modalidad, la proteína de unió nstante de disociación (KD) para sus objetivos de 107 10~8 M a 10"9 ; de 10'9 M a 10'10 M; de 10'10 a 10"11 M 10"12 M; o de 10*12 a M 10"13 M.
En otra modalidad, la proteína de unión descrita njugado que además comprende un agente seleccionad e consiste de una molécula de inmunoadhesión, rmador de imagen, un agente terapéutico, y un agent una modalidad, el agente formador de imagen se sel upo que consiste de una radiomarca, una enzima, u orescente, una etiqueta luminiscente, una eti iniscente, una etiqueta magnética, y biotina. En otra agente formador de imagen es una radioetiqueta selec upo que consiste de: 3H 1 C 35S, 90Y, "Te, 111ln, 1251, unión cristalizada tiene una vida media mayor, in v traparte soluble de dicha proteína de unión. En otr icional, la proteína de unión cristalizada retiene l lógica.
En otra modalidad, la proteína de unión descrit cosilada. Por ejemplo, la glicosilación es un cosilación humano.
Un aspecto de la invención se refiere a un áci lado que codifica cualquiera de las proteínas de uni uí. Una modalidad más proporciona un vector que co ido nucleico aislado descrito aquí, en donde dicho lecciona del grupo que consiste de pcADN; pTT (Duro cleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT nación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima, S. y 990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJ PO, pEF6 TOPO y pBJ. En una modalidad, el vector e 4.1 S; NSO, SP2, PER.C6 o una célula fúngica ccahoromyces cerevisiae; o una célula de insecto tal c En una modalidad, dos o más DVD-lgs, por ej erentes especificidades, se producen en una célu ombinante individual. Por ejemplo, la expresión de un ticuerpos ha sido denominada Oligoclonics™ (M landa) Patentes de E.U.A. Nos. 7,262,028; 7,429,486.
Otro aspecto de la invención proporciona un m oducir una proteína de unión descrita aquí, que compre alquiera de las células huésped también descritas dio de cultivo bajo condiciones suficientes para oteína de unión. En una modalidad, un 50%-75% de la ión producida mediante este método es una proteín ravalente específica doble. En una modalidad partícul % de la proteína de unión producida mediante este mé teína de unión tetravalente específica doble. En un hídridos), poli (depsipéptido), poli (esteres), ácido p ido poii (láctico-co-glicólico) o PLGA, poli (b-hidroxibu prolactona), poli (dtoxanona); poli (etilen gi idroxipropil) metacrilamída, poli [(órgano)fosfazeno], teres), alcohol poli (vinílico), poli (vinilpirrolidona), cop hídrido maleico-alquil vinil éter, polioles plurónicos inato, celulosa y derivados de celulosa, coláge atina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicam lisacáridos sulfatadas, mezclas y copolímeros de los r mplo, el ingrediente se selecciona del grupo que úmina, sacarosa, trehalosa, iactitol, gelatina, hid lodextrina, metoxipolietilen glicol y polietiien g dalidad proporciona un método para tratar a un ma mprende el paso de administrar al mamífero una cantí la composición descrita aquí.
La invención también proporciona una ibidor de TIE-2), un bloqueador de molécula de co- cluyendo, pero no limitándose a anti-B7.1, anti-B7.2, ti-CD20), un bloqueador de molécula de adhesión ( ro no limitándose a un anticuerpo anti-LFA-1, un anti L selectina, un inhibidor de molécula pequeña), y un ti-citocina o fragmento funcional del mismo (incluyen itándose a anticuerpo de receptor anti-IL-18, anti-TN citocina), metotrexato, ciclosporina, rapamicina, F iqueta o reportero detectable, un antagonista de TN umático, un relajante muscular, un narcótico, un fá lamatorío no esteroidal (NSAID), un analgésico, un an dante, un anestésico local, un bloqueador neurom timicrobiano, un anti-psoriático, un corticoesteroide, u abólico, una eritropoyetína, una inmuniza munoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de fármaco de reemplazo de hormona, un radio-farma chos síntomas es mitigado o el tratamiento es l mplo, el trastorno se selecciona del grupo que compre teoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artrit tritis psoriática, artritis reactiva, espondiloatrop témico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis fermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, rmatitis escleroderma, enfermedad de injerto contr chazo de trasplante de órgano, enfermedad inmun ónica asociada con trasplante de órganos, erosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enf wasaki, enfermedad de grave, síndrome nefrótico, s tiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura hoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hep oñica, uveítis, choque séptico, síndrome de cho ndrome de sepsis, caquexia, enfermedades erativa, sinoviíis enteropática, clamidia, yersinia y ociada con salmonella, espondi!oartropatia, romatosa/arterioesclerosis, alergia ató pica, enferme toinmune, pénfigo vulgaris, pénfigo foliáceo, fermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmu molítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquir rniciosa juvenil, encefalitis mialgica/enfermedad Libr ndidiasis mucocutánea crónica, hepatitis esclerosant patitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmun quirida, enfermedades relacionadas con inmun quirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia var ipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatí ertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica fermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante c fermedad pulmonar intersticial pos-inflamatoria, ersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con imonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, diación, bronquiolitis obliteran, neumonía eosinofíli fermedad pulmonar de infiltración linfocítica, enfermed ersticial pos-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis pa t i t i s autoinmune de tipo 1 (hepatitis autoinmune oide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis de anti M), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a íns n acantosis nigricans, enfermedad inmune aguda a splante de órgano, enfermedad inmune crónica as splante de órgano, osteoartrítis, colangitis escierosan oriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, toinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonef riti croscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus coide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoín perma, esclerosis múltiple (todos los sub-tipos patética, hipertensión pulmonar secundaria a enfermed pático inducido por alcohol, colecistitis, enfermedad osincrática, hepatitis inducida por fármacos, esteato ohólica, alergia y asma, infección por estreptococo BS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esq fermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dol ónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales c pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, d ovario, de próstata y rectal y malignidades hem ucemia y linfoma), abetalipoprotemia, Acrocianosis, rásitos o infecciosos agudos y crónicos, leucemia agud foblástica aguda (ALL), leucemia mieioide aguda (AM cteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, falla r enocarcinoma, latidos ectópicos aéreos, complejo de d DA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgic rgica por contacto, rinitis alérgica, rechazo de f ¡ciencia de alfa-1-anti-tripsina, esclerosis lateral mores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de infl rivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de generaciones corticales de cerebelo, trastornos d uicardía atríal caótica o de foco múltiple, trastorno n quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CIVIL), nico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia ónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva cróni oxicación crónica por salicilato, carcinoma color rdiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por co lmonar, enfermedad de arteria coronaria, enfe eutzfeldt-Jakob, sepsis negativa de cultivo, fibros stornos asociados con terapia de citocina, demencia fermedades desmieiizantes, fiebre hemorrágica p rmatitís, condiciones dermatológicas, diabetes, diabet fermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad del wy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trasto chazo de injerto de cualquier órgano o tejido, s gativa, sepsis gram positiva, granulomas debido raceluiares, leucemia de célula pilosa, enfer llerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del he trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisi émico hemolítico/púrpura trombocitopénico t morragía, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infecc uropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, tra vimiento hipercinéticos, reacciones de hipers umonitis por hípersensíbilidad, hipertensión, tra vimiento hipocin éticos, evaluación hipotalámica-p renal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosi opática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, áste scular espinal infantil, inflamación de la aorta, i posición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neu ño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis seph), miastenia gravé, micobacterium aviar i erculosis por micobacteria, síndrome mielodiplásico ocardio, trastornos isquémicos al miocardio, carcin íngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefriti fermedades neurodegenerativas, atrofias musculares n fiebre neutropénica, linfoma de no Hodgkin, oclusión dominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales apía okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos vasectomía, órganomegalia, osteoporosis, rechazo d páncreas, carcinoma pancreático, síndrome para ercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de p fermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenial, ricardial, enfermedad aterosclerótica periférica, sculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, umonía carinii, neumonía, síndrome de POEMS (pol ganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonal, mbios de piel, rechazo de trasplante de intestino deiga lidos, arritmias específicas, ataxia espinal, deg pino-cerebelares, miositis por estreptococo, lesiones e l cerebelo, panencefalitis esclerosante, sub-aguda, sín l sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, sí puesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juve témíco, ALL de célula T o FAB, telangiectasia, tr literante, trombocitopenia, toxicidad, uma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad d ersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, icaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas sculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, ntricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vita éptica, síndrome hemafagocítíco asociado vital, sí rnicke-Korsakoff , enfermedad de Wilson, rechazo de cualquier órgano o tejido. mínales, testículos y tumores de célula germinal) docrinas (incluyendo la tiroides, glándulas adrenales piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas uellos que surgen de huesos y tejidos blandos así co Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y cluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retin uromas, neuroblastomas, Schwanomas, y meningioma lidos que surgen de malignidades hematopoyéticas cemias, y linfomas (tanto linfomas de Hodgkin c dgkin).
Las DVD-lgs de la invención también pueden tratar las siguientes enfermedades: síndromes coronari lineuritis Idiopática Aguda, Poliradiculoneuropatía D flamatoria Aguda, isquemia aguda, Enfermedad de Still opecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti emia aplástica, arteriesclerosis, eczema atópico, iquiátrico que inicia en la Niñez, enfermedad pulmonar nica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatí betes mellitus, hernia de disco, prolapsos de dis molítica inmune inducida por fármacos, e dometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multifor ltiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de G BS), Fiebre del Heno, síndrome de Hughes, enfe rkinson idiopática, neumonía intersticial idiopáti diada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositts lusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, smielizante inflamatoria, enfermedad cardiaca i fermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, eratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enf ssmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocttosis de ngerhan, livedo reticularis, degeneración macular, m liangitis microscópica, Morbus Bechterev, trastornos ¡mario, cáncer de próstata y rectal, y matopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasi a pura, Insuficiencia Adrenal Primaria, Optica de N currente, enfermedad cardiaca reumática, SAPHO (sin stulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma , cundaria, choque pulmonar, escleritis, ciática, i renal secundaria, enfermedad del tejido conectivo a eón, dermatosis de Sneddon-Wiikinson, espondilitis a drome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de lamatoria sistémica, arteritís temporal, retinitis to crolisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAP Factor de Necrosis Tumoral), reacción alérgica tipo o II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), njuntívitis primaveral, retinitis viral, síndrome de Vo rada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, ridas, y artropatía asociada con yersinia y salmonella. gundo agente, como se discute aquí. En una modalida segundo agente se selecciona del grupo que c denosida, factor de crecimiento epidérmico, cortic losporina, sulfasalazina, aminosalícilatos, 6-mer atioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, alazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de t tagonistas de receptor de IL-1, mAbs anti-l L-1 ß, mAbs ti-IL-6 o IL-6, factores de crecimiento, inhibidores d mpuestos de piridiníl-imidazol, anticuerpos o agonist , IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, I L-12, IL-13, IL-15, IL-16, I AP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, 8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, andos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, fetil, leflunomida, NSA!Ds, ibuprofeno, cortic edniso!ona, inhibidores de fosfodiesterasa, ag enosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de c ciente a través de por lo menos un modo selec ministración parenteral, subcutánea, intramuscular, i ra -articular, íntrabronquial, int ra -abdominal, in ra cartilaginosa, intracavitaria, íntracelial, int ra ce re b rebrovascular, intra-cólica, íntracervicai, in rahepática, intramiocardío, intraosteai, i raperícardiaca, intraperitonea) , intrapieural , i ntr rapulmonar, intra-rectal, intra-renal( i nt ra - retí n a ! t i rasinovial, intratoráxica, intrauterina, intravesical, bo ctal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmica.
Un aspecto de la invención proporciona por lo ticuerpo anti-ídiotípico para por lo menos una proteína presente invención. E! anticuerpo anti-idiotí pico inclu oteína o péptido conteniendo una molécula que compr nos una porción de una molécula de inmunoglobulin .ro no limitándose a, por lo menos una región de deter BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1A es una representación esque nstrucciones de Dominio Variable Doble (DVD)-lg y trategia para la generación de una DVD-lg de dos rentales; La Figura 1B es una representación de construccion D2-lg, y dos anticuerpos mono-específicos quimérico hibridoma 2D13.E3 (anti-IL-1a) y 13F5.G5 (anti- IL-?ß) DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIO Esta invención se refiere a proteínas de unión multt ltiespecíf icas capaces de unir dos o más pecíficamente, la invención se refiere a inmunogl minio variable (DVD-lg), y composiciones farmacéut minos deben ser claros, sin embargo, en el caso d bigüedad latente, las definiciones provistas a ecedente sobre cualquier definición de diccionario o emás, a menos que se requiera lo contrario por c minos singulares deben incluir pluralidades y los térmi ben incluir los singulares. En esta solicitud, el uso de o" a menos que se establezca otra cosa. Además, mino "que incluye", así como otras formas, tales como cluido", no es limitante. También, los términos emento" o "componente" abarcan tanto eieme mponentes que comprenden una unidad y el mponentes que comprenden más de una subunidad a pecíficamente se establezca lo contrario.
En general, las nomenclaturas utilizadas con re cnicas de, cultivo celular u de tejido, biología unologta, microbiología y química de proteína y ácid cnica o como se describe aquí. Las nomenclaturas úti lación a, y los procedimientos de laboratorio y técnicas alítica, química orgánica sintética, y química rmacéutica descritas aquí, son aquellas bien c múnmente conocidas en la técnica. Se utilizan técnicas ra síntesis químicas, análisis químicos, preparación fa mulación y suministro, y tratamiento de pacientes.
Para entender la presente invención más fácil rminos seleccionados se definen a continuación.
El término "polipéptido" como se utiliza aquí, s alquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términ "proteína" se usan intercambiablemente con el término también se refieren a una cadena polimérica de ami rmino "polipéptido" abarca proteínas nativas o gmentos de proteína y análogos de polipéptido de un proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o pol r lo menos aproximadamente 15 aminoácidos contigu nos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una lipéptido es como se describe aquí.
El término "proteína aislada" o "polípéptido aisla teína o polípéptido que en virtud de su origen o rivación no está asociado con componentes n ociados que lo acompañan en su estado n bstancialmente libre de otras proteínas de la misma presa por una célula de una especie diferente; o no turaleza. De esta manera, un polípéptido que está q tetizado o sintetizado en un sistema celular diferente partir de la cual se origina naturalmente d¾be ser "aisl mponentes naturalmente asociados. Una proteína tam r presentada substancíalmente libre de componentes n ociados mediante aislamiento, utilizando técnicas de proteína bien conocidas en el campo. iógicas incluye, pero no se limitan a, receptor de unió proliferación de célula, inhibición de crecimiento ucciones de otras citocinas, inducción de apoptosis, zimática. La actividad biológica también incluye la a a molécula de Ig.
Los términos "unión específica" o "específicament mo se utiliza aquí, con referencia a la ínteracc ticuerpo, una proteína, o un péptido con una segu ímica, significa que la interacción depende de la prese tructura particular (por ejemplo, un determinante a ítopq) en la especie química; por ejemplo, un anticuer se une a una estructura de proteína específica e oteínas en geaeral. Si un anticuerpo es específico para la presencia de una molécula que contiene el epítop no marcado), en una reacción conteniendo "A" ma ticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al an tá compuesta de una región variable de cadena pesada uí como HCVR o VH) y una región constante de cadena gión constante de cadena pesada está compuesta de tr 1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de riable de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR gión constante de cadena ligera. La región constante era está compuesta de un dominio, CL. Las regione emas pueden ser subdívididas en regiones de hiper nominadas regiones de determinación de comple DR), intercaladas con regiones que son más c nominadas regiones de estructura de trabajo (FR). Ca tá compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuest rmino amino hacia ei término carboxi en el siguiente R1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las mo unoglobulina pueden ser de cualquier tipo de clase ( G, I g E , IgM, IgD, IgA e tg Y) , o subclase (por ejemplo, l función fectora de anticuerpo (Wínter, et al, Patente s. 5,648,260 y 5,624,821). La porción Fe de un anticu rias funciones efectoras importantes, por ejemplo, la i ocina, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad depen mplemento (CDC) y vida media/velocidad de elimi ticuerpo y complejos de antígeno-anticuerpo. En aig tas funciones efectoras son deseables para anticuerpo ro en otros casos pueden ser innecesarias o aú pendiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertas isoti rticularmente IgG 1 e lgG3, medían ADCC y CDC a t ión a FCyRs y C1q de complemento, respectiva ceptores de Fe neonatales (FcRn) son los componen e determinan ia vida media en circulación de ios anti a modalidad, por lo menos un residuo de ami emplazado en la región constante del anticuerpo, por gión Fe dei anticuerpo, de manera que las funciones e ochemistry 37: 9266-73). Por lo tanto, es posible gen dia monovalente. De manera interesante, estas molé dia monovalente se han encontrado por naturaleza belases de IgG como de IgA (Seligman 1978 Ann I 5-70; Biewenga, et al, 1983 Clin Exp Immunol 51: 3 tequíometría de la región Fe de FcRn.lg se ha determ 1 (West, et al, 2000 Biochemístry 39: 9698-708), y la ficiente para mediar la unión de FcRn (Kim, et al, munol; 24: 542-548). Las mutaciones para int merizacion del dominio CH3 pueden no tener mayor efe bre su unión de FcRn ya que los residuos importan merizacion de CH3 están localizados en la superfici erna de la estructura de la lámina de CH3 b} mien gión responsable para la unión de FcRn está ubi perficie colindante externa de los dominios CH bargo, la molécula Ig media puede tener cierta ve ñera que un fragmento I g G 1 Fe apropiado puede nerando así una í g G 1 Fe completamente recombinant n potencia enormemente mejorada (Anthony, R.M. et ience 320:373-376).
El término "porción de unión a antígeno" de un a plemente "porción de anticuerpo"), como se utiliz iere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que bilidad de unirse específicamente a un antígeno. Se e la función de unión a antígeno de un anticuerpo alizada a través de fragmentos de un anticuerpo mpleta. Dichas modalidades de anticuerpo también rmatos biespecíficos, específicos dobles, o multi- iéndose específicamente a dos o más antígenos emplos de fragmentos de unión abarcados dentro orción de unión a antígeno" de un anticuerpo inclu gmento de Fabt un fragmento monovalente que con mplementariedad aislada (CDR). Además, aunque los d l fragmento de Fv, VL y VH, son codificados por genes tos pueden ser unidos utilizando métodos recombinant un enlazador sintético que les permite hacerse como proteína individual en donde las regiones VL y VH s ra formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv ividual (scFv); ver, Bird, et al, (1988) Science 24 ston, et al, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci USA 85 chos anticuerpos de cadena individual también pre arcados dentro del término "porción de unión a antíg ticuerpo. También se consideran otras formas de ant dena individual, tales como diacuerpos. Los diac ticuerpos bivalentes, biespecíficos, en donde los domin expresan en una cadena de poüpéptido individual, per enlazador que es demasiado corto para permitir la f res entre los dos dominios en la misma cadena, forzan 1) que, junto con polipéptidos de cadena mplementariedad, forman un par de regiones de unión apata, et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062); y Patent . 5,641,870).
El término "proteína de unión multivalente" se utili esta especificación para denotar una proteína de mprende dos o más sitios de unión a antígeno. En una proteína de unión multivalente se diseña por ingenierí tres o más sitios de unión a antígeno, y en gener ticuerpo de existencia natural. El término "proteín ltiespecífica" se refiere a una proteína de unión capaz más objetivos relacionados o no relacionados. Las p ión de dominio variable dobíe (DVD) de la invención s ó más sitios de unión a antígeno y son proteín ravalentes o multivaientes. Los DVDs pu noespecíf icos, es decir, capaces de unir un a El término "anticuerpo biespecífico", como se utili i e r e a anticuerpos de longitud completa que son diante la tecnología de cuadroma (ver, Milstein, C y ture, 1983. 305(5934); p. 537-40), a través de conjugac dos diferentes anticuerpos monoclonales (ver, Staerz, ture, 1985. 314(6012), o a través de perilla en el pectos similares que introducen mutaciones en la r er, Holliger, P., T. Prospero, y G. Winter, Proc Nati Ac 93. 90(14): p. 6444-8.18), dando como resultad erentes especies de ínmunoglobulína, de las cuales so ticuerpo biespecífico funcional. A través de función m ticuerpo biespecífico une un antígeno (o epítopo) en s brazos de unión (un par de HC/LC), y une un diferen epítopo) en su segundo brazo (un par diferente de vés de esta definición, un anticuerpo biespecífico tintos brazos de unión a antígeno (tanto en especifi e se une, Un "sitio de unión a antígeno funcional" de una ión es uno que es capaz de unir un antígeno objetivo. unión a antígeno del sitio de unión a antíg cesariamente tan fuerte como el anticuerpo parental, al se deriva el sitio de unión a antígeno, pero la habili antígeno debe ser. medible utilizando cualquiera de riedad de métodos conocidos para evaluar la unión de antígeno. Además, la afinidad de unión a antígeno de s sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multívale cesita ser cuantitati amente la misma.
El término "citocina" es un término genérico par eradas por una población de célula, las cuales actúa blación de célula como mediadores intercelulares. chas citocinas son linfocinas, rnonocinas, y ho lipéptido tradicionales. Entre las citocinas se incluyen tivina; factor de crecimiento endotelial vascular; mbopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervios F-alfa; factor de crecimiento de plaqueta; factor de cre centa, factores de crecimiento de transformación ( mo TGF-alfa y TGF-beta; factor-1 y -11 de crecimie ulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivo; les como interferón-alfa, -beta y -gama, factores esti lonia (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF); crófago.CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); i s), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL , IL-11. IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-2 ctor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-b ctores de polipéptido incluyendo LIF y el ligando kit (K iliza aquí, el término cítocína incluye proteínas túrales o de un cultivo de célula recombinante y lógicamente activos de las citocinas de secuencia nati ; SAKTTPKLGG (SEC ID NO: 4); SAKTTP (SEC ID NO: EC ID NO: 6); RADAAPTVS (SEC ID NO: 7); RADA EC ID NO: 8); R AD AAAA(G4S)4 (SEC ID TTPKLEEGEFSEAR V (SEC ID NO: 10); ADAAP (SEC AAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVAAP (SEC ID AAPSVFÍFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP (SEC I KAAPSVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC I TTPPSVT.PLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC I TTAPSVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC I TKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGG : 23); GENKVEYAPALMALS (SEC ID NO: 24); GPAKEL EC ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEC ID NO: 26).
Un "dominio constante de inmunoglobulina" se r minio constante de cadena pesada o ligera. En la nocidas las secuencias de aminoácido de dominio c dena pesada y cadena ligera de IgG humana. ntra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb ntra un determinante individual en el antígeno. El onoclonal" no debe ser construido como requiriendo la l anticuerpo mediante cualquier método particular.
El término "anticuerpo humano", como se utiliza aq luir anticuerpos que tienen regiones variables y rivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina de lín mana. Los anticuerpos humanos de la invención incluy aminoácido no codificados por secuencias de inmuno ea germinal humana (por ejemplo, mutaciones i diante mutagénesís aleatoria o de sitio específico i vés de mutación somática in vivo), por ejemplo, en las rticular, CDR3. Sin embargo, el término "anticuerp mo se utiliza aquí, no pretende incluir anticuerpo cuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra mífero, tal como un ratón, han sido injertadas en se ghsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavil rrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogen ames P. (2000) immunology Today 21:371-378), lados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es ra genes de inmunoglobulina humana (ver, Taylor, 992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. y 002) Current Opinión in Biotechnology 13:593-597; Lit 000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos presados, creados o aislados mediante otros olucran la división de secuencias del gen de inm mana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerp combinantes tienen regiones variables y constantes d cuencias de inmunoglobulina de línea germinal n bargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpo combinantes son sometidos a mutagénesis in vitro (o, iza un animal transgénico para secuencias de n un anticuerpo parental que no posee esas altera ticuerpos maduros de afinidad ilustrativos tendrán nomolares o aún picomolares para el antígeno o ticuerpos maduros de afinidad son producidos ocedimientos conocidos en la técnica. Marks, et al, B i d 1 :779-783 (1992) describe maduración de afinida tremezclado de dominio VH y VL. La mutagénesis aleat 0 residuos de estructura de marco se describe por: B oe. Nat. Acad, Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier 9:147- 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994- ckson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawki l. Biol 226:889-896 (1992) y mutación selectiva en p tagénesis selectiva, posiciones de contacto o hiperm residuo de aminoácido de mejora de actividad como » la Patente de E.U.A. US 6914128B1.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anti riables de cadena pesada y ligera de murino en donde las CDRs de murino (por ejemplo, CDR3) ha sido reem cuencias de CDR humanas.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a e comprenden secuencias de región variable de cade era de una especie no humana (por ejemplo, un rató nde por lo menos una porción de la secuencia VH y/o erada a una apariencia de tipo humano", es decir, m cuencias variables de línea germinal humanas. ticuerpo humanizado en un anticuerpo injertado co de se introducen secuencias de^CDR humanas en se VL no humanas para reemplazar las secuencias manas correspondientes. También "anticuerpo humani ticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragment e se une de manera inmunoespecífica a un antígeno e comprende una región de estructura de marco (F bstancialmente todos de por lo menos uno, y típica minios variables (Fab, Fab\ F(ab') 2, FabC, Fv) en do bstancialmente todas las regiones de CDR corre uellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, nador) y todas o substancialmente todas las regiones d marco son aquellas de una secuencia de co unoglobulina humana. En una modalidad, un manizado también comprende por lo menos una por gión constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente a inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, u manizado contiene tanto la cadena ligera como al minio variable de una cadena pesada. El anticuer luye las regiones CH1, de gozne, CH2, CH3, y CH4 d sada. En algunas modalidades, un anticuerpo huma ntiene una cadena ligera humanizada. En algunas mod ticuerpo humanizado solo contiene una cade anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de l abat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Inte ición, U.S. Department of Health and Human Services, H No. 91-3242). Para la región variable de cadena gión hipervariable varía de las posiciones de aminoáci ra CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 65 par siciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Par riable de cadena ligera, la región hipervariable v siciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, po inoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoác ra CDR3.
Como se utiliza aquí, el término "CDR" se refiere a terminación de complementariedad dentro de secuenci anticuerpo. Existen tres CDRs en cada una de l riables de la cadena pesada y la cadena ligera, la riable de un anticuerpo, pero también proporciona límit residuo definiendo las tres CDRs. Estas CDRs nominadas como CDRs de Kabat. Chothia y colaborado Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia et 2:877-883 (1989)) encontraron que ciertas sub-porcion CDRs de Kabat adoptan conformaciones de estructura ptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad cuencia de aminoácido. Estas sub-porciones se desig , L2 y L3 ó H1, H2 y H3, en donde "L" y "H" designan cadena ligera y de cadena pesada, respectivam giones pueden ser denominadas como las CDRs de ales tienen límites que traslapan con las CDRs de K ites que definen CDRs que traslapan con las CDRs d o descritos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Otras definiciones m CDR pueden no estrictamente seguir uno de los sis ecuencia de estructura de marco" se refiere a las stantes de una región variable menos las CDRs. Ya q finición de una secuencia de CDR puede ser deter erentes sistemas, el significado de una secuencia de e rco es sometido a interpretaciones correspon erentes. Las seis CDRs (CDR-L1 , -L2, y -L3 de la cad R-H1, -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen ! estructura de marco en la cadena ligera y la cadena atro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada nde la CDR1 está colocada entre FR1 y FR2, CDR2 3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las s rticulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de e rco, como las denominadas por otras, represent mbinadas dentro de la región variable de una munoglobulina de existencia natural, individual. Com uí, una FR representa una de las cuatro sub-regione (2001)). Una de las ventajas provistas por varias mod presente invención se basa en eí reconocimiento que i ticuerpo de línea germinal son probablemente más qu anticuerpo maduros para conservar estructuras de s inoácido esenciales características de individuos en la r lo que menos probablemente serán reconocidas co nte extraña cuando se usan terapéuticamente en esa e Como se utiliza aquí, el término "neutralizar" s ntrarrestar la actividad biológica de un antígeno teína de unión específicamente une el antígen dalidad, la proteína de unión de neutralización une l duce su actividad biológica por al menos aproximada %, 60%, 80%, 85% ó más.
El término "actividad" incluye actividades tale pecificidad de unión y la afinidad de una DVD-lg para tígenos. anticuerpo une específicamente un antígeno cuando tígeno objetivo, en una mezcla compleja de pr cromoléculas. Se dice que los anticuerpos "se une ítopo" si los anticuerpos compiten de manera cruzada ( i ó n o efecto modulador del otro). Además, las tructurales de epítopos (traslape, similar, idé ormativas, pero las definiciones funcionales por lo s relevantes ya que abarcar parámetros estructurale ncionales (modulación, competencia).
El término "resonancia de plasmón superficial", co uí, se refiere a un fenómeno óptico que permite el eracciones bioespecíf icas en tiempo real a través de l alteraciones en concentraciones de proteína dentro d bio-sensor, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcor ternationai AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsa scataway, NJ). Para más descripciones, ver Jónsson onstante de velocidad de asociación", o "ka", ya ercambiablemente aquí. Este valor que indica la v ión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la v rmación de complejo entre un anticuerpo y un antígeno estra por la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag") ? Ab-A El término "Koff\ como se utiliza aquí, se refiere a I velocidad sin acción para la disociación, o "co locidad de disociación", de una proteína de unión^ (por ticuerpo) del, por ejemplo, complejo de anticuerpo/ant conocido en la técnica. Este valor indica la v sociación de un anticuerpo a partir de su antígeno paración del complejo Ab-Ag con el tiempo en el anticu antígeno como se muestra por la siguiente ecuación: equilibrio se utilizan para representar la afinidad de ticuerpo a un antígeno. En la técnica son bien co todos para determinar las constantes de velocidad de disociación. La utilización de técnicas a base de fl rece alta sensibilidad y la habilidad de examinar guiadores de pH fisiológicos en equilibrio. Otro perimentales e instrumentos tales como el ensay nálisis de interacción bío-molecular) pueden ser uti mplo, el instrumento disponible de BIAcore internatio mpañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Además, ede utilizar un ensayo KinExA® (Kjnetic E_sclusi ponible de Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
"Etiqueta" y "etiqueta detectable* significan una por patrón de unión específico, tal como un anticuerpo o emplo, para presentar la reacción entre miembros de ión específico, tal como un anticuerpo y un analito, d otiniio que pueden ser detectadas a través de avidina m emplo, estreptavidina conteniendo un marcador flu tividad enzimatica que puede ser detectada a través ticos y colorimétricos). Ejemplos de etiquetas para cluyen, pero no se limitan a, los siguientes; radi dionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 111l Lu, 16???, o 153Sm); cromógenos, etiquetas fluores emplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), etiquetas or ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatas rcadores químioluminiscentes; grupos de biotínílo; lipéptido predeterminados reconocidos por un reportero or ejemplo, secuencias de par de cierre de leucina, siti ra anticuerpos secundarios, dominios de unión de met epítopo); y agentes magnéticos, tales como queíatos d emplos representativos de etiquetas comúnmente emp munoensayos incluyen porciones que produce luz, p gente" se utiliza aquí para denotar un compuesto q zcla de compuestos químicos, una macromoiécula b i o I tracto hecho de materiales biológicos. En una mo entes terapéuticos o cítotóxicos incluyen, pero no s xina pertussis, taxol, citocalasin B, gramicidina D, etidi etina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, lquicina, doxorubicina, daunorubicina , dihidroxi antr toxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrot ucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, pro romicina y análogos u homólogos de los mismos. iplean en el contexto de un inmunoensayo, el an njugado puede ser un anticuerpo detectablemente iquetado utilizado como el anticuerpo de detección.
Los términos "cristal" y "cristalizado" como se utiii fieren a una proteína de unión (por ejemplo, un an rción de unión a antígeno del mismo, que existe en construcción, que se repite en un cristal se denomin imétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una e se conforma a una simetría cristalográfica bi oporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición itaría por traducciones regulares en todas las tres oporciona el cristal. Ver, Giege, R. y Ducruix, ystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practica d ea., pp. 20 1- 16, Oxford üniversity Press, New York 999).
El término "polinucleótido" se refiere a una forma p S o más nucleótídos, ya sea ribonucl soxiribonucleótidos o una forma modificada de cualq cleótido. El término incluye formas de ADN de es dena individual o doble.
El término "polinucleótido aislado" debe refer linucleótido (por ejemplo, de origen genómico, ADNc, o tructura de cadena doble circular en el cual se p gmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector e ral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden se genoma viral. Ciertos vectores son capaces de tónoma en una célula huésped en donde se intr emplo, vectores bacterianos que tienen un origen ba ctores de replicación y epísomales de mamífero). Otr or ejemplo, vectores de mamífero no epísomales) tegrados al genoma de una célula huésped des troducción a la célula huésped, y de esta manera se re el genoma huésped. Además, ciertos vectores son rigir la expresión de genes a los cuales están ope lazados. Dichos vectores son denominados aquí como presión recombinante" (o simplemente "vectores de exp nera!, los vectores de expresión de utilidad en técni combinantes están por lo regular en la forma de plás lación que les permite funcional en su forma prete cuencia de control "operablemente enlazada" a una s dificación está ligada de tal manera que ' la expré cuencia de codificación se logra bajo condiciones com secuencias de control. Las secuencias "op lazadas" incluyen tanto secuencias de control de ex n contiguas al gen de interés como secuencias de presión que actúan in trans o a una distancia para cont interés. El término "secuencia de control de expresió iliza aquí, se refiere a secuencias de poiinucleóti cesarias para efectuar la expresión y procesamiento de codificación a las cuales están ligadas. Las secuencia expresión incluyen secuencias apropiadas de rminación, promotoras y mejoradoras; señales de proce N eficientes tales como señales de división y de poli cuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; sec control" pretende Incluir componentes cuya presencia ra la expresión y procesamiento, y también pue mponentes adicionales cuya presencia es ventajosa, p cuencias líderes y secuencias de patrón de fusión.
"Transformación" se refiere a cualquier procedimien cual el ADN exógeno entra a una célula h nsformación puede ocurrir bajo condiciones naturales ilizando varios métodos bien conocidos en la t nsformación puede basarse en cualquier método cono erción de secuencias de ácido nucleico extrañas en ésped procariótica o eucariótica. El método se sándose en la célula huésped siendo transformada y p ro no se limita a, infección viral, electroporación, li mbardeo de partículas. Dichas células "transformada uías establemente transformadas en donde el ADN i paz de replicación ya sea como un plásmido de rminos pretenden referirse no solo a la célula partícul mbién a la progenie de dicha célula. Ya qué ciertas mo eden ocurrir en generaciones siguientes debido a sus mutación o ambientales, dicha progenie, en realida r idéntica a la célula de origen o parental, p cluyéndose dentro del alcance del término "célula hué utiliza aquí. En una modalidad, las células huésp lulas procarióticas y eucarióticas seleccionadas de c s Reinos de la vida. En otra modalidad, las células cluyen, células protistas, fúngicas, vegetales y de ani dalidad, las células huésped incluyen, pero no se M ea de célula procariótica E. Coli; líneas de célula d O, HEK 293, COS, NSO, SP2, y PER.C6; la línea d secto Sf9¡ y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae Se pueden utilizar técnicas estándares para ADN re ntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación d íd Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H 989)), la cual se Incorpora aquí para referencia par opósito.
"Organismo transgénico", como es conocido en la fiere a un organismo que tiene células que contienen donde el transgen introducido en el organismo (o un ganismo) expresa un polípéptido no naturalmente expr ganismo. Un "transgen" es una construcción de ADN, ta ble y operablemente integrada en el genoma de u rtir de la cual se desarrolla un organismo transgénico expresión de un producto de gen codificado en uno o lula o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" s ercambiablemente, y, tal como se utiliza aquí, se r mbio o una alteración en la actividad de una molécul or ejemplo, la actividad biológica de una citocina). La la magnitud de cierta actividad o función de un mparado con la magnitud de la actividad o función o sencia del modulador. En ciertas modalidades, un mod hibidor, el cual reduce la magnitud de por lo menos una nción de una molécula. Los inhibidores ilustrativos in se limitan a, proteínas! péptidos, anticuerpos, p rbohídratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pept scriben en, por ejemplo, WO 01/83525.
El término "agonista" se refiere a un modulador que ne en contacto con una molécula de interés, o cremento en la magnitud de cierta actividad o fu lécula comparado con la magnitud de la actividad servada en ausencia del agonista. Los agonistas rticulares pueden incluir, pero no se limitan a, polipépt cleicos, carbohidratos, o cualquier otra molécula qu tígeno. lécula, la cual se une al antígeno.
Como se utiliza aquí, el término "cantidad efectiva" cantidad de una terapia que sea suficiente para redu severidad y/o duración de un trastorno o uno o ntomas, evitar el avance de un trastorno, ocasionar un un trastorno, evitar la recurrencia, desarrollo, inicio uno o más síntomas asociados con un trastorno, storno, o mejorar o aliviar el efecto(s) profiláctico o te ra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutic "Paciente" y "sujeto" pueden ser utilizados intercam uí para referirse a un animal, tal como un mamífero, in ímate (por ejemplo, un ser humano, un mono, y un chi primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, gato, un perro, una rata, un ratón, una ballena), emplo, un pato o un ganso), y un tiburón. Preferib sa viviente o una cosa anteriormente viviente. Di vientes incluyen, pero no se limitan a, seres human tas, monos, perros, conejos, y otros animales. Dichas cluyen, pero no se limitan a, sangre (por ejemplo, san asma, suero, orina, fluido amniótíco, fluido sinov doteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órga dula ósea, nodos linfáticos y bazo.
"Componente", "cBmponentes", y "por lo mponente", se refieren generalmente a un anticuerpo anticuerpo de detección o conjugado, un control, un a serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un regulador de pH, un diluyente, una sal, una enzima, ra una enzima, un reactivo de detección, un reactivo etratamiento, un substrato (por ejemplo, como una so lución de detención, y similares que pueden ser incl uipo para ensayo de una muestra de prueba, tal como filizados para reconstitución para usarse en un ensayo.
"Control" se refiere a una composición conocida n ontrol negativo") o por contener un analito ("control p ntrol positivo puede comprender una concentración alito. "Control", "control positivo", y "calibrador" pued ercambiablemente aquí y se refieren a una comp mprende una concentración conocida de analito. sitivo" puede utilizarse para establecer carácte ncionamiento de ensayo y es un indicador útil de la in activos (por ejemplo, analitos).
"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se neral a un valor de corte de ensayo que se utiliza par ultados de diagnóstico/pronóstico/terapéuticos com sultados del ensayo contra el corte/nivel predeterminad corte/nivel predeterminado ya ha sido enlazado o a rios parámetros clínicos (por ejemplo, severidad de la ede variar entre los ensayos, en general deben ser a rrelaciones como se describe aquí (si hay alguna).
"Reactivo de pre-tratamiento", por ejemplo, lisís, p o reactivo de soiubilización, como se utiliza en un agnóstico como se describe aquí es uno que permite la uías y/o solubiliza cualquier analito que esté/estén p a muestra de prueba. El pre-tratamiento no es nec das las muestras, como se describe aquí. Entre otra lubilización del analito (por ejemplo, polipéptido de int esentar la liberación del analito a partir de cualquier ión endógena presente en la muestra. Un reacti tamiento puede ser homogéneo (que no requiere de paración) o heterogéneo (que requiere de un paso de n el uso de un reactivo de pre-tratamiento heterogén moción de cualquier proteína de unión de analito p rtir de la muestra de prueba antes de proseguir al sig sitivo/negativo predeterminado. Se pueden utiliza ibradores (es decir, más de un calibrador o una canti calibradores) en conjunto para comprender un n s i b i I i d a d " .
"Riesgo" se refiere a la posibilidad o probabilidad d rticular que ocurre ya sea en la actualidad o en algún uro. "Estratificación de riesgo" se refiere a una dis tores de riesgo clínicos conocidos que permiten a l sificar pacientes en un riesgo, bajo, moderado, alto, o sarrollar una enfermedad, trastorno o condición particul "Específ ico(a)" y "especificidad" en e! context eracción entre miembros de un par de unión esp mplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y un an gmento antigénicamente reactivo del mismo)) se re actividad selectiva de la interacción. La frase "específ e a" y frases análogas se refiere a la habilidad de an treptavidina), carbohidratos y lecitinas, secuencias d mplementarias( moléculas efectoras y de receptor. C zirnas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. res de unión específicos pueden incluir miembro álogos de los miembros de unión específicos orig mplo, una analito-anáiogo. Los miembros de unión munoreactivos incluye antígenos, fragmentos de ticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y poli mo complejos, fragmentos, y variantes (incluyendo fra rlantes) de ios mismos, ya sea aislados o recombi oducidos.
"Variante", como se utiliza aquí, representa un poli iere de un polipéptido dado (por ejemplo, polipéptid P, NGAL o VIH o anticuerpo antí-polipéptido) en una s inoácido mediante la adición (por ejemplo, inserción), substitución conservadora de aminoácidos, pero qu r ejemplo, Kyte et al., J. Mol. BioL 157: 105-132 (1982 dropático de un aminoácido se basa en una consider rácter hidrofóbico y carga. Se sabe en la técn i inoácidos de índices similares hidropáticos p bstituidos y seguir reteniendo la función de la prot pecto, los aminoácidos que tienen índices hidropático stituidos. El carácter hidrofílico de los aminoácidos ta r utilizado para revelar substituciones que podrían sultado proteínas que retengan la función biol nsideración de! carácter hidrofílico de aminoácidos en péptido permite el cálculo del carácter hidrofílico pro yor de ese péptido, una medida útil que ha sido rep rrelacionarse bien con la antigenicidad e inmunogen r ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,554,101, la cual uí para referencia). La substitución de aminoácidos lores de carácter hidrofílico similares puede dar com rticular las cadenas laterales de esos aminoácidos, seg r el carácter hidrofóbico, el carácter hidrofílico, carga ras propiedades. "Variante" también se puede u scribir un polipéptido o fragmento del mismo qu erencialmente procesado, tai como a través de sforilación, u otra modificación de pos-traducción, aú tivídad biológica o reactividad antigéníca, por ejemplo, ra unirse a IL-18. El uso de "variante" aquí 'prete gmentos de una variante a menos que se diga otra ntexto.
Generación de proteína de unión DVD La invención se refiere a proteínas de unión riable Doble capaces de unir uno o más objetivos, y m cer las mismas. En una modalidad, la proteína de unión a cadena de polipéptido, en donde dicha cadena de Generación de anticuerpos monoclonales parente Los dominios variables de la proteína de unión DVD tenidos a partir de . anticuerpo parenterales, liclona!es y mAbs capaces de unir antígenos de int ticuerpos pueden ser de existencia natural o pueden se través de tecnología recombinante.
Se pueden preparar mAbs utilizando una amplia cnicas conocidas en el campo incluyendo el uso de enologías recombinantes, y de presentación de fa mbínación de las mismas. Por ejemplo, se pueden pr ilízando técnicas de hibrídoma, incluyendo aquellas c campo y enseñadas en, por ejemplo, Harlow et al. , A borátory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Pre 88); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies bridomas 563-681 (Elsevier, N, Y., 1981) (dichas ref corporan aquí para referencia en sus totalidades), S hibridomas pueden ser cultivados y expandidos ímales singénicos, en animales que carecen de munológico, por ejemplo, ratones desnudos o pelones, célula in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar bridomas son bien conocidos por aquellos expertos en una modalidad particular, los hibridomas son hibridom otra modalidad, los hibridomas son producidos en una mana, no de ratón, tal como ratas, ovejas, cerdos, cab caballos. En otra modalidad, los hibridomas son manos, en donde un mie!oma de no secreción sionado a una célula humana expresando un anticuer ión un antígeno específico.
Los mAbs recombinantes también son generados focitos individuales, aislados, utilizando un pr nominado en la técnica como el método de anticuerpo leccionado (SLAM), como se describe en la Patente d mífero, tales como células COS o CHO. Las célul nsfectadas con las secuencias de inmunoglobulina rivadas de linfocitos seleccionado in vivo, despu perimentar otro análisis y selección in vitro, por ejempl a técnica de toma panorámica de las células transfe tar anticuerpos de expresión al antígeno de i cuencias de inmunoglobulina amplificada además nipuladas in vitro, tal como a través de métodos de ma inidad in vitro, tales como aquellos descritos en ta Pu T WO 97/2913 y Publicación de PCT WO 00/56772.
Los anticuerpos monoclonales también se produce inmunización de un animal no ser humano comprendien todos, de los sitios de inmunoglobulina humana con un erés. En una modalidad, el animal no ser humano nsgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón diseñada po e comprende grandes fragmentos de sitios de inm blicada el 21 de Octubre, 1999, WO 00 09560, publica brero, 2000 y WO 00/037504, publicada el 29 de Juni tón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio o adulto de anticuerpos totalmente humanos, y genera noclonales humanos específicos en antígeno. El ratón NOMOUSE contiene aproximadamente 80% del re ticuerpo humano a través de la introducción de fragme nfiguración de línea germinal, con un tamaño de mega ios de cadena pesada humana y x sitios de cadena ndez et al., Nature Genética 15:146-156 (1997) kobovits J. Exp, Med. 188:483-495 (1998), las descripc ales se incorporan aquí para referencia.
También se pueden utilizar métodos in vitro par ticuerpos parenterales, en donde una biblioteca de a sificada para identificar un anticuerpo que tiene le e unión deseada. Los métodos para dicha clasi tibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Scienc 81 ; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Gri 993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) 6:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628: 992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19. Barbas et ai. (1991) PNAS 88:7978- 7982, publicación patente de E.U.A. 20030186374, y Publicación P /29131, los contenidos de cada una de las cuales se uí para referencia.
Los anticuerpos parentales de la presente invenc eden ser generados utilizando varios métodos de pres go conocidos en la técnica. En métodos de presentaci s dominios de anticuerpo funcionales son presentad perficte de partículas de fago, las cuales llevan las se linucleótido que las codifican. En particular, dicho fag tabilizados con disulfuro recombinaníemente fusionado n lil de fago a la proteína del gen IV. Ejemplos de esentación de fago que pueden ser utilizados para ticuerpos de la presente invención incluyen aquellos d inkman et al., J, Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 rton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (199 PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones de PCT W 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/ /15982; WO 95/20401; y Patentes de E.U.A. Nos. 223,409; 5,403,484; 5,580,717; .5,427,908; 5,750,753; 571,698; 5,427,908; 5,516,63.7; 5,780, 225; 5,658,727; 969,108; cada una de las cuales se incorporan aquí par su totalidad.
Como se describió en las referencias de la presen todos conocidos en la técnica, tales como aquellas de blicación de PCT WO 92/22324; Mullinax et al., Bi (6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJPJ 34:26-34 (199 al., Science 240:1041-1043 (1988) (dichas refe orporan aquí para referencia en sus totalidades). cnicas que pueden ser utilizadas para producir Fvs ividual y los anticuerpos incluyen aquellos descri tentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., zymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 9 993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
Como alternativa a la clasificación de bibliotecas d combinante a través de presentación de fago, se pu ras metodologías conocidas en las técnicas para clasifi bliotecas de combinación para la identificación de renterales. Un tipo de sistema de expresión alternativ nde la biblioteca de anticuerpo recombinante se ex ©piedades del péptido o proteína codificada, p ticuerpo, o una porción del mismo, tal como la ticuerpo, o porción del mismo, al antígeno de especifi s secuencias de ácido nucleico que codifican ant rciones de los mismos, recuperadas de la clasificació bliotecas pueden ser expresadas a través de medios re mo se describe aquí (por ejemplo, en células mífero) y, además, pueden ser sometidas a ma nidad adicional a través de rondas adicionales de clas siones de ARNm-péptido en donde se han introducido la secuencia(s) originalmente seleccionada, o a trav todos para maduración de afinidad in vitro de combinantes, como se describe aquí.
En otro aspecto, los anticuerpos parentales también nerados utilizando métodos de presentación de levadur la técnica. En los métodos de presentación de l Los anticuerpos descritos aquí además pueden ser ra generar anticuerpos parentales de CDR in manizados. Los anticuerpos parentales injertados mprenden secuencias de región variable de cadena pes partir de un anticuerpo humano, en donde una o iones CDR de VH y/o VL son reemplazadas con secuen anticuerpos de murino capaces de unir el antígeno de i cuencia de estructura de marco de cualquier anticue ede servir como la plantilla para el injerto de CDR. S reemplazo de cadena recta en dicha estructura de' neral conduce a cierta pérdida de afinidad de unión tre más homólogo sea un anticuerpo humano al an urino original, hay menos posibilidad de que la com Rs de murino con la estructura de marco humano storsiones en las CDRs que podrían reducir la afini nto, en una modalidad, la estructura de marco variable r lo menos 80% de identidad de secuencia. En la nocidos los métodos para producir tales anticuerpo 9,400; publicación de PCT WO 91/09967; Patentes de 225,539; 5,530,101 ; y 5,585,089), anticuerpos de recu juvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, munology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et gineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 994)), y arrastre de cadena (Pat. E.U.A. No. 5, ticuerpos anti-idiotípicos.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de an anticuerpo de especie no humana que une el antíge niendo una o más regiones de determinación de comple DRs) de la especie no humana y regiones de estructu una molécula de inmunoglobulina humana. Las secue mana conocidas se describen en, por w. nebí, nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.sc thbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www u/.about.hcl/; www. pebio.com/pa/340913/3 w. nal.usda .gov/awic/pubs/antibody/; w acjp/.about.yasuhito-/ Elisa, html; www. biodesign. co w. icnet. uk/axp/facs/davies/lin-ks. html; w. biotech . ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; t.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni- marburg.de/.ab a rt. html; baserv. uci.kun.nl/. about.jraats/linksl. html; ww .de/immuno. bme.nwu.edu/; www. mrc-cpe.cam.ac.uk ie/ INTRO.html; www.íbt.unam.mx/vir/ gt.cnusc.fr:8104/; www. .uk/.about.martin/abs/index.html; antibody. gen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; w. unizh.ch/.about. honegger/AHOsem -i na r/SlideO w.cryst. bbk.ac.Uk/.about.ubcg07s/; w.nimr.mrc.ac,uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; locídad de activación, velocidad de no activación inidad, especificidad, vida media u otra característic ??10 es conocido en la técnica.
Los residuos de estructura de marco en las r tructura de marco humana pueden ser substituidos co respondiente del anticuerpo donador de CDR para emplo, mejora la unión a antígeno. Estas substit tructura de marco se identifican a través de m nocidos en el campo, por ejemplo, modelando las inter CDR y residuos de CDR para identificar residuos de e rco importantes para la unión a antígeno y com cuencia para identificar residuos de estructura de uaies en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Q tente de E.U.A. No. 5,585,089; Riechmann et aL, Nat 988), las cuales se incorporan aquí para referen talidades). Están comúnmente disponibles m eccionados y combinados a partir de las secuencias d de importación de manera que la característica de seada, tal como la afinidad incrementada para el jetivo, se logra. En general, los residuos de ectamente y muy substancialmente involucrados en in ión a antígeno. Los anticuerpos pueden ser h lizando una variedad de técnicas conocidas en el c * mo, pero no limitándose a aquellas descritas por J ture 321:522 (1986); Verhoeyen et ai., Science 239:15 s et al., J. Immunoi. 151: 2296 (1993); Chothia y L l. 196:901 (1987), Cárter et al., Proc. Nati. Acad. :4285 (1992); Presta et al., J. Immunoi. 151:2623 (19 lecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studni otein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et :969-973 (1994); publicación de PCT WO 91/09 98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, U Criterios para seleccionar anticuerpos m réntales Una modalidad de la invención se refiere a ticuerpos parentales con al menos una o más seadas en la molécula de DVD-lg, En una modalidad, l seada se selecciona de uno o más parámetros de ant ra modalidad, los parámetros de anticuerpo se sele upo que consiste de especificidad de antígeno, tígeno, potencia, función biológica, reconocimiento tabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmu rmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada ión a antígeno ortóloga.
. Afinidad a antígeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede naturaleza del antígeno, y el punto final terapéutico mocionales que se unen a, secuestran, y eliminan esp amiloide en circulación. En otros casos, se puede ducción de la afinidad de un mAb de alta afinidad vés de mutagénesis dirigida al sitio o utilizando u i n id ad inferior para su objetivo, para evitar efect tenciales, por ejemplo, un mAb de alta afinidad puede utralizar todo su objetivo pretendido, quitando/elimina mpleto la función(es) de la proteína de objetiv cenario, un mAb de baja afinidad puede secuestrar/neu cción del objetivo que puede ser responsable de los enfermedad (los niveles patológicos o sobre- mitiendo de esta manera que una fracción del objeti alizando su función(es) fisiológica normal. Por lo tanto sible reducir el valor de Kd para ajustar la dosis y/o ectos laterales. La afinidad del mAb parental puede jug portante en la activación por objetivo apropiada de m La señalización a través de un receptor des eracción con su ligando puede depender de la afi eracción del receptor-ligando, Similarmente, es conce inidad de un mAb para un receptor de superficie pueda naturaleza de señalización intracelular y si el ministrar una señal agonista o antagonista. La natura afinidad de señalización mediada por mAb puede tene el perfil de efecto lateral. Por lo tanto, la afinidad de nciones deseadas de anticuerpos monoclonales cesitan ser determinadas cuidadosamente a perimentación in vitro e ín vivo.
El valor de Kd deseado de una protetna de unión ( anticuerpo) puede ser determinado experi pendiendo del resultado terapéutico deseado. En una seleccionan anticuerpos parentales con afinidad (K tígeno particular igual a, o mejor que la afinidad dese al VD1 se obtiene y el segundo anticuerpo parental al VD2 se obtiene y pueden tener una afinidad si ferente (KD) para el antígeno respectivo. Cada anticue ne una constante de velocidad de acción (Kon) leccionada del grupo que consiste de; por roximadamente 102M"1s"1; por lo menos aprox 3M"1s"1; por lo menos aproximadamente 104M"1s"1; p roximadamente 105M" s " ; y por lo menos aprox 6M" s"1, según medido a través de resonancia perfícial. El primer anticuerpo parental a partir del c tiene y el segundo anticuerpo parental a partir del c tiene pueden tener una constante de velocidad de a milar o diferente para el antígeno respectivo. En una da anticuerpo parental tiene una constante de veiocida off) al antígeno seleccionada del grupo que consis ucho 10*3s"1'; a lo mucho 10"4s"!; a lo mucho 10"5s"1; y mplo, para interacciones de receptor-ligando (R-L), ) es igual o mejor que la kd de R-L (escala pM). Para minación de una proteína patogénica en circulación, el ede estar en una baja escala de nM, por ejemplo, la eli rias especies de péptido ?-ß en circulación. Además, también dependerá de si el objetivo expresa múltiple smo epítopo, por ejemplo, un mAb de activación de c objetivo en oligómeros ?ß.
Cuando VD1 y VD2 unen el mismo antígeno, pe ítopos, la DVD-lg contendrá 4 sitios de unión par tígeno, incrementando así la avidez y de esta manera aparente de la DVD-lg. En una modalidad, se ticuerpos parentales con un valor de kd igual o más seado en la DVD-lg. Las consideraciones de afinidad rental también puede depender de si DVD-lg contiene c íos de unión a antígeno idénticos (es decir, una DVD-l terminada a través de un bioensayo dependiente de nde las células de un tipo apropiado producen una se s decir, proliferación o producción de citocina) en res timuJación del objetivo, y la neutralización de objetivo b pueden reducir la señal en una forma dependiente d . Funciones biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden realizar pot rias funciones. Algunas de estas funciones se listan e Estas funciones pueden ser determinadas a través nto in vitro (por ejemplo( ensayos a base de célula o mo in vivo en modelos de animal. adro 1. Algunas Aplicaciones de Potencial para rapéuticos Objetivo (Clase) Mecanismo de Acción (objetivo) rapéuticos deseados. Dos d más anticuerpos m rentales seleccionados después pueden ser utiliz rmato de DVD-lg para obtener dos funciones distin lécula de DVD-lg individual. Por ejemplo, una DVD-l nerada seleccionando un mAb parental que neutralice l a citocina específica, y seleccionando un mAb parental eliminación de una proteína patológica. Simiíarmente, leccionar dos anticuerpos monoclonales paren conozcan dos diferentes receptores de superficie de 1 b con una función agonista en un receptor y el otro nción antagonista en un receptor diferente. Estos dos noclonales seleccionados cada uno con una fuñe eden ser utilizados para construir una molécula dividual que poseerá las dos funciones distintas tagonista) de los anticuerpos monoclonales seleccion lécula individual. Simiíarmente, se pueden utilizar dos nciones. Por ejemplo, regiones específicas de u eractúan con el receptor de citocina para producir a ceptor, mientras que otras regiones de la proteína queridas para estabilizar la citocina. En este caso leccionar un mAb que se une específicamente a la re eracción de receptor en la citocina y de esta manera eracción de citocina-receptor. En algunos casos, p rtos receptores de quimiocina que unen múltiples li ede seleccionar un mAb que se une al epítopo (r ceptor de quimiocina) que interactúa solo con un ligan sos, los anticuerpos monoclonales pueden unirse a epí jetivo que no solo son directamente responsables de la iológicas de la proteína, sino que la unión de un m giones puede ya sea interferir con las funciones pedimento estérico) o alterar la conformación de la ñera que la proteína no puede funcionar (mAb a rec nguna unión de R. un Ab puede unir el objetivo en un un sitio de unión de receptor, pero sigue interfiriendo receptor y funciones del objetivo induciendo un nformación y elimina funciones (por ejemplo, Xolair), pero bloquea la señalización (125-2H).
En una modalidad, el mAb parental necesita jetivo al epítopo apropiado para una eficacia má ítopo debe ser conservado en la DVD-lg. El epítopo de b puede ser determinado a través de varios aspectos, -cristalografía, proteólisis limitada del complejo de m s mapeo de péptido espectrométrico masivo (Legros V otein Sci. 9:1002-10), bibliotecas de péptido presenta 'Connor KH et al, 2005 J Immunol Methods. 299:21-3 utagénesis (Wu C. et al, 2003 J Immunol 170:5571-7).
. Propiedades físico-químicas y farmacéuticas mi, y por lo tanto, son deseables concentraciones de ra limitar el número de inyecciones por dosis. En una anticuerpo terapéutico se administra en una dosis. El d ha formulación está restringido, sin embargo, por inter oteína-proteí na (por ejemplo, agregación, que pot rementa los riesgos de inmunogenicidad) y por rante el procesamiento y suministro (por ejemplo, nsecuentemente, las grandes cantidades requeridas p nica y las restricciones de desarrollo asociadas limi plotación del potencia! de la formulación de antic ministración s.c. en regímenes de dosis alta. Es evide opiedades físico-químicas y farmacéuticas de una oteína y ta solución de proteína son de gran impo mplo, aspectos de estabilidad, solubilidad y viscosidad .1 Estabilidad estable después de la congelación (a, por ejempl scongelación de la formulación, de aquí en adelante mo "ciclo de congelación/descongelación". En otro e rmulactón "estable" puede ser una en donde roximadamente 10% y menos de aproximadamente oteína está presente como un agregado en la formulaci Una DVD-lg estable in vitro a varias temperaturas ríodo extendido de tiempo es deseable. Se puede obt vés de una rápida clasificación de mAbs parentales ro a temperatura elevada, por ejemplo, a 40°C manas, y después determinar la estabilidad macenamiento a 2-8°C, la proteína revela estabilidad nos 12 meses, por ejemplo, hasta 24 meses. La estab lécula monomérica, intacta) puede ser determinad rias técnicas, tales como cromatografía de intercambi omatografía de exclusión de tamaño, SDS-PAGE, así c 1 .
Heterogeneidad y formación de agregado; la est ticuerpo puede ser tal que la formulación puede revel roxímadamente 10%, en una modalidad, roximadamente 5%, en otra modalidad, menos de aprox o , o, en otra modalidad, dentro de la escala de 0.5° nd*s en el material de anticuerpo de GMP que está pr regado. La cromatografía de exclusión de tamaño es e es sensible, reproducible, y muy robusto en la d regados de proteína.
Además de los bajos niveles de agregado, el anticu odalidad debe ser químicamente estable. La estabili ede ser determinada a través de cromatografía de ico (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico), cromatografía de interacción hidrofóbica, u ot es como enfoque isoeléctrico o electroforesís capilar. iegue correcto. La inestabilidad química debido a cai tructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede tividad de anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad, seg r la actividad del anticuerpo, puede ser tal que macenamiento durante al menos 12 meses a 2-8°C, la a ticuerpo puede reducirse a no más del 50%, en una m s de 30%, o aún no más de 10%, o en una modalidad o ó 1% según comparado con la solución de anticuer ueba de almacenamiento. Se pueden emplear ensayos tígeno adecuados para determinar la actividad de antic .2 Solubilidad La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la IgG monomérica, correctamente plegada. La solubilíd ede, por lo tanto, ser determinada a través de HPLC. IgG soluble (monomérica) dará surgimiento a un pico i ford, UK and Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, renteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Deii 1). La solubilidad de un mAb terapéutico para formula ncentración por lo regular requirió de dosificación adec presenta aquí, se pueden requerir de solubilidad de ra adaptar la dosificación eficiente de anticuerpo. Por lubilidad de anticuerpo puede ser no menor que aprox mg/ml en la fase temperara de investigación, en una m nor que aproximadamente 25 mg/ml en etapas av ncía de proceso, o en una modalidad, no roximadamente 100 mg/ml, o en una modalidad no roximadamente 150 mg/ml. Es obvio para un experto e e las propiedades intrínsecas de una molécula de p portantes las propiedades físico-químicas de la oteína, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, visc bargo, un experto en ia técnica apreciará que una amp mplo, sales tales como NaCI, azúcares, alcoholes de i ) otros (por ejemplo conservadores, agentes q tioxidantes, substancias quelatadoras (por ejemp límeros biodegradables, moléculas portadoras (por ej Gs).
La viscosidad es un parámetro de alta importancia c la fabricación del anticuerpo y procesamiento del ant mplo, diafiltración/ultrafiitración), procedimientos de a lieno, aspectos de filtración) y aspectos de suministro aplicación de jeringa, suministro de dispositivo sofis jas viscosidades permiten la solución líquida deh niendo una concentración más alta. Esto permite qu sis sea administrada en volúmenes más pequeños. Lo inyección pequeños son inherentes a la ventaja de dol nsaciones de inyección, y las soluciones no necesaria e ser isotónicas para reducir el dolor en la inye células de mamífero, tales como células de ovario iño (CHO), en una modalidad, requerirá de dos nocionales parentales que por sí mismos son icientemente en células de mamífero. El rendimiento de una línea de mamífero estable (es decir, CHO) deb riba de aproximadamente 0.5 g/l, en una modalidad, p roximadamente 1 g/l, y en otra modalidad en la roximadamente 2-5 g/l o más (Kipriyanov SM, Littie otechnol. 12:173-201; Carrol! S, A1-Rubeai M. 2004 ol Ther. 4:1821-9).
La producción de anticuerpos y proteínas de f luenciada por varios factores. El diseño por ingenierí expresión a través de la incorporación de promoto joradores y marcadores de selección puede incrementa transcripción del gen de interés a partir de una copi egrada. La identificación de sitios de integración de . Inmunogenicidad La administración de un mAb terapéutico pued sultado cierta incidencia de una respuesta inmunológic formación de anticuerpos endógenos dirigidos con rapéutico). Los elementos potenciales que pueden munogenicidad deben ser analizados durante la selec ticuerpos monoclonales parentales, y se pueden tomar ducir dicho riesgo para optimizar los anticuerpo m rentales antes de la construcción de la DVD-lg. Se ha e los anticuerpos derivados de ratón son altamente in pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos regiones constantes variables de ratón y humanas guíente paso lógico para reducir la inmunogenicidad de rapéuticos (Morrison y Schlom, 1990). Alternativ munogenicidad puede ser reducida transfiriendo se R de murino a una estructura de marco de anticuerpo terminación de especificidad" (SDRs), definidas como residuos de CDR que está involucrado en la unión de su objetivo (Kashmiri et al, 2005). Esto necesita la i las SDRs ya sea a través de análisis de dimensionales disponibles de complejos de anticue mo de análisis mutacional de los residuos de CDR d ra determinar cual interactúa con el objetivo. Alternattv ticuerpos totalmente humanos tienen inmunogenicid mparado con los anticuerpos de murino, quimérico o hu Otro aspecto para reducir la inmunogenícidad de rapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias esp pronostica que son inmunogénicas. En un aspecto, e una primera generación biológica ha sido probad manos y se encontró que es inaceptablemente ínmun ítopos de célula B pueden ser trazados y después alt itar la detección inmunológica. Otro aspecto utiliza m r therapy". Nature (1988) 332: 323-327; Roguska M-A, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee- mbert-J-M, Blattler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C. A co o murine mAbs humanized by CDR-grafting and vari surfacing. Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, 5-904; Kashrnri-Syed-V-S , De-Pascalis-Roberto, Gonza Schlom- Jeffrey , SDR-grafting - a new approach manization. Methods (San Diego Calif.), {Meíhods}, i. 36, no. 1, pág. 25-34; Desmet- Johan, Meerss utonnet-Nathalie, Pletinckx-J urgen, De-Clercq-Krista , ja, Braeckman-Tessa, Lasters-lgnace. Anchor profií ecific peptides: analysis by a novel affinity scoring perimentai validation. Proteins, 2005, vol. 58, pág. 53- M, Esteli-D-A, Harding-F-A. CD4 + T-cell epitope d ing unexposed human donor peripheral blood monon urnal of immunotherapy 2000, vol, 23, pag. 654-60). imbinación de dos mAbs separados. Aquí en ia sec scriben funciones biológicas deseables adicionales, leccionar anticuerpos parentales con características d molécula de DVD-lg con base en factores t rmacocinéttca V/2 distribución de tejido; objetivos sol perficie celular; y concentración de objetivo-solubi perficie. 8 Distribución de tejido in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con distribuci vivo deseada, en una modalidad, se deben seiecc rentales con un perfil de distribución de tejido in seado. Alternativamente, basándose en el mecani trategia de activación doble específica, en otros tie quería seleccionar mAbs parentales con la distribución o similar deseada cuando se daban en combinación. seadas incluyendo, pero no limitándose a, Isotipo ectoras y vida media en circulación, en una mo leccionan mAbs parentales con funciones Fc-efectoras pendiendo de la utilidad terapéutica y el punto final seado. Existen cinco clases de cadena pesada pr otipos, algunos de los cuales tienen varios subtip terminan las funciones efectoras de una molécula de tas funciones efectoras residen en la región de gozn 2 y CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, otras partes de una molécula de anticuerpo pueden t bre las funciones efectoras también. Las funciones Fc-gión de gozne incluyen: (i) citotoxicidad celular dep ticuerpo, (ii) unión de complemento (C1q), a totoxicidad dependiente de complemento (CDC), (iii) iminación de complejos de antígeno-anticuerpo, y (iv) li tocina en algunos casos. Estas funciones Fc-efecto pecíficos en la región dé gozne inferior (por ejem 35A) que son requeridos para la unión de FcgR siduos de aminoácido en la región Fe, en particular l 2-CH3, también determinan la vida media en circul lécula de anticuerpo. Esta función Fe es mediada a t ión de la región Fe al receptor Fe neonatal (Fc sponsable de la re-cicl ización de moléculas de anticuer osomas ácidos de regreso a la circulación general.
Si un mAb debe tener un isotipo activo o u penderá del punto final terapéutico deseado para un gunos ejemplos de uso de isotipos y resultados t seados se listan a continuación: (a) Si el punto final deseado es neutralización f a cítocina soluble entonces se puede utilizar un isotipo (b) Si el resultado deseado es la eliminación de tológica se puede utilizar un isotipo activo; culación sin entrar al CNS se puede utilizar un isoti mpio, eliminar especies de péptido Ab en circulación).
Las funciones efectoras Fe de un mAb parental terminadas a través de varios métodos in vitro bien c técnica.
Como se discutió, la selección de isotipo, y de esta nciones efectoras dependerán del punto final terapéuti casos en donde se desea una simple neutralización de circulación, por ejemplo, bloquear interacciones de ando, las funciones efectoras pueden no ser requerida sos, son deseables isotipos o mutaciones en la regió ticuerpo que eliminen funciones efectoras. En otro nde la eliminación de células objetivo es el punto final r ejemplo, la eliminación de células tumorales, son tipos o mutaciones o des-fucosilación en la región Fe funciones efectoras (Presta GL, Adv. Drug Delivery R La información publicada en varios residuos que inf erentes funciones efectoras de un mAb terapéutico n cesitar ser confirmada para DVD-ig. Puede ser posibl rmato de DVD-lg puedan ser importantes residuos d icionales (diferentes), distintos a aquellos identifica dulación de funciones efectoras de anticuerpo monoclo En resumen, la decisión de qué funciones efectoras rán críticas en el formato final de DVD-lg depen dicación de la enfermedad, objetivo terapéutico, rapéutico deseado y consideraciones de seguridad. A listan regiones constantes de cadena pesada y ca ropiadas, ilustrativas, incluyendo pero no limitándose a ° I g G 1 - alotipo: G1 mz IgG 1 muíante - A234, A235 0 lgG2 - alotipo: G2m(n-) 0 Kappa - Km3 esentes en ta región de gozne de I g G 1 de mAb, sultado la unión disminuida de mAb a receptores Fe hur FcRn), ya que se cree que la unión de FcgR ocurr ios de traslape en la región de gozne l g G 1. Esta cara b puede conducir a un perfil de seguridad mejo ticuerpos que contienen una IgG de tipo silvestre. b a receptores Fe humanos puede ser determinada perimentos de citometría de flujo utilizando líneas de emplo, THP-1, K562) y una línea de célula CGO di eniería que expresa FcgRIIb (u otras FcgRs). Com ticuerpos monoclonales de control IgG 1 , mAb muestr ducida a FcgRI y FcgRIIa, mientras que la unión a Fc afección. La unión y activación de C1q a través d munológicos de antígeno/lgG activa la cascada de c sica con consecuentes respuestas inflamatorias y guladoras. El sitio de unión a C1q en IgG ha sido loc n !os receptores de activación FcgRI y FcgRIIa o C1q.
Unión de FcRn humana: El receptor neonatal sponsable del transporte de IgG a través de la pla ntrol de la vida media catabólica de las moléculas de r deseable incrementar la vida media termina! de un ra mejorar la eficacia, para reducir la dosis y fre ministración, o para remover la localización a ternati varnente, puede ser ventajoso hacer la conversió ducir la vida media terminal de un anticuerpo para posición de cuerpo entero o para mejorar las relacion objetivo a no objetivo. E! desarrollo de la interacción receptor salvaje, FcRn, ofrece una forma de increment vida media terminal de IgG. Las proteínas en cluyendo IgG, se toman en la fase de fluido a icropinocitosis a través de ciertas células, tales como G de ratón (ver, G, et al.; Nature Biotechnolog (1997), 0). También se han identificado mutaciones de la re crementan la afinidad de unión de IgG humana para F 6.0, pero no a un pH de 7.4 (ver, Dall'Acqua Willia urnal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). Ade so, también se observó un incremento dependiente d la unión (hasta de 27 veces) para FcRn rhesus, y es sultado un doble incremento en la vida media en suer esus comparado con Ja IgG parental (ver, Hinton, Pa urnal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6 llazgos indican que es confiable extender la vida medi terapéuticos de anticuerpo elaborando la interacción con FcRn. En forma inversa, las mutaciones de la re enúan la interacción con FcRn pueden reducir la vid ticuerpo. munogenicidad mínima o ninguna para construir moléc manera que las DVD-lgs resultantes tambi munogenicidad mínima o ninguna. Algunos factores que PK de un mAb incluyen, pero no se limitan a, trínsecas del mAb (secuencia de aminoácido VH); inmu tón FcRn y funciones Fe, El perfil de PK de anticuerpos monoclonales leccionado puede ser fácilmente determinado en roed perfil de PK en roedores se correlaciona bi trechamente pronostica) el perfil de PK de noclonales en monos cinomolgos (macaco cangreje manos. El perfil de PK se determina como se des cción de Ejemplos 1.2.2.3. A.
Después de que se seleccionan los anticuerpos m rentales con características deseadas de PK (y otras ncionales deseadas como se discute aquí), la DVD-lg s pactar en el perfil de PK de la DVD-lg incluyen la or minio de unión a antígeno (CDR); tamaño de e eracciones de Fc/FcRn. Las características de PK de rentales pueden ser evaluadas determinando los rámetros: absorción, distribución, metabolismo y excre Absorción: Hasta la fecha, la administración de nocionales terapéuticos es a través de rutas paren emplo, intravenosa [IV], subcutánea [SCj, o intramusc sorción de un mAb en la circulación sístémica ministración ya sea SC o IM desde el espacio incipalmente es a través de la trayectoria linfática. La turable, pre-sistémica, proteolítica puede dar como re ©disponibilidad absoluta variable después de la ad travascular. Usualmente, se pueden observar increm odisponibilidad absoluta con dosis en incrementos de eden ser reducidos debido al transporte trans-celular r barrera hematoencefálica (BBB) en el compartimento rvioso central, en donde la DVD-lg es liberada para tivación a través de su segundo sitio de recono tígeno.
Distribución: Después de la administración IV, los noclonales usuaimente siguen un perfi! de concentraci plasma) bifásica-tiempo, comenzando con una fase stribución, seguido por una fase de lenta eliminación. modelo farmacocinético biexponencial describe mejor rfil farmacocinético. El volumen de distribuci mpartimento central (Ve) para un mAb es usuaiment eramente mayor que el volumen en el plasma (2-3 trón bifásico distinto en perfil de concentración en sue ntra tiempo puede no «ser evidente con otras ] 44 Metabolismo y Excreción: Debido al tamaño mo ticuerpos monoclonales intactos no son excretados a vés del riñon. Estos son principalmente inactivados tabolismo (por ejemplo, catabolismo). Para noclonales terapéuticos a base de IgG, las vi icamente varían de horas a 1-2 días a más de iminación de un mAb puede ser efectuada a través ctores, incluyendo, pero no limitándose a, afinidad para Rn, inmunogenicidad del mAb, el grado de g I i c o s i i a c í susceptibilidad del mAb a proteólisis, y eliminación r ceptor. 11 Patrón de reactividad cruzada de tejido e manas y toxicológicas El patrón de tinción idéntico sugiere que la toxici tencial puede ser evaluada en especies toxicól traparte natural y contra-clasificación contra an lacionados por lo regular son parte del embudo de ra anticuerpo terapéuticos. Sin embargo, la clasifica a multitud de antígenos es por lo regular impráctica. s estudios de reactividad cruzada con tejidos humanos ganos principales sirven para regular la unión no d ticuerpo a cualquier ant í geno no relacionado.
Criterio 2: Los estudios de reactividad cruzad mparativos con especies tejidos humanos y especies t ono cinomolgo, perro, posiblemente roedores y otros, ó 37 tejidos han sido probados como en el estud udan a validar la selección de una especie toxicoló tudios típicos de reactividad cruzada en secciones ngelados se puede demostrar la unión esperada nocido y/o, a un grado menor, la unión a tejidos basán interacciones de bajo nivel (unión no específica, un manos obtenidos de autopsia o biopsia se fijaron y se objeto de vidrio. Se realizó la tinción con peroxid cciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-bi ídance "Points to Consider in the Manufacture and noclona! Antibody Products for Human Use". Las levantes incluyen Clarke J 2004, Boon L. 2002a, Bo an A 1999.
Los estudios de reactividad cruzada de tejido por l alizan en dos etapas, la primera etapa incluyendo cri 32 tejidos (típicamente: glándula adrenai, tracto gast óstata, vejiga, corazón, músculo esquelético, células on, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, ma zo, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cere o, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratirotdes, tuitaria, útero, trompa de Falopio y placenta) de mano. En la segunda fase, se realiza un estudio de El anticuerpo terapéutico (es decir, artículo de p ticuerpo de control de isotipo coincidente pueden se ra detección del complejo de avidina-biotina (ABC); ot detección pueden incluir detección de anticuerpo terci tículo de prueba marcada FITC(o de otra manera), o p mplejo con una IgG anti-humana marcada para un ueba no marcado.
Brevemente, crio-secciones (aproximadamente 5 µ!\/ manos obtenidos en autopsia o biopsia se fijaron y se objeto de vidrio. Se realizó la tinción con peroxidasa d tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina. Prime un sistema de detección de pr'e-formación de c tículo de prueba se incubó con la IgG anti-humana cundaria y se desarrolló en un complejo inmunológico. munológico a las concentraciones finales de 2 y 1 tículo de prueba se agregó a secciones de tejido sobre tígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgad clasificada para intensidad y frecuencia. Estudios de bloqueo de antígeno o suero pueden ayudar ad terminar sí la tinción observada es específica o no esp Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionado s criterios de selección, tinción apropiada de tej incidente entre tejido específico humano y animal t tos pueden ser seleccionados para la generación de DV El estudio de reactividad cruzada de tejido tie petido con la construcción final de DVD-lg, pero a tudios siguen el mismo protocolo como se presenta aq mplejos para evaluar ya que cualquier unión viene d los dos anticuerpos parentales, y cualquier unión n cesita ser confirmada con estudios de competencia de mplejo.
Es fácilmente evidente que el complejo que toma lectividad deseadas, se necesita generar y selecc rentales con el perfil de especificidad y selectividad s seado.
Los estudios de unión para especificidad y selectivi D-lg pueden formarse en complejo debido a los cu ios de unión, dos de cada uno para cada antígeno. s estudios de unión utilizando ELISA, Bl Acore. Kin E tudios de interacción con una DVD-lg necesitan verifi uno, dos o más antígenos a la molécula de DVD-lg cnología de BIAcore puede resolver la unión dependiente de múltiples antígenos, métodos más t cluyendo ELISA o técnicas más modernas como KinExA r lo tanto, la caracterización cuidadosa de cada rental es crítica. Después de que cada anticuerpo i do caracterizado para especificidad, la confirmación especificidad de los sitios de unión individuales en la trelazamiento químico, SEC con difusión de luz, uilibrio, penetración de gel, ultrafiltración, cromatogr C analítica de zona grande, ultracentrifugación eparación (equilibrio de sedimentación), pectroscópicos, micro-calorimetría de titulación, e dimentación (en ultracentrífuga analítica), vel dimentación (en centrífuga analítica), resonancia perficial (incluyendo BIAcore), Referencias relevant urrent Protocols in Protein Science", John E. Colig nn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) pítulos 19 y 20, publicada por John Wiley & S erencias citadas ahí y "Current Protocols in Immunolo ligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan I arren Strober (eds.) publicadas por John Wiley & ferencias relevantes incluidas ahí. ncentraciones de mAb con sangre entera durante 2 ncentración probada debe cubrir una amplia escala, ncentraciones finales que imitan niveles de sangre icientes (incluyendo, pero no limitándose a, 100 ng/ml -sspués de la incubación, se analizaron los sobrenadant i célula para la presencia de IL-1Rat TNF-a, 1L-lb, IL-6 r f i I e s de concentración de citocina generados pa mpararon con perfiles producidos a través "de un con mano negativo y un control LPS o PHA positivo. ocína presentado por mAb a partir tanto de sobren uía como iisatos de célula se comparó con la IgG ntrol. En una modalidad, eí anticuerpo monoclona! n n células de sangre humana para liberar espo ocinas inflamatorias.
Los estudios para la liberación de citocina para una mplejos debido a los cuatro o más sitios de unión, d la remoción de la porción Fe, separación de sitios de jtagénesis de sitio de unión u otros métodos ne ipleados para desconvolucionar cualquier obser ilmente evidente que este complejo que se toma es e plificado si los dos anticuerpos parentales son se ra la falta de liberación de citocina antes de ser co a DVD-lg. 13 Reactividad cruzada a otros especies par xicológicos En una modalidad, los anticuerpos individuales se n suficiente reactividad cruzada para especies t opiadas, por ejemplo, mono cinomolgo. Los rentales necesitan unirse a especies objetivo ortóloga no cinomolgo) y producir una respuestas apropiada ( Utralización, activación). En una modalidad, la reactivi zada aceptable para una especie toxicologica común, í estudios de DVD-lg en la misma especie.
Se pueden selecciona mAbs parentales de varios m unir objetivos específicos y bien conocidos en la téc luyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-TNF ( U.A. 6,258,562), anticuerpo anti-IL-12 y/o anti-IL-12p E.U.A. No. 6,914,128); anticuerpo anti-IL-18 (US 20 , anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, antí-gpl20, anti-V 11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (p r WO2007124299) anti-ld, anti-ICAM-1, anti-CXCL13 ti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti R1( anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-selectina, anti-Fac r2/neu, anti-F gp, anti-CD111/18, anti-CD14, anti-IC N, anti CD-19, anti-CD80 (por ejemplo, ver WO200303 4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina1 anti-a ti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (por ejemplo, ver p://www. path. cam. ac.uk/-m rc7/h urna nisat ion/anticuerpo También se pueden seleccionar mAbs de varios robados para uso, en estudios clínicos, o en el desarro nico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, pero n (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (ver, por ejemplo, . 5,736,137), un anticuerpo quimérico anti-CD20 apr tar linfoma de no Hodgkin; HuMax-CD20, un tualmente desarrollado por Genmab, un anticuerpo scrito en la Pat. E.U.A. No. 5, 500,362, AME-1 lecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), tracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, intitulada Inmunogiobulina y Sus Usos), trastuzumab ( nentech) (ver, por ejemplo, Pat. E.U.A. No. 5,6 ticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para trata ma; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), actualm sarrollado por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 des otein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cáncer Res 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. :129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer. 1993, 6 djtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjt 03, Int J Cáncer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM ñada and Centra de Immunologia Molecular, Cuba (Pat. 91,996; Pat. E.U.A. No. 6,506, 883; Mateo et munotechnology, 3 ( 1 ) : 7 - 81); mAb-806 (Ludwig I ncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth oe Nati Acad Sel USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS I-1 (IVAX, National Cáncer Institute) (PCT WO 016 100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab llenium), un mAb humanizado actualmente aproba tamiento de leucemia crónica de célula B; muro rthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollad otech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Ze F a I f a desarrollado por Celltech, golimumab (CNT ticuerpo totalmente humano TNF desarrollado por nercept (Enbrel®), una fusión Fe del receptor sarrollada por Immunex/Amgen, ienercept, una fusi eptor p55TNF previamente desarrollada por Roche, A ticuerpo anti-CD147 siendo desarrollado por Abgenix, ticuerpo anti-IL8 siendo desarrollado por Abgenix, A ticuerpo anti-MUC18 siendo desarrollado por mtumomab (R1549, 90Y-muHMFGI), un anti-MUC1 en r Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-M sarrollado por Antisoma, AngioMab (AS 1405), siendo r Antisoma, HuBC-1, siendo desarrollado por Antisoma S 1407) siendo desarrollado por Antisoma, atalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y siendo desarrollado por Biogen, VLA-1 mAb, un anti A-1 integrina siendo desarrollado por Biogen, LTB AIL-R1mAb( un anticuerpo anti-TRAI L-R 1 siendo desa mbridge Antibody Technology and Human Genome Scie astin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo ndo desarrollado por Genentech, un anticuerpo de la eptor anti-HER siendo desarrollado por Genentech, jido (ATF), un anticuerpo del Factor anti-Teji sarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un ti-lgE siendo desarrollado por Genentech, Raptiva® ( anticuerpo anti-CD11a siendo desarrollado por Gen ma, anticuerpo MLN-02 (antiguamente LDP-02 sarrollado por Genentech and Millenium Pharmaceutic 4, un anticuerpo anti-CD4 siendo desarrollado po Max- IL 15, un anticuerpo anti-l L15 siendo desar nmab and Amgen, HuMax-Inflam, siendo desarrollado d Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparan sarrollado por Genmab and Medarex y Oxford G ticuerpo anti-idiotípico siendo desarrollado por Imcione anticuerpo antt-KDR siendo desarrollado por Imcione, ticuerpo anti-flk-1 siendo desarrollado por Imcione, ti-VE cadherina siendo desarrollado por Imcione, betuzumab), un anticuerpo anti-carcinoembriónico (C sarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratu ticuerpo anti-CD22 siendo desarrollado por Immunom de, siendo desarrollado por Immunomedics, yelomaC sarrollado por Immunomedics, LkoCide, siendo desar munomedics, ProstaCide, siendo desarrollado por Imm X-101, un anticuerpo anti-CTLA4 siendo desarr darex, MDX- 060, un anticuerpo anti-CD30 siendo desa darex, MDX-070 siendo desarrollado por Medarex ndo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-1), y un ti-Her2 siendo desarrollado por Medarex e Immu lecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 siendo ti-C D 3 siendo desarrollado por Protein Design Labs, icuerpo interferón anti-gamma siendo desarrollado sign Labs, Anti-a 5ß? Integrina, siendo desarrollado sign Labs, anti-IL-12, siendo desarrollado por Prot bs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM siendo desar rna, Xoiair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-lgE sarrollado por Genentech and Novartís, y MLN01, un ti-Beta2 integrina siendo desarrollado por Xoma, ferencias citadas aquí en este párrafo se incorporan ex uí para referencia. En otra modalidad, los terapéutic N330 (Kirin); anticuerpo huA33 (A33, Ludwig Institute search); CNTO 95 (alfa V integrinas, Centocor); ME 3 integrina, Medimmune); volociximab (alfa ß1 ogen/PDL); mAb 216 Humano (epítopo glicosilado d l); BiTE MT103 (CD19 x CD3 biespecíf ico, Medimmun celIxFcgammaRI biespecífico, Medarex/MercK KGa); r nmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); A20) (CD20, Immunomedics); Epratu2urnab (CD2 miliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab- tho); HuM291 (receptor fe CD3, PDL Biopharma); He l); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Med (CD30, Seattle Genetics); SGN-33 (Lintuzumab) (C nentics); Zanoiímumab (HuMax-CD4) (CD4, Genma D40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); emtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Med PB-1) (CD74.38, immunomedics); Galiximab (IDEC-1 ogen); MT293 (TRC093/D93) (colágeno dividido, Traco S1, PDL Pharma); ipilimumab ( DX-010) (CTLA4, Br uibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTL S-ETR1 (Mapatumumab) (agonista DR4 TRAIL-R1, Hu ience /Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Ap nentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); rtuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); dena HLA-DR beta, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-I ti-IGF-1 R R1507 (1GF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1 C-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R , Biogen); -2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, ti-KIR (1-7F9) (Receptor de tipo Ig de célula asesina ( 3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Instítute of Cáncer BE-11 (LTBR, Biogen); HuHMFG 1 (MUC1, Antisoma/N pítopo de carbohidrato N-eniazado, Raven); CA acionada con hormona de paratiroides (PTH-rP), U lífornia); CT-011 (PD1f CureTech); MDX-1106 (ono- darex/Ono); MAb CT-011 (PDI, Curetech); IMC-3G3 clone); bavttuximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ rnell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornel undation); GC1008 (inhibidor TGFb (pan) (lgG4), liximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (r cadena ligera (VL) de dos diferentes anticuerpos m rentales se enlazan en tándem directamente o a tr lazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, dominio constante de cadena ligera. Similarmente, sada comprende dos diferentes dominios variables sada (VH) enlazados en tándem, seguido por el domini 1 y la región Fe (Figura 1A).
Los dominios variables pueden ser obtenidos cnicas de ADN recombinante de un anticuerpo parent r cualquiera de los métodos descritos aquí. En una m minio variable es un dominio variable de cadena pes murino. En otra modalidad! el dominio variable e ertada o un dominio variable de cadena pesad manízado. En una modalidad, el dominio variable es riable de cadena pesada o ligera humano.
En una modalidad, los primero y segundo domini mo un dominio de unión a ligando de un receptor, dor una enzima. Las moléculas de DVD también pueden c ás dominio no Ig.
La secuencia enlazadora puede ser una se inoácido o polipéptido individual. En una mod cuencias enlazadoras se selecciona del grupo que TTPKLEEGEFSEAR (SEC ID NO: 1); AKTTPKLEEGEF S NO: 2); AKTTPKLGG (SEC ID NO: 3); SAKTTPKLGG ( ; SAKTTP (SEC ID NO: 5); RADAAP (SEC ID NO: 6); EC ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEC ID NO: 8); RAD EC ID NO: 9), S AKTTPKLEEGEF SEARV (SEC ID NO: EC ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEC ID NO: 12); TVA : 13); TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: 14); QPKAAP ( ); QPKAAP SVTLFPP (SEC ID NO: 16); AKTTPP (SEC TTPPSVTPLAP (SEC ID NO: 18); AKTTAP (SEC ID NO SVYPLAP (SEC ID NO: 20); ASTKGP (SEC ID y 4-6 residuos del término N del dominio CL/CH 1. Las invención se generaron utilizando 5-6 residuos de am minales, ó 11-12 residuos de aminoácido, de CL o lazador en la cadena ligera y pesada de DVD-lg, respe S residuos N-terminales de los dominios CL o CH1, part primeros 5-6 residuos de aminoácido, adoptan una c bucle sin estructuras secundarias fuertes, por lo ta tuar como enlazadores flexibles entre los dos dominio S residuos N-terminales de los dominios CL o CH1 son I tural de los dominios variables, ya que son parte de la Ig, por lo tanto reducen al mínimo a una gran grad unogenicidad que potencialmente surja de los en iones.
Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1, pe s residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo, los pri En una modalidad, un dominio constante es enlaza minios variables enlazados utilizando técnicas combinante. En una modalidad, la secuencia que minios variables de cadena pesada enlazados está en minio constante de cadena pesada y la secuencia que minios variables de cadena ligera está enlazada a nstante de cadena ligera. En una modalidad, lo nstantes son un dominio constante de cadena pesada h minio constante de cadena ligera humano, respectiv a modalidad, la cadena pesada de DVD además está a región Fe. La región Fe puede ser una región Fe d tiva, o una región Fe variante. En otra modalidad, la r a región Fe humana. En otra modalidad, la región Fe gión Fe de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD En otra modalidad, dos polipéptidos de DVD de cad os polipéptidos de DVD de cadena ligera se combinan adro 2. Lista de Secuencias de Aminoácido de Reg de Anticuerpos para ia Generación de DVD-lqs EC. ID ABT Región Secuencia ID Unico Pro eína o. 123456789012345678901234567890 3 AB001VH CD20 QVQLQQPGAELV PGASV MSC ASGYTFT PGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATL MQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNV A 9 ABO01VI, CD20 QIVLSQSPAILSPSPGEKVTMTCRASSSVS SSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSY DAATYYCQQWTSNPPTFGGGT LEI R 0 AB003VH EGFR { 1er QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVS seo . ) Q3PG GLEWIGHIYYSGNTNYN SLKS LT SIJKLSSVTAADT IYYCVRDRVTGAFDIWG 1 AB003VL EGFR { 1er DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDI3 seo . ) GKAPKI/LIYDAS LETGVPSRFSGSGSGTD EDIA YFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR 2 AB010VH IGF1, 2 Q QLVQSGAEV PGAS KVSCKAS YTFT TGQGLEW GW NPNSG TG AQ FQG V M MELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVW 3 AB010VL IGF1, 2 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIE PGT PKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGT TGDEADYYCET DTSLSAGRVFGGGTKLTV AB017VH TNF EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD PGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTI LQMNSLRAEDTAVYYCA VSYLS ASSLDY S 5 AB017VL TNF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR GKAPKLLIY AS LQSGVPSRFSGSGSGTD AB033VL EGFR (2d DILLTQSPVILSVSPGERV3FSCRASQSIG sec. ) NGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTD EDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR AB040VH IL-6 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLS QPSGKGLEWLAHIYWDED RYNPSLKSRL FL ITNVD DT T YC RRRI IYDVEDYF VSS AB040VL IL-6 QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVS SSPRLLIYDTSNLASGVPYRFSGSGSGTSY DAATYYCQQ SGYPYTFGGGTKLEIKR AB043VH Abeta (sec. E QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS ' 1 ) PGKGLEWVASIRSGGGRTYYSD VKGRFTI LQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWG AB0 3VL A-bet (sec. DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLL 1) LLQKPGQSPQRLI LVSKLDSGVPDRFSGS SRVEAED GVYYCWQG HFPRTFGQG KVE AB04 VH Abeta (ses.c. E KLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS 2) PGKGLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRF IS QMNSLRAEDTAVYYCTRGR3NSYAMDYWGQ AB0 4VL Abeta (sec. DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQTLV 2} YLQ PGQSPQSLIY VSNRFSGVPDRFSGS SRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLE AB0 5VH Abeta (sec. EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 3) PGKGLELVASI SNGGS YYPDSVKGRFTI LQMIS1SLRAED YYCASGDYWGQGTLVTV AB0 5VL Abeta (sec. DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSC)SLV 3) YLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRF3GS SRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVE AB0 6VH IL-18 EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYTVT PGKGLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQV I LQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTFDI S AB0 6VL IL-1S EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESIS GQAPRLFIYTASTRATDIPARFSGSGSGTE EDFAVYYCQQYNNWPSITFGQGTRLEIKR Una descripción detallada de las moléculas pecíficas capaces de unir objetivos específicos, y m cer las mismas, se proporciona en la sección de Ejem esenta más adelante.
Producción de proteínas de DVD Las proteínas de unión de la presente invención oducidas a través de cualquier número de técnicas con mpo. Por ejemplo, la expresión a partir de células nde los vectores de expresión que codifican las cade DVD y ligera de DVD son transfectados a una célula vés de técnicas estándares. Se pretenden varias rmino "transfección" para abarcar una amplia variedad múnmente utilizadas para la introducción de ADN exó uía huésped procariótica o eucarionte, por ctroporación, precipitación de fosfato de calcio, tran ticuerpos recombinantes de la invención incluyen célula Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células scritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati, Aca _:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionado mplo, como se describe por RJ. Kaufman y P.A, Sharp ol. 159:601 - 621), células de mieloma NSO, células C 2 y PER.C6. Cuando se introducen vectores de combinantes que codifican proteínas de DVD a células mífero, las proteínas de DVD se producen cultivando ésped durante un período de tiempo suficiente para presión de las proteínas de DVD en las células creción de las proteínas de DVD en el medio de cultiv desarrollan las células huésped. Las proteínas de DVD uperadas del medio de cultivo utilizando métodos de proteínas estándares.
En un sistema ilustrativo para la expresión reco O que han sido transfectadas con el vector ección/amplificación mediante metotrexato. Las célul nsformantes seleccionadas son cultivadas para presión de DVD de cadena pesada y ligera y la prote acta es recuperada del medio de cultivo. Se utilizan ología molecular estándares para preparar el vector d combinante, transfectar células huésped, nsformantes, cultivar las células huésped y recuperar DVD del medio de cultivo. Aún más, la invención pro todo para sintetizar una proteína de DVD de l ltivando una célula huésped de la invención en un medi ecuado hasta que se sintetiza una proteína de vención. El método además puede comprender aislar la D del medio de cultivo.
Una característica importante de una DVD-lg es qu oducida y purificada en una forma similar a un gitud completa, mono-específica, multiespecífica , ctiva, ensamblada, y proteínas de unión de longitu ltivalentes con la combinación de diferentes sitios de ejemplo, basándose en el diseño descrito por Mill ublicación de OCT WO 2001/077342 (A1)), existen mbinaciones de cadenas pesadas y ligeras. Consec lo el 6.25% de la proteína probablemente estará en la f seada, y no como un producto individual principal ividual primario comparado con ias otras 1 mbinaciones. La separación de las formas totalme seada de la proteína a partir de las formar i rcialmente activas de la proteína utilizando t matografía estándares, típicamente usadas en la f a an escala, aún se va a demostrar.
Sorprendentemente el diseño de las "proteínas d gitud completa, multivalentes, dobles específicas" de luye un método para expresar una cadena ligera r i a b t e doble y una cadena pesada de dominio variab a célula individual que conduce a un producto indtvid una "proteína de unión de longitud completa tetraval pecífica\ La presente invención proporciona un método pa a cadena ligera de dominio variable doble y una caden minio variable doble en una célula individual que co roducto primario" de una "proteína de unión de longit ravalente doble específica", en donde el "producto s del 50% de toda la proteína ensamblada, compre dena ligera de dominio variable doble y una cadena minio variable doble.
La presente invención proporciona métodos para e dena ligera de dominio variable doble y una cadena minio variable doble en una célula individual conduc mpleta tetravalente doble, específica", en donde e imario" es más del 90% de toda la proteína mprendiendo una cadena ligera de dominio variable dena pesada de dominio variable doble.
Proteínas de unión de DVD de ri atizadas Una modalidad proporcionar una proteína de unión quetada, en donde la proteína de unión de la i rivatizada o enlazada a otra molécula funciona! (por e pt ido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión invención puede ser derivada enlazando funciona oteína de unión de la invención (a través de acoplamie sión genética, asociación no covalente u otra cosa) a u ras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo ( anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de ente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una protei zimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, pe baño, oxidasa de glucosa, y similares. Cuando una y ió n es derivatizada con una enzima detectable, regando reactivos adicionales que la enzima utiliza p producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuand tectable, tal como peroxidasa de rábano, está present peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina conduce a reacción de color, el cual es detectable. Una proteí mbién puede ser derivatizada con biotina, y detectada dición indirecta de unión de avidtna o estreptavidina.
Otra modalidad de la invención proporciona una ión cristalizada y formulaciones y composiciones que chos cristales. En una modalidad, la proteína de unión ne una vida media mayor in vivo que la contraparte s oteína de unión. En otra modalidad, la proteína de unió tividad biológica después de cristalización. ducción. En particular, se pueden agregar enzi siduos de azúcar (glicosilo), un procedimiento con icosilación. Las proteínas resultantes que llevan caden oligosacárido covalentemente unidas son cono oteínas glicosiladas o glicoproteínas. Los antic icoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato e , así como el dominio variable. Los residuos de carboh minio Fe tienen un efecto importante en la función minio Fe, con un efecto mínimo en la unión a antíge dia del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol, Prog. 21 ( -16). En contraste, la glicosilación del dominio vari er un efecto en la actividad de unión a antígeno del glicosilación en el dominio variable puede tener gativo en la afinidad de unión de anticuerpo, pr bido a la impedancia estérica (Co, M.S. et al, Mol. Imm :1361-1367), o dar como resultado una afinidad increm a actividad de unión incrementada o reducida son otro esente invención.
En otra modalidad, la glicosilacion del anticuerpo o ión a antígeno de la invención es modificada. Por ede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el rece de glicosilacion). La glicosilacion puede ser al mplo, para incrementar la afinidad del anticuer tígeno. Dichas modificaciones de carbohidrato pued r ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilacion cuencia de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer bstituciones de aminoácido que dan como resultado la uno o más sitios de glicosilacion de región variable p í la glicosilacion en ese sitio. Dicha aglicosila rementar la afinidad del anticuerpo para el antíg pecto se describe con mayor detalle en la Publicación 03016466A2, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,714,350 y erados incrementan la habilidad ADCC de anticuer dificaciones de carbohidrato pueden ser logradas, p presando el anticuerpo en una célula huésped con una glicosilación alterada. En la técnica se han descrito quinaria de glicosilación alterada y pueden ser utili lulas huésped en donde se expresan anticuerpos recom invención para producir así un anticuerpo con erada. Ver, por ejemplo, Shields, R. L et al. (2002) J. 7:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 1 mo también, Patente Europea No: EP 1,176,195; Publi T WO 03/035835; WO 99/54342 80, cada una de la corpora aquí para referencia en su totalidad.
La glicosilación de proteína depende de la se inoácido de la proteína de interés, así como la célula nde se expresa !a proteína. Diferentes organismos pue ferentes enzimas de glicosilación (por ejemplo, glicosilt Es sabido por aquellos expertos en la técni cosilación de proteína de diferenciación puede dar com racterísticas de proteína de diferenciación. Por cacia de una proteína terapéutica producida en un mic ésped, tal como levadura, y glicosilada utilizando la dógena de levadura puede ser reducida comparada con misma proteína expresada en una célula de mamífer a línea de célula CHO. Dichas gücoproteínas también unogénicas en seres humanos y muestran vida media o después de administración. Los receptores específic manos y otros animales pueden reconocer re cosilación específicos y promueven la rápida elimin oteína a partir del a corriente sanguínea. Otros efect eden incluir cambios en el pliegue de proteína, sceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, capacida mpartimentos, secreción, reconocimiento por otras ilizando técnicas conocidas en e! campo, un practic nerar anticuerpos o porciones de unión a antígeno de hibiendo giicosilación de proteína humana. Por ejempl levadura han sido genéticamente modificadas pa zimas de giicosilación de existencia no natural de ma oteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en est vadura exhiben giicosilación de proteína idéntica a lulas de animal especialmente células humanas (so tente de E.U.A. 200440018590 y 20020137134 y pu T WO 2005100584 A2).
Además de las proteínas de unión, la present mbién está dirigida a anticuerpos anti-idiotí pico pecíficos para dichas proteínas de unión de la in tticuerpo anti-ld es un anticuerpo, el cual reconoce de icos generalmente asociados con la región de unión otro anticuerpo. El anti-ld puede ser preparado inm mbién reconocen el ídiotipo (por ejemplo, sitio de unión el contexto de la DVD-lg. Los anticuerpos ant pecificados para cada uno de los dos o más sitios tígeno de una DVD-lg proporcionan reactivos ideales ncentraciones de DVD-lg de una DVD-lg humana en el ciente; se pueden establecer ensayos de concentració ilizando un "formato de ELISA de ensayo de empared ticuerpo para primeras regiones de unión a antígeno fase sólida (por ejemplo, oblea de BIAcore, placa de E juagado con un regulador de pH de enjuague, íncuba estra de suero, otro paso de enjuague y finalmente inc ro anticuerpo anti-idiotípico para el otro sitio de unión rcado a sí mismo con una enzima para la cuantific accíón de unión. En una modalidad, paja una DVD-lg s sitios de unión diferentes, los anticuerpos anti-idio s dos sitios de unión más externos (más lejos y cerca ésped de miembro de la biblioteca producen la proteín n patrones de glicosilación variantes. Un practicant ede seleccionar y aislar la proteína de interés con cosilación novedosa particular. En una modalidad, la p ne un patrón de glicosilación novedoso part leccionado exhibe propiedades biológicas mejoradas o . Usos de DVD-lg Dada su habilidad para unirse a dos o más ant oteínas de unión de la invención pueden ser utili tectar los antígenos (por ejemplo, en una muestra bi mo suero o plasma), utilizando un inmunoensayo conv mo ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas dioinmunoensayo (RIA), o inmunohistoquímica de tejido directa o indirectamente marcada con una substanci ra facilitar la detección de! anticuerpo unido o no inol; y ejemplos de materiales radioactivos adecuad 14C 35S F 90Y F 99TCÍ 111,^ 125^ 131 ^ 177LY 166R O Q 153S En una modalidad, las proteínas de unión de la in paces de neutralizar la actividad de los antígenos i o. Por consiguiente, dichas DVD-lgs pueden ser uti hibir la actividad de antígeno, por ejemplo, en un culti teniendo los antígenos, en sujetos seres humanos jetos mamíferos teniendo los antígenos con los oteína de unión de la invención reacciona en forma ra modalidad, la invención proporciona un método par tividad de antígeno en un sujeto que sufre de una en storno en donde la actividad de antígeno es dañina. U unión de la invención puede ser administrada a un ra propósitos terapéuticos.
Como se utiliza aquí el término "un trastorno e tividad de antígeno es dañina" pretende incluir enfe fre del trastorno (por ejemplo, un incremento en la co antígeno en el suero, plasma, fluido sinovial, etc. emplos no limitantes de trastornos que pueden ser trata oteínas de unión de la invención incluye aquellos cutidos más adelante y en la sección que se mposiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la inv Las DVD-lgs de la invención pueden unir un itiples antígenos. Dichos antígenos incluyen, pero no objetivos listados en las siguientes bases de datos, d datos se incorporan aquí para referencia. Estas bas jetivo incluyen estas listas: erapeutic targets (http://xin.cz3. ñus. edu.sg/group/cjttd/ tokines and cytokine receptors (http://www.cytokinewe t p :// w ww. co pe withcy tokines.de/cope.cg i, tp://cmbi . bjmu.edu. cn/cmb id ata/cgf/CGF D ataba se/cyto iamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html); ttp://spd. cbi.pku.edu.cn/); otein kinases (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), y man CD ttp://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_f'ina y (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell di lecules Blood, 106:3123-6).
Las DVD-lgs son útiles como agentes terapé multáneamente bloquear dos diferentes objetivos para icacia/seguridad y/o incrementar la cobertura del paci jetivos pueden incluir objetivos solubles (TNF) y o ceptor de superficie de célula (VEGFR y EGFR). Tambi ilizar para inducir citotoxicidad redirigida entre células lulas T (Her2 y CD3) para terapia de cáncer, o entre la activa y células efectoras para enfermedad aut splante, o entre cualquier célula objetivo y la célula e iminar células causantes de enfermedad en cualquier ñalización (en una molécula). Similarmente, una moléc puede ser diseñada para activar la ligación de CT ñal negativa activando dos diferentes epítopos (o dos smo epítopo) del dominio extraceíular CTLA-4, condu b-regulación de la respuesta inmunológica. La CT jetivo clínicamente validado para tratamiento terapé mero de trastornos inmunológicos. Las interacciones d gativamente regulan la activación de célula T at ogresión del ciclo celular, la producción de IL-2, y la células T después de la activación, y e! acoplamiento D152) puede sub-regular la activación de célula T y ducción de tolerancia inmunológica. Sin embargo, la e enuar la activación de célula T a través de acoplamient r anticuerpo agonístico no ha tenido éxito ya que la a L-4 requiere de ligación. La interacción molecular de tá en arreglos de "cierre torcido", como se demue (Griffin 200 Jl 164:4433). En ambos casos, la ligación logró a través de anticuerpos unidos a miembro est alizados en sistemas artificiales. Aunque estos e oporcionan prueba de concepto para la su unológica activando la señalización negativa de activos utilizados en estos reportes no son adecuad apéutico. Hasta este punto, la ligación de CTLA-4 pue ilizando una molécula de DVD-lg, que activa dos ítopos (o dos copias del mismo epítopo) de dominio ext LA-4. La razón fundamental es que ía distancia que íos de unión de una IgG, aproximadamente 15 masiado grande para la ligación activa de CTLA-4 (30 homodímero 2 CTLA-4). Sin embargo, la distancia e íos de unión en DVD-lg (un brazo) es mucho más corta, escala de 30-50 A, permitiendo la ligación apropiada d Similarmente, la DVD-lg puede activar dos diferent a molécula intracelular), suministrando adentro d ctivando el receptor de transferrlna y un mediador de l CNS para cruzar la barrero hematoencef álica). mbién puede servir como una proteína de vehículo para antígeno a una ubicación específica a través de la Ítopo de no neutralización de ese antígeno y ta crementar la vida media del antígeno. Además, la Ü r diseñada ya sea para enlazarse físicamente a dicos implantados en pacientes o activar estos dicos (ver, Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Sch , Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delive 006) , 58(3), 437-446; Surface coatings for biological ac nctionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; B ; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., atings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; mbinations for local drug therapies and infection prop positivo a través de un DVD acoplado a o que positivo. Por ejemplo, se han utilizado stents duran rdiolog ta de intervención para limpiar arterias bloque jorar el flujo de sangre hacia el músculo cardiaco. S sabe que los stents de metal tradicionales causan res trechamiento de la arteria en el área tratada) en algun pueden conducir a la formación de coágulos. Reciente scrito un stent recubierto con el anticuerpo anti-CD duce restenosis y evita que se formen coágulos captur ogenitoras endoteliales (EPC) que circulan a través d s células endoteliales son células que alinean vasos rmitiendo que la sangre fluya suavemente. Las EPCs s superficie dura del stent formando una capa suave omueve la curación sino que también evita la r águlos, complicaciones previamente asociadas con ents (Aoji et al., 2005 J Am Coll Cardiol. 45(1p):1574 34) así como una proteína (o un epítopo de cua luyendo, pero no limitándose a proteínas, lípidos y po e ha sido colocada como cubierta en el dispositivo impl ilitar el reclutamiento de células. Dichos aspectos tam r aplicados a otros implantes médicos en ernativamente, las DVD-lgs pueden ser colocadas com bre dispositivos médicos y después de implantación y li os los DVDs del dispositivo (o cualquier otra necesida querir DVD-lg fresco adicional, incluyendo enveje snaturalización de ka DVD-lg ya cargada) el dispos lver a ser cargado a través de administración sistemic sca al paciente, en donde ia DVD-lg se diseña para jet i vo de interés (una citocina, un. marcador de super l como CD34), etc) con un grupo de sitios de un jetivo colocado como cubierta en el dispositivo (ind oteína, un epítopo de cualquier tipo, incluyendo scriben ejemplos de dichos objetivos en varias enferme Respuesta Autoinmune e Inflamatoria Humana Muchas proteínas han sido implicadas en toinmunes e inflamatorias generales, incluyendo C5, C LI11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (???-ld), CCL L17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), ), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / L25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP ANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1 , CXC CL11 (l-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL CL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 L13 (mcp-4), CCR 1 , CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, C R8, CCR9, CX3CR1 , IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, 7C, ILtA, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, I , IL8, IL9, LTA, LTB, MI F, SCYE1 (citocina de ac L13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL L22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, C R6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1 , CX3CR1 , CXCL CL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12 CR4, GPR2, SCYE1 , SDF2, XCL1 , XCL2, XCR1, ?? PR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, C F3, DKFZp451 J0118, FGF2, GFM , IFNA1, IFNB1 , I A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3 , IL5RA, IL6, 1L6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, 0RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB 3, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, I 8R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB F, NPPB, PDGFB, TBX21 , TDGF , TGFA, TGFB1 FB2, TGFB3, TGFBi , TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, FRSF1A, TNFRSF1 B, TNFRSF7, TNFRSF8, FRSF11A, TNFRSF21 , TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, tor clave que subraya la patogénesis de asma, involu eraccion de complejo de células inflamatorias tales c células B, eosinófilos, células cebadas o mastocitos y e otros mediadores secretados incluyendo citocinas y s corticoesteroides son el tratamiento anti-inflam portante para asma en la actualidad, sin embargo, su acción es no específico y existen preocupaciones de pecialmente en la población de pacientes jóvenes. El d rapias más específicas y dirigidas, por lo tanto, está íste una evidencia creciente de que IL-13 en ratones í las características del asma, incluyendo AHR, hipers co y fibrosis de vías respiratorias, independient lamación eosinofílica (Finotto et al, International 005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of 005), 174(12), 8097-8105).
IL-13 ha sido implicada por tener un papel pivotal e NFt-a). El TNF-a puede amplificar la respuesta infl ma y puede ser enlazado a la severidad de la cDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (200 ugs for Asthma, Allergy and COPD), 247- 250.)· Esto bloquear tanto IL-13 como TNF-a puede tener efecto rticularmente en enfermedad severa de las vías respi ra modalidad, la DVD-lg de la invención une los objeti F- , y se utiliza para tratar asma.
Modelos de animales tales como el modelo de rat ucida por OVA, en donde se pueden valorar tanto mo AHR, son conocidos en la técnica y se pueden terminar la habilidad de las varias moléculas de DVD-lg iria. Los modelos de animales para estudiar asma se d ffman, et al., Journal of Experimental Medicine (200 75-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (200 5; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (200 Basándose en los fundamentos descritos aquí y u smo modelo de evaluación para eficacia y seguridad, objetivos que las moléculas de DVD-lg pueden unir ra tratar asma pueden ser determinados. En una modali jetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 e IL-1 b mbién se implican en la respuesta inflamatoria en as ocinas y quimiocinas que están involucradas en inflam mo IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL RC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-ß; IL-13 R; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a¡ IL-13 y SPRR2b AM8. La presente invención también proporciona DVD- unir uno o más objetivos involucrados en asma, selec upo que consiste de CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), C F2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamína y receptores d 1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, I 12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITL Artritis reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad si racteriza por una reacción inflamatoria crónica en l ovial de articulaciones y está asociada con la dege rtílago y erosión del hueso yuxta-articular. Muchas ci flamatorias, incluyendo TNF, quimiocinas, y factores de expresan en articulaciones enfermas. La administraci anticuerpo anti-TNF o proteína de fusión sTNFR a tón de RA se mostró ser anti-inflamatoria y pr ticulaciones. Las investigaciones clínicas en donde la F en pacientes con RA se bloqueó con infliximab a travenosamente (Harriman G, Harper LK, Schaible mmary of ciinical triáis in rheumatoid arthritis usirig in ti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1 : 161 ti-TNF quimérico, ha probado evidencia de que TN oducción, reclutamiento de IL-6, IL-8, MCP-1 y VEGF r rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis f ibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), y terapia de c tuximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for thritis . N Engl J Med. 351 :1909) ya han sido probados ntrolados aleatorizados durante el año pasado. Se han ras citocinas y se ha mostrado que son de beneficio en imal, incluyendo interleucina-15 (anticuerpo terapéut _15, AMG 714, ver, Baslund, Bo et al., Arthritis & 005), 52(9), 2686-2692), interleucina-17 e interle sayos clínicos de estos agentes están actualmente e rapia de anticuerpo doble específica, combinando anti diador, tiene enorme potencial para mejorar la eficaci bertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo tanto d VEGF potencialmente puede erradicar la infl giogénesis, ambas involucradas en la patofisiolog mbién se contempla el bloqueo de otros pares d lécula de DVD-lg será útil para el tratamiento umatoíde, esto se puede determinar utilizando modelo imal pre-clínicos tales como un modelo de ratón ucida por colágeno. En la técnica también son bie ros útiles modelos (ver, Brand DD., Comp. Med. (2005 ). Basándose en la reactividad cruzada de los rentales para ortólogos humanos y de ratón (p actividad para TNF humano y de ratón, IL-15 humana c.) se pueden conducir estudios de validación en el mo ratón con un "anticuerpo substituto coincídente" léculas de DVD-lg; en resumen, una DVD-lg basada s) anticuerpos específicos objetivo de ratón pue incidentes al grado posible a las características de los níanos parentales o humanizados usados para la con D-lg humana (afinidad similar, potencia de neutraliza a media similar, etc.). í como moléculas co-estimuiantes, tales como, CD40 y CD28 y CTLA-4, las cuales inician la segunda s eracciones junto con la eliminación fagocítica mplejos inmunes y material apoptótico, perpetuán l munológica con daño de tejido resultante. Los siguient eden ser involucrados en SLE y potencialmente ilizados para el aspecto de DVD-lg para intervención apias activadas por célula B: CD-20, CD-22, CD-19, 80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF FSF6, BLR 1 , HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IC 4A1, RGS 1 , SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, FSF5, AiCDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC AC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, 69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRS 24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, C GA2, ITGA3, MS4A1 , ST6GAL1 , CD1C, CHST10, HLA- eccionados del grupo que consiste de IL-4, IL-6, IL-1 F-a. La combinación de objetivos, discutida aquí, icacia terapéutica para SLE que puede ser probada en modelos pre-clínicos de lupus (ver, Peng SL (2004) d.; 102:227-72). Basándose en la reactividad cruz ticuerpos parentales para ortólogos humanos y de mplo, reactividad para CD20 humano y de ratón, int mano y de ratón, etc.) se pueden conducir estudios d un modelo de ratón con lupus con moléculas de DVD-l "anticuerpo substituto coinci'dente"; en resumen, sada en dos (o más) anticuerpos específicos de obj cerse coincidente al grado posible a las característ ticuerpos humano o humanizados parentales usad nstrucción de DVD-lg humana (afinidad similar, p utralización similar, vida media similar, etc.). nitrógeno reactivas y moiéculas co-estimula nsideración principal son los mecanismos inmunol tribuyen al desarrollo de autoinmunidad. En pa presión de antígeno, interacciones de citocina y l uías T reguladoras, que ayudan a equilibrar/modular o tales como células Th1 y Th2t son áreas importan entificación terapéutica objetivo.
IL-12 es una citocina pro-inflamatoria que es pr C y promueve la diferenciación de células efectoras T oducida en las lesiones en desarrollo de pacientes c mo en animales afectados por EAE. Previamente, se m erferencia en las trayectorias de IL-12 efectivamente e edores, y que la neutralización in vivo de !L-12p40, util ti-IL-12, tiene efectos benéficos en el modelo de EAE i elina en mono tití comunes.
TWEAK es un miembro de la familia de TNF, const cocito cuando los ratones se trataron después de oceso de inicio de la polimerización.
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas paces de unir uno o más, por ejemplo dos, objetivos se l grupo que consiste de IL-12, TWEAK, IL-23, CXC 40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IN F, FGF. C5, CD52, y CCR2. Una modalidad incluye ti-iM 2/TWEAK específico doble como un agente néfico para ei tratamiento de MS.
Varios modelos de animal para valorar la utíli léculas de DVD para tratar MS son conocidos en la t einman L, et al, (2005) Trends Immunol. 26 (11):565-71 al, (1985) Springer Semin Immunopathol. 8(3): 197-2 , et al, (1997) J Mol Med. 85(3): 187-97; Tuohy VK, et p Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al, (1995) I ( 1 ) : 51 - 73 ; y 't Hart BA, et al, (2005) J Immunol 17 D-lg humana (afinidad similar, potencia de neutraliza a media similar, etc.). El mismo concepto se aplica a imal en otras especies de no roedor, en donde rivada de un "anticuerpo substituto coíncidente" eccionada para la farmacología anticipada y p tudios de seguridad. Además las valoraciones de s tina de estas pruebas específicas de pares objetivo p inmunosupresión pueden ser garantizadas y útiles par mejores pares objetivo (ver, Luster et al, Toxicól (1-3), 229-43; Descotes, et al, Developments in ndarization (1992), 77 99-102; Jones R. 2000 Roveliz rp): IDrugs.3(4):442-6).
Sin embargo, MS no es la única enfermedad inmun ne un componente neurodegenerativo muy imp ogresión de la enfermedad en MS se debe a la pérdida daño de axones y las clasificaciones de enfermedad fi inas, pueden contribuir a ia neurodegeneración dirigi rdida de una exitosa regeneración de axones. La activa lécula de DVD Ig individual que neutraliza las ígidas contra componentes como RGM A, NOGO A, S rinas con actividades neutralizantes dirigidas contra ci lamatorias como IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, , VEGF, VLA-14, TNF, CD45RB, CD2G0, IGNgama, GE , CD52, y CCR2 podría permitir el foco simultá lamación y neurodegeneración, un objetivo aún no nguno de los principios de MS terapéuticos a urodegeneración estimulante puede compensar ncionales causados por la neurodegeneración axo servada en MS, haciendo posible la recuperación de la nciones cerebrales.
Sepsis incipales respuestas inflamatorias e inmunológicas s enciales de choque séptico y juegan una parte ce togénesis del daño de tejido, falla múltiple de órgan ucida por sepsis. Se ha mostrado que las citocínas, es ctor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina ( I L - 1 ) son íticos de choque séptico. Estas citocínas tienen un e ecto en los tejidos; también activan la fosfolipasa ros efectos conducen a concentraciones incrementada activación de plaqueta, promoción de actividad de ido nítrico, promoción de infiltración de tejido a utrófilos, y promoción de actividad de neutrófilo.
El tratamiento de sepsis y choque séptico permane unto clínico difícil, y pruebas recientes de pro dificadores de respuesta biológica (es decir, anti-TN rígidos a la respuesta inflamatoria han mostrado u nico solo modesto. Recientemente, el interés se ha d apoptosis prosigue a través de auto-activación d osólicas y/o mitocondriales, las cuales pueden ser i r los miembros pro- y anti-apoptóticos de la famili ímales experimentales, no solo el tratamiento con inh optosis evita la apoptosis de célula I i nf o i de , sino q jorar el resultado. Aunque las pruebas clínicas con a optóticos permanece distante debido en gran parte a cnicas asociadas con su administración y activación d hibición de apoptosis representa un objetivo terapéuti ra el paciente séptico. Asimismo, un agente doble es tiva tanto mediadores inflamatorios como un mediador ede tener un beneficio agregado. Un aspecto de la i fiere a DVD-lgs capaces de unir uno o más objetivos i sepsis, en una modalidad dos objetivos, seleccionado e consiste de TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, I S, receptores de tipo Toll, TLR-4, factor de tej Trastornos Neurológicos Enfermedades Neurodegenerativas Las enfermedades neurodegenerativas son ya sea yo caso usualmente dependientes de la edad o a mplo, apoplejía, daño traumático al cerebro, daño pinal). Se caracterizan por la pérdida progresiva d uronales (muerte de célula neuronal, pérdida de axon urítica, desmielinación), pérdida de movilidad y moria. El conocimiento emergente de los meca brayan enfermedades neurodegenerativas crónicas (p fermedad de Alzheimer) muestra una compleja etiolog reconocido una variedad de factores para contr sarrollo y progresión, por ejemplo, edad, estado educción de amiloíde y multimerización, acumulación d ales de glicación avanzados (AGE), los cuales se ceptor RAGE (receptor para AGE), estrés incrementa evenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápt tamientos fallan para detener la progresión de la tudios recientes sugieren que terapias con más obj mo anticuerpos para péptido A-b soluble (incluyendo igoméricas A-b) no pueden solo detener la progre fermedad sino que pueden ayudar a mantener la memo tas observaciones preliminares sugieren que terapias e activan más de un mediador de enfermedad (por eje a citocina pro-inflamatoria tal como TNF) pueden prop icacia terapéutica aún mejor para en urodegenerativas crónicas que la observada con la a mecanismo de enfermedad individual (por ejempl luble) (ver, CE. Shepherd, et al, Neurobiol Aging, 2 tubre; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005; 11:3335; ein; Neurochem Int. 2002; 41:345; Michelle C Janelsi uroinflammation, 2005; 2:23; Soloman B., Curr Alz foterina), citocinas pro-inflamatorias (por ejem imiocinas (por ejemplo, PC1), moléculas que generación de nervios (por ejemplo, Nogo, RGM A), mo joran el crecimiento de neuritas (neurotrof inas) . La efi léculas de DVD-lg puede ser validad en modelos de a ínicos tales como los ratones transgénicos que sobre-oteína precursora amiloide o RAGE y desarrollan sínto fermedad de Alzheimer. Además, las moléculas de DV r construidas y probadas para eficacia en los modelos la mejor DVD-lg terapéutica puede ser seleccionada par cientes seres humanos. Las moléculas de DVD-lg tam r empleadas para el tratamiento de otras en urodegenerativas tales como la enfermedad de Parkins nucleína está involucrada en la patología de Parkinson. paz de activar la alfa-sinucleina y mediadores inflam rno TNF, IL-1, MCP-1 pueden proporcionar terapia efe Regeneración Neurona! y Daño a Médula Espinal A pesar de un incremento en el conocimie canismos patológicos, el daño a médula espinal (SCI) ndtción devastadora y representa una indicaci racterizada por una alta necesidad médica. La may ños de médula espinal son contusiones o daños por c daño primario es usualmente seguido por mecanism Cundarios (mediadores inflamatorios, por ejemplo, imiocinas) que empeoran el daño inicial y dan como r randamiento importante del área de lesión, algunas ve 10 veces. Estos mecanismos primarios y secundarios y similares a aquellos en daño de cerebro causad dios, por ejemplo, ataque apopléjico. No exis tamiento satisfactorio y la única terapia utilizada en u bolo de dosis alta de metilprednisolona (MP) dentro tiempo limitado de 8 horas después del daño. Sin e Ita de recuperación funcional en SCI en humanos es ctores que inhiben el crecimiento de neurita, en lo ión, en tejido cicatrizante, en mielina así como ociadas con daño. Tales factores son las proteínas as elina, NogoA, OMpg y MAG, RG A, los CSPG as atriz (Proteoglicanos de Sulfato de Condroitina) ibidores en astrocitos reactivos (algunas semaforinas n embargo, en el sitio de la lesión no se encuentra ibidoras de crecimiento sino que también factores de crecimiento de neurita como neurotrofinas, laminina, te ensamble de moléculas inhibidoras de crecimiento omotoras de crecimiento puede explicar que el bloqueo ividuales, como NogoA o RGM A, dio como r cuperación funcional importante en modelos de SCI d e una reducción de las influencias inhibidoras puede uilibrio de inhibición de crecimiento a promoción de r ejemplo, Nogo y una molécula pro-inflamatoria, p IF, (ver, McGee AW et al, Trends Neurosci. 2003; 26 meniconi, et al, J Neurol Sci. 2005; 233:43; Milán Mak BS J. 2005; 272:2628; Barry J. Dickson, Science 200 licia Yu Hsuan Teng, et al, J Neurosci Res. 2005; 7 rnezis, et al, Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang urochem. 2004; 91; 1018).
En un aspecto, las DVD-lgs capaces de unir pa les como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM M A; RGM A y RGM B; RGM A y semaforina 3A; maforina 4; CSPGs y RGM A; agrecan, mídeina, rsican, fosfacan, Te38 y TNF-a; se proporcionan pecíficos de globulómero ?ß combinados con antic omueven dendritas y brotes de axón. La patología de signo muy antiguo de AD y se sabe que NOGO A ecimiento de dendritas y en donde las otras molécula lamatorias (por ejemplo, IL-1), quimiocinas (por ejemp léculas que inhiben la regeneración de nervios. La ti-nogo/anti-RGM A o moléculas de DVD-lg similares lidada en modelos de animales pre-ciínicos de daño pinal. Además, estas moléculas de DVD-lg pueden ser probadas para eficacia en modelos de animales y la me rapéutica puede ser seleccionada para probarse en pac manos. Además, las moléculas de DVD-lg pueden ser ra que activen dos diferentes sitios de unión de lig ceptor individual, por ejemplo, receptor Nogo, el cu andos, Nogo, Ompg, y MAG y RAGE que une A-b emás, los inhibidores de sobre-crecimiento de n rnpio, nogo y receptor nogo, también juegan un papel prevenir la regeneración de nervios en en munológicas como esclerosis múltiple. Se ha mostr hibición de la interacción del receptor nogo-nogo bargo, en ciertas enfermedades neurológicas, p oplejía, daño traumático al cerebro, esclerosis múlti B puede ser comprometida y permite la penetración in las DVD-lgs y anticuerpos en el cerebro. En otras urológicas, cuando la fuga de BBB no ocurre, se pued tivación de sistemas de transporte endógenos, nsportadores mediados por vehículo, tales como v ucosa aminoácido y estructuras celulares/receptores d transcitosis mediada por receptor en el endotelio va B, permitiendo así el transporte trans-BBB de la tructuras de la BBB que permiten dicho transporte inc se limitan a, receptor de insulina, receptor de transfe GE: Además, las estrategias permiten el uso de DVD- mo lanzaderas para transportar fármacos potencíal tema nervioso central incluyendo fármacos de lecular, nanopartículas y ácidos nucleicos (Coloma ec. 1); IGF1.2 y Abeta (sec. 1); Abeta (sec. 1) e IL- eta (sec. 1); Abeta (sec. 1) y RAGE; NGF e IL-18; N F e IL-6; TNF y EGFR (sec. 2); TNF y RAGE; CD-20 y ; CD-20 y EGFR (sec, 2); RGMA y TNF (ver Ejemplo 2.1 Trastornos Oncológicos La terapia de anticuerpo monoclonal ha surgido daíidad terapéutica importante para cáncer (von Mehr 003), Annu Rev Med,; 54:343-69), Los anticuerpos pu ectos antitumoraies induciendo apoptosis, citotoxicida teríerencia con interacciones de ligando-receptor, presión de proteínas que son críticas al fenotipo emás, los anticuerpos pueden activar componentes ibíente tumoral, perturbando estructuras vítales tal rmación de vasculatura asociada con tumor. Los mbién pueden activar receptores cuyos ligandos son En otra modalidad, un DVD de la invención es ca GF y fosfatidilserina; VEGF y ErbB3; VEGF y PLG B04; VEGF y BSG2; VEGF y CDCP1; VEGF y ANPEP T; HER-2 y ERB3; HER-2 y BSG2; HER-2 y CDCP PEP; EGFR y CD64; EGFR y BSG2; EGFR y CDC PEP; IGF1R y PDGFR; IGF1R y VEGF; IGF1R y CD 74; CD20 y CD30; CD20 y DR4; CD20 y VEGFR2; C 20 y CD4; HGF y c-MET; HGF y NRP1; HGF y fosf bB3 e IGF1R; ErbB3 y IGF1.2 ; c-Met y Her-2 ; c-Met t e IGF1R; IGF1.2 y PDGFR; IGF1.2 y CD20; IGF1. F2 y EGFR; IGF2 y HER2; IGF2 y CD20; IGF2 y VE F1R; IGF1 e ÍGF2; PDGFRa y VEGFR2; PDGFRa y PL VEGF; PDGFRa y c-Met; PDGFRa y EGFR; PDGFRb GFRb y c-Met; PDGFRb y EGFR; RON y c-Met; RO N y MSP; RON y CDCP1; VGFR1 y PLGF; VGFR1 y RO FR; VEGFR2 y PLGF; VEGFR2 y NRP1; VEGFR2 y R CD52; CD30 y CD20; CD30 y CD22; CD30 y CD23; CD 30 y VEGF; CD30 y CD74; CD30 y CD19; CD30 y D 4; CD30 y VEGFR2; CD30 y CD52; CD30 y CD4; CD13 33 y FTL3; CD33 y VEGF; CD33 y VEGFR2; CD33 y C 4¡ CD33 y DR5; DR4 y CD137; DR4 e IGF1.2; DR4 e IG 5; DR5 y CD40; DR5 y CD137; DR5 y CD20; DR5 y E F1.2; DR5 e IGFR, DR5 y HER-2, EGFR y D mbinaciones objetivo incluyen uno o más miembros d F/erb-2/erb-3, Otros objetivos (uno o más) invol fermedades oncológicas que las DVD-lgs pueden un ro no se limitan a aquellos seleccionados del grupo q : CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8t BMP6, IL12A, 2, IL24, INHA, TNF, TNF10SF10, BMP6, EGF, FG F11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF F2t FGF20, FGF21 , FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, F F7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, i LIA, IL1B, R 1 , ESR2, NROB1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1 2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1 , NR2F2, NR3 4A1, NR4A2, NR5A1 , NR5A2, NR6A1 , PGR, RARB, F F6, KLK3, KRT1 , AP0C1, BRCA1 , CHGA, CHGB, C L6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1 , FGF10, FGF11, FG F16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21 , FGF22, F F4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, I FBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, ????, ?? K10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, ? K9, ???2, ???9, MSMB, ???4, 0D21, ???, PLAU, RPINA3, SHBG, TGFA, ????3, CD44, CDH1, CDH H20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH H20, CDH7, CDH8, CDH9, R0B02, CD44, ILK, I 164, C0L6A1, MTSS1 , ???, TGFB111 , AGR2, AI ??2, CANT1, CAV1 , CDH12, CLDN3, CLN3; C ??5, CY S, DNCL1 , ELAC2, ??02, ??03, FASN, FLJ12584, NB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, P FA, TGFB1 , TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, C0L1 G, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BC NA2, CCND1, CCNE1 , CCNE2, CDH1 (E-caderina 27Kipl), CDKN2A (p!6!NK4a), C0L6A1, CTNNB1 (b-cat atepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOS TA3, GSN (Gelsolin), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL licoproteina 130), ITGA6 (a6 integrina), JUN, KL P2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NM R, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspin), SERPI FA, THBS1 (tromboespondina-1), TIE (Tie-1), TNF FSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP.53, AZ coproteína), BPAGa (plectina), CDKN1A (p21Wapl/Ci laudin-7), CLU (clusterína), ERBB2 (Her-2), FG bronectina), GABRP (GABAa), GNAS1 , ID2, ITGA6 (a GB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT 19 (qu MA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, P D1 f y CD59.
Composiciones Farmacéuticas La invención también proporciona composiciones fa e comprenden una proteína de unión de la invención y rmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmac mprenden proteínas de unión de la invención son para ro no se limitan a, el diagnóstico, detección, o verific storno, en la prevención, tratamiento, manejo o mitig storno o uno o más síntomas del mismo, y/o en inves a modalidad específica, una composición comprende oteínas de unión de la invención. En otra mo mposición farmacéutica comprende una o más proteín la invención y uno o más agentes profilácticos o t erentes a las proteínas de unión de la invención pa t 220 unión de la invención y un vehículo farmacéuticament rno se utiliza aquí, "vehículo farmacéuticamente acepta alquiera y todos los solventes, medios de cubrimientos, agentes antibacterianos y anti-f úngic otónicos y de retraso de absorción, y similares ológicamente compatibles. Ejemplos de rmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de a liña regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicer müares, así como combinaciones de los mismos. dalidades, en la composición se incluyen agentes iso emplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, oruro de sodio. Los vehículos farmacéuticamente emás pueden comprender cantidades menores de xiliares tales como agentes humectantes o em nservadores o reguladores de pH, los cuales mejoran l tante o almacén o la efectividad del anticuerpo o u, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción cleico como parte de un vector retroviral u otro vect todos para administrar un agente profiláctico o terap ención incluyen, pero no se limitan a, administració or ejemplo, intradérmica, intramuscular, intr ravenosa o subcutánea), administración epidural, ad ra-tumoral, y administración por la mucosa (p ranasal y rutas orales). Además, se puede minístración pulmonar, por ejemplo, a través del halador o nebulizador, y formulación con un agente r, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,019,968; 985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; WO 98/ /44014; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de la corpora aquí para referencia en sus totalidades. En una a proteína de unión de la invención, terapia de combin al, mucosa rectal e intestinal) y se pueden administr ros agentes biológicamente activos. La administración témica o local.
En una modalidad, la unión específica de nanotubos oplados a anticuerpo (CNTs) a células tumorales in vi r su ablación altamente específica con luz casi infr ede ser utilizada para tener como objetivo células tu mplo, se pueden utilizar lípidos biotinilados par spersio.nes de CNT no citotóxico, biocompatible, spués se unen a una o dos diferentes DVD-lgs deriva idina dirigidas contra uno o más antígenos tumorales ( 22) (Chakravarty, P, et al, (2008) Proc. Nati. Acad 5:8697-8702.
En una modalidad específica, puede ser deseable s agentes profilácticos o terapéuticos de la invención lo ea con la necesidad de tratamiento; esto puede lo ticuerpos de la invención se administra oralmente a! ár combinación con una cantidad efectiva de una o más t mplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) a proteína de unión de la invención de un sujeto pa tar, manejar, y/o mitigar un trastorno o uno o más s smo.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapé r suministrado en un sistema de liberación controlada tenida. En una modalidad, se puede utilizar una grar la liberación controlada o sostenida (ver, Lan fton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buc 80, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Eng!. J. M otra modalidad, se pueden utilizar materiales polim grar la liberación controlada o sostenida de las ter vención (ver, por ejemplo, Medical Applications of lease, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca limeros utilizados en formulaciones de liberación cluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidrosi etil >!i(metil metacrilato), ácido poli(acrílico), acetato de p nilo), ácido poli(metacrílico), poliglicolidas (PLG), pol li(N-vinilpirrolidona), alcohol pol i(vin Mico), po I i ( e t i I e n glicol), polilactídas (PLA), poli(lactida-c LGA), y poliortoésteres. En una modalidad, el polímero a formulación de liberación sostenida es inerte, libre d ibiables, estable al almacenamiento, estéril, y biodeg V ra modalidad más, un sistema de liberación controlada ede ser colocado cerca del objetivo profiláctico o quiriendo así solo de una fracción de la dosis sistémi emplo, Goodson, en Medical Applications of Controll pra, voL 2, pág, 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se disc visión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Cualq :372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. ntrol. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et licroencapsulation of Recombinant Humanized Monoclo r Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control ReL Bi :759- 760, cada una de las cuales se incorpora ferencia en sus totalidades.
En una modalidad específica, en donde la compo vención es un ácido nucleico que codifica un agente p rapéutíco, el ácido nucleico puede ser administrado i omover la expresión de sus agente profiláctico o dificado, construyéndolo como parte de un vector de e ido nucleico apropiado y administrándolo de manera q tracelular, por ejemplo, a través del uso de un vect er, patente de E.U.A. No. 4,980.286), o a través d recta, o a través del uso de bombardeo de micropar G compatible con su ruta de administración pretendida. tas de administración incluyen, pero no se limitan a, ad renteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcu ranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (p pica), transmucosa, y rectal. En una modalidad es mposición se formula de acuerdo con procedimiento mo una composición farmacéutica adaptada para ad travenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal, res humanos. Típicamente, las composiciones para ad ravenosa son soluciones en un regulador de pH acuos téril. Cuando es necesario, la composición también p agente de solubilización y un anestésico local nocamne para reducir el dolor en el sitio de ía inyecció Si las composiciones de la invención van a ser a picamente, las composiciones pueden ser formuladas un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, g ulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, ilares, los cuales son, si se desea, esterilizados o me entes auxiliares (por ejemplo, conservadores, esta entes humectantes, reguladores de pH, o sales) para rias propiedades, tales como, por ejemplo, presión osm rmas de dosis tópicas adecuadas incluyen prepar rosol que se pueden rociar, en donde el ingrediente ac dalidad, en combinación con un vehículo inerte solid empaca en una mezcla con un volátil presurizado (por pulsor gaseoso, tal como freón) o una botella qu mprimir. También se pueden agregar humectadores o las composiciones farmacéuticas y formas de dosis s emplos de dichos ingredientes adicionales son bien c técnica.
Si el método de la invención comprende ad ranasal de una composición, la composición puede se ministrar una cantidad medida. Se pueden formular rtuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina) para u halador o insuflador conteniendo una mezcla de mpuesto y una base de polvo tal como lactosa o almidó Si el método de la invención comprende admin istrac mposiciones pueden ser formuladas oralmente en l bletas, cápsulas, bolsas pequeñas, cápsulas de gel lucionesf y similares. Se pueden preparar tabletas o vés de medios convencionales con excipientes farmac eptables tales como agentes de unión (por ejemplo, íz pregelatinizado, polivínilpirrolidona o hidroxípropilm nadores (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalin ido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de leo, o sílice); agentes de desintegración (por ejemplo, pa o glicolato de almidón de sodio); o agentes hume emplo, lauril sulfato de sodio). Las tabletas pueden ser mplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p eite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico, getales fraccionados); y conservadores (por e roxibenzoatos de metilo o propilo o ácido só eparaciones también pueden contener sales regulado entes saborizantes, colorantes, y edulcorantes, opiado. Las preparaciones para administración oral nvenientemente formuladas para liberación lenta, ntrolada, o liberación sostenida de un agente(s) pr rapéutico.
El método de la invención puede comprender ad lmonar, por ejemplo, a través del uso de un i bulizador, de una composición formulada con un rosol. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 880,078; y Publicaciones de PCT Nos. WO 92/19244; W usión continua). Las formulaciones para inyección esentadas en una forma de dosis unitaria (por polletas o en recipientes de dosis múltiples) con un regado. Las composiciones pueden tomar formas spensiones, soluciones o emulsiones en vehículos uosos, y pueden contener agentes de formulación entes de suspensión, de estabilización y/o de ternativamente, el ingrediente activo puede estar e ivo para constitución con un vehículo adecuado (por ej re de pirógeno, estéril) antes de uso.
Los métodos de la invención además pueden co ministración de composiciones formuladas como prepa pósito. Dichas formulaciones de larga acción ministradas a través de implantación (por ejemplo, s tramuscularmente) o a través de inyección intramuscul añera, por ejemplo, las composiciones pueden ser for tiones taies como aquellas derivadas de sodio, potas cio, hidróxidos férricos, isopropilamina, írtetil ¡laminoetanol, histidina, procaína, etc.
Generalmente, los ingredientes de las compo ministran ya sea en forma separada o mezclados conju forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polv co o concentrado libre de agua en un contenedor her llado, tal como una ampolleta o saco pequeño i ntidad de agente activo. Cuando el modo de admin usión, la composición puede ser suministrada con un usión conteniendo agua o salina de grado farmacéu ando el modo de administración es a través de in ede proporcionar una ampolleta de agua estéril para i liña, de manera que los ingredientes pueden ser mezc administración.
En particular, la invención también proporciona un ministración a un sujeto. En una modalidad, uno o ofilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéu ención se suministran como un polvo liofilizado estér contenedor herméticamente sellado a una dosis unitar nos 5 mg, por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, p mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por l , por lo menos 75 mg, o por lo menos 100 mg. filácticos o terapéuticos liofilizados o co rmacéuticas de la invención deben ser almacenados de C, en su contenedor original y los agentes pro apéuticos, o composiciones farmacéuticas de la inve r administradas en 1 semana, por ejemplo, en 5 días, 48 horas, en 24 horas, en 12 horas, en 6 horas, en 5 ras o en 1 hora después de ser reconstituidas. En un ternativa, uno o más agentes profilácticos o ter mposiciones farmacéuticas de la invención se suministr igtnal .
Las proteínas de unión de la invención pueden ser i una composición farmacéutica adecuada para ad renteral. En una modalidad, el anticuerpo o po ticuerpo serán preparados como una solución teniendo 0,1-250 mg/ml de la proteína de unión. ectable puede estar compuesta de ya sea de una for uida o liofilizada en un frasco de cristal o ámbar, inga pre-llenada. El regulador de pH puede ser L-his ), opcionalmente 5-10 mM, al un pH de 5.0 a 7.0 (ópti de 6.0). Otros reguiadores de pH incluyen, pero no S ccinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o tasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para xicidad de la solución a una concentración de ptimamente 150 mM para una forma de dosis líquida), luir crio-protectores para una forma de dosis ¡clónales incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 2 nsoactivos BRIJ. La composición farmacéutica que co oteínas de unión de la invención preparadas como u yectable para administración parenteral, adem mprender un agente útil como un auxiliar, tales co ilizados para incrementar la absorción, o dispersi oteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo). rticularmente útil es hialuronidasa, tal como ialuronidasa humana recombinante). La adición de hialu solución inyectable mejora la biodisponibilidad huma administración parenteraL en particular ad bcutánea. También permite volúmenes mayores d yección (es decir, mayores que 1 mi) con men comodidad, e incidencia mínima de reacciones de sitio er, WO 2004078140 y US2006104968 incorporadas erencia). manos con otros anticuerpos. El modo de ad eccionado es parenteral (por ejemplo, intravenosa, raperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el an ministrado a través de infusión intravenosa o inyecci dalidad, el anticuerpo es administrado a través d ramuscuiar o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas deben ser estérile jo las condiciones de fabricación y almacena mposición puede ser formulada como una solución, mic spersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecua a concentración de fármaco. Las soluciones inyectabl eden ser preparadas incorporando el compuesto activ ticuerpo o porción de anticuerpo) en ia cantidad requ ívente apropiado con uno o una combinación de i umerados aquí, según se requiera, seguido por e trada. En general, se preparan dispersiones i neo r mo lecitina, a través del mantenimiento del tamaño querido en el caso de dispersión y a través del uso nsoactivos. Una absorción prolongada de las co ectables puede $er lograda incluyendo, en la comp ente que retrase la absorción, por ejemplo, noestearato y gelatina.
Las proteínas de unión de la presente invención ministradas a través de una variedad de métodos con cnica, aunque para muchas aplicaciones terapéutic dalidad, la ruta/modo de administración es inyección yección intravenosa o infusión. Como será aprecia pertos en la técnica, la ruta/modo de administrac pendiendo deMos resultados deseados. En ciertas mod mpuesto activo puede ser preparado con un vehículo qu compuesto contra una rápida liberación, tal como una liberación controlada, incluyendo implantes ede ser oralmente administrada, por ejemplo, con u erte o un vehículo comestible, asimilable. El compue redientes, sí se desea) también puede ser encerr psula de gelatina de cubierta dura o suave, comprimid incorporarse directamente en la dieta del s ministración terapéutica oral, los compuestos corporados con excipientes y utilizarse en la forma geribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas spensiones, jarabes, obleas, y similares. Para ad mpuesto de la invención a través de otro tipo de ad renteral, puede ser necesario recubrir el compuesto ministrar el compuesto con un material para activación.
También se pueden incorporar compuesto plementarios en las composiciones. En ciertas modal oteína de unión de la invención es co-formulada s bajas de los agentes terapéuticos administrados, sibles toxicidades o complicaciones asociadas con noterapias.
En ciertas modalidades, una proteína de unión está vehículo de extensión de vida media conocido en chos vehículos incluyen, pero no se limitan a, el liet ilen glicol, y dextrana. Dichos vehículos se descri emplo, Solicitud de E.U.A. Serie No. 09/428,082 y Soiic blicada No. WO 99/25044, las cuales se incorporan ferencia para cualquier propósito.
En una modalidad específica, se administran se ido nucleico que codifican una proteína de unión de la ros agente profiláctico o terapéutico de la invención evenir, manejar, o mitigar un trastorno o uno o más s smo a través de terapia de gen. La terapia de en se r rapia realizada a través de la administración a un s xicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 rgan y Anderson, 1993, Ann. Rev, Biochem. 62:191 93, TIBTECH 11 (5) : 155-215. Los métodos comúnment la técnica de tecnología de ADN recombinante que s scriben por Ausubel et al. (eds.)f Current Protocols i ology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Ge d Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, a descripción detallada de varios métodos de terapi scribe en US20050042664 A1, la cual se incorpora I ferencia.
Las proteínas de unión de la invención son útiles rias enfermedades en donde los objetivos que son reco s proteínas de unión son peligrosos. Dichas e cluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, tritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Ly oriátíca, artritis reactiva, espondiloartropatía, Jupu scu litis microscópica de los ríñones, hepatitis acti eítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, s psis, caquexia, enfermedades infecciosas, en rásitas, síndrome de inmunodef íciencta adquirid nsversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de fermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar prim jmolítica, malignidades, falla cardiaca, infarto al fermedad de Addison, deficiencia poüglandular esporá y deficiencia poüglandular de tipo II, síndrome ndrome de dificultad respiratoria en adultos (aguda opecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enf iter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerati teropática, ctamidia, yersinia y artropatía asociada con pondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteri ergia atópica, enfermedad bullosa áutoinmune, pénfi nfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lin fermedad pulmonar fíbrótica, alveolitis fibrosante c fermedad pulmonar intersticial pos-inflamatoria, ersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con lmonar intersticial, enfermedad pulmonar asociada con tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar interstici n esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar interstici n artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociad stémico eritematoso, enfermedad pulmonar aso rmatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asoc fermedad de Sjógren, enfermedad pulmonar as pondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa fermedad pulmonar asociada con hemasiderosis, ilmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, diación, bronquiolitis obliteran, neumonía eosinofíli fermedad pulmonar de infiltración linfocítica, enfermed tersticial pos-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematos ertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad clerosis múltiple (todos los sub-tipos), oftalmía pertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejid drome de Goodpasture, manifestación pulmonar de dosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, ? Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enf kayasu/arteritis, tromboci tope nía autoinmune, tro m iopática, enfermedad de la tiroides autoinmune, hip potiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de potiroidismo autoinmune atrófico, mixidema prima cogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática agu fermedades crónicas del hígado, cirrosis alcohólica, da ducido por alcohol, colecistitis, enfermedad iosincrática, hepatitis inducida por fármacos, estato cohólica, alergia y asma, infección por estreptococo enocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo d r SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntiviti rmatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica, r injerto, deficiencia de alfa-1-anti-tripsina, escler iotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración celul terior, terapia anti-cd3, síndrome anti-fosfolípido, re persensibilidad de anti-receptor, aneurismas aórticos y ección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclero teriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o pidación auricular, bloque atrioventricular, linfoma d chazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de MT), bloque de ramificación de grupo, linfoma emaduras, arritmias cardiacas, síndrome de atrofi mores cardíacos, cardiomiopatía, respuesta de infl rivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante d generaciones corticales de cerebelo, trastornos d ocina, demencia pugilística, enfermedades de desm »bre hemorrágica por dengue, dermatitis, rmatológicas, diabetes, diabetes mellitus, eroesclerótica diabética, enfermedad del cuerpo de L rdiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de l sales, síndrome de Down en edad media, tra ovimiento inducidos por fármacos, que bloquean los re pamina del sistema nervioso central (CNS), sen rmacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, end iglotitis, infección por el virus de Epsteín-barr, eri stornos extrapiramidales y del cerebelo, linfo matofagocítica familiar, rechazo de implante de timo Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcion ngica, gangrena de gas, úlcera gástrica, nefritis chazo de injerto de cualquier órgano o tejido, S gativa, sepsis gram positiva, granulomas debido renal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosi iopática, citoíoxicidad mediada por anticuerpo, áste scular espinal infantil, inflamación de la aorta, i posición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neu ño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis venil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kap trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, l tema cortiespinal, lipedema, rechazo de trasplante federma, malaria, iinfoma maligno, histiocitosi lanoma maligno, meningitis, meningococcemia, en tabólicas/idiopáticas, migraña, dolor de cabeza, t tema múltiple mitocondrial, enfermedad de tejido cone mopatía monoclonal, mieloma múltiple, degener stemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager seph), miastenia grave, micobacteríum aviar berculosis por micobacteria, síndrome mielodiplásico fermedad inflamatoria pélvica, rinitis pereníal, ricardial, enfermedad aterosclerótica periférica, sculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, n eumocistis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (pol ganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonai, cambios de piel), síndrome de pos-perfusión, síndro mba, síndrome de cardiotomía pos- I, preeclampsi ogresiva de supra-núcleo, hipertensión pulmonar prim radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enf ynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia QRS estre pertensión reno-vascular, daño por reperfusión, ca strictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demen o de cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, apopl células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, mbios de piel, rechazo de trasplante de intestino delga lidos, arritmias específicas, ataxia espinal, deg sculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, ntricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vita éptica, síndrome hemafagocítico asociado vital, sí ernicke-Korsakoff , enfermedad de Wilson, rechazo de cualquier órgano o tejido, (ver, Peritt et al. publicac . WO2002097048A2, Leonard et al., publicación d 9524918 Al, y Salfeld et al., publicación de 00/56772?1).
Las DVD-lgs de la invención también pueden tratar las siguientes enfermedades: síndromes coronart lineuritis Idiopática Aguda, Poliradiculoneuropatía D flamatoria Aguda, isquemia aguda, Enfermedad de Still opecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti emia aplástica, arteriosclerosis, eczema atópico, ópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune a ección por Streptococcus, pérdida de la audición eo, prolapsos de disco, anemia hemolítica inmune i macos, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, itema multiforme, eritema multiforme mayor, Stacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS), Fiebre drome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopátic ersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia uñe, miositis corporal de inclusión, enfermedad ular infecciosa, enfermedad desmíelizante i fermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal i /UIP, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enf ssmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis tiocitosis de célula de Langerhan, livedo reticularis, d cular, malignidades, poüangitis microscópica, Morbus stornos de neurona motora, penfigoide de membrana gánica múltiple, miastenia grave, síndrome miel ocarditis, trastorno de raíz nerviosa, neuropatía, Hepat imaría, Optica de Neuromíelitis Recurrente, enfermed umática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hipe teítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, choqu cleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enf i d o conectivo asociada con silicón, dermatosis d ilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stev JS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémic mporal, retinitis toxoplásmica, necrolisis epidérmica tóx nsversal, TRAPS (Receptor de Factor de Necrosi acción alérgica tipo 1, diabetes tipo II, urticaria, ersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis primave al, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndro generación macular húmeda, y curación de heridas.
Las proteínas de unión de la invención pueden s ra tratar seres humanos que sufren de enfermedades a particular aquellas asociadas con inflamación, incluye pofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesí etos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluy jiga y urotelio), tracto genital femenino (incluyendo cé arios, así como coriocarcínoma y enfermedad t stacional), tracto genital masculino (incluyendo próstat mínales, testículos y tumores de célula germinal) docrinas (incluyendo la tiroides, glándulas adrenales piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas uellas surgen de hueso y tejidos blandos así como posi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y meninges trocitomas, g lio mas, glioblastomas, retín o bl a st ornas, uroblastomas, Schwannomas (neurilemmoma), y m mores sólidos que surgen de malignidades hematopoy mo leucemias, y linfomas (linfomas tanto de Hodgk dgkin).
En una modalidad, los anticuerpos de la invención (orubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, ibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisom orouracilo (5-FU), leucovorin, irinotecan, inhibidores asa de receptor por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inh )X-2 (por ejemplo, celocoxib), inhibidores de cinasa, y s 9 Una proteína de unión de la invención también ministrada con uno o más agentes terapéuticos adició el tratamiento de varias enfermedades.
Una proteína de unión de la invención puede ser út en combinación para tratar dichas enfermedades. Se de e las proteínas de unión pueden ser utilizadas rnbinación con un agente adicional, ' por ejemplo, apéutico, dicho agente adicional seleccionándose perto en la técnica para su uso pretendido. Por ejempl icional puede ser un agente terapéutico reconocido e e es útil para tratar la enfermedad o condición q 3den ser los anticuerpos de la presente invención y p agente adicional seleccionado de las listas que se pre elante. La combinación también incluye más de icional, por ejemplo, dos o tres agentes adicion mbinación es tal que la composición formada pueda ición pretendida.
Las combinaciones para tratar enfermedades aut 'lamatorias son fármacos anti-inflamatorios no esteroida nominados como NSAIDS, los cuales incluyen fármac uprofeno. Otras combinaciones son corticoesteroides ednisolona; los efectos laterales bien conocidos teroides pueden ser reducidos o aún eliminados unien esteroide requerida cuando se tratan pacientes en n las DVD-lgs de esta invención. Ejemplos no li entes terapéuticos para artritis reumatoide con ticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención >90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD Las combinaciones de agentes terapéuticos pueden i erentes puntos en la cascada autoínmune e i bsecuente; ejemplos incluyen antagonistas de ticuerpos de TNF quiméricos, humanizados o JALI UMAB, (Publicación de PCT No. WO 97/29 emicade™), CDP 571, y receptores de TNF solubles rivados de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p nercept), y también inhibidores de enzima de conversi CE); similarmente, inhibidores de IL-1 (inhibidores de nversión lnterleucina-1 , IL-1RA, etc.) pueden ser efecti sma razón. Otras combinaciones incluyen Interleucin mbínación más incluyen jugadores clave de la toinmune, los cuales pueden actuar en paralelo a, dep de acuerdo con la función de IL-12; especial tagonistas de IL-12 incluyendo anticuerpos IL-18 o re Ifasalazina de azatioprma, mesalazina, >roquinina/hidroxicloro quina, pencilarnina, a tramuscular y oral), azatioprina, coquicina, cortic rales, inhalados e inyección local), agonistas re no receptor (salbutamol, terbutalina, sal meterá I) iofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, cetotife oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenol flunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, cortic les como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de c entes adrenérgicos, agentes que interfieren con la se ves de citocinas pro-inflamatorias tales como TNF-a ernplo, IRAK, NIK, IKK , p38 o inhibidores de M hibidores de enzima de conversión IL-?ß, inhibidores d nversión TNFa (TACE), inhibidores de señalización d les como inhibidores de cinasa, inhibidores de metal amcinolona acetonida, napsiláto de propoxifeno/ap burnetona, diciofenac, piroxicam, etodolac, diciofenac, dica, HCI de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap dico/misoprostol, fentaníio, anakinra, recombinante h tramado!, salsalato, sulindac, cianocobalamin/f etaminofen, alendronato sódico, prednisolona, sulfato ^rhidrato de lidocaína, indometacina, glucosamina sulf/ \ de amitriptilina, sulfadiazina, HCI de oxicodona/ac \ de olopatadina, misoprostol, naproxen sódico, lofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, ti-IL-18, Anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AM ), Roflumíiast, IC-485, CDC-801, y Mesopram, Las co luyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis derada o severa, ciclosporina.
Los agentes adicionales no limitantes que también ilizados en combinación con una proteína de unión 9. I/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado EC/Smith line; ver, por ejemplo, Arthritis & Rheuma I. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteína 2; Seragen; ver, también, Arthritis & Rheumatism (19 23); Anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protei bs/Roche); IL-4 (citocina anti-infiamatoría; DNAX/Sche CH 52000; IL-10 recom binante, citocina anti-i !AX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (p ticuerpos agonistas); IL-IRA (antagonista de rec nergen/Amgen); anakinra (Kineret®/Amgen); TN oteína de unión TNF soluble; ver, por ejemplo, eumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S28 ysioL - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 2 ); R973401 (inhibidor de fosfodíesterasa Tipo IV; ver, p thritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supleme -966 (Inhibidor de COX-2; ver, por ejemplo, implo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (s 84); T-614 (inhibidor de citocina; ver, por ejemplo, eumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplement :>staglandina E1 (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheuma I. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (fár lamatorio no-esteroidal; ver, por ejemplo, Arthritis <& 96) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); Naproxen (fá lamatorio no-esteroidal; ver, por ejemplo,, Neuro Re l. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (fármaco anti-infla teroidal); Ibuprofen (fármaco anti-inf lamatorio no- oxicam (fármaco antí-inflamatorio no-esteroidal); rmaco anti-inflam atorio no-esteroidal); Indometacin ti-inf!amatorio no-esteroidal); Sulfasalazina (ver, p thritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supleme atioprina (ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (19 . 9 (suplemento), S281); inhibidor de ICE (inhibidor d thritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supleme libidores de interleucina- 7 (ver, por ejemplo, leumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S nicilamina; cloroquina; clorambucil; hídrox :losporina; ciclofosfamida; irradiación linfoide total; glo nocito; anticuerpos anti-CD4; CD5-toxinas; péptidos Iministrados y colágeno; lobenzarít dísódico; Agentes Citocina (CRAs) HP228 y HP466 (Houghten Phar c); oligo-desoxinucleótidos fosforotioato ICAM-I antis 02; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 de complem P10; T Ceíl Sciences, Inc.); prednisona; orgotein; po icosaminoglican; minociclina; anticuerpos anti-IL2 rinos y botánicos (ácidos grasos de pescado y semill r, por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum, Dís. Clin :759-777); auranofin; fenilbutazona; ácido meclofená fenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; azar queña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; á Ifato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; lunomida; naproxen; valdecoxib; sulfasalazina; metilpr jprofen; meíoxicam; acetato de metilprednisolona; tí o-sodio; aspirina; azatioprina; triamcino!ona acetonid propoxifeno /apap; folato; nabumetona; diclofenac; doiac; diclofenaco sódico; oxaprozina; HCI de artrato de hidrocodona/apap; diclofenaco sódico/ ntanilo; anakinra, recombinante humano; HCI de lsalato; sulindac; cianocobalamin/fa/píridoxína; a c ndronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; cí ocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/ losporina; HCI de amitriptilina; sulfadiazina; codona/acetaminofen; HCI de olopatadina; misoprosto dico; omeprazol; micofenolato mofetil; cíclofosfamida -1 TRAP; RA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-12/23; anti-IL tagonistas del receptor IL-1; mAbs anti-IL-?ß; mAb ctores de crecimiento; inhibidores de elastasa; ridinil-imidazol; anticuerpos para o antagonistas d imanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT 6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, E AP-II, GM- GF. Los anticuerpos de la invención, o porciones tígeno de los mismos, pueden ser combinados con ant molécula de superficie celular, tales como CD2, CD3, 25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus li ticuerpos de la invención, o porciones de unión a antí smos, también pueden ser combinados con agentes, totrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, rnicofenol lunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticoeste mo prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, a enosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de c entes adrenérgicos, agentes que interfieren con la se .g.,IL-4, !L-10, IL-11, !L-13 y TGFp) e Inhibidores de bci Ejemplos de agentes terapéuticos para la enfermed i donde una proteína de unión puede ser combinada i guientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerp DALIMUMAB (Publicación de PCT No. WO 97/29131; HU EMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, ( NBREL) e inhibidores de p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e PDE4. Los anticuerpos de la invención, o una porción tígeno de los mismos, pueden ser combi ticoesteroides, por ejemplo, budenosida y dexamet teínas de unión de la invención o porciones de unión los mismos, también pueden ser combinados con a mo sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina e interfieren con la síntesis o acción de cit fiamatorias, tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores d nversión de I L- 1 ß e I L- 1 r a . Los anticuerpos de la inve epra 201, folato, ciprofloxacina/dext rosa-agua, bit rocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, f tronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramin rhidrato de ciprofloxacina, sulfato de hiosciamina, cl peridina, clorhidrato de midazolam, icodona/acetaminofen, clorhidrato de prometazina, dio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofi propoxifeno, hidrocortisona, multivitamínícos, ódica, fosfato de codeína/apap, HCI de c nocobalamín, ácido fólico, levof loxacina, metilp talizumab y interferón-gamma.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos par itiple con los cuales las proteínas de unión de la inven r combinadas incluyen los siguientes: cortíc ednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; r aminopiridina; tizanidina; interferó -ß? a (AVO EX teínas de unión de !a invención pueden ser comb ticuerpos para las moléculas de superficie de célula, 2, CD3, CD4t CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, C 69, CD80, CD86, CD90 o sus ügandos. Las proteínas invención también pueden ser combinadas con ag mo metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, fetil, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, rticoesteroides tales como prednisolona, inhib fodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-t ibidores de complemento, agentes adrenérgicos, a erfieren con la señalización a través de citocinas pro-i es como TNFa o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, I ibidores de MAP cinasa), I L- 1 ß inhibidores de nversíón, inhibidores de TACE, inhibidores de seña uía T, tales como inhibidores de cinasa, inhi taloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-merc spasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y ra ligando CD40 y CD80.
Las proteínas de unión de la invención también mbinadas con agentes tales como alemtuzumab, imed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de mpridina, acetato de glatiramer, natalizumab, stn unocína NNS03, ABR-215062, Anerg iX. M S , antag ceptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI- itoxantrona encapsulada en liposoma), THCCBD nabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4) ticuerpo de receptor anti-IL-6, neurovax, pirfenidona al DP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida limotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-1 trahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de mma, agonistas de IL-4.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para lsartan, clorhidrato de sotalol, fenofibrato, ezetimiba, artan potásico, lisinopril/cloruro de tiazida, felodipin marato de bisoprolol.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéu pondilitis anquilosante con los cuales las proteínas de ención pueden ser combinadas incluyen los siguientes lofenaco y mísoprostol, naproxen, meloxicam, in clofenaco, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina, atioprina, minociclina, prednisona, etanercept, inflixima Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos par s cuales las proteínas de unión de la invención mbinadas incluyen los siguientes: albuterol, salmeteroi/ ntelukast sódico, propionato de fluticasona, ednisona, xínafoato de salmeterol, HCI de levalbuterol buteroi/ipratropio, fosfato de prednisolona-sodio, tr etonida, dipropionato de beclometasona! bromuro de tirizina, furoato de mometasona, xinafoato de nzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, tirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/p detna/prometazina, cefprozil, dex aifenesina/pseudoefedrina, chiorfeniramina/h docromil sódico, sulfato de terbutalina, tilprednisolona, sulfato de metaproterenol.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos par cuales las proteínas de unión de la invención mbinadas incluyen los siguientes: sulfato de albuterol omuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, lmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofili ccinato de metilprednisolona-sodio, montelukas desonída, fumarato de formoterol, triamcinolona ofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropi clometasona, HCI de levalbuterol, flunisolida, ceftriax mbinadas incluyen los siguientes; lnterferón-a!Fa-2a, a-2b, Interferón-alfa conl, Interferón-alfa-n1 , interf gilado, interferón-alfa-2b pegilado, ribavirina, Peginte + ribavirina, ácido Ursodesoxicólico, ácido alfasin, Maxamina, VX-497 y cualesquiera compues lizan para tratar HCV a través de la intervención de lo jetivos: HCV polímerasa, HCV proteasa, HCV helicasa, tio de entrada de ribosoma interno).
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos p lmonar idíopática con los cuales las proteínas de ención pueden ser combinadas incluyen los ednisona, azatioprina, albuterol, colquicina, sulfato d oxina, gamma-interferón, metilpredniso!ona sod succ, rosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, cicl omuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, pro ticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, nonitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, i mipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida artan potásica, HCI de quinaprit/mag carb, bumetanida alaprilat, clorhidrato de amiodarona, HCI m-hidrato d rhidrato de diltiazem, captopril, irbesartan, valsarían, propranolol, fosinopril sódico, clorhidrato de ifibatida, cefazolin sódico, sulfato de atropi i noca pro ico, espiro no!actona, interferón, clorhidrato ruro de potasio, docusato sódico, HCI de dobutamina, avastatina sódica, atorvastatina de calcio, clor dazotam, clorhidrato de meperidina, dinitrato de inefrina, clorhidrato de dopamina, bivalirudina , ro etimiba/simvastatina, avasimiba, cariporida.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos pa n los cuales las proteínas de unión de la invención mbinadas incluyen los siguientes: inhibidor de KDR cetato de diflorasona, folato de etanercept, áci toxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, ac tilprednisolona, prednisona, filtro solar, halcinon licílico, antralina, pívalato de clocortolona, extracto uitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de licíl ico/azufre, desoximetasona, diazepam, ocinonida/emoiiente, aceite mineral/aceite de ricino/na neral/aceite de cacahuate, petróleo/miristato de oralen, ácido salicílico, jabón/tribromsaian, timerosal/á ecoxib, infiiximab, cíclosporina, alefacept, efalizumab, ecrolimus, PUVA, UVB, sulfasalazina.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos oriátíca con los cuales las proteínas de unión de ! eden ser combinadas incluyen los siguientes: anercept, rofecoxib, celecoxib, ácido f ói ico, su proxen, ieflunomida, acetato de metilprednisolona, in Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos par n los cuales las proteínas de unión de la invención mbinadas incluyen los siguientes: sirolimus, paciitaxei, rolimus, Zotarolimus, acetaminofen.
Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para cuales las proteínas de unión de la invención mbínadas incluyen los siguientes: bitartrato de hidroc ecoxib, HCI de ciclobenzaprina , metilprednisolona, profen, HCI de oxicodona/acetaminofen, celecoxib, etato de metilprednisolona, prednísona, fosfato de co l de tramadoi/acetaminofen, metaxalona, tocarbamol, clorhidrato de lidocaína, diclofena bapentina, dexametasona, carisoprodol, cetorolac t ometacína, acetaminofen, diazepam, nabumetona codona, HC! de tizanidina, diclofenaco sódico/r psilato de propoxifen/apap, asa/oxicod/oxico roxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, pr denostda, dexametasona; citotóxícos, por ejemplo, lofosfamida, micofenolato mofetil, metotrexato; inhi E4 o inhibidor de síntesis de purina, por ejemplo C oteínas de unión de la invención, también pueden ser n agentes tales como suifasalazina, ácido 5-ami alazina, Imuran y agentes que interfieren con l oducción o acción de citocinas pro-inflamatorias tale r ejemplo, inhibidores de caspasa como inhibidores d nversión I L- 1 ß e I L- 1 ra . Las proteínas de unión de l mbién pueden ser utilizadas con inhibidores de señ uía T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa; o m nen por objeto moléculas de activación de célula T, p ticuerpos de la familia CTLA-4-lgG o anti-B7, anticu milia anti-PD-1. Las proteínas de unión de la inv eden ser combinadas con IL-11 o anticuerpos anti-c FR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LEN íbidores de bcl-2, ya que se ha demostrado que presión de bcl-2 en ratones transgénicos ocasiona un f us (ver arquina, Regina et al., Journal of Immunol 2(11), 7177-7185), por lo tanto se espera que la inhi ectos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pu a "cantidad terapéuticamente efectiva" o una .ofilácticamente efectiva" de una proteína de unión de l a "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a u ectiva, a dosis y durante períodos de tiempo nece rar el resultado terapéutico deseado. Una rapéuticamente efectiva de la proteína de unión terminada por un experto en la técnica y puede variar factores tales como el estado de la enfermedad, ed so del individuo, y la habilidad de la proteína de ntidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosis pueden ser ajustados para p respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta profiláctica). Por ejemplo, un bolo individual ministrado, varias dosis divididas pueden ser administr mpo o la dosis puede ser proporcionalmente rementada según sea indicado por las exigencias de rapéutica. Es especialmente ventajosa formular cor renterales en una forma de dosis unitaria para ministración y uniformidad de la dosis. La forma de do mo se utiliza aquí, se refiere a unidades físicament ecuadas como dosis unitarias para los sujetos ma rán tratados; cada unidad conteniendo una edeterminada de un compuesto activo calculada para ecto terapéutico deseado en asociación con e rmacéutico requerido. La especificación para las form veridad de la condición que va a ser aliviada. Adem tender que para cualquier sujeto particular, los regíme pecíficos deben ser ajustados con ei tiempo de acu cesidad individual y el juicio profesional de la p ministra o está supervisando la administración de la c que las escalas de dosis establecidas aquí son solo i e no pretenden limitar el alcance o práctica de la clamada.
Diagnóstico La presente descripción también proporciona apli agnóstico. Esto además se discute a continuación.
Método de Ensayo La presente descripción también proporciona un terminar la presencia, cantidad o concentración de un zima (EIA) o ensayo por inmunoabsorción ligado LISA) (por ejemplo, Quantikine ELISA assays, R& nneapolis, MN))), inmunoensayo de inhibición comp mplo, anterior y reverso), inmunoensayo de pola orescencia (FPIA), técnica de inmunoensayo mult zima (EMIT), transferencia de energía de res luminiscencia (BRET), y ensayo quimioluminiscente e. En un inmunoensayo basado en SELDI, un reactivo e específicamente une un analito (o fragmento del erés está unido a la superficie de una sonda de es siva, tal como un arreglo de circuito de proteína pre- alito (o fragmento del mismo) después es esp pturado en el bio-circuito, y el analito capturado (o fr smo) es detectado a través de espectrometr ternativamente, el analito (o fragmento del mismo) traído del reactivo de captura y detectado a través activo de inmunodiagnostico y/o en un equipo de inmu alito. La muestra de prueba puede comprender otra emás del analito de interés, tales como anticuerpos, ptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, ptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucle mplo, la muestra puede ser una muestra de sa tenida de un sujeto. Puede ser necesario o desea estra de prueba, particularmente sangre entera, sea tr inmunoensayo como se describe aquí, por ejemp activo de pre-tratamiento. Aún en casos en don tamiento no sea necesario (por ejemplo, la mayoría de orina), el pre-tratamiento opcionalmente puede ser.re mplo, como parte de un régimen en una plataforma co El reactivo de pre-tratamiento puede ser cualqui ropiada para usarse con el inmunoensayo y equ ención. El pre-tratamiento opcionalmente comprende 990), y Wallemacq eí al., Evaluation of the N closporine Assay: Comparison with TDx Monocíonal d EMIT Cyc!osporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 mo está comercialmente disponible. Además, pre ede ser realizado como se describe en la Patente de 135,875 de Abbott, Pat. Pub. Europea No. 0 471 29 ovisional de E.U.A. 60/878,017, presentada el 29 de 06, y Sol. Pat. E.U.A. Pub. No. 2008/0020401 (incorp su totalidad para sus enseñanzas con respec tamiento). El reactivo de pre-tratamiento puede ser terogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pre-tratamiento hete activo de pre-tratamiento precipita la proteína de uni or ejemplo, proteína que puede unirse a un analito o fr smo) presente en la muestra. Dicho paso de pre mprende remover cualquier proteína de unión a analit smo), tal como un anticuerpo anti-anaiito marcado (o u tigénicarnente reactivo del mismo). El reactivo de pre ipleado para dicho ensayo típicamente se diluye en l estra de prueba pre-tratada, ya sea antes o durante la primer patrón de unión específico. A pesar de dic rta cantidad del reactivo de pre-tratamiento aún sigue rmanece) en esta mezcla de muestra de prueba durante acuerdo con la invención, el patrón de unión específ ede ser una DVQ-lg (o un fragmento, una variante, o u una variante del mismo).
En un formato heterogéneo, después de que se estra de prueba a partir de un sujeto, se prepara zcla. La mezc-la contiene la muestra de prueba sien ra un analito (o fragmento del mismo) y un primer patr pecífico, en donde el primer patrón de unión específico alito contenido en la muestra de prueba forman un co pecíf ico y, opcionalmente, el segundo patrón de unión ede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica ro no limitándose a, una partícula magnética, una pe ensayo, una placa de microtitulación, una mem lécula de andamio, una película, un papel filtro, un cuito.
Después de que se forma ia mezcla que contiene primer patrón de unión específico-analito, cualquier ido es removido del complejo utilizando cualquier técni el campo. Por ejemplo, el analito no unido puede s diante lavado. Sin embargo, deseablemente, el prime ión específico está presente en exceso de cualq esente en ia muestra de prueba, de manera que tod esente en la muestra de prueba es unido a través del p unión específico.
Después de que se remueve cualquier analito n D-lg (o un fragmento, una variante, o un fragme riante del mismo) como se describe aquí.
Cualquier marca o etiqueta detectable adecuad nocido en la técnica, puede ser utilizada. Por ejempl tectable puede ser una marca radioactiva (tal como 3 , 32P, y 33P), una marca enzimática (tal como pe bano, peroxidasa alcalina, 6-fosfato deshidrogenasa d ilares), una marca quimioiuminiscente (tai como ridinio, tioésteres, o sulfonamidas; luminol, isoluminol, antridinio, y similares), una marca fluorescente oresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluore rboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, oresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de f similares)), rodamina, fico bilí proteínas, R-ficoeritri antum (por ejemplo, sulfuro de zinc-seleniuro de cadmi su extremo, una marca termométrica, o una marca de 28.1 orporan aquí para referencia en sus totalidades). Un acridinio puede ser utilizado corno una marca tectable en un ensayo de quimioluminiscencia ho terogéneo (ver, por ejemplo, Adamczyk et ai., Bioorg. tt. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. I tt. 4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. : 3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 03».
Un compuesto de acridinio preferido es una 9-carb ridinio. Los métodos para preparar 9-carboxamídas de scriben por Mattingly, J. Biolumin. Chemílumin. 6: 107-amczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); , Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 00); Mattingly et ai., en Luminescence Biotechnology: d Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Ra 965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000) Luminescence 15: 239-244 (2000); y Patente de 241,070 (cada una de las cuales se incorpora aquí par su totalidad para sus enseñanzas con respecto a lo mi talles sobre eiacridinio-9-carboxilato aril éster y tablecen en US 2008-0248493.
Se pueden realizar ensayos quimioluminíscentes ( ilizando acridinio como se describió anteriormente u ot imioluminiscentes) de acuerdo con los métodos d amczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (200 alquier formato de ensayo adecuado puede ser u imioluminómetro de microplaca (Mithras LB-940 chnologies U.S. A., LLC, Oak Ridge, TN) permite el ltíples muestras de pequeños volúmenes en forma rápi El orden en el cual la muestra de prueba y el p ión específico se agregan para formar la mezcla para e trón de unión específico. Cualquier patrón de unión e ido, ya sea marcado o no marcado, puede ser rem zcla utilizando cualquier técnica conocida en el camp ado.
Se puede generar peróxido de hidrógeno in situ en oporcionarse o suministrarse a la mezcla (por ejempl \ peróxido de hidrógeno siendo uno o más regulador ras soluciones que son conocidas por contener rógeno)antes, simultáneamente con, o después de la mpuesto acridinio antes descritos. El peróxido de hídró G generado in situ en un número de formas tales co identes para un experto en la técnica.
Después de la adición simultanea o subsecuente nos una solución básica a la muestra, se genera tectable, principalmente, una señal quimioluminiscent la presencia del analito. La solución básica contiene p cantidad de solución básica que se agregará a la muest La señal quimiolumintscente que es generado tectada utilizando técnicas de rutina conocidas p pertos en el campo. Basándose en la intensidad nerada, la cantidad de analito en la muestra antificada. Específicamente, la cantidad de analito en proporcional a la intensidad de la señal generada. La alito presente puede ser cuantificada comparando la generada con una curva estándar para el analito o n un estándar de referencia. La curva estándar nerada utilizando diluciones en serie o s ncentraciones conocidas de analito a través de es siva, métodos gravimétricos, y otras técnicas cono mpo. Aunque lo anterior se describe con énfasis en e mpuesto acridinio como el agente quimioiúminiscente, la técnica fácilmente puede adaptar esta descripción complejo inmune, el cual es denominado como un "ei general, en los inmunoensayos, uno o más anticuer r utilizados para capturar el analito (o fragmento d smo) en la muestra de prueba (estos anticu cuentemente denominados como un anticuerpo de ticuerpos de "captura") y uno o más anticuerpos ilizados para unir una marca detectable (prin antificable) al emparedado (estos anticuerpos son fre nominados como el "anticuerpo de detección", los "ant tección", el "conjugado", o los "conjugados"). De esta contexto de un formato de inmunoensayo emparedad ilizar una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un f a variante de la misma) como se describe aquí ticuerpo de captura, un anticuerpo de detección, o emplo, una DVD-lg que tiene un dominio que puede un ítopo en un analito (o fragmento del mismo) puede s imer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo ede unir un epítopo en un segundo analito (o un fr smo) puede ser utilizada como un anticuerpo de cap ticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente S o más analitos. En el caso de que un analito esente en una muestra en más de una forma, tal com noméríca y una forma dimértca/multiméríca, que momérica o heteromérica, una DVD-lg teniendo un ede unir un epítopo que solo está expuesto e noméríca y otra DVD-lg teniendo un dominio que pu ítopo en una parte diferente de una forma dimérica eden ser utilizadas como anticuerpos de captura y/o detección, permitiendo así la detección y opció antif ícación t de diferentes formas de un analito dado, pleo de DVD-lgs con afinidades diferenciales dentro d individual y/o entre DVD-lgs puede proporcionar una ternos.
Hablando en general, una muestra que es probad mplo, con sospecha de contener) anaiito (o un frá smo) puede ponerse en contacto con al menos un an ptura (o anticuerpos) y al menos un anticuerpo de d al puede ser un segundo anticuerpo de detección ticuerpo de detección o aún un anticuerpo su umerado, por ejemplo, como cuando eí anticuerpo de tección comprende anticuerpos múltiples) ya sea si cuencialmente y en cualquier orden. Por ejemplo, la ueba primero puede ponerse en contacto con al ticuerpo de captura y después (secuencialmente) con ticuerpo de detección. Alternativamente, la muestra imero puede ponerse en contacto con al menos un an tección y después (secuencialmente) con al menos un captura. En otra alternativa adicional, la muestra de p paredado, los anticuerpos, es decir, preferiblemente, a ticuerpo de captura, son utilizados en cantidades en e la cantidad máxima del analito (o un fragmento perada en !a muestra de prueba. Por ejemplo, se pue aproximadamente 5 g a aproximadamente 1 mg de an del regulador de pH (por ejemplo, regulador cubrimiento de micropartícula).
Los inmunoensayos de inhibición competitivos, los c guiar se utilizan para medir analitos pequeños ya q diante solo un anticuerpo es requerida, comprend cuenciales y clásicos. En un inmunoensayo de mpetitivo secuencia!, un anticuerpo de captura para u erés es colocado como recubrimiento en una cavidad d microtitulación u otro soporte sólido. Cuando la ntienen el analito de interés es agregado a la cavida interés se une al anticuerpo de captura. Después d vidad de una placa de microtitulación) . Sin embargo, \ ínmunoensayo de inhibición competitivo secuencíal, l analito marcado se agregar a la cavidad al mis alquier analito en la muestra compite con el analito m irse al anticuerpo de captura. Después de lavar, la señ r el analito marcado es medida y es inversamente prop ntidad de analito en la muestra.
Opcionalmente, antes de poner en contacto la uestra con al menos un anticuerpo de captura (por imer anticuerpo de captura), al menos un anticuerpo ede ser unido a un soporte -sólido, el cual facilita la se mpiejo de primer anticuerpo/analito (o un fragmento sde la muestra de prueba. El substrato al cual el a ptura se une puede ser cualquier soporte sólido adec lida que facilita la separación del complejo del an ptura-analito a partir de la muestra. roximadamente 1-10 mieras). El substrato puede co terial poroso adecuado con una afinidad de superfici ra unir antígenos y suficiente porosidad para permitir vés de anticuerpos de detección. Generalmente se terial microporoso, aunque se puede utilizar latinoso en un estado hidratado. Dichos substratos eferencia están en la forma de láminas con un roximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mm, de rededor de 0.1 mm. Aunque el tamaño de poro puede bit, de preferencia el tamaño de poro es de aprox 025 a aproximadamente 15 mieras, muy preferib rededor de 0.15 a 15 mieras. La superficie de dicho ede ser activada a través de procedimientos qu asionan el enlace covalente de un anticuerpo al substr unión irreversible, generalmente a través de adsorci erzas hidrofóbicas, del antígeno o el anticuerpo a noclonales anti-especies-específicos. Si es ne bstrato puede ser derivatizado para permitir la rea rios grupos funcionales en el anticuerpo. Dicha de quiere del uso de ciertos agentes de acoplamiento, eje ales incluyen, pero no se limitan a, anhídrido roxisuccinimida y etil-1-3-(3-dimetiíaminopropii) carb desea, uno o más reactivos de captura, tales como an gmentos de los mismos), cada uno de los cuales e ra al analito(s) puede ser unido a fases sólidas e icaciones físicas y dirigible, por ejemplo, tal cor nfíguración de biochip (ver, por ejemplo, Pat. 225,047; Sol. Int'l Pat. Pub. No. WO 99/51773; Pat. 329,209; Sol. Int'l Pat. Pub. No. WO 00/56934, y Pat. 242,828). Si el reactivo de captura se une a un pectrometría masiva como el soporte sólido, la cantida ido a la sonda puede ser detectada a través de es ptura), la mezcla se incuba con el fin de permitir la f complejo de primer anticuerpo (o anticuerpo múltiple fragmento del mismo). La incubación puede realizarse roximadamente 4.5 a aproximadamente 10.0, a una tem roximadamente 2°C a aproximadamente 45°C, y durant por lo menos aproximadamente un (1) minuto a aprox ciocho (18) horas, de preferencia de aproximada roximadamente 24 minutos, muy preferiblemente de air 18 minutos. El inmunoensayo descrito aquí puede ser c paso (lo que significa que la muestra de prueba, por l ticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo d os se agreguen secuencia! o simultáneamente a acción) o en más de un paso, tal como dos pasos, tres Después de la formación del complejo de anticuerp rimero o múltiple)/anaüto (o un fragmento del mismo), spués se pone en contacto con al menos un an n más de un anticuerpo de detección, entonces s mplejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/a gmento del mismo)/anticuerpo de detección (múltiple) anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer an ptura), cuando al menos un anticuerpo de detección ( gundo y cualquiera subsecuente) se pone en cont mplejo de anticuerpo de captura/analito (o un fra smo), se requiere de un período de incubación bajo iiares a aquellas descritas anteriormente para la fo mplejo de anticuerpo de captura (primero o múitip!e)/a gmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo eferiblemente, al menos un anticuerpo de detección c rca o etiqueta detectable. La marca detectabie puede lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, ticuerpo de detección) antes de, simultáneamente con la formación del complejo de anticuerpo de captura entes de acoplamiento que pueden ser utilizados son c técnica. Los métodos para unir una marca detec ticuerpo son conocidos en la técnica. Además, mucha iquetas detectables pueden ser compradas o sintetiza ntienen grupos finales que faciliten el acoplamiento tectable al anticuerpo, tal como CPSP-Acridinio Este rboxamida de 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3- ridinio) o SPSP-Acridinio Ester (es decir, carboxamida |fopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9).
El complejo de anticuerpo de captura ( ltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múl r, pero no tiene que ser, separado del resto de la ueba antes de la cuantificación de la marca o et emplo, si al menos un anticuerpo de captura (por ejemp ticuerpo de captura) se une a un soporte sólido, ta vidad o una perla, ia separación puede lograrse re rimero , o múltiple)/anatito (segundo o múltiple) no tie movido de la muestra de prueba para cuantif icación de la marca o etiqueta.
Después de la formación del complejo de an ptura/analito/anticuerpo de detección marcado (por mplejo del primer anticuerpo de captura/ana ticuerpo de detección), la cantidad de marca en el antificada utilizando técnicas conocidas en el campo. se utiliza una marca enzimática, el complejo marca accionar con un substrato para la marca que da u antificable tal como el desarrollo de color. Si la m rca radioactiva, la marca es cuantificada utiliza ropiados, tales como un contador de cintilación. Si a marca fluorescente, la marca es cuantificada est arca con una luz de un color (que es conocida como da de excitación") y detectando otro color (el cual sido generada usando diluciones en serie de a gmento del mismo de concentración conocida. En luga uciones en serie del anatito o un fragmento del mis tandar puede ser generada gravimétricamente, a pectroscopia masiva y a través de otras técnicas con mpo.
En un ensayo de m icropartícula quimiolumíniscente analizador ARCHITECT®, el pH del diluyente conjuga aproximadamente 6.0 +/- 0.2, el regulador de pH de re micropartícula debe ser mantenido a temperatura a cir, de aproximadamente 17 a aproximadamente 27° gulador de pH de recubrimiento de micropartícula d roximadamente 6.5 +/- 0.2, y e! pH del diluyente de mi be ser de aproximadamente 7.8 +/- 0.2. Los sólidos de n de menos de aproximadamente 0.2%, tales como roximadamente 0.15%, menos de aproximadamente 0. larizada, la luz emitida permanece altamente polarizad oróforo es restringido de la rotación entre el tiempo es absorbida y el tiempo en el que la luz es emitida, mpuesto rastreador "Ubre" (es decir, un compuesto ido a un anticuerpo) es excitado mediante luz lanzada, su rotación es mucho más rápida que el c streador-anticuerpo correspondiente producido munoensayo de unión competitivo. Los FPIAs son venta s RIAs ya que no hay substancias radioactivas que r nejo y desecho especiales. Además, los FPIAs s mogéneos que pueden ser fácil y rápidamente realizado En vista de lo anterior, se proporciona un m terminar la presencia, cantidad o concentración de a gmento del mismo) en una muestra de prueba. mprende analizar la muestra de prueba para un an gmento del mismo) a través de un ensayo (i) que empl estra de prueba para una señal generado como un recta o indirecta de la presencia, cantidad o conce alito (o un fragmento del mismo) en un control o ca líbrador es opcionalmente parte de una serie de calib nde cada uno de los calibradores difiere de los otros r la. concentración de analito.
El método puede comprender (i) poner en contacto prueba con al menos un primer patrón de unión espec alito (o un fragmento del mismo) seleccionado del nsiste de un anticuerpo, o un fragmento de un anti ede unirse a un analito, una variante de un anticuerp irse a un analito, un o un fragmento de una vari ticuerpo que puede unirse a un analito, y una DV gmento, una variante, o un o un fragmento de una smo) que puede unirse a un analito con el fin de mplejo de un primer patrón de unión específ ico/an alito que puede unirse a! anaüto, y una DVD-lg dete rcada (o un fragmento, una variante, o un fragme riante del mismo) con el fin de formar un complejo d trón de unión específ ico/analito (o un frag smo)/segundo patrón de unión específico, y (iii) de esencia, cantidad o concentración de analito en la ueba detectando la señal generada por la marca dete mplejo del primer patrón de unión específico/ana gmento del mismo)/segundo patrón de unión específico ). Como se describe aquí se puede preferir un métod r lo menos un primer patrón de unión específico (o u l mismo) y/o por lo menos un segundo patrón de unió un fragmento del mismo) es una DVD-lg (o un frag riante, o un fragmento de una variante del mismo).
Alternativamente, el método puede comprender ntacto la muestra de prueba con al menos un prime \ mismo) para unirse por lo menos a un primer patr pecífico y el cual se selecciona del grupo que con alito detectablemente marcado, un fragmento dete rcado del analito que puede unirse ai primer patró pecífico, una variante detectablemente marcada del ede unirse al primer patrón de unión específico, y u tectablemente marcado de una variante del analito irse al primer patrón de unión específico. Cualquier a gmento del mismo) presente en la muestra de prueba segundo patrón de unión específica compiten entre sí complejo de primer patrón de unión específico/an gmento del mismo) u un compiejo de un primer patr pecífico/segundo patrón de unión específico, respecti todo además comprende determinar la presencia» ncentración del analito en la muestra de prueba d diendo la señal generado por la marca detectable en estra de prueba. Si el método además comprende cacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del nde se obtuvo la muestra, el método opcionalme mprende modificar el tratamiento terapéutico/profi ctente según sea necesario para mejorar la eficacia, ede ser adaptado para usarse en un sistema automa tema semi-automatizado.
Con respecto a los métodos de ensayo (y equi smos), puede ser posible emplear anticuerpos mercialmente disponibles o métodos para la producción alito como se describe en la literatura. Los merciales de varios anticuerpos incluyen, pero no s nta Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Gen c. (San Diego, CA), y R&D Systems (RDS; Mínneapolis, Generalmente, se puede emplear un nivel predeter a benchmark contra el cual para valorar resultado sayos de sujetos de referencia (o poblaciones de alito medido puede incluir fragmentos del mismo, p gradación de los mismos, y/o productos de escisión en mismos.
En particular, con respecto a un nivel predetermina plea para verificar la progresión y/o tratamien fermedad, la cantidad o concentración de analito o u l mismo puede ser "no cambiada", "favorable" (o "fav erada"), o "desfavorable" (o "desfavorablemente levada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o co una muestra de prueba que es mayor que el nivel o es rmal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o es ma el o escala de referencia (por ejemplo, muestra muy línea de base). El término "baja" o "reducida" se re ntidad o una concentración en una muestra de pru nor que un nivel o escala típica o normal (por ejemp unos casos serán muy bajos, se puede considera mado nivel o alteración alterada ha ocurrido cu alquier cambio neto según comparado con el nivel o e normal, o nivel o escala de referencia, que no puede s través de error experimental o variación de muest ñera, el nivel medido en una muestra particular será n el nivel o escala de niveles determinados en muestr partir de un así llamado sujeto normal. En este context rmal" es un individuo sin ninguna enfermedad dét mplo, un paciente "normal" (algunas veces denomina población es uno que no exhibe ninguna enfermedad spectivamente, por ejemplo. Además, dado que el an cuentra por rutina a un alto nivel en la mayoría de l mana, un "sujeto normal" puede ser considerado como ninguna cantidad incrementada o elevada detectable concentración de analito, y un paciente o poblaci estra de prueba a un nivel más alto que lo norm ñera, entre otras cosas, la descripción proporciona ra clasificar un sujeto que tiene, o que está en riesg a enfermedad particular, trastorno o condición. El sayo también puede involucrar el ensayo de otros m ilares.
Por consiguiente, los métodos descritos aquí tam r utilizados para determina si un sujeto tiene o no o e sgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o con pecíf icamente, dicho método puede comprender los pas (a) determinar la concentración o cantidad en una ueba de un sujeto, de un analito (o un fragmento del mplo, utilizando los métodos descritos aquí, o l noctdos en la técnica); y (b) comparar la concentración o .cantidad del a gmento del mismo) determinada en el paso (a) c gresión de la enfermedad en un sujeto. Opcionalment mprende los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de an estra de prueba de un sujeto; (b) determinar la concentración o cantidad de u a última muestra de prueba de! sujeto; y (c) comparar la concentración o cantidad de an terminada en el paso (b) con concentración o cantida terminada en el paso (a), en donde si la concentració terminada en el paso (b) no cambio o es desfavorabl mpara con la concentración o cantidad de analito dét paso (a), entonces la enfermedad en el sujeto se de ne ha continuado, proseguido o empeorado. En compa ncentración o cantidad de analito, según determinada ), es favorable cuando se compara con la concentració analito, según determinada en el paso (a), e sfavorablemente alterada con respecto al nivel predete Aún más, los métodos pueden ser utilizados para tamiento en un sujeto que recibe el tratamiento con mposiciones. Específicamente, dichos métodos oporciona.r una primera muestra de un sujeto antes d ya administrado una o más composiciones far seguida, la concentración o cantidad de analito en estra de prueba de un sujeto se determina (por ejempl s métodos descritos aquí o como es conocido en spués de que se determinó la concentración o cantidad cionalmente después se compara la concentración o alito con un nivel predeterminado. Si la concentración analito, según determinada en la primera muestra de nor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto n n una o más composiciones. Sin embargo, si la conc ntidad de analito, según determinada en la primera isposiciones farmacéuticas, después se obtienen bsecuentes muestras de prueba del sujeto. El número prueba y ei tiempo en el cual dichas muestras de tienen del sujeto no son críticos. Por ejemplo, u estra de prueba puede ser obtenida siete (7) días des sujeto se le administró por primera vez una o mposiciones farmacéuticas, una tercera muestra de pr r obtenida dos (2) semanas después de que al sujeto p ministró una o más de las composiciones farmacé arta muestra de prueba puede ser obtenida tres ( spués de que al sujeto se le administró primero una isposiciones farmacéuticas, una quinta muestra de pr r obtenida cuatro (4) semanas después de que al s ministró primero una o más de la composiciones far e.
Después de que se obtiene cada segunda o ntidad de anaiiío, según determinada en el paso (c) ando se compara con la concentración o cantidad de an terminada en el paso (a), entonces se determi fermedad en el sujeto ha terminado, ha regresado o ha sujeto se le debe continuar administrando una o mposiciones farmacéuticas del paso (b). Sin emb ncentración o cantidad de analito, según determinada ) no cambia o no es favorable cuando se comp ncentración o cantidad de analito, según determinada ), entonces se determina que la enfermedad en el suje osigue o empeora, y el sujeto debe ser tratad ncentración más alta de una o más de las co rmacéuticas administradas al sujeto en e! paso (b) o el r tratado con una o más de las composiciones que so una o más de las composiciones farmacéuticas admi jeto en el paso (b). Específicamente, el sujeto puede r obtenida minutos, horas, días, semanas o años des ha obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. segunda muestra de prueba puede ser obtenida de! riodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproxím nutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente roxímadamente 60 minutos, aproximadamente roxímadamente 3 horas, aproximadamente roxímadamente 5 horas, aproximadamente roxímadamente 7 horas, aproximadamente roxímadamente 9 horas, aproximadamente roxímadamente 11 horas, aproximadamente roxímadamente 13 horas, aproximadamente roxímadamente 15 horas, aproximadamente roxímadamente 17 horas, aproximadamente roxímadamente 19 horas. aproximadamente roximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 roximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 roximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 roximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 roximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 roximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 roxímadamente 23 semanas, aproximadamente 24 roximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 roximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 roximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 roximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 roximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 roximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 roximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 roximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 roximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 roximadamente 5.5. años, aproximadamente roximadamente 6.5 años, aproximadamente roximadamente 7.5 años, aproximadamente roximadamente 8.5 años, aproximadamente roximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años e la primera muestra de prueba se obtuvo del sujeto.
Cuando se utiliza para verificar la progresión de la ensayo anterior puede ser utilizado para verificar la pr enfermedad en sujetos que padecen de condiciones ndiciones agudas, también conocidas como condiciones íticas, se refieren a enfermedades aguas, que ponen e a u otras condiciones médicas críticas que invo emplo, el sistema cardiovascular o sistema de picamente, las condiciones de cuidado críticas se uellas condiciones que requieren de intervención médi hospital (incluyendo, peto no limitándose a, salas de roxímadamente 2 horas, aproximadamente roximadamente 4 horas, aproximadamente roximadamente 6 horas, aproximadamente roximadamente 8 horas, aproximadamente roximadamente 10 horas, aproximadamente roximadamente 12 horas, aproximadamente roximadamente 14 horas, aproximadamente roximadamente 16 horas, aproximadamente roximadamente 18 horas, aproximadamente roxímadamente 20 horas, aproximadamente roximadamente 22 horas, aproximadamente roximadamente 24 horas, aproximadamente roximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aprox días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 sayo inicial asimismo es generalmente realizado en u mpo más corto, por ejemplo, minutos, horas o días del udas, generalmente se realiza la verificación repetit rco de tiempo más largo, por ejemplo, horas, días, os (por ejem pío, 1 hora, aproximadamente roximadamente 3 horas, aproximadamente roximadamente 5 horas, aproximadamente roximadamente 7 horas, aproximadamente roximadamente 9 horas, aproximadamente roximadamente 11 horas, aproximadamente roximadamente 13 horas , aproximadamente roximadamente 15 horas, aproximadamente roximadamente 17 horas, aproximadamente roximadamente 19 horas, aproximadamente roximadamente 21 horas, aproximadamente roximadamente 23 horas, aproximadamente roximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aprox días, aproximadamente 5 días, aproximadament roximadamente 19 aproximadamente 20 roximadamente 21 aproximadamente 22 roximadamente 23 aproximadamente 24 roximadamente 25 aproximadamente 26 roximadamente 27 aproximadamente 28 roximadamente 29 aproximadamente 30 roximadamente 31 aproximadamente 32 roximadamente 33 aproximadamente 34 roximadamente 35 aproximadamente 36 roximadamente 37 aproximadamente 38 roximadamente 39 aproximadamente 40 roximadamente 41 aproximadamente 42 roximadamente 43 aproximadamente 44 roximadamente 45 aproximadamente 46 roximadamente 47 aproximadamente 48 roximadamente 49 aproximadamente 50 roximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 sayo inicial asimismo en general se realiza dentro de mpo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, años del inicio de la enfermedad o condición.
Además, los ensayos anteriores pueden ser lizando una primera muestra de prueba obtenida de u nde la primera muestra de prueba se obtiene de una mo orina, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayo spués pueden ser repetidos utilizando una segunda ueba obtenida del sujeto, en donde la segunda muestr obtiene de otra fuente. Por ejemplo, si la primera ueba se obtuvo de orina, la segunda muestra de prueb tenida de suero o plasma. Los resultados obtenidos de ilízando la primera muestra de prueba y la segunda ueba pueden ser comparados. La comparación puede ra determina el estado de una enfermedad o cond De esta manera, en modalidades particulares, la mbién proporciona un método para determinar si un ne, o está en riesgo de una enfermedad dada, ndición es candidato para terapia. Generalmente, el s e ha experimentado algún síntoma de una enfermedad, ndición dada, o quien en realizada ya ha sido diagn ner, o estar en riesgo de tener, una enfermedad, ndición dada, y/o quien demuestra una concentración sfavorable de analito o un fragmento del mismo, como uí .
El método opcionalmente comprende un ensayo scribe aquí, en donde el analito es analizado antes y tamiento de un sujeto con una o más composiciones fa or ejemplo, en particular con un farmacéutico relación canismo de acción que involucra al analito), con munosupresión, o a través de terapia de inmunoa ciente.
No se puede finalizar sin decir que, aunq dalidades de la presente son ventajosas cuando se er forar una enfermedad, trastorno o condición dada com uí, los ensayos y equipos pueden ser empleados par alito en otras enfermedades, trastornos y condiciones ensayo también puede involucrar el ensayo de otros m ilares.
El método de ensayo también puede ser util entificar un compuesto que mitigue o mejore una storno o condición dada. Por ejemplo, una célula que alito puede ponerse en contacto con un compuesto c el de expresión del analito en la célula en cont mpuesto, puede ser comparado con aquel de una célul ilizando el método de ensayo descrito aquí. mposición que comprende una DVD-lg anti-analito (.o u a variante, o un fragmento de una variante del mismo) cionalmente inmovilizado sobre una fase sólida.
El equipo puede comprender por lo menos un comp alizar la muestra de prueba para un analito a munoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de mí imioluminiscente, e instrucciones para analizar la ueba para un analito a través de inmunoensayo, p munoensayo de micropartícula quimioluminiscente. Por uipo puede comprender por lo menos un patrón de unió ra un analito, tal como un anticuerpo noclonal/polic!onal (o un fragmento del mismo que pue alito, una variante del mismo que puede unirse a! a gmento de una variante que puede unirse a! analito) o ti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragm riante del mismo), cualquier de los cuales irse at analito) o una DVD-lg anti-analito (o un frag riante, o un fragmento de una variante del mismo), cual ales puede ser inmovilizado sobre un soporte sólido ede comprende un calibrador o control, por ejem slado o purificado. El equipo puede comprender por l ntenedor (por ejemplo, tubo, placas de microtitulación eden ya ser recubiertas con un primer patrón de unión r ejemplo) para conducir el ensayo, y/o regulador de p regulador de pH de ensayo o un regulador de pH alquier de los cuales puede ser provisto como u ncentrada, una solución de substrato para la marca det emplo, una marca o etiqueta enzimática), o una soluci preferencia, el equipo comprende todos los comp cir, reactivos, estándares, reguladores de pH, d i I u yent ales son necesarios para realizar el ensayo. Las i eden estar en forma de papel o en forma legible por c ropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
Opcionalmente, el equipo incluye componentes de lidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibrados sitivos). La preparación de reactivos de control de cali nocida en la técnica y se describe en hojas anexa riedad de productos de inmunodiagnósttco. Opcion ilizan miembros de panel de sensibilidad para ractertsticas de funcionamiento del ensayo, cionalmente son indicadores útiles de la integrid activos de equipo de inmunoensayo, y la estandariza sayos.
El equipo también opcionalmente puede incluir otr ra conducir un ensayo de diagnóstico o facilitar eval ntrol de calidad, tales como reguladores de pH, sale -factores enzimáticos, substratos enzimáticos, re tección, y similares. En el equipo también se inc mplo, una placa de microtitulación. El equipo ade cluir contenedores para mantener o almacenar una m mplo, un contenedor o cartucho para una muestra ando es apropiado, el equipo opcionalmente tam ntener vasos de reacción, vasos de mezclado mponentes que facilitan la preparación de reactivos o prueba. El equipo también puede incluir uno o más i ra asistir a la obtención de una muestra de prueba, t ringa, pipeta, fórceps, cuchara medidora, o similares.
Si la marca detectable es por lo menos un co ridinio, el equipo puede comprender por lo menos una rboxamida, por lo menos un acridinio-9-carboxilato a alquier combinación de los mismos, si la marca detect menos un compuesto de acridinío, el equipo tam mprender una fuente de peróxido de hidrógeno, t guiador de pH, una solución, y/o al. menos una solució mo se describe aquí, puede ser adaptado para usa riedad de sistemas automáticos o semi-automáticos uellos en donde !a fase sólida comprende una míe mo se describe en, por ejemplo, Patentes de 089,424 y 5,006,309, y como se vende comercial emplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, CHITEC®.
Algunas de las diferencias entre el sistema automá tomático, según comparado con un sistema no auto empio, ELISA), incluyen el substrato al cual el prime íón específico (por ejemplo, un anticuerpo noclonal/policlonaí) (o un fragmento del mismo, una smo, o un fragmento de una variante del mismo) o ti-analito (o un fragmento del mismo, una variante del gmento de una variante dei mismo) se une; de cualqu rmación de emparedado y reactividad del analito mo ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, activo de conjugado, durante un tiempo de lativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente rmato automático o semi-automático (por ejemplo, A ede tener un tiempo de incubación relativamente má mplo, aproximadamente 4 minutos para ARCHITEC®).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratori ro no se limitan a, AxSYM®, IMx® (ver, por ejemplo, . 5,294,404, la cual se incorpora aquí para refere talidad), PRISM®, EIA (perla), y Quantum™ II, así ataformas. Además, los ensayos, equipos y componente eden ser empleados en otros formatos, por e ectroquímicos u otros sistemas de ensayo independi nto de cuidado. La presente descripción, por ejemplo, sistema de inmunoensayo electroquímica Abbott Po mercial (i-STAT®, Abbott Laboratories) que realiza inm a 1 i t o para el sistema l-STAT®, se prefiere la nfiguración. Un chip de silicio micro-fabricado se fab r de electrodos de trabajo amperométricos de oro y u referencia de plata-cloruro de plata. En una de los el bajo, perlas de poliestireno (diámetro 0.2 mm) con anti alito inmovilizado, monoclonal/policlonal (o un fra smo, una variante del mismo, o un fragmento de una smo) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento del riante del mismo, o un fragmento de una variante del hieren a un recubrimiento de polímero de alcohol polivi electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho l-ST rmato de fluido adecuado para inmunoensayo. Una o red de la cámara de soporte de muestra del cartucho e comprende un patrón de unión específico para un rno anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o u l mismo, una variante del mismo, o un fragmento de trón de unión específico para un analito se ha dis estra, un elemento de bomba dentro del cartucho estra hacia un conducto conteniendo el chip. Aquí, se ra promover ta formación del emparedado. En el pen \ ensayo, el fluido es forzado fuera de la bolsa y hacia ra sacar por lavado la muestra del chip y hacia una sperdício. En el paso final del ensayo, la marca o sfatasas alcalina reacciona con fosfato de p-amin sdoblar el grupo fosfato y permitir que el p-aminofe a electroquímicamente oxidado en el electrodo sándose en la corriente medida, el lector es capaz de ntidad de anatito en la muestra a través de un a!goritr curva de calibración determinada por fábrica.
Si no puede terminar sin antes decir, que tos uipos descritos aquí necesariamente abarcan otros todos para realizar el inmunoensayo. Por ejemplo, strativo es un diíuyente de calibrador humano ipleado en ciertos equipos (Abbott Laboratories, Abbo cual comprende un regulador de pH conteniendo ME a bloqueador de proteína, y un agente antimicrobia mo se describe en la Solicitud de Patente de /142,048 presentada el 31 de Diciembre del 2008, tener la generación de una señal mejorada, por eje rmato de cartucho l-Stat, utilizando una secuenci cleico enlazada al anticuerpo de señal como un amp ñal.
Será evidente para aquellos expertos en la técnic dificaciones y adaptaciones adecuadas de los mét vención aquí descritos son obvias y pueden hacers utvalentes adecuados sin apartarse del alcance de la s modalidades descritas aquí. Habiendo ahora descrito vención con detalle, la misma será más clarament EJE PL1FICACION emplo 1:Piseño, Construcción y Análisis de una DVD emplo 1.1: Ensayos Utilizados para Identificar y ticuerpos Parentales y DVD-lg Se utilizaron los siguientes ensayos a través de l ra identificar y caracterizar anticuerpos parentales y nos que se establezca otra cosa. emplo 1.1.1: Ensayos Utilizados para Determinar inidad de Anticuerpos Parentales y DVD-lg para su ietivo emplo 1.1.1A: ELISA de Unión Directa Los Ensayos por Inmunoabsorción Ligados a En asificar anticuerpos que unen un antígeno objetivo alizaron como sigue. Placas de ELISA de unión super adición de 300 pL/cavidad de solución de bloqueo (po grasa, varios proveedores al menudeo, diluido a 2 rante ½ hora temperatura ambiente. Las placas se lav ces después e bloquear con PBS conteniendo 0.02% T Alternativamente, cien microlitros por cavidad de tigeno objetivo deseado marcado con Histidina stems, Minneapolis, MN) se agregaron a placaste ELI n anticuerpo anti-poli-Histídina de ratón monoclon scribió anteriormente y se incubaron durante 1 hora a biente. Las cavidades se lavaron cuatro veces nteniendo 0.02% Tween 20.
Cien microlitros de preparaciones de anticuerp luidas en una solución btoqueadora como se teriormente se agregaron a la placa de antígeno objet antígeno objetivo deseado/placa de fusión FC o l ticuerpo anti-poli-Histidina/antígeno objetivo deseado i njugado con HRP específico de cadena ligera IgG- mano de cabra (Southern Biotech # 2060-05 Birming regaron a cada cavidad de la placa de antíge seado/fusión FC y se incubaron durante 1 hora a biente. Las placas se lavaron 4 veces con PBS contení een 20.
Cien microlitros de una solución T B mejorada (N 08177, K Blue, Lexington, KY) se agregaron a cada C cubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. detuvo a través de la adición de 50 µ? de 1N ácido s acas se leyeron espectrofotométricamente a una longit 450 nm.
El Cuadro 3 contiene una lista de los antígenos utili sayo de Unión Directa.
El Cuadro 4 contiene los datos de unión expresados ra aquellos anticuerpos y construcciones de DVD-lg pro tígeno objetivo en otros formatos de ELISA, tales c acore o bioensayo. La no unión de una DVD-lg también ustarte la longitud del enlazador entre dos dominios var D-lg, como se mostró previamente. adro 3: Antíqenos Utilizados en ELISA de Unión Pir fusión de región Fe La unión de todas las construcciones de DVD se m mparable con aquella de anticuerpos parentales. minios variables N-terminales con una alta afinidad sim ticuerpo parental así como los dominios variables C-te nstrucciones DVD. DVD289, DVD291, DVD294 y DVD29 tes de uso. Las placas se bloquearon a través de la 5 L/cavidad de solución de bloqueo durante mperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces oquear con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Se diluyeron anticuerpo o DVD-lgs en 100 ng/ L A al 0.5% y se diluyeron en serie 1:3. Se agr crolitros de preparaciones de anticuerpo o DVD-lg a l cubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las C varon tres veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Se agregaron 200 microlitros de POD anti-hum 5000 a cada cavidad de la placa y se incubaron duran imperatura ambiente. Las placas se lavaron tres vec nteniendo 0.02% Tween 20.
Se agregaron 100 microlitros de una solución de vidad y se incubaron durante 10 minutos. Las solución eparó mezclando 20 mi de 100 mM acetato de natrio, adro 5. ELISA de ?ß 1-42 de Anticuerpos Pa nstrucciones DVD La unión de todas las construcciones DVD se ma n 100 pL/cavidad de 2 g/ml de globulómero ?ß 20-4 S durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon vidad de 100% de regulador de PBS de súper-bloq ientific, #37515) y se incubaron durante 45 minutos a biente. Las placas se lavaron tres veces después de b S conteniendo 0.02% Tween 20.
Se diluyeron el anticuerpo o DVD-Igs a 2000 ng/m!s 0 ng/ml, 40 ng/ml, 8 ng/ml, 1.6 ng/ml y 0.32 ng/ml en s 10% en PBS. Se agregaron 100 microlitros de prepa ticuerpo o de DVD-lg a la placa por triplicado y s rante 2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades neo veces con PBS conteniendo 0.02% Tween 20.
Se agregaron 100 microlitros de anticuerpo conjug ti-humano de cabra (Pierce #31412) diluido 1:40, 0 vidad de la placa y se incubaron durante 30 minutos a biente. Las placas se lavaron cinco veces con PBS adro 6: ELISA de ?ß 20-42 de Anticuerpos Pa nstrucciones DVD La unión de todas las construcciones DVD se ma mparable a anticuerpos parentales. emplo 1.1.1.D: ELISA de Captura Se incubaron placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Ro rante la noca de 4°C con anticuerpo Fe anti-humano S, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Las varon tres veces en regulador de pH de lavado (PBS 05% Tween 20), y se bloquearon durante 1 hora guiador de pH de bloqueo (PBS conteniendo 1% color, la reacción se detuvo con 1N HCI y se midió la 450 nM. Los resultados se muestran en el Cuadro 7. empfo 1.1.1.E: Determinación de Afinidad cnología BIACORE adro 7: Reactivo utilizado en Análisis Biacore Dominio Extracelular antígeno/proteína de fusión de dominio IgG Fe / mM EDTA, y 0.005% agente tensoactivo P20) a 25°C ímicos se obtuvieron de Biacore® AB (Uppsala, Sueci ñera de una fuente diferente como se describe en e mplo, aproximadamente 5000 RU de IgG anti-ratón de ticuerpo poitclonal de fragmento específico (Pierce Bi c, Rockford, IL) diluidos en 10 mM acetato de sodio movilizaron directamente a través de un chip de biosen investigación CM5 utilizando un equipo de acoplamien acuerdo con las instrucciones y procedimientos del pg/ml. Las porciones sin reaccionar en la superficie d bloquearon con etanolamina. Se utilizó una su rboximetil-dextrana modificada en célula en flujo perficie de reacción. Se utilizó carboximetil-d dificada sin IgG anti-ratón de cabra en célula en flujo superficie de referencia. Para análisis cinético, las ec locidad derivadas del modelo de unión Langmuir 1:1 ntinuo de 25 µ?/minuto. Las constantes de velocidad ciendo mediciones de unión cinéticas a diferentes con antígeno variando de 10 - 200 nM. La constante de di uilibrio (M) de la reacción entre anticuerpos o D tígeno objetivo se calculó después a partir de las co locidad cinéticas mediante la siguiente fórmula: KD = ión se registra como una función de tiempo y nstantes de velocidad cinéticas. En este ensayo, las acción tan rápidas como 10eM" s"1 y las velocidades si jas como 10"6s~1 pueden ser medidas. adro 8: Análisis de BIACORE de Anticuerpos P nstrucciones DVD nticuerpo Dominio Dominio K0n arentai o Variable N- Variable C-D DVD-lg Termínal Terminal (fVMs-1) <s-1) B017 TNF 3.37E+06 9.57E-05 La unión de todas las construcciones de DVD-lg ca r fa tecnología Biacore se mantuvo y fue comparable anticuerpos parentales. Todos los dominios variables unieron con una alta afinidad similar como el anticuerp emplo 1.1.2: Ensayos usados para Determinar la ncional de Anticuerpos Parentales y DVD-lg emplo 1.1.2. A: Bioensavo de Citocina La habilidad de una anti-citocina o un anticuerpo ctor de anti-crecimiento o DVD-lg conteniendo secuencí ti-citocina o anti-crecimiento para inhibir o neut oactividad de citocina o factor de crecimiento terminando el potencial inhibidor del anticuerpo o emplo, la habilidad de un anticuerpo anti-IL-4 par oducción de I g E mediada por lL-4 puede ser utilizada. aislaron células B naturales humanas a partir ltivo a 37°C y en presencia de C02 al 5%. Se prepar r anticuerpo para la prueba, consistiendo de 3 cavi a de controles no inducidos e inducidos y repet adruplicado de titulaciones de anticuerpo empezando rriendo una dilución por triplicado a 29 ng/nl de concen regados en 50 µ? de pre-dilución cuatro veces conce ducir la producción de IgE, se agregaron a cada cavid ng/ml más anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Nova iza) a concentraciones finales de 0.5 pg/ml, y las conc IgE se determinaron al final del período de cultivo a t todo de ELISA de emparedado estándar. emplo 1.1.2.B: Ensayo de Liberación de Citocina Se analizó la habilidad de un anticuerpo parentai o asionar la liberación de citocina. Se sacó sangre perif nadores saludables a través de una venopunción licional como anticuerpo de control negativo. El exp alizó por duplicado. Las placas se incubaron a 37°C a spués de 24 horas, los contenidos de las ca nsfirieron a tubos de ensayo y se hicieron girar durant 1200 rpm. Los sobrenadantes libres de célula se reco ngelaron para ensayos de citocina. Las células qu bre las placas y en los tubos se Usaron con 0.5 mi de is, y se colocaron a -20°C y se descongelaron. Se ag I del medio (para llegar a un volumen al mismo niv uestras de sobrenadante libre de célula) y las prepa lula se recolectaron y se congelaron para ensayos de brenadantes libres de célula y los lisatos de célula s ra niveles de citocina a través de ELISA, por ejemplo, IL-8, IL-6, IL-?ß, IL-1RA, o TNF-a. empfo 1.1.2.C: Estudio de Reactividad Cruzada d ncentración de 25 Mg/ml, diluido en acetato de sodio, ectó a través del biosensor activado y las aminas oteína se unieron directamente a los grupos carboxil picamente, se inmovilizaron 5000 Unidades de Resona S EDC-ésteres de matriz sin reaccionar se desactivar I una inyección de 1 M etanolamina. Se preparó una seg flujo como un estándar de referencia inmoviliza mana utilizando el equipo de acoplamiento de amina e alizaron mediciones de SPR utilizando el chip de bio dos los antígenos que se analizarán en la superficie d diluyeron en reguiador de pH de corrida de HBS-EP 0 al 0.01%.
Para examinar la especificidad de unión de citocina exceso de citocina de interés (100 nM, por ejemp combinante soluble) a través del anticuerpo parental an perficie de biosensor inmovilizada con DVD-lg (tiempo ??, de otra forma se inyectó regulador de pH de corri trices. Simultáneamente, también se inyectaron citocin -1a, IL-?ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, JL-9, I -12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-2 , TNF-a, TNF-ß, y IFN-?, por ejemplo) sobre la s ferencia lgG1/K de ratón inmovilizada para regístra tecedente de unión específica. Al preparar una s ferencia y de reacción, Biacore automáticamente s tos de superficie de referencia de los datos de s acción con el fin de eliminar la mayoría del cambio d fracción y ruido de inyección. De esta manera, terminar la verdadera respuesta de unión atribuida a u unión de anticuerpo antí-citocina o DVD-lg.
Cuando una citocina de interés se inyecta a tr ticuerpo antí-citocina inmovilizado, se observó portante. La regeneración con 10 mM de HCI co ticuerpo o DVD-lg. Se seleccionaron anticuerpos o D ión esperada a la citocina de .interés y no unión a cu ocina. emplo 1.1.2.D: Reactividad Cruzada de Tejido Se realizaron estudios de reactividad cruzada de te apas, la primera etapa incluyendo crio-secciones de 3 gunda etapa incluyendo hasta 38 tejidos, y la te cluyendo tejidos adicionales de 3 adultos no relacionad scribe más adelante. Los estudios se realizaron típica veles de dosis.
Etapa 1: se fijaron crio-secciones (aproximadam tejidos humanos (32 tejidos (típicamente de: glánd cto gastrointestinal, próstata, vejiga, corazón quelético, células de la sangre o hematocitos, riñon, ea, hígado, médula espinal, mama, pulmón, cere estino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, giándu ario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periféric centa, próstata, glándula salival, piel, intestino delg pinal, bazo, estómago, músculo estriado, testíc iígdala, uréter/ vejiga urinaria, y útero) de 3 acionados obtenidos mediante autopsia o bíopsia) y bre un objeto de vidrio. Se realizó tinción con peroxi cciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-bioti Etapa 3: se fijaron crio-secciones (aproximadam tejidos de mono cínomolgo (38 tejidos (incluyen ngre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cere ófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, p fático, glándula mamaria, ovario, oviducto, páncreas, rvio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula estino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músc stículos, timo, amígdala, uréter, vejiga urinaria, y accionar durante 30minutos con un equipo de avi roxidasa. Subsecuentemente, se aplicó D aminobencidina), un substrato para la reacción de rante 4 minutos para la tinción de tejido. Se utilizaro tígeno-Sepharose como secciones de tejido de contr s estudios de bloqueo de antígeno objetivo y de su vieron como controles adicionales. El complejo in ncentraciones de 2 y 10 Mg/ml de anticuerpo o DV cubó con antígeno objetivo (concentración final de 1 ero humano (concentración final 10%) durante 30 spués se agregaron sobre las secciones de tejido en rio y después las secciones de tejido se hicieron rante 30 minutos con un equipo de avidina-biotina bsecuentemente, se aplicó DAB (3,3'-diaminoben bstrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 min ción de tejido. emplo 1.1.2.E: inhibición de Prol iferación/S uper VEC a través de Construcciones de Anticuerpo Pare N Antes de la colocación en placas para el ntuvieron células endoteliales vasculares umbilical rmales o HUVEC (pasaje 2-6) en EBM-2 (Lonz alkersville, MD) suplementado con EGM-2 SingleQu onetics, Walkersville, MD, #CC-4176). Las células locaron en placas a 10,000 células/cavidad sobre pl vidades negras cubiertas con colágeno en EMB-2 (100 0.1% en ausencia de factores de crecimiento. Al día s dios se reemplazaron con FBS al 0.1% en ausencia de ecimiento. Al día siguiente el medio se reemplazó co B-2 (sin factores de crecimiento o suero) y se inc atro horas antes de la adición de VEGF y anticuerpos/D ticuerpos monoclonales anti-VEGF o DVD-lgs (a con emplo 1.1.2.F: Bioensayo de lL-?a/ß y Ensayo de Neu Se colocaron en placas células MRC5 a 1.5-2 x 104 vidad en un volumen de 200 pL y se incubaron durant e, 5% C02- Se preparó una solución de material de tr /ml de anticuerpo (4x concentrada) en un medio compl realizó una dilución de ocho puntos en serie (5 p /ml) en EM completo en placas de dilución de regaron 65 pL/cavidad de cada dilución de anti adriplicado a una placa de fondo con forma de v de 9 ostar #3894) y también se agregaron 65 pL de una solu /ml de IL-1a o I L - 1 ß ó 65 pL de una solución mixta a solución de 50 pg/ml tanto de IL-1 como de vidades de control recibieron 65 pL de 200 pg/ml de I 50 pg/ml de IL-?a/ß mixto (4x concentrado) más 65 p M y las cavidades de control de medio recibieron dio. Después de una hora de incubación, se agregaro porcentaje de inhibición con relación a IL-?a, I L - 1 ß , lo de control de IL-a/ß. Los resultados se muestran adro 9: Ensayo de Neutralización IL-?ß con rental iL-?ß v Construcciones DVP-ig Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB032 y sición N-terminal o C-terminal mostraron neutraliz sayo de neutralización de MCR5 lL-??a/ß. 3 en serie. El huTNFa se diluyó a 400 pg/ml en e sayo. Se agregó la muestra de anticuerpo (200 pL) 00 pL) en un esquema de dilución de 1:2 y se dejó incu 5 horas a temperatura ambiente.
La solución de DVD-lg™/huTNFa se agregó a las c aca a 100 pL para una concentración final de 100 pg/ml 25 nM - 0.00014 nM DVD-ig™. Las placas se incubaron ras a 37°C, 5% C02. Para cuantificar la viabilidad, se 0 pL de las cavidades y se agregaron 10 pL del rea oche cat# 11644807001). Las placas se incubaron de a ndiciones del ensayo durante 3.5 horas, se centrifugar se transfirieron 75 pL del sobrenadante a una plac ostar cat# 3369). Las placas se leyeron a =D 420-60 ctor de placa Spectromax 190 ELISA. Los res oporcionan en el Cuadro 10.
\D291 TNF RG a 0.248 \D295 RAGE TNF VD296 TNF RAGE 0.158 VD289 TNF EGFR (sec.1) 0.122 Todas las DVD-lgs conteniendo VDs de AB017 ya sición N-terminal o C-ternninal mostraron neutraliza sayo de neutralización de TNF a. mplo 1.1.2.H: Ensayo de pSTAT3 inducido por lL-6 Se cultivaron células TF-1 en DMEM con 2 m de 1 mM HEPES, 100 U/ml de Pen/strep, 1.5 g/l de bic d io , 4.5 g/l de glucosa, 1 mM de piruvato de sodio, FBS /ml de GM-CSF. Las células se colocaron en placas a lulas por cavidad en un volumen de 10 µ? y se incuba noche a 37°C, 5% C02 en medio de ensayo (DME nos GM-CSF). Las células se colocaron en placas en u ncentración) preparado con medio de ensayo. Se a da cavidad, 5 pL/cavidad de los 100 ng/ml de IL-6. La ubaron durante 30 minutos a 37°C. Las células regando 5 pL de 5X regulador de pH de célula a vidades y las placas se agitaron durante 10 minutos a biente. Las placas se congelaron a -20°C y se corri TAT3 SureFíre (Perkin Elmer).
La placa se descongeló a temperatura ambiente y se cada cavidad, 30 pL/cavidad de Regulador de pH de r a mezcla de Regulador de pH de Activación conteniend eptor Alpha Screen Acceptor Bea.ds (40 partes de regu reacción, 10 partes de regulador de pH de activación rlas de aceptor). La placa se selló con hoja de al otegerla de la luz y se agitó moderadamente durant °C. Se agregó» a cada cavidad un regulador de pH 2.5 pL/cavidad) conteniendo las perlas Donadoras Al lbecco con BSA al 0.1%), 20 L, se agregaron a célula manas a concentraciones finales de 0.01 pg/ml - 10 0 [ÍL. Las placas se incubaron a 37°C en una atmós 2, humedecida durante 3 días. El número de células vi idad se cuantificó utilizando reactivos MTS de acue trucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para porcentaje de inhibición de crecimiento de tumor. La utilizaron sin tratamiento de anticuerpo como controle ibición mientras que las cavidades sin células se co straron un 100% de inhibición. empio 1.1.2.J: Efecto Tumoricida de un Anticuerpo D-lg In Vitro Los anticuerpos parentales o DVD-lg que se unen jetivo en células tumorales pueden ser analizados pa moricida. En resumen, los anticuerpos parentales o ibición, mientras que las cavidades sin células se co straron un 100% de inhibición.
Para la valoración de apoptosis, se determinó la a spasa-3 a través del siguiente protocolo: células tr icuerpo en placas de 96 cavidades se lisaron en 12 guiador de pH de Itsis (1.67 mM Hepes, pH 7.4, 7 mM K CI2. 0.11 mM EDTA, 0.11 mM EGTA, 0.57% CHAPS, 1 bleta de coctel de inhibidor de proteasa; libre de E armaceuticals, Nutley, NJ) a temperatura ambiente c rante 20 minutos. Después de la lisis de célula, se agr un regulador de pH de reacción de caspasa-3 (48 mM 5, 252 mM sacarosa, 0.1% CHAPS, 4 mM DTT, y bstrato Ac-DEVD-AMC; Biomol Research Labs, Inc. etíng, PA) y las placas se incubaron durante 2 horas cas se leyeron en un Contador de Etiquetas Múl CTOR (Perkin Elmer Life Sciences, Downers, Grove, I un medio RPMI suplementado con suero de bovino fe incubaron a 37°C, 5% C02 durante la noche. Al día s uías se trataron con diluciones en serie de anticuerp 013 nM a 133 nM de escala de dosis), y se incubaron a atmósfera de 5% C02, humedecida durante 5 días. pervivencia/proliferación de célula indirectamente va eles de ATP utilizando un equipo ATPIite (Perkin Elme ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. enripio 1.1.2. L: Anticuerpo Parentai VEGF y Con D-lg Evita la Interacción de VEGFi con VEGFR1 Se incubaron placas de ELISA (Nunc, MaxiSorp, Roc rante la noche a 4°C con 100 µ? de PBS conteniendo íón de dominio Fe extracelular de VEGFR1 recombinan D Systems, Minneapolis, MN). Las placas se lavaron tr uiador de pH de lavado (PBS conteniendo 0.05% Twe s veces, y se agregaron, por cavidad, 100 µ? de ISA (Pierce, Rockford, IL). Después del desarrollo cción se detuvo con 1 N HCI y se midió la absorbancia enripio 1.1.2.M: Inhibición de Fosforilación de Recept Anticuerpos Parentales o Construcciones DVD-lq In Se colocaron en placas células de carcinoma human 96 cavidades a 40,000 células/cavidad en 180 µ? de suero (DMEM + BSA al 0.1%), y se incubaron durante °C, 5% C02. Las placas de Costar El A (Lowell, MA) S n 100 µ?/cavidad de Ab de captura de recepto ncentración final), y se incubaron durante la noche a ibíente mientras se agitaba. Al día siguiente, las placa biertas con anticuerpo receptor se lavaron (tres veces 5% Tween 20 en PBS, pH 7.2 - 7.4), y se agregaro lución de bloqueo (1% BSA, 0.0% NaN3 en PBS, pH 7.2 aron en 120 µ?/cavidad de regulador de pH de extracci o (10 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM ortovanadato de sodio, 1% Tritón icerol, 0.1% SDS, y coctel de inhibidor de prote ubaron a 4°C durante 20 minutos con agitación. Los uía (100 µ?) se agregaron a la placa de ELISA, y s rante la noche a 4°C mientras se agitaba con modera uíente, las placas de ELISA se lavaron, y se agr cavidad de Ab de detección pTyr-HRP (equipo p-IG D System #DYC1770, Minneapolis, MN), y las placas s rante 2 horas a 25°C en la oscuridad. Las placas se d ra determinar la fosforilación de acuerdo a las instru ricante. emplo 1.1.2.N: Inhibición de Fosforilación de VEGF vés de Anticuerpo Parental VEGF y Construcciones cas se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% C02 nutos. Las células se lavaron dos veces con PBS frío través de la adición de 100 µ?/cavidad de Regulador lula (Cell Signaling, Boston, MA) suplementado con P combinaron muestras por duplicado y 170 µ? se agre vidades de placas de ELISA previamente cubiertas con ti-VEGFR2 ( R % D Systems, AF357, Minneapolís, ubaron a 25°C con agitación moderada durante dos vidades se lavaron cinco veces con regulador de pH BS conteniendo 0.05% Tween 20), y se incubaron con 5 ución 1:2000 de anticuerpo anti-fosfotirosina biotinil ilipore, Billerica, MA) durante 1 hora a 25°C. Las c arón cinco veces con PBS conteniendo 0.05% T spués se incubaron durante 1 hora a 25°C con estrept PL #474-3000, Gaithersburg, MD). Las cavidades se i ces con estreptavidina-HRP (KPL #474-3000, Gaithers cultivo de tejido. Ratones hembra SCID (Charles R lmington, MA) a 19-25 gramos se inyectaron subcután flanco derecho con 1 x 106 células tumorales hu trigel) en el día 0 del estudio. La administració /semana) de IgG de control humana o DVD-lg se inició e los ratones coincidieron en tamaño en grupos de úmenes medios de. tumor de aproximadamente 200 a 3 ores se midieron tres veces en una semana, oximadamente en el día 10 después de la inyecció oral. emplo 1.1.2.P: Unión de Anticuerpos Monoclon perficie de Líneas de Célula Tumorai Humana segú r Citometría de Flujo Líneas de célula estable sobre-expresando un perficie celular de interés o líneas de célula tumoral t. #109-116-170). Después de 30 minutos de incubaci células se cosecharon dos veces y se volvieron a s S/FBS. Se midió la fluorescencia utilizando un apa ckinson FACSCalibur (Becton Díckinson, San José, CA).
El Cuadro 11 muestra los datos de FACS nstrucciones de DVD-lg. La media geométrica es la ducto de multiplicación de n señales fluorescentes (a . an). Con los datos de registro transformado, la media utilizó para normalizar la carga de la distribución d uíente cuadro contiene la medía geométrica de ticuerpos parentales y construcciones de DVD-lg. adro 11: Clasificación de Célula Activada Fluor nstrucciones DVD-lg Anticuerpo Dominio Dominio Medía Geométrica Pa renta I o ID Variable N- Variable C- de FACS N- rental. La unión puede ser restaurada o mejorada a gitud de enlazador. emplo 1.1.2.Q: Unión de Anticuerpo de Receptor nstrucciones DVD-lq a la Superficie de Lineas moral Humanas según Valorado a través de Citometr Líneas de célula estable sobre-expresando rec perficie celular o líneas de célula tumoral humanas se partir de matraces de cultivo de tejido y se volvieron salina regulada en su pH con fosfato de Duibe teniendo suero de becerro fetal al 1% (DPBS/FCS). S x 105 células con 100 pL de anticuerpos o DVD-igs (1 BS/FCS durante 30-60 minutos sobre hielo. Las célula s veces y se agregaron 50 µ! de IgG-ficoeritrina lución 1:50 en DPBS/BSA) (Southern Biotech mingham, AL, cat#2040-09). Después de 30-45 erés y una variante del mismo: emplo 1.2. A: Inmunización de Ratones con un mano de Interés Se inyectaron, subcutáneamente, veinte micro tígeno humano purificado recombinante (por ejemp zclados con auxiliar completo de Freund o auxiliar I iagen, Valencia, CA) a cinco ratones Balb/C de 6-8 ad, y cinco ratones AJ, en el Día 1. En los días 24, ectaron, simultáneamente, a los mismos raton crogramos de variante de antígeno humano combinante mezclado con auxiliar incompleto de Freun munoeasy. En el día 84 ó día 112 ó día 144, los ectaron intravenosamente con 1 µ de antígeno human combinante de interés. croscópicos. El sobrenadante de cada cavidad lonias de híbridoma se probó a través de ELISA para I anticuerpo para el antígeno de interés (como se de emplo 1.1.1. A). Los sobrenadantes que exhibe pecífica de antígeno, después se probaron para la acti describe en los ensayos del Ejemplo 1.1.2), por bilidad de neutralizar el antígeno de interés en un bí mo aquel descrito en el Ejemplo, 1.1.2.1). emplo 1.2.C: Identificación y Caracterización de noclonales Parentales para un Antiqeno Objetivo terés emplo 1.2.C.1 : Análisis de Actividad de Neutra ticuerpo Monoclonal Parental Se analizaron sobrenadantes de híbridoma para la p ticuerpos parentales que unen un antígeno de interés teniendo suero de bovino fetal al 10% con bajo conte yclone #SH30151, Logan, UT). En promedio 250 brenadante de hibridoma (derivado de una población secharon, se concentraron y se - purificaron a matografía de afinidad de proteína A, como se d rlow, E. y Lañe, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory l bilidad de los mAbs purificados para inhibir la activ tígeno objetivo se determinó, por ejemplo, utilizando e citocina como se describe en el Ejemplo 1.1.2.1. emplo 1.2.C.2: Análisis de Reactividad Cr ticuerpo onoclonal Parental para Antígeno de nomolqo Objetivo Para determinar si los mAbs seleccionados, como uí, reconocen al antígeno de interés de cinomolgo, se álisis BIACORE como se describe aquí (Ejemp emplo 1.2.D: Determinación de la Secuencia de Ami región Variable para cada Anticuerpo Monoclonal A Murino El aislamiento de los ADNcs, expresión y caracteriz bs de ratón anti-humanos recombinantes se condujo ra cada determinación de secuencia de roximadamente 1 x 106 células de híbridoma se aislar ntrifugación y se procesaron para aislar el ARN total ibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instru bricante. El ARN total se sometió a síntesis de ADN tructura de cadena utilizando el sistema Superscript nthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) sig trucciones del fabricante. Se utilizó oligo(dT) par tesís de primera estructura de cadena para selecció N. El producto de ADN de primera estructura de cade amplificó a través de PCR con iniciadores diseña lencia, CA). Los insertos en los plásmidos se secu bas estructuras de cadena para determinar las secuen cadena pesada variable o de cadena ligera variabl ciadores de avance 13 y de reversa M13 (Fer iences, Hanover MD). Se identificaron secuencias sada variable y de cadena ligera variable de los mA dalidad, los criterios de selección para un pane incipaies para el siguiente paso de desarrollo (hu luyen los siguientes: El anticuerpo no contiene ningún sitio de glico lazado (NXS), excepto de uno de estructura de cadena El anticuerpo no contiene ninguna cisteína extra ad teínas normales en cada anticuerpo La secuencia de anticuerpo está alineada con las línea germinal humanas más cercanas para VH y VL inoácido inusual debe ser verificado para ocurrenci de actividad El anticuerpo tiene un bajo nivel de agregación El anticuerpo tiene una solubilidad >5-10 mg/ml (e investigación); >25 mg/ml El anticuerpo tiene un tamaño normal (5-6 nm) Diseminación de Luz Dinámica (DLS) El anticuerpo tiene una heterogeneidad de carga baj El anticuerpo carece de liberación de citocina ( 1.1.2.B) El anticuerpo tiene especificidad para la citocina (ver Ejemplo 1.1.2. B) El anticuerpo carece de reactividad cruzada inesperada (ver Ejemplo 1.1.2.D) El anticuerpo tiene similitud entre la reactividad tejido humano y de ctnomolgo (ver Ejemplo 1.1.2.D) n un cambio de leucina a alanina en la posición 234 ( ) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 ( 91, J. Immunol., 147:2657). La región constante de ca cada uno de estos anticuerpos se reemplaza por una r mana. Los anticuerpos quiméricos de longitud co sajeramente expresados en células COS a trav nsfección de ADNcs de cadena pesada y ligera quimér plásmido de expresión pBOS (Mizushima y Nagata, N search 1990, Voi 18, pág 5322). Los sobrenadante nteniendo el anticuerpo quimérico recombinante se p vés de cromatografía de Proteína A Sepharose y el ido se eluyó a través' de la adición de regulador de pH ticuerpos se neutralizaron y se dializaron a PBS.
El ADNc de cadena pesada que codifica un mAb q -transfectado con su ADNc de cadena ligera quimér ados en el vector pBOS) en células COS. El sobre tividad de los mAbs de hibridoma parentaies se selec sarrollo futuro. emplo 1.2.2.2: Construcción y Expresión de rentales Anti-humanos Humanizados emplo 1.2.2.2. A: Selección de Estructuras de ticuerpo Humano Cada secuencia de gen de cadena pesada variabl era variable de murino se alineó separadamente cuencias de cadena pesada variable de línea ger cuencias de cadena ligera variable de línea g unoglobulina humana (derivadas del sitio web NCBI p:// www.ncbi.nlm. noh.gov/retrie veig.html.) utilizando ctor NTI.
La humanización se basó en la homología de s inoácido, análisis de grupo de CDR, frecuencia de decir, similitud de secuencia, a la secuencia de amin las regiones variables de anticuerpo de murino.
La modelación de homología se utiliza para identtfi icos a las secuencias de anticuerpo de murino que s e son críticos para la estructura del sitio -de com ticuerpo, las CDRs. La modelación de homología es mputacionai mediante el cual se generan c dimensionales aproximadas para una proteína. La ordenadas iniciales y guía para su refinación adicio gunda proteína, la proteína de referencia, para l nocidas las coordenadas tridimensionales y la secue ales se relaciona con la secuencia de la primera p lación entre las secuencias de las dos proteínas se nerar una correspondencia entre ía proteína de refe oteína para la cual se desean las coordenadas, jetivo. Las secuencias primarias de las proteínas de tructura de modelo se determina a través de la exa ntención con la que las proteínas de referencia y ob acionadas y la precisión con la cual se construye la al cuencia.
Para mAbs de murino, se utiliza una combinación d AST e inspección visual para identificar estructuras d ecuadas. La identidad de secuencia de 25% entre las aminoácido de referencia y objetivo se considera cesario para intentas un ejercicio de modelación de s alineaciones de secuencia se construyen manualr neran coordenadas de modelo con el programa Jackai ( et al. (2003) Proteins 53 (Suppl. 6): 430-435).
Las secuencias primarias de las regiones de es rco de murino y humanas de los anticuerpos se mparten identidad significante. Las posiciones de ieren son candidatos para la inclusión del residuo de adro 12: Secuencia de Dominio Constante sada v de Dominio Constante de Cadena Ligera de lg Proteina SEC. Secuencia ID NO 1234567890123456789012345678 egión constante 58 ASTKGP3VFPLAPSSKSTSGGTAALGCL lgGl de tipo NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV ilvestre CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC FLFPP PKDTLMI3RTPEVTCVVVDVS VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY SLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENN FLYS LTVDKSR QQGNVFSCSVMHEA GK egión constante 59 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC lgGl Mutante NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA GK egión constante 60 T AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL g kappa VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS VYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC egión constante 61 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVC g Lambda KADSSP KAGVETTTPSKQSNNKY AS SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS tencíón del residuo de murino en el anticuerpo hum cir, retro-mutación).
Los anticuerpos humanizados construidos in nstruyen utilizando oligonucleótidos. Para cada ADN riable, se diseñan 6 oligonucleótidos de 60-80 nucle slaparse entre sí por 20 nucleótidos en el extremo da olígonucleótido. En una reacción de clasificac igonucleótidos se combinan, hierven y se clasifican e dNTPs. Se agregó ADN polimerasa I, fragmento gran ew England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) para llena roximadamente 40 bp entre los oligonucleótidos trasl alizo la PCR para amplificar el gen de región de vari ilizando dos iniciadores muy extremos conteniendo lgantes complementarias al sitio de clonación múltiple 0S modificado (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) N s. 18: 17). Los productos de PCR derivados de cada era variable se insertó en marco con la región cons mana a través de recombinación homologa. Se aislar cterianas y el ADN de plásmido se extrajo. Los insert secuenciaron en su totalidad. Las cadenas pesada manizadas correctas que corresponden a cada anticu nsfectaron en células COS para producir pa ticuerpos anti-humanos humanizados de longitud co brenadantes de célula conteniendo un anticuerpo ombinante se purificaron a través de cromatografía de pharose y el anticuerpo unido se eluyó a través de l guiador de pH ácido. Los anticuerpos se neutrali alizaron en PBS. emplo 1.2.2.3: Caracterización de Anticuerpos H Se determinó la habilidad de los anticuerpos rificados para inhibir una activad funcional, por ejempl ron caracterizados. emplo 1.2.2.3. A: Análisis Farmacoci nético de manizados Se realizaron estudios farmacocinéticos en rata wley y monos cinomolgos. Se dosificaron, intr bcutáneamente, ratas macho y hembra y monos cino a sola dosis de 4 mg/kg de mAb y se analizaron l ilizando ELISA de captura de antígeno, y se deter rámetros farmacocinéticos a través de anális mpartimento. En resumen, las placas de ELISA se cu ticuerpo anti-biotina de cabra (5 mg/ml, 4°C, durante l quearon con Superblock (Pierce), y se incubaron c mano biotinilado a 50 ng/ml en Superblock TTBS peratura ambiente durante 2 horas. Las muestras d uyeron en serie (0.5% suero, Superblock al 10% en celente biodisponibilidad 50-100%). emplo 1.2.2.3.B: Análisis Físico-Químico y Est tro de Anticuerpos Monoclonales Humanizados omatografía de exclusión de tamaño Se diluyeron anticuerpos a 2.5 mg/ml con agua alizaron en un sistema Shimadzu HPLC utilizando una 000 SWXL de gel TSK (Tosoh Bioscience, cat# k55 yeron muestras de la comuna con 211 mM de sulfato de fosfato de sodio, pH 7.0, a una velocidad de f /minutos. Las condiciones de operación del sistema H uientes: se móvil: 211 mM Na2S04, 92 mM Na2HP04*7 adíente: (socrático locidad de flujo: 0.3 mi /minuto tector de longitud de onda: 280 nm adro 13: Pureza de Anticuerpos Pare nstrucciones de DVD-lg según Determinado a omatoqrafta de Exclusión de Tamaño Las DVD-lgs mostraron un excelente perfil de S-PAGE de tris-glicina (Invitrogen, cat# LC2676, lote n 100 mM DTT, y se calentaron a 60°C durante 30mi ndiciones de no reducción, las muestras se mezclar gulador de pH de muestra y se calentaron a 100°C nutos. Las muestras reducidas (10 mg por carril) se car l de tris-glicina pre-colado al 12% (Invitrogen, cat# e # 6111021), y las muestras no reducidas (10 mg p rgaron en un gel de tris-glicina pre-colado ai 8%-16% t# EC6045caja, lote # 6111021). Se utilizó Se vitrogen, cat# LC5925, lote # 1351542) como un marca lecular. Los geles se corrieron en una caja de gel de ell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y las pr pararon aplicando primero un voltaje de 75 para estras en el gel, seguido por un voltaje constante d e el colorante frontal llegó al fondo del geL El regulad rrida usado fue reguiador de pH 1X tris-glicina SDS, las tres piezas centrales estándares de carbón e ctores. Estas piezas centrales tiene una longitud de tica de 1.2 centímetros y se construyen con ventanas d ilizó PBS para un regulador de pH de referencia y c tuvo 140 pL Todas las muestras se examinaron simul ilizando un rotor de 4 agujeros (??-60??) en una ult alítíca Beckman ProteomeLab XL-I (serie # PL106C01).
Las condiciones de operación se programaron y s ntrol de centrífuga utilizando ProteomeLab (v5.6). Las rotor se dejaron equilibrar térmicamente durante un álisis (20.0 +.0.1°C). Se realizó la confirmación de car ropiada a 3000 rpm y se registró una escaneada ind da célula. Las condiciones de velocidad de sedime mo sigue: lumen de célula de muestra: 420 mi lumen de célula de referencia: 420 mi dición de peso molecular LC-MS de anticuerpos inta Se analizaron los pesos moleculares de anticuerpo vés ' de LC-MS. Cada anticuerpo se diluyó a aproxi g/ml con agua. Se utilizó un sistema 1100 HPLC (Agil cro-trampa de proteína (Michrom Bioresources, I 4/25109/03) para desalar y se introdujeron 5 mg de la espectrómetro masivo API Qstar pulsar i (Applied Bios lizó un gradiente corto para eluir las muestras. El g r rí ó con una fase móvil A (0.08% FA, 0.02% TFA en agu una fase móvil B (0.08% FA y 0.02% TFA en acetoni locidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro masi un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con una escala 2000 a 3500, relación de masa a carga. dición de peso molecular LC-MS de cadenas ligera y ticuerpo 38.1 °C. Se utilizó un sistema Agilent 1100 HPLC con una ydac, cat# 214TP5115, S/N 060206537204069) para roducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro masiv lsar i (Applied Biosystems). Se utilizó un gradiente cort muestra. El gradiente se operó con una fase móvil A 02% TFA en agua de HPLC) y una fase móvil B (0.08% A en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 m pectrómetro masivo se operó a un voltaje de asper oltios con una escala de escaneo de 800 a 3500, reiac carga, peo de péptido El anticuerpo se desnaturalizó durante 15 mperatura ambiente con una concentración final de 6M guanidina en 75 mM bicarbonato de amonio. La naturalizadas se redujeron con una concentración fin peo de péptido con detección de espectrómetro pararon 40 mi de las digestiones a través de croma uido de alto rendimiento de fase inversa (RPHPL lumna C18 (Vydac, cat# 218TP51, S/N NE9606 10.3 tema Agilent 1100 HPLC. La separación de péptido s gradiente utilizando una fase móvil A (0.02% TFA y 0 ua de HPLC) y una fase móvil B (0.02% TFA y 0. etonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/ pectrómetro masivo API QSTAR Pulsar i se operó e sitivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltíos y un caneo de 800 a 2500, relación de masa a carga. peo de Enlace de Disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo, se mezclaron ticuerpo con 300 mi de 8 M HCI de guanidina e arbonato de amonio. Ei pH se verificó para asegur icionales de tripsina o Lys-C a las muestras y la diges seguir durante 2 horas más a 37°C, Las digestiones s regando 1 mi de TFA a cada muestra. Las muestras d pararon a través de RPHPLC utilizando una columna t# 218TP51 S/N NE020630-1 -1 A) en un sistema Agilen paración se operó con el mismo gradiente utilizado pa péptído utilizando una fase móvil A (0.02% TFA y O ua de HPLC) y una fase móvil B (0.02% TFA y 0. etonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/ ndiciones de operación de HPLC fueron iguales l izadas para el mapeo de péptido. El espectrómetro TAR Pulsar i se operó en un modo positivo a un persión de 4.5 kvoltios y a una escala de escaneo de lación de masa a carga. Se asignaron enlaces d ciendo coincidir los MWs observados de ios péptidos c onosticados de péptido trípticos o Lys-C unidos a DTNB + RSH <8> RS-TNB + TNB- + H + La absorbancia del TNB- se midió a 412 nm ut pectrofotómetro Cary 50. Se trazó una curva de lizando diluciones de 2-mercaptoetanol (b-ME) como SH libre y se determinaron las concentraciones de lfhidrilo libre en la proteína a partir de la absorbancia muestra.
Se preparó un abastecimiento del estándar b-ME a dilución en serie de 14.2 M b-ME con agua, de grado ncentración final de 0.142 mM. Después, se prepararon r triplicad para cada concentración. El anticuerpo se mg/ml utilizando un filtro de centrífuga amicon ultra 1 illipore, cat# UFC801096, lote # L3KN5251) y el regul cambió al regulador de pH de formulación util alimumab (5.57 mM fosfato de sodio monobásico, 8.69 cantidad de SH libre y OD 12 nm de los estándares d lculó el contenido de SH libre basándose en esta curva substracción del manto. omatografía de Intercambio de Catión Débil El anticuerpo se diluyó a 1 mg/ml con 10 mM fosfa 6.0. Se analizó la heterogeneidad de carga utilizando imadzu HPLC con una columna analítica WCX-10 ProP t# 054993, S/N 02722). Las muestras se cargaron en la % de fase móvil A (10 mM fosfato de sodio, pH 6.0) y vil B (10 mM fosfato de sodio, 500 mM NaCi, pH 6.0) y una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto. rfil de Oligosacárido Los oligosacáridos libreados después del tratamient i anticuerpo se derivatizaron con el reactivo de m regó salina regulada en su pH con fosfato para dar al de 60 mi. La muestra se incubó durante la noche a rmo-mezclador Eppendorf fijado a 700 RPM. alimumab, lote AFP04C, fue digerido con PNGase ntrol.
Después del tratamiento con PNGase F, las ubaron a 95°C durante 5 minutos en un term pendorf fijado a 750 RPM para precipitar las proteín muestras se colocaron en una centrífuga de Eppendo nutos a 10,000 RPM para hacer girarlas proteínas pre brenadante conteniendo los oiigosacáridos se transfiri Eppendorf de 500 mi y se secó en un velocidad-vac a Los oiigosacáridos se marcaron con 2AB utilizand marcación 2AB comprado en Prozyme (cat# GKK- 2026). El reactivo de marcación se preparó de acue trucciones del fabricante. Se agregó ácido acétic cción se colocaron en un termo-mezclador de Eppend r °C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción.
Después de la reacción de marcación, se removió e lorante fluorescente utilizando cartuchos GlycoClean S t# GK1-4726). Antes de la adición de las muestras, lo lavaron con 1 mi de agua M i 11 i - Q seguido por 5 lavado a solución de ácido acético al 30%. Justo antes de estras, se agregó 1 mi de acetonitrilo (Burdick and Ja 015-4) a los cartuchos.
Después de que todo el acetonitrilo se hizo pasar rtucho, la muestra se salpicó sobre el centro cientemente lavado y se dejó absorber en el disco nutos. El disco se lavó con 1 mi de acetonitrilo seguid ados de 1 mi de acetonitrilo al 96%. Los cartuchos s bre un tubo de Eppendorf de 1.5 mi y los oligosacárido n 2-AB se eluyeron con 3 lavados (400 mi cada lava dio monobásico, 8.69 mM fosfato de sodio dibásico, CI, 1.07 mM citrato de sodio, 6.45 mM ácido cítrico, nitol, 0.1% (p/v) Tween, pH 5.2; ó 10 mM histidi tionina, 4% manitol, pH 5.9, utilizando filtros de ult iicon. La concentración final de los anticuerpos se /mi con los reguladores de pH apropiados. Las sol ticuerpo después se esterilizaron mediante filtro y se 5 mi de alícuotas bajo condiciones estériles. Las a jaron ya sea a -80°C, 5CC, 25°C, ó 40°C, durante manas. Al final del período de incubación, las m alizaron mediante cromatografía de exclusión de tam GE.
Las muestras de estabilidad se analizaron a trav GE bajo condiciones tanto de reducción como de no r cedimiento utilizado fue igual al descrito aquí. Lo eron durante la noche con tinción azul coloidal (Invi mplo 1.2.2.3.C: Eficacia de un Anticuerpo manizado Por Sí Mismo o en Combinación con Qu bre el Crecimiento de Xenoiniertos de Carcinoma Hu Se desarrollaron células cancerosas humanas in vit viabilidad, 85% de confluencia en matraces de cultiv marcaron en la oreja y se rasuraron ratones SCI cho (Charles Rivers Labs) a 19-25 gramos. Después ron inoculados subcutáneamente en el flanco derecho 2 x 106 células tumorales humanas (1:1 matrigel) en tudio. La administración (IP, Q3D/semana) de vehí ticuerpo humanizado, y/o quimioterapia se inició desp ratones se hicieron coincidir por tamaño en jaulas s ones con volúmenes medios de tumor de aproxímada 0 mm3. Los tumores se midieron a través de un par de S veces a la semana, empezando aproximadamente spués de la inoculación y los volúmenes de tumor se c sangre periférica aisladas previamente congeladas vés de una columna de enriquecimiento de seiecci &D Systems, Minneapolis, MN; Cat.# HTCC-523). Las timularon durante 4 días en matraces (tapa de rning, Acton, MA) cubiertos con 10 pg/ml de anti-C ioscience, Inc., San Diego, CA) y 2 pg/ml de anti-CD ioscience, Inc., San Diego, CA) en D-PBS (Invitroge ) y se cultivaron en 30U/ml de IL-2 (Roche) en un me 40 completo (Invitrogen, Carlsbad, CA) con L-glutam ME, Pen/Strep, 10% FBS). Después, las células T posar durante la noche en 30U/m! de IL-2 antes de util sayo. Las células objetivo DoHH2 o Raji se marcaron igma-Aldrich, St. Louis, MO) de acuerdo con las instr bricante. A través de todo el ensayo de rCTL, se utilí MI 1640 (sin fenol, Invitrogen, Carlsbad, CA) con utamina y 10% FBS (Hyclone, Logan, UT). (Ver, Dreíer % (Invitrogen, Carlsbad, CA), azida de sodio al 0.1% yoduro de propidio (BD) en D-PBS. Los datos d olectaron en una máquina FACS Canto II (Becton Dic se, CA) y se analizaron en Flowjo (Treestar). El po jetivos vivos en las muestras tratadas con DVD-lg divid rcentaje total de objetivos (control, sin tratamiento) ra determinar el porcentaje específico de lisis. Se cal lores de IC50s en Prism (Graphpad).
Se probó CD3/CD20 DVD-lg para toxicidad redirigi iquilación de tumor in vítro con un valor de IC50 = cuencia de este CD3 / CD20 DVD-lg se describió en la tente de E.U.A. Serie No. 20070071675. mplo 1.4: Generación de una DVD-lg Se construyeron moléculas de DVD-lg capaces d tígenos, utilizando dos anticuerpos monoclonales pare erentes orientaciones de dominio: VA-VB-C y VB-VA-C ). Las secuencias enlazadoras, derivadas de la se minal del dominio Cl/Ck o CH1 humano, son como sigu Para construcciones DVDAB: Cadena ligera (si anti-A tiene ?): Enlazador cort EC ID NO: 15); Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP(SEC Cadena ligera (si anti-A tiene ?): Enlazador corto: NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: Cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP ( ); Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEC ID NO: 22) Para construcciones DVDBA: Cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador cort EC ID NO: 15); Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP ( ) Cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador corto: ? NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEC ID NO: B. adro 14: Construcciones de DVD-lg anti-A/B emplo 1.4.2: Clonación molecular de construcc io n ara PVDABSL y PVDABLL Para generar construcciones de cadena pesada DV DABHC-SL, el dominio VH del anticuerpo A se amplifi R utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3 cuencia de forro corta/larga para construcció spectivamente); mientras que el dominio VH del antic móioga estándar.
Para generar construcciones DVDABLC-LL y DVD dena ligera, el dominio VL del anticuerpo A se amplifi R utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3' cuencia de forro corta/larga para las construccio pectivamente); mientras que el dominio VL del antic plificó utilizando iniciadores específicos (iniciadores cuencia de forro corta/larga para las construccio spectivamente). Ambas reacciones de PCR se re uerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándar oductos de PCR se purificaron con ge!, y se utilizaron mo plantilla traslapante para la reacción subsecuen slapante utilizando condiciones de PCR estándares. LO PCR traslapantes se subclonaron en un vector de e mífero (Abbott) pBOS-hCk digerido doble Srf I y Not aspecto de recombinación homologa estándar. Se ha /LL, respectivamente); mientras que el dominio VH del se amplificó utilizando iniciadores específicos (ini ntienen secuencia de forro corta/larga para las con /LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se r uerdo con técnicas y procedimientos de PCR estándar ductos de PCR se purificaron con gel, y se utilizaron mo plantilla traslapante para la reacción subsecuen slapante utilizando condiciones de PCR estándares. Lo PCR traslapantes se subclonaron en el vector de expr mífero pBOS-h-Cy1,z digerido doble Srf I y Sal lizando un aspecto de recombinación homologa estánda Para generar construcciones DVDBALC-LL y DVD dena ligera, el dominio VL del anticuerpo B se amplifi R utilizando iniciadores específicos (iniciadores 3 cuencia de forro corta/larga para las construccio spectivamente); mientras que el dominio VL del antic aspecto de recombinación homologa estándar. mplo 1.4.4: Construcción v Expresión de DVD-lg A mplo 1.4.4.1: Preparación de Construcciones P-lg Las secuencias de aminoácido de anticuerpo pa ticuerpos específicos, que reconocen antígenos es ítopos del mismo, para incorporación a una DVD-lg tenidas a través de la preparación de hibridoma scribió anteriormente o se pueden obtener m cuenciación de proteínas de anticuerpo conocidas cleicos. Además, se pueden obtener secuencias cono ratura. Las secuencias pueden ser utilizadas par idos nucleicos utilizando síntesis de ADN o tecn plificación y ensamblando los fragmentos de anticuerp vectores de expresión, usando tecnología de ADN re bclonaron en un vector de expresión. (Ver, 7,306,914; 79,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20 080075690; 20080063780; 20080050506: 20 080022422; 20070289033; 20070287170; 20 070243194; 20070225227; 20070207171; 20 070135620; 20070128190; 20070104722; 20 070037196; 20070028321 ; 20060172404; 20 060153791; 20030215458; 20030157643).
Un grupo de vectores pHybE (Solicitud de Patent rie No. 61/021,282) se utilizó para la clonación del rental y DVD-lg. Se utilizó V1, derivado de pJP1 gl,z,no-a V2, para la clonación del anticuerpo y caden DVD con una región constante de tipo silvestre. Se rivado de pJP191; pHybE-hCk V2, para la clonación de adenas ligeras de DVD con una región constante kapp , derivado de pJP192; pHybE-hC1 V2, para la cí Haciendo referencia al Cuadro 15, se utilizó un ctores en la clonación de los anticuerpos parentales y L de DVD-lg. adro 15: Vectores Usados para Clonar renteles v PVD-lqs ID Vector de cadena pesada Vector de cadena ligera AB001 V1 V2 AB003 V1 V2 AB010 V1 V2 AB017 V1 V2 AB020 V1 V2 AB032 V1 V2 AB033 V1 V2 AB040 V1 V2 AB043 V1 V2 AB044 V1 V2 AB045 V1 V2 AB046 V1 V2 AB052 V1 V2 AB059 V1 V2 AB060 V1 V2 DVD 193 V1 V2 DVD 194 V1 V2 ID Vector de cadena pesada Vector de cadena ligera DVD216 V1 V2 DVD217 V1 V2 DVD218 V1 V2 DVD219 V1 V2 DVD220 V1 V2 DVD221 V1 V2 DVD222 V1 V2 DVD223 V1 V2 DVD224 V1 V2 DVD225 V1 V2 DVD226 V1 V2 DVD229 V1 V5 DVD230 VI V4 DVD231 V1 V2 DVD232 V1 V2 DVD233 V1 V2 DVD234 V1 V2 DVD235 V1 V2 DVD236 V1 V2 DVD239 V1 V2 DVD240 V1 V2 DVD243 V1 V2 DVD244 V1 V2 DVD247 V1 V2 DVD248 V1 V2 DVD255 V1 V2 DVD256 V1 V2 DVD289 V1 V2 DVD290 V1 V2 DVD291 V1 V2 DVD292 V1 V2 DVD293 V1 V2 oengineering 90(3):332-44. Los reactivos que fueron u transfección incluyeron: células HEK 293-6E (línea de célula de riñon mano establemente expresando EBNA1; obtenidas search Council Canadá) se cultivaron en matraces de sechables en una incubadora humedecida fijada a 130 o C02.
Medio de cultivo: Medio de Expresión FreeStyle 293 338-018) más 25 pg/ml de Geneticina (G418) (Invitro 1) y 0.1% Pluronic F-68 (invitrogen 24040-032).
Medio de transfección: Medio de Expresión FreeSt mM HEPES (Invitrogen 15630-080).
Material de abastecimiento de polietilenimina (PEI): lución de abastecimiento estéril, pH 7.0, preparada con eal (Polysciences) y se almacenó a menos de -15°C.
Medio de Alimentación de Triptona: 5% p/v de ab Transfección: el medio de transfección y el i astecimiento de PEI se pre-calentaron a temperatur T). Para cada transfección, se combinaron 25 pg smido y 50 pg de polietilenimina (PEI) en 5 mi d nsfección y se incubaron durante 15-20 minutos a ibíente para permitir la formación de complejos de AD transfecciones de BR3-lg, se utilizaron 25 pg del plásr transfección. Cada 5 mi de la mezcla del complejo regaron a un cultivo de 40 mi preparado previamente y incubadora humedecida fijada a 130 rpm, 37°C y 5% C 20-28 horas, se agregaron 5 mi del Medio de Alim ptona a cada transfección y los cultivos se continua is días.
El Cuadro 16 contiene los datos de producción para rentales o construcciones DVD-lg expresada como mil ro en células 293. adro 16: Expresión Pasajera en Producc ticuerpos Parentales v Construcciones de DVD-lg Todos los DVDs se expresaron bien en células 293 eden ser fácilmente purificados sobre una columna de la mayoría de los casos >5mg/l de DVD-lg purificad tenido fácilmente de los sobrenadantes de las células 2 emplo 1.4.5: Caracterización v selección principal d s 4* (3^^ ra cada mAb. Basándose en la colección de análisis incipal final se hizo avanzar al desarrollo de la líne table CHO, y se empleó el material derivado de CHO estabilidad, farmacocinética y eficacia en monos cí tividades de pre-formulación. emplo 2: Generación y Ca racterizaci munoqlobuíinas de Dominio Variable Doble (DVD-lg) Se generaron inmunoglobulinas de dominio vari VD-lg) utilizando anticuerpos con secuencias de nocidas, sintetizando fragmentos de polinucleótido q cuencias de cadena pesada variable de DVD-lg y de c riable de DVD-lg y clonando los fragmentos a un vecto acuerdo con el Ejemplo 1,4.4.1. Las construcciones d naron a y se expresaron en células 293 como se de emplo 1.4.4.2. La proteína de DVD-lg se purificó de emplo 2.1: Generación de Abeta isec. 1) y Abe D-lqs adro 17 SEC . Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 62 VTD193H AB044VH ABO 45VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLEWVASIHNRGTIF LDS XSRDW NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCT YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPEVQLVE QPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQA LVAS INSNGGSTYYPDSV GRFTISRDN LQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTIJV 63 VD193L ABG44VL ABO 45VL DVLVTQSPLSLPVTFGEPASISCRSTQT DTYLEWYLQKPGQSPQSLI YKV3NRFSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG FGQGTKLEIKRTVAAPDIVMTQSPLSLP ASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPG IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI OVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKR 64 VD194H AB045VH AB04 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLELVAS X NSNGGSTYYPD TISRDNAKNTLYLQ NSLRAEDTAVY C GQGTLVTVSSASTKGPEV LVESGGGLV RLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLE MRG'IIFYLDS GRFTXSRDNVRNTLYL AEDTAVYYCTRGRSNSYAMDYWGQGTSV 65 VD194L AB0 5VL ABO 44VI, DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS DTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSG ad ro 1 8 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 66 VD19SH AB0 VH AB017VH EVKL ESGGGLV PGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPG GLEWVASIHNRGTI FYLDS ISRDIWRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCT AMDYWGQGTSVTVSSASTKGPE QLVE QPGRSLRLSCAASGFTFDDYA HWVRQA WVSATTWNSGHID ADSVEGRFTIS DN LQMNSLRAEDTAVYYCA VSYLSTASSL TLVTV3S 67 VD195L AB04 VL AB017VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCR3TQT DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVG YCFQG FGQGTKLEIKRTVAAPDIQMTQSPSSL5 VTlTCP-A3QGIRNYLAWYQQKPG APKL TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI.SSLQP YCQR NRAPYTFGQGTKVEIKR 68 VD196H AB017VH AB044VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRIiSCAASGFT HWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHID AD TIS DHAKHSLYLQ MSL AED AVYYC STASSI.DYWGQGTLVTVfíSASTKGPEVK GLV PGGSLRLSCAASGF FSS AMSWV GLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISR LYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSWSYAH TSVTVSS 69 VD196L ABO i7 I. AB0 4VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQG WYQQKPG APKLLI AASTLQSGVPSRF TDFTLTÍSSLQPEDVATYYCQRYNRAPY emplo 2.3: Generación de IL-beta v Abeta (sec. 2) adro 19 emplo 2.4: Generación de Abeta (sec. 1) y Abe D-lgs adro 20 SEC . Hombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dom nio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 74 VD201H AB0 VH AB0 3VH EV LVESGGGLVKPGGSL T..SCAASGFT SWVRQAPGKGL.EWVASIHN GTIFYLDS ISRDMV NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCT Y MO WGQGTSVTVSSASTKGPE QLLE QPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQA W STRSGGGRT SDNVKGRFTISRDN LQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDY VTVSS 75 VD201L ABQ44 L AB043VL DVLVTQSPLSLPV P.GEP SISCRSTQT DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSG GSGSGTDFTL ISRVEAEDVGVYYCFQG FGQGTKLEIKRTVAAPDWMTQSPLSLP ASISC S3QSLLDSDGKT LNWLLQKPG IYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI DVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVE1KR 76 VD202H AB043VH ABO 44Vil EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQA GKGLEW AS I SGGGRTYYSD TISRDNS NTLYLOMNSLRAEDTAVY C 3G3SDYWGQGTLVTVSSASTKGPE KLV VKPGGSLRLSCAASGFTFSS AMSW RQ EWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISRDN LQ N LRAEDTAV YCTRGRSNSYAMDY VTVSS emplo 2.5: Generación de 1GF1.2 y Abeta ísec. 2) adro 21 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio ¡ Dominio Dominio NO. Variable Variable Var able DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 78 VD203H AB044VH ABQ10VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLEWV/vS GHNRGTIF LDS ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCT YAMD WGQGTSVTVSSASTKGPQVQLVQ PGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQA WMGWM mSGNTG AQKFQGRVTMTRNT MELSSLRSEDTAVYYCARDPYYYYYGMD VTVSS 79 VD203L AB0 4VL ABO1 OVL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQT DTYLEWYLQKPGQSPQSLIY VSNRFSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG FGQGT LEIKRTVAAPQ5VLTQPPSVSA TISCSGSSSNIENNHVSWYQQLPGTAPK NKRPSGIPDRFSGS SGTSATLGITGL YYCETWDTSLSAGRVFGGGT LTVLG 80 VT20 H AB010VH AB044VH QVQLVQSGAEVKKPGAS VSC ASGYT NWVRQATGQGLEWMG MNPNS HTGYA TMT NTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYC YYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPEVK LVKPGGSLRLSCAASGF*rTSSYAMSWV LEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTI SR YLQMNSLRAEDTAVYYCTRGRSNS AM SVTVSS 81 VD204L ABO 1 OVL AB04 L QSVLTQ PSVS??PGQ VT ISCSGSSS SWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGI PD GTSATLGITGLQTGDEADYYCET DTS emplo 2.6: Generación de Abeta (sec. 2) e IL-18 D adro 22 SEC . Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 VD205H AB0 VH AB0 6VH EVKLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFT SWV QAPGKGLEWVASIHNRGTIFYLDS ISRDNVRNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCT YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPEVQLVQ KPGESLKI SC GSGYTVTSYWIGWVRQM W GFTYPGD3ETRYSPTFQGQVTISAD LQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYTF TMVTVSS 83 VD205L AB0 VL AB04 VL DVLVTQSPLSLPVTPGEPASISCRSTQT DTYLEWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG FGQGTKLEIKRTVAAPEIVMTQSPATLS ATLSG ASES ISSNLAWYQQKPGQAPRL TRATDI PARFSGSGSGTEFTLTISSLQS YCQQYNNWPSX FGQGT LEIKR 84 VD206H AB0 6VH AB0 4VH EVQLVQSGTEV KPGE3LK ISCKG5GYT GWVRQMPGKGLEWMGFIYPGDSETRYSP ISADKSFNTAFLQWSSLKASDTAMY C WYPYTFDIWGQGT VTVSSASTKGFEVK GLVKPGGSLRLSCAASGFTFSS*AMSWV GLEWVASIHNRGTIFYLDSVKGRFTISR LYLQMNSLRAEDTA CTRGRS SYAM TSVTVSS 85 V 206L AB046VL AB044VL EIVMTQSPA LSVSPGERATLSC ASES WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARF TEFTLT1SSLQSEDFAVYYCQQYNNWPS emplo 2.7: Generación de iL-6 y Abeta (sec. 2) DV adro 23 emplo 2.8: Generación de TNF y Abeta (sec. 3) DV adro 24 Generación de IL-1beta y Abeta (sec. 3 adro 25 SEC. Hombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 94 VD2X1H AB04 VH AB032VH EVQLVE5GGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYypD TIG DNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC GQGTLV VSSASTKGPQVQLVESGGGW RLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPG GLE YDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY RAEDTAVYYCARDLRTG FDYWGQGTLV 95 V 211L AB045 L AB032VL DI MTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS DTYLHWYLQKPGQSP LLIYKVSNRFSG GSGSGTDFTL ISRVEAEDVGVYYCSQS FGGGTKVEIKRTVAAPEIVLTQSPDFQS VTITCRAS0SIG3SLHWYQQKPDQSPKL QSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEA YCHQSSSLPFTFGPGT VDIKR 96 VD212H AB032VH AB045VH QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFT NWVRQAPGKGLEWVA11WYDGDNQYYAD TISRDNSKWThYLQMNGLRAEDTAVYYC GPFDYWGQGTLVTVSSASTKGFEVQLVE QPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQA LVASI SNGGSTYYPDSVKGRF ISRDN LQM SLRAEDTAVYYCASGDYVÍGQGTLV 97 VD212L AB032VL AB0 5 L EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQS YQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRF TDFTLTIMSLEAEOA A VCHQSSSLPF VDIKRTVAAPDIVMTQSPLSLPVTPGE RSSQSLV SNGDT LHWYLQK GQSPKL emplo 2.10: Generación de Abeta (sec. 1¾ Abeta (s adro 26 SH*C * Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 98 VD215H AB045 H AB043VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLELVASI SNGGS YY D TIS D AKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC GQGTLVTVSSASTKGPEVQLLESGGGLV RLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGK LE SGGGRTYYSDNV GRFTISRDNSKNTLY RAEDTAVYYCVR DHYSGSSDYWGQGTL 99 VD215L AB045VL ABO43VI, DI TQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS D LHW LQ PGQS KLLI KV$ FSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQS FGGGTKVEI RTVAAPDWMTQSPLSLP ASISCKSSQSLLDSDG TYLNWLLQKPG IYLVSKLD3GVPDRFSGSGSGTDFTLKI DVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTEVEIKR 100 VD216H AB043 H AB045VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLEVfVASIRSGGGRTYYSD TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV C SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQL VQPGG3LRLSCA SGFTFSSYGMSWVRQ ELVASIWSNGGSTYY DSVKG TISRD YLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTL 101 VD216L AB0 3 L AB0 5VL DWMTQSPLSLPVTPGEPASXSCKSSQ5 KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSG 2.11: Generación de 1GF1,2 y Abeta (sec. 3) SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 102 VD217H AB045VH ABO 10VH EVQLVESGGGLVQPGG5LRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPD TISRDNAKNTLYLQMMSLR EDTAVYYC GQGTLVTVSSASTKGPQVQLVQSGAEV KVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLE PNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAY RSEDTAVYYCARDPYYYYYGMDVWGQGT 103 VD217L ABO45VI, AB010VL DIV TQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQS DT LHWYLQK GQSP LLlY VSNRFSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQS FGGGTKVEIKRTVAAPQSVLTQPPSVSA TISC5GSSSNIENNHVSWYQQLPGTAPK NKRPSGI DRFSGSKSG SA 13XTGLQ YYCETWDTSLSAGRVFGGG KLTVLG 104 VD218H AB010 H AB0 5VH QVQL QSGAEVKKPGAS KV3CKAS YT NWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQ TMTRHTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYC YYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPEVQL LVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYG SWVR LELVASINSNGGSTYYPDSV GRFTISR LYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGT 105 VD218L AB010VL AB0 5VL QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSN SWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDR GTSATLGITGLQTGDEADYYCETWDTSL GGGTKLTVLGQPKAAPDIVMTQSPLSLP ASISCRSSQSLVYSNGDTYLHW LQ PG emplo 2.12: Generación de Abeta (sec. 3) e IL-18 D adro 28 emplo 2.13: Generación de L-6 v Abeta (sec. 3) DV adro 29 emplo 2.14: Generación de TNF y Abeta (sec. 1) DV adro 30 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dom nio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 114 VP223H ABO 43VH AB01 VK EVQLLESGGGL QPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPG GLEWVASIRSGGGR ?YSD T.TSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLV VQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQ EWVSAITWWSGHIDYADSVEGRFTISRD YLQMNSiiRAEDTAVYYCA VS LS ASS GTLVTVSS 115 VD223L AB043VL AB017VL DWMTQSPLSLP TPGEPAS?SCKSSQS KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSG GSGSGTÜFTLKISRVEAEDVGVYYCWQG FGQGT VEI R VAAPD?QMTQSPS5LS VTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKL TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP YCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 116 VD224H AB017VH AB0 3 H EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT HWVRQAPGKGLEWVSAIT WSGHIDYAD TISRDWA MSLYLQMNSLRAEDTAVYYC 3 ASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPEVQ GLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGM5WV GLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTIS TLYLQ NSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGS GTLVTVSS 117 VD224L AB017VL AB043VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQG WYQQKPGKAPKLL IYAASTLQSGVPSRF TDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNR PY emplo 2.15: Generación de IL-1beta y Abeta (sec. 1) adro 31 emplo 2.16: Generación de 1GF1.2 y Abeta (sec. 1) adro 32 SEC . Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dom nio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 122 VD229H AB043VH AB010VH EVQLLESGGGLVQPGGSL LSCAASGt'T SWVRQAPGKGLEWVASI SGGGRTYYSD TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SGSSDY GQGTLVTVSSASTKGPQVQLV KPGASVKVSCKASGY FTSYDIM VRQ EWMGW NPNSGNTGYAQKFQGRVT TRN YMELS5LR3EDTAVYYCARDPYY YGM TTVTVSS 123 VD229L AB043VL ABQIOVL DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISC SSQS KTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQG FGQGT VEIKRTVAAP0SVLTQPP5V3A TISCSGSSSNIESNHVSWYOQLPGTAPK NKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQ YYCETWD S AGRVFGGG KLTVLG 124 VD230H AB010VH AB043VH QVQLVQSGAEVK PGASVKVSCKASGYT N VRQATGQGLE MGWMNPNSGNTGYAQ TMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYC YYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGFEVQL LVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVR LEWVASIRSGGGRTYYSDHVKGRFTISR LYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSS TLVTVSS 125 V 230L AB010VL ABO 43VI, QSVLTQPPSVSAAPGQ VTISCSGSSSN SWYQQLPGTAPKÍiLIYDMW RPSGIPDR GTSATLGITGLQTGDEADYYCETWDTSL emplo 2.17: Generación de Abeta (sec. 1) e 1L-18 D adro 33 ¦" «"¦¦¦¦¦— -'-¦¦¦¦¦«-"- SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Domin o Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 126 VD231H AB043VH AB0 6VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSD TIS DNSKN LYLQMNSLRAEDTAVYYC SGSSDYWGQGTIiVTVSSASTKGPEVQLV K PGESLKISCKGSGYTVT5 WIGWVRQ EWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTISAD FLQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYPYT GTMVTVSS 127 VD231L AB0 3VL AB046VL DW TQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQS TYLNWLLQ PGQSPQRLIYLVSKLDSG GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQG FGQGTKVEIKRTVAAPEIVMTQSPATLS ATLSGRASESISSNLAWYQQKPGQAPRL TRATDIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS YCQQYNNWPS TFGQGTRLEIKR 128 VD232H AB0 6VH AB0 3VH EVQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSG T GWVRQMPGKGLEWMGFI GDSETRYSP TISADKSFWTAFLQWSS LKASDTAMYYC WYPYTFDIWGQGTMV VSSASTKGPEVQ GLVQPGG3LRLSCAASGFTFSNYGMSWV GI.EV/VASIRSGGGRTY SDNYKGRFTJ. TLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGS GTLV VSS 129 VD232L AB0 6VL AB0 3 L EI MTQSPATLSVSPGERA LSCRASES WYQQKPGQAPRLFIYTASTRATDIPARF TEFTL ISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPS emplo 2.18: Generación de IL-6 y Abeta (sec. 1) DV adro 34 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 130 VD233R AB043VH AB040VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQAPGKGLEWVASI-RSGGGRTYYSD TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC SGSSDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVTLK LQPSQTLSLTCSFSGFSLST GMGVSWI GLEWLAHIYWDEDKRYNPSLKSRLTISK VFLKITNVDTADTATYYCARRRI I DVE GQGTTLTVSS 131 VD233L AE043VL AB0 0VL DWMTQS LSLPVTPGEPA31SCKSSQS KT??,? LLQK GQS QRLIYLVSKLDSG GS6SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QG FGQGTK EI RTVAAPQIVLIQS AIMS VTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLL IASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAE CQQ SGYPYT GGGT LEI R 132 VD234H AB040VH AB043VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFS GVSÍJIRQPSGKGLEWLAHIYWDEDKRYN L ISKDTSNNQVFL ITNVDTADTA YY IYDVEDYFDYWGQGTTLTVSSASTKGFE GGGiiVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMS GKGIiEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFT KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYS GQGTLVTVSS 133 VD234L ABO 40VI. ABQ 3VL QIVL1QSPAIMSASPGEKVTMTCSASSS YQQKPGSSPRLLIYDTSNÍ.ASGVPVRFS SYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYT emplo 2.19: Generación de Abeta (sec, 1) y RAGE adro 35 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Var able Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 134 VD293H AB060VH AB043VH Q I QL VQSG PE LKK PGE T VK I SC PÍAS GYT NWVKQAPGKGLKWMGY THTNTGES I YSE A FS LE T S A S TA Y LQ I N N LKNE DTATY FC TAYG DYWGQGTSVTVSSASTKGPEVQL LVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVR LE WVAS I RSGGGRT Y S DNVKGR FTIS R LYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSS TLVTVSS 135 VD293L AB060VL AB0 3VL DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQN WYQQRPGQS KLLI FSASNRYTGVPDRF TDFTLTLSNMQPEDLADYFCQQYSSYPL KLELKRTVAAPDWMTQ5 PLS LPVT PGE KSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQR KLDS GV PDR F SG SG SGT DF LKI S RVEA YCWQGTH F PRTFGOGTK VE I R 136 VD294H AB043VH AB060VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT SWVRQA PGKGLEW AS IRSGGGRT YYS D TI SRDNSKNTLY LQMNS LRAEDTAVYYC SGSSDY. GQGTLVTVSSAS KGPQIQLV KKPGETVKISCKASGY TNFGMtWVKQ ¦K MGYI.NTHTGESIYSEEFKGRFAFSLE YLQ I NNLKNE OTA T YFC ARS MVTA YGM TSVTVSS 137 VD294L AB0 3VL AB060VL DWMTQS PLS LPVTPGE PAS I SCKS SQS KT Y LNWLLQKPGQS PQRLI YLVSKLD3G GSGSGTDFTLK1SRVEAEDVGVYYC QG Generación de NGF e ÍL-18 DVD-lgs adro 36 3EC . Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dom n o Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 138 VD239H AB046VH ÁB020VH EVQLVQSG EVK GESLKISC GS YT GWVRQMPGKGLEWMGEIYP DSETRY$P TISADKSF TAFLQWS3LKASDTA YYC WYPYT F D1WGQGTMVTV5SASTKGPQVQ GLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWI GLEWIG11WGDGTTDYWSAVKSRV ISK FSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATS GQGTLVTVSS 139 VD239L AB0 6VL AB020VL EIV TQSPATLSVSPGERATLSCRASES WYQQKPGQ PRLFI TASTRATDI PARF TEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPS TRLEI RTVAAPDIQ TQSPSSLSASVG CRASQSISNNLKWYQQK G APKLL1YY GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA EHTLPYTFGQGTKLEIKR 140 VD240H AB020VH AB0 6VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFS NWI QPPGKGLEWIG11WGDGTTDYNSA ISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA ATSYYFDYWGQGTLVTVñSAST GPEVQ EVKKPGESLKISCKGSGYTVTSY IGWV GLEWMGFIYPGDSETRYSPTFQGQVTIS TAFLQWSSLKASDTAMYYCARVGSGWYP GQGTMVTVSS 141 VD240L ABO20VI. AB0 6VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASOS WYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRF TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPY emplo 2.21: Generación de NGF e lL-1beta DVD-lqs adro 37 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 142 VD243H AB032VH ABU2ÜVH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFT N VRQAPGKGLE VAII YDGDNQYYAD T1SRÜNSKNTL LQMNGLRAED VYYC GPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQLQE KPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQP WIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTS KLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYF TLVTVSS 143 VD243L AB032VL AB020VL EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQS WYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSFF TDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPF KVDIKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGD RASQS?SNNLNWYQQKPGKAPKLLIY VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAT HTLPYTFGQGTKLEIKR 144 VD244H AB020VH AB032 H QVQLQESGPGLVKPSETLSI.TCTVSGF5 NWIRQ PGKGLEWIG11WGDGTTDYNSA ISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA ATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPQVQ GWQPGRSLRLSCAASGFTFS YGMNWV GLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTtS TLYLQMNGLRAEDTAVY CARDLRTGPF TLVTVSS 145 VD244L AB020VL AB032VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS WYQQ PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRF TDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHT PY pío 2.22: Generación de NGF e 1L6 DVD-lqs ro 38 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 146 VD247H AB0 0VH AB020VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFS GVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWCED RYN LTGSKDTSNNQVF KITNVDTADTATY i IYDVEDY DYWGQGTTLT SSASTKGPQ GPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLN GKGLE IGI IWGDGTTDYNSAVKSRVTI NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYA YWGQGTLVTVSS 147 VD2 7L AB040VL AB020VL QIVLIQSPAIMSASPGEK TMTCSASSS YQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFS SYSLTISRMEAEDAATYYCQQW$GYPYT LEIKRTVAAPDI MTQSPSSLSASVGDR ASQS ISNNLNWYQQKPGKAPKLLX YTS PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATY TLPYTFGQGTKLEIKR 148 VD248H AB020VH AB0 0VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFS HWIRQPPGKGLEWIGI IWGDGTTDYNSA ISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA ATSYYFDYWGQGTLVTVSSAS KGPQ T GILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTNGMGVS GKGLEWLAHIYWDEDKRY PSLKSRLTI NQVFLKITNVDTADTATYYCARRRIIYD Y GQGTTLTVSS 149 VD248L AB020VL AB040VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS WYQQ PGKAPKLLIYYTS FHSGVPS F TDFTF ISSL PEDIATYYCQQEHTLPY empio 2.23: Generación de TNF EGFR (sec, 2) DVP- adro 39 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 150 VD289H AB017VH AB033VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT HVWRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDyAD TISRDNAKN5I.YLQMNSLRAEDTAVYYC STASSLD WGQGTLVTVSSAS KGPQ Q GLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWV GLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINK VFFKM SLQSNDTAIYYCARALTYYDYE GTLVTVSA 151 VD289L AB01 VL AB033VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQG WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRF TDFTLTISSLQPEDVA YYCQRYWRAPY KVEIKRTVAAPDILLTQSPVILSVSPGE RASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIK A IPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIAD NNWPTTFGAGTKLELKR 152 VD290H AB033VH AB017VH QVQLKQS PGLVQ SQSLSI CTVSGFS HWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTP INKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCA DYEFAYWGQGTLVTV5AASTKGPEVQLV VQPGRSLRLSCAASGF FDDYAMHWVRQ EWVSAI WNSGHIDYADSVEGRFTISRD YLQMNSLRAEDTAVYYCAK S LSTASS GTLV VSS 153 VD290L AB033VL AB017 L DILLTQSPVIL3VSPGERVSFSCRASQS WYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRF TDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPT m pío 2.24 : Generación de TNF y RAGE PVD-lqs adro 40 SEC. Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 154 VD295H AB060VH ABQ1 VK QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYT NWVKQAPGKGL WMGYINTNTGES I SE AFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC TAYGMDY GQGTS'VTVSSASTKGPEVQL LVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVR LEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR LYLQMNSLRAEDTAVYYCA VSYLSTAS QGTLVTVSS 155 VD295L AB060VL AB017VL DIVMTQSQKFMST5VGDRVSITCKASQN WYQQRPGQSPKLLIFSASNRYTGVPDRF TDFTLTLSNMQPEDLADYFCQQYSSYPL LELKR VAAPDIQr4TQSPSSLSASVGD RASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAA VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAT NPAPYTFGQGTKVEIKR 156 VD296H AB017VH AB060VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT HWVROAPGKGLEWVSAITWNSGHXD AD TISRDMAKMSLYLQMNSLRAEDTAVY C STASSLDY GQGTLVTVSSAS KGPQIQ ELKKPGE VKISCKASGYTFTNFGMNWV GLKWMGY INTNTGES IYSEEFKGRFAFS T LQI NLKNEDTA FCARSRMV AY QGTSVTVSS 157 VD296L AB017VI, AB060VL DIQMTQSPSSLSASVGDRV I CRASOG YQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRF TDFTL ISSLQPEDVATYYCQRYNRA emplo 2.25: Generación de CP-20 y EGFR (sec. 1) P adro 41 emplo 2.26: Generación de CD-20 y EGFR (sec. 2) P adro 42 SEC . Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia J ID Dominio Domin o Dominio NO. Variable Variable Variable DVD Externo Interno 1234567890123456789012345678 162 VD235H ABO01Vil AB033VH QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYT HWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYMQ TLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC GGDWYF VWGAGTTVTVSAASTKGPQVQ GLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWV GLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLS IN VFF MNSLQSWDTAIYYCAR LTYYDYE GTLVTVSA 163 VD235L AB001VL AB033 L QIVLSQSPAILSPS GEKVTMTCRASSS FQQKPGSSPKPWI TSNLASGVPVRFS SYSLTISRVEAEDAA YYCQQWTSNPPT LEIKRTVAÁPDILLTQSPVILSVSPGER ASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYAS PSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADY NWPTTFGAGTKLELKR 164 VD236H AB033VH AB001VH QVQL QSGPGLVQPSQSLSITC VSGFS HWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTP INKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCA DYEFA WGQGTLVTVSAASTKGFQVQLQ VKPGASVKM3C ASGYTFTSYNMHWVKQ EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTAD YMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGD Y GTTVTVSA 165 VD236X. AB033VL AB001VL DILLTQS VILSVS GERVSFSC ASQS WYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRF TDFTLSI S ESEDIADYYCQQNNNWPT Generación de RGWIA y TNF DVD-lgs adro 43 emplo 2.28: Secuencias de Vector de Clonación ra Clonar Secuencias de Anticuerpo Parentai v PVD- adro 44 SEC. Nombre de Secuencias de Nucleótido ID Vector NO. 12345678901234567890123456789012345678 170 VI GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTQGCACCCTCCT ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG "ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGC GTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC GGACTCCGACGGCTCCT TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGC AATAAAGGAAATTTAT T T AGTGT G T ? GG AAT T T T T G T G T C T C T C ACTC G G AAG G ACAT CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAG CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCC GGTGAACCATGTTGTTACACTC^ GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCG CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGG TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACAC CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGAT GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAA GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGG TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGC GGT G TGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGT TTGCCATGGGTAGCATATAC ACCCAAATATC GGATAGCA TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGG AGTATA GCTATCCTAA GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATG TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTT TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCGT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTG TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAAT GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGC CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCA GATAAGCTGTCA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTT TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTT GTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTC TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATA GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGT AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACG GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGG ATTATC CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCA GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGC CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGC GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATG CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCC CATGTTCTTTCCTGCGTTA CCCC GA TCTGTGGA AACCG CTTTGAG GAGC GA ACCGC CGCCGCAGCCGAACGACCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACC CGCGCGTTGGCCGATTCA TA ^TGCAGCTGGCACGACAGGT GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCT GGCACCCCAGGCT TACAGTTTATGCT CCGGCTCGTATGTT TGTGAGCGGATAACAATT CACACAGGAAACAGCTATGACCA CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAA GCA GCA CTCAATTAG CAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTT TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAA TGGCTCCGGTGC GGCAGAGCGCACATCGCCCACAG CCCCGAGAAGTTGGGGGG CAA TGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTG TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTT CCCGAGGGTGGGGGAGA AAGTGCAGTAG CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTT AACACAGGTAAGTGCCG GTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCT TTATGGCCC TGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCA TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAG GGGTGGGAGAGTTC CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTG CTGGGGCCGCCGCGTGCGA/VRCTGG GGCACCTTCGCGCCTG TTTCGATAAG C CTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGC TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCT TA CGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGC CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCT GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGC TCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG GAGGA.CGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCAC AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCAC GGCGCCGTCCAGGCACCTCGAT AGTTGTCGAGCTTTTGGAG TT AGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCA G T AAC T C T T GGCT G AAG C TC T AC CC AT GCT G G GGG AC AT G AGGGGCC C AGG AAG AC T AC GG G AG G CT AC ACC AAC G TC AAT C A TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAA ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCC AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTT GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGG TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTT TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAG GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA ACCCCTTGGGCAATAAATAC AGTG AGGAA GAAACATTCT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA ACGCC AATGGGGCXCAT AAACAAAGAC AAG TGGCC ACTC T TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG ACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATT ATATCT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTA CCGGGTAGCATATG TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATC ATATCTGGGTAGTATA AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GTC CGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACAGATCGCTGACATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA C C AAG T T TAC T C ?? AT A T AC T AG ?? TG AT TT AAAAC T T C A TAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC TTAACGTGAGTT TCGT CCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG AAAAAAACCACCGCT ACCAGCGGTGGTTTG T GCCGGATCA AACTCT TT T TCCGAAGGT AACTGGCTTC AGC AG AGCGCAG AT TGT CTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGT GGACTCAAGACGATA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCG GA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGT TCGCCACCTCTGACTTGA TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC GGCC TTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA TCC GCGTTATCCCCTGATTC GTGGATAACCGTATTACCGC AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCG ATGTTGTGTGGAAT ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA T C AAT AGT C AG C AACC AT AG T C C C GCC C C T AAC TCCGCCCA TAÁCTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGG CGG CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGGACATGCGCG AGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGA.T CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCC CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTG G CTCATAAGTGAC GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTC GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTAC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGA TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTG GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATC CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAG AT TT T T T G ? G TC C T C AC T C GG AAGG AC AT ATGGG AGG G C A TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCG AACTAAACCTGACTACGACATCTC GCCCCTTCTTCGCGGGG TAATCCCTTCAGTTGG TGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTG TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCT GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCT ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTA GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGA GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCG AT AT AC TAT C C AG ACT AACCCT AAT T C AAT AG CATAT G T ? AC AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGG ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGG CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCA GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAG TGTGAACAGTAAGGT GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAA GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAA C AAT AG AAA C C ATG GGGTGGGGA C AAGC C GT AAAG ACTG G A CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCA TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGG CC AAT GG GG C CC AT AAAC AA AG AC AAG TGG C C ACT C T T TTT ? CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCC ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAA TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGC TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAA G AT CCTT GAG AG T T T T C G C C C CG AAG AACG T T TC C AAT G A TAAAGTTCTGCTATG GGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGC GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGT ACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGA GGCATGACAGTAAG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTT AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGA AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAAC CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCA AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG TCCGGC TG GC TGGT T T AT TGC TG AT AAATC TGG AGCCGGT G A TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTC AG TATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA GAACG GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACT AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTT AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGA AATCTCATGACCAA ACGTGAGTT TCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAA ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTT AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGC CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCC GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCT CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGT GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCG GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAG CTTTTTACGGTTCCTGGCCTT TGCTGGCCTTTTGCTCACAT TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTT CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCT TC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTT AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATT TGGG GCCGCGG GCGG CG ACGG GGCCCG G CGTCCC AGCGCAC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGG AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTG GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTG TGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGC CAAAATGGAG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAG GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGC GCACCTCGA TAG TCTCGAGCTT TGGAGTACGTCGTCTTT GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACAC GAGTGGGT AG T T GGCC AGC TTGGC ACTTGAT GT ATTCTCCTTGG AATT TG AGT TGG TCTT GGTTC T T CTCAAGCC CAG C GTGGT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATC CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGACTTGGACCCCA C CACCC CC CCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG CGGTGGC GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATGTGAT AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGG GGA AACGCCCTCCAATCG C AGG AG AGT G T C AC AG AG C AGG AC AGC AAG G AC AG C AC C T AC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG .AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG CCT C G AC C TC T G GC ???? AAAG G AAAT T AT T TC AT T GC AA GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG TGGTCGAGATCCCTCGGAGA CTCTAGCTAGAGGATCGATCC ACGAACTAAACCTGACTACGACA CTCTGCCCCTTC TCGCG ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG CTGGAGGAGACTTTGCAG C G GGACTGCAACACAACATTG GTAACTCT GGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG TCCTCATATTCACGAGG CGCTGAGAGCACGGTGGGCTAA G GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG C AC CC AAAT AT C T G G AT AG C AT ATGC A CC AA C T AT AT ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT CTGGG AGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCT ATTCCCTTTTTTGC CCT CC GTTTTTGCTCACCCAGAAACGC GGTGAAAG AAA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGA CT TAAGA CCTTGAGAG TTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA GGATCATGTAACTCGCC GATCG TGGGAACCGGAGCTGAA ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCT GCAGCAATGGC GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGA AAGCATTGG A CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT AGTGAGGAGGC,RTTTT GGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG AGCGCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG tGAAGTTAGGCC GC G CACTTG TGTAA TCTCC TGG TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT TTTTTTTC TCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTC CTAGAG CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGACTTGGACCC CCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG ' CAACCCAñ ÍG¾GC CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGAC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAG CACAAGGGCAGTGGCTG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAAT CT TCGCC GCTTCTTCA GTTTAGCTAATAGAATTVACTGC GAGTTGTGAACAGTAAGGT GTGCTCGAAAACA VGGTTTCAGG GACGCCCCCAGAATAAAA GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCC CCT GGGCAATAAATACTAGTG AGGAATGA/LACATTCTGAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGA C AC ACG AAT T T AT GGCT AT GGGC AACAC AT AAT CCT AGTGC A TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCC GGACTCCAC GGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAAT IAAACGG CCAI TGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTT TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGG G AAAA A \GGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCT GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGG CA AAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGC GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGG TCATATTCACGAGG CGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTG GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAA GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGG AGCATATG C A A CTGGGTAGTATA GCTATCCTAATTTATATCTGGG CTATCCTAATCTATA CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCT TAGTA ATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTÁ AGZV TAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAG C CC AAAT ATC ? G G AT AG C AT AT G C ??? CC T AATC T AT ATCTG TGCTATCCTAATCTATATCTGGG AGCATAGGCTATCCTAAT GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGC TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATA CTGGGT TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTG AGCA ATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATT ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGT CCC ATTTGTTTATTT TTCTA7 ATACATTCAAATATGTATCC ACAATAACCCTGA AAA GC TTCAATAATATTGAAAAAGGAA TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTT TGCGGC TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGA TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTC GC C T AC AT C C C G C T C ? G C AA CC G T ACC AGTG GC T G C CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCC GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCT CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGT GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCG GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAG CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACAT TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTT TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTC GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAA TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCfc CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCC G GG G G C T T T T T G G AGGC CTAG G C TT T T C AAAAGCT T GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGAC C T TG AAAG G AGT G G G A AT TG G C TC CGG T GC CCG T C AGT G GGC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAA TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGT GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAG CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAAC TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTA CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCT GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTT TC AGCCATTTAAAATT TTGATGACCTGCTGCGACGCTTTT AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTAT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG AACTACAAGACCACGCC^CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG TCA GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC ACACG CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGG ATCCC CCG AC C T C GACC T C TGG C T AAT AAAG G ????? T ??? T AG T GT GT TG G AAT TTTTTGTGTCTCT C AC T CGG AÁGG C A CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAG CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCC GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGG CTGTAGTTGACATCCT A AAATGGATGTGCACATTTGCCAA GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAAC CC TTATGTGTAAC C TGGCTGAAGCTCTTACACC/VATGCT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCA AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGG ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAAT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAA AGGG'f TAG ??? AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTT GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAA CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCG TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAA AACTGCTGAGTTGT GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCC AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATG GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCC ^"1* ^5 TGCTATCCTAAT TA ATCTGGGTAGCATAGGC ATCCTAAT GGTAGCATATGCTATCCTAA CTATATCTGGGTAGTATATGC CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCC CATGATAAGCTGTCA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTT TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGÁCGTCAGGTGGCACTTT TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTC TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATA GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGT AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACG GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATC CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCA GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGC CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCT GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGG GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATC TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGA CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAAC ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTT TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAA CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGT CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGG GG TTGTTT GAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAG ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTT TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTC GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTC GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCT GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA A AGGAGAGCGCACGAGGGAGCT TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGA AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTT AACACAGG AAGTGCCGTGTGTGGT CCCGCGGGCCTGGCCT TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTAC TCCACCTGGCTGCA TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTC CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTG C GGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTG TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGC TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCT TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGC CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAG GGGG AGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCT GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCAC AAGG GC CT T T C C G T CC T C AG CCG T C G C T T C ATG T G AC C C AC GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAG TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCA GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATT ATTTGCCCTTTTTGAGTT GGATCTTGGTTCATTCTCAAGCC GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAAT ATCCC CGACCTCGAGATCCATTG GCCCGGGCGCCACCATG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAG La presente invención incorpora para referen alidad, técnicas bien conocidas en el campo de biologí suministro de fármaco. Estas técnicas incluyen, pero n técnicas descritas en las siguientes publicaciones: subel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Bi iley & Sons, NY (1993); subel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular . 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X). ntrolied Druq Bioavailabilitv. Druq Product D rformance. Smolen and Batí (eds.), Wiley, New York (1 ege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crvstallization of N d Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1 iversity Press, New York, New York, (1999); odson, in Medical Appíications of Controlled Reléase. 5-138 (1984); mmerlíng, et al., in: Monoclonai Antibodies and T-Ceti rlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). iegler, Gene Transfer and Expression, A Laborato ockton Press, NY (1990); and Weiner eds., Cloninq and Expression Vector nction Analvsis (2001) BioTechniques Press. Westbo 8 pp. (ISBN 1-881299-21 -X). dical Appiications of Controiled Reléase. Langer and C Pres., Boca Ratón, Fia, (1974); d, R. W. & S. B. Primrose, Principies of Gene Mani roduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) ientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; BN 0-632-01318-4). mbrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratorv . 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols 87969-309-6). stained and Controiled Reléase Drug Deliverv Sv Incorporación para Referencia Los contenidos de todas las referencias citadas erencias de literatura, patentes, solicitudes de pate b) que pueden ser citados a través de esta solicitud s uí expresamente para referencia en su totalidad, a ferencias citadas ahí. La práctica de la present ipleará, a menos que se indique otra cos nvencionales de inmunología, biología molecular y biol s cuales son bien conocidas en la técnica.
Equivalentes La invención puede ser modalizada en otras formas n apartarse del espíritu o sus características esen dalidades anteriores, por lo tanto, deben ser cons dos los respectos ilustrativos en lugar de limita l scrita aquí. El alcance de la invención de esta

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una proteína de unión que comprende una lipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido com 1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesad VD2 es un segundo dominio variable de cadena pes C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 es una región Fe; y n es 0 ó 1 ; donde la proteína de unión es capaz de unir un par d leccionados del grupo que consiste de Abeta (sec, 1) y ; TNF-a y Abeta (sec. 2); I L- 1 ß y Abeta (sec. 2); Abet eta (sec. 2); IGF1,2 y Abeta (sec. 2); Abeta (sec. 2) y I eta (sec. 2); TNF-a y Abeta (sec.3); I L- 1 ß y Abeta (se , 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54} y 56. 3. Una proteína de unión que comprende una lipéptido, en donde dicha cadena de polipéptido comp 1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena lige C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 ó 1 ; donde la proteína de unión es capaz de unir un par d leccionados del grupo que consiste de Abeta (sec. 1) y ; TNF-a y Abeta (sec. 2); IL-?ß y Abeta (sec. 2); Abet eta (sec. 2); IGF1,2 y Abeta (sec. 2); Abeta (sec. 2) y I eta (sec. 2); TNF-a y Abeta (sec.3); I L - 1 ß y Abeta (se ec. 1) y Abeta (sec. 3); IGF1,2 y Abeta (sec. 3); Abet - , 51 , 53, 55, y 57. 5. La proteína de unión de acuerdo con la reivin en donde n es 0. 6. Una proteína de unión que comprende primer denas de polipéptido, en donde dicha primera lipéptido comprende un primer VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n: VD1 es un primer dominio variable de cadena pesad VD2 es un segundo dominio variable de cadena pes C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; y X2 es una región Fe; y donde dicha segunda cadena de polipéptido co gundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena iige C es un dominio constante de cadena ligera; 18; IL-6 y Abeta (sec. 3); TNF-a y Abeta (sec. 1 ); IL ec. 1); IGF1 ,2 y Abeta (sec. 1); Abeta (sec. 1 ) y IL-18; I c. 1); Abeta (sec. 1) y RAGE; NGF e IL-18; NGF y I 6; TNF-a y EGFR (sec. 2); TNF-a y RAGE; CD-20 y EG -20 y EGFR (sec. 2); RGMA y TNF-CL 7. La proteína de unión de acuerdo con la reivi donde los dominios variables de cadena pesada mprenden una secuencia de aminoácido seleccionad e consiste de SEC ID Nos: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, , 50, 52, 54, y 56, y en donde los dominios variables era VD1 y VD2 comprenden una secuencia de leccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, f 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, y 57. 8. La proteína de unión de acuerdo con la reivi ó 6, en donde X1 y X2 es una secuencia de leccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs 1-26. gión Fe de una lgG1, lgG2, igG3, lgG4, I g A , IgM, i g E , e 12. La proteína de unión de acuerdo con la reivi ó 6, en donde dicho VD1 de la primera cadena de p ho VD1 de la segunda cadena de polipeptido se o smo primer y segundo anticuerpo parental, respect rción de unión a antígeno del mismo. 13. La proteína de unión de acuerdo con la reivi ó 6, en donde dicho VD1 de la primera cadena de p ho VD1 de la segunda eadena de polipéptido se obti imer y segundo anticuerpo parental diferente, respect rción de unión a antígeno del mismo. 14. La proteína de unión de acuerdo con la reivi ó 6, en donde dicho VD2 de la primera cadena de p cho VD2 de la segunda cadena de polipéptido se o smo primer y segundo anticuerpo parental, respect rción de unión a antígeno del mismo. ¡vindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerp rción de unión del mismo, une dicho primer antíge tencia diferente de la potencia con ia cual dic ticuerpo parental o porción de unión de antígeno del ho segundo antígeno. 18. La proteína de unión de acuerdo con cuaiqu ¡vindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerp rción de unión del mismo, une dicho primer antíge inidad diferente de la afinidad con la cual dic ticuerpo parental o porción de unión de antígeno del ho segundo antígeno. 19. La proteína de unión de acuerdo con cuaiqu vindicaciones 13-15, en donde dicho primer anticuerp rción de unión del mismo, y dicho segundo anticuerp rción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan d nsiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo injertad dominios VL y VH de un brazo individual de un ant gmento dAb; una región de determinación de comple iada (CDR); un anticuerpo de cadena individual; y un d 21. La proteína de unión de acuerdo con la reivi ó 6, en donde dicha proteína de unión posee por lo opiedad deseada exhibida por dicho primer anticuerp rción de unión a antígeno del mismo, o dicho segund rental o porción de unión a antígeno del mismo. 22. La proteína de unión de acuerdo con la reivi donde dicha propiedad deseada se selecciona de rámetros de anticuerpo. 23. La proteína de unión de acuerdo con la reivin donde dichos parámetros se seleccionan del grupo q especificidad de antígeno, afinidad a antígeno, poten ológica, reconocimiento de epítopo, estabilidad, iciencia de producción, inmunogenicidad, farm X2 es una región Fe; y donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-( 2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena liger C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 ó 1 ; donde los dominios variables de cadena pesada mprenden una secuencia de aminoácido seleccionad e consiste de SEC ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, , 50, 52, 54, y 56, y en donde los dominios variables era VD1 y VD2 comprenden una secuencia de eccionada del grupo que consiste de SEC ID NOs: 29, , 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, y 57. donde dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-( 2)n, en donde: VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de cadena lige C es un dominio constante de cadena ligera; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; y n es 0 ó 1 ; donde las DVD-lg une por lo menos un antígeno selec upo que consiste de beta Amiioide (Abeta) (sec. 1), Ab eta (sec. 3), Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a), (IL-?ß), Factor de Crecimiento 1 de tipo Insulina (IGF1 ecimiento 2 de tipo Insulina (IGF2), Interleucina erleucina 6 (IL-6), Receptor para Productos Finales d anzada (RAGE), Factor de Crecimiento de Nerv ceptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF - 27. La proteína de unión de acuerdo con la reivi 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión tiene un velocidad sin acción (Koff) para uno o má leccionados del grupo que consiste de: por roximadamente 10~3s"1; por lo menos aproximadamente menos aproximadamente 10"5s"1¡ y por lo menos aprox '6s"\ según medido a través de resonancia de plasmón 28. La proteina de unión de acuerdo con la reivi 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión tiene un disociación (KD) para' uno o más objetivos selecc upo que consiste de: a lo mucho 10"7M; a lo mucho cho 10*9M; a lo mucho 10*10M; a lo mucho 10"11M; a l ; y a lo mucho 10"13M. 29. Un conjugado de proteína de unión que com oteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, 3, donde dicho conjugado de proteína de unión además ¦ i indicación 30, en donde dicho el agente formador d a radioetiqueta seleccionada del grupo que consiste , 90Y, "Te, 111ln, ,251, 13 l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. 32. El conjugado de proteína de unión de acu i vindicación 30, en donde dicho agente es un agente t otóxico se selecciona del grupo que consiste d tabolito, un agente de alquiiación, un antibiótico, u ecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, ti-m'itótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptó 33. La proteína de unión de acuerdo con la reívi 6, 24, ó 25, en donde dicha proteína de unión es una ión cristalizada. 34. La proteína de unión de acuerdo con la reivin donde dicho cristal es un cristal de liberación rmacéutico libre de vehículo. 35. La proteína de unión de acuerdo con la reivin 46! 39. El vector de acuerdo con la reivindicación 3 ho vector se selecciona del grupo que consiste de p ?3 , pEFBOS, pB V, pJV, pcADN3.1 TOPO, pEF6 TOPO 40. Una célula huésped que comprende un vector n la reivindicación 38. 41. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula huésped es una célula procariótíca . 42. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula huésped es E. Coli. 43. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula huésped es una célula eucariótíca. 44. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula eucariótíca se selecciona del grupo célula protista, célula de animal, célula vegetal y célul 45. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula eucariótíca es una célula de animal s nde dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevis 50. La célula huésped de acuerdo con la reivindic nde dicha célula huésped es una célula de insecto Sf9. 51. Un método para producir una proteína de mprende cultivar una célula huésped descrita en cuaiq ¡vindicaciones 40-50 en un medio de cultivo bajo ficíentes para producir la proteína de unión. 52. El método de acuerdo con la reivindicación 5 50%-75% de la proteína de unión producida es una ión tetravalente específica doble. 53. El método de acuerdo con la reivindicación 5 75%-90% de la proteína de unión producida es una ión tetravalente específica doble. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 5 90%-95% de la proteína de unión producida es una ión tetravalente específica doble. ivindicación 57, en donde dicho agente terapéutico lecciona del grupo que consiste de: agente terapéut rmador de imagen, agente cítotoxico, inhibidores de a ibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-e queadores de molécula de adhesión; anticuerpo ant gmento funcional del mismo; metotrexato; c pamicina; FK506; una etiqueta o reportero dét tagonista de TNF; un anti-reumático; un relajante rcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal ( algésico, un anestésico, un sedante, un anestésic queador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-ps rticoesteroide, un esferoide anabólico, una eritropo munización, una inmunoglobuüna, un inmunosupresor, u crecimiento, un fármaco de reemplazo de hormona rmacéutico, un antidepresivo, un anti»psicótico, un esti dicamento para asma, un agonista beta, un esteroid pondiloatropatia, lupus sistémico eritematoso, enfe ohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria de betes mellitus dependiente de insulina, tiroidi fermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis es fermedad de injerto contra huésped, rechazo de tr gano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada co órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación i eminada, enfermedad de awasaki, enfermedad ndrorne nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granul egener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculítis micr ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choq ndrorne de choque tóxico, síndrome de sepsis, fermedades infecciosas, enfermedades parásitas, s munodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda ntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de oplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, m nfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolííica iemia hemolítica positiva de Coombs, anemia pernicios emia perniciosa juvenil, encefalitis m ialgica/enfermed yal, candidiasis mucocutánea crónica, hepatitis maria, hepatitis autoinmune criptogénica, sín munodeficiencia adquirida, enfermedades relació munodef ¡ciencia adquirida, hepatitis B, he munodeficiencia variada común (hipogamaglobulinem mún), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, f lla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fib.rótíc rosante criptogénica, enfermedad pulmonar inter flamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad de tejid ociada con enfermedad pulmonar intersticial, enfermed ociada con enfermedad dé tejido conectivo mixta, lmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, lmonar asociada con artritis reumatoide, enfermeda toinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (hepatitis sica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 ( ticuerpo anti-KLM), hípogiicemia mediada autoinmun'e, insulina tipo B con acantosis nigricans, enfermedad in ociada con trasplante de órgano, enfermedad inm ociada con trasplante de órgano, osteoartritis, clerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, iopática, neutropenia autoinmune, NOS de enferm omerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculin NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple b-tipos), oftalmía sinpatética, hipertensión pulmonar s fermedad de tejido conectivo, síndrome de G nífestacíón pulmonar de políarteritis nodosa, fiebr uda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Stiil, témica, síndrome de Sjórgren, enfermedad de Takaya or ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedade r tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferente lor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de tómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, d ctal y malignidades hematopoyéticas (leucemia etalipoprotemia, Acrocianosis, proceso por parásitos o udos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfobiá LL), leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteri ónica, pancreatitis aguda, falla renal aguda, aden idos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SID ucida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis ntacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficienci ti-tripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angin generación celular de cuero anterior, terapia antí-cd ti-fosfolípido, reacciones de hipersensibilidad de a eurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, stornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocí ML), alcoholismo crónico, patologías inflamatoria ucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar ónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, lorectal, falla cardiaca congestiva, conjuntivitis, de ntacto, cor pulmonar, enfermedad de arteria coronaria, Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa de cultivo, fibros stornos asociados con terapia de citocina, demencia fermedades desmielizantes, fiebre hemorrágica p rmatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabet fermedad ateroesclerótica diabética, enfermedad del wy Difuso, cardiomiopatía congestiva dilatada, trasto nglios básales, síndrome de Down en edad media, tr vimiento inducidos por fármacos, que bloquean los re pamina del sistema nervioso central (CNS), sen rmacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, end - trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálísi émico hemoiítico/púrpura trombocitopénico t morragia, hepatitis (A), arritmias de haz de His, infecc uropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, tra vimiento hipercinéticos, reacciones de h i pe rs umonitis por hipersensibilidad, hipertensión, tra vimiento hipocinéticos, evaluación hipotalámica-p renal, enfermedad de Addison id io pática } fibrosi iopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, áste scular espinal infantil, inflamación de la aorta, í posicion a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neu ño por isquemia-reperfusión, choque isquémico, artritis enil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kap trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, tema cortiespinal, lipedema, rechazo de trasplante federma, malaria, linfoma maligno, histiocitosis malign fermedades neurodegenerativas, atrofias musculares n fiebre neutropénica , linfoma de no Hodgkin, oclusión dominai y sus ramificaciones, trastornos arteriales apia okt3, orquítis/epidídímitis, orquitis/procedimientos vasectomía, órganomegalia, osteoporosis, rechazo d páncreas, carcinoma pancreático, síndrome par ercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de fermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenial, ricardial, enfermedad aterosclerótica periférica, sculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, umonía carinii, neumonía, síndrome de POEMS {pol ganomegalia, endocrinopatía, gamopatia monoclonal, cambios de piel), síndrome de pos-perfusión, síndro mba, síndrome de cardiotomía pos-MI, preclampsi ogresiva de supra-núcleo, hipertensión pulmonar prim radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enf l sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, sí spuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juve témico, ALL de célula T o FAB, telangiectasia, tr iiterante, trombocitopenia, toxicidad, uma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad d persensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, ticaria, enfermedades cardíacas valvulares, venas sculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, ntricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vit éptica, síndrome hemafagocítico asociado vital, s ernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de cualquier órgano o tejido, síndromes coronari lineuritis idiopática aguda, poliradiculoneuropatía d lamatoría aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still opecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti emía aplástica, arteriesclerosis, eczema atópico, fermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), d rmatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus seo, prolapsos de disco, anemia hemolítica inmune i rmacos, endocarditis, endometriosis, endoftaimitis, tema multiforme, eritema multiforme mayor, stacional, síndrome de Guillain-Barré (GBS), fiebre ndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idíopátic tersticial idíopática, alergia mediada por IgE, anemi muñe, miositis corporal de oclusión, enfermedad inflam fecciosa, enfermedad desmielizante inflamatoria, rdiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IP eratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de fermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, hist uía de Langerhan, reticulares livedo, degeneració liangitis microscópica, morbus bechterev, trastorno triz, penfigoide de membrana mucosa, falla orgáni matopoyéticas (leucemia y linfoma), prostatitis, óbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, n currente óptica, restenosis, enfermedad cardiaca reu inovitis, acné, pustulosís, hiperostosis y osteítis), es iloidosis secundaria, ataque pulmonar, escleriti suficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejid ociada con silicón, dermatosis de sneddon-wilktnson , quilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), s spuesta inflamatoria sistémica, arteritis tempora xoplásmica, necrolisís epidérmica tóxica, mielitis APS (receptor de factor de necrosis tumoral), reacc o 1, diabetes tipo II, urticaria, neumonía intersticial sculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis viral, síndror yanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macu ración de heridas, artropatía asociada con yersinia y sa 61. EL método de acuerdo con la reivindicación 6 etal, bucal, sublingual, intranasal, y transdérmica. 62. Un método para generar una I nmunoglobulina riable Doble capaz de unir dos antígenos, que co sos de: a) obtener un primer anticuerpo parental o una ión a antígeno de! mismo, capaz de unir un primer antí b) obtener un segundo anticuerpo parental o una ión a antígeno del mismo, capaz de unir un segundo an c) construir primera y tercera cadenas de poli mprenden VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en donde VD1 es un primer dominio variable de cadena pesa un primer anticuerpo parental o una proteína de unió \ mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cad tenido de un segundo anticuerpo parental o una proteí antígeno del mismo; * VD2 es un segundo dominio variable de cadena lig un segundo anticuerpo parental o porción de unión a smo; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un enlazador siempre que no sea CH1; (X2)n no comprenda una región Fe; y n es 0 ó 1 ; y e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cua polipéptido; de manera que se genera una Inmuno minio Variable Doble capaz de unir dicho primer y di tígeno, en donde la proteína de unión es capaz de un ttgenos seleccionados del grupo que consiste de Abet eta (sec. 3); TNF-a y Abeta (sec. 2); IL-?ß y Abeta (se ec. 1) y Abeta (sec. 2); IGF 112 y Abeta (sec. 2); Abet -18; IL-6 y Abeta (séc. 2); TNF-a y Abeta (sec.3); IL ec. 3); Abeta (sec. 1) y Abeta (sec. 3); IGF1.2 y Abe - · , y en donde los dominios variables de cadena ligera mprenden una secuencia de aminoácido seleccionad e consiste de SEC ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, , 51, 53, 55, y 57. 64. E! método de acuerdo con la reivindicación 6 cho primer anticuerpo parental o antígeno de unión d cho segundo antígeno parental o porción de unión de smo, se seleccionan del grupo que consiste de un mano, un anticuerpo injertado de CDR, y un manizado. 65. El método de acuerdo con la reivindicación 6 cho primer anticuerpo parental o antígeno de unión d ho segundo antígeno parental o porción de unión de smo, se seleccionan del grupo que consiste de un fra fragmento F(ab')2; un fragmento bivalente que com gmentos Fab enlazados a través de un puente de disul · 67. E! método de acuerdo con la reivindicación 6 ho segundo anticuerpo parenta! o antígeno de unión see por lo menos una propiedad deseada exhib munoglobulina de Dominio Variable Doble. 68. E! método de acuerdo con la reivindicación 6 región Fe se selecciona del grupo que consiste de un secuencia nativa y una región Fe de secuencia variant 69. El método de acuerdo con la reivindicación 6 región Fe se selecciona del grupo que consiste de un una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgÉ, e IgD. 70. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ha propiedad deseada se selecciona de uno o más pa ticuerpo. 71. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ha propiedad deseada se selecciona de uno o más pa ticuerpo. nsiste de especificidad de antígeno, afinidad a antígen nción biológica, reconocimiento de epítopo, lubilidad, eficiencia de producción, inmu rmacocinétíca, biodisponibílidad, reactividad cruzada ión de antígeno ortóloga. 74. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ho primer anticuerpo parental o porción de unión de smo, une dicho primer antígeno con una afinidad dife inidad con la cual dicho segundo anticuerpo^ o porción tígeno del mismo une dicho segundo antígeno. 75. El método de acuerdo con la reivindicación 6 cho primer anticuerpo parental o porción de unión de smo, une dicho primer antígeno con una potencia dtfe tencia con la cual dicho segundo anticuerpo o porción tígeno del mismo une dicho segundo antígeno, 76. Un método para generar una Inmunoglobulina munogtobulina de Dominio Variable Doble; c) construir primera y tercera cadenas de poli mprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena pesa un primer anticuerpo parental o una proteína de unión i mismo; VD2 es un segundo dominio variable de cad tenido de un segundo anticuerpo parental o una proteí antígeno del mismo; C es un dominio constante de cadena pesada; X1 es un enlazador siempre que no sea CH1; X2 es una región Fe; y n es 0 ó 1 ; d) construir segunda y cuarta cadenas de poli mprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en donde; VD1 es un primer dominio variable de cadena lige e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cua polipéptido; de manera que se genera una Inmunog minio Variable Doble capaz de unir dicho primer tígenos con propiedades deseadas, en donde la proteí capaz de unir un par de antígenos seleccionados de nsiste de Abeta (sec. 1) y Abeta (sec. 3); TNF-a y Ab 1ß y Abeta (sec. 2); Abeta (sec. 1) y Abeta (sec. 2 eta (sec. 2); Abeta (sec. 2) y IL-18; IL-6 y Abeta (sec. eta (sec.3); IL-?ß y Abeta (sec. 3); Abeta (sec. 1) y Ab F.1.2 y Abeta (sec. 3); Abeta (sec. 3) e IL-18; IL-6 y Ab F-a y Abeta (sec. 1); i L- 1 ß y Abeta (sec. 1); IGF1 ,2 y ; Abeta (sec. 1) y IL-18; IL-6 y Abeta (sec. 1); Abet GE; NGF e IL-18; NGF y IL-?ß; NGF y IL-6; TNF-a y ; TNF-a y RAGE; CD-20 y EGFR (sec. 1); CD-20 y EG MA y TNF-a.
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