MX2011005953A - Inmunoglobulinas de dominio variable dual y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas diseñadas, métodos para hacerlas, y específicamente a sus usos en la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de enfermedad.

Description

I NM UNOG LOBU LINAS DE DOMINIO VARIABLE DUAL Y USOS DE LAS MISMAS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es u na solicitud no provisional q ue reclama prioridad para la solicitud provisional E. U .A. No. de serie 61 /200,877, presentada el 4 de Diciembre del 2008 y la solicitud provisional E. U .A. No. de serie 61 /21 2 ,071 , presentada el 7 de abril del 2009, cuyos contenidos se incorporan en la presente solicitud para referencia .

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas a métodos para elaborarlas, y específicamente a sus usos en el diagnóstico , prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, cáncer, y otras enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas diseñadas, tales como los anticuerpos mutiespecíficos que pueden ligar dos o más antígenos son conocidos en la técnica. Dichas proteínas de unión multiespecíficas se pueden generar utilizando técnicas de fusión celular, conjugación química, o ADN recombinante.

Se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando tecnología de cuadroma (véase Milstein, C. y A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40) tomando como base la fusión somática de dos líneas de célula de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales (mAbs) de múrido con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de dos cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina (Ig) diferentes dentro de la línea celular de hibridoma híbrido resultante (o cuadroma), se generan hasta diez especies de Ig diferentes, de las cuales solamente una es el anticuerpo biespecífico funcional. La presencia de subproductos mal apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, significa que se requieren procedimientos de purificación sofisticados.

También se pueden producir anticuerpos biespecíficos mediante conjugación química de dos mAbs diferentes (véase Staerz, U.D., et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31). Este método no produce una preparación homogénea. Otros métodos han utilizado conjugación química de dos mAbs diferentes o fragmentos de anticuerpo más pequeños (véase Brennan, M., et al. (1985) Science 229(4708): 81-3).

Otro método utilizado para producir anticuerpos biespecíficos es la copulación de dos anticuerpos progenitores con un entrelazador hetero-bifuncional, pero los anticuerpos biespecíficos resultantes padecen de heterogeneidad molecular significativa debido a que la reacción del entrelazador con los anticuerpos progenitores no es dirigida a sitio. Para obtener preparaciones más homogéneas de anticuerpos biespecíficos se han entrelazado químicamente dos fragmentos Fab diferentes en sus residuos cisteína del gozne en una manera dirigida a sitio (véase Glennie, M.J., et al (1987) J. Immunol. 139(7) 2367-75). Pero este método da como resultado fragmentos Fab'2, no la molécula de IgG completa.

Se ha desarrollado una amplia variedad de otros formatos de anticuerpo biespecífico recombinante (véase Kriangkum, J., et al (2001) Biomol. Eng. 18(2):31 -40). De entre estos las moléculas de Fv de cadena individual en tándem y los diacuerpos, y varios derivados de los mismos, son los más ampliamente utilizados. En forma rutinaria, la construcción de estas moléculas comienza a partir de dos fragmentos Fv de cadena individual (scFv) que reconocen antígenos diferentes (véase Economides, A.N., et al. (2003) Nat. Med 9(1): 47-52). Las moléculas de scFv en tándem (taFv) representan un formato directo que simplemente conecta las dos moléculas de scFv con un enlazador peptídico adicional. Los dos fragmentos de scFv presentes en estas moléculas de scFv en tándem forman entidades que se pliegan separadas. Se pueden utilizar varios enlazadores para conectar los dos fragmentos de scFv y enlazadores con una longitud de hasta 63 residuos (véase Nakanishi, K., et al. (2001) Ann. Rev. Immunol. 19:423-74). Aunque los fragmentos de scFv progenitores pueden ser expresados normalmente en forma soluble en bacterias, con frecuencia se observa, sin embargo, que las moléculas scFv en tándem forman agregados insolubles en bacterias. Por lo tanto, usualmente se aplican protocolos de re-plegamiento o el uso de sistemas de expresión en mamífero para producir moléculas de scFv en tándem solubles. En un estudio reciente, se reportó la expresión in vivo mediante conejos y vacas transgénicas de scFv en tándem dirigido contra CD28 y un proteoglucano asociado a melanoma (véase Gracie, J.A., et al. (1999) J. Clin. Invest. 104(10): 1393-401). En esta construcción, las dos moléculas de scFv se conectan mediante un enlazador CH1 y se encuentran concentraciones en suero de hasta 100 mg/l del anticuerpo biespecífico. Se emplean diversas estrategias incluyendo variaciones del orden del dominio o el uso de enlazadores intermedios con una longitud o flexibilidad variable para permitir la expresión soluble en bacterias. Actualmente unos pocos estudios han reportado la expresión de moléculas de scFv en tándem solubles en bacterias (véase Leung, B.P, et al (2000) J. Immunol. 164(12): 6495-502; Ito, A., et al (2003) J. Immunol. 170(9):4802-9; armi, A., et al. (2002) J. Neuroimmunol. 125(1 -2): 134-40) utilizando ya sea un enlazador Ala3 muy corto o enlazadores ricos en glicina/serina largos. En otro estudio, se utiliza despliegue en fago de un repertorio de scFv en tándem que contiene enlazadores intermedios aleatorizados con una longitud de 3 o 6 residuos para enriquecer respecto a aquellas moléculas que se producen en forma soluble activa en bacterias. Este método da como resultado el aislamiento de una molécula de scFv en tándem con un enlazador de 6 residuos de aminoácido (véase Arndt, M . y J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305-21 ). No es claro si esta secuencia enlazadora representa o no una solución general para la expresión soluble de moléculas de scFv en tándem . Sin embargo, este estudio demuestra que el despliegue en fago de moléculas de scFv en tándem en combinación con mutagénesis dirigida es una herramienta poderosa para enriquecer respecto a estas moléculas, las cuales pueden ser expresadas en bacterias en una forma activa.

Los diacuerpos biespecíficos (Db) util izan el formato de diacuerpo para expresión . Los diacuerpos se producen a partir de fragmentos de scFv red uciendo la longitud del enlazador q ue conecta el domino VH y VL hasta aproximadamente 5 residuos (véase Peipp, M . y T. Valerius (2002) Biochem. Soc. Trans . 30(4): 507-1 1 ) . Esta red ucción del tamaño del enlazador facilita la dimerización de dos cadenas polipeptídicas mediante apareamiento cruzado de los dominios VH y VL. Los diacuerpos biespecíficos se prod ucen expresando, dos cadenas de polipéptido con , cualquiera de las estructu ras VHA-VLB y VH B-VLA (configuración VH-VL) , o VLA-VH B y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. En el pasado se ha producido u na g ran variedad de diacuerpos biespecíficos diferentes y la mayoría de estos son expresados en forma soluble en bacterias. Sin embargo, u n estudio comparativo reciente demuestra que la orientación de los dominios variables puede influir en la expresión y formación de sitios de u nión activos (véase Mack, M . et al. (1 995) Proc. Nati. Acad . Sci . U S A 92(1 5) : 7021 -5) . Sin embargo, la expresión soluble en bacterias representa una ventaja importante sobre las moléculas de scFv en tándem . Sin embargo, debido a que se expresan dos cadenas de polipéptido diferentes dentro de una sola célula se pueden producir homodímeros inactivos junto con los heterodímeros activos. Esto necesita la implementación de pasos de pu rificación ad icionales con el fin de obtener preparaciones homogéneas de diacuerpos biespecíficos. Una estrategia para forzar la generación de diacuerpos biespecíficos es la producción de diacuerpos de tipo botón en ojal (véase Holliger, P. , T. Prospero y G . Winter ( 1 993) Proc. Nati. Acad . Sci. U S A 90(1 4): 6444-8.1 8) . Esta estrategia fue demostrada para un diacuerpo biespecífico dirigido contra HER2 y CD3. Se introd uce un botón grande en el dominio VH mediante intercambio de Val37 con Phe y Leu45 con Trp y se produce un ojal complementario en el dominio VL mutando Phe98 a Met y Tyr87 a Ala, ya sea en el dominio variable anti-H ER2 o el dominio variable anti-CD3. Mediante el uso de esta estrategia la prod ucción de diacuerpos biespecíficos se puede incrementar desde 72% por parte del diacuerpo progenitor hasta más del 90% por parte del diacuerpo de tipo botón en ojal. Como un aspecto importante, los rendimientos de producción disminuyen sólo ligeramente como resultado de estas mutaciones. Sin embargo, se observa una reducción de actividad de unión a antígeno para varias construcciones analizadas. Por lo tanto, este método demasiado elaborado requiere el análisis de varias construcciones con el fin de identificar aquellas mutaciones que producen la molécula heterodimérica sin actividad de unión alterada. Además, dicho método requiere modificación mediante mutación de la secuencia de ¡nmunoglobulina en la región constante, creando de esta manera la forma no nativa y no natural de la secuencia del anticuerpo, lo cual puede dar como resultado inmunogenicidad incrementada, poca estabilidad in vivo, así como farmacocinética indeseable.

Los diacuerpos de cadena individual (scDb) representan una estrategia alternativa para mejorar la formación de moléculas tipo diacuerpo biespecífico (véase Holliger, P. y G Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother 45(3-4): 128-30, Wu, A.M., et al. (1996) Immunotechnology 2(1):p. 21-36). Los diacuerpos de cadena individual biespecífica se producen conectando las dos cadenas de polipéptido formadoras del diacuerpo con un enlazador intermedio adicional con una longitud de aproximadamente 15 residuos de aminoácido. Por consiguiente, todas las moléculas con un peso molecular correspondiente a los diacuerpos de cadena individual monoméricos (58-60 kDa) son biespecíficos. Varios estudios han demostrado que los diacuerpos de cadena individual biespecíficos son expresados en bacterias en forma soluble y activa con la mayoría de las moléculas purificadas presentes como monómeros (véase Holliger, P. y G. Winter (1997) Cáncer Immunol. Immunother.45(3-4): 128-30; Wu, A.M., et al (1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36; Pluckthum, A. y P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2):85-105; Ridgway, J.B., et al (1996) Protein Engin. 9(7): 617-21). Por lo tanto, los diacuerpos de cadena individual combinan las ventajas de los scFv en tándem (todos los monómeros son biespecíficos) y los diacuerpos (expresión soluble en bacteria).

Más recientemente, se han fusionado diacuerpos a Fe para generar moléculas mas perecidas a Ig , nombradas di-diacuerpos (véase Lu D . , et al (2004) J. Biol . Chem 279(4) :2856-65) . Además, se han descrito construcciones de anticuerpo multivalente que comprenden dos repeticiones de Fab en la cadena pesada de una IgG y que pueden ligar cuatro moléculas de antígeno (véase WO 01 77342A1 , y Miller, K. , et al (2003) J . I mmu nol. 1 70(9) : 4854-61 ).

Existe en la técnica la necesidad de proteínas de unión multivalentes mejoradas que puedan ligar dos o más antígenos. La solicitud de patente E. U .A. No. de serie 1 1 /507,050 provee una familia novedosa de proteínas de unión que pueden ligar dos o más antígenos con alta afinidad , las cuales son llamadas inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg™) . La presente invención provee proteínas de unión novedosas adicionales que pueden ligar dos o más antígenos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención pertenece a proteínas de unión multivalentes que pueden ligar dos o más antígenos. La presente invención provee una familia novedosa de proteínas de unión que pueden ligar dos o más antígenos con alta afinidad .

En una modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 o 1. En una modalidad el VD1 y VD2 en la proteína de unión son los dominios variables de la cadena pesada. En otra modalidad, el dominio variable de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de un dominio variable de la cadena pesada de múrido, un dominio variable de la cadena pesada de humano, un dominio variable de la cadena pesada injertado con CDR, y un dominio variable de la cadena pesada humanizado. Incluso en otra, modalidad VD1 y VD2 pueden ligar el mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 pueden ligar antígenos diferentes. Incluso en otra modalidad, C es un dominio constante de la cadena pesada. Por ejemplo, X1 es un enlazador con la condición que X1 no sea CH1.

Por ejemplo, X1 es un enlazador que se selecciona a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G S)4 (SEQ ID NO: 9), SAKTTP KLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27); GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28); PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29); PNLLGGP (SEQ ID NO: 30); GGGGGGP (SEQ ID NO: 31); PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32); PTIS PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 33); TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34); TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35); LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36); ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37); ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38); ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39); TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40); ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41); TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42); ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43); LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44); TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45); ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46); PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47); TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48); AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49); PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50); PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51); PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52); PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53); GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54); GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55); AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56); GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57); AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58); ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59); ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60); TVAAPSV (SEQ ID NO: 61), y TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62). En una modalidad, X2 es una región Fe. En otra modalidad, X2 es una región Fe variante.

En una modalidad la proteína de unión descrita en la presente solicitud comprende una cadena de polipéptido, en la cual la cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe.

En una modalidad, VD1 y VD2 en la proteína de unión son los dominios variables de la cadena ligera. En una modalidad, el dominio variable de la cadena ligera se selecciona a partir del grupo que consiste de un dominio variable de la cadena ligera de múrido, un dominio variable de la cadena ligera de humano, un dominio variable de la cadena ligera injertado con CDR, y un dominio variable de la cadena ligera humanizado. En una modalidad VD1 y VD2 pueden ligar el mismo antígeno. En otra modalidad VD1 y VD2 pueden ligar antígenos diferentes. En una modalidad, C es un dominio constante de la cadena ligera. En otra modalidad, X1 es un enlazador con la condición que X1 no sea CL1.

En una modalidad, X1 es un enlazador que se selecciona a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9). SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27); GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28); PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29); PNLLGGP (SEQ ID NO: 30); GGGGGGP (SEQ ID NO: 31); PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32); PTIS PAP LLGGP (SEQ ID NO: 33); TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34); TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35); LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36); ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37); ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38); ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39); TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40); ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41); TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42); ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43); LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44); TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45); ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46); PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47); TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48); AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49); PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50); PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51); PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52); PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53); GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54); GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55); AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56); GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57); AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58); ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59); ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60); TVAAPSV (SEQ ID NO: 61), y TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62).

En una modalidad, la proteína de unión no comprende X2. En una modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden el mismo enlazador. En otra modalidad, la cadena pesada variable y la cadena ligera variable comprenden enlazadores diferentes. En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador corto (aproximadamente 6 aminoácidos). En otra modalidad, tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable comprenden un enlazador largo (mayor de 6 aminoácidos). En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador corto y la cadena ligera variable comprende un enlazador largo. En otra modalidad, la cadena pesada variable comprende un enlazador largo y la cadena ligera variable comprende un enlazador corto.

En una modalidad la proteína de unión descrita en la presente solicitud comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe.

En otra modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende dos cadenas de polipéptido, en la cual dicha primera cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y dicha segunda cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 no comprende una región Fe. En una modalidad particular, la proteína de unión de Dominio Variable Dual (DVD) comprende cuatro cadenas de polipéptido en la cual las primeras dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, respectivamente en las cuales VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, y X2 es una región Fe; y las segundas dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n respectivamente, en las cuales VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , y X2 no comprende una región Fe. Dicha proteína de Dominio Variable Dual (DVD) tiene cuatro sitios de unión a antígeno.

En otra modalidad las proteínas de unión descritas en la presente solicitud pueden ligar uno o más objetivos. En una modalidad , el objetivo se selecciona a partir del grupo q ue consiste de citocinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores . En otra modalidad, la proteína de u nión puede mod ular una función biológica de uno o más objetivos. En otra modalidad, la proteína de unión puede neutralizar uno o más objetivos. La proteína de unión de la invención puede ligar citocinas que se seleccionan a partir del grupo que consiste de linfocinas , monocinas, hormonas polipeptídicas, receptores, o marcadores de tu mor. Por ejemplo, la DVD-lg de la invención puede ligar dos o más de los siguientes : VEG F, NRP1 , SOST, y TN F (véase también Tabla 4). En una modalidad específica la proteína de unión puede ligar pares de objetivos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de VEGF y NRP 1 ; y TNF y SOST.

En una modalidad , la proteína de unión que puede ligar a N RP 1 (sec. 1 ) y VEGF (sec. 1 ) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ I D N O . 84 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de S EQ I D NO. 85.

En una segunda modalidad , la proteína de unión que puede ligar a N RP1 (sec. 1 ) y VEGF (sec. 1 ) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 86 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 87.

En una tercera modalidad, la proteína de unión que puede ligar a NRP1 (sec. 1) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 88 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 89.

En una cuarta modalidad, la proteína de unión que puede ligar a NRP1 (sec. 1) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 90 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 91.

En una quinta modalidad, la proteína de unión que puede ligar a NRP1 (sec. 1) y VEGF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 92 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 93.

En una modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 94 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 95.

En una segunda modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 96 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 97.

En una tercera modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 98 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO.99.

En una cuarta modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 100 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 101.

En una quinta modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 102 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 103.

En una sexta modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 104 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 105.

En una séptima modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 106 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 107.

En una octava modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 108 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 109.

En una novena modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 110 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 111.

En una décima modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 112 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 113.

En una décimo primera modalidad, la proteína de unión que puede ligar a SOST y TNF (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de SEQ ID NO. 114 y una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de SEQ ID NO. 115.

En una modalidad, la proteína de unión que puede ligar a TNF (sec. 3) e IL-13 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de cualquiera de SEQ ID NOs: 116-122. En una modalidad, la proteína de unión que puede ligar a TNF (sec. 3) e IL-13 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de cualquiera de SEQ ID NOs: 123-128. Cualquiera de las cadenas pesadas de SEQ ID NOs: 116-122 se puede combinar con cualquiera de las cadenas ligeras de SEQ ID NOs: 123-128 para elaborar una DVD-lg de la invención.

En una modalidad, la proteína de unión que puede ligar a TNF (sec. 2) e IL-13 (sec. 2) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena pesada de DVD de cualquiera de SEQ ID NOs: 129-130. En una modalidad, la proteína de unión que puede ligar a TNF (sec. 3) e IL-13 (sec. 1) comprende una secuencia de aminoácido de la cadena ligera de DVD de cualquiera de SEQ ID NOs: 131-132. Cualquiera de las cadenas pesadas de SEQ ID NOs: 129-130 se puede combinar con cualquiera de las cadenas ligeras de SEQ ID NOs: 131-132 para elaborar una DVD-lg de la invención.

En otra modalidad la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual dicho (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente. En una modalidad, la región Fe está ausente de la proteína de unión.

En otra modalidad, la invención provee una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de u nión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera q ue se obtiene a partir de un seg undo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1 )n es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 )n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente. En una modalidad , (X2)n está ausente de la proteína de unión .

En otra modalidad la proteína de un ión de la invención comprende la primera y segunda cadenas de polipéptido, en la cual dicha primera cadena polipeptídica comprende un primer VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD 1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de u n segu ndo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1 )n es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 )n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; y en la cual dicha segu nda cadena polipeptídica comprende un segundo VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual VD 1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual dicho (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente. En otra modalidad, la proteína de unión comprende dos primeras cadenas de polipéptido y dos segundas cadenas de polipéptido. Incluso en otra modalidad, (X2)n está ausente del segundo polipéptido. Incluso en otra modalidad, la región Fe, si está presente en el primer polipéptido, se selecciona a partir del grupo que consiste de región Fe de la secuencia original y una región Fe de secuencia variante. Incluso en otra modalidad, la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe proveniente de una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.

En otra modalidad la proteína de unión de la invención es una DVD-lg que puede ligar dos antígenos que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en la cual, la primera y tercera cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual dicho (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; y en la cual la segunda y cuarta cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1)n es un enlazador con la condición que éste no sea CH1, en el cual dicho (X1)n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente.

La invención provee un método para elaborar una proteína de unión de tipo DVD-lg mediante pre-selección de los anticuerpos progenitores. En una modalidad, el método para elaborar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar a dos antígenos comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar un primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar un segundo antígeno; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada ; (X1 )n es un enlazador con la cond ición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 )n puede estar presente o ausente ; y (X2)n es una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido q ue comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual , VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera q ue se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho seg undo anticuerpo progenitor o unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; (X1 )n es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 )n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende u na región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; e) expresar dichas primera , segunda , tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que se pueda unir a dichos primero y segundo antígenos.

I ncluso en otra modalidad , la invención provee un método para generar u na I nmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar dos antígenos con las propiedades deseadas que comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar un primer antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la I nmunoglobulina de Dominio Variable Dual; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de u nión a antígeno del mismo, que pueda ligar un segundo antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la I nmu noglobulina de Dominio Variable Dual; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual ; VD 1 es un primer domin io variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de u nión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada ; (X 1 )n es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 ) n puede estar presente o ausente; y (X2)n es una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; d) construir la segu nda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual; VD 1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es u n seg undo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera ; (X1 )n es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 , en el cual dicho (X1 )n puede estar presente o ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, en el cual dicho (X2)n puede estar presente o ausente; e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar a dichos primero y segundo antígenos con las propiedades deseadas.

En una modalidad, los VDI de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir del mismo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, los VDI de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir de anticuerpos progenitores diferentes o porciones de unión a antígeno de los mismos. En otra modalidad, los VD2 de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir del mismo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, los VD2 de la primera y segunda cadenas de polipéptido descritos en la presente solicitud se obtienen a partir de anticuerpos progenitores diferentes o porciones de unión a antígeno de los mismos.

En una modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, son el mismo anticuerpo. En otra modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, son anticuerpos diferentes.

En una modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un primer antígeno y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un segundo antígeno. En una modalidad particular, el primer y segundo antígenos son el mismo antígeno. En otra modalidad, los anticuerpos progenitores se unen a epítopes diferentes en el mismo antígeno. En otra modalidad el primer y segundo antígenos son antígenos diferentes. En otra modalidad, el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al segundo antígeno. Incluso en otra modalidad, el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la cual el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se une al segundo antígeno.

En otra modalidad el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, y el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, se seleccionan a partir del grupo que consiste de, anticuerpo humano, anticuerpo injertado con CDR, y anticuerpo humanizado. En una modalidad, las porciones de unión a antígeno se seleccionan a partir del grupo que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente de disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; u n fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, un fragmento dAb, u na región determinante de complementariedad (CDR) aislada , u n anticuerpo de cadena individual , y diacuerpos.

En otra modalidad la proteína de un ión de la invención posee por lo menos una propiedad deseada exhibida por el primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, o el segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo. De manera alternativa , el primer anticuerpo progenitor o porción de u nión a antígeno del mismo y el segu ndo anticuerpo progenitor o porción de u nión a antígeno del mismo poseen por lo menos una propiedad deseada exhibida por la I nmu noglobulina de Dominio Variable Dual . En u na modalidad , la propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad , los parámetros del anticuerpo se seleccionan a partir del grupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antígeno, potencia , función biológica , reconocimiento de epítope, estabilidad , solubilidad , eficiencia de producción , inmunogenicidad , farmacocinética, biodisponibilidad , reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo. En u na modalidad la proteína de unión es multivalente. En otra modalidad, la proteína de unión es multiespecífica. Las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas descritas en la presente solicitud tienen propiedades deseables particularmente desde un punto de vista terapéutico. Por ejemplo, la proteína de unión multivalente y o multiespecífica puede (1) ser interiorizada (y/o catabolizada) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos; (2) ser un anticuerpo agonista; y/o (3) inducir muerte celular y/o apoptosis de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo multivalente se puede unir. El "anticuerpo progenitor" que provee especificidad de unión a por lo menos un antígeno, de las proteínas de unión multivalentes y o multiespecíficas puede ser uno que sea interiorizado (y/o catabolizado) por una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo; y/o puede ser un anticuerpo agonista, anticuerpo que induzca muerte celular, y/o anticuerpo que induzca apoptosis, y la proteína de unión multivalente y o multiespecífica como la descrita en la presente solicitud puede presentar mejora(s) en una o más de estas propiedades. Asimismo, el anticuerpo progenitor puede carecer de cualquiera de una o más de estas propiedades, pero puede ser dotado con las mismas cuando se construye como una proteína de unión multivalente como la descrita en la presente solicitud.

En otra modalidad la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de asociación (Kas0c) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 103 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 104 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 105 M" s"1; y por lo menos aproximadamente 106 M'1s"1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de asociación (Kasoc) para uno o más objetivos entre 102 M'V y 103 M" s"1; entre 103 M"V y 104 M'V1; entre 104 M'V1 y 105 M"V1; o entre 105 M'V1 y 106 IvTV1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.

En otra modalidad la proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Kdis0c) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"3 s"1; cuando mucho aproximadamente 10"4 s"1; cuando mucho aproximadamente 10"5 s" ; y cuando mucho aproximadamente 10"6 s~\ según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de velocidad de disociación (Kd¡soc) para uno o más objetivos de 10"3 s"1 a 10"4 s"1; de 10"4 s' a 10"5 s'1; o de 10"5 s" a 10"6 s" , según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.

En otra modalidad la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10'7 M; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 10"9 M; cuando mucho aproximadamente 10'10 M; cuando mucho aproximadamente 10"11 ; cuando mucho aproximadamente 10"12 M; y cuando mucho 10"13 M. En una modalidad, la proteína de unión de la invención tiene una constante de disociación (KD) para sus objetivos de 10"7 M a 10"8 M; de 10"8 M a 10"9 M; de 10"9 a 10"10 M; de 10"10 a 1011 M; de 10"11 M a 10"12 M; o de 10"12 a M 10"13 M.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud es un conjugado que también comprende un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una molécula de inmuno-adhesión, un agente para formación de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotóxico. En una modalidad, el agente para formación de imagen se selecciona a partir del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina. En otra modalidad, el agente para formación de imagen es una radiomarca que se selecciona a partir del grupo que consiste de: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. Incluso en otra modalidad, el agente terapéutico o citotóxico se selecciona a partir del grupo que consiste de un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud es una proteína de unión cristalizada y existe como un cristal. En una modalidad, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de vehículo. Incluso en otra modalidad, la proteína de unión cristalizada tiene un tiempo de vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de dicha proteína de unión. Incluso en otra modalidad, la proteína de unión cristalizada retiene la actividad biológica.

En otra modalidad, la proteína de unión descrita en la presente solicitud está glucosilada. Por ejemplo, la glucosilación es un patrón de glucosilación de h umano.

Otro aspecto de la invención pertenece a un ácido nucleico aislado que codifica para cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente solicitud . Una modalidad adicional provee un vector que comprende el ácido nucleico aislado descrito en la presente solicitud en la cual el vector se selecciona a partir del grupo que consiste de pcDNA; pTT (Durocher et al, Nucleic Acids Research 2002, Volumen 30, No.2); pTT3 (pTT con sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (M izushima , S. y Nagata , S. , (1 990) Nucleic acids Research Vol . 1 8, No. 1 7) ; pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ . En una modalidad , el vector es un vector descrito en la Solicitud de Patente E. U .A. No. de Serie 61 /021 ,282.

En otro aspecto se transforma una célula hospedera con el vector descrito en la presente solicitud . En una modalidad, la célula hospedera es una célula procariota . En otra modalidad, la célula hospedera es E. coli. En una modalidad relacionada la célula hospedera es una célula eucariota. En otra modalidad , la célula eucariota se selecciona a partir del grupo que consiste de célula protista , célula animal, célula vegetal y célula fúngica. I ncluso en otra modalidad, la célula hospedera es u na célula de mam ífero incluyendo, pero sin limitarse a , CHO, COS; NSO, SP2, PE R.C6 o una célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; o u na célula de insecto tal como Sf9.

En una modalidad , dos o más DVD-lgs, por ejemplo, con especificidades diferentes , se producen en una célula hospedera recombinante individual. Por ejemplo, la expresión de una mezcla de anticuerpos ha sido nombrada Oligoclonics™, (Merus B.V. , Los Países Bajos) patentes E. U .A. Nos. 7,262 ,028; 7,429,486.

Otro aspecto de la invención provee un método para producir una proteína de unión descrita en la presente solicitud que comprende cultivar cualquiera de las células hospederas también descritas en la presente solicitud en un medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión . En u na modalidad, 50%-75% de la proteína de unión producida mediante este método es u na proteína de unión tetravalente específica d ual. En una modalidad particular, 75%-90% de la proteína de unión producida mediante este método es una proteína de un ión tetravalente específica dual . En una modalidad particu lar, 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual.

Una modalidad provee una composición para la liberación de una proteína de unión en la cual la composición comprende una formulación q ue a su vez comprende una proteína de unión cristalizada, como la descrita en la presente solicitud , y un ingrediente , y por lo menos un vehículo polimérico. Por ejemplo, el veh ículo polimérico es un polímero q ue se selecciona a partir de u no o más del grupo que consiste de: poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), pol¡(aminoácidos), poli(anh ídridos), poli(depsipéptido) , poli(ésteres), pol¡(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona) , poli(dioxanona); poli(etilenglicol) , pol¡((hidroxipropil)metacrilamida , poli[(organo)fosfazeno] , poli(ortoésteres), poli(alcohol vinílico) , poli(vinilpirrolidona) , copolímeros de an h ídrido maléico-éter alquil-vin ílico, polioles tipo pluronic, albúmina , alginato, celulosa y derivados de celulosa , colágena, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glucaminoglucanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos. Por ejemplo, el ingrediente se selecciona a partir del grupo que consiste de albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol , gelatina , hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol . Otra modalidad provee un método para tratar a un mam ífero que comprende el paso de administrar al mam ífero una cantidad efectiva de la composición descrita en la presente solicitud .

La invención también provee una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión , como la descrita en la presente solicitud y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional la composición farmacéutica comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar u n trastorno. Por ejemplo, el agente adicional se selecciona a partir del grupo que consiste de: un agente terapéutico, un agente para formación de imagen , u n agente citotóxico, u n inhibidor de angiogénesis (incluyendo pero sin limitarse a un anticuerpo anti-VEGF o una trampa para VEG F) , un inhibidor de cinasa (incluyendo pero sin limitarse a un inhibidor de KDR y un inhibidor de TI E-2) , u n bloqueador de molécula de co-estimulación (incluyendo pero sin limitarse a anti-B7.1 , anti-B7.2, CTLA4-lg, anti-CD20), un bloqueador de molécula de adhesión (incluyendo pero sin limitarse a u n anticuerpo anti-LFA-1 , un anticuerpo anti-E/L-selectina , un inhibidor de molécula pequeña), un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo (incluyendo pero sin limitarse a un anticuerpo anti-I L-1 8, un anticuerpo anti-TN F , y u n anticuerpo anti-I L-6/receptor de citocina), metotrexato, ciclosporina, rapamicina, FK506, una marca o reportero detectable, un antagonista de TN F , u n anti-reumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esteroidal (NSAI D por sus siglas en inglés), un analgésico, un anestésico, u n sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-psoriático, un corticosteroide, un esferoide anabólico, una eritropoyetina , una inmunización , una inmunoglobulina, un inmu nosupresor, una hormona del crecimiento, u n fármaco para reemplazo hormonal , un agente radiofarmacéutico, un antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para el asma , un beta agonista, un esferoide inhalado, una epinefrina o análogo, u na citocina, y un antagonista de citocina.

En otro aspecto, la invención provee un método para tratar a un individuo humano que padece de un trastorno en el cual el objetivo, u objetivos, que pueden ser ligados por la proteína de unión descrita en ia presente solicitud es(son) perjudicial(es) , que comprende administrar al individuo h umano u na proteína de unión descrita en la presente solicitud de modo tal que se inhiba la actividad del objetivo, u objetivos, en el individuo humano y se alivie uno o más síntomas o se log re el tratamiento. Por ejemplo, el trastorno se selecciona a partir del grupo que comprende artritis, osteoartritis, artritis crónica juvenil , artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espond iloartropatía , lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn , colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroid itis, asma , enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki , enfermedad de G rave, síndrome nefrótico , síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpu ra de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica , uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome séptico, caquexia , enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington , enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, apoplej ía, cirrosis biliar primaria , anemia hemol ítica , tumores malignos, insuficiencia card iaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison , deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia polig landular tipo I I , síndrome de Schmidt, sínd rome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia , alopecia circunscripta , artropatía seronegativa , artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática, artropatía asociada con Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmu ne, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemol ítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adq uirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante , hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogén ica , Sínd rome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida , Enfermedades Relacionadas con I nmunodeficiencia Adquirida , Hepatitis B , Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común) , cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura , enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria , pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta , enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjdgren , enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación , bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica , enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa , hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmu ne tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM) , hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1 , psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoi nmu nidad por esperma, esclerosis m últiple (todos los subtipos) , oftalmía del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, sínd rome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren , enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmu ne de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmu ne bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica , vasculitis primaria, enfermedad hepática ag uda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática ind ucida por alcohol, coleosatatis, enfermedad hepática idiosincratica, hepatitis ind ucida por droga , esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma , infección por estreptococos del g rupo B (G BS por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esq uizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th 1 y tipo Th2 , dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon , de páncreas , de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma) , Abetalipoprotemia, Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos ag udos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL por sus siglas en inglés) , leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SI DA, hepatitis inducida por alcohol , conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa-1 , esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismos aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o paroxística), aleteo atrial, bloqueo atrioventricular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT por sus siglas en inglés), bloqueo de la rama del fascículo, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de aturdimiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación por bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos del cerebelo, taquicardia atrial caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés), intoxicación con salicilato crónico, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados con terapia con citocina, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica de dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterioesclerótica diabética, enfermedad de cuerpo difuso de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad intermedia, trastornos del movimiento fármaco-inducidos inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por Gram negativos, sepsis por Gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del fascículo de His, infección por VIH/neuropatía de VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad , neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, Legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas, dolor de cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma de tipo no hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomia, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por Pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios de la piel), síndrome post perfusión, síndrome post bomba, síndrome de cardiotomía postinfarto al miocardio (post-MI), preeclampsia, Parálisis supranuclear Progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia con radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynoud, enfermedad de Refsum, taquicardia de QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choque, anemia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios de la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventrícular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado con vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson , rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática ag uda, poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia circunscripta, anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfol ípido, anemia aplásica , arteriosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmu ne, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical , isquemia crónica , penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética , diabetes mellitus, hernia discal , prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barré (G BS por sus siglas en inglés) , fiebre del heno, síndrome de H ughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumon ía intersticial idiopática , alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión , enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad desmielinizante inflamatoria, enfermedad cardiaca inflamatoria, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan, livedo reticularis, degeneración macular, poliangiitis microscópica, espondilitis anquilosante (morbus bechterev), trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa, insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteólisis, cáncer de ovario, artritis reumatoide juvenil (JRA por sus siglas en inglés) pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD por sus siglas en inglés), enfermedad de arteria periférica (PAD por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR por sus siglas en inglés), síndrome post-bomba, Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, reestenosis, enfermedad cardiaca reumática, sapho (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis,~ y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, síndrome de dificultad respiratoria aguda (shock lung), escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad de tejido conectivo asociada a silicón , dermatosis de sneddon-wilkinson , espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS por sus siglas en inglés) , síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal , reti nitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal , TRAPS (receptor del factor de necrosis tumoral, reacción alérgica tipo 1 , diabetes tipo I I , urticaria, neumon ía intersticial usual (U l P por sus siglas en inglés) , vasculitis, conj untivitis primaveral , retinitis viral , sínd rome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH) , degeneración macular h úmeda , cicatrización de heridas, artropatía asociada con Yersinia y Salmonella.

En u na modalidad , las enfermedades q ue se pueden tratar o diagnosticar con las composiciones y métodos de la invención incluyen , pero no se limitan a, cánceres primarios y metastásicos, incluyendo carcinomas de mama , colon, recto, pulmón , orofaringe, hipofari nge , esófago, estómago, páncreas, hepático, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado , tracto urinario (incluyendo riñon, vejiga urinaria y urotelio), del tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero, y ovarios así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional) , del tracto genital masculino (incluyendo tumores de próstata, de las vesículas seminales, de los testículos y de las células germinales) , de las glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenales, y pituitaria), y de la piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellos que se originan en hueso y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwan nomas, y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos tales como leucemias, y linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como linfomas de tipo no Hodgkin) .

En una modalidad , los anticuerpos de la invención o porciones de u nión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos en la presente solicitud ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.

En otro aspecto la invención provee un método para tratar a un paciente que padece de un trastorno q ue comprende el paso de administrar cualquiera de las proteínas de unión descritas en la presente solicitud , antes, al mismo tiempo, o después de la administración de u n segundo agente, como se discute en la presente solicitud . En u na modalidad particular el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste de budenosida , factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina , metronidazol , inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina , balsalazida , antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagon istas del receptor de I L-1 , mAbs anti-l L-1 ß, mAbs anti-I L6 o anti-receptor de I L-6, factores de crecimiento, in hibidores de elastasa , compuestos de piridinil-imidazol , anticuerpos o agonistas de TN F, LT, I L- 1 , I L-2 , I L-6 , IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-23, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, ibuprofen, corticosteroides, prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, inhibidores de MAP cinasa, inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de célula T, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocina soluble, receptor de TNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, slL-1RI, s I L-1 Rl I , slL-6R, citocinas anti-inflamatorias, IL-4, I L-10, IL- 1 , IL-13 y JGF .

En una modalidad particular las composiciones farmacéuticas descritas en la presente solicitud se administran al paciente mediante por lo menos un modo que se selecciona a partir de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intra-cartilaginoso, intra-cavidades, intra-celíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, subling ual, intranasal, y transdérmico.

Un aspecto de la invención provee por lo menos un anticuerpo anti-idiotipo para por lo menos u na proteína de unión de la presente invención . El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier molécula que contenga péptido o proteína que comprende por lo menos una porción de una molécula de inmunoglobulina tal como, pero sin limitarse a, por lo menos una región determinante de complementariedad (C DR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión a ligando de la misma , una reg ión variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o de la cadena ligera , una región de estructura base, o cualquier porción de las mismas, que se pueda incorporar en una proteína de unión de la presente invención .

En otro aspecto, la invención provee un método para mejorar una característica de una proteína de u nión de la invención que comprende los pasos de (a) determinar la característica de la proteína de u nión antes de la alteración ; (a) alterar la longitud y/o secuencia de (X1 de la cadena pesada y/o la cadena ligera con lo cual se provee una cadena pesada y/o cadena ligera alterada; y (b) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas. En otra modalidad , la invención provee u n método para mejorar u na característica de la proteína de unión de la invención que comprende los pasos de (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración ; (b) alterar la primera y la segunda cadenas de polipéptido de manera tal que VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n se cambie a VD2-(X1 )n-VD 1 -C-(X2)n , con lo cual se proveen las cadenas pesada y ligera alteradas; y (c) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas. En otra modalidad , la invención provee un método para mejorar una característica de la proteína de unión de la invención que comprende los pasos de (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración ; (b) alterar la primera y/o segunda cadenas de polipéptido de modo tal que se cambie la secuencia de solamente u no del VD 1 o VD2 de la cadena pesada y/o ligera ; y (c) determinar la característica de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas . La característica se selecciona a partir del grupo que consiste de u nión al antígeno objetivo, rendimiento de expresión a partir de la célula hospedera, tiempo de vida media in vitro, tiempo de vida media in vivo, estabilidad , solubilidad , afinidad , avidez, y función efectora mejorada.

En una modalidad , la longitud del enlazador de la cadena pesada alterada está incrementada. En otra modalidad , la longitud del enlazador de la cadena pesada alterada está reducida .

En una modalidad , la longitud del enlazador de la cadena ligera alterada está incrementada. En otra modalidad, la longitud del enlazador de la cadena ligera alterada está reducida.

I ncluso en otra modalidad de los métodos y composiciones de la invención , la cadena pesada y/o ligera alterada comprende un sitio de corte. En una modalidad, el sitio de corte está entre por lo menos un VD1 y VD2. En otra modalidad, el sitio de corte está en por lo menos un enlazador. En una modalidad, la cadena pesada y/o ligera en cortada por una enzima o agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de enterocinasa, trombina, PreScission, proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV), y activador de plasminógeno tisular (tPA) + Prolina. En otra modalidad, la proteína de unión es cortada por una enzima o agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una endopeptidasa dependiente de zinc, metaloproteinasa de matriz (M P), una serralisina, una astacina, una adamalisina, MMP-1; MMP-2; MMP-3; MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-10; MMP-11; MMP-12; MMP-13; MMP-14; MMP-15; MMP-16; MMP-17; MMP-18; MMP-19; MMP-20; MMP-21; MMP-22; MMP-23A; MMP-23B; MMP-24; MMP-25; MMP-26; MMP-27; MMP-28; una Desintegrina y Metaloproteinasa (ADAM); ADAM17; ADAMTS1; ADAM1 ; ADAM 10; ADAM8; ADAMTS4; ADAMTS13; ADAM12; ADAM15; ADAM9; ADAMTS5; ADAM33; ADAM11; ADAM2; ADAMTS2; ADAMTS9; ADAMTS3; ADAMTS7; ADAM22; ADAM28; ADAMTS12; ADAM19; ADAMTS8; ADAM29; ADAM23; ADAM3A; ADAM18; ADAMTS6; ADAM7; ADAMDES1; ADAM20; ADAM6; ADAM21; ADAM3B; ADAMTSL3; ADAMTSL4; ADAM30; ADAMTS20; ADAMTSL2; una Caspasa; Caspasas 1-12, Caspasa 14; una Catepsina; Catepsina G; Catepsina B; Catepsina D; Catepsina L1; Catepsina C; Catepsina K; Catepsina S; Catepsina H; Catepsina A; Catepsina E; Catepsina L; Catepsina Z; Catepsina F; Catepsina 2 tipo G; Catepsina 1 tipo L; Catepsina W; Catepsina 2 tipo L; Catepsina 3 tipo L; Catepsina 4 tipo L; Catepsina 5 tipo L; Catepsina 6 tipo L; Catepsina 7 tipo L; Catepsina O; a Calpaína; Calpaína 3; Calpaína 10; Calpaína 1 (mu/1) subunidad grande; Calpain, subunidad pequeña 1; Calpaína 2, (mu/1); subunidad grande; Calpaína 9; Calpaína 11; Calpaína 5; Calpaína 6; Calpaína 13; Calpaína 8; Calpaína, subunidad pequeña 2; Calpaína 15; Calpaína 12; Calpaína 7; y Calpaína 8.

En una modalidad, por lo menos uno del VD1 o VD2 no se une a su objetivo hasta que ocurre un corte entre el VD1 y VD2. En otra modalidad, el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima. En otra modalidad, el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima durante el procedimiento de fabricación. En otra modalidad, el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima cuando la DVD-lg está adyacente a por lo menos un objetivo. En otra modalidad, la proteína de unión es cortada selectivamente por una enzima cuando la DVD-lg se une a por lo menos un objetivo.

En otro aspecto, la invención provee un método para tratar a un individuo por una enfermedad o un trastorno administrando al individuo la proteína de unión de la invención, de modo tal que se logra el tratamiento. En una modalidad, por lo menos uno de un VD1 o VD2 no se une a su objetivo hasta que se corta la proteína de unión. En otra modalidad, el VD2 no se une a su objetivo hasta que se corta la proteína de unión. En otra modalidad, el VD1 es liberado cuando se corta la proteína de unión. En otra modalidad, el VD1 es liberado cuando el VD2 se une a su objetivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A es una representación esquemática de construcciones de Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual ((DVD)-Ig) y muestra la estrategia para generar una DVD-lg a partir de dos anticuerpos progenitores.

La Figura 1B, es una representación esquemática de las construcciones DVD1-lg, DVD2-lg, y dos anticuerpos mono-específicos quiméricos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención pertenece a proteínas de unión multivalentes y/o multiespecíficas que pueden ligar dos o más antígenos. Específicamente, la invención se refiere a inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg), y a composiciones farmacéuticas de las mismas, así como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospederas para elaborar dichas DVD-Igs. Los métodos para utilizar las DVD-lgs de la invención para detectar antígenos específicos, ya sea in vitro o in vivo también quedan abarcados por la invención.

A menos que se defina de otra manera en la presente solicitud , los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención deberán tener los significados que son comúnmente entendidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, el sign ificado y alcance de los términos deben ser claros, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones provistas en la presente solicitud tienen prioridad con respectó a cualquier diccionario o definición extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular deberán inclu ir los plurales y los términos en plural deberán incluir el singular. En esta solicitud, el uso de "o" sig nifica "y/o" a menos que se indique de otra manera. Asimismo, el uso del término "incluyendo" , así como otras formas, tal como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden u na unidad como elementos y componentes q ue comprenden más de una subunidad a menos que se indiq ue específicamente de otra manera.

En términos generales, las nomenclaturas utilizadas en conexión con , y las técnicas de, cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmu nolog ía , microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente solicitud son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técn icas de la presente invención generalmente se llevan a cabo de conformidad con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a través de toda la presente descripción a menos que se indique de otra manera. Las reacciones y técnicas de pu rificación enzimáticas se efectúan de conformidad con las especificaciones del fabricante, como normalmente se logra en la técnica o como se describe en la presente solicitud . Las nomenclatu ras utilizadas en conexión con , y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, qu ímica analítica , qu ímica de síntesis orgánica , y qu ímica de medicamentos y farmacéutica descritas en la presente solicitud son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica . Se utilizan técnicas estándar para síntesis química , análisis químico, preparación , formulación , y suministro farmacéutico, y tratamiento de pacientes.

Para que la presente invención se pueda entender más fácilmente, a contin uación se definen términos selectos .

El término "polipéptido" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas originales o artificiales, fragmentos de proteína y análogos polipeptídicos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El uso de "polipéptido" en la presente solicitud tiene la intención de abarcar polipéptido y fragmentos y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) del mismo, a menos que el contexto contradiga de otra manera . Para u n polipéptido antigénico, un fragmento de polipéptido contiene opcionalmente por lo menos un epítope contiguo o no lineal de polipéptido. Los límites precisos de d icho por lo menos un fragmento de epítope se pueden confirmar utilizando la habilidad com ún en la técn ica. El fragmento comprende por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, tal como por lo menos aproximadamente 1 0 aminoácidos contiguos, por lo menos aproximadamente 1 5 aminoácidos contiguos, o por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una variante de polipéptido es como se describe en la presente solicitud .

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que debido a su origen o fuente de obtención no está asociado con componentes natu ralmente asociados que lo acompañan en su estado original; está sustancialmente libre de otras proteínas provenientes de la misma especie; es expresado por u na célu la de una especie diferente; o no se presenta en la Naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o que se sintetiza en un sistema celular diferente al de la célula a partir de la cual éste se orig ina natu ralmente estará "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína también se puede hacer sustancialmente libre de los componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, utilizando técn icas de purificación de proteína bien conocidas en la técn ica.

El término "recuperar" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere al procedimiento de hacer que una especie qu ímica tal como un polipéptido esté sustancialmente libre de los componentes natu ralmente asociados mediante aislamiento, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación de proteína bien conocidas en la técnica.

"Actividad biológica" tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a cualquiera de una o más propiedades biológicas inherentes de una molécula, (ya sea que esté presente de manera natu ral tal como se encuentra in vivo, o provista o habilitada mediante medios recombinantes). Las propiedades biológicas incluyen pero no se limitan a unión al receptor; inducción de proliferación celular, inhibición del crecimiento celular, inducciones de otras citocinas, inducción de apoptosis, y actividad enzimática. Actividad biológica también incluye la actividad de una molécula de ig.

Los términos "unión específica" o "u nirse específicamente" , tal como se utilizan en la presente solicitud , con referencia a la interacción de un anticuerpo , u na proteína, o un péptido con u na segu nda especie qu ímica, significan que la interacción depende de la presencia de una estructu ra particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítope) en la especie qu ímica; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructu ra de proteína específica en vez de a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítope "A", la presencia de una molécula que contenga al epítope A (o A libre, no marcado) , en una reacción que contenga "A" marcado y al anticuerpo, reduce la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

El término "anticuerpo" , tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere ampliamente a cualqu ier molécula de inmunoglobulina (Ig) constituida por cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) , o cualquier fragmento, mutante, variante, o derivación funcional de las mismas , que conserve las características de unión a epítope esenciales de una molécula de Ig . Dichos formatos de anticuerpo mutante, variante, o derivado son conocidos en la técnica. Las modalidades no limitativas de las mismas se discuten a continuación .

En un anticuerpo de long itud completa, cada cadena pesada está constituida por una región variable de la cadena pesada (abreviado en la presente solicitud como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada . La región constante de la cadena pesada está constituida por tres dominios, CH1 , CH2 y C H3. Cada cadena ligera está constituida por una región variable de la cadena ligera (abreviado en la presente solicitud como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está constituida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad , denominadas regiones determi nantes de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones q ue están más conservadas, denominadas regiones de estructura base (FR) . Cada VH y VL está constituida por tres CDRs y cuatro FRs, acomodadas desde el extremo amino-terminal hacia el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden : FR 1 , CDR 1 , FR2, CDR2 , FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de ¡nmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG , Ig E, Ig , IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.

El término "región Fe" se utiliza para definir la región C-terminal de la cadena pesada de una ¡nmunoglobulina , la cual puede ser generada mediante digestión de un anticuerpo intacto con papaína. La región Fe puede ser una región Fe de la secuencia original o u na reg ión Fe variante. La reg ión Fe de una ¡nmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio C H4. Los reemplazos de residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, et al. patentes E. U .A. Nos. 5,648,260 y 5,624,821 ). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes por ejemplo, inducción de citocina , ADCC , fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC por sus siglas en inglés) y tiempo de vida media/velocidad de depu ración del anticuerpo y los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas fu nciones efectoras son deseables para el anticuerpo terapéutico pero en otros casos podrían ser in necesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Algunos isotipos de IgG de humano, en particu lar lgG 1 e lgG3 , median ADCC y CDC mediante unión a FcyRs y C 1 q del complemento, respectivamente. Los receptores de Fe neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan el tiempo de vida media en circulación de los anticuerpos. I ncluso en otra modalidad se reemplaza por lo menos un residuo de aminoácido en la región constante del anticuerpo, por ejemplo la región Fe del anticuerpo, de modo tal que se alteran las funciones efectoras del anticuerpo. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de los dominios CH3 y es estabilizada por los puentes de disulfu ro dentro la región de gozne (Huber et al . Nature; 264: 41 5-20; Th ies et al 1 999 J Mol Biol; 293: 67-79). La mutación de los residuos cisteína dentro de las regiones de gozne para evitar los puentes de d isulfu ro de tipo cadena pesada-cadena pesada puede desestabilizar la dimerización de los dominios CH3. Se han identificado los resid uos responsables de la dimerización de C H3 (Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73) . Por lo tanto, es posible generar una semi-lg monovalente. Como un aspecto interesante, estas moléculas de semi-lg monovalente se han encontrado en la Naturaleza tanto para la subclase IgG como para la subclase IgA (Seligman 1978 Ann Immunol 1 29: 855-70; Biewenga et al 1983 Clin Exp I mmunol 51 : 395-400). Se ha determinado que la esteq uiometría de FcRn : región Fe de Ig es de 2 : 1 (West et al .2000 Biochemistry 39: 9698-708), y la mitad de Fe es suficiente para mediar la unión a FcRn (Kim et al 1994 Eu r J I mmunol ; 24: 542-548) . Las mutaciones para perturbar la dimerización del dominio CH3 podrían no tener mayor efecto adverso sobre su u nión a FcRn debido a que los residuos importantes para la dimerización de CH3 están localizados en la interfaz interior de la estructu ra de lámina b de CH3, mientras que la región responsable de la u n ión a FcRn está localizada en la interfaz exterior de los dominios CH2-CH3. Sin embargo, la molécula de semi-lg puede tener cierta ventaja en la penetración de tejido debido a su tamaño más pequeño q ue el de un anticuerpo regular. En una modalidad se reemplaza por lo menos un residuo de aminoácido en la región constante de la prote ína de unión de la invención , por ejemplo la región Fe, de modo tal que se perturbe la dimerización de las cadenas pesadas, lo que da como resultado moléculas de semi-DVD Ig. La actividad anti-inflamatoria de IgG es completamente dependiente de la sialilación del glucano N-ligado del fragmento Fe de IgG . Se han determinado los requerimientos precisos del g lucano para la actividad antiinflamatoria, de modo tal q ue se puede crear un fragmento Fe de lgG 1 apropiado, con lo cual se genera una Fe de lgG 1 sialilada , completamente recombinante, con potencia incrementada en gran manera (Anthony, R. M . , et al . (2008) Science 320:373-376) .

El término "porción de unión a antígeno" de u n anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a uno o más frag mentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para un irse específicamente a un antígeno . Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por frag mentos de u n anticuerpo de longitud completa. Dichas modalidades de anticuerpo también pueden ser formatos biespecíficos, duales específicos, o multiespecíficos ; que se unan específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, u n fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH , C L y CH 1 ; (ii) u n fragmento F(ab')2, u n fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al. , (1 989) Nature 341 : 544-546. Winter et al. , publicación WO 90/05144 A1 del PCT incorporada en la presente solicitud para referencia) el cual comprende u n domin io variable individual; y (vi) u na región determinante de complementariedad (C DR) aislada . Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH , son codificados por genes separados , éstos también se pueden ligar, utilizando métodos recombinantes , mediante un enlazador sintético que permita q ue éstos se puedan preparar como una cadena de proteína individual en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. , ( 1 988) Science 242:423-426: y H uston et al. (1 988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) . Se pretende también que dichos anticuerpos de cadena individ ual queden abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena individual, tales como los diacuerpos también quedan abarcadas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL están expresados en una cadena polipeptídica individual, pero utilizando un enlazador el cual es muy corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, con lo cual se obliga a dichos dominios a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., ef al. (1994) Structure 2:1121-1123). Dichas porciones de unión a anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibodv Enqineerinq (2001) Springer-Verlag, New York, 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). Además, los anticuerpos de cadena individual también incluyen "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) los cuales, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); y patente E.U.A. No.5,641,870).

El término "proteína de unión multivalente" se utiliza a través de toda esta descripción para indicar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión multivalente se diseña para que tenga dichos tres o más sitios de unión a antígeno, y generalmente es un anticuerpo no presente en la Naturaleza. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión que puede ligar dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas de unión de dominio variable dual (DVD) de la invención comprenden dos o más sitios de un ión a antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Los DVDs pueden ser monoespecífícos, es decir, pueden ligar un antígeno o multiespecíficos , es decir pueden ligar dos o más antígenos. Las proteínas de unión de DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de la cadena ligera son referidas como DVD-lg . Cada mitad de una DVD-lg comprende un polipéptido de DVD de la cadena pesada , y un polipéptido de DVD de la cadena ligera , y dos sitios de u nión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera con un total de 6 CDRs implicadas en la unión a antígeno por cada sitio de unión a antígeno.

El término "anticuerpo biespecífico", tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a anticuerpos de longitud completa que son generados mediante tecnolog ía de cuad roma (véase ilstein , C. y A.C. Cuello, Nature, 1 983. 305(5934) : p. 537-40), mediante conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz, U . D. , et al , Nature , 1 985. 314(601 2) : p. 628-31 ), o mediante estrategia de botón en ojal o estrategias similares que introduzcan mutaciones en la región Fe (véase Holliger, P. , T. Prospero, y G. Winter, Proc Nati Acad Sci USA, 1 993. 90(14) : p. 6444-8.1 8) , lo que da como resultado múltiples especies de ¡nmunoglobulinas diferentes de las cuales sólo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Mediante función molecular, un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítope) en uno de sus dos brazos de unión (u n par de HC/LC), y se une a u n antígeno diferente (o epítope) en su segundo brazo (un par de HC/LC diferente) . Por esta definición , un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión a antígeno distintos (tanto en especificidad como en secuencias de CDR), y es monovalente para cada antígeno al cual éste se une.

El término "anticuerpo dual-específico", tal como se utiliza en la presente solicitud , se refiere a anticuerpos de longitud completa que pueden ligar dos antígenos diferentes (o epítopes) en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase publicación WO 02/02773 del PCT) . Por consiguiente una proteína de unión dual-específica tiene dos brazos de unión a a ntígeno idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de C DR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al cual ésta se une.

Un "sitio de unión a antígeno funcional" de una proteína de unión es aquel que puede ligar u n antígeno objetivo. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión a antígeno no necesariamente es tan fuerte como la del anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene el sitio de unión a antígeno, pero la capacidad para unirse al antígeno debe ser mensurable utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la un ión del anticuerpo a u n antígeno. Asimismo , la afinidad de unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo multivalente en la presente solicitud no necesita ser cuantitativamente la misma.

El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular, las cuales actúan sobre otra población celular como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas están incluidas la hormona del crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana modificada con N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glucoproteína tales como la hormona estimulante de folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de nervio tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factor de crecimiento placentario, factores de crecimiento transformantes (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento tipo insulina 1 y 11; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como CSF de macrofago (M-CSF); CSF de granulocito y macrofago (GM-CSF); y CSF de granulocito (G-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y el ligando kit (KL). Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término citocina incluye proteínas provenientes de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia original.

El término "enlazador" se utiliza para indicar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácido unidos mediante enlaces peptídicos y se utilizan para ligar una o más porciones de unión a antígeno. Dichos polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Los enlazadores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9), S AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27); GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28); PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29); PNLLGGP (SEQ ID NO: 30); GGGGGGP (SEQ ID NO: 31); PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32); PTISPAPNLLGGP (SEQ ID NO: 33); TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34); TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35); LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36); ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37); ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38); ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39); TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40); ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41); TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42); ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43); LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44); TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45); ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46); PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47); TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48); AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49); PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50); PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51); PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52); PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53); GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54); GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55); AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56); GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57); AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58); ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59); ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60); TVAAPSV (SEQ ID NO: 61), y TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62).

En algunos casos, la arquitectura de la DVD-lg, en particular los enlazadores que conectan al VL1— VL2 y VH1— VH2, puede imponer restricciones sobre la unión al ligando al dominio interior (C-terminal). En una modalidad, la DVD-lg puede ser cortada por una enzima de modo tal que dichas restricciones se alivien o se eliminen. En una modalidad, la DVD-lg puede ser cortada por una enzima entre los dominios VD1 (VH 1 , VL1 ) y VD2 (VH2 , VL2) de por lo menos una de una cadena pesada y una cadena ligera . En una modalidad , un enlazador susceptible de corte une los dominios VD1 y VD2 de por lo menos una de una cadena pesada y una cadena ligera. En u na modalidad, la DVD-lg es cortada por enterocinasa, trombina, PreScission , proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV) , y activador de plasminógeno tisular (tPA) + Prolina.

En una modalidad, se analizan los enlazadores susceptibles de corte entre el dominio variable exterior (N-terminal) y el dominio variable interior (C-terminal) de la DVD-lg , o la unión de una cadena individ ual (VH/VL sin enlazadores) del dominio variable exterior al dominio variable interior de la DVD-lg a través del enlazamiento VH 1— VH2 o VL1— VL2 para intentar superar dichas restricciones potenciales. La unión del dominio interior también se puede modular mediante la longitud del enlazador. Los enlazadores VH 1— VH2 y VL1— VL2 pueden consistir de, pero no se limitan a, secuencias obtenidas a partir de CH 1 /CL, la reg ión de gozne de IgG , y secuencias tales como las repeticiones de glicina-serina. Proveer dichos enlazadores alternativos puede (1 ) retornar la afinidad del antígeno completo al sitio de unión a antígeno interior de una DVD-lg; (2) mod ular la afinidad del sitio de unión a antígeno interior de la DVD-lg ; (3) activar el sitio de unión a antígeno interior de una DVD-lg en el sitio de acción ; (4) incrementar la avidez de una DVD-lg para un antígeno; y/o (5) liberar el dominio variable exterior como una unidad Fv.

La unión del Fv del dominio exterior se logra en un número de maneras. Primero, se diseña un sitio de corte de proteasa en la secuencia del enlazador. Esto se efectúa en uno o en ambos enlazadores de la cadena pesada o la cadena ligera q ue conectan los dominios variables interior o exterior de la DVD-lg. La secuencia de corte de proteasa se selecciona a partir de cualqu ier número de secuencias de corte de proteasa (véase Tablas 1 , 2 , 5, 6, y el Ejemplo 2.3, para ejemplo) . Idealmente, la proteasa se selecciona para cortar en una secuencia específica , y no corta fácilmente otros sitios en la DVD-lg . La construcción de DVD-lg q ue contiene u na secuencia de corte de proteasa se corta proteolíticamente en el procedimiento de fabricación mismo o, si la proteasa seleccionada es expresada por el tipo de célula elegida como blanco, la DVD-lg es cortada en el tejido elegido como blanco o por otra proteasa endógena. De esta manera , la DVD-lg es considerada como un profármaco que es activado en el sitio terapéutico pretendido. De manera adicional , d icho mecanismo permite que la DVD-lg enmascare una afinidad de unión a antígeno particular en el sitio de unión interior hasta que ésta es activada en el sitio terapéutico elegido como blanco. Otra ventaja para las composiciones y métodos de la invención es la capacidad para incrementar la afinidad para un antígeno particular elegido como blanco en una manera específica de sitio. Esto se log ra mediante la avidez de la sig uiente manera. Si la DVD-lg contiene dominios de unión a antígeno que se unen a dos epítopes diferentes en el mismo antígeno, es posible con la flexibilidad incrementada del dominio variable exterior que ésta se una dos veces - pero en sitios diferentes - al mismo antígeno, con lo cual se incrementa la afinidad aparente para dicho antígeno particular mediante la avidez. También se puede diseñar una DVD-lg con enlazadores susceptibles de corte que elija como blanco dos antígenos distintos (en las mismas células o en dos células diferentes) para incrementar la afinidad (mediante avidez) en u na manera específica de sitio. Por ejemplo, los dos antígenos de interés pueden ser expresados en un tumor simultáneamente , pero individualmente en células normales. Por lo tanto , la unión de los dos dominios de DVD-lg en la célula de tumor con avidez incrementada puede mejorar la especificidad de u nión a tumor y reducir los efectos secundarios (toxicidad) de la DVD-lg en las células normales. También se contempla que se pueda diseñar u n enlazamiento de disulfuro entre las cadenas pesada y ligera , o mutaciones específicas en el VH y VL, del dominio variable exterior para mantener su conectividad in vivo. También es conveniente, en algunos casos , cortar de la DVD-lg el Fv exterior completo utilizando la misma tecnolog ía de corte q ue dé como resultado Fv's e IgG's libres. El corte de Fv puede ocurrir antes o después de la unión del objetivo al dominio exterior.

TABLA 1 Ejemplos de enlazadores con sitios de corte de proteasa (indicados mediante el espacio) en los enlazadores VL1-VL2 o VH1-VH2 Enlazador de la SEQ Enlazador de la SEQ cadena pesada ID cadena ligera ID Descripción (VH1-VH2) NO (VL1-VL2) NO Enlazador de HC corto; enlazador ASTKGP 21 TVDDDDK AAP 35 de LC escindible con enterocinasa (EK) Enlazador de HC escindible con ASDDDDK GGP 37 TVAAP 13 EK; enlazador de IC corto Enlazador de HC corto; enlazador ASTKGP 21 LVPR GSAAP 36 de LC escindible con trombina Enlazador de HC escindible con ALVPR GSGP 38 TVAAP 13 trombina; enlazador de LC corto TVAADDDDK Enlazador de HC corto; enlazador ASTKGP 21 34 SVFIVPP de LC más largo escindible con EK Enlazador de HC más largo ASTDDDDK 39 TVAAP 13 escindible con EK; enlazador de SVFPLAP LC corto Enlazador de HC corto; enlazador TVALVPR ASTKGP 21 40 de LC más largo escindible con GSVFIFPP trombina Enlazador de HC más largo ASTLVPR 41 TVAAP 3 escindible con trombina; enlazador GSVFPLAP de LC corto Enlazador de HC largo; enlazador ASTKGPSVFPLAP 22 TVDDDDK AAP 35 de LC escindible con EK Enlazador de HC escindible con ASDDDDK GGP 37 TVAAPSVFIFPP 14 EK; enlazador de LC largo Enlazador de HC largo; enlazador ASTKGPSVFPLAP 22 LVPR GSAAP 36 de LC escindible con trombina Enlazador de HC escindible con ALVPR GSGP 38 TVAAPSVFIFPP 14 trombina, enlazador de LC largo TVAADDDDK Enlazador de HC largo; enlazador ASTKGPSVFPLAP 22 34 SVFIVPP de LC más largo escindible con EK Enlazador de HC más largo ASTDDDK 43 TVAAPSVFIFPP 14 escindible con EK; enlazador de SVFPLAP LC largo Enlazador de HC largo; enlazador TVALVPR ASTKGPSVFPLAP 22 40 de LC más largo escindible con GSVFIFPP trombina TABLA 1 (cont.

Enlazador de la SEQ Enlazador de la SEQ cadena pesada I0 cadena ligera ID Descripción (VH1-VH2) NO (VL1-VL2) NO Enlazador de HC más largo ASTLVPR 41 TVAAPSVFIFPP 14 escindible con trombina; enlazador GSVFPLAP de LC largo Enlazador de HC corto; enlazador ASTKGP 21 LEVLFQ GP 44 de LC escindible con PreScission Enlazador de HC escindible con LEVLFQ GP 44 TVAAP 13 PreScission; enlazador de LC corto TVAALEVLFQ Enlazador de HC corto; LC más ASTKGP 21 45 GPAP largo escindible con PreScission Enlazador de HC más largo ASTLEVLFQ 46 TVAAP 3 escindible con PreScission; GPLAP enlazador de LC corto Enlazador de HC largo; enlazador ASTKGPSVFPLAP 22 LEVLFQ GP 44 de LC escindible con PreScission Enlazador de HC escindible con LEVLFQ GP 44 TVAAPSVFIFPP 14 PreScission; enlazador de LC largo Enlazador de HC largo; enlazador TVAALEVLFQ ASTKGPSVFPLAP 22 45 de LC más largo escindible con GPAP PreScission Enlazador de HC más largo ASTLEVLFQ 46 TVAAPSVFIFPP 14 escindible con PreScission; GPLAP enlazador de LC largo Enlazador de HC más largo PAPLEVLFQ GP 47 escindible con PreScission basado en el gozne Enlazador de LC más largo PAPLEVLFQ GP 47 escindible con PreScission basado en el gozne Enlazador de HC corto; enlazador ASTKGP 21 TAENLYFQ GAP 48 de LC escindible con TEV Enlazador de HC más corto AENLYFQ GA 49 TVAAPSVFIFPP 14 escindible con TEV; enlazador de LC largo Enlazador de HC más corto AENLYFQ GA 49 PAPNLLGGP 29 escindible con TEV; enlazador de LC largo basado en el gozne (9) TABLA 2 Ejemplos de enlazadores con sitios de corte de proteasa (indicados mediante el espacio) tanto en los enlazadores de cadena VH1-VH2 como de la cadena VL1-VL2 Cadena pesada SEQ Cadena ligera SEQ (VH1-VH2) ID (VL1-VL2) ID Comentarios NO NO Enlazador de HC más corto TVALVPR escindible con EK; enlazador de ASDDDDK GGP 37 40 GSVFIFPP LC más largo escindible con trombina Enlazador de HC más corto TVAADDDDK escindible con PreScission; LEVLFQ GP 34 SVFIVPP enlazador de LC más largo escindible con EK Enlazador de HC más corto TVAALEVLFQ escindible con trombina; enlazador ALVPR GSGP 38 45 GPAP de LC más largo escindible con PreScission Enlazador de HC más corto escindible con PreScission; LEVLFQ GP 44 TAENLYFQ GAP 48 enlazador de LC más largo escindible con TEV Enlazador de HC más corto TVAADDDDK AENLYFQ GA 49 34 escindible con TEV; enlazador de SVFIVPP LC más largo escindible con EK Activador de plasminógeno tisular PGPFGR SAGGP 50 (tPA) + Prolina más cercana a la secuencia tipo gozne tPA + Prolina más cercana a la PGPFGR SAGGP 50 secuencia tipo gozne tPA + gozne - se puede utilizar PGPFGR SAGG 51 para cualquiera del enlazador de HC o de LC tPA + gozne - se puede utilizar PQRGR SAG 52 para cualquiera del enlazador de HC o de LC tPA + gozne - se puede utilizar PHYGR SGG 53 para cualquiera del enlazador de HC o de LC tPA + gozne - se puede utilizar GPFGR SAGP 54 para cualquiera del enlazador de HC o de LC EK - enlazador corto se puede GDDDDK GGP 55 utilizar para cualquiera del enlazador de HC o de LC EK - enlazador corto se puede AGDDDDK GGP 56 utilizar para cualquiera del enlazador de HC o de LC EK - enlazador corto se puede GGDDDDK GGP 57 utilizar para cualquiera del enlazador de HC o de LC Aunque la introducción de un sitio de corte se puede lograr mediante la inserción de un enlazador, otros métodos pa ra inserción de un sitio de corte en una proteína son conocidos en la técnica. Se puede introducir cualquiera de u n número de sitios objetivo de proteasa en una DVD-lg de conformidad con las composiciones y métodos de la invención de modo tal que la DVD-lg pueda ser cortada por una enzima de elección y/o donde y cuando se desee (por ejemplo, durante el procedimiento de fabricación de en un cierto tiempo o sitio de elección en el cuerpo).

Las enzimas útiles en la práctica de la invención son extensas y bien conocidas en la técnica (Barrett, D. , Rawlings, N . D. , Woessner, J . F. (2004) Handbook of Proteolytic Enzymes , Academic Press; Rawlings, N. , Morton, F. , Barrett, A. (2006) Nucleic Acid Research 34, número sobre base de datos, D270-D272; sitios en la red de la Sociedad I nternacional de Proteólisis ( I nternational Proteolysis Society (I PS)) http://www. protease.org/index.html y http://www. protease.org/blog . html ; sitio en la red de Merops (base de datos de todas las proteasas) http://merops.sanger.ac. uk/; http://www. ihop-net.org/U niPub/iHOP/) .

En una modalidad , la DVD-lg es cortada por una proteasa de la superfamilia de metzincina, la cual es una familia de endopeptidasas dependientes de zinc, tal como una Metaloproteinasa de Matriz (M MP), serralisinas, astacinas, adamalisinas. Las MM Ps pueden deg radar la matriz extracelular que rodea a las células y tejidos y por lo tanto juegan un papel en la degradación y reparación de los tejidos en un número de estados patológicos. En el cáncer, las MMPs degradan la matriz extracelular que rodea a las células de cáncer lo que permite el avance y metástasis de las células de cáncer. Otras MMP's específicas son expresadas en tipos diferentes de tejidos o procesos patológicos y por lo tanto son consideradas como proteasas específicas de tejido para enfermedades relacionadas con dichos tejidos o estados patológicos tales como artritis, reparación de tejido, cirrosis, angiogénesis, metástasis, y morfogénesis. Los motivos de corte para estas enzimas son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo las Tablas 1, 4A, 4B, y 4D en Turk, B.E. et al. (2001) Nature Biotechnology 19:661-667 para los motivos/secuencias cortadas por las MMPs. Las MMPs de ejemplo incluyen, por ejemplo, MMP-1; MMP-2; MMP-3; MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-10; MMP-11; MMP-12; MMP-13; MMP-14; MMP-15; MMP-16; MMP-17; MMP-18; MMP-19; MMP-20; MMP-21; MMP-22; MMP-23A; MMP-23B; MMP-24; MMP-25; MMP-26; MMP-27; y MMP-28.

En una modalidad, la DVD-lg es cortada por una Disintegrina y Metaloproteinasa (ADAM). Por ejemplo ADAM-17 (o TACE) es una enzima convertidora de TNF-alfa. Las proteinasas de ADAMs son importantes en las interacciones célula-célula, y en la muda del ectodominio de la proteína (por ejemplo, el corte de partes de otras proteínas de superficie celular importantes para hacerlas activas). Por ejemplo, HER-2 se activa cuando es cortada por ADAM-10, lo cual lleva a la proliferación celular. Actualmente se está reconociendo que ADAM-10 juega un papel en la migración de célula de glioblastoma a través de corte de N-cadherina. Véase, por ejemplo, J Neuroscience (2009); 29 (14): 4605-15 (2009) y Cáncer Biol Ther. (2006) Jun; 5(6):657-64. Por ejemplo, HER-2 es cortada por ADAM-10, la cual juega un papel en la migración de célula de glioblastoma. Véase, por ejemplo, Caescu, C.l. et al. (2009) Biochem J. 424:79-88 MMP para los motivos/secuencias cortadas por estas dos enzimas. Los ejemplos de ADAMs incluyen, por ejemplo, ADAM17; ADAMTS1; ADAM1 ; ADAM10; ADAM8; ADAMTS4; ADAMTS13; ADAM12; ADAM15; ADAM9; ADAMTS5; ADAM33; ADAM11; ADAM2; ADAMTS2; ADAMTS9; ADAMTS3; ADAMTS7; ADAM22; ADAM28; ADAMTS12; ADAM19; ADAMTS8; ADAM29; ADAM23; ADAM3A; ADAM18; ADAMTS6; ADAM7; ADAMDES1; ADAM20; ADAM6; ADAM21; ADAM3B; ADAMTSL3; ADAMTSL4; ADAM30; ADAMTS20; y ADAMTSL2.

En una modalidad, la DVD-lg es cortada por una Caspasa (cisteína-aspártico proteasas) la cual es una familia de cisteína proteasas que juegan papeles importantes en apoptosis, necrosis, e inflamación). Algunas caspasas también son requeridas para la maduración de las citocinas. Los ejemplos de caspasas incluyen, por ejemplo, las caspasas 1-12, y 14.

En una modalidad, la DVD-lg es cortada por una Catepsina. Las catepsinas participan en el recambio celular de mamífero, por ejemplo, neoplasia, metástasis, resorción de hueso; inflamación, enfermedades degenerativas de las articulaciones. Los ejemplos de Catepsinas incluyen, por ejemplo, Catepsina G; Catepsina B; Catepsina D; Catepsina L1; Catepsina C; Catepsina K; Catepsina S; Catepsina H; Catepsina A; Catepsina E; Catepsina L; Catepsina Z; Catepsina F; Catepsina 2 tipo G; Catepsina 1 tipo L; Catepsina W; Catepsina 2 tipo L; Catepsina 3 tipo L; Catepsina 4 tipo L; Catepsina 5 tipo L; Catepsina 6 tipo L; Catepsina 7 tipo L; o Catepsina O.

En una modalidad, la DVD-lg es cortada por una Calpaína. Las calpaínas son cisteína proteasas activadas por calcio que juegan papeles en el ciclo celular, función neuronal y memoria, y vasos sanguíneos y coagulación. Los ejemplos de calpaínas incluyen, por ejemplo, Calpaína 3; Calpaína 10; Calpaína 1 (mu/1) subunidad grande; Calpaína, subunidad pequeña 1; Calpaína 2, (mu/1); subunidad grande; Calpaína 9; Calpaína 11; Calpaína 5; Calpaína 6; Calpaína 13; Calpaína 8; Calpaína, subunidad pequeña 2; Calpaína 15; Calpaína 12; Calpaína 7; o Calpaína 8.

El término "dominio constante de inmunoglobulina" se refiere a un dominio constante de la cadena pesada o de la cadena ligera. Las secuencias de aminoácido del dominio constante de la cadena ligera y de la cadena pesada de IgG de humano son conocidas en la técnica.

El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pudieran estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Asimismo, en contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopes) diferentes, cada mAb está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe ser considerado como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular.

El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente solicitud , pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inm unoglobulina de línea germinal de humano. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano (por ejemplo, mutaciones introd ucidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo) , por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo h umano", tal como se utiliza en la presente solicitud , no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mam ífera, tal como un ratón, han sido injertadas en las secuencias de estructura base de humano.

El término "anticuerpo recombinante de humano" , tal como se utiliza en la presente solicitud , pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tal como los anticuerpos que se expresan utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera (descrito con mayor detalle en la Sección II C, más adelante), anticuerpos aislados a partir de una genoteca de anticuerpo de humano, combinatoria, recombinante (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina de humano (véase, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. y Green L.L. (2002) Current Opinión in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquiera otros medios que impliquen empalmar las secuencias de gen de inmunoglobulina de humano con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes de humano tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano. Sin embargo, en algunas modalidades, dichos anticuerpos recombinantes de humano se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para la secuencia de Ig de humano, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque obtenidas a partir de y relacionadas con las secuencias de VH y VL de línea germinal de humano, podrían no existir de manera natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo de humano ¡n vivo.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo lo cual da como resultado una mejoría en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dicha(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad de ejemplo pueden tener afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. BidITechnology 10:779-783 (1992) describen la maduración por afinidad mediante reacomodo del dominio de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura base es descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al, J. Mol. BioL 226:889-896 (1992) y mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectivas, posiciones de contacto o de hipermutación con un residuo de aminoácido incrementador de actividad como se describe en la patente E.U.A. No.6914128B1.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de la cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie y secuencias de región constante provenientes de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera de múrido ligadas a regiones constantes de humano.

El término "anticuerpo injertado con CD " se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera provenientes de una especie pero en los cuales las secuencias de una o más de las regiones de CDR de VH y/o VL están remplazadas con secuencias de CDR de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de mú rido en las cuales una o más de las CDRs de múrido (por ejemplo , CDR3) han sido remplazadas con secuencias de CDR de humano.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de reg ión variable de la cadena pesada y cadena ligera provenientes de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en los cuales por lo menos una porción de la secuencia de VH y/o VL ha sido alterada para que sea de tipo "más humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal de humano . Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR , en el cual se introducen secuencias de CDR de humano en las secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias de CDR no humanas correspondientes. También "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo que se une de manera inmuno-específica a un antígeno de interés y el cual comprende u na región de estructu ra base (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo humano y una región determinante de complementariedad (C DR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo no humano. Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "sustancialmente" en el contexto de u na CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácido por lo menos 80% , por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácido de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab' , F(ab')2 , FabC , Fv) en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de C DR corresponden a las de una inmunog lobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones de estructura base son las de u na secuencia de consenso de inmunoglobulina de humano. En una modalidad , un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una porción de una región constante ( Fe) de inmunoglobulina , típicamente la de una inmunoglobu lina de humano. En algu nas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera así como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada . El anticuerpo también puede incluir las regiones CH 1 , de gozne, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada . En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene solamente una cadena pesada humanizada. En modalidades específicas, un anticuerpo humanizado contiene solamente un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.

Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "marcación de Kabat" se utilizan de manera intercambiable en la presente solicitud. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema para numerar residuos de aminoácido los cuales son más variables (es decir hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicación del NIH No. 91-3242). Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable varía de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, las posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y las posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "CDR" se refiere a la región determinante de complementariedad dentro de las secuencias variables del anticuerpo. Hay tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, las cuales son designadas como C DR 1 , CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conj unto de CDR" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a un grupo de tres C DRs que se presentan en una región variable individual que pueden ligar al antígeno . Los límites exactos de estas CDRs han sido definidos de distinta manera de conformidad con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al. , Sequences of Proteins of I mmu nologicai I nterest (I nstitutos Nacionales de Salud , Bethesda , Md . ( 1 987) y ( 1 991 )) no solo provee un sistema de numeración de residuo inequívoco que se puede aplicar a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también provee límites de residuo precisos que definen las tres C DRs. Estas CDRs pueden ser referidas como las CDRs de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 1 96:901 -91 7 ( 1 987) y Chothia et al . , Nature 342 :877-883 (1 989)) descubrieron que ciertas sub-porciones dentro de las CDRs de Kabat adoptan conformaciones de estructu ra base peptídica casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácido. Estas sub-porciones fueron designadas como L1 , L2 y L3 o H 1 , H2 y H3 en las cuales la "L" y la "H" indican las regiones de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como las CDRs de Chothia , las cuales tienen límites que se traslapan con las CDRs de Kabat. Otros límites que definen CDRs que se traslapan con las C DRs de Kabat han sido descritos por Padlan (FASEB J. 9: 1 33-1 39 (1 995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5) :732-45 (1 996)). I ncluso otras definiciones de límite de CDR podrían no apegarse estrictamente a uno de los sistemas de la presente solicitud , pero no obstante se traslapan con las CDRs de Kabat, aunque éstas se pueden acortar o alargar en vista de la predicción o hallazgos experimentales de q ue residuos particulares o grupos de residuos o incluso CDRs completas no afectan de manera significativa la u nión al antígeno. Los métodos utilizados en la presente solicitud pueden utilizar CDRs definidas de conformidad con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilizan CDRs definidas por Kabat o por Chothia .

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "estructu ra base" o "secuencia de estructura base" se refiere a las secuencias remanentes de una región variable menos las CDRs . Debido a que la definición exacta de u na secuencia de CDR se puede determinar mediante sistemas diferentes, el significado de una secuencia de estructura base está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDRs (CDR-L1 , C DR-L2 , y CDR-L3 de la cadena ligera y CDR-H 1 , CD R-H2 , y CDR-H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones de estructura base en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro sub-reg iones (FR1 , FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las cuales CDR1 está posicionada entre FR 1 y FR2 , C DR2 entre FR2 y FR3, y CD R3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR 1 , FR2 , FR3 o FR4, una región de estructura base , en la forma referida por otros, representa las FRs combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina individual , presente en la Naturaleza. Tal como se utiliza en la presente solicitud, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y FRs representa dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen u na región de estructura base.

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "gen de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de mad uración que conduce al reacomodo y mutación genética para expresión de una inmunoglobulina particular. (Véase, por ejemplo, Shapiro et al . , C rit. Rev. Immunol . 22(3) : 1 83-200 (2002) ; Marchalonis et al . , Adv Exp Med Biol . 484: 1 3-30 (2001 )). Una de las ventajas provistas por varias modalidades de la presente invención surge del reconocimiento que es más probable que los genes de anticuerpo de línea germinal conserven las estructu ras de secuencia de aminoácidos esenciales características de los individuos en las especies que los genes de anticuerpo mad uro , por lo tanto es menos probable que sean reconocidos como provenientes de una fuente exógena cuando se utilizan terapéuticamente en dicha especie.

Tal como se utiliza en la presente solicitud , el término "neutralizar" se refiere a contrarrestar la actividad biológica de un antígeno cuando una proteína de unión se une específicamente al antígeno. En una modalidad , la proteína de unión neutralizante se une a la citocina y reduce su actividad biológica en por lo menos aproximadamente 20% , 40% , 60%, 80%, 85% o más.

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad y afinidad de unión de una DVD-lg para dos o más antígenos.

El término "epítope" incluye cualq uier determinante polipeptídico con capacidad de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. En algunas modalidades, los determinantes de epítope incluyen ag rupamientos de moléculas qu ímicamente activos en superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, o sulfonilo, y, en algunas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno que es ligada por un anticuerpo. En algunas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando éste reconoce su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que los anticuerpos "se unen al mismo epítope" si los anticuerpos presentan competencia cruzada (uno evita la unión o efecto modulador del otro) . Además, las definiciones estructurales de los epítopes (traslape, similar, identidad) son informativas, pero las definiciones funcionales con frecuencia son más relevantes debido a que éstas abarcan parámetros estructurales (u nión) y funcionales (modulación , competencia).

El término "resonancia de plasmón de superficie", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante detección de las alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz bio-detectora, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore® (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véase Jónsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 5J_: 19-26; Jónsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "KaSoc". tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la constante de la velocidad de asociación para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) al antígeno para formar, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno como se sabe en la técnica. La "Kas0c" también es conocida por los términos "constante de velocidad de asociación", o "ka", tal como se utiliza de manera intercambiable en la presente solicitud. Este valor que indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo o la velocidad de formación de complejo entre un anticuerpo y el antígeno también se demuestra mediante la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")'Ab-Ag.

El término "Kd i S0c" , tal como se utiliza en la presente solicitud , pretende hacer referencia a la constante de la velocidad de disociación para la disociación , o "constante de la velocidad de disociación", de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) de, por ejemplo, el complejo anticuerpo/antígeno como se sabe en la técnica. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antígeno objetivo o la separación del complejo Ab-Ag con el tiempo en anticuerpo y antígeno libres como se muestra mediante la sig uiente ecuación: Ab + Ag <- Ab-Ag .

El término "KD" tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la "constante de disociación en equilibrio", y se refiere al valor obtenido en una med ición de titulación en equilibrio, o dividiendo la constante de velocidad de disociación (kd i Soc) entre la constante de velocidad de asociación (ka Soc) - La constante de velocidad de asociación , la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación en equilibrio se utilizan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica . El uso de técnicas basadas en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y la capacidad de examinar muestras en soluciones amortiguadoras fisiológicas en equilibrio. Se pueden utilizar otras estrategias experimentales e instrumentos tales como una prueba BIAcore® (análisis de interacción biomolecular) (por ejemplo, instrumento disponible de BIAcore I nternational AB, a G E Healthcare company, Uppsala, Suecia). De manera adicional , también se puede utilizar una prueba KinExA® (Prueba de Exclusión Cinética), disponible de Sapidyne I nstruments (Boise, Idaho) .

"Marca" y "marca detectable" significan una porción unida a un compañero de unión específica, tal como un anticuerpo o un analito, por ejemplo, para hacer q ue la reacción entre los miembros de un par de unión específica, tal como u n anticuerpo y un analito, sea detectable, y el compañero de unión específica , por ejemplo, anticuerpo o analito, marcado de esta manera es referido como "marcado en forma detectable". Por lo tanto , el término "proteína de unión marcada" tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a una proteína con una marca incorporada que provee la identificación de la proteína de unión . En u na modalidad, la marca es un marcador detectable que puede producir u na señal que se puede detectar utilizando medios visuales o instrumentales, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que se puedan detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se pueda detectar utilizando métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo , 3H , 4C , 35S , 9oYi 99Tc> ???| ?) 125|( 177|_U ?66??? Q i53Sm); cr0mógenos, marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, luminóforos de lantánido), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítope); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. Los ejemplos representativos de marcas comúnmente empleadas para inmuno-ensayos incluyen porciones que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio, y porciones que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En la presente solicitud se describen otras marcas. En este sentido, la porción por sí misma podría no estar marcada en forma detectable pero se podría tornar detectable después de reaccionar con incluso otra porción. El uso de "marcado en forma detectable" pretende abarcar a este último tipo de marcación detectable.

El término "conjugado" se refiere a una proteína de unión, tal como un anticuerpo, químicamente enlazado a una segunda porción química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se utiliza en la presente solicitud para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. En una modalidad, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen , pero no se limitan a, toxina de pertussis, taxol , citocalasina B , gramicidina D, bromuro de etidio, emetina , mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina , daunorrubicina, dihid roxi-antracin-d iona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D , 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína , tetracaína , lidocaína , propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Cuando se utiliza en el contexto de u n inmuno-ensayo, el anticuerpo conj ugado puede ser un anticuerpo marcado en forma detectable utilizado como el anticuerpo de detección .

Los términos "cristal" y "cristalizado" tal como se utilizan en la presente solicitud , se refieren a una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) , o porción de unión a antígeno del mismo, que existe en forma de un cristal . Los cristales son una forma del estado sólido de la materia , la cual es distinta de otras formas tal como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están constituidos por arreglos tridimensionales, repetitivos, reg ulares de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos), o ensambles moleculares (por ejemplo, complejos antígeno/anticuerpo). Estos arreglos tridimensionales están acomodados de conformidad con relaciones matemáticas específicas que son bien entendidas en el campo. La unidad fundamental , o bloque de construcción , que se repite en un cristal se denomina la unidad asimétrica. La repetición de la u nidad asimétrica en un ordenamiento que se ajusta a una simetría cristalográfica bien definida, dada, provee la "celda unitaria" del cristal . La repetición de la celda unitaria mediante traslaciones regulares en todas las tres dimensiones provee el cristal . Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach , 2a ed . , pp. 201 -1 6, Oxford U niversity Press, N ueva York, N ueva York, (1999).

El término "polin ucleótido" significa una forma polimérica de dos o más nucleotidos, ya sea ribon ucleótidos o desoxi nucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de n ucleótido. El término incluye formas de cadena sencilla y cadena doble de ADN .

El término "polinucleótido aislado" sig nifica un polinucleótido (por ejemplo, de ADNc, genómico, o de origen sintético, o alguna combinación de los mismos) que, debido a su origen , el "polinucleótido aislado" no está asociado con el total o u na porción de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la Naturaleza; está ligado en forma operable a un polinucleótido con el que éste no está ligado en la Naturaleza; o no se presenta en la Natu raleza como parte de una secuencia más grande.

El término "vector", pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual éste ha sido enlazado. U n tipo de vector es u n "plásmido", el cual se refiere a u n asa de ADN de doble cadena circular en la cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Algunos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedera dentro de la cual éstos se han introducido (por ejemplo , vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mam ífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mam ífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera después de introducción dentro de la célula hospedera, y de esta manera se replican junto con el genoma hospedero. Asimismo, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales éstos están ligados en forma operativa . Dichos vectores son referidos en la presente solicitud como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en forma de plásmidos. En la presente descripción , "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma más comú nmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión , tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), los cuales cumplen funciones equivalentes.

El término "ligado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en la cual los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida . Una secuencia de control "ligada en forma operable" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "ligadas en forma operable" incluyen tanto secuencias de control de expresión que están contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificadoras a las cuales éstas están ligadas. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio de transcripción, de terminación, de promotor e incrementador; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como las señales de empalmado y poliadenilación; secuencias que estabilizan al ARNm citoplasmático; secuencias que incrementan la eficiencia de traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que incrementan la estabilidad de proteína; y cuando se desee, secuencias que incrementen la secreción de proteína. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo hospedero; en los procariotas, dichas secuencias de control por lo general incluyen secuencias de promotor, de sitio de unión ribosómico, y de terminación de transcripción; en los eucariotas, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión .

"Transformación", se refiere a cualquier proced imiento mediante el cual el ADN exógeno entra a una célula hospedera. La transformación puede ocurrir bajo condiciones natu rales o artificiales utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación se puede basar en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico exógenas dentro de u na célula hospedera procariota o eucariota. El método se selecciona tomando como base la célula hospedera que está siendo transformada y puede incluir, pero no se limita a , i nfección viral , electroporación , lipofección , y bombardeo de partícu las. Dichas células "transformadas" incluyen células transformadas de manera estable en las cuales el ADN insertado es capaz de replicacion ya sea como un plásmido que se replica de manera autónoma o como parte del cromosoma hospedero. Estas también incluyen células q ue expresan en forma transitoria el ADN o ARN insertado du rante períodos limitados de tiempo.

El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera") , pretende hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido ADN exógeno. Se debe entender que dichos términos pretenden hacer referencia no solamente a la célula objeto particular, sino también a la progenie de dicha célu la . Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones subsiguientes causadas ya sea por mutación o por influencias ambientales, dicha progenie podría, de hecho, no ser idéntica a la célula progenitora, pero aú n sigue estando incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" tal como se utiliza en la presente solicitud. En una modalidad , las células hospederas incluyen células procariotas y eucariotas q ue se seleccionan a partir de cualquiera de los Reinos de la vida. En otra modalidad , las células eucariotas incluyen células protistas, fúngicas, vegetales y animales. En otra modalidad , las células hospederas incluyen pero no se limitan a la l ínea de célula procariota de E. coli; líneas de célula de mamífero CHO , HEK 293, COS , NSO, SP2 y PER .C6 ; la línea de célula de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

Se pueden utilizar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejidos y transformación (por ejemplo, electroporación , lipofección). Las reacciones y técnicas de purificación enzimáticas se pueden efectuar de conformidad con las especificaciones del fabricante o como normalmente se logra en la técnica o como se describe en la presente solicitud . Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden efectuar en forma general de conformidad con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de toda la presente descripción . Véase por ejemplo , Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Man ual (2a ed . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .Y. (1 989)) , la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia pa ra cualquier propósito.

"Organismo transgénico" , como se sabe en la técnica, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgen, en el cual el transgen introducido en el organismo (o u n ancestro del organismo) expresa un polipéptido no expresado de manera natural en el organismo. U n "transgen" es una construcción de ADN , la cual está integrada de manera estable y operable en el genoma de u na célula a partir de la cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del organismo transgénico.

Los términos "regular" y "mod ular" se utilizan de manera intercambiable, y, tal como se utilizan en la presente solicitud , se refieren a un cambio o una alteración en la actividad de u na molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina) . La modulación puede ser u n incremento o un decremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula de interés. Los ejemplos de actividades y funciones de una molécula incluyen , pero no se limitan a, características de unión , actividad enzimática , activación de receptor celular, y transd ucción de señal .

De manera correspondiente, el término "mod ulador" es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de una citocina) . Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o decremento en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula en comparación con la magn itud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En alg unas modalidades, u n modulador es un inhibidor, el cual disminuye la magnitud de por lo menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores de ejemplo incluyen , pero no se limitan a , proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen , por ejemplo, en el documento WO 01 /83525.

El término "agonista", se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, causa u n incremento en la magnitud de una cierta actividad o fu nción de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o fu nción observada en ausencia del agonista . Los agonistas particulares de interés pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohid ratos, o cualesquiera otras moléculas q ue se unan al antígeno.

El término "antagonista" o "inhibidor", se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés causa u n decremento en la magnitud de una cierta actividad o función de la molécula en comparación con la magn itud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista . Los antagonistas particulares de interés incluyen aq uellos q ue bloquean o modulan la actividad biológica o inmunológica del antígeno. Los antagonistas e in hibidores de antígenos pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas, ácidos n ucleicos, carbohidratos, o cualesq uiera otras moléculas, que se unan al antigeno.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el térmi no "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o aliviar la gravedad y/o du ración de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, evitar el avance de un trastorno, ocasionar la regresión de u n trastorno, evitar la recurrencia , desarrollo, inicio o avance de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o incrementar o mejorar el o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) .

"Paciente" e "individuo" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud para referirse a un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (por ejemplo , un humano, un mono, y un chimpancé) , un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, u na oveja , un hámster, un cobayo, un gato , un perro, u na rata, u n ratón , una ballena) , un ave (por ejemplo, un pato o un ganso) , y un tiburón . De preferencia, el paciente o individuo es un humano, tal como un humano que está siendo tratado o evaluado respecto a una enfermedad, trastorno o condición , un humano en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición , un humano q ue tiene una enfermedad, trastorno o condición , y/o un h umano que está siendo tratado por una enfermedad , trastorno o condición .

El término "muestra", tal como se utiliza en la presente solicitud , se utiliza en su sentido más amplio. Una "muestra biológica" , tal como se utiliza en la presente solicitud , incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia proveniente de un ente vivo o de un ente anteriormente vivo. Dichos entes vivos incluyen , pero no se limitan a , humanos , ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen , pero no se limitan a , sangre, (por ejemplo, sangre entera) , plasma , suero, orina, líquido amniótico, líquido sinovial , células endoteliales, leucocitos, monocitos, otras células, órganos, tejidos, médula ósea, nodos linfáticos y bazo.

"Componente", "componentes", y "por lo menos un componente", se refieren en general a un anticuerpo de captura , u n anticuerpo para detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un contenedor, una solución amortiguadora , un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección , u n reactivo/solución de pretratamiento, un substrato (por ejemplo, como una solución) , una solución de terminación , y similares que pueden ser incluidos en un estuche para análisis de una muestra de prueba , tal como una muestra de orina, suero o plasma de u n paciente, de conformidad con los métodos descritos en la presente solicitud y otros métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, en el contexto de la presente descripción , "por lo menos un componente" , "componente" , y "componentes" pueden incluir un polipéptido u otro analito como se indicó anteriormente, tal como u na composición que comprende un analito tal como un polipéptido, el cual opcionalmente se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como mediante unión a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti-polipéptido). Alg unos componentes pueden estar en solución o liofilizados para reconstitución para uso en u na prueba .

"Control" se refiere a una composición que se sabe no contiene analito ("control negativo") o que contiene analito ("control positivo") . Un control positivo puede comprender una concentración conocida de analito. "Control", "control positivo" , y "calibrador" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente solicitud para referi rse a u na composición que comprende una concentración conocida de analito. Se puede utilizar un "control positivo" para establecer las características de desempeño de la prueba y es un indicador útil de la integridad de los reactivos (por ejemplo, analitos) .

"Corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren generalmente a un valor de corte de la prueba q ue se utiliza para evaluar los resultados de diagnosis/prognosis/eficacia terapéutica mediante comparación de los resultados de la prueba contra el corte/nivel predeterminado, en donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, gravedad de la enfermedad , progreso/no progreso/mejoría, etc.) . Aunque la presente descripción puede proveer niveles predeterminados de ejemplo, es bien sabido que los valores de corte pueden variar en función de la naturaleza del inmuno-ensayo (por ejemplo, anticuerpos utilizados, etc.). También está dentro de la habilidad comú n del experto en la técnica adaptar la presente descripción para otros inmuno-ensayos para obtener valores de corte específicos de inmuno-ensayo para aquellos otros inmuno-ensayos basados en esta descripción . Mientras que el valor preciso del corte/nivel predeterminado puede variar entre pruebas, las correlaciones como las descritas en la presente solicitud (si las hubiera) deben ser aplicables en términos generales.

"Reactivo de pretratamiento" , por ejemplo, reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, tal como se utiliza en una prueba de diagnóstico como se describe en la presente solicitud es aquel que lisa cualesquiera células y/o solubiliza cualq uier analito que esté/estén presente(s) en u na muestra de prueba. El pretratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe también en la presente solicitud. Entre otras cosas, solubilizar el analito (por ejemplo, polipéptido de interés) puede implicar la liberación del analito a partir de cualesq uiera proteínas de unión endógenas presentes en la muestra . Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (no requ iere de un paso de separación) o heterogéneo (requiere un paso de separación) . Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo existe remoción de cualesquiera proteínas de unión a analito precipitadas a partir de la muestra de prueba antes de proceder con el siguiente paso de la prueba.

"Reactivos de control de calidad" en el contexto de inmuno-ensayos y estuches descritos en la presente solicitud , incluyen , pero no se limitan a , calibradores, controles , y paneles de sensibilidad . Típicamente se utiliza un "calibrador" o "patrón de referencia" (por ejemplo , uno o más, tal como una pluralidad) para establecer cu rvas de calibración (patrón) para interpolación de la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. De manera alternativa, se puede utilizar un calibrador individual , el cual está cerca de un valor de corte positivo/negativo predeterminado. Se pueden utilizar calibradores múltiples (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibrador(es)) en conju nto de modo tal que constituya un "panel de sensibilidad".

"Riesgo" se refiere a la posibilidad o probabilidad de que ocurra un evento particular ya sea en el presente o en algún pu nto en el futuro. "Estratificación del Riesgo" se refiere a u n arreglo de factores de riesgo clínicos conocidos que permite a los médicos clasificar a los pacientes en riesgo bajo, moderado, alto o el más alto, de desarrollar una enfermedad , trastorno o condición particular.

"Específico" y "especificidad" en el contexto de una interacción entre miembros de un par de unión específica (por ejemplo, un antígeno (o fragmento del mismo) y u n anticuerpo (o fragmento antigénicamente reactivo del mismo)) se refieren a la reactividad selectiva de la interacción . La frase "se u ne específicamente a" y frases análogas se refieren a la capacidad de los anticuerpos (o fragmentos antigénicamente reactivos de los mismos) de unirse específicamente al analito (o un fragmento del mismo) y no u nirse específicamente a otras entidades.

"Compañero de unión específica" es un miembro de un par de unión específica. Un par de unión específica comprende dos moléculas diferentes, las cuales se unen específicamente una a la otra a través de medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específica antígeno y anticuerpo de los inmuno-ensayos comunes, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótido complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Asimismo, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específica originales, por ejemplo, un análogo de analito. Los miembros de unión específica inmuno-reactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígeno, y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales así como complejos, fragmentos, y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de los mismos, ya sea aislados o producidos en forma recombinante.

"Variante" tal como se utiliza en la presente solicitud significa un polipéptido que difiere de un polipéptido dado (por ejemplo, polipéptido de IL-18, BNP, NGAL o VIH o anticuerpo anti-polipéptido) en la secuencia de aminoácido por la adición (por ejemplo, inserción), deleción, o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva la actividad biológica del polipéptido dado (por ejemplo, una IL-18 variante puede competir con el anticuerpo anti-IL-18 por la unión a IL-18). Se reconoce en la técnica que una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, carácter hidrofílico y grado y distribución de las regiones cargadas) típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos , como se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al . , J . Mol . Biol. 1 57: 1 05-1 32 ( 1982)) . El índice hidropático de u n ami noácido se basa en una consideración de su carácter hidrofóbico y carga . Se sabe en la técnica q ue se pueden sustituir los aminoácidos de índices hidropáticos similares y aún conservar la función de proteína . En u n aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. También se puede utilizar el carácter hidrofílico de los aminoácidos para revelar sustituciones que pod rían dar como resultado proteínas que retienen la función biológica. Una consideración del carácter hidrofílico de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo del carácter hidrofílico promedio local más grande de dicho péptido, una medida útil que se ha reportado se correlaciona bien con la antigenicidad y carácter inmunogénico (véase, por ejemplo, patente E. U.A. No. 4, 554, 1 01 , la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia) . La sustitución de aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico similares puede dar como resultado péptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo carácter inmunogénico, como se entiende en la técnica. En un aspecto, se efectúan sustituciones con aminoácidos que tienen valores de carácter hidrofílico dentro de ± 2 de uno con respecto al otro. Tanto el índice de carácter hidrofobico como el valor de carácter hidrofílico de los aminoácidos son influenciados por la cadena lateral particular de dicho aminoácido. Consistente con dicha observación, se entiende que las sustituciones de aminoácido que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de dichos aminoácidos, como se revela mediante el carácter hidrofobico, carácter hidrofílico, carga, tamaño, y otras propiedades. También se puede utilizar "variante" para describir un polipéptido o fragmento del mismo que ha sido procesado diferencialmente, tal como mediante proteólisis, fosforilación, u otra modificación posterior a la traducción, y que aún conserva su actividad biológica o reactividad al antígeno, por ejemplo, la capacidad de unirse a IL-18. El uso de "variante" en la presente solicitud tiene la intención de abarcar fragmentos de una variante a menos que el contexto contradiga de otra manera.

I. Generación de proteína de unión de DVD La invención pertenece a proteínas de unión de Dominio Variable Dual (DVD) que pueden ligar uno o más objetivos y a métodos para elaboración de las mismas. En una modalidad, la proteína de unión comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, C es un dominio constante, X1 representa un aminoácido o polipéptido, X2 representa una región Fe y n es 0 o 1 . La proteína de unión de la invención se puede generar utilizando varias técnicas. La invención provee vectores de expresión , célula hospedera y métodos para generar la proteína de u nión .

A: Generación de anticuerpos monoclonales progen itores Los dominios variables de la proteína de unión de DVD se pueden obtener a partir de anticuerpos progenitores, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales que se pueden unir a antígenos de interés. Estos anticuerpos pueden estar presentes en la Naturaleza o se pueden generar utilizando tecnología recombinante.

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo, incluyendo el uso de tecnolog ías de hibridoma , recombinante, y despliegue en fago , o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los mAbs se pueden producir utilizando técn icas de hibridoma incluyendo aquellas conocidas en el campo y que se enseñan , por ejemplo, en Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1 988); Hammerling , et al. , en : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N .Y. , 1981 ) (dichas referencias se incorporan para referencia en sus totalidades). El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente solicitud no está limitado a anticuerpos que se producen a través de tecnolog ía de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de un clon individ ual , incluyendo cualquier clon eucariota , procariota, o de fago, y no al método mediante el cual éste se produce. Los hibridomas se seleccionan, clonan y se someten a tamizaje adicional respecto a las características deseables, incluyendo crecimiento robusto del hibridoma , alta producción de anticuerpo y características deseables del anticuerpo, como se discute en el Ejemplo 1 más adelante. Los hibridomas se pueden cultivar y expandir in vivo en animales singenéicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo celu lar in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una modalidad particular, los hibridomas son hibridomas de ratón. En otra modalidad , los hibridomas se producen en una especie no humana , no de ratón tal como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacu no o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas de humano, en los cuales un mieloma no secretor de humano se fusiona con una célula de h umano que expresa un anticuerpo que pueda ligar un antígeno específico.

Los mAbs recombinantes también se generan a partir de linfocitos aislados, individuales, utilizando un procedimiento conocido en la técnica como el método de anticuerpo de linfocitos seleccionado (SLAM por sus siglas en inglés) , como se describe en la patente E. U .A. No. 5,627 ,052 , Publicación WO 92/02551 del PCT y Babcock, J . S. et al. (1 996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848. En este método, se identifican células individuales que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos obtenidos a partir de un animal inmunizado, y se rescatan de las células, las moléculas de ADNc de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera mediante PCR de transcriptasa inversa y estas regiones variables después se pueden expresar, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes de humano) , en células hospederas de mamífero, tales como las células COS o CHO . Las células hospederas transfectadas con las secuencias de inmu noglobulina amplificadas, obtenidas a partir de linfocitos seleccionados in vivo, después pueden someterse a análisis y selección adicional in vitro, por ejemplo mediante visualización (panning) de las células transfectadas para aislar las células que expresan anticuerpos para el antígeno de interés. Además, las secuencias de inmunoglobulina amplificadas se pueden manipular in vitro, tal como med iante métodos de madu ración por afinidad in vitro tal como los descritos en la publicación WO 97/29131 del PCT y en la publicación WO 00/56772 del PCT.

Los anticuerpos monoclonales también se producen inmunizando un animal no humano q ue comprende algunos, o todos , los locus de inmunoglobulina de humano con u n antígeno de interés. En una modalidad, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón diseñado que comprende fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina de humano y es deficiente en la producción de anticuerpo de ratón . Véase, por ejemplo, Green et al . Nature Genetics 7: 1 3-21 ( 1 994) y las patentes E.U.A. Nos. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741, publicado el 25 de julio de 1991, WO 94/02602, publicado el 3 de febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados el 31 de octubre de 1996, WO 98/16654, publicado el 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, WO 98/50433, publicado el 12 de noviembre de 1998, WO 99/45031, publicado el 10 de septiembre de 1999, WO 99/53049, publicado el 21 de octubre de 1999, WO 0009560, publicado el 24 de febrero de 2000 y WO 00/037504, publicado el 29 de junio de 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio de humano tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpo de humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal, de tamaño megabase de los loci de la cadena pesada de humano y "x" loci de la cadena ligera. Véase Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), cuyas descripciones se incorporan en la presente solicitud para referencia.

También se pueden utilizar métodos in vitro para elaborar los anticuerpos progenitores, en los cuales se somete a tamizaje una genoteca de anticuerpo para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión deseada. Los métodos para dicho tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante son bien conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos en, por ejemplo, Ladner et al. patente E.U.A. No. 5,223,409; Kang et al. Publicación No. WO 92/18619 del PCT; Dower et al. Publicación No. WO 91/17271 del PCT; Winter et al. Publicación No. WO 92/20791 del PCT; Markland er al. Publicación No. WO 92/15679 del PCT; Breitling et al. Publicación No. WO 93/01288 del PCT; McCafferty et al. Publicación No. WO 92/01047 del PCT; Garrard er al. Publicación No. WO 92/09690 del PCT; Fuchs er al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281: McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths er al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins er al. (1992) J Mol Biol 226:889-896: Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628: Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad eí al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom er al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas er al. (1991) PNAS 88:7978-7982, publicación de solicitud de patente US 20030186374, y Publicación No. WO 97/29131 del PCT, cuyos contenidos de cada uno se incorporan en la presente solicitud para referencia.

Los anticuerpos progenitores de la presente invención también se pueden generar utilizando varios métodos de despliegue en fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue en fago, los dominios de anticuerpo funcionales se despliegan sobre la superficie de partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En particular, dicho fago se puede utilizar para desplegar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpo combinatoria (por ejemplo, de humano o múrido). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie sólida o glóbulo. Los fagos utilizados en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados de manera recombinante ya sea al gen III o a la proteína del gen VIII del fago. Los ejemplos de métodos de despliegue de fago que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134; Publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108, cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad.

Como se describe en las referencias en la presente solicitud, después de seleccionar el fago, las regiones codificadoras de anticuerpo provenientes del fago se pueden aislar y utilizar para generar anticuerpos completos incluyendo anticuerpos de humano o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresar en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe con mayor detalle más adelante. Por ejemplo, también se pueden utilizar técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 empleando métodos conocidos en la técnica tales como aq uellos descritos en la publicación WO 92/22324 del PCT; M ullinax et al. , BioTechniques 12(6) :864-869 (1 992) ; y Sawai et al, AJ RI 34:26-34 (1 995) ; y Better et al . , Science 240: 1041 -1 043 (1 988) (dichas referencias se incorporan para referencia en sus totalidades) . Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para prod ucir Fvs de cadena individual y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las patentes E. U .A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al . , Methods in Enzymology 203:46-88 (1 991 ); Shu et al. , PNAS 90:7995-7999 (1 993) ; y Skerra et al . , Science 240: 1038-1040 ( 1988) .

De manera alternativa al tamizaje de genotecas de anticuerpo recombinante mediante despliegue en fago, se pueden aplicar otras metodolog ías conocidas en la técnica para el tamizaje de genotecas combinatorias grandes para la identificación de anticuerpos progenitores. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el cual la genoteca de anticuerpo recombinante se expresa como fusiones de ARN-proteína, como se describe en la Publicación del PCT No. WO 98/31700 de Szostak y Roberts, y en Roberts, R. W. y Szostak, J . W. ( 1 997) Proc. Nati Acad. Sci. USA 94: 12297-1 2302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteina que éste codifica med iante traducción in vitro de moléculas de ARNm sintético q ue portan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en sus extremos 3' . Por lo tanto, se puede enriquecer un ARN m específico a partir de una mezcla compleja de moléculas de ARNm (por ejemplo, una genoteca combinatoria) tomando como base las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, anticuerpo, o porción del mismo, tal como unión del anticuerpo, o porción del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico q ue codifican para los anticuerpos, o porciones de los mismos, recuperadas a partir del tamizaje de dichas genotecas se pueden expresar utilizando medios recombinantes como se describe en la presente solicitud (por ejemplo, en células hospederas de mamífero) y, además, se pueden someter a mad uración por afinidad adicional ya sea med iante rondas adicionales de tamizaje de las fusiones de ARNm-péptido en las cuales se han introducido mutaciones en la secuencia o secuencias originalmente seleccionadas, o mediante otros métodos para maduración por afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe en la presente solicitud .

En otra estrategia los anticuerpos progenitores también se pueden generar utilizando métodos de despliegue en levadura conocidos en la técnica . En los métodos de despliegue en levadura, se utilizan métodos genéticos para fijar los dominios del anticuerpo a la pared celular de la levadura y los despliega sobre la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura se puede utilizar para desplegar dominios de u nión a antigeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpo combinatoria (por ejemplo, de humano o múrido) . Los ejemplos de métodos de despliegue en levadura que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos progenitores incluyen aquellos descritos en Wittrup, et al. , patente E. U.A. No. 6,699,658 incorporada en la presente solicitud para referencia.

Los anticuerpos descritos en la presente solicitud también se pueden modificar para generar anticuerpos progenitores injertados con CDR y humanizados. Los anticuerpos progenitores injertados con CDR comprenden secuencias de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera provenientes de un anticuerpo de humano en las cuales una o más de las regiones CD R de VH y/o VL están remplazadas con secuencias de CDR de anticuerpos de múrido que pueden ligar al antígeno de interés. Una secuencia de estructura base proveniente de cualquier anticuerpo de humano puede servir como la plantilla para el injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo directamente en la cadena en dicha estructu ra base con frecuencia conduce a cierta pérdida de afinidad de unión al antígeno. Mientras más homólogo sea un anticuerpo de humano al anticuerpo de múrido original , menos probable será la posibilidad de que la combinación de las CDRs de múrido con la estructura base de humano introduzca distorsiones en las CDRs que pudieran reducir la afinidad. Por lo tanto, en una modalidad, la estructura base variable de h umano que se elige para remplazar la estructura base variable de mundo excepto las CDRs tiene por lo menos un 65% de identidad de secuencia con la estructura base de la región variable de anticuerpo de mú rido. En una modalidad , las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia. En una modalidad particular, q ue las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 75% de identidad de secuencia . En otra modalidad , las regiones variables de humano y de múrido excepto las CDRs tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia . Los métodos para producir dichos anticuerpos son conocidos en la técnica (véase el documento EP 239,400; publicación del PCT WO 91 /09967; patentes E . U .A. Nos. 5,225,539; 5, 530 , 1 01 ; y 5,585,089), revestimiento o restau ración (resurfacing) (EP 592, 1 06; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5) :489-498 (1 991 ) ; Studnicka et al. , Protein Engineering 7(6) :805-814 (1 994); Roguska et al. , PNAS 91 :969-973 (1994)), y reacomodo de la cadena (patente E. U .A. No . 5,565,352); y anticuerpos anti-idiotípicos.

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpo de especie no humana que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y regiones de estructura base de una molécula de inmunoglobulina de humano. Las secuencias de Ig de humano conocidas se describen, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www. public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools. html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.th i nkquest.org/12429/I mmune/Antibody. html; www. hhmi.org/grants/lect ures/1996/vlab/; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html.www.immunologylink.com /; path box. wustl.edu/.about.hcenter/i ndex.html; www. biotech. ufl.edu/. a bout.h el/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.rn.ehime-u.acjp/. a bout.yasuhito-/Elisa. html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www. biotech. ufl.edu/. about.fccl/protocol. html; www.isac-net.org/sites_geo.html; axi mtl. ¡ mt. u n i-ma rb urg.de/. a bout. re k/AEP-Start. html; base rv. uci. ku n. n I/. a bout.jraats/l i nksl.html; www.recab.uni-hd.de/imrnuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www. b ioc he m. ucl. ac. u k/. abo ut.mart i n/abs/i ndex.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/SlideOI .html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h urna nisation/TAHHP. html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. cryst.bioc. cam.ac.uk/. abo ut.f mol i n a/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada una incorporada completamente en la presente solicitud para referencia.

Dichas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir el carácter inmunogénico o reducir, incrementar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, tiempo de vida media, o cualquier otra característica apropiada, como se sabe en la técnica.

Los residuos de estructura base en las regiones de estructura base de humano se pueden sustituir con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones en la estructura base se identifican utilizando métodos bien conocidos en la técnica , por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de la CDR y los resid uos de estructura base para identificar los residuos de estructura base importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos de estructu ra base inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al , patente E. U .A. No. 5,585,089; Riechmann et al ., Nature 332 :323 ( 1 988) las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia en sus totalidades) . Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se pueden conseguir fácilmente y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas de computadora que ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmu noglobulina , es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta ma nera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR de las secuencias de consenso e importada de modo que se puedan lograr las características de anticuerpo deseadas, tales como afinidad incrementada hacia el antígeno o antígenos objetivo. En general, los residuos de CDR están directamente y de manera muy sustancial implicados en influir la unión a antígeno. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el campo, tales como pero sin limitarse a las descritas en Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994); publicación del PCT WO 91/09967, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, patentes E.U.A. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, cada una incorporada completamente en la presente solicitud para referencia, incluidas las referencias citadas en las mismas.

B: Criterios para seleccionar anticuerpos monoclonales progenitores Una modalidad de la invención pertenece a la selección de anticuerpos progenitores con por lo menos una o más propiedades deseadas en la molécula de DVD-lg. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona a partir de uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad , los parámetros del anticuerpo se seleccionan a partir del g rupo que consiste de especificidad de antígeno, afinidad hacia el antigeno, potencia , función biológica, reconocimiento de epítope, estabilidad , solubilidad, eficiencia de producción , inmunogenicidad, farmacocinética , biodisponibilidad , reactividad cruzada tisular, y unión a antígeno ortólogo.

B.1 . Afinidad hacia el antígeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede depender de la naturaleza del antígeno, y del punto final terapéutico deseado. En una modalidad , los anticuerpos monoclonales tienen afinidades más altas (Kd = 0.01 - 0.50 p ) cuando se bloquea u na interacción de citocina-receptor de citocina ya que dicha interacción por lo general son interacciones de alta afinidad (por ejemplo, intervalos de < pM - <nM) . En tales casos, la afinidad del mAb hacia su objetivo debe ser igual o mejor que la afin idad de la citocina (ligando) por su receptor. Por otro lado, el mAb con afinidad menor (intervalo > n M) podría ser terapéuticamente efectivo por ejemplo, en la depu ración de proteínas potencialmente patógenas en circulación por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen a , secuestran , y eliminan especies en circulación de amiloide ?-ß. En otros casos, se puede utilizar reducir la afinidad de un mAb de alta afinidad existente mediante mutagénesis dirigida a sitio o utilizando un mAb con afinidad menor hacia su objetivo para evitar efectos secundarios potenciales por ejemplo, un mAb de alta afinidad puede secuestrar/neutralizar el total de su objetivo pretendido, con lo cual agota/elimina completamente la función o funciones de la proteína elegida como blanco. En este escenario, un mAb de baja afinidad puede secuestrar/neutralizar una fracción del objetivo que pudiera ser la responsable de los síntomas de la enfermedad (los niveles patológicos o sobre-producidos), permitiendo de esta manera que una fracción del objetivo continúe ejecutando su función o funciones fisiológicas normales. Por lo tanto, podría ser posible reducir la Kd para ajustar la dosis y/o red ucir los efectos secu ndarios. La afinidad del mAb progenitor podría desempeñar un papel en elegir apropiadamente como blanco las moléculas de la superficie celular para lograr el resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, si un objetivo se expresa en células de cáncer con alta densidad y en células normales con baja densidad , un mAb con afinidad más baja podría unirse a u n número más grande de objetivos en las células tumorales que en las células normales, lo que da como resultado la eliminación de célula tumoral a través de ADCC o CDC , y por lo tanto podría tener efectos terapéuticamente deseables. Por lo tanto, seleccionar un mAb con afinidad deseada podría ser relevante tanto para objetivos solubles como para objetivos de su perficie.

La señalización a través de u n receptor después q ue interactúa con su ligando puede depender de la afinidad de la interacción receptor-ligando. De manera similar, es concebible que la afinidad de un mAb hacia un receptor de superficie pueda determinar la natu raleza de la señalización intracelular y si el mAb puede o no suministrar u na señal agonista o una señal antagonista . La naturaleza basada en afinidad de la señalización mediada por mAb puede tener un impacto de su perfil de efecto secundario. Por lo tanto, la afinidad deseada y funciones deseadas de los anticuerpos monoclonales terapéuticos necesitan ser determinadas cuidadosamente mediante experimentación in vitro e in vivo.

La Kd deseada de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) se puede determinar experimentalmente en función del resultado terapéutico deseado. En u na modalidad se seleccionan anticuerpos progen itores con afinidad (Kd) hacia u n antígeno particular igual a , o mejor q ue, la afinidad deseada de la DVD-lg hacia el mismo antígeno. La afinidad y cinética de u nión al antígeno se evalúan mediante Biacore u otra técnica similar. En u na modalidad , cada anticuerpo progenitor tiene una constante de disociación (Kd) hacia su antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 1 0"7 M ; cuando mucho aproximadamente 1 0"8 M ; cuando mucho aproximadamente 1 0"9 M ; cuando mucho aproximadamente 10" 10 M ; cuando mucho aproximadamente 1 0' 1 1 ; cuando mucho aproximadamente 1 0~ 12 M ; y cuando mucho 1 0" 1 3 M . El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD 1 y el segundo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener afinidad (KD) similar o diferente para el antígeno respectivo. Cada anticuerpo progenitor tiene una constante de velocidad de asociación ( asoc) al antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 103 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 104 M"1s" 1; por lo menos aproximadamente 105 M"1s"1; y por lo menos aproximadamente 106 M"1s"1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener una constante de velocidad de asociación (KaS0c) similar o diferente para el antígeno respectivo. En una modalidad, cada anticuerpo progenitor tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) al antígeno que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10' 3 s'1; cuando mucho aproximadamente 10"4 s"1; cuando mucho aproximadamente 10"5 s"1; y cuando mucho aproximadamente 10"6 s"1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie. El primer anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo progenitor a partir del cual se obtiene VD2 pueden tener constantes de velocidad de disociación (Kdisoc) similares o diferentes para el antígeno respectivo.

B2. Potencia La afinidad/potencia deseada de los anticuerpos monoclonales progenitores puede depender del resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para interacciones receptor-ligando ( -L) la afinidad (kd) es igual o mejor que la kd de R-L (intervalo p ). Para la depuración simple de una proteína patológica en circulación , la kd podría estar en el intervalo nM bajo por ejemplo, la depuración de varias especies de péptido ?-ß en circulación. Además, la kd también puede depender de si el objetivo expresa o no copias múltiples del mismo epítope por ejemplo un mAb que elija como blanco el epítope conformacional en los oligómeros ?ß.

En casos en los que VD 1 y VD2 se u nen al mismo antígeno, pero a epítopes distintos, la DVD-lg puede contener 4 sitios de unión para el mismo antígeno, incrementando de esta manera la avidez y por lo tanto la kd aparente de la DVD-lg . En una modalidad , se eligen anticuerpos progenitores con kd igual o menor que la deseada en la DVD-lg . Las consideraciones de afin idad de un mAb progenitor también pueden depender de si la DVD-lg contiene o no cuatro o más sitios de unión a antígeno idénticos (es decir; una DVD-Ig proveniente de un mAb individual) . En este caso , la kd aparente sería mayor que la del mAb debido a la avidez. Dichas moléculas de DVD-lg se pueden utilizar para entrelazar el receptor de superficie, incrementar la potencia de neutralización , incrementar la depu ración de proteínas patológicas, etc.

En una modalidad se seleccionan anticuerpos progenitores con potencia de neutralización para antígeno específico igual a o mejor que el potencial de neutralización deseado de la DVD-lg para el mismo antígeno. La potencia de neutralización se puede evaluar mediante un bio-ensayo dependiente de objetivo en el cual las células del tipo apropiado producen una señal mensurable (es decir proliferación o producción de citocina) en respuesta a la estimulación del objetivo, y la neutralización del objetivo por parte del mAb puede reducir la señal en una manera dependiente de la dosis.

B3. Fu nciones biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden efectuar potencialmente varias funciones. Algunas de esas funciones se listan en la Tabla 3. Estas funciones se pueden evaluar mediante pruebas tanto in vitro (por ejemplo, pruebas basadas en células y bioqu ímicas) como con modelos animales in vivo.

TABLA 3 Algunas aplicaciones potenciales para anticuerpos terapéuticos Objetivo (clase) Mecan ismo de acción (objetivo) Neutralización de actividad (por ejemplo una citocina) Soluble depu ración incrementada (por ejemplo, (citocinas, otros) oligómeros ?ß) tiempo de vida media incrementado (por ejemplo, G LP 1 ) Agonistas (p,ej , G LP 1 R ; EPO R; etc) Superficie celular Antagonistas (p.ej . integ rinas; etc) (Receptores, otros) Citotóxico (CD20; etc) Depósitos de Depuración/degradación incrementada (p.ej . proteína placas ?ß, depósitos amiloides Se pueden seleccionar mAbs con fu nciones distintas descritos en los ejemplos en la presente solicitud en la Tabla 3 para lograr los resultados terapéuticos deseados . Después se pueden utilizar dos o más anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados en formato de DVD-lg para obtener dos funciones distintas en una sola molécula de DVD-lg . Por ejemplo, se puede generar u na DVD-lg seleccionando u n mAb progenitor que neutralice la función de una citocina específica , y seleccionando un mAb progenitor que Incremente la depu ración de una proteína patológica. De manera similar, se pueden seleccionar dos anticuerpos monoclonales progenitores que reconozcan dos receptores de superficie celular diferentes, un mAb con una función agonista sobre un receptor y el otro mAb con una función antagonista sobre un receptor diferente. Estos dos anticuerpos monoclonales seleccionados, cada uno con u na función distinta , se pueden utilizar para construir una molécula de DVD-lg individual q ue tendrá las dos funciones distintas (agonista y antagonista) de los anticuerpos monoclonales seleccionados en una sola molécula . De manera similar, se pueden utilizar dos anticuerpos monoclonales antagonistas hacia los receptores de superficie celular cada uno bloqueando la unión de los ligandos de receptor respectivos (por ejemplo, EG F e IGF) , en un formato de DVD-lg . Por el contrario , se pueden seleccionar un mAb anti-receptor antagonista (por ejemplo, anti-EG FR) y un mAb anti-mediador soluble neutralizante (por ejemplo, anti-IGF 1 /2) para elaborar una DVD-lg .

B4. Reconocimiento de epítope Regiones diferentes de las proteínas pueden efectuar funciones diferentes. Por ejemplo, regiones específicas de una citocina interactúan con el receptor de citocina para lograr la activación del receptor mientras que otras regiones de la proteína podrían ser necesarias para estabilizar a la citocina. En este caso, se puede seleccionar un mAb que se una específicamente a la región o regiones que interactúan con el receptor en la citocina y de esta manera bloquear la interacción citocina-receptor. En algunos casos, por ejemplo, se pueden seleccionar ciertos receptores de quimiocina que se unen a ligandos múltiples, un mAb que se une al epítope (región en el receptor de quimiocina) que interactúe solamente con un ligando. En otros casos, los anticuerpos monoclonales se pueden unir a epítopes en un objetivo que no son los directamente responsables de las funciones fisiológicas de la proteína, pero la unión de un mAb a estas regiones podría ya sea interferir con las funciones fisiológicas (impedimento estérico) o alterar la conformación de la proteína de modo tal que la proteína no pueda funcionar (mAb para receptores con ligando múltiple el cual altera la conformación del receptor de tal manera que ninguno de los ligandos se puede unir). También se han identificado anticuerpos monoclonales anti-citocina que no bloquean la unión de la citocina a su receptor, pero que bloquean la transducción de señal (por ejemplo, 125-2H, un mAb anti-IL-18).

Los ejemplos de epítopes y funciones de mAb incluyen, pero no se limitan a, bloqueo de la interacción receptor-ligando (R-L) (mAb neutralizante que se u ne al sitio de interacción con el receptor) ; impedimento estérico que da como resultado la unión disminuida o la no unión al receptor. U n anticuerpo se puede u nir al objetivo en un sitio diferente al sitio de unión al receptor, pero sigue interfiriendo con la u nión a receptor y funciones del objetivo mediante inducción de un cambio conformacional y elimina la fu nción (por ejemplo, Xolair) , unión al receptor pero bloquea la señalización ( 1 25-2 H).

En una modalidad , el mAb progenitor necesita elegir como blanco al epítope apropiado para eficacia máxima. Dicho epítope se debe conservar en la DVD-lg. El epítope de unión de un mAb se puede determinar mediante varias estrategias, incluyendo co-cristalografía, proteólisis limitada del complejo mAb-antígeno más mapeo del péptido mediante espectrometría de masas (Legros V. et al 2000 Protein Sci . 9: 1002-10) , genotecas de péptido desplegadas en fago (O'Connor KH et al 2005 J Immunol Methods. 299:21 -35), así como mutagénesis (Wu C. et al. 2003 J Immunol 1 70:5571 -7).

B5. Propiedades fisicoquímicas v farmacéuticas El tratamiento terapéutico con anticuerpos frecuentemente req uiere la administración de dosis altas, con frecuencia varios mg/kg (debido a una potencia baja en una base en masa como consecuencia de un peso molecular típicamente grande) . Con el fin de adaptar el cumplimiento del paciente y para tratar adecuadamente las terapias para enfermedad crónica y el tratamiento de paciente externo, es deseable la administración por vía subcutánea (s.c.) o intramuscular (i .m .) de mAbs terapéuticos. Por ejemplo, el volumen máximo deseable para administración por vía s.c. es de ~ 1 .0 ml_, y por lo tanto, son deseables concentraciones de > 1 00 mg/mL para limitar el número de inyecciones por dosis. En una modalidad , el anticuerpo terapéutico se administra en una dosis. Sin embargo, el desarrollo de dichas formulaciones está restringido por las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, agregación , lo cual incrementa potencialmente los riesgos de inmunogenicidad) y por limitaciones durante el procesamiento y suministro (por ejemplo, viscosidad). Por consiguiente, las cantidades grandes requeridas para eficacia clínica y las restricciones de desarrollo asociadas limitan la explotación completa del potencial de la formulación de anticuerpo y de la administración por vía s.c. en reg ímenes de dosis altas. Es evidente que las propiedades fisicoqu ímicas y farmacéuticas de una molécula de proteína y la solución de proteína son de primordial importancia, por ejemplo, características de estabilidad, solubilidad y viscosidad .

B5.1 . Estabilidad U na formulación de anticuerpo "estable" es aquella en la cual el anticuerpo en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica en almacenamiento . La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. En una modalidad , el anticuerpo en la formulación es estable a temperatu ra ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante por lo menos 1 mes y/o estable aproximadamente a 2-8°C durante por lo menos 1 año, durante por lo menos 2 años. Asimismo, en una modalidad, la formulación es estable después de congelamiento (a, por ejemplo, -70°C) y descongelación de la formulación, referido de aquí en adelante como un "ciclo de congelación/descongelación". En otro ejemplo, una formulación "estable" puede ser aquella en la cual menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un agregado en la formulación.

Se desea una DVD-lg estable in vitro a diversas temperaturas durante un periodo de tiempo prolongado. Esto se puede lograr mediante tamizaje rápido de mAbs progenitores estables in vitro a temperatura elevada, por ejemplo, a 40°C durante 2-4 semanas, y después se evalúa la estabilidad. Durante el almacenamiento a 2-8°C, la proteína revela estabilidad durante por lo menos 12 meses, por ejemplo, por lo menos 24 meses. La estabilidad (% de molécula intacta, monomérica) se puede evaluar utilizando varias técnicas tales como cromatografía por intercambio catiónico, cromatografía por exclusión de tamaño, SDS-PAGE, así como análisis de bioactividad. Para una lista más comprensiva de técnicas analíticas que se pueden utilizar para analizar las modificaciones covalentes y de conformación véase Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. En: Cleland, J. L; Langer, R., editores. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1a edición, Washington, ACS, pg. 22-45; y Pearlman, R.; Nguyen, T. H. (1990) Analysis of protein drugs. En: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1a edición, Nueva York, Marcel Dekker, Inc., pg.247-301.

Heterogeneidad y formación de agregado: La estabilidad del anticuerpo puede ser tal que la formulación puede revelar menos de aproximadamente 10%, y, en una modalidad, menos de aproximadamente 5%, en otra modalidad, menos de aproximadamente 2%, o, en una modalidad, dentro del intervalo de 0.5% a 1.5% o menos en el material de anticuerpo de G P que está presente como agregado. La cromatografía por exclusión de tamaño es un método que es sensible, reproducible, y muy robusto en la detección de agregados de proteína.

Además de niveles bajos de agregado, en una modalidad, el anticuerpo debe ser químicamente estable. La estabilidad química se puede determinar mediante cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico), cromatografía de interacción hidrofóbica, u otros métodos tales como enfocamiento isoeléctrico o electroforesis capilar. Por ejemplo, la estabilidad química del anticuerpo puede ser tal que después de almacenamiento de por lo menos 12 meses a 2-8°C el pico que representa el anticuerpo no modificado en una cromatografía de intercambio catiónico se puede incrementar en no más de 20%, en una modalidad, no más de 10%, o, en otra modalidad, no más de 5% en comparación con la solución de anticuerpo antes del análisis en almacenamiento.

En una modalidad, los anticuerpos progenitores despliegan integridad estructural; formación de puente de disulfuro correcto, y plegamiento correcto: La inestabilidad química debido a cambios en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede afectar la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad como se indica mediante la actividad del anticuerpo puede ser tal que después de almacenamiento de por lo menos 12 meses a 2-8°C la actividad del anticuerpo puede disminuir no más del 50%, en una modalidad no más del 30%, o incluso no más de 10%, o en una modalidad no más del 5% o 1% en comparación con la solución de anticuerpo antes del análisis en almacenamiento. Se pueden utilizar pruebas de unión a antígeno apropiadas para determinar la actividad del anticuerpo.

B5.2. Solubilidad La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la producción de IgG monomérica, correctamente plegada. Por lo tanto, la solubilidad de la IgG se puede evaluar mediante HPLC. Por ejemplo, la IgG soluble (monomérica) da origen a un pico individual en el cromatografo de HPLC, mientras que la insoluble (por ejemplo, multimérica y agregada) da origen a una pluralidad de picos. Por lo tanto, un experto en la técnica será capaz de detectar un incremento o decremento en la solubilidad de una IgG utilizando técnicas de HPLC rutinarias. Para una lista más comprensiva de técnicas analíticas que pueden ser utilizadas para analizar la solubilidad (véase Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. Londres, Londres, RU. Editor(es): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oxford, RU y Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301). La solubilidad de un mAb terapéutico es crítica para poder formular a la concentración elevada con frecuencia requerida para dosificación adecuada. Como se indicó en la presente solicitud, podrían ser necesarias solubilidades de > 100 mg/mL para ajusfar una dosificación eficiente de anticuerpo. Por ejemplo, la solubilidad del anticuerpo podría ser no menor de aproximadamente 5 mg/mL en fase de investigación inicial, en una modalidad no menos de aproximadamente 25 mg/mL en etapas de ciencia de procesos avanzados, o en una modalidad no menos de aproximadamente 100 mg/mL, o en una modalidad no menos de aproximadamente 150 mg/mL. Es evidente para un experto en la técnica que las propiedades intrínsecas de una molécula de proteína son importantes para las propiedades fisicoquímicas de la solución de proteína, por ejemplo, estabilidad, solubilidad, viscosidad. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que existe una amplia variedad de excipientes que se pueden utilizar como aditivos para afectar benéficamente las características de la formulación final de proteína. Estos recipientes pueden incluir: (i) solventes líquidos, cosolventes (por ejemplo, alcoholes tales como etanol); (ii) agentes amortiguadores (por ejemplo, amortiguadores de fosfato, acetato, citrato, aminoácido); (iii) azúcares o alcoholes de azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, fructosa, rafinosa, manitol, sorbitol, dextranos); (iv) agentes tensoactivos (por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60, 80, poloxámeros); (v) modificadores de isotonicidad (por ejemplo, sales tales como NaCI, azúcares, alcoholes de azúcar); y (vi) otros (por ejemplo, conservadores, agentes quelantes, antioxidantes, sustancias quelantes (por ejemplo, EDTA), polímeros biodegradables, moléculas portadoras (por ejemplo, HSA, PEGs).

La viscosidad es un parámetro de alta importancia con respecto a la fabricación de anticuerpo y procesamiento de anticuerpo (por ejemplo, diafiltración/ultrafiltración), procedimientos de terminado en el llenado (aspectos de bombeo, aspectos de filtración) y aspectos de suministro (capacidad de aplicación con jeringa, suministro con dispositivo sofisticado). Las viscosidades bajas permiten que la solución líquida del anticuerpo tenga una concentración más alta. Esto permite que se pueda administrar la misma dosis en volúmenes más pequeños. Los volúmenes de inyección pequeños tienen la ventaja inherente de menor dolor sobre las sensaciones de la inyección, y las soluciones no necesariamente tienen que ser isotónicas para reducir el dolor al inyectar al paciente. La viscosidad de la solución de anticuerpo puede ser tal que a esfuerzos cortantes de 100 (1/s) la viscosidad de la solución de anticuerpo es menor de 200 mPa s, en una modalidad menor de 125 mPa-s, en otra modalidad menor de 70 mPa-s, e incluso en otra modalidad menor de 25 mPa-s o incluso menor de 10 mPa-s.

B5.3. Eficiencia de producción La generación de una DVD-lg que se exprese de manera eficiente en células de mamífero, tal como las células de ovario de hámster chino (C HO), en una modalidad , requiere dos anticuerpos monoclonales progenitores los cuales por sí mismos son expresados de manera eficiente en células de mam ífero. El rendimiento de producción a partir de u na l ínea estable de mam ífero (es decir CHO) debe estar por encima de aproximadamente 0.5 g/l , en una modalidad por encima de aproximadamente 1 g/l, y en otra modalidad en el intervalo de aproximadamente 2-5 g/l o más (Kipriyanov SM , Little M . 1999 Mol Biotechnol. 1 2 : 1 73-201 ; Carroll S, Al-Rubeai M . 2004 Expert Opin Biol Ther. 4: 1 821 -9) .

La producción de anticuerpos y proteínas de fusión de Ig en células de mamífero es influenciada por varios factores. El diseño del vector de expresión a través de la incorporación de promotores, incrementadores y marcadores de selección fuertes puede llevar al máximo la transcripción del gen de interés a partir de una copia del vector integrada . La identificación de los sitios de integración del vector que son permisivos para niveles elevados de transcripción del gen puede aumentar la expresión de proteína a partir de u n vector (Wurm et al , 2004, Nature Biotechnology, 2004, Vol/ejemplar/Págs. 22/1 1 ( 1 393-1 398)) . Asimismo, los niveles de prod ucción se ven afectados por la proporción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y los diversos pasos en el proceso de ensamblado y secreción de proteína (J iang et al . 2006, Biotech nology Progress, Ene-Feb 2006 , vol . 22, no. 1 , p. 31 3-8) .

B.6. I nmunoqenicidad La administración de un mAb terapéutico puede dar como resultado cierta incidencia de una respuesta inmune (es decir, la formación de anticuerpos endógenos dirigidos contra el mAb terapéutico) . Se deben analizar los elementos potenciales que pudieran inducir inmunogenicidad durante la selección de los anticuerpos monoclonales progenitores, y se pueden tomar medidas para reduci r dicho riesgo para optimizar los anticuerpos monoclonales progenitores antes de la construcción de la DVD-lg. Se ha descubierto que los anticuerpos obtenidos de ratón son altamente inmunogénicos en los pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos constituidos por regiones constantes de humano y variables de ratón presentan un siguiente paso lógico para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos (Morrison y Schlom, 1990). De manera alternativa, la inmunogenicidad se puede reducir transfiriendo secuencias de CDR de múrido hacia la estructura base de anticuerpo de humano (reconfig u ración/injerto de CDR/humanización) , en la forma descrita para u n anticuerpo terapéutico por Riechmann et al . , 1 988. Otro método es conocido como "restauración (resurfacing)" o "revestimiento (veneering)", comenzando con los dominios ligero y pesado variables de roedor, solamente los aminoácidos de estructura base accesibles en superficie se alteran a los humanos, mientras que permanecen la CDR y los aminoácidos enterrados provenientes del anticuerpo de roedor progenitor (Roguska et al . , 1 996) . En otro tipo de humanización , en lugar de injertar las CDRs completas, una técnica injerta solamente las "regiones determinantes de especificidad" (SD Rs) , definidas como el subconjunto de residuos de CDR que están implicados en la unión del anticuerpo a su objetivo (Kashmiri et al . , 2005) . Esto necesita la identificación de las SD Rs ya sea a través de análisis de estructuras tridimensionales disponibles de complejos anticuerpo-objetivo o análisis de mutación de los resid uos de CDR del anticuerpo para determinar cuáles interactúan con el objetivo . De manera alternativa, los anticuerpos completamente h umanos pueden tener inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos de múrido, quiméricos o humanizados.

Otra estrategia para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias específicas q ue se predice serán inmunogénicas. En una estrategia, después que se analiza una primera generación biológica en humanos y se encuentra que es inaceptablemente inmu nogén ica , los epítopes de célula B se pueden mapear y después alterar para evitar la detección inmunitaria. Otra estrategia utiliza métodos para predecir y eliminar epítopes de célula T potenciales. Se han desarrollado métodos computacionales para escudriñar e identificar las secuencias de péptido de agentes terapéuticos biológicos con potencial para unirse a proteínas del MHC (Desmet et al. , 2005) . De manera alternativa se puede utilizar un método basado en célula dendrítica de humano para identificar epítopes de célula T CD4+ en alérgenos proteínicos potenciales (Stickler et al., 2005; S. L. Morrison y J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990), pp. 3-18; Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H. y Winter, G. "Reshaping human antibodies for therapy" Nature (1988) 332:323-327; Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Bláttler-W-A. Rees-A-R, Guild-B-C. A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing. Protein engineering, {Protein-Eng}, 1996, vol. 9, p. 895-904; Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey. SDR grafting— a new approach to antibody humanization. Methods (San Diego Calif), {Methods}, Mayo 2005, vol. 36, no. 1, p. 25-34; Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx-Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman-Tessa, Lasters-lgnace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation. Proteins, 2005, vol. 58, p. 53-69; Stickler-M-M, Estell-D-A. Harding-F-A. CD4+ T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunotherapy 2000, vol. 23, p. 654-60.).

B.7. Eficacia in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con la eficacia in vivo deseada, es importante generar y seleccionar mAbs con eficacia in vivo deseada similar cuando se administran en combinación. Sin embargo, en algu nos casos la DVD-lg puede presentar eficacia in vivo que no puede ser lograda con la combinación de dos mAbs separados. Por ejemplo, una DVD-lg puede poner dos objetivos en proximidad cercana lo que conduce a una actividad que no se puede lograr con la combinación de dos mAbs separados. Fu nciones biológicas deseables adicionales se describen en la presente solicitud en la sección B3. Se pueden seleccionar anticuerpos progenitores con características deseables en la molécula de DVD-lg tomando como base factores tales como el tiempo de vida media (t1 /2) farmacocinético; distribución en tejido; objetivos solubles contra objetivos en superficie celular; y concentración-soluble/densidad-superficie del objetivo.

B.8. Distribución en tejido in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con distribución en tejido in vivo deseada, en una modalidad se deben seleccionar mAbs progenitores con perfil de distribución en tej ido in vivo similar. De manera alternativa , tomando como base el mecan ismo en la estrategia de elección específica dual de objetivo, ésta podría no ser requerida en otros momentos para seleccionar mAbs progenitores con la similitud deseada de distribución en tejido in vivo cuando se administran en combinación . Por ejemplo, en el caso de una DVD-lg en la cual un componente de u nión dirige la DVD-lg hacia un sitio específico con lo cual lleva al segundo componente de unión al mismo sitio objetivo. Por ejemplo, una especificidad de u nión de una DVD-lg puede elegir como blanco el páncreas (células del islote) y la otra especificidad puede llevar G LP1 al páncreas para inducir insulina.

B.9. Isotipo Para generar una molécula de DVD-lg con las propiedades deseadas incluyendo, pero sin limitarse a, isotipo, funciones efectoras y tiempo de vida media en circulación , en una modalidad se seleccionan mAbs progenitores con funciones Fc-efectoras apropiadas dependiendo de la utilidad terapéutica y del punto final terapéutico deseado. Existen cinco clases principales de la cadena pesada o isotipos algunos de los cuales tienen varios subtipos y éstos determinan las funciones efectoras de una molécula de anticuerpo. Estas funciones efectoras residen en la región de gozne, dominios CH2 y CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, los residuos en otras partes de una molécula de anticuerpo pueden tener efectos sobre las funciones efectoras también . Las funciones Fc-efectoras de la región de gozne incluyen : (i) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, (ii) unión al complemento (C 1 q) , activación y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , (iii) fagocitosis/depuración de complejos antígeno-anticuerpo, y (iv) en algunos casos liberación de citocina . Estas funciones Fc-efectoras de una molécula de anticuerpo son mediadas a través de la interacción de la región Fe con un conjunto de receptores de superficie celular específicos de clase. Los anticuerpos del isotipo I g G 1 son más activos mientras que lgG2 e lgG4 tienen funciones efectoras mínimas o ninguna función efectora. Las funciones efectoras de los anticuerpos de IgG son mediadas a través de interacciones con tres tipos de receptor Fe celular estructuralmente homólogos (y subtipos) (Fcg R1 , Fcg RI l y FcgRI I I ). Estas funciones efectoras de una lgG 1 se pueden eliminar mediante mutación de residuos de aminoácido específicos en la región de gozne inferior (por ejemplo, L234A, L235A) que son requeridos para unión a Fcg R y C 1 q . Los residuos de aminoácido en la región Fe, en particular los dominios CH2-CH3, también determinan el tiempo de vida media en circulación de la molécula de anticuerpo. Esta función de Fe es mediada a través de la unión de la región Fe al receptor de Fe neonatal (FcRn), el cual es responsable del reciclado de las moléculas de anticuerpo desde los lisosomas ácidos de regreso a la circulación general.

El que un mAb deba tener un isotipo activo o uno inactivo depende del pu nto final terapéutico deseado para un anticuerpo. Algunos ejemplos de uso de isotipos y resu ltado terapéutico deseado se listan a continuación : a) si el punto final deseado es neutralización funcional de una citocina soluble entonces se puede utilizar un isotipo inactivo; b) si el resultado deseado es depuración de una proteína patológica se puede utilizar un isotipo activo; c) si el resultado deseado es depu ración de ag regados de proteína se puede utilizar un isotipo activo; d) si el resultado deseado es antagonizar un receptor de superficie se utiliza un isotipo inactivo (Tysabri , lgG4; OKT3, lgG 1 mutada) ; e) si el resultado deseado es eliminar células objetivo se utiliza un isotipo activo (Herceptin , lgG 1 (y con fu nciones efectoras incrementadas); y f) si el resultado deseado es depurar proteínas desde la circulación sin entrar al SNC se puede utilizar un isotipo de IgM (por ejemplo, depurar especies de péptido Ab en circulación) .

Las funciones efectoras de Fe de un mAb progenitor se pueden determinar utilizando diversos métodos in vitro bien conocidos en la técnica .

Como se discutió, la selección del isotipo, y de esta manera de las funciones efectoras depende del punto final terapéutico. En casos en los cuales se desea la neutralización simple de un objetivo en circulación , por ejemplo bloquear las interacciones receptor-ligando, las funciones efectoras pod rían no ser necesarias. En dichas instancias son deseables los isotipos o mutaciones en la región de Fe de un anticuerpo que elimine las funciones efectoras. En otras instancias en las cuales la eliminación de células objetivo es el punto final terapéutico, por ejemplo eliminación de células de tumor, son deseables los isotipos o mutaciones o des-fucosilación en la región de Fe que incrementen las fu nciones efectoras (Presta G L, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006; Satoh M . , l ida S . , Sh itara K. Expert Opinión Biol. Ther. 6: 1 1 61 -1 1 73, 2006) . De manera similar, dependiendo de la utilidad terapéutica, el tiempo de vida media en circulación de una molécula de anticuerpo se puede reducir/prolongar modulando las interacciones anticuerpo-FcRn mediante introducción de mutaciones específicas en la región Fe (Dall'Acqua WF, Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281:23514-23524, 2006; Petkova SB., Akilesh S., Sproule TJ. et al. Internat. Immunol. 18:1759-1769, 2006; Vaccaro C, Bawdon R., Wanjie S et al. PNAS 103:18709-18714, 2007).

La información publicada sobre los diversos residuos que influyen en las diferentes funciones efectoras de un mAb terapéutico normal podría necesitar ser confirmada para DVD-lg. Puede ser posible que en el formato de DVD-lg puedan ser importantes residuos (diferentes) de la región Fe adicionales, diferentes de aquellos identificados para la modulación de las funciones efectoras de anticuerpo monoclonal.

En general, la decisión en cuanto a cuáles funciones efectoras de Fe (isotipo) serán críticas en el formato de DVD-lg final depende de la indicación de la enfermedad, objetivo terapéutico, punto final terapéutico deseado y consideraciones de seguridad. A continuación se listan ejemplos de regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera apropiadas incluyendo, pero sin limitarse a: • lgG1 -alotipo: G1 mz • lgG1 muíante - A234, A235 • lgG2 -alotipo: G2m(n-) • Kappa - Km3 • Lambda Estudios de receptor de Fe y de C1 q La posibilidad de citotoxicidad mediada por célu la dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) indeseadas por parte del anticuerpo cuando se compleja con cualquier objetivo sobre-expresado sobre las membranas celulares puede ser abrogada mediante las mutaciones en la región de gozne (por ejemplo, L234A, L235A) . Se espera q ue estos aminoácidos sustituidos, presentes en la región de gozne de IgG 1 del mAb, den como resultado unión disminuida del mAb a los receptores de Fe de humano (pero no a FcRn) , ya que se cree que la unión a FcgR ocurre dentro de los sitios de traslape en la región de gozne de lgG 1 . Esta característica del mAb puede llevar a un perfil de seguridad mejorado con respecto a los anticuerpos que contienen una IgG de tipo silvestre. La u nión del mAb a los receptores de Fe de humano se puede determinar mediante experimentos de citometría de flujo utilizando líneas celulares (por ejemplo, THP-1 , K562) y una línea celular CHO diseñada que expresen Fcg RI I b (u otros Fcg Rs). En comparación con anticuerpos monoclonales de control de lgG 1 , el mAb muestra unión reducida a Fcg RI y Fcg RI Ia mientras q ue la unión a FcgRI I b no se ve afectada. La unión y activación de C1 q mediante complejos de antígeno/lgG ¡nmunitarios desencadena la cascada clásica del complemento con las consiguientes respuestas inflamatoria y/o inmuno-reguladora. El sitio de unión a C1q en las IgGs ha sido localizado hasta los residuos dentro de la región de gozne de la IgG. La unión a C1q a concentraciones cada vez mayores de mAb se evalúa mediante ELISA para C1q. Los resultados demuestran que el mAb no se puede unir a C1q, como era de esperar cuando se compara con la unión de una lgG1 de control de tipo silvestre. En general, la mutación de la región de gozne L234A, L235A suprime la unión del mAb a FcgRI, FcgRIIa y C1q pero no afecta la interacción del mAb con FcgRIlb. Estos datos sugieren que in vivo, el mAb con Fe mutante interactúa normalmente con el FcgRIlb inhibidor pero probablemente no pueda interactuar con los receptores FcgRI y FcgRIIa activadores o C1q.

Unión a FcRn de humano El receptor neonatal (FcRn) es responsable del transporte de IgG a través de la placenta y de controlar el tiempo de vida media catabólico de las moléculas de IgG. Sería deseable incrementar el tiempo de vida media terminal de un anticuerpo para mejorar la eficacia, para reducir la dosis o frecuencia de administración, o para mejorar la localización hacia el objetivo. De manera alternativa, podría ser conveniente hacer lo contrario, es decir, reducir el tiempo de vida media terminal de un anticuerpo para reducir la exposición corporal completa o para mejorar las proporciones de unión objetivo a no objetivo. Confeccionar a la medida la interacción entre la IgG y su receptor de salvamento, FcRn, ofrece una manera de incrementar o reducir el tiempo de vida medio terminal de la IgG. Las proteínas en la circulación, incluyendo IgG, son llevadas a la fase de fluido a través de micropinocitosis por ciertas células, tales como aquellas del endotelio vascular. La IgG se puede unir a FcRn en los endosomas bajo condiciones ligeramente ácidas (pH 6.0-6.5) y se puede reciclar hacia la superficie celular, en donde ésta es liberada bajo condiciones casi neutras (pH 7.0-7.4). El mapeo del sitio de unión a la región de Fe en FcRn80, 16, 17 muestra que dos residuos de histidina que están conservados a través de las especies, His310 y His435, son responsables de la dependencia del pH de esta interacción. Utilizando tecnología de despliegue en fago, se identifica una mutación de la región Fe de ratón que incrementa la unión a FcRn y prolonga el tiempo de vida media de la IgG de ratón (véase Víctor, G. et al.; Nature Biotechnology (1997), 15(7), 637-640). También se han identificado mutaciones de la región Fe que incrementan la afinidad de unión de la IgG de humano para FcRn a pH 6.0, pero no a pH 7.4 (véase Dall'Acqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). Asimismo, en un caso, también se observa un incremento similar dependiente del pH en la unión (de hasta 27 veces) para FcRn de rhesus, y esto da como resultado un incremento del doble en el tiempo de vida media en suero en monos rhesus en comparación con la IgG progenitora (véase Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 621 3-621 6). Estos hallazgos indican que es posible extender el tiempo de vida media en plasma de agentes terapéuticos de anticuerpo confeccionando a la medida la interacción de la región Fe con FcRn . Por el contrario, las mutaciones de la reg ión Fe q ue atenúan la interacción con FcRn pueden reducir el tiempo de vida media del anticuerpo.

B.1 0. Farmacocinética (PK) Para generar u na molécula de DVD-lg con el perfil farmacocinético deseado, en una modalidad se seleccionan mAbs progenitores con el perfil farmacocinético similarmente deseado. U na consideración es que la respuesta inmunogénica hacia anticuerpos monoclonales (es decir, respuesta de anti-anticuerpo humano de humano (HAHA por sus siglas en inglés; respuesta anti-anticuerpo quimérico de humano, HACA por sus siglas en inglés) complica adicionalmente la farmacocinética de estos agentes terapéuticos. En una modalidad , se utilizan anticuerpos monoclonales con inmunogenicidad mínima o no inmunogén icos pa ra construir moléculas de DVD-lg de manera tal que las moléculas de DVD-lg resultantes también tienen inmunogenicidad mínima o no tienen inmunogenicidad . Algunos de los factores q ue determinan la farmacocinética de un mAb incluyen , pero no se limitan a , propiedades intrínsecas del mAb (secuencia de aminoácido de VH); inmunogenicidad ; unión a FcRn y funciones de Fe.

El perfil PK de los anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados se puede determinar fácilmente en roedores ya que el perfil PK en roedores se correlaciona bien con (o predice cercanamente) el perfil PK de anticuerpos monoclonales en mono cynomolg us y humanos. El perfil PK se determina como se describe en el Ejemplo Sección 1 .2.2.3. A.

Después que se seleccionan los anticuerpos monoclonales progenitores con las características farmacocinéticas deseadas (y otras propiedades fu ncionales deseadas como se discute en la presente solicitud), se construye la DVD-lg . Debido a que las moléculas de DVD-lg contienen dos dominios de unión a antígeno provenientes de dos anticuerpos monoclonales progenitores, también se eval úan las propiedades farmacocinéticas de la DVD-lg . Por lo tanto, mientras se determinan las propiedades farmacocinéticas de la DVD-lg , se pueden utilizar pruebas farmacocinéticas que determinen el perfil PK tomando como base la funcionalidad de ambos dominios de unión a antígeno obtenidos a partir de los 2 anticuerpos monoclonales progenitores. El perfil PK de una DVD-lg se puede determinar como se describe en el ejemplo 1 .2.2.3. A. Los factores adicionales que pueden afectar el perfil farmacocinético de la DVD-lg incluyen la orientación del dominio de unión a antígeno (C DR) ; tamaño del enlazador; e interacciones Fc/FcRn . Las características farmacocinéticas de los anticuerpos progen itores se pueden evaluar mediante evaluación de los siguientes parámetros: absorción , distribución , metabolismo y excreción .

Absorción Hasta la fecha, la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos es a través de vías de administración parenterales (por ejemplo, intravenosa [IV] , subcutánea [SC], o intramuscular [I M]) . La absorción de un mAb en la circulación sistémica después de administración ya sea subcutánea o intramuscular desde el espacio intersticial es principalmente a través de la ruta linfática. La degradación proteolítica, pre-sistémica, saturable puede dar como resultado biod isponibilidad absoluta variable después de la administración extravascular. Normalmente, se pueden observar incrementos en biodisponibilidad absoluta con dosis crecientes de anticuerpos monoclonales debido a la capacidad proteol ítica saturada a dosis más altas. El proceso de absorción para un mAb es normalmente muy lento ya que el fluido linfático d rena lentamente al interior del sistema vascular, y la duración de absorción puede tardar desde horas hasta varios días. La biodisponibilidad absoluta de los anticuerpos monoclonales después de la administración subcutánea generalmente varía desde 50% hasta 100% .

Distribución Después de la administración por vía intravenosa, los anticuerpos monoclonales normalmente siguen un perfil de concentración-tiempo en suero (o plasma) bifásico, comenzando con una fase de distribución rápida , seguido por una fase de eliminación lenta . En general, un modelo farmacocinético biexponencial describe de mejor manera este tipo de perfil farmacocinético. El volumen de distribución en el compartimiento central (Ve) para un mAb por lo general es igual a o ligeramente mayor que el volumen del plasma (2-3 litros) . U n patrón bifásico distinto en el perfil de concentración contra tiempo en suero (plasma) pod ría no ser evidente con otras vías de administración parenterales, tales como I M o SC, debido a que la fase de distribución de la curva de concentración-tiempo en suero (plasma) es enmascarada por la porción de absorción larga. M uchos factores, incluyendo las propiedades fisicoquímicas, absorción mediada por receptor específica de sitio y orientada a objetivo, capacidad de unión del tejido, y dosis de mAb pueden influir en la biodistribución de un mAb. Alg unos de estos factores pueden contribu ir a la no linealidad en la biodistribución para un mAb.

Metabolismo y excreción Debido al tamaño molecular, los anticuerpos monoclonales intactos no son excretados en la orina a través del riñon . Estos son inactivados principalmente por el metabolismo (por ejemplo, catabolismo) . Para anticuerpos monoclonales terapéuticos basados en IgG , los tiempos de vida media típicamente varían desde horas o 1 -2 d ías hasta más de 20 d ías. La eliminación de un mAb puede ser afectada por muchos factores, incluyendo, pero sin limitarse a , afinidad por el receptor de FcRn , inmunogenicidad del mAb, el g rado de glucosilación del mAb, la susceptibilidad del mAb a la proteólisis, y eliminación mediada por receptor.

B.1 1 . Patrón de reactividad cruzada en tejido en especies humanas y especies para toxicología (especie Tox) Patrones de tinción idénticos sugieren que la toxicidad potencial en humanos se puede evaluar en especies Tox. Las especies Tox son aquellos animales en los cuales se estudia la toxicidad no relacionada .

Los anticuerpos individuales se seleccionan para satisfacer dos criterios. (1 ) Tinción de tejido apropiada para la expresión conocida del objetivo del anticuerpo. (2) Patrón de tinción similar entre tejidos de especie h umana y especie Tox provenientes del mismo órgano.

Criterio 1 : Las inmunizaciones y/o selecciones de anticuerpo típicamente emplean antígenos recombinantes o sintetizados (proteínas, carbohidratos u otras moléculas) . La unión a la contraparte natural y el contra-tamizaje contra antígenos no relacionados con frecuencia son parte del embudo de tamizaje para anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, el tamizaje contra una multitud de antígenos con frecuencia es impráctico. Por lo tanto , los estudios de reactividad cruzada en tejido con tejidos humanos de todos los órganos principales sirven para excluir la unión no deseada del anticuerpo a cualesquiera antígenos no relacionados.

Criterio 2 : Los estudios de reactividad cruzada en tejido comparativos con tejidos de especie humana y especie Tox (mono cynomolgus, perro, posiblemente roedores y otros, se analizan los mismos 36 o 37 tejidos como en el estudio en humanos) ayudan a validar la selección de una especie Tox. En los estudios típicos de reactividad cruzada en tejido en secciones de tejidos congelados los anticuerpos terapéuticos pueden demostrar la unión esperada al antígeno conocido y/o en un grado menor la unión a tejidos tomando como base ya sean interacciones de bajo nivel (u nión no específica, bajo nivel de unión a antígenos similares, interacciones basadas en carga de bajo nivel , etc.)- En cualquier caso la especie an imal más relevante para toxicología es aquella con el grado más alto de coincidencia de unión a tejido humano y animal .

Los estudios de reactividad cruzada en tejido siguen los lineamientos regulatorios apropiados incluyendo el Lineamiento 111/5271 /94 de CPMP de EC "Production and quality control of mAbs" y el Lineamiento US FDA/CBER de 1 997 "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use" . Se fijan criosecciones (5 pm) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia y se secan sobre vidrio de objeto. Se efectúa la tinción de secciones de tejido con peroxidasa, utilizando el sistema avidina-biotina . Lineamiento de la FDA "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use". Las referencias relevantes incluyen Clarke J 2004, Boon L. 2002a , Boon L 2002b, Ryan A 1 999.

Los estudios de reactividad cruzada tisular con frecuencia se efectúan en dos etapas, en el que la primera etapa incluye criosecciones de 32 tejidos (típicamente: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga urinaria, corazón , músculo esquelético, células sangu íneas, riñon , piel, médula ósea , hígado, médula espinal, tejido mamario, pulmón, bazo, cerebelo , nodo linfático, testículos, corteza cerebral , ovario, timo, colon , páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uretra , ojo, pituitaria , útero, trompas de Falopio y placenta) provenientes de u n donador humano. En la segunda fase se efectúa un estudio de reactividad cruzada completa hasta con 38 tejidos (incluyendo adrenales, sang re, vaso sang uíneo, médula ósea , cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón , riñon , intestino g rueso, h ígado, pulmón , nodo linfático, glánd ula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata , glándula salival, piel , intestino delgado, médu la espinal , bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala , uretra , vejiga urinaria , y útero) de 3 adultos no relacionados. Los estudios se hacen típicamente como mínimo a dos niveles de dosis.

El anticuerpo terapéutico (es decir artículo de prueba) y el anticuerpo de control igualado al isotipo pueden estar modificados con biotina para detección del complejo avid ina-biotina (ABC); otros métodos de detección pueden incluir detección de anticuerpo terciario para un artículo de prueba marcado con FITC (u otro), o formación previa de complejo con un anti-lgG de humano marcado para un artículo de prueba no marcado.

Brevemente, se fijan criosecciones (aproximadamente 5 µ?t?) de tejidos humanos obtenidos en la autopsia o biopsia y se secan sobre vidrio de objeto. Se efectúa la tinción de secciones de tejido con peroxidasa, utilizando el sistema de avidina-biotina. Primero (en caso de un sistema detección con formación previa de complejo), el artículo de prueba se incuba con el anti-lgG de humano modificado con biotina secundario y se desarrolla como complejo inmune. El complejo inmune, a las concentraciones finales de 2 y 10 pg/ml del artículo de prueba, se agrega sobre las secciones tisulares en el vidrio de objeto y después las secciones tisulares se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción de tejidos. Se utilizan glóbulos de antígeno-sefarosa como secciones tisulares de control positivo.

Cualquier tinción específica se juzga ya sea como una reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión de antígeno) o como una reactividad inesperada tomando como base la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada como específica se califica respecto a intensidad y frecuencia. Los estudios de competencia o bloqueo de antígeno o suero también pueden ayudar a determinar si la tinción observada es específica o no específica.

Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionados satisfacen los criterios de selección - tinción tisú lar apropiada, coincidencia de tinción entre tejidos específicos de humano y animal para toxicolog ía - éstos se pueden seleccionar para generar la DVD-lg .

El estudio de reactividad cruzada tisu lar tiene que repetirse con la construcción de DVD-lg final, pero aunque estos estudios siguen el mismo protocolo como se indica en la presente solicitud , éstos son más complejos de evaluar debido a que cualquier unión puede provenir de cualquiera de los dos anticuerpos progenitores, y cualquier unión inexplicada necesita ser confirmada con estudios complejos de competición de antígeno.

Es fácilmente evidente que la compleja tarea de estudios de reactividad cruzada tisular con una molécu la multiespecífica tal como una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a ( 1 ) falta de hallazgos de reactividad cruzada tisular inesperados y (2) respecto a similitud apropiada de los hallazgos de reactividad cruzada tisular entre los tejidos de especie humana y especie animal para toxicolog ía correspondientes.

B.1 2 Especificidad v selectividad Para generar una molécula de DVD-lg con especificidad y selectividad deseada, se necesita generar y seleccionar mAbs progenitores con perfiles de especificidad y selectividad similarmente deseados.

Los estudios de u nión para especificidad y selectividad con una DVD-lg pueden ser complejos debido a los cuatro o más sitios de unión , dos de cada uno por cada antígeno. Brevemente, los estudios de unión utilizando ELI SA, BIAcore , Kin ExA u otros estudios de interacción con una DVD-lg necesitan mon itorear la un ión de u no, dos o más antígenos a la molécula de DVD-lg . Mientras que la tecnolog ía BIAcore puede resolver la u nión secuencial, independiente de antígenos múltiples, los métodos más tradicionales incluyendo ELISA o las técnicas más modernas como KinExA no pueden . Por lo tanto, la caracterización cuidadosa de cada anticuerpo progenitor es crítica . Después de que cada anticuerpo individual ha sido caracterizado respecto a especificidad , la confirmación de retención de especificidad de los sitios de u nión individuales en la molécula de DVD-lg se simplifica en gran medida .

Es fácilmente evidente q ue la compleja tarea de determinar la especificidad de una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a especificidad antes de q ue se combinen como u na DVD-lg .

Los estudios de interacción antígeno-anticuerpo pueden tomar muchas formas, incluyendo muchos estudios de interacción proteína-proteína clásicos, incluyendo ELISA (prueba con inmunosorbente ligado a enzima) , espectrometría de masas, entrelazamiento q u ímico, SEC con dispersión de luz, diálisis en equilibrio, permeación de gel, ultrafiltración, cromatog rafía en gel, SEC analítico de zona grande, ultracentrifugación micropreparativa (eq uilibrio de sedimentación), métodos espectroscópicos, microcalorimetría con titulación , equilibrio de sedimentación (en ultracentrífuga analítica), velocidad de sedimentación (en centrífuga analítica), resonancia de plasmón de superficie (incluyendo BIAcore). Las referencias relevantes incluyen "Current Protocols in Protein Science", John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W. Speicher, Paul T, Wingfield (eds.) Volumen 3, capítulos 19 y 20, publicado por John Wiley & Sons Inc., y las referencias incluidas en el mismo y "Current Protocols in Immunology", John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (eds.) publicado por John Wiley & Sons Inc y las referencias relevantes incluidas en el mismo.

Liberación de citocina en sangre entera La interacción del mAb con células sanguíneas humanas se puede investigar utilizando una prueba de liberación de citocina (Wing, M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190; "Current Protocols in Pharmacology ", S.J. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser, (eds.) publicado por John Wiley & Sons Inc; Madhusudan, S. Clinical Cáncer Research (2004), 10(19), 6528-6534; Cox, J. ethods (2006), 38(4), 274-282; Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1), 94-106). Brevemente, se incuban varias concentraciones de mAb con sangre entera de humano durante 24 horas. La concentración analizada debe cubrir un amplio intervalo que incluya concentraciones finales que imiten los niveles sanguíneos típicos en pacientes (incluyendo pero sin limitarse a 100 ng/ml - 100 g/ml). Después de la incubación, los sobrenadantes y los Usados celulares se analizan respecto a la presencia de IL-1Ra, TNF-a, I L- 1 b , IL-6 e IL-8. Los perfiles de concentración de citocina generados para el mAb se comparan con los perfiles producidos por un control negativo de IgG de humano y un control de LPS o PHA positivo. El perfil de citocina presentado por el mAb proveniente tanto de los sobrenadantes celulares como de los Usados celulares es comparable con IgG de humano de control. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal no interactúa con células sanguíneas humanas para liberar espontáneamente citocinas inflamatorias.

Los estudios de liberación de citocina para una DVD-lg son complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada uno por cada antígeno. Brevemente, los estudios de liberación de citocina como se describen en la presente solicitud, miden el efecto de la molécula de DVD-lg completa sobre sangre entera u otros sistemas celulares, pero puede resolver cuál porción de la molécula ocasiona la liberación de citocina. Una vez que se detecta la liberación de citocina, se tiene que determinar la pureza de la preparación de DVD-lg, debido a que algunos componentes celulares que se co-purifican pueden ocasionar por sí mismos la liberación de citocina. Si la pureza no es el tema, podría ser necesario utilizar fragmentación de DVD-lg (incluyendo pero sin limitarse a remoción de la porción Fe, separación de los sitios de unión, etc.), mutagénesis de sitio de unión u otros métodos para someter a desconvolución cualesquiera observaciones. Es fácilmente evidente que esta tarea compleja se simplifica en g ran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan respecto a falta de liberación de citocina antes de que se combinen como una DVD-lg.

B.1 3. Reactividad cruzada con otras especies para estudios toxicológicos En una modalidad , los anticuerpos individuales se seleccionan con suficiente reactividad cruzada hacia la especie tox apropiada, por ejemplo, mono cynomolg us. Los anticuerpos progenitores necesitan unirse al objetivo de especie ortóloga (es decir, mono cynomolgus) y provocar la respuesta apropiada (modulación , neutralización , activación) . En u na modalidad , la reactividad cruzada (afinidad/potencia) hacia el objetivo de especie ortóloga debe estar dentro de 10 veces la del objetivo humano. En la práctica , los anticuerpos progenitores se evalúan para especies múltiples, incluyendo ratón , rata, pero, mono (y otros primates no humanos), así como para especies de modelo de enfermedad (es decir ovejas para modelo de asma) . La reactividad cruzada aceptable hacia la especie tox de los anticuerpos monoclonales progenitores permite estudios toxicológicos futuros de la DVD-lg-lg en la misma especie. Por esta razón , los dos anticuerpos monoclonales progenitores deben tener reactividad cruzada aceptable para una especie tox común permitiendo por lo tanto estudios de toxicolog ía de DVD-lg en la misma especie.

Los mAbs progen itores se pueden seleccionar a partir de varios mAbs que puedan ligar objetivos específicos y que sean bien conocidos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a anticuerpo anti-TNF (patente E.U.A. No. 6,258,562), anticuerpo anti-IL-12 y/o anti-IL-12p40 (patente E.U.A. No. 6,914,128); anticuerpo anti-IL-18 (US 2005/0147610 A1), anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp120, anti-VLA-4, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (por ejemplo, véase el documento WO2007124299) anti-ld, anti-ICAM-1 , anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL-4, anti-NPR1, anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-selectina, anti-Fact VII, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD 1/18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti-SOST, anti CD-19, anti-CD80 (por ejemplo, véase el documento WO2003039486, anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti-alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (por ejemplo, véase patente E.U.A. No. 5,789,554), anti-CD20, anti-MIF, ant¡-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, anti-gpllbllla, anti-lgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGF1,2, anti IGFR, anti-VNRintegrina, anti-IL-1 alfa, anti-IL-1 beta, anti-receptor de IL-1, anti-receptor de IL-2, anti-IL-4, anti-receptor de IL-4, anti-IL5, anti-receptor de IL-5, anti-IL-6, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-receptor de IL-13, anti-IL-17, y anti-IL-23 (véase Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 y http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).

Los mAbs progenitores también se puede seleccionar a partir de varios anticuerpos terapéuticos aprobados para uso, en pruebas clínicas, o en desarrollo para uso clínico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (véase por ejemplo patente E.U.A. No. 5,736,137), un anticuerpo quimérico anti-CD20 aprobado para tratar linfoma de tipo No Hodgkin; HuMax-CD20, un anti-CD20 que actualmente está siendo desarrollado por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la patente E.U.A. No. 5,500,362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulada "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof), trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (véase por ejemplo patente E.U.A. No. 5,677,171), un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg®), actualmente bajo desarrollo por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la patente E.U.A. No. 4,753,894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (patente E.U.A. No. 4,943,533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo quimérico anti-EGFR en pruebas clínicas para una variedad de cánceres; ABX-EGF (patente E.U.A. No. 6,235,883), actualmente está siendo desarrollado por Abgenix-lmmunex-Amgen; HuMax-EGFr (E.U.A. No. de Serie 10/172,317), actualmente está siendo desarrollado por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (patente E.U.A. No. 5,558,864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Instituto para Investigación del Cáncer) (PCT WO 95/20045; odjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46¡ Modjtahedi et al., 1993, Br J Cáncer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cáncer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cáncer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá y Centro de Inmunología Molecular, Cuba (patente E.U.A. No. 5,891,996; patente E.U.A. No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Nati Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, Instituto Nacional del Cáncer) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un mAb humanizado actualmente aprobado para tratamiento de leucemia linfocítica crónica de célula B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), una fusión de Fe anti-LFA-3 desarrollada por Biogen), abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148), un anticuerpo de TNF completamente humano desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión de Fe de receptor de TNF p75 desarrollada por Immunex/Amgen, lenercept, una fusión de Fe de receptor p55TNF previamente desarrollada por Roche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-l L8 que está siendo desarrollado por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti- UC18 que está siendo desarrollado por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1 ), un anti- UC1 bajo desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 que está siendo desarrollado por Antisoma, AngioMab (AS1405), que está siendo desarrollado por Antisoma, HuBC-1, que está siendo desarrollado por Antisoma, Tioplatin (AS1407) que está siendo desarrollado por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y anticuerpo alfa-4-beta-7 que está siendo desarrollado por Biogen, mAb VLA-1, un anticuerpo anti-VLA-1 integrina que está siendo desarrollado por Biogen, mAb LTBR, un anticuerpo anti-receptor beta de linfotoxina (LTBR) que está siendo desarrollado por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF- 2 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo anti-IL-12 p40 que está siendo desarrollado por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGFpi que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Genzyme, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxin1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-R1 que está siendo desarrollado por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF que está siendo desarrollado por Genentech, un anticuerpo anti-familia del receptor HER que está siendo desarrollado por Genentech, Factor Anti-Tejido (ATF), un anticuerpo anti-Factor Tisular que está siendo desarrollado por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-lgE que está siendo desarrollado por Genentech, Raptiva® (Efalizumab), un anticuerpo anti-CD11a que está siendo desarrollado por Genentech y Xoma, Anticuerpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), que está siendo desarrollado por Genentech y Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-Inflam, que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex, HuMax-Cancer, un anticuerpo anti-Heparanasa I que está siendo desarrollado por Genmab y Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, que está siendo desarrollado por Genmab y Amgen, HuMax-TAC, que está siendo desarrollado por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anti-CD23 que está siendo desarrollado por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos anti-factor de migración de macrófagos (MIF) que están siendo desarrollados por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotípico que está siendo desarrollado por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR que está siendo desarrollado por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 que está siendo desarrollado por Imclone, anticuerpos anti-cadherina de VE que están siendo desarrollados por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) que está siendo desarrollado por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 que está siendo desarrollado por Immunomedics, AFP-Cide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MyelomaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, LkoCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, ProstaCide, que está siendo desarrollado por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-070 que está siendo desarrollado por Medarex, MDX-018 que está siendo desarrollado por Medarex, Osidem® (IDM-1), y anticuerpo anti-Her2 que está siendo desarrollado por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 que está siendo desarrollado por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFa que está siendo desarrollado por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina que está siendo desarrollado por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) (CD54) que están siendo desarrollados por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFR-3) que está siendo desarrollado por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo anti-interferón gamma que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-integrina a 5ß1, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, anti-IL-12, que está siendo desarrollado por Protein Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM que está siendo desarrollado por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo anti-lgE humanizado desarrollado por Genentech y Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti-integrina Beta2 que está siendo desarrollado por Xoma todas las referencias citadas en la presente solicitud en este párrafo están expresamente incorporadas en la presente solicitud para referencia. En otra modalidad, los terapéuticos incluyen KRN330 (Kirin); anticuerpo huA33 (A33, Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer); CNTO 95 (alfa V integrinas, Centocor); MEDI-522 (integrina alfa \/ß3, Medimmune); volociximab (integrina alfa Vp1, Biogen/PDL); mAb humano 216 (epítope glucosilado de célula B, NCI); BiTE MT 103 (CD 19 x CD3 biespecífico, Medimmune); 4G7xH22 (célulaBxFcgammaRI biespecífico, Medarex/Merck KGa); rM28 (CD28 x MAPG biespecífico, patente E.U.A. No. EP 1444268); MDX447 (EMD 82633) (CD64 x EGFR biespecífico, Medarex); Catumaxomab (removab) (EpCAM x anti-CD3 biespecífico, Trion/Fres); Ertumaxomab (HER2/CD3 biespecífico, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (anhidrasa carbónica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglin), Tracon); BMS-663513 (agonista de CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor fe CD3, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD 122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hl_L1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágena cortada, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 agonista de TRAIL-R1, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS- ETR2 (lexatumumab) (DR5 agonista de TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIll, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor a de folato, Morphotech); KW-2871 (gangliósido GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 ( DX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (cadena beta de HLA-DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (receptor de célula asesina tipo Ig (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Instituto Ludwig para Investigación del Cáncer); hCBE-11 (LT R, Biogen); HuHMFGI (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (epítope de carbohidrato N-ligado, Raven); CAL (proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTH-rP), Universidad de California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ591 (PSMA, Fundación Cornell para la Investigación); muJ591 (PSMA, Fundación Cornell para la Investigación); GC1008 (inhibidor (lgG4) de TGFb (pan), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (receptor de transferrina, Instituto Salk, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (receptor de transferrina, Instituto Salk); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab - WO/2000/034337, Universidad de Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).

B. Construcción de moléculas de DVD La molécula de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-lg) está diseñada de tal manera que dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes provenientes de los dos anticuerpos monoclonales progenitores diferentes se ligan en tándem directamente o a través de un enlazador corto mediante técnicas de ADN recombinante, seguidos por el dominio constante de la cadena ligera. De manera similar, la cadena pesada comprende dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes ligados en tándem, seguidos por el dominio constante CH1 y la región Fe (figura 1A).

Los dominios variables se pueden obtener utilizando técnicas de ADN recombinante a partir de un anticuerpo progenitor generado mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente solicitud. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de la cadena pesada o ligera de múrido. En otra modalidad, el dominio variable es un dominio de la cadena pesada o ligera variable humanizado o injertado con CDR. En una modalidad, el dominio variable es un dominio variable de la cadena pesada o ligera de humano.

En una modalidad, el primero y segundo dominios variables se ligan directamente uno al otro utilizando técnicas de ADN recombinante. En otra modalidad, los dominios variables se ligan a través de una secuencia enlazadora. En una modalidad, se ligan dos dominios variables. También se pueden ligar tres o más dominios variables directamente o a través de una secuencia enlazadora. Los dominios variables pueden ligar al mismo antígeno o pueden ligar antígenos diferentes. Las moléculas de DVD de la invención pueden incluir un dominio variable de inmunoglobulina y un dominio variable no proveniente de inmunoglobulina tal como el dominio de unión a ligando de un receptor, dominio activo de una enzima. Las moléculas de DVD también pueden comprender 2 o más dominios de tipo no Ig.

La secuencia enlazadora puede ser un aminoácido individual o una secuencia de polipéptido. En una modalidad, las secuencias enlazadoras se seleccionan a partir del grupo que consiste de AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (SEQ ID NO: 6); RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7); RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8); RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9), S AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10); ADAAP (SEQ ID NO: 11); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12); TVAAP (SEQ ID NO: 13); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14); QPKAAP (SEQ ID NO: 15); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16); AKTTPP (SEQ ID NO: 17); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18); AKTTAP (SEQ ID NO: 19); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20); ASTKGP (SEQ ID NO: 21); ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26); GGGGGGGP (SEQ ID NO: 27); GGGGGGGGP (SEQ ID NO: 28); PAPNLLGGP (SEQ ID NO: 29); PNLLGGP (SEQ ID NO: 30); GGGGGGP (SEQ ID NO: 31); PAPELLGGP (SEQ ID NO: 32); PTIS PAP LLGGP (SEQ ID NO: 33); TVAADDDDKSVFIVPP (SEQ ID NO: 34); TVDDDDKAAP (SEQ ID NO: 35); LVPRGSAAP (SEQ ID NO: 36); ASDDDDK GGP (SEQ ID NO: 37); ALVPR GSGP (SEQ ID NO: 38); ASTDDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 39); TVALVPR GSVFIFPP (SEQ ID NO: 40); ASTLVPR GSVFPLAP (SEQ ID NO: 41); TVAADDDK SVFIVPP (SEQ ID NO: 42); ASTDDDK SVFPLAP (SEQ ID NO: 43); LEVLFQ GP (SEQ ID NO: 44); TVAALEVLFQ GPAP (SEQ ID NO: 45); ASTLEVLFQ GPLAP (SEQ ID NO: 46); PAPLEVLFQ GP (SEQ ID NO: 47); TAENLYFQ GAP (SEQ ID NO: 48); AENLYFQ GA (SEQ ID NO: 49); PGPFGR SAGGP (SEQ ID NO: 50); PGPFGR SAGG (SEQ ID NO: 51); PQRGR SAG (SEQ ID NO: 52); PHYGR SGG (SEQ ID NO: 53); GPFGR SAGP (SEQ ID NO: 54); GDDDDK GGP (SEQ ID NO: 55); AGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 56); GGDDDDK GGP (SEQ ID NO: 57); AS; TVA; ASTK (SEQ ID NO: 58); ASTKGPSV (SEQ ID NO: 59); ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 60); TVAAPSV (SEQ ID NO: 61), y TVAAPSVFI (SEQ ID NO: 62). La elección de secuencias enlazadoras se basa en el análisis de estructura de cristal de varias moléculas de Fab. Existe un enlazamiento flexible natural entre el dominio variable y el dominio constante CH1/CL en la estructura molecular de Fab o del anticuerpo. Este enlazamiento natural comprende aproximadamente 10-12 residuos de aminoácido, de los cuales 4-6 residuos son contribuidos por el extremo C-terminal del dominio V y 4-6 residuos provienen del extremo N-terminal del dominio CL/CH1. Las DVD-lgs de la invención se generan utilizando 5-6 residuos de aminoácido N-terminales, u 11-12 residuos de aminoácido, de CL o CH1 como enlazador en la cadena ligera y la cadena pesada de la DVD-lg, respectivamente. Los residuos N-terminales de los dominios CL o CH1, particularmente los primeros 5-6 residuos de aminoácido, adoptan una conformación de asa sin estructuras secundarias fuertes, por lo tanto pueden actuar como enlazadores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N-terminales de CL o CH1 son extensión natural de los dominios variables, como éstos son parte de las secuencias de Ig, reducen, por lo tanto, al mínimo en grado elevado cualquier inmunogenicidad que potencialmente surja de los enlazadores y las uniones.

Otras secuencias enlazadoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1 pero no todos los residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo los primeros 5-12 residuos de aminoácido de los dominios CL/CH1; los enlazadores de la cadena ligera pueden provenir de C O CX; y los enlazadores de la cadena pesada se pueden obtener a partir de CH1 de cualesquiera isotipos, incluyendo Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C8, Ce, y Cp. Las secuencias enlazadoras también se pueden obtener a partir de otras proteínas tales como proteínas tipo Ig , (por ejemplo, TCR, FcR, KI R); secuencias basadas en G/S (por ejemplo las repeticiones de G4S; SEQ I D NO: 63); secuencias derivadas de la región de gozne; y otras secuencias naturales provenientes de otras proteínas.

En una modalidad un dominio constante se liga a los dos dominios variables ligados utilizando técnicas de ADN recombinante. En una modalidad , la secuencia que comprende los dominios variables de la cadena pesada ligados se liga a un dominio constante de la cadena pesada y la secuencia que comprende los dominios variables de la cadena ligera ligados se liga a un dominio constante de la cadena ligera . En una modalidad, los dominios constantes son el dominio constante de la cadena pesada de humano y el dominio constante de la cadena ligera de humano respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada de DVD se liga también a una región Fe; la región Fe puede ser una región Fe de secuencia original, o una región Fe de variante. En otra modalidad , la región Fe es una región Fe de humano. En otra modalidad , la reg ión Fe incluye la región Fe de lgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, IgA, Ig M , IgE , o IgD.

En otra modalidad dos polipéptidos de DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de la cadena ligera se combinan para formar u na molécula de DVD-lg . La tabla 4 lista las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de anticuerpos de ejemplo para objetivos útiles para tratar enfermedad , por ejemplo , para tratar cáncer. En una modalidad , la invención provee un DVD que comprende por lo menos dos de las regiones de VH y/o VL listadas en la tabla 4, en cualquier orientación .

TABLA 4 Lista de secuencias de am i noácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos para generar DVD-lgs SEQ ID Unico Región de Secuencia ID NO. de ABT la proteína 1234567890123456789012345678901234567890 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQA VH VEGF PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAY 64 AB014VH (sec. 1) LQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVT VSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKP VL VEGF 65 AB014VL GKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP (sec. 1) EDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSEPISWVRQA VH NRP1 66 AB016VH PGKGLEWVSSITGKNGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAY (sec. 1) LQMNSLRAEDTAVYYCARWG KVYGMDVWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKP VL NRP1 67 AB016VL GKAPKLLIYGASSRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP (sec. 1) EDFATYYCQQYMSVPITFGQGTKVEIKR EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA VH TNF PGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNA NSLY 68 AB017VH (sec. 1) LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS S DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQ P VL TNF 69 AB017VL GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP (sec. 1) EDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR EVQLQQSGPELM PGASVKMSCKASGYTFTDYNMH MKQN QGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATLTVDKSSSTAY 70 AB050VH VH SOST MELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNYEDWYFDVWGAGTTVT VSS TABLA 4 (cont.) SEQ ID Unico Región de la Secuencia ID NO. de ABT proteina 1234567890123456789012345678901234567890 DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP 71 ABO50VL VL SOST DGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTNYSLTITNLEQ DDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLEIKR EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA VH TNF PGKGLE VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY 72 AB229VH (D2E7) LQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSLDYWGQGTLVTVS (sec. 2) S VL TNF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CRASQGIRNYLAWYQQKP 73 AB229VL (D2E7) GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP (sec. 2) EDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEI R EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA VH TNF PGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNA NSLY 74 AB230VH (D2E7.1) LQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSLDYWGQGTLVTVS (sec. 3) S VL TNF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQ P 75 AB230VL (D2E7.1) GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP (sec. 3) EDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIR VH IL-13 QPPGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQV 76 AB231VH (13C5.5) VLKLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVT (sec. 1) VSS VL IL-13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKP 77 AB231VL (13C5.5) GKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP (sec. 1) EDIATYYCQQGNTLPLTFGGGTKVEIKR EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIR VH IL-13 QPPGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQV 78 AB232VH (13C5.5L3F) VLKLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVT (sec. 2) VSS VL IL-13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKP 79 AB232VL (13C5.5L3F) GKAPKLLI FYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP (sec. 2) EDIATYYCQQGNTLPLTFGGGTKVEIKR La descripción detallada de moléculas de DVD-lg específicas que pueden ligar objetivos específicos, y los métodos para elaborarlas , se proveen en la sección de Ejemplos más adelante.

C. Producción de proteínas de DVD Las proteínas de unión de la presente invención se pueden producir mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, expresión a parti r de células hospederas , en la cual el vector o vectores de expresión que codifica(n) para las cadenas pesada de DVD y ligera de DVD se transfecta(n) en una célula hospedera mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de AD N exógeno en u na célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporacion , precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Au nque es posible expresar las proteínas de DVD de la invención en células hospederas ya sea procariotas o eucariotas, las proteínas de DVD son expresadas en células eucariotas, por ejemplo, células hospederas de mam ífero , debido a que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamífero) tienen mayor probabilidad q ue las células procariotas de ensamblar y secretar u na proteína de DVD plegada adecuadamente e inmunológicamente activa.

Las células hospederas de mamífero de ejemplo para expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr", descritas en U rlaub y Chasin, (1 980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77.:421 6-4220, utilizadas con un marcador seleccionable para DH FR, por ejemplo, como se describe en R.J . Kaufman y P.A. Sharp ( 1 982) Mol. Biol. 1 59:601 -621 ) . células de mieloma NSO, células COS, células SP2 y células PER.C6. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican para las proteínas de DVD se introducen en células hospederas de mamífero, las proteínas de DVD se producen cultivando las células hospederas du rante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión de las proteínas de DVD en las células hospederas o la secreción de las proteínas de DVD hacia el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospederas. Las proteínas de DVD se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteína .

En un sistema de ejemplo para la expresión recombinante de proteínas de DVD de la invención , un vector de expresión recombinante q ue codifica tanto para la cadena pesada de DVD como para la cadena ligera de DVD se introduce en células CHO dhfr" mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes para las cadenas pesada y ligera de DVD están cada uno ligados en forma operativa a elementos reguladores de incrementador de CMV/promotor de Ad M LP para controlar niveles elevados de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DH FR, el cual permite la selección de células C HO que han sido transfectadas con el vector utilizando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospederas transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de DVD y la proteína de DVD intacta se recupera del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biolog ía molecular estándar para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospederas, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar la proteína de DVD a partir del medio de cultivo. I ncluso la invención también provee un método para sintetizar u na proteína de DVD de la invención cultivando una célula hospedera de la invención en un medio de cu ltivo apropiado hasta que se sintetice u na proteína de DVD de la invención . El método también puede comprender aislar la proteína de DVD a partir del medio de cultivo.

Una característica importante de la DVD-lg es que ésta se puede producir y pu rificar en una manera similar a la de un anticuerpo convencional. La prod ucción de DVD-lg da como resultado un producto principal individ ual, homogéneo con la actividad dual-específica deseada , sin ning una modificación de secuencia de la región constante o modificaciones qu ímicas de ningún tipo. Otros métodos previamente descritos para generar proteínas de unión de longitud completa "biespecíficas", "multiespecíficas", y "multi-específicas multivalentes" no conducen a un prod ucto primario individual sino en cambio conducen a la producción intracelular o secretada de una mezcla de proteínas de un ión de longitud completa, mono-específicas, multiespecíficas, multivalentes, inactivas, ensambladas, y a proteínas de unión de longitud completa multivalentes con combinación de sitios de unión diferentes. Como un ejemplo, tomando como base el diseño descrito por M iller y Presta (publicación del PCT WO2001 /077342(A1 ), existen 1 6 posibles combinaciones de las cadenas pesada y ligera. Por consiguiente, solamente 6.25% de la proteína probablemente esté en la forma activa deseada , y no como un producto principal individ ual o producto primario individual en comparación con las otras 1 5 posibles combinaciones. La separación de las formas completamente activas, deseadas de la proteína a partir de las formas inactivas y parcialmente activas de la proteína utilizando técnicas de cromatografía estándar, típicamente utilizadas en la fabricación a gran escala , todavía está por demostrar.

De manera sorpresiva, el diseño de las "proteínas de unión de longitud completa multivalentes dual-específicas" de la presente invención conduce a una cadena ligera de dominio variable dual y a una cadena pesada de dominio variable dual q ue se ensamblan principalmente hasta las "proteínas de u nión de longitud completa m ultivalentes dual-específica".

Por lo menos 50% , por lo menos 75% y por lo menos 90% de las moléculas de inmunoglobulina de dominio variable dual ensambladas, y expresadas son la proteína tetravalente dual-específica deseada. Este aspecto de la invención en particular incrementa la utilidad comercial de la invención . Por lo tanto, la presente invención incluye un método para expresar una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que cond uce a un producto primario individual de una "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica".

La presente invención provee métodos para expresar u na cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable d ual en una célula individual q ue conducen a u n "prod ucto primario" de u na "proteína de unión de longitud completa tetravalente dual-específica" , en los cuales el "prod ucto primario" es más del 50% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable d ual y una cadena pesada de dominio variable d ual.

La presente invención provee métodos para expresar u na cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable d ual en una célula individual que conducen a un "prod ucto primario" individual de una "proteína de u nión de longitud completa tetravalente dual-específica", en los cuales el "producto primario" es más de 75% de toda la proteína ensamblada , que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual .

La presente invención provee métodos para expresar u na cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual en una célula individual que conducen a un "producto primario" individual de una "proteína de u nión de longitud completa tetravalente dual-específica", en los cuales el "producto primario" es más de 90% de toda la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera de dominio variable dual y una cadena pesada de dominio variable dual.

II. Proteínas de unión de DVD convertidas en derivados Una modalidad provee una proteína de unión marcada en la cual la proteína de unión de la invención se convierte en derivado o se liga a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención se puede convertir en derivado ligando funcionalmente una proteína de unión de la invención (mediante copulación química, fusión genética, asociación no covalente u otro) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación de la proteína de unión con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una marca de polihistidina).

Los agentes detectables útiles con los cuales se puede convertir en derivado una proteína de unión de la invención incluyen compuestos fluorescentes. Los ejemplos de agentes detectables fluorescentes incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamin-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Una proteína de unión también se puede convertir en derivado con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa y similares. Cuando una proteína de unión se convierte en derivado con una enzima detectable, ésta se detecta mediante adición de reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción con color, el cual es detectable. Una proteína de unión también se puede convertir en derivado con biotina, y se detecta a través de medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.

Otra modalidad de la invención provee una proteína de unión cristalizada y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una modalidad la proteína de unión cristalizada tiene un tiempo de vida media mayor in vivo que la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra modalidad la proteína de unión retiene la actividad biológica después de la cristalización.

La proteína de unión cristalizada de la invención se puede producir de conformidad con métodos conocidos en la técnica y como los descritos en el documento WO 02072636, incorporado en la presente solicitud para referencia.

Otra modalidad de la invención provee una proteína de unión glucosilada en la cual el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende uno o más residuos de carbohidrato. La producción de la proteína naciente in vivo puede experimentar procesamiento adicional, conocido como modificación posterior a la traducción. En particular, se pueden agregar enzimáticamente residuos de azúcar (glucosilo), un procedimiento conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que tienen cadenas laterales de oligosacárido ligadas covalentemente son conocidas como proteínas glucosiladas o glucoproteínas. Los anticuerpos son glucoproteínas con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fe, así como en el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fe tienen un efecto importante sobre la función efectora del dominio Fe, con efecto mínimo sobre la unión a antígeno o el tiempo de vida media del anticuerpo (R. Jefferís, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). En contraste, la glucosilación del dominio variable puede tener un efecto sobre la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. La glucosilación en el dominio variable puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de unión del anticuerpo, probablemente debido a impedimento estérico (Co, M.S., et al, Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), o dar como resultado una afinidad incrementada por el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).

Un aspecto de la presente invención está dirigido a la generación de mutantes de sitio de glucosilación en los cuales el sitio de glucosilación O-ligado o N-ligado de la proteína de unión ha sido mutado. Un experto en la técnica puede generar dichos mutantes utilizando tecnologías estándar bien conocidas. Los mutantes de sitio de glucosilación que retienen la actividad biológica pero que tienen actividad de unión incrementada a disminuida son otro objetivo de la presente invención .

Incluso en otra modalidad , se modifica glucosilacion del anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención . Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilacion) . La glucosilacion se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden log rar, por ejemplo, alterando u no o más sitios de glucosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden efectuar una o más sustituciones de aminoácido que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilacion de la región variable para de esta manera eliminar la glucosilacion en dicho sitio. Dicha aglucosilacion puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicha estrategia se describe con mayor detalle en la publicación del PCT WO2003016466A2 , y en las patentes E. U .A. Nos. 5,714,350 y 6, 350,861 , cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad .

Adicionalmente o de manera alternativa , se puede elaborar una proteína de unión modificada de la i nvención que tenga un tipo alterado de glucosilacion , tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo (véase Kanda, Yutaka et al, Journal of Biotech nology (2007), 1 30(3), 300-31 0. ) o un anticuerpo que tenga estructu ras de GIcNAc bisectrices incrementadas. Dichos patrones de gl ucosilacion alterada han demostrado incrementar la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohid rato se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedera con maquinaria de glucosilacion alterada. Las células con maquinaria de glucosilacion alterada han sido descritas en la técnica y se pueden utilizar como células hospederas en las cuales se expresan los anticuerpos recombinantes de la invención para de esta manera producir un anticuerpo con glucosilación alterada . Véase, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J . Biol. Chem . 277:26733-26740; Umana et al. ( 1 999) Nat. Biotech . 1 7: 1 76-1 , así como, patente europea No: EP 1 , 1 76, 1 95; publicaciones del PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad.

La glucosilación de la proteína depende de la secuencia de aminoácido de la proteína de interés, así como de la célula hospedera en la cual se expresa la proteína. Organismos diferentes pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas) , y tienen diferentes substratos (azúcares de nucleótido) disponibles . Debido a dichos factores, el patrón de glucosilación de la proteína, y la composición de los resid uos de glucosilo, pueden diferir en función del sistema hospedero en el cual se exprese la proteína particular. Los residuos de glucosilo útiles en la invención pueden incluir, pero no se limitan a, glucosa , galactosa, mañosa , fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. En u na modalidad , la proteína de unión glucosilada comprende residuos glucosilo tales que el patrón de glucosilación es humano.

Es bien sabido por los expertos en la técnica que la glucosilación de proteína diferente puede dar como resultado características de proteína diferentes. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica que se produce en un microorga nismo hospedero, tal como levadu ra, y que se glucosila utilizando la ruta endógena de la levadu ra pueden estar reducida en comparación con la de la misma proteína expresada en u na célula de mamífero, tal como una línea de células CHO . Dichas glucoproteínas también pueden ser inmunógenas en los humanos y mostrar tiempo de vida reducido in vivo después de la administración . Los receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos glucosilo específicos y promover la depuración rápida de la proteína a partir del torrente sangu íneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de la proteína, solubilidad , susceptibilidad a proteasas, tráfico, transporte, distribución en compartimientos, secreción , reconocimiento por otras proteínas o factores, carácter antigénico, o carácter alergénico. Por consig uiente, un practicante puede elegir una proteína terapéutica con una composición y patrón de glucosilación específicos , por ejemplo composición y patrón de glucosilación idénticos, o por lo menos similares, a los producidos en células humanas o en células específicas de especie del animal objeto pretendido.

La expresión de proteínas glucosiladas diferentes de las de una célula hospedera se puede lograr modificando genéticamente la célula hospedera para que exprese enzimas de glucosilación heterólogas. Utilizando técnicas conocidas en el campo, un practicante puede generar anticuerpos o porciones de u nión a antígeno de los mismos que presenten glucosilación de proteína humana. Por ejemplo, se han modificado genéticamente cepas de levadu ra para que expresen enzimas de glucosilación normalmente no presentes de modo tal que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que se producen en estas cepas de levadu ra exhiban g lucosilación de proteína idéntica a la de las célu las animales, en especial células de humano (solicitudes de patente E. U.A. 2004001 8590 y 200201 371 34 y publicación del PCT WO2005100584 A2) .

Además de las proteínas de unión , la presente invención también está dirigida a anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) específicos para dichas proteínas de unión de la invención . Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo, el cual reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión a antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld se puede preparar inmunizando un animal con la proteína de unión o una región que contenga CDR de la misma. El animal inmu nizado reconoce, y responde contra los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y produce un anticuerpo anti-ld . Es fácilmente evidente que es más fácil genera r anticuerpos anti-idiotípicos contra dichos dos o más anticuerpos progenitores incorporados en una molécula de DVD-lg; y confirmar los estudios de unión utilizando métodos bien reconocidos en la técnica (por ejemplo, BIAcore, ELISA) para verificar que los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el idiotipo de cada anticuerpo progenitor también reconozcan el idiotipo (por ejemplo, sitio de unión a antígeno) en el contexto de la DVD-lg. Los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para cada uno de dichos dos o más sitios de unión a antígeno de una DVD-lg proveen reactivos ideales para medir las concentraciones de DVD-lg de una DVD-lg de humano en suero del paciente; se pueden establecer pruebas de concentración de DVD-lg utilizando un "Formato ELISA de prueba de emparedado" con un anticuerpo para una primera región de unión a antígeno aplicada como revestimiento sobre la fase sólida (por ejemplo, chip BIAcore, placa de ELISA etc.), enjuague con solución amortiguadora para enjuague, incubación con la muestra de suero, otro paso de enjuague y finalmente incubación con otro anticuerpo anti-idiotípico para el otro sitio de unión a antígeno, por sí mismo marcado con una enzima para cuantificación de la reacción de unión. En una modalidad, para una DVD-lg con más de dos sitios de unión diferentes, los anticuerpos anti-idiotípicos para los dos sitios de unión más externos (más alejados y cercanos a la región constante) no sólo ayudan a determinar la concentración de DVD-lg en suero de humano sino también documentan la integridad de la molécula ¡n vivo. Cada anticuerpo anti-ld también se puede utilizar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune incluso en otro animal, para producir un denominado anticuerpo anti-anti-ld.

Además, el experto en la técnica apreciará que se puede expresar u na proteína de interés utilizando u na genoteca de células hospederas genéticamente diseñadas para q ue expresen varias enzimas de glucosilación , de modo tal que células hospederas miembros de la genoteca producen la proteína de interés con patrones de glucosilación variantes. Un practicante después puede seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glucosilación novedosos particulares. En una modalidad, la proteína que tiene un patrón de glucosilación novedoso particularmente seleccionado exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.

I I I . Usos de DVD-lg Dada su capacidad para unirse a dos o más antígenos, las proteínas de unión de la invención se pueden utilizar para detectar los antígenos (por ejemplo, en u na muestra biológica, tal como suero o plasma) , utilizando un inmuno-ensayo convencional , tal como una prueba con inmunosorbente ligado a enzima (ELI SA) , un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. La DVD-lg se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no u nido. Las sustancias detectables apropiadas incluyen varias enzimas, grupos de prótesis, materiales fluorescentes , materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas apropiadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina , ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo de prótesis apropiados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína , cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo apropiado incluyen 3H , 14C , 35S, 90Y, "Te, 1 1 1 l n , 125l , 1 3 l , 177Lu , 166Ho, o 153Sm.

En una modalidad , las proteínas de un ión de la invención pueden neutralizar la actividad de los antígenos tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, dichas DVD-lgs se pueden utilizar para inhibir la actividad del antígeno, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene los antígenos, en individuos humanos o en otros individuos mamíferos que tienen los antígenos con los cuales una proteína de unión de la invención presenta reacción cruzada . En otra modalidad , la invención provee un método para reducir la actividad de antígeno en un individ uo que padece de una enfermedad o trastorno en el cual la actividad del antígeno es perjudicial. Una proteína de unión de la invención se puede administrar a un individuo humano para propósitos terapéuticos.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "un trastorno en el cual la actividad de antígeno es perjudicial" tiene la intención de incluir enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia del antígeno en un individuo que padece del trastorno ha demostrado que es o se sospecha que puede ser la responsable de la fisiopatolog ía del trastorno o es un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, u n trastorno en el cual la actividad del antígeno es perjudicial es un trastorno en el cual se espera q ue la reducción de la actividad del antígeno alivie los síntomas y/o avance del trastorno. Dichos trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, mediante un incremento en la concentración del antígeno en un fluido biológico de un individuo que padece del trastorno (por ejemplo, un incremento en la concentración del antígeno en suero, plasma, líquido sinovial , etc. del ind ividuo) . Los ejemplos no limitativos de trastornos que se pueden tratar con las proteínas de unión de la invención incluyen los trastornos discutidos más adelante y en la sección perteneciente a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención .

Las DVD-lgs de la invención pueden ligar un antígeno o antígenos múltiples. Dichos antígenos incluyen , pero no se limitan a , los objetivos listados en las sig uientes bases de datos, las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia. Estas bases de datos de objetivo incluyen dichos listados: Objetivos terapéuticos: (http://xin .cz3. n us.edu .sg/group/cjttd/ttd .asp); Citocinas y receptores de citocina: (http://www.cytokinewebfacts .com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi , y http://cmbi .bjmu.edu .cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine. medic k umamoto-u .ac.jp/CFC/i ndexR. html) ; Quimiocinas: (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html); Receptores de quimiocina y GPCRs: (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/); Receptores olfatorios: (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp); Receptores: (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); Objetivos de Cáncer: (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); Proteínas secretadas como objetivos potenciales de anticuerpo: (http://spd.cbi.pku.edu.cn/); Proteína cinasas: (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), y Marcadores de CD de Humano: (http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf ) y (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).

Las DVD-lgs son útiles como agentes terapéuticos para bloquear simultáneamente dos objetivos diferentes para incrementar la eficacia/seguridad y/o para incrementar la cobertura del paciente. Dichos objetivos pueden incluir objetivos solubles (TNF) y objetivos de receptor de superficie celular (VEG FR y EG FR) . Estas también se pueden utilizar para inducir citotoxicidad redirigida entre células de tumor y células T (Her2 y CD3) para terapia de cáncer, o entre célula auto-reactiva y células efectoras para enfermedad autoinmune o transplante, o entre cualquier célula objetivo y célula efectora para eliminar células causantes de enfermedad en cualquier enfermedad dada .

Además, la DVD-lg se puede utilizar para disparar el agrupamiento y activación del receptor cuando ésta está diseñada para elegir como blanco dos epítopes diferentes en el mismo receptor. Esto podría tener beneficios en la elaboración de terapéuticos anti-GPCR agonistas y antagonistas. En este caso, la DVD-lg se puede utilizar para elegir como blanco dos epítopes diferentes (incluyendo epítopes tanto en las regiones de asa como en el dominio extracelular) en una célula para agrupamiento/señalización (dos moléculas de superficie celular) o señalización (en una molécula) . De manera similar, se puede diseñar una molécula de DVD-lg para disparar la ligación a CTLA-4, y una señal negativa eligiendo como blanco dos epítopes diferentes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4, q ue conduce a una reg ulación negativa de la respuesta inmune. CTLA-4 es un objetivo clínicamente validado para tratamiento terapéutico de u n número de trastornos inmunológicos. Las interacciones de CTLA-4/B7 reg ulan en forma negativa la activación de célula T mediante aten uación del avance del ciclo celular, producción de I L-2 , y proliferación de células T después de la activación , y el acoplamiento (engagement) de CTLA-4 (C D 1 52) puede regular en forma negativa la activación de célula T y promover la inducción de tolerancia inmune. Sin embargo, la estrategia de atenuar la activación de célula T mediante acoplamiento de anticuerpo agonista de CTLA-4 ha sido infructuosa debido a que la activación de CTLA-4 requiere ligación . La interacción molecular de CTLA-4/B7 es en arreglos de "cremallera desalineada", como queda demostrado por el análisis estructural del cristal (Stamper 2001 Natu re 41 0:608) . Sin embargo ning uno de los reactivos de unión a CTLA-4 actualmente dispon ibles tiene propiedades de ligación , incluyendo mAbs anti-CTLA-4. Se han hecho varios intentos para solucionar este problema. En un caso, se genera un anticuerpo de cadena individ ual unido a miembro celular, e inhibe significativamente el rechazo alogénico en ratones (Hwang 2002 Jl 169:633) . En un caso separado, se genera anticuerpo de cadena individual ligado a superficie de APC artificial contra CTLA-4 y demuestra atenuar las respuestas de célula T (G riffin 2000 Jl 164:4433). En ambos casos, la ligación a CTLA-4 se logra mediante anticuerpos u nidos a miembro cercanamente localizado en sistemas artificiales. Au nque estos experimentos proveen prueba de concepto para regulación negativa inmune mediante disparo de señalización CTLA-4 negativa, los reactivos utilizados en estos reportes no son apropiados para uso terapéutico. Para este fin , la ligación de CTLA-4 se puede log rar utilizando una molécula de DVD-lg , q ue elija como blanco dos epítopes diferentes (o 2 copias del mismo epítope) del dominio extracelular de CTLA-4. El razonamiento es q ue la distancia que abarcan dos sitios de unión de u na IgG , aproximadamente 1 50-1 70 A , es demasiado g rande para ligación activa de CTLA-4 (30-50 A entre 2 homodímeros de CTLA-4). Sin embargo , la distancia entre los dos sitios de un ión en la DVD-lg (un brazo) es mucho más corta, también en el intervalo de 30-50 A, lo que permite la ligación apropiada de CTLA-4.

De manera similar, la DVD-lg puede elegir como blanco dos miembros diferentes de un complejo de receptor de superficie celular (por ejemplo, I L- 1 2R alfa y beta). Asimismo, la DVD-lg puede elegir como blanco a CR 1 y una proteína soluble/patógeno para controlar la depuración rápida de la proteína soluble/patógeno objetivo.

De manera adicional , las DVD-lgs de la invención se pueden utilizar para suministro específico de tejido (objetivo a marcador de tejido y u n mediador de enfermedad para farmacocinética local incrementada por lo tanto mayor eficacia y/o menor toxicidad), incluyendo el suministro intracelular (eligiendo como blanco un receptor de interiorización y una molécula intracelular), suministro al interior del cerebro (elig iendo como blanco al receptor de transferrina y un mediador de enfermedad de SNC para cruzar la barrera hemato-encefálica) . La DVD-lg también puede servir como una proteína portadora para suministrar un antígeno a un sitio específico a través de unión a un epítope no neutralizante de dicho antígeno y también para incrementar el tiempo de vida media del antígeno. Asimismo, la DVD-lg se puede diseñar ya sea para que esté ligada físicamente a dispositivos médicos implantados en los pacientes o para elegir como blanco dichos dispositivos médicos (véase Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemaín, N.; Mayer, G.¡ Chai, F.¡ Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokíne network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reís, Rui L., Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). Brevemente, dirigir los tipos apropiados de célula al sitio del implante médico puede promover la curación y restauración de la función tisular normal. De manera alternativa, también se provee la inhibición de mediadores (incluyendo pero sin limitarse a citocinas), liberados después de implantar el dispositivo por un DVD acoplado a o dirigido a un dispositivo. Por ejemplo, durante años se han utilizado endoprótesis (Stents) en cardiología de intervención para despejar las arterias bloqueadas y para mejorar el flujo de sangre hacia el músculo cardiaco. Sin embargo, se sabe que los stents de metal descubierto tradicionales causan reestenosis (re-estrechamiento de la arteria en el área tratada) en algunos pacientes y puede conducir a coágulos sang u íneos. Recientemente, se describió un stent revestido con anticuerpo anti-C D34 el cual reduce la reestenosis y evita que se presenten coágulos sanguíneos mediante captura de células progenitoras endoteliales (EPC) que circulan a través de toda la sangre. Las células endoteliales son células que recubren los vasos sangu íneos, lo que permite que la sangre fluya uniformemente. Las EPCs se adhieren a la superficie dura del stent formando una capa lisa que no sólo promueve la cu ración sino q ue también evita la reestenosis y los coágulos sang uíneos, complicaciones previamente asociadas con el uso de stents (Aoji et al . 2005 J Am Coll Cardiol. 45( 10) : 1 574-9) . Además de mejorar los resultados para pacientes que requieren stents, también hay algu nas implicaciones para pacientes que requieren cirugía de derivación (bypass) cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular protético (arteria artificial) revestido con anticuerpos anti-EPC pod ría eliminar la necesidad de utilizar arterias provenientes de las piernas o brazos de los pacientes para injertos de cirug ía de bypass. Esto pod ría reducir los tiempos de cirug ía y anestesia, lo cual a su vez pod ría reducir las muertes por cirug ía coronaria. La DVD-lg está diseñada de tal manera que ésta se une a un marcador de superficie celular (tal como C D34) así como a una proteína (o un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero sin limitarse a proteínas, lípidos y polisacáridos) q ue han sido aplicados como revestimiento en el dispositivo implantado para facilitar el reclutamiento de células. Dichas estrategias también se pueden aplicar a otros implantes médicos en general. De manera alternativa, las DVD-lgs se pueden aplicar como revestimiento en dispositivos médicos y después del implante y de la liberación de todos los DVDs a partir del dispositivo (o cualquier otra necesidad que pudiera req uerir DVD-lg nueva adicional , incluyendo envejecimiento y desnaturalización de la DVD-lg ya cargada) el dispositivo se puede volver a recargar mediante administración sistémica de DVD-lg nueva al paciente, en donde la DVD-lg está diseñada para unirse a un objetivo de interés (una citocina, un marcador de superficie celular (tal como CD34) etc.) con un conjunto de sitios de unión y a un objetivo aplicado como revestimiento en el d ispositivo (incluyendo una proteína , un epítope de cualquier tipo, incluyendo pero sin limitarse a l ípidos, polisacáridos y polímeros) con el otro. Esta tecnolog ía tiene la ventaja de extender la utilidad de los implantes revestidos.

A. Uso de DVD-lgs en varias enfermedades Las moléculas DVD-lg de la invención también son útiles como moléculas terapéuticas para tratar varias enfermedades. Dichas moléculas de DVD pueden ligar uno o más objetivos implicados en una enfermedad específica. Los ejemplos de dichos objetivos en varias enfermedades se describen a continuación .

. Respuesta autoinmune e inflamatoria humana Muchas proteínas han sido implicadas en las respuestas autoinmunes e inflamatoria generales, incluyendo C5, CCL1 ( I-309) , CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 ( IP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (l-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina activadora de monocito endotelial), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, A H, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, B PR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1 , CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1 , IFNB1 , IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1 , TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1 A, TNFRSF B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11 A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, RNF110 (ZNF144). En un aspecto, se proveen DVD-Igs que pueden ligar uno o más de los objetivos listados en la presente solicitud. 2. Asma El asma alérgica se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de célula caliciforme, alteraciones de célula epitelial, hiperreactividad de vías aéreas (AHR), y expresión de citocina de Th2 y Th1, así como niveles elevados de IgE en suero. En la actualidad se acepta ampliamente que la inflamación de vías aéreas es el factor clave subyacente a la patogénesis del asma, que implica una interacción compleja de células inflamatorias tales como células T, células B, eosinófilos, mastocitos y macrófagos, y de sus mediadores secretados incluyendo citocinas y quimiocinas. Los corticosteroides son el tratamiento anti-inflamatorio más importante para el asma hoy en día, sin embargo su mecanismo de acción es no específico y existen preocupaciones de seguridad, especialmente en la población de pacientes juveniles. Por lo tanto, está justificado el desarrollo de terapias más específicas y dirigidas. Existe una evidencia cada vez mayor de que IL-13 en ratones imita muchas de las características del asma, incluyendo AHR, hiper-secreción de moco y fibrosis de vías aéreas, independientemente de la inflamación eosinofílica (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).

Se ha implicado que IL-13 tiene un papel pivotante en ocasionar las respuestas patológicas asociadas con el asma. El desarrollo de terapia con mAb anti-IL-13 para reducir los efectos de IL-13 en el pulmón es una nueva estrategia excitante que ofrece promesa considerable como un tratamiento novedoso para el asma. Sin embargo otros mediadores de rutas inmunológicas diferenciales también están implicados en la patogénesis del asma, y el bloqueo de estos mediadores, además de IL-13, puede ofrecer beneficio terapéutico adicional. Dichos pares de objetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 y una citocina pro-inflamatoria, tal como el factor de necrosis tumoral a (TNF-a). TNF-a puede amplificar la respuesta inflamatoria en asma y se puede vincular con la gravedad de la enfermedad (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31 (New Drugs for Asthma, Allergy y COPD), 247-250 ). Esto sugiere que el bloqueo tanto de IL-13 como de TNF-a puede tener efectos benéficos, particularmente en enfermedad de vías aéreas severa. En otra modalidad la DVD-lg de la invención liga los objetivos IL-13 y TNFa y se utiliza para tratar asma.

Los modelos animales tales como el modelo de asma inducida por OVA en ratón, en el cual se pueden evaluar tanto la inflamación como AHR, son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para determinar la capacidad de varias moléculas de DVD-lg para tratar el asma. Los modelos animales para estudiar asma se describen en Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; y Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de estos pares de objetivos, las pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión pueden estar justificadas y ayudar en la selección de los mejores pares de objetivos (véase Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 7799-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).

Tomando como base la justificación descrita en la presente solicitud y utilizando el mismo modelo de evaluación para eficacia y seguridad, se pueden determinar otros pares de objetivos a los que se pueden unir las moléculas de DVD-lg y que son útiles para tratar asma. En una modalidad, dichos objetivos incluyen, pero no se limitan a, IL-13 e IL-1beta, debido a que IL-1beta también está implicada en la respuesta inflamatoria en asma; IL-13 y citocinas y quimiocinas que están implicadas en la inflamación, tales como IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-ß; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; e IL-13 y ADAM8. La presente invención también provee DVD-lgs que pueden ligar uno o más objetivos implicados en asma que se seleccionan a partir del grupo que consiste de CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamina y receptores de histamina, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1 , CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21 , TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, PGD2 y quitinasa. 3. Artritis reumatoide La artritis reumatoide (RA), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en el sinovio de las articulaciones y está asociada con degeneración de cartílago y erosión del hueso yuxta-articular. Muchas citocinas pro-inflamatorias incluyendo TNF, quimiocinas, y factores de crecimiento son expresadas en las articulaciones enfermas. La administración sistémica de anticuerpo anti-TNF o de proteína de fusión sTNFR a modelos de RA en ratón ha demostrado ser anti-inflamatoria y protectora de las articulaciones. Las investigaciones clínicas en las cuales se bloquea la actividad de TNF en pacientes con RA con infliximab administrado por vía intravenosa (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical triáis in rheumatoid artritis using infliximab, an anti-TNFalfa treatment. Ann Rheum Dis 58 Supl 1:161-4), un mAb anti-TNF quimérico, han brindado evidencia de que TNF regula la producción de IL-6, IL-8, MCP-1, y VEGF, el reclutamiento de células inmunitarias inflamatorias hacia las articulaciones, angiogénesis, y reducción de niveles sanguíneos de las metaloproteinasas de matriz 1 y 3. Un mejor entendimiento de la ruta inflamatoria en artritis reumatoide ha llevado a la identificación de otros objetivos terapéuticos implicados en artritis reumatoide. Tratamientos prometedores tales como antagonistas de interleucina-6 (anticuerpo para receptor de IL-6 MRA, desarrollado por Chugai, Roche (véase Nishimoto, Norihiro et al., Arthritis & Rheumatism (2004), 50(6), 1761-1769), CTLA4lg (abatacept, Genovese Me et al 2005 Abatacept for rheumatoid artritis refractory to tumor necrosis factor alfa inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), y terapia anticélula B (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid artritis. N Engl J Med. 351: 1909) ya han sido probados en pruebas controladas aleatorizadas en el transcurso del año pasado. Se han identificado otra citocinas y se ha demostrado que son de beneficio en modelos animales, incluyendo interleucina-15 (anticuerpo terapéutico HuMax-IL_15, AMG 714 véase Baslund, Bo et al., Arthritis & Rheumatism (2005), 52(9), 2686-2692), interleucina-17, e interleucina-18, y las pruebas clínicas de estos agentes actualmente se están realizando. La terapia con anticuerpo dual-específico, que combina anti-TNF y otro mediador, tiene gran potencial para incrementar la eficacia clínica y/o cobertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo tanto de TNF como de VEGF puede potencialmente erradicar la inflamación y angiogénesis, de las cuales ambas están implicadas en la fisiopatología de RA. También se contempla el bloqueo con DVD-lgs específicas de otros pares de objetivos implicados en RA incluyendo, pero sin limitarse a, TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-23; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-17; TNF e IL-15; TNF y SOST. Además de las evaluaciones de seguridad rutinarias de dichos pares de objetivos, pueden estar justificadas pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión y son útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véase Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al, Developments ¡n biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). El que una molécula de DVD-lg sea útil o no para el tratamiento de artritis reumatoide se puede evaluar utilizando modelos pre-clínicos de artritis reumatoide en animales tales como el modelo de artritis inducida por colágena en ratón . Otros modelos útiles también son bien conocidos en la técnica (véase Brand DD. , Comp Med . (2005) 55(2) : 1 14-22) . Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de humano y de ratón (por ejemplo, reactividad para TNF de humano y de ratón , I L-1 5 de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en el modelo de CIA en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas a partir de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede igualar hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de la DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida med ia similar etc.). 4. Lupus eritematoso sistémico (SLE) El sello inmunopatogénico característico de SLE es la activación de célula B policlonal, lo cual conduce a h iperglobulinemia, producción de auto-anticuerpo y formación de complejo inmune. La anormalidad fundamental parece ser la falla de las células T para suprimir los clones de célula B prohibidos debido a u na desregulación de célula T generalizada. Además la interacción de célula B y T es facilitada por varias citocinas tales como I L-1 0 así como moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, las cuales inician la seg unda señal. Estas interacciones junto con depuración fagocítica disminuida de los complejos inmunes y material apoptótico, perpetúan la respuesta inmune con la lesión tisular resultante. Los siguientes objetivos pueden estar implicados en SLE y potencialmente se pueden utilizar para una estrategia con DVD-lg para la intervención terapéutica: terapias dirigidas a célula B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, S4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, y NT5E.; señales co-estimuladoras: CTLA4 o B7.1/B7.2; inhibición de supervivencia de célula B: BlyS, BAFF; inactivación del complemento: C5; modulación de citocina: el principio clave es que la respuesta biológica neta en cualquier tejido es el resultado de un equilibrio entre niveles locales de citocinas pro-inflamatorias o anti-inflamatorias (véase Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). SLE es considerada como una enfermedad controlada por Th-2 con elevaciones documentadas de IL-4, IL-6, IL-10 en suero. También se contemplan DVD Igs que pueden ligar uno o más objetivos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, PGE2, y TNF-a. La combinación de objetivos discutidos en la presente solicitud puede incrementar la eficacia terapéutica para SLE lo cual se puede analizar en un número de modelos pre-clínicos de lupus (véase Peng SL (2004) Methods Mol Med.; 102:227-72). Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de humano y de ratón (por ejemplo, reactividad hacia CD20 de humano y de ratón, Interferón alfa de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en un modelo de lupus en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede igualar hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida media similar etc.). 5. Esclerosis múltiple La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad humana de tipo auto-inmune compleja con una etiología predominantemente desconocida. La destrucción inmunológica de la proteína básica de mielina (MBP) a través de todo el sistema nervioso es la patología principal de la esclerosis múltiple. MS es una enfermedad de patologías complejas, que implica infiltración por células T CD4+ y CD8+ y de respuesta dentro del sistema nervioso central. La expresión en el SNC de citocinas, especies nitrogenadas reactivas y moléculas coestimuladoras ha sido descrita en MS. De primordial consideración son los mecanismos inmunológ icos que contribuyen al desarrollo de autoinmunidad . En particular, la expresión de antígeno, interacciones de citocina y leucocitos, y células T reguladoras, las cuales ayudan a equilibrar/modular otras células T tales como las células Th 1 y Th2 , son áreas importantes para identificación de objetivo terapéutico.

I L-1 2 es una citocina pro-inflamatoria que es producida por APC y promueve la diferenciación de las células efectoras Th 1 . I L-1 2 se produce en lesiones en desarrollo de pacientes con MS así como animales afectados con EAE . Previamente se demostró que la interferencia en las rutas de I L-12 previene efectivamente EAE en roedores, y que la neutralización in vivo de I L-1 2p40 utilizando un mAb anti-I L-1 2 tiene efectos benéficos en el modelo de EAE inducido por mielina en titíes comunes.

TWEAK es un miembro de la familia de TN F, que se expresa en forma constitutiva en el sistema nervioso central (SNC) , con efectos pro-inflamatorios, proliferativos o apoptóticos en función de los tipos celulares. Su receptor, Fn 14, es expresado en SNC por células endoteliales, astrocitos reactivos y neuronas. La expresión de ARNm de TWEAK y Fn 14 se incrementa en médula espinal durante encefalomielitis auto-inmune experimental (EAE) . El tratamiento con anticuerpo anti-TWEAK en EAE inducida por glucoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) en ratones C57BL/6 da como resultado una reducción de la gravedad de la enfermedad y de la infiltración de leucocitos cuando los ratones se tratan después de la fase de cebado.

Un aspecto de la invención pertenece a moléculas de Ig de DVD que pueden ligar uno o más, por ejemplo dos, objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, y CCR2. Una modalidad incluye una DVD Ig anti-IL-12/TWEAK dual-específica como un agente terapéutico benéfico para el tratamiento de MS.

En la técnica se conocen varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de DVD para tratar MS (véase Steinman L, et al, (2005) Trends Immunol. 26(11 ):565-71 ; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin lmmunopathol.8(3): 197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3): 187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1):51-73; y 't Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761 -8. Tomando como base la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores para ortólogos de especie humana y animal (por ejemplo, reactividad hacia IL-12 de humano y de ratón, TWEAK de humano y de ratón etc.) se pueden efectuar estudios de validación en el modelo de EAE en ratón con moléculas de DVD-lg obtenidas de "anticuerpo sustituto igualado"; brevemente, una DVD-lg basada en (o más) anticuerpos específicos de objetivo de ratón se puede igualar hasta el mayor grado posible con las características de los anticuerpos humanos o humanizados progenitores utilizados para la construcción de la DVD-lg de humano (afinidad similar, potencia de neutralización similar, tiempo de vida media similar etc.) . El mismo concepto se aplica a modelos animales en otras especies no roedoras, en los cuales se puede seleccionar una DVD-lg obtenida a partir de "anticuerpo sustituto igualado" para farmacología anticipada y posibles estudios de seguridad . Además de las evaluaciones de segu ridad rutinarias de dichos pares de objetivos las pruebas específicas respecto al grado de inmuno-supresión pueden estar justificadas y son útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véase Luster et al, Toxicology (1 994), 92( 1 -3), 229-43; Descotes, et al. , Developments in biological standardization ( 1 992) , 77 99-1 02; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp) . IDrugs.3(4) :442-6) . 6. Sepsis La fisiopatolog ía de sepsis es iniciada por los componentes de la membrana exterior tanto de organismos Gram-negativos (lipopolisacárido [LPS] , lípido A, endotoxina) como de organismos Gram-positivos (ácido lipoteicóico, peptidoglucano) . Estas componentes de membrana exterior se pueden unir al receptor de CD 14 en la superficie de monocitos. Debido a los receptores tipo toll recientemente descritos, después se transmite una señal a la célula, que lleva a la eventual producción de las citocinas pro-inflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) e interleucina-1 (I L-1 ) . Respuestas inflamatorias e inmunes abrumadoras son características esenciales de choque séptico y j uegan un papel central en la patogénesis de daño tisular, insuficiencia de órgano múltiple, y muerte inducida por sepsis. Las citocinas, especialmente factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina (I L-I) , han demostrado ser mediadores críticos del choque séptico. Estas citocinas tienen un efecto tóxico directo en los tejidos; éstas también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos conducen a concentraciones incrementadas de factor activador de plaquetas, promoción de la actividad de la oxido n ítrico sintetasa , promoción de infiltración en tejidos por los neutrófilos, y promoción de actividad de neutrófilo.

El tratamiento de sepsis y choque séptico sigue siendo u n acertijo clínico, y las pruebas prospectivas recientes con modificadores de la respuesta biológica (es decir anti-TN F, anti-M I F) dirigidos a la respuesta inflamatoria han demostrado beneficio clínico solamente modesto. Recientemente, el interés se ha desplazado hacia terapias dirigidas a revertir los periodos acompañantes de supresión inmune. Los estudios en animales de experimentación y pacientes críticamente enfermos han demostrado que la apoptosis incrementada de órganos linfoides y algunos tejidos del parénquima contribuyen a esta supresión inmune, anergia, y disfunción del sistema de órgano. Du rante los síndromes sépticos, la apoptosis de linfocitos puede ser disparada por la ausencia de I L-2 o por la liberación de glucocorticoides , granzimas, o las denominadas citocinas "de la muerte": factor de necrosis tumoral alfa o el ligando Fas. La apoptosis avanza a través de auto-activación de caspasas citosólicas y/o mitocóndricas, las cuales pueden ser i nfluenciadas por los miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos de la familia de Bcl-2. En animales experimentales, el tratamiento con inhibidores de apoptosis no sólo puede evitar la apoptosis de célula linfoide; éste también puede mejorar el resultado. Aunque las pruebas clínicas con agentes anti-apoptóticos permanecen distantes debido en gran parte a las dificultades técnicas asociadas con su administración y elección como blanco del tejido, la inhibición de apoptosis de linfocito representa un objetivo terapéutico atractivo para el paciente séptico. Del mismo modo, un agente dual-específico que elija como blanco tanto al mediador inflamatorio como al mediador apoptótico, puede tener beneficio adicional. Un aspecto de la invención pertenece a DVD Igs que pueden ligar uno o más objetivos implicados en sepsis, en una modalidad dos objetivos, que se seleccionan a partir del grupo que consiste de TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, receptores tipo 7o//, TLR-4, factor tisular, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1 A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, midquina, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, y TREM1. La eficacia de dichas DVD Igs para sepsis se puede evaluar en modelos animales pre-clínicos conocidos en la técnica (véase Buras JA, et al., (2005) Nat Rev Drug Discov.4(10):854-65 y Calandra T, et al., (2000) Nat Med.6(2): 164-70). 7. Trastornos neurológicos 7.1 . Trastornos neurodegenerativos Las enfermedades neu rodegenerativas crónicas por lo general son enfermedades dependientes de la edad caracterizadas por pérdida progresiva de las funciones neu ronales (muerte de célula neu ronal , desmielinización) , pérdida de movilidad y pérdida de memoria . El conocimiento emergente de los mecanismos subyacentes a las enfermedades neurodegenerativas crónicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) muestra una etiolog ía compleja y se ha reconocido una variedad de factores q ue contribuyen a su desarrollo y avance por ejemplo, edad , condición glucémica, producción y multimerización de amiloide, acumulación de prod uctos finales de glucosilación avanzados (AG E) que se unen a su receptor RAG E (receptor para AG E), estrés oxidante cerebral incrementado, flujo sangu íneo cerebral disminuido , neuro-inflamación incluyendo liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias, disfunción neu ronal y activación de la microgl ía. Por lo tanto , estas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan u na interacción compleja entre tipos y mediadores celulares múltiples. Las estrategias de tratamiento para dichas enfermedades son limitadas y en su gran mayoría constituyen ya sea el bloqueo de procesos inflamatorios con agentes anti-inflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores de COX) o agentes para evitar pérdida de neu rona y/o funciones sinápticas. Estos tratamientos no pueden detener el avance de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que terapias más dirigidas tales como anticuerpos para el péptido A-b soluble (incluyendo las formas oligoméricas de A-b) no sólo pueden ayudar a detener el avance de la enfermedad sino que también ayudan también a mantener la memoria. Estas observaciones preliminares sugieren que las terapias específicas que eligen como blanco más de un mediador de enfermedad (por ejemplo, A-b y una citocina pro-inflamatoria tal como TNF) pueden proveer eficacia terapéutica incluso más adecuada para enfermedades neurodegenerativas crónicas que la observada con la elección como blanco de un solo mecanismo de enfermedad (por ejemplo, A-b soluble solo) (véase CE. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 24 de Octubre de 2005; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11 :3335¡ William L. Klein.; Neurochem Int. 2002;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004; 1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005; 11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13; y Eliezer Masliah, et al., Neuron.2005;46:857).

Las moléculas de DVD-lg de la invención pueden ligar uno o más objetivos implicados en enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como enfermedad de Alzheimer. Dichos objetivos incluyen, pero no se limitan a, cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la patogénesis de AD, por ejemplo AGE (S100 A, anfoterina), citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1), quimiocinas (por ejemplo, MCP 1), moléculas que inhiban la regeneración de nervio (por ejemplo, Nogo, RG M A) , moléculas q ue incrementen el crecimiento de neurita (neurotrofinas) . La eficacia de las moléculas de DVD-lg se puede validar en modelos an imales pre-clínicos tales como el ratón transgénico que sobre-expresa la proteína precursora de amiloide o RAG E y desarrollan síntomas parecidos a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, se pueden construir moléculas de DVD-lg y analizar respecto a eficacia en los modelos animales y se puede seleccionar la mejor DVD-lg terapéutica para análisis en pacientes humanos. Las moléculas de DVD-lg también se pueden utilizar para tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson . Alfa-Sinucleína está implicada en la patolog ía de Parkinson . U na DVD-lg que pueda elegir como blanco a alfa-sinucleína y mediadores inflamatorios tales como TN F, I L-1 , MCP-1 puede demostrar terapia efectiva para la enfermedad de Parkinson y está contemplada en la invención . 7.2 Regeneración neuronal y lesión de médula espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, la lesión de méd ula espinal (SC I por sus siglas en inglés) sigue siendo u na cond ición devastadora y representa u na indicación médica caracterizada por u na alta necesidad médica. La mayoría de las lesiones de la médula espinal son lesiones por contusión o compresión y la lesión primaria generalmente es seguida por mecanismos de lesión secundarios (mediadores inflamatorios por ejemplo, citocinas y quimiocinas) que empeoran la lesión inicial y dan como resultado agrandamiento significativo del área de lesión, algunas ocasiones más de 10 veces. Estos mecanismos primarios y secundarios en SCI son muy similares a aquellos en lesión cerebral causada por otros medios por ejemplo, apoplejía. No existe tratamiento satisfactorio y la inyección de bolo de dosis elevada de metilprednisolona (MP) es la única terapia utilizada dentro de una ventana de tiempo estrecha de 8 horas después de la lesión. Sin embargo, este tratamiento sólo está pensado para evitar la lesión secundaria sin ocasionar ninguna recuperación funcional significativa. Esta ha sido bastante criticada por la falta de eficacia inequívoca y efectos secundarios severos, tal como inmuno-supresión con las infecciones subsiguientes y alteraciones histo-patológicas de músculo graves. No se ha aprobado ningún otro fármaco, producto biológico o moléculas pequeñas, que estimulen el potencial regenerativo endógeno, pero en años recientes principios de tratamiento y candidatos de fármaco prometedores han demostrado eficacia en modelos animales de SCI. Hasta en un grado amplio la falta de recuperación funcional en SCI en humano es causada por factores que inhiben el crecimiento de neurita, en los sitios de la lesión, en tejido cicatricial, en mielina así como en las células asociadas con la lesión. Dichos factores son las proteínas asociadas a mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, los CSPG (proteoglucanos de sulfato de condroitina) asociados a cicatriz y factores inhibidores en astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo , en el sitio de la lesión no solamente se encuentran moléculas inhibidoras del crecimiento sino también factores estimulantes del crecimiento de neurita tales como neu rotrofinas, laminina , L1 y otros. Este ensamble de moléculas inhibidoras del crecimiento y promotoras del crecimiento de neurita puede explicar que el bloqueo de factores individuales , tales como NogoA o RG A, dé como resultado una recuperación funcional significativa en modelos de SCI en roedores, debido a que u na reducción de las influencias inhibidoras pod ría desplazar el equilibrio de inhibición de crecimiento a promoción de crecimiento. Sin embargo, las recuperaciones observadas con el bloqueo de una molécula individual inhibidora del crecimiento de neurita no son completas. Para obtener recuperaciones más rápidas y más pronunciadas sería deseable ya sea bloquear dos moléculas inhibidoras del crecimiento de neurita por ejemplo Nogo y RGM A, o bloquear una molécu la inhibidora del crecimiento de neurita e incrementar las funciones de una molécu la incrementadora del crecimiento de neurita por ejemplo Nogo y neu rotrofinas, o bloquear una molécula inhibidora del crecimiento de neurita por ejemplo, Nogo y una molécula pro-inflamatoria por ejemplo, TNF, (véase McGee AW, et al . , Trends Neu rosci . 2003;26: 1 93; Marco Domeniconi, et al. , J Neurol Sci . 2005;233:43; Milán Makwanal , et al . , FEBS J . 2005;272 :2628; Barry J . Dickson , Science. 2002;298: 1959; Felicia Yu Hsuan Teng , et al. , J Neurosci Res. 2005; 79:273; Tara Karnezis, et al. , Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu , et al . , J.

Neurochem .2004; 91 ; 1 01 8).

En un aspecto, se proveen DVD-lgs que pueden ligar pares de objetivos tales como Ng R y RG M A; NogoA y RGM A; MAG y RG A; OMGp y RG M A; RG M A y RGM B; CSPGs y RGM A; agrecano, midquina , neurocano, versicano, fosfacano, Te38 y TN F-a; anticuerpos específicos de globulómero ?ß combinados con anticuerpos q ue promueven la gemación de dendritas y axones . La patología de dendrita es una señal muy temprana de AD y se sabe que NOGO A restringe el crecimiento de dendrita . Se puede combinar dicho tipo de anticuerpo con cualq uiera de los anticuerpos candidatos para SC I (proteínas de mielina) . Otros objetivos de DVD-lg pueden incluir cualquier combinación de Ng R-p75, NgR-Troy, Ng R-Nogo66 (Nogo), Ng R-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. De manera adicional , los objetivos también pueden inclu ir cualquier mediador, soluble o de superficie celular, implicado en la inhibición de neurita por ejemplo Nogo, Ompg , MAG , RGM A, semaforinas, efrinas, A-b soluble, citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, I L-1 ) , quimiocinas (por ejemplo, M I P 1 a) , moléculas que in hiban la regeneración de nervio. La eficacia de moléculas de DVD-lg anti-nogo/anti-RGM A o moléculas de DVD-lg similares se puede validar en modelos animales pre-clínicos de lesión de médula espinal . Además, estas moléculas de DVD-lg se pueden construir y analizar respecto a eficacia en los modelos animales y se puede seleccionar la mejor DVD-lg terapéutica para pruebas en pacientes humanos. Además, se pueden construir moléculas de DVD-lg que elijan como blanco dos sitios de unión a ligando distintos en un receptor individual por ejemplo, el receptor de Nogo el cual se u ne a tres ligandos Nogo, Ompg , y MAG y RAG E que se une a A-b y S 1 00 A. Asimismo, los inhibidores de crecimiento de neu rita por ejemplo, nogo y receptor de nogo, también juegan un papel en evitar la regeneración de nervio en enfermedades inmunológicas tales como esclerosis múltiple. La inhibición de la interacción nogo-receptor de nogo ha demostrado incrementar la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Por lo tanto, las moléculas de DVD-lg que pueden bloquear la función de un mediador inmune por ejemplo una citocina tal como I L-12 y una molécula inhibidora del crecimiento de neu rita , por ejemplo, nogo o RG M pueden ofrecer eficacia más rápida y mayor q ue el bloqueo de cualqu iera de u na molécula inmune o una molécula inhibidora de crecimiento de neurita sola. 8. Trastornos oncológicos La terapia de anticuerpo monoclonal ha surgido como una modalidad terapéutica importante para cáncer (von Mehren , M . , et al. (2003) Monoclonal antibody therapy for cáncer. Ann u . Rev. Med . 54:343-69) . Los anticuerpos pueden ejercer efectos antitumorales induciendo apoptosis, redirigiendo la citotoxicidad , interfiriendo con las interacciones ligando-receptor, o evitando la expresión de proteínas que son críticas para el fenotipo neoplásico. Además, los anticuerpos pueden elegir como blanco componentes del microambiente tumoral , perturbando estructuras vitales tales como la formación de vasculatura asociada al tumor. Los anticuerpos también pueden elegir como blanco receptores cuyos ligandos sean factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. El anticuerpo por lo tanto inhibe que los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular se unan a las células tumorales elegidas como blanco. De manera alternativa, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotípica, citotoxicidad mediada por complemento, o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC por sus siglas en inglés). El uso de anticuerpo dual-específico que elige como blanco dos mediadores de tumor separados probablemente brinde beneficio adicional en comparación con una terapia mono-específica. También se contemplan DVD Igs que puedan ligar los siguientes pares de objetivos para tratar enfermedad oncológica: IGF1 e IGF2; IGF1/2 y HER-2; VEGFR y EGFR; CD20 y CD3; CD138 y CD20; CD38 y CD20; CD38 y CD138; CD40 y CD20; CD138 y CD40; CD38 y CD40; CD-20 y CD-19; CD-20 y EGFR; CD-20 y CD-80; CD-20 y CD-22; CD-3 y HER-2; CD-3 y CD-19; EGFR y HER-2; EGFR y CD-3; EGFR e IGF1.2; EGFR e IGF1R; EGFR y RON; EGFR y HGF; EGFR y c-MET; HER-2 e IGF1.2; HER-2 e IGF1R; RON y HGF; VEGF y EGFR; VEGF y HER-2; VEGF y CD-20; VEGF e IGF1,2; VEGF y DLL4; VEGF y HGF; VEGF y RON; VEGF y NRP1 ; CD20 y CD3; VEGF y PLGF; DLL4 y PLGF; ErbB3 y EGFR; HGF y ErbB3, HER-2 y ErbB3; c-Met y ErbB3; HER-2 y PLGF; HER-2 y HER-2; y TNF y SOST.

En otra modalidad, una DVD de la invención puede ligar VEGF y fosfatidilserina; VEGF y ErbB3; VEGF y PLGF; VEGF y ROB04; VEGF y BSG2; VEGF y CDCP1; VEGF y ANPEP; VEGF y c-MET; HER-2 y ERB3; HER-2 y BSG2; HER-2 y CDCP1; HER-2 y ANPEP; EGFR y CD64; EGFR y BSG2; EGFR y CDCP1 ; EGFR y ANPEP; IGF1R y PDGFR; IGF1R y VEGF; IGF1R y CD20; CD20 y CD74; CD20 y CD30; CD20 y DR4; CD20 y VEGFR2; CD20 y CD52; CD20 y CD4; HGF y c-MET; HGF y NRP1; HGF y fosfatidilserina; ErbB3 e IGF1R; ErbB3 e IGF1.2; c-Met y Her-2; c-Met y NRP1; c-Met e IGF1R; IGF1.2 y PDGFR; IGF1.2 y CD20; IGF1.2 e IGF1R; IGF2 y EGFR; IGF2 y HER2; IGF2 y CD20; IGF2 y VEGF; IGF2 e IGF1R; IGF1 e IGF2; PDGFRa y VEGFR2; PDGFRa y PLGF; PDGFRa y VEGF; PDGFRa y c-Met; PDGFRa y EGFR; PDGFRb y VEGFR2; PDGFRb y c-Met; PDGFRb y EGFR; RON y c-Met; RON y MTSP1; RON y MSP; RON y CDCP1; VGFR1 y PLGF; VGFR1 y RON; VGFR1 y EGFR; VEGFR2 y PLGF; VEGFR2 y NRP1; VEGFR2 y RON; VEGFR2 y DLL4; VEGFR2 y EGFR; VEGFR2 y ROB04; VEGFR2 y CD55; LPA y S1P; EPHB2 y RON; CTLA4 y VEGF; CD3 y EPCAM; CD40 e IL6; CD40 e IGF; CD40 y CD56; CD40 y CD70; CD40 y VEGFR1; CD40 y DR5; CD40 y DR4; CD40 y APRIL; CD40 y BCMA; CD40 y RANKL; CD28 y MAPG; CD80 y CD40; CD80 y CD30; CD80 y CD33; CD80 y CD74; CD80 y CD2; CD80 y CD3; CD80 y CD19; CD80 y CD4; CD80 y CD52; CD80 y VEGF; CD80 y DR5; CD80 y VEGFR2; CD22 y CD20; CD22 y CD80; CD22 y CD40; CD22 y CD23; CD22 y CD33; CD22 y CD74; CD22 y CD19; CD22 y DR5; CD22 y DR4; CD22 y VEGF; CD22 y CD52; CD30 y CD20; CD30 y CD22; CD30 y CD23; CD30 y CD40; CD30 y VEGF; CD30 y CD74; CD30 y CD19; CD30 y DR5; CD30 y DR4; CD30 y VEGFR2; CD30 y CD52; CD30 y CD4; CD138 y RANKL; CD33 y FTL3; CD33 y VEGF; CD33 y VEGFR2; CD33 y CD44; CD33 y DR4; CD33 y DR5; DR4 y CD137; DR4 e IGF1.2; DR4 e IGF1R; DR4 y DR5; DR5 y CD40; DR5 y CD137; DR5 y CD20; DR5 y EGFR; DR5 e IGF1.2; DR5 e IGFR, DR5 y HER-2, EGFR y DLL4; y TNF y SOST. Otras combinaciones de objetivos incluyen uno o más miembros de la familia EGF/erb-2/erb-3. Otros objetivos (uno o más) implicados en enfermedades oncológicas que pueden ser ligados por las DVD Igs incluyen, pero no se limitan a aquellos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, EN01, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1 , NR2E3, NR2F1 , NR2F2, NR3C1 , NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1 , NR5A2, NR6A1 , PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, AP0C1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, C0L1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, ????, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, ???2, ??9, MS B, ???4, ODZ1, ???, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, ????3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1 , CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1 , APC, CD164, COL6A1, MTSS1, ???, TGFB1I1, AGR2, AIG1, ????1 , ????2, CANT1 , CAV1 , CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ??02, ??03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1 , GAGEC1 , GGT1 , GSTP1, ???1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, ???1, RT2A, ???1, PART , ????, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1 , PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, ???1, ?? 2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ?????, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, ???1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1 , PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1 , CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1 , EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, C0L18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1 , THBS2, BAD, BAG1 , BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-cadherina), CDKN1B (p27K¡p1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), F0SL1 (FRA-1 ), GATA3, GSN (Gelsolina), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glucoproteina 130), ITGA6 (integrina a6), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (tromboespondina-1 ), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glucoproteína), BPAG1 (plectina), CDKN1A (p21 Wap1/Cip1 ), CLDN7 (claudina-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1 , ID2, ITGA6 (integrina a6), ITGB4 (integrina b4), KLF5 (GC Caja BP), KRT 19 (queratina 19), KRTHB6 (queratina tipo II específica de cabello), MACMARCKS, MT3 (metalotionectina-lll), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidilserina, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, MTSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG , FLT3, PDG FR alfa , PDG FR beta, R0R 1 , PSMA, PSCA, SCD 1 , y CD59.

IV. Composiciones farmacéuticas La invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión , de la invención y un veh ículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión de la invención son para ser utilizadas en , pero sin limitarse a, diagnóstico, detección , o monitoreo de un trastorno, en la prevención, tratamiento, manejo, o alivio de un trastorno o de uno o más síntomas del mismo, y/o en investigación. En una modalidad específica, una composición comprende una o más proteínas de u nión de la invención. En otra modalidad , la composición farmacéutica comprende una o más proteínas de unión de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos además de las proteínas de unión de la invención para tratar un trastorno. En u na modalidad, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para o han sido o actualmente están siendo utilizados en la prevención , tratamiento, manejo, o alivio de un trastorno de u no o más síntomas del mismo. De conformidad con estas modalidades, la composición también puede estar constituida por un veh ículo, diluyente o excipiente.

Las proteínas de unión de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas apropiadas ' para administración a un individ uo. Típicamente, la composición farmacéutica comprende una proteína de u nión de la invención y un veh ículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente solicitud , "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión , recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúng icos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina , solución salina regulada con fosfatos, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, en la composición se incluyen agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol , o cloruro de sodio. Los veh ículos farmacéuticamente aceptables también pueden comprender cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o amortig uadores, los cuales incrementan el tiempo de vida en anaquel o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Se conocen varios sistemas de sumi nistro y se pueden utilizar para administrar uno o más anticuerpos de la i nvención o la combinación de u no o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para preven ir, manejar, tratar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que puedan expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu , J . Biol. Chem. 262 :4429-4432 (1 987)) , construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, pero no se limitan a , administración por vía parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa y subcutánea), administración epid u ral , administración intratumoral, y administración en las mucosas (por ejemplo, vías de administración intranasal y oral). Además, se puede utilizar la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de u n inhalador o nebulizador, y formulación con un agente para conversión en aerosol . Véase, por ejemplo, patentes E. U .A. Nos. 6,01 9,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5 ,874,064; 5,855,91 3; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones del PCT Nos. WO 92/1 9244; WO 97/32572 ; WO 97/4401 3; WO 98/31 346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en sus totalidades. En una modalidad, se admi nistra una proteína de unión de la invención, terapia de combinación , o una composición de la invención utilizando tecnología para suministro de fármaco en pulmones Alkermes AI R® (Alkermes, I nc. , Cambridge , Mass.) . En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa , intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar med iante cualquier vía conveniente , por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo , mediante absorción a través de los recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En una modalidad, se puede utilizar la unión específica de nanotubos de carbono (CNTs por sus siglas en inglés) acoplados al anticuerpo a las células de tumor in vitro, seguido por su extirpación altamente específica con luz en el infrarrojo cercano (NIR) para elegir como blanco las células tumorales. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos polares conjugados con biotina para preparar dispersiones de CNT no citotóxicas, biocompatibles, estables que después se unen a una o dos DVD-lgs convertidas en derivados con avidina neutralita dirigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty, P. et al. (2008) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105:8697-8702.

En una modalidad específica, sería deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante infusión local, mediante inyección, o por medio de un implante, dicho implante es de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®), o matrices de colágena. En una modalidad, se administra a un individuo una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención antagonistas localmente al área afectada para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o un síntoma del mismo. En otra modalidad, se administra una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos de la invención localmente al área afectada de un individuo en combinación con una cantidad efectiva de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de una proteína de unión de la invención para prevenir, tratar, manejar, y/o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico se puede suministrar en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una modalidad, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Blomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al, 1989, N. Engl. J. ed.321:574). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la Invención (véase por ejemplo, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailabllity, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wlley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente E.U.A. No. 5,679,377; patente E.U.A. No. 5,916,597; patente E.U.A. No. 5,912,015; patente E.U.A. No. 5,989,463; patente E.U.A. No. 5,128,326; Publicación del PCT No. WO 99/15154; y Publicación del PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(et¡leno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglucólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), poliláctidos (PLA), poli(láctido-co-glucólidos) (PLGA), y poliortoésteres. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas que puedan lixiviar, estable en almacenamiento, estéril y biodegradable. Incluso en otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada o sostenida en proximidad del objetivo profiláctico o terapéutico, requiriendo de esta manera sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol.2, pp. 115-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada son discutidos en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Se puede utilizar cualquier técnica conocida por el experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, por ejemplo, patente E.U.A. No.4,526,938, Publicación del PCT WO 91/05548, Publicación del PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cáncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en sus totalidades.

En una modalidad específica, en la cual la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica para un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo tal que éste se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase patente E.U.A. No. 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en conexión con un péptido de tipo homeobox el cual se sabe que entra al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). De manera alternativa, se puede introducir un ácido nucleico de manera intracelular e incorporado dentro del ADN de la célula hospedera para expresión mediante recombinación homologa.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida . Los ejemplos de vías de administración incluyen , pero no se limitan a, administración por vía parenteral , por ejemplo, intravenosa, intradérmica , subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica) , trans-mucosas, y rectal. En u na modalidad específica, la composición se formula de conformidad con procedimientos acostumbrados como una composición farmacéutica adaptada para administración por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal , o tópica a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración por vía intravenosa son soluciones en solución amortig uadora acuosa isotónica estéril. En donde sea necesario , la composición también puede incluir un agente para solubilizacion y u n anestésico local tal como lig nocamne para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.

Si las composiciones de la invención se van a administrar por vía tópica , las composiciones se pueden formular en forma de u n ungüento, crema, parche transdérmico, loción , gel , champú , aspersión , aerosol , solución , emulsión, u otra forma bien conocida por el experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and I ntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 1 9a edición , Mack Pub. Co. , Easton , Pa. ( 1 995). En una modalidad, para formas de dosificación tópicas no asperjables, se utilizan formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen u na viscosidad dinámica mayor q ue la del agua . Las formulaciones apropiadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos, y similares, los cuales, si se desea, se esterilizan o mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, amortiguadores, o sales) para influir en varias propiedades, tal como, por ejemplo, presión osmótica . Otras formas de dosificación tópica apropiadas incluyen preparaciones en aerosol asperjables en las cuales el ingrediente activo, en una modalidad, en combinación con un veh ículo sólido o líquido inerte, se empaca en u na mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella comprimible. También se pueden agregar hidratantes o h umectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea . Los ejemplos de dichos ing redientes adicionales son bien conocidos en la técnica.

Si el método de la invención comprende administración de una composición por vía intranasal, la composición se puede formular en forma de un aerosol, aspersión , niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso de conformidad con la presente invención se pueden suministrar de manera conveniente en forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de paquetes presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propelente apropiado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas apropiado). En el caso de un aerosol presurizado la dosis unitaria se puede determinar proveyendo una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (constituidos, por ejemplo, por gelatina) para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular de modo tal que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo apropiada tal como lactosa o almidón .

Si el método de la invención comprende administración por vía oral, las composiciones se pueden formular oralmente en forma de tabletas, cápsulas, obleas, gelcaps, soluciones, suspensiones, y similares. Las tabletas o cápsulas se pueden preparar utilizando medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona , o hidroxipropil-metilcelulosa) ; materiales de relleno (por ejemplo, lactosa , celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o sílice) ; desinteg rantes (por ejemplo, almidón de papa o almidón-glicolato de sodio), o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas se pueden recubrir utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones l íquidas para administración por vía oral pueden tomar forma de, pero sin limitarse a, soluciones, jarabes o suspensiones, o éstas se pueden presentar como un producto seco para constitución con agua u otro veh ículo apropiado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar utilizando medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes para suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa, o g rasas comestibles hidrogenadas) ; agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico, o aceites vegetales fraccionados) ; y conservadores (por ejemplo, metil-o propil-p-hid roxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras , saborizantes, colorantes, y edulcorantes seg ún sea apropiado. Las preparaciones para administración por vía oral se pueden formular de manera apropiada para liberación lenta , liberación controlada, o liberación sostenida de un agente o agentes profilácticos o terapéuticos.

El método de la invención puede comprender administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de u n inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente para conversión en aerosol. Véase, por ejemplo, patentes E. U .A. Nos. 6, 01 9,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272 ; 5,874,064; 5,855,91 3; 5,290,540; y 4,880 ,078; y Publicaciones del PCT Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31 346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en sus totalidades. En u na modalidad específica, se administra una proteína de unión de la invención , terapia de combinación , y/o composición de la invención utilizando tecnología de suministro de fármaco pulmonar Alkermes AI R® (Alkermes, Inc. , Cambridge, Mass.) .

El método de la invención puede comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, med iante inyección de bolo o infusión continua) . Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples) con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en veh ículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes para formulación tales como agentes para suspensión , estabilizadores y/o dispersantes. De manera alternativa , el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un veh ículo apropiado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes del uso .

Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones para depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implante (por ejemplo, en forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo , las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en u n aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble) .

Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aq uellas obtenidas a pa rtir de los ácidos clorh ídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. , y aquellas formadas con cationes tales como los obtenidos a partir de sodio, potasio, amonio , calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina , trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína , etc.

En términos generales, los ing redientes de las composiciones se suministran ya sea por separado o mezclados entre sí en forma de dosificación unitaria , por ejemplo, como u n polvo liofilizado seco o como concentrado libre de ag ua en u n contenedor herméticamente sellado tal como u na ampolleta o bolsita que indique la cantidad del agente activo. En casos en los que el modo de administración sea infusión , la composición se puede surtir con una botella para infusión que contenga ag ua o solución salina de g rado farmacéutico estéril . En casos en los que el modo de administración sea mediante inyección, se puede proveer una ampolleta de ag ua estéril para inyección o solución salina para que los ing redientes se puedan mezclar antes de la administración .

En particular, la invención también provee q ue uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención esté(n) empacado(s) en un contenedor herméticamente sellado tal como u na ampolleta o bolsita que indique la cantidad del agente. En una modalidad , u no o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o como concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado y se puede reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) hasta la concentración apropiada para administración a u n individuo. En una modalidad , uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención se suministra como un polvo liofilizado estéril seco en un contenedor herméticamente sellado a u na dosis unitaria de por lo menos 5 mg , por lo menos 1 0 mg , por lo menos 1 5 mg, por lo menos 25 mg , por lo menos 35 mg , por lo menos 45 mg , por lo menos 50 mg , por lo menos 75 mg , o por lo menos 100 mg . Los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas de la invención liofilizados(as) se deben almacenar a una temperatura entre 2°C y 8°C en su contenedor original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención se deben administrar en el transcurso de 1 semana, por ejemplo, dentro de 5 d ías, dentro de 72 horas, dentro de 48 horas, dentro de 24 horas, dentro de 1 2 horas, dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas , o dentro de 1 hora después que se reconstituyen . En una modalidad alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en forma l íquida en un contenedor herméticamente sellado que indique la cantidad y concentración del agente . En una modalidad , la forma líquida de la composición administrada se suministra en un contenedor herméticamente sellado a por lo menos 0.25 mg/ml , por lo menos 0.5 mg/ml , por lo menos 1 mg/ml , por lo menos 2.5 mg/ml , por lo menos 5 mg/ml , por lo menos 8 mg/ml , por lo menos 1 0 mg/ml , por lo menos 1 5 mg/kg , por lo menos 25 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml , por lo menos 75 mg/ml o por lo menos 1 00 mg/ml. La forma líquida se debe almacenar a una temperatura entre 2°C y 8°C en su contenedor original .

Las proteínas de unión de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica apropiada para administración parenteral . En u na modalidad , el anticuerpo o porciones de anticuerpo se preparan como una solución inyectable que contiene 0.1 -250 mg/ml de proteína de unión . La solución inyectable puede estar constituida por una forma de dosificación líquida o liofilizada en un frasco de vidrio transparente o de color ámbar, ampolleta o jeringa pre-llenada . El amortiguador puede ser L-histidina (1 -50 mM) , de manera óptima 5-1 0 mM , a pH 5.0 a 7.0 (de manera óptima pH 6.0). Otros amortiguadores apropiados incluyen pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (de manera óptima 1 50 mM para una forma de dosificación líquida) . Se pueden incluir crioprotectores para u na forma de dosificación liofilizada , principalmente 0-1 0% de sacarosa (de manera óptima 0.5-1 .0%) . Otros crioprotectores apropiados incluyen trehalosa y lactosa. Se puede incluir agentes para volumen para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 1 -1 0% de manitol (de manera óptima 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-metionina 1 -50 mM (de manera óptima 5-10 m M) . Otros agentes para volumen apropiados incluyen glicina , arginina , pueden ser incluidos como 0-0.05% de polisorbato 80 (de manera óptima 0.005-0.01 %) . Los agentes tensoactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y agentes tensoactivos de tipo BR IJ . La composición farmacéutica que comprende las proteínas de un ión de la invención preparada como una solución inyectable para administración por vía parenteral , también puede comprender un agente útil como un coadyuvante, tales como aquellos utilizados para incrementar la absorción, o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo). U n coadyuvante particularmente útil es hialuronidasa , tal como Hylenex® (hialuronidasa recombinante de h umano) . La adición de hialu ronidasa a la solución inyectable mejora la biodisponibilidad en humanos después de la administración por vía parenteral , particularmente administración subcutánea. Esto también permite volúmenes de sitio de inyección más grandes (es decir mayores de 1 mi) con menos dolor y molestia, e incidencia m ínima de reacciones en el sitio de inyección , (véase los documentos WO2004078140 , y US20061 04968 incorporados en la presente solicitud para referencia) .

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen , por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas , pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma elegida depende del modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas están en forma de soluciones inyectables o para infusión , tal como las composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de h umanos con otros anticuerpos. El modo de administración elegido es por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa , subcutánea , intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa . En otra modalidad , el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución , microemulsión , dispersión , liposoma, u otra estructura ordenada apropiada para concentración alta de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados en la presente solicitud, según se requiera , seguido por esterilización por filtración. En términos generales, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un veh ículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes req ueridos de los enumerados en la presente solicitud . En el caso de polvos liofilizados, estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por aspersión que producen un polvo del ing red iente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada por filtración de la misma. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo , mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensoactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo, en la composición , un agente que retrase la absorción , por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las proteínas de unión de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, en una modalidad , la vía/modo de administración es inyección subcutánea , inyección o infusión intravenosa . Como será apreciado por el experto en la técnica , la vía y/o modo de administración puede variar en función de los resultados deseados . En algunas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un veh ículo que pueda proteger el compuesto contra la liberación rápida , tal como u na formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, pa rches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar pol ímeros biodeg radables, biocompatibles, tales como etilen-acetato de vinilo, polianh ídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres , y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de d ichas formulaciones están patentados o son conocidos en términos generales por los expertos en la técnica . Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson , ed . , Marcel Dekker, I nc. , Nueva York, 1 978.

En algunas modalidades, u na proteína de unión de la invención se puede administrar por vía oral , por ejemplo, con u n diluyente inerte o un veh ículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se puede encerrar en u na casa de gelatina de cubierta dura o blanda, compactar como tabletas, o incorporar directamente en la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y utilizar en forma de tabletas que se puedan ingerir, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires , suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante administración diferente a la parenteral , podría ser necesario recubrir el compuesto con , o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación .

En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios. En algu nas modalidades , una proteína de unión de la invención se coformula con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos con la proteína de un ión de la invención .

Por ejemplo, una proteína de unión de la invención se puede coformular y/o coadministrar con uno o más anticuerpos adicionales que se unan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moléculas de superficie celular). Asimismo, se pueden utilizar uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación pueden utilizar de manera conveniente dosis mas bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

En algunas modalidades, una proteína de unión está ligada a un vehículo extensor del tiempo de vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen , pero no se limitan a , el dominio Fe, polietilenglicol, y dextrano. Dichos veh ículos se describen , por ejemplo, en la solicitud E. U .A. No. de Serie 09/428,082 y en la solicitud publicada del PCT No. WO 99/25044, las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia para cualquier propósito.

En una modalidad específica, se administran secuencias de ácido n ucleico que codifican para una proteína de unión de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención para tratar, prevenir, manejar, o aliviar un trastorno o uno o más síntomas del mismo por medio de terapia de gen. Terapia de gen se refiere a la terapia efectuada mediante la administración a un individuo de un ácido n ucleico expresado o susceptible de ser expresado. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o agente profiláctico o terapéutico codificado de la invención que media un efecto profiláctico o terapéutico.

Se puede utilizar cualquiera de los métodos para terapia de gen disponibles en la técnica de conformidad con la presente invención. Para la revisión en general de los métodos de terapia de gen, véase Goldspiel et al, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95, Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Mayo de 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). La descripción detallada de varios métodos de terapia de gen se divulga en el documento US20050042664 A1 el cual se incorpora en la presente solicitud para referencia.

Las proteínas de unión de la invención son útiles para tratar varias enfermedades en las cuales los objetivos que son reconocidos por las proteínas de unión son perjudiciales. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn , colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroid itis , asma, enfermedades alérgicas , psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, sínd rome de fatiga crónica , granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica , uveitis , choque séptico , síndrome de choque séptico, síndrome séptico, caquexia , enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Hu ntington , enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica , tumores malignos, insuficiencia cardiaca , infarto al miocardio, enfermedad de Addison , deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia polig landular tipo I I , síndrome de Schmidt, sínd rome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia , alopecia circunscripta , artropatía seronegativa , artropatía , enfermedad de Reiter, artropatía psoriática , artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática , artropatía asociada con Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis , alergia atópica , enfermedad ampollosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal , anemia hemol ítica autoinmune, anemia hemolitica positiva de Coombs, anemia perniciosa adq uirida , anemia perniciosa juvenil , encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante , hepatitis esclerosante primaria , hepatitis autoinmune criptogénica , Sínd rome de Enfermedad de I nmunodeficiencia Adquirida , Enfermedades Relacionadas con I nmunodeficiencia Adquirida , Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común) , cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura , enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica , enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial , enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren , enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vascul ítica , enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación , bronquiolitis obliterante, neumon ía eosinofíl ica crónica , enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad por esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashímoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleosatatis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por droga, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas tipo Th1 y tipo Th2, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor ), y cánceres tales como cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma), Abetalipoprotemia, Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (A L), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SIDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa 1, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arteriosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación atrial (sostenida o paroxística), aleteo atrial, bloqueo atrioventricular, linfoma de célula B, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT), bloqueo de la rama del fascículo, linfoma de Burkitt, Quemaduras, arritmias cardiacas, síndrome de aturdimiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación por bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos del cerebelo, taquicardia atrial caótica o multifocal , trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocitica crómica (CM L) , alcoholismo crónico, patolog ías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica(CLL) , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (CO PD) , intoxicación con salicilato crónico, carcinoma colorrectal , insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de arteria coronaria , enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis qu ística , trastornos asociados a terapia con citocina , demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica de dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterioesclerótica diabética , enfermedad de cuerpo difuso de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad intermedia , trastornos del movimiento inducidos por fármaco inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC , sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía , epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia , trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal , ataxia de Friedreich , trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica , gang rena gaseosa, úlcera gástrica , nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualqu ier órgano o tejido, sepsis por G ram negativos, sepsis por G ram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares , leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del fascículo de His, infección por VIH/neuropatía de VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hípersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, apoplejía isquémica, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfederma, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólico/idiopático, dolor de cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, tuberculosis por Mycobacterium, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neu rogénicas I , fiebre neutropénica, linfoma de tipo no hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, orquitis/procedimientos de reversión de vasectomia , organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas , carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis peren ne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumon ía por Pneumocystis carinii, neumon ía, sínd rome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios de la piel) , síndrome post perfusión , síndrome post bomba , sínd rome de cardiotomía postinfarto al miocardio (post-M I), preeclampsia, Parálisis supranuclear Progresiva , hipertensión pulmonar primaria, terapia con radiación , fenómeno y enfermedad de Raynaud , enfermedad de Raynoud , enfermedad de Refsum , taquicardia de Q RS estrecho regular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión , cardiomiopatía restrictiva , sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choque , anemia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel , síndrome de cambios de la piel , rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda , síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad , transplantes, trauma/hemorragia , reacciones de hipersensibilidad de tipo I I I , hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia , urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica , síndrome hemafagocítico asociado con vital , sínd rome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson , rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido. (Véase Peritt et al. Publicación del PCT No. WO2002097048A2 , Leonard et al , Publicación del PCT No. W0952491 8 A1 , y Salfeld et al . , Publicación del PCT No. WO00/56772A1 ).

Las proteínas de unión de la invención se pueden utilizar para tratar a humanos que padecen de enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con inflamación , incluyendo, artritis reumatoide , espondilitis, alergia, diabetes autoinmu ne, uveitis autoinmu ne. En una modalidad , las proteínas de u nión de la invención o porciones de u nión a antígeno de las mismas, se utilizan para tratar artritis reumatoide, enfermedad de Croh n , esclerosis múltiple , diabetes mellitus dependiente de insulina y psoriasis.

En una modalidad , las enfermedades que se pueden tratar o diagnosticar con las composiciones y métodos de la invención incluyen , pero no se limitan a, cánceres primarios y metastásicos, incluyendo carcinomas de mama, colon , recto, pulmón , orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hepático, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñon , vejiga u rinaria y urotelio) , del tracto gen ital femenino (incluyendo cuello uterino, útero, y ovarios así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional) , del tracto genital masculino (incluyendo tumores de próstata, de las vesículas seminales, de los testículos y de las células germinales) , de las glánd ulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, ad renales, y pituitaria), y de la piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo aquellos que se originan en hueso y tejidos blandos así como sarcoma de Kaposi), tumores del cerebro, nervios, ojos, y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas , retinoblastomas, neu romas, neu roblastomas, Schwannomas , y meningiomas) , tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos tales como leucemias, y linfomas (tanto linfomas de Hodgkin como linfomas de tipo no Hodgkin) .

En una modalidad , los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar cáncer o en la prevención de metástasis de los tumores descritos en la presente solicitud ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos.

Los anticuerpos de la invención , o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con agentes que incluyen pero no se limitan a, agentes antineoplásicos, radioterapia, quimioterapia tal como agentes alquilantes de ADN , cisplatino, carboplatino, agentes anti-tubulina , paclitaxel , docetaxel , taxol, doxorrubicina , gemcitabina , gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de topoisomerasa I , inhibidores de topoisomerasa I I , 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorin , irinotecano, inhibidores del receptor de tirosina cinasa (por ejemplo, erlotinib, gefitinib) , inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , inhibidores de cinasa, y siRNAs.

Una proteína de un ión de la invención también se puede administrar con u no o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de varias enfermedades.

Una proteína de unión de la invención se puede utilizar sola o en combinación para tratar dichas enfermedades. Se debe entender que las proteínas de unión se pueden utilizar solas o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional es seleccionado por el experto en la técnica por su propósito pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que está siendo tratada por el anticuerpo de la presente invención . El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo benéfico a la composición terapéutica , por ejemplo, un agente que afecte la viscosidad de la composición.

También se debe entender que las combinaciones que se van a incluir dentro de esta invención son aquellas combinaciones útiles para su propósito pretendido. Los agentes indicados más adelante son ilustrativos para dichos propósitos y no pretenden estar limitados. Las combinaciones, las cuales son parte de esta invención, pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional que se selecciona a partir de las listas siguientes. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede efectuar su función pretendida.

Las combinaciones para tratar enfermedades autoinmunes e inflamatorias son fármacos anti-inflamatorios no esferoidales también conocidos como AINES (NSAIDS) los cuales incluyen fármacos tales como ibuprofen. Otras combinaciones son los corticosteroides incluyendo prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esferoides se pueden reducir o incluso eliminar reduciendo gradualmente la dosis de esteroide requerida cuando se trata a los pacientes en combinación con las DVD Igs de esta invención. Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen los siguientes: fármacos anti-inflamatorios supresores de citocina (CSAIDs por sus siglas en inglés); anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1. IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-23, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).

Las combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune e inflamatoria subsiguiente; los ejemplos incluyen antagonistas de TNF tal como los anticuerpos humanizados o de humano quiméricos para TNF, ADALI UMAB, (Publicación del PCT No. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, y los receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados, de los mismos, (p75TNFR1gG (Enbrel™) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE); de manera similar los inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima convertidora de lnterleucina-1 , IL-1RA etc.) pueden ser efectivos por la misma razón. Otras combinaciones incluyen interleucina 11. Incluso otra combinación incluye participantes clave de la respuesta autoinmune los cuales pueden actuar paralelos a, dependientes de o en concierto con la función de IL-12; en especial son antagonistas de IL-18 incluyendo anticuerpos para IL-18 o receptores de IL-18 solubles, o proteínas de unión a IL-18. Se ha demostrado que IL-12 e IL-18 tienen funciones que se traslapan pero distintas y una combinación de antagonistas para ambos podría ser más efectiva. Incluso otra combinación son los inhibidores anti-CD4 no agotantes. I ncluso otras combinaciones incluyen antagonistas de la ruta co-estimuladora de CD80 (B7.1 ) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas.

Las proteínas de unión de la invención también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, 6-M P, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hid roxicloroq uina , pencilamina, au rotiomalato (intramuscular y oral) , azatioprina, cochicina, corticosteroides (orales, inhalados e inyección local) , agonistas del adrenorreceptor beta-2 (salbutamol , terbutalina, salmeteral) , xantinas (teofilina, aminofilina) , cromoglicato, nedocromil , ketotifen, ipratropio y oxitropio, ciclosporina , FK506, rapamicina , mofetil micofenolato, leflu nomida , NSAI Ds , por ejemplo, ibuprofen , corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa , agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes ad renérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citocinas pro-inflamatorias tales como TN F-a o I L-1 (por ejemplo, IRAK, N I K, I KK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 p , inhibidores de la enzima convertidora de TN Fa (TACE) , inhibidores de señalización de célula T tales como los inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazi na, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75 y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™ y p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-IRII, slL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxen, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, aurotiomalato de sodio, aspirina, acetónido de triamcinolona, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenac, piroxicam, etodolac, diclofenac sódico, oxaprozin, clorhidrato de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenac sódico/misoprostol, fentanil, anakinra, recombinante de humano, clorhidrato de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofen, alendronato de sodio, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaína, indometacina, sulfato de glucosamina/condroitina, clorhidrato de amitriptilina, sulfadiazina, clorhidrato de oxicodona/acetaminofen, clorhidrato de olopatadina, misoprostol, naproxen sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801, y Mesopram. Las combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severa, ciclosporina.

Los agentes adicionales no limitativos los cuales también se pueden utilizar en combinación con una proteína de unión para tratar artritis reumatoide incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (AINES); fármacos anti-inflamatorios supresores de citocina (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticuerpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-lgG/etanercept (proteína de fusión de receptor de TNF-lgG de 75 kD; Immunex; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-lgG (proteína de fusión del receptor TNF-lgG de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado no agotante; IDEC/SmithKIine; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión de IL-2; Seragen; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina anti-inflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-1RA (antagonista de receptor de IL-1; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (proteína de unión a TNF soluble; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268. pp. 37-42); R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa Tipo IV; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39., No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (inhibidor de COX-2; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); lloprost (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidomida (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida (anti-inflamatorio e inhibidor, de citocina; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39., No. 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexámico (inhibidor de activación de plasminógeno; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284); T-614 (inhibidor de citocina; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (fármaco antiinflamatorio no esteroidal; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); Naproxen (fármaco antiinflamatorio no esteroidal; véase por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Ibuprofen (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Piroxicam (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Diclofenac (fármaco anti-inflamatorio no esteroidal); Indometacina (fármaco antiinflamatorio no esteroidal); Sulfasalazina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No.9 (suplemento), S281); Azatioprina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); inhibidor de ICE (inhibidor de la enzima convertidora de interleucina-1 ß); zap-70 y/o inhibidor de 1ck (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o Ick); inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento de célula endotelial vascular o del receptor de factor de crecimiento de célula endotelial vascular; inhibidores de angiogénesis); fármacos corticosteroides anti-inflamatorios (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; anticuerpos anti-IL-12; anticuerpos anti-IL-18; interleucina-11 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol.39, No. 9 (suplemento), S296); interleucina-13 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S308); inhibidores de interleucina-17 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S120); oro; penicilamina; cloroquina; clorambucil; hidroxicloroquina; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiación linfoide total; globulina anti-timocito; anticuerpos anti-CD4; CD5-toxinas; péptidos y colágena administrados por vía oral; lobenzarit disódico; agentes reguladores de citocina (CRAs por sus siglas en inglés) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligo-desoxinucleótidos de fosforotioato antisentido para ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 soluble del complemento (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; polisulfato de glucosaminoglucano; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de peces y semillas vegetales; véase por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmune intravenosa; zileuton; azaribina; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); metotrexato; inhibidores de bcl-2 (véase Bruncko, Milán et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662); antivirales y agentes moduladores inmunes.

En una modalidad, la proteína de unión o porción de unión a antígeno de la misma, se administra en combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumatoide: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; leflunomida; naproxen; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofen; meloxicam; acetato de metilprednisolona; aurotiomalato de sodio; aspirina; azatioprina; acetónido de triamcinolona; napsilato de propoxifeno/apap; folato; nabumetona; diclofenac; piroxicam; etodolac; diclofenac sódico; oxaprozin; clorhidrato de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenac sódico/misoprostol; fentanil; anakinra, recombinante de humano; clorhidrato de tramadol; salsalato; sulindac; cianocobalamina/fa/piridoxina; acetaminofen; alendronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina; clorhidrato de amitriptilina; sulfadiazina; clorhidrato de oxicodona/acetaminofen; clorhidrato de olopatadina; misoprostol; naproxen sódico; omeprazol; mofetil micofenolato; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL- 2/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; y mesopram.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para enfermedad inflamatoria del intestino con los cuales se puede combinar una proteina de unión de la invención incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; mAbs anti-l L-1 ß; mAbs anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de señalización de célula T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocina y derivados de los mismos (por ejemplo, los receptores solubles de TNF p55 o p75, slL-1 Rl , slL-1RII, slL-6R) y citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10 , IL-11 , IL-13 y TGF ) e inhibidores de bcl-2.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para enfermedad de Crohn en los cuales se puede combinar una proteína de unión incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, ADALIMUMAB (Publicación del PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, inhibidores de (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Las proteínas de unión de la invención o porciones de unión a antígeno de las mismas, también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o acción de citocinas pro-inflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 ß e IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, 6-mercaptopurinas inhibidoras de tirosina cinasa. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, se pueden combinar con IL-11. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión a antígeno de las mismas, se pueden combinar con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, succinato sódico de metilprednisolona, difenoxilato/sulfato de atrop, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofloxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de oxicodona/acetaminofen, clorhidrato de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofilo, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/apap, clorhidrato de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacinaa, metilprednisolona, natalizumab e interferón-gamma.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-ß? a (AVONEX; Biogen); interferón-ß? b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferón a-?3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß??-IF (Serono/lnhale Therapeutics), PEG-interferón a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolimero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento de humano y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, E AP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención se pueden combinar con anticuerpos para moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Las proteínas de unión de la invención, también se pueden combinar con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofen, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas pro-inflamatorias tales como TNFa o IL-I (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL- ß, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de célula T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocina y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75, slL-1RI, slL-1RII, SIL-6R), citocinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL- 0, IL-13 y TGFp) e inhibidores de bcl-2.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple en los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen interferón-ß, por ejemplo, IFNpia e IFNplb; Copaxone, corticosteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo inhibidores de caspasa-1, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para el ligando de CD40 y CD80.

Las proteínas de unión de la invención, también se pueden combinar con agentes, tales como alemtuzumab, dronabinoi, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de xaliproden, fampridina, acetato de glatirámero, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THC.CBD (agonista canabinoide) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo anti-receptor de IL-6, neurovax, pirfenidona alotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferón gamma, agonistas de IL-4.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para angina de pecho con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: aspirina , nitroglicerina, mononitrato de isosorbida, succinato de metoprolol, atenolol , tartrato de metoprolol , besilato de amlodipina, clorhid rato de diltiazem, dinitrato de isosorbida, bisulfato de clopidog rel , nifedipina, atorvastatina cálcica, cloruro de potasio, furosemida , simvastatina, clorhidrato de verapamil , digoxina, clorhid rato de propranolol, carvedilol, lisinopril, espironolactona, clorohidrotiazida , maleato de enalapril , nadolol , ramipril, enoxaparina sódica , heparina sódica, valsartán , clorhid rato de sotalol , fenofibrato, ezetimiba , bumetanida, losartan potásico , lisinopril/clorohidrotiazida, felodipina , captopril, fumarato de bisoprolol.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para espondilitis anquilosante con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los sigu ientes: ¡buprofen , diclofenac y misoprostol , naproxen , meloxicam , indometacina, diclofenac, celecoxib, rofecoxib, Sulfasalazina , Metotrexato, azatioprina , minociclina, prednisona, etanercept, infliximab.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para asma con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención i ncluyen los siguientes: albuterol, salmeterol/fluticasona , montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesonida, prednisona, xinafoato de salmeterol , clorhidrato de levalbuterol , sulfato de albuterol/ipratropio, fosfato sódico de prednisolona , acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol , pred nisoiona, teofilina anhid ra, succinato sódico de metilprednisoiona, claritromicina , zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna del virus de la influenza, metilprednisoiona, amoxicilina trihid ratada, flunisolida, inyección para alerg ia, cromolin sódico, clorhidrato de fexofenadina, flunisolida/mentol , amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo auxiliar del inhalador, guaifenesina, fosfato sódico de dexametasona, clorhidrato de moxifloxacina, hiclato de doxiciclina, g uaifenesina/d-metorfano, p-efed rina/cod/clorfenir, gatifloxacina , clorhidrato de cetirizina, furoato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, clorhidrato de cetirizina/pseudoefed, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozil, dexametasona , guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisoiona, sulfato de metaproterenol.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para CO P D con los cu ales se pueden com binar las proteínas de u n ión de la invención incluyen los siguientes: sulfato de albuterol/ipratropio, bromu ro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol , propionato de fluticasona, prednisona , teofilina anhidra, succinato sódico de metilprednisoiona , montelukast sódico, budesonida, fumarato de formoterol , acetón ido de triamcinolona, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, clorhid rato de levalbuterol, flunisolida , ceftriaxona sódica, amoxicilina trihidratada, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisolida/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, sulfato de metaproterenol, metilprednisolona , furoato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efed rina/loratadina , sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R,R)-formoterol , TgAAT, Cilomilast, Roflumilast.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para VHC con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: interferón-alfa-2a , interferón-alfa-2b, interferón-alfa con 1 , interferón-alfa-n 1 , interferón-alfa-2a conjugado con PEG , interferón-alfa-2b conjugado con PEG, ribavirina , PEG-interferón alfa-2b + ribavirina , ácido ursodesoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasin , axamina , VX-497 y cualesquiera compuestos que se utilicen para tratar VHC a través de intervención con los siguientes objetivos: polimerasa de VHC , proteasa de VHC, helicasa de VHC, I RES (sitio de entrada a ribosoma interno) de VHC .

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para fibrosis pulmonar idiopática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colchicina , sulfato de albuterol , digoxina , gamma interferón, succinato sódico de metilpred nisolona, lorazepam, fu rosemida, lisinopril , nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d , alteplasa, propionato de fluticasona , levofloxacina , sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, clorhidrato de oxicodona, cloruro de potasio, acetónido de triamcinolona, tacrolimus anhidro, calcio, interferón-alfa, metotrexato, mofetil micofenolato, interferón-gamma-1 ß.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para infarto al miocardio con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, retavasa, losartan potásico, clorhidrato de quinapril/carbonato de magnesio, bumetanida, alteplasa, enalaprilat, clorhidrato de amiodarona, clorhidrato de tirofiban m-hidratado, clorhidrato de diltiazem, captopril, irbesartán, valsartán, clorhidrato de propranolol, fosinopril sódico, clorhidrato de lidocaína, eptifibatida, cefazolin sódico, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, clorhidrato de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, clorhidrato de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, atorvastatina cálcica, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de meperidina, dinitrato de isosorbida, epinefrina, clorhidrato de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, caripórida.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para psoriasis con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: inhibidor de molécula pequeña de KDR, inhibidor de molécula pequeña de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, acetónido de triamcinolona, propionato de halobetasol , tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, betametasona diprop aumentado, acetónido de fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona , furoato de mometasona, ketoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurand renólido, urea, betametasona , propionato de clobetasol/emol, propionato de fluticasona , azitromicina, hidrocortisona, fórmula hidratante, ácido fólico, desonida, pimecrolimus, alq uitrán de hulla, diacetato de diflorasona , folato de etanercept, ácido láctico, metoxsalen , hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, bloqueador sola r, halcinonida, ácido salicílico, antralina , pivalato de clocortolona, extracto de hulla, alquitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicílico/azufre, desoximetasona , diazepam , emoliente, fluocinonida/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de cacahuate , petróleo/miristato de isopropilo, psoraleno, ácido salicílico, jabón/tribromsalan , timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus , PUVA, UVB, sulfasalazina.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para artritis psoriática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: metotrexato, etanercept, rofecoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxen , leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina , sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, betametasona diprop aumentado, ¡nfliximab, metotrexato, folato, acetónido de triamcinolona, diclofenac, sulfóxldo de dimetilo, piroxicam , diclofenac sódico, ketoprofen , meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetin sódico, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenac sódico/misoprostol, fluocinonida , sulfato de glucosamina , aurotiomalato de sodio, bitartrato de hidrocodona/apap, ibuprofen , risedronato sódico, sulfadiazina , tiog uanina, valdecoxib , alefacept, efalizumab e inhibidores de bcl-2.

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para reestenosis con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: sirolimus , paclitaxel , everolimus, tacrolimus, Zotarolimus , acetaminofen .

Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos para ciática con los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: bitartrato de hid rocodona/apap, rofecoxib, clorhid rato de ciclobenzaprina, metilprednisolona , naproxen, ibuprofen , clorhidrato de oxicodona/acetaminofen , celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona , fosfato de codeína/apap, clorhidrato de tramadol/acetaminofen, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, clorhid rato de lidocaína, diclofenac sódico, gabapentina, dexametasona, carisoprodol, ketorolac trometamina, indometacina, acetaminofen , diazepam, nabumetona, clorh idrato de oxicodona, clorhidrato de tizanidina, diclofenac sódico/misoprostol, napsilato de propoxifeno/apap, asa/oxicod/oxicodona ter, ibuprofen/hidrocodona bit, clorhidrato de tramadol , etodolac, clorhidrato de propoxifeno, clorhidrato de amitriptilina, carisoprodol/codeína fos/asa , sulfato de morfina, multivitaminas, naproxen sódico, citrato de orfenadrina, temazepam.

Los ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (Lupus) en los cuales se pueden combinar las proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: NSAI DS, por ejemplo, diclofenac, naproxen , ibuprofen , piroxicam, indometacina ; inhibidores de COX2 , por ejemplo, Celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-palúdicos, por ejemplo, hid roxicloroq uina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenosida , dexametasona; citotóxicos, por ejemplo , azatioprina , ciclofosfamida, mofetil micofenolato, metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidor de síntesis de purina , por ejemplo Cellcept. Las proteínas de unión de la invención , también se pueden combinar con agentes tales como sulfasalazina, 5-aminoácido salicílico, olsalazina, I muran y agentes que interfieren con la síntesis, producción o acción de citocinas pro-inflamatorias tales como I L-1 , por ejemplo, inhibidores de caspasa tales como inhibidores de la enzima convertidora de I L-1 ß e IL-1 ra . Las proteínas de unión de la invención también se pueden utilizar con inhibidores de señalización de célula T, por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa; o moléculas que eligen como blanco las moléculas de activación de célula T, por ejemplo, anticuerpos para CTLA-4-lgG o anti-familia B7, anticuerpos anti-familia de PD- 1 . Las proteínas de u nión de la invención, se pueden combinar con I L-1 1 o anticuerpos anti-citocina , por ejemplo, fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos anti-receptor, por ejemplo, anticuerpo anti-receptor de IL-6 y anticuerpos para moléculas de superficie de célula B. Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar con LJP 394 (abetimus), agentes que agotan o inactivan las células B, por ejemplo, Rituximab (anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (publicación del PCT No. WO 97/29131; HUMIRA), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, (p75TNFRIgG (ENBREL) y p55TNFRIgG (LENERCEPT)) e inhibidores de bcl-2, debido a que se ha demostrado que la sobre-expresión de bcl-2 en ratones transgénicos ocasiona un fenotipo tipo lupus (véase Marquina, Regina et al., Journal of Immunology (2004), 172(11), 7177-7185), por lo tanto, se espera que la inhibición tenga efectos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de una proteína de unión de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión puede ser determinada por el experto en la técnica y puede variar de conformidad con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, género, y peso del individuo, y la capacidad de la proteína de unión para provocar una respuesta deseada en el individuo. U na cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo, o porción de anticuerpo, son sobrepasados por los efectos terapéuticamente benéficos. U na "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva , a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a que se utiliza una dosis profiláctica en los individuos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad , la cantidad profilácticamente efectiva será menor q ue la cantidad terapéuticamente efectiva.

Los reg ímenes de dosificación se pueden ajusfar para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, se puede administrar u n bolo individual , se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica . Es especialmente conveniente formu lar composiciones parenterales en formas de dosificación unitaria para facilidad de administración y un iformidad de dosis. Forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un idades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los individ uos mamíferos a ser tratados; cada u nidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calcu lada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el veh ícu lo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención queda dictada por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a obtener, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formular dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.

Un intervalo no limitativo, de ejemplo, para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de una proteína de unión de la invención es 0.1 -20 mg/kg , por ejemplo, 1 -1 0 mg/kg . Se debe indicar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y gravedad de la condición que se va a aliviar. También se debe entender que para cualquier individ uo particular, los reg ímenes de dosificación específicos se deben ajusfar con el tiempo de conformidad con las necesidades del individuo y el juicio profesional de la persona q ue administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosis indicados en la presente solicitud son solamente ejemplos y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada .

Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que son evidentes otras modificaciones y adaptaciones apropiadas de los métodos de la invención descritos en la presente solicitud y que las mismas se pueden hacer utilizando equivalentes adecuados sin alejarse del alcance de la invención o de las modalidades descritas en la misma. Habiendo descrito la presente invención con detalle, la misma se entenderá más claramente mediante referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen para propósitos de ilustración únicamente y no pretenden ser limitativos de la invención.

V. Diagnósticos La descripción de la presente solicitud también provee aplicaciones de diagnóstico. Esto se elucida con mayor detalle más adelante.

I. Método de prueba La presente descripción también provee un método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito (o fragmento del mismo) en una muestra de prueba utilizando por lo menos una DVD-lg como la descrita en la presente solicitud. Se puede utilizar cualquier prueba apropiada tal como se conozca en la técnica, en el método. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, inmuno-ensayo, tal como inmuno-ensayo en emparedado (por ejemplo, inmuno-ensayos en emparedado monoclonal, policlonal y/o DVD-lg o cualquier variación de los mismos (por ejemplo, monoclonal/DVD-lg, DVD-lg/policlonal, etc.), incluyendo detección de radioisótopos (radoinmuno-ensayo (RIA)) y detección de enzima (inmuno-ensayo de enzima (EIA) o la prueba con inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) (por ejemplo pruebas ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN))), inmuno-ensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, de avance e inverso), inmuno-ensayo de polarización de fluorescencia (FPIA), técnica de inmuno-ensayo multiplicado con enzima (EM IT) , transferencia de energ ía con resonancia de bioluminiscencia (BRET), y prueba quimioluminiscente homogénea , etc. En un inmuno-ensayo basado en SELDI , un reactivo de captura que se une específicamente a un analito (o u n fragmento del mismo) de interés se une a la superficie de una sonda de espectrometría de masas, tal como u n arreglo de chip de proteína pre-actívada . El analito (o un fragmento del mismo) se captura después específicamente en el biochip, y el analito capturado (o un fragmento del mismo) se detecta mediante espectrometría de masas . De manera alternativa , el analito (o un fragmento del mismo) se puede eluir del reactivo de captura y detectar mediante MALDI (desorción/ionización de láser asistido con matriz) tradicional o mediante S ELDI . Un inmuno-ensayo de micropartícula quimioluminiscente, en particular uno que utilice el analizador automatizado ARCH ITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) , es un ejemplo de un inmuno-ensayo preferido.

En la práctica de la presente descripción se utilizan métodos bien conocidos en la técnica para recolectar, manejar y procesar orina, sangre, suero y plasma , y otros fluidos corporales, por ejemplo , cuando se utiliza una DVD-lg como la descrita en la presente solicitud como un reactivo de inmuno-diagnóstico y/o en un estuche de inmuno-ensayo de analito. La muestra de prueba puede comprender porciones adicionales además del analito de interés, tales como anticuerpos, antígenos, haptenos, hormonas, fármacos, enzimas, receptores, proteínas, péptidos , polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre entera que se obtiene a partir de u n individuo. Puede ser necesario o deseado que una muestra de prueba , particularmente sangre entera, se trate antes del inmuno-ensayo como se describe en la presente solicitud , por ejemplo, con un reactivo de pretratamiento. I ncluso en casos en los que el pretratamiento no sea necesario (por ejemplo, la mayoría de muestras de orina) , el pretratamiento se puede efectuar de manera opcional (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial) .

El reactivo de pretratamiento puede ser cualqu ier reactivo apropiado para uso con el inmuno-ensayo y estuches de la invención . El pretratamiento comprende opcionalmente: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y etilenglicol) y opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal , y opcionalmente , detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal. Los reactivos de pretratamiento son conocidos en la técnica, y dicho pretratamiento se puede utilizar, por ejemplo, en la forma en que se utiliza para las pruebas en los analizadores Abbott TDx, AxSYM®, y ARCH ITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) , como se describe en la literatura (véase, por ejemplo , Yatscoff et al. , Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood , Clin . Chem . 36: 1 969-1 973 ( 1990), y Wallemacq et al , Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EM IT Cyclosporine Assays, Clin. Chem . 45: 432-435 (1 999)), y/o como los comercialmente disponibles. De manera adicional, el pretratamiento se puede efectuar como se describe en los siguientes documentos: patente E . U .A. No. 5, 135,875 , Publicación de patente europea No . 0 471 293, Solicitud provisional de patente E. U .A. 60/878,01 7, presentada el 29 de diciembre de 2006, y publicación de solicitud de patente E. U .A. No. 2008/0020401 todas de Abbott (incorporadas para referencia en sus totalidades por sus enseñanzas referentes al pretratamiento) . El reactivo de pretratamiento puede ser un agente heterogéneo o un agente homogéneo.

Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo , el reactivo de pretratamiento precipita la proteína de unión a analito (por ejemplo, proteína que se puede u nir a un analito o u n fragmento del mismo) presente en la muestra. Dicho paso de pretratamiento comprende retirar cualquier proteína de unión a analito separando de la proteína de u nión a analito precipitada el sobrenadante de la mezcla formada por la adición del agente de pretratamiento a la muestra. En dicha prueba, el sobrenadante de la mezcla sin ninguna proteína de unión se utiliza en la prueba, procediendo d irectamente al paso de captu ra de anticuerpo.

Con el uso de un reactivo de pretratamiento homogéneo no existe dicho paso de separación . La mezcla completa de la muestra de prueba y reactivo de pretratamiento se ponen en contacto con un compañero de unión específica marcado para el analito (o un fragmento del mismo), tal como un anticuerpo anti-analito marcado (o un fragmento antigénicamente reactivo del mismo) . El reactivo de pretratamiento utilizado para dicha prueba típicamente se diluye en la mezcla de muestra de prueba pretratada , ya sea antes o durante la captura por el primer compañero de un ión específica. A pesar de dicha dilución , una cierta cantidad del reactivo de pretratamiento sigue estando presente (o permanece) en la mezcla de muestra de prueba durante la captura . De conformidad con la invención, el compañero de u nión específica marcado puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) .

En un formato heterogéneo, después que se obtiene la muestra de prueba de un individuo, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que está siendo analizada respecto a un analito (o u n fragmento del mismo) y un primer compañero de unión específica , en donde el primer compañero de unión específica y cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un primer complejo de compañero de unión específica-analito. De preferencia, el primer compañero de unión específica es un anticuerpo anti-analito o un fragmento del mismo. El primer compañero de un ión específica puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud . El orden en el cual la muestra de prueba y el primer compañero de unión específica se agregan para formar la mezcla no es crítico. De preferencia, el primer compañero de u nión específica se inmoviliza sobre una fase sólida . La fase sólida utilizada en el inmuno-ensayo (para el primer compañero de unión específica y, opcionalmente, el segundo compañero de unión específica) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, partícula magnética, un glóbulo, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una celda, una membrana, una molécula de andamiaje, una película, un papel filtro, un disco y un chip.

Después que se forma la mezcla que contiene al complejo de primer compañero de unión específica-analito, se retira del complejo cualquier analito no unido utilizando cualquier técnica conocida en el campo. Por ejemplo, el analito no unido se puede eliminar mediante lavado. De manera deseable, sin embargo, el primer compañero de unión específica está presente en exceso de cualquier analito presente en la muestra de prueba, de modo tal que todo el analito que está presente en la muestra de prueba es ligado por el primer compañero de unión específica.

Después que se retira cualquier analito no unido, se agrega un segundo compañero de unión específica a la mezcla para formar un complejo de primer compañero de unión específica-analito-segundo compañero de unión específica. El segundo compañero de unión específica de preferencia es un anticuerpo anti-analito que se une a un epítope en el analito que difiere del epítope en el analito ligado por el primer compañero de unión específica. Asimismo, también de preferencia, el segundo compañero de unión específica se marca con o contiene una marca detectable como se describió anteriormente. El segundo compañero de unión específica puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud.

Se puede utilizar cualquier marca detectable apropiada como se sabe en la técnica. Por ejemplo, la marca detectable puede ser una marca radioactiva (tal como 3H, 125l, 35S, 14C, 32P, y 33P), una marca enzimática (tal como peroxidasa de rábano, peroxidasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenase, y similares), una marca quimioluminiscente (tal como ésteres, tioésteres, o sulfonamidas de acridinio; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio y similares), una marca fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos de quantum (por ejemplo, selenuro de cadmio bloqueado con sulfuro de zinc), una marca termométrica, o una marca de inmuno-reacción en cadena de polimerasa. Una introducción a las marcas, procedimientos de marcado y detección de marcas se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2a edición, Springer Verlag, N. Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), el cual es un manual y catálogo combinado publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Se puede utilizar una marca fluorescente en FPIA (véase, por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 5,593,896, 5,573,904, 5,496,925, 5,359,093, y 5,352,803, las cuales se incorporan en la presente solicitud para referencia en sus totalidades). Se puede utilizar un compuesto de acridinio como una marca detectable en una prueba quimioluminiscente homogénea o heterogénea (véase, por ejemplo, Adamczyk et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14:3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett.5:3779-3782 (2003)).

Un compuesto de acridinio preferido es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio-9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6:107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63:5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55:10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett. 1:779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11:714-724 (2000); Mattingly et al., en Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Ratón, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5:3779-3782 (2003); y patentes E.U.A. Nos. 5,468,646, 5,543,524 y 5,783,699 (cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad por sus enseñanzas referentes a lo mismo). Otro compuesto de acridinio preferido es un éster acridinio-9-carboxilato de arilo. Un ejemplo de un éster acridinio-9-carboxilato de arilo es fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres de acridinio-9-carboxilato de arilo se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol.4:1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 1 5:245-249 (2000) ; Razavi et al . , Luminescence 1 5:239-244 (2000); patente E.U .A. No . 5,241 ,070 (cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad por sus enseñanzas referentes a lo mismo) . Detalles adicionales referentes al éster acridinio-9-carboxilato de arilo y su uso se indican en el documento US 2008-0248493.

Las pruebas quimioluminiscentes (por ejemplo utilizando acridinio como se describió anteriormente u otros agentes quimioluminiscentes) se pueden efectuar de conformidad con los métodos descritos en Adamczyk et al. , Anal. Chim . Acta 579( 1 ) :61 -67 (2006). Aunque se puede utilizar cualquier formato de prueba apropiada, un medidor de quimioluminiscencia en microplaca (M ithras LB-940, Berthold Technologies E. U .A. , LLC, Oak Ridge, TN) permite el análisis de muestras múltiples de volúmenes pequeños rápidamente.

El orden en el cual la muestra de prueba y el compañero o compañeros de unión específica se agregan para formar la mezcla para la prueba quimioluminiscente no es crítico . Si el primer compañero de unión específica está marcado en forma detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridinio, se forman complejos de primer compañero de unión específica-analito marcados en forma detectable. De manera alternativa, si se utiliza un segundo compañero de unión específica y el seg undo compañero de unión específica está marcado en forma detectable con un agente quimioluminiscente tal como un compuesto de acridinio , se forman complejos de primer compañero de unión específica-analito-segundo compañero de unión específica marcados de manera detectable. Cualquier compañero de unión específica no unido, ya sea que esté marcado o no, se puede retirar de la mezcla utilizando cualquier técnica conocida en el campo, tal como lavado.

Se puede generar peróxido de hidrógeno in situ en la mezcla o se puede proveer o suministrar a la mezcla (por ejemplo, la fuente de peróxido de hidrógeno es una o más soluciones amortiguadoras u otras soluciones que se sepa contengan peróxido de hidrógeno) antes, simultáneamente con, o después de la adición de un compuesto de acridinio antes descrito. El peróxido de hidrógeno se puede generar in situ en un número de maneras como será evidente para el experto en la técnica.

Después de la adición simultánea o subsiguiente de por lo menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, específicamente, una señal quimioluminiscente, que indica la presencia del analito. La solución básica contiene por lo menos una base y tiene un pH mayor o igual a 10, de preferencia, mayor o igual a 12. Los ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica agregada a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Tomando como base la concentración de la solución básica utilizada, el experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica a agregar a la muestra.

La señal quimioluminiscente que se genera se puede detectar utilizando técnicas rutinarias conocidas por el experto en la técnica. Tomando como base la intensidad de la señal generada, se puede cuantificar la cantidad de analito en la muestra. Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito presente se puede cuantificar mediante comparación de la cantidad de luz generada con u na curva patrón para el analito o mediante comparación con un patrón de referencia . La cu rva patrón se puede generar utilizando diluciones en serie o soluciones de concentración conocida de analito mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos, y otras técnicas conocidas en el campo. Aunque lo anterior se describe con énfasis en el uso de un compuesto de acridinio como el agente quimioluminiscente, el experto en la técnica puede adaptar fácilmente esta descripción para uso de otros agentes quimiolu miniscentes.

Los inmuno-ensayos de analito por lo general se pueden efectuar utilizando cualquier formato conocido en la técnica , tal como, pero sin limitarse a, un formato de emparedado. Específicamente, en un formato de inmuno-ensayo, se utilizan por lo menos dos anticuerpos para separar y cuantificar el analito, tal como un analito de humano, o un fragmento del mismo , en una muestra. De manera más específica, dichos por lo menos dos anticuerpos se unen a epítopes diferentes en un analito (o u n fragmento del mismo) formando un complejo inmune, el cual es referido como un "emparedado". En términos generales, en los inmuno-ensayos se pueden utilizar uno o más anticuerpos para captu rar el analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba (estos anticuerpos frecuentemente son conocidos como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y se pueden utilizar uno o más anticuerpos para ligar u na marca detectable (específicamente, cuantificable) al emparedado (estos anticuerpos frecuentemente son conocidos como el "anticuerpo de detección", los "anticuerpos de detección", el "conjugado", o los "conjugados") . Por lo tanto, en el contexto de un formato de inmuno-ensayo de emparedado, se puede utilizar una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) como la descrita en la presente solicitud como un anticuerpo de captu ra , un anticuerpo de detección , o ambos. Por ejemplo, se puede utilizar una DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de captu ra y/o se puede utilizar otra DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como u n anticuerpo de detección . En este sentido, se puede utilizar una DVD-lg que tenga u n primer dominio que se pueda unir a un primer epítope en un analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que se pueda unir a un segundo epítope en un analito (o un fragmento del mismo) como u n anticuerpo de captu ra y/o u n anticuerpo de detección . De manera alternativa, se puede utilizar una DVD-lg q ue tenga un primer dominio q ue se pueda unir a un epítope en un primer analito (o un fragmento del mismo) y un segundo dominio que se pueda unir a un epítope en un segu ndo analito (o un fragmento del mismo) como un anticuerpo de captu ra y/o un anticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente cuantificar, dos o más analitos. En caso que un analito pueda estar presente en u na muestra en más de una forma , tal como una forma monomérica y u na forma dimérica/multimérica, la cual puede ser homomérica o heteromérica, se puede utilizar una DVD-lg q ue tenga u n dominio que se pueda u nir a un epítope q ue solamente esté expuesto en la forma monomérica y otra DVD-lg que tenga un dominio que se pueda unir a un epítope en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica como anticuerpos de captu ra y/o anticuerpos de detección , con lo cual se permite la detección , y opcionalmente la cuantificación , de formas diferentes de un analito dado. Asimismo, el uso de DVD-lgs con afinidades diferenciales dentro de u na DVD-lg individual y/o entre DVD-lgs puede proveer una ventaja de avidez. En el contexto de los inmu no-ensayos como los descritos en la presente solicitud, por lo general podría ser útil o deseado incorporar uno o más enlazadores dentro de la estructura de una DVD-lg . Cuando está presente, de manera óptima, el enlazador debe ser de longitud y flexibilidad estructu ral suficiente para permitir la unión a un epítope por parte de los dominios interiores así como la unión de otro epítope por parte de los dominios exteriores. En este sentido, si una DVD-lg puede unirse a dos analitos diferentes y un analito es más grande que el otro, de manera deseable el analito más grande es ligado por los dominios exteriores.

En términos generales, se puede poner en contacto una muestra que está siendo analizada respecto a (por ejemplo, que se sospecha que contiene) un analito (o un fragmento del mismo) con por lo menos un anticuerpo (o anticuerpos) de captura y por lo menos un anticuerpo de detección (el cual puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección o incluso un anticuerpo numerado en forma sucesiva, por ejemplo, como en el caso en el que el anticuerpo de captura y/o detección comprenda anticuerpos múltiples) ya sea en forma simultánea o secuencial y en cualquier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba se puede poner en contacto primero con por lo menos una anticuerpo de captura y después (en forma secuencial) con por lo menos un anticuerpo de detección. De manera alternativa, la muestra de prueba se puede poner primero en contacto con por lo menos un anticuerpo de detección y después (en forma secuencial) con por lo menos un anticuerpo de captura. Incluso en otra alternativa, la muestra de prueba se puede poner en contacto simultáneamente con un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.

En el formato de prueba en emparedado, una muestra de la que se sospecha que contiene analito (o un fragmento del mismo) se pone primero en contacto con por lo menos un primer anticuerpo de captura bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de primer anticuerpo/analito. Si se utiliza más de un anticuerpo de captura, se forma un complejo de primer anticuerpo de captura/analito que comprende dos o más anticuerpos de captura. En una prueba de emparedado, los anticuerpos, es decir, de preferencia dicho por lo menos un anticuerpo de captura , se utilizan en cantidades en exceso molar respecto a la cantidad máxima de analito (o un fragmento del mismo) esperada en la muestra de prueba. Por ejemplo se pueden utilizar desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 1 mg de anticuerpo por cada mi de solución amortiguadora (por ejemplo, solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula).

Los inmuno-ensayos de inhibición competitiva , los cuales con frecuencia se utilizan para medir analitos pequeños debido a que se requiere u nión por parte de sólo un anticuerpo, comprenden formatos secuenciales y clásicos. En un inmu no-ensayo de inhibición competitiva secuencial se aplica como revestimiento un anticuerpo de captu ra para un analito de interés sobre una cavidad de una placa de microtitulación u otro soporte sólido. Cuando la muestra q ue contiene el analito de interés se agrega a la cavidad , el analito de interés se une al anticuerpo de captura. Después de lavar, se agrega una cantidad conocida de analito marcado (por ejemplo, biotina o peroxidasa de rábano (H RP)) a la cavidad . Es necesario un substrato para una marca enzimática para generar una señal . U n ejemplo de un substrato apropiado para H RP es 3,3' ,5,5'-tetrametilbencidina (TM B) . Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado y ésta es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra . En un inmuno-ensayo de inhibición competitiva clásico se aplica un anticuerpo para un analito de interés como revestimiento sobre un soporte sólido (por ejemplo, una cavidad de una placa de microtitulación). Sin embargo, a diferencia del inmuno-ensayo de inhibición competitiva secuencial, la muestra y el analito marcado se agregan a la cavidad al mismo tiempo. Cualq uier analito en la muestra compite con el analito marcado por la unión al anticuerpo de captura . Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado y es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

De manera opcional, antes de poner en contacto la muestra de prueba con dicho por lo menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captu ra) , dicho por lo menos un anticuerpo de captura se puede unir a u n soporte sólido, lo cual facilita separar de la muestra de prueba al complejo de primer anticuerpo/analito (o un fragmento del mismo) . El substrato al cual se une el anticuerpo de captura puede ser cualquier soporte sólido o fase sólida apropiada que facilite separar de la muestra el complejo anticuerpo de captu ra-analito.

Los ejemplos incluyen una cavidad de una placa, tal como una placa de microtitulación , un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa , dextrano, o gelatina) , una pel ícula polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), glóbulos (por ejemplo glóbulos de poliestireno o glóbulos magnéticos) , una tira de un filtro/membrana (por ejemplo nitrocelulosa o nylon) , micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas susceptibles de imantación (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido férrico u óxido de cromo y revestimientos homopoliméricos o heteropoliméricos y radios de aproximadamente 1 -1 0 mieras) . El substrato puede comprender un material poroso apropiado con una afinidad de superficie apropiada para ligar los antígenos y porosidad suficiente para permitir el acceso por parte de los anticuerpos de detección . Generalmente se prefiere u n material microporoso, aunque se puede utilizar un material gelatinoso en u n estado hidratado. Dichos substratos porosos de preferencia están en forma de hojas que tienen u n espesor de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.5 mm, de preferencia aproximadamente 0.1 mm . Aunque el tamaño de poro puede variar bastante, de preferencia , el tamaño de poro es de aproximadamente 0.025 hasta aproximadamente 1 5 mieras, de manera más preferida desde aproximadamente 0.1 5 hasta aproximadamente 1 5 mieras. La superficie de dichos substratos se puede activar mediante procedimientos químicos que ocasionan el enlazamiento covalente de un anticuerpo al substrato. De esto resulta la u nión irreversible , generalmente por adsorción a través de fuerzas hid rofóbicas, del antígeno o el anticuerpo al substrato; de manera alternativa, se puede utilizar u n agente para copulación qu ímica u otros medios para unir covalentemente el anticuerpo al substrato, con la condición que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse al analito. De manera alternativa, el anticuerpo se puede ligar con micropartículas, las cuales han sido previamente revestidas con estreptavidina (por ejemplo, Glóbulos Mag néticos DYNAL®, I nvitrogen , Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, utilizando micropartículas revestidas con estreptavidina Power-BindTM-SA-M P (Seradyn , Indianapolis, I N)) o anti-anticuerpos monoclonales específicos de especie. Si fuera necesario, el substrato se puede convertir en derivado para permitir la reactividad con varios g rupos funcionales en el anticuerpo. Dicha conversión en derivado requiere el uso de ciertos agentes de copulación, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anh ídrido maléico, N-hidroxisuccinimida , y 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida . Si se desea, se pueden unir uno o más reactivos de captura, tales como anticuerpos (o fragmentos de los mismos) , cada uno de los cuales es específico para el o los analitos, a fases sólidas en sitios físicos o dirigibles diferentes (por ejemplo, tal como en una configu ración de biochip (véase, por ejemplo, patente E .U .A. No. 6,225,047; Publicación de solicitud de patente internacional No . WO 99/51 773; patente E. U .A. No. 6,329,209; Publicación de solicitud de patente internacional No. WO 00/56934, y patente E . U .A. No. 5,242,828). Si el reactivo de captura se une a una sonda de espectrometría de masas como soporte sólido, la cantidad de analito unido a la sonda se puede detectar mediante espectrometría de masas por ionización-desorción de láser. De manera alternativa, se puede empacar una columna individual con glóbulos diferentes, los cuales se convierten en derivados con dichos uno o más reactivos de captu ra, con lo cual se captura el analito en un solo lugar (véase, tecnologías basadas en glóbulo derivatizados con anticuerpo, por ejemplo, la tecnología xMAP de Luminex (Austin , TX)) .

Después que la muestra de prueba que está siendo analizada respecto al analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con dicho por lo menos u n anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) , la mezcla se incuba para permitir la formación de un complejo de primer anticuerpo (o anticuerpo múltiple)-analito (o un fragmento del mismo) . La incubación se puede efectuar a un pH de aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 1 0.0, a una temperatura de aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 45°C , y durante un periodo de por lo menos aproximadamente un (1 ) minuto hasta aproximadamente dieciocho (18) horas, de preferencia desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 24 minutos, de manera más preferida d urante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 1 8 minutos. El inmuno-ensayo descrito en la presente solicitud se puede efectuar en un paso (significando que la muestra de prueba, por lo menos u n anticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo de detección se agregan todos en forma secuencial o simultáneamente a un recipiente de reacción) o en más de un paso, tal como dos pasos, tres pasos, etc.

Después que se forma el complejo de anticuerpo de captu ra (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo) , el complejo se pone después en contacto con por lo menos un anticuerpo de detección bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/segundo anticuerpo de detección). Aunque titulado para calidad como el "segundo" anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo de detección), de hecho, en casos en los que se utilicen anticuerpos múltiples para captura y/o detección, dicho por lo menos un anticuerpo de detección puede ser el segundo, tercero, cuarto, etc. anticuerpos utilizados en el inmuno-ensayo. Si el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo) se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (múltiple). Al igual que con el anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), cuando dicho por lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, segundo y cualesquiera subsiguientes) se pone en contacto con el complejo de anticuerpo de captura/analito (o un fragmento del mismo), se requiere de un periodo de incubación bajo condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple). De preferencia, por lo menos un anticuerpo de detección contiene una marca detectable. La marca detectable se puede ligar a dicho por lo menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, el segundo anticuerpo de detección) antes de, simultáneamente con, o después de la formación del complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito (o un fragmento del mismo)/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) . Se puede utilizar cualquier marca detectable conocida en la técnica (véase la discusión anterior, incluyendo las referencias de Polak y Van Noorden (1 997) y Haugly ( 1 996)) .

La marca detectable se puede unir a los anticuerpos ya sea directamente o a través de un agente de copulación. Un ejemplo de un agente de copulación que se puede utilizar es EDAC (clorhidrato de -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida) , el cual se puede conseguir comercialmente a partir de Sigma-Aldrich , St. Louis, MO. Otros agentes de copulación que se pueden utilizar son conocidos en la técnica . Los métodos para unir una marca detectable a un anticuerpo son conocidos en la técnica . De manera adicional , se pueden comprar o sintetizar muchas marcas detectables que ya contienen grupos de extremo que facilitan la copulación de la marca detectable al anticuerpo, tales como éster de CPSP-acridinio (es decir, carboxamida de 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-1 0-(3-sulfopropil)acridinio) o éster de SPSP-acridinio (es decir, N 1 0-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9-carboxamida).

El complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) puede, pero no tiene que, ser separado del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación de la marca . Por ejemplo, si dicho por lo menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) está unido a un soporte sólido, tal como u na cavidad o un glóbulo, la separación se puede lograr retirando el fluido (de la muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. De manera alternativa, si dicho por lo menos primer anticuerpo de captura está unido a un soporte sólido, éste se puede poner en contacto simultáneamente con la muestra que contiene al analito y dicho por lo menos un segundo anticuerpo de detección para formar un complejo de primer (múltiple) anticuerpo/analito/segundo (múltiple) anticuerpo, seguido por remoción del fluido (muestra de prueba) del contacto con el soporte sólido. Si dicho por lo menos un primer anticuerpo de captura no está unido a un soporte sólido, entonces el complejo de anticuerpo de captura (primero o múltiple)/analito/anticuerpo de detección (segundo o múltiple) no tiene que ser retirado de la muestra de prueba para cuantificación de la cantidad de la marca.

Después de la formación del complejo de anticuerpo de captura marcado/analito/anticuerpo de detección (por ejemplo, el complejo de primer anticuerpo de captura/analito/segundo anticuerpo de detección), se cuantifica la cantidad de marca en el complejo utilizando técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, si se utiliza una marca enzimática, el complejo marcado se hace reaccionar con un substrato para la marca que produzca una reacción cuantificable tal como el desarrollo de color. Si la marca es una marca radioactiva, la marca se cuantifica utilizando medios apropiados, tales como un contador de centelleo. Si la marca es una marca fluorescente, la marca se cuantifica estimulando la marca con una luz de un color (el cual se conoce como la "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (el cual se conoce como la "longitud de onda de emisión") que es emitido por la marca en respuesta a la estimulación. Si la marca es una marca quimioluminiscente, la marca se cuantifica detectando la luz emitida ya sea visualmente o mediante el uso de luminómetros, película de rayos X, película fotográfica de alta velocidad , una cámara CCD, etc. Una vez que se cuantifica la cantidad de la marca en el complejo, se determi na la concentración del analito o un fragmento del mismo en la muestra de prueba utilizando medios apropiados, tal como mediante el uso de una curva patrón q ue se genera utilizando diluciones en serie del analito o un fragmento del mismo de concentración conocida . Además de utilizar diluciones en serie del analito o u n fragmento del mismo, la cu rva patrón se puede generar en forma g ravimétrica, mediante espectrometría de masas y mediante otras técnicas conocidas en el campo.

En una prueba de micropartícula quimioluminiscente que utiliza el analizador ARCH ITECT®, el pH del diluyente del conjugado debe ser de aproximadamente 6.0 +/- 0.2, la solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula se debe mantener aproximadamente a temperatura ambiente (es deci r, a u na temperatura de aproximadamente 1 7 hasta aproximadamente 27°C) , el pH de la solución amortiguadora para revestimiento de micropartícula debe ser de aproximadamente 6.5 +/- 0.2, y el pH del diluyente de micropartícula debe ser de aproximadamente 7.8 +/- 0.2. El contenido de sólidos de preferencia es menor de aproximadamente 0.2%, tal como menos de aproximadamente 0.15%, menos de aproximadamente 0.14%, menos de aproximadamente 0.13%, menos de aproximadamente 0.12%, o menos de aproximadamente 0.11%, tal como aproximadamente 0.10%.

Los FPIAs están basados en principios de inmuno-ensayo de unión competitiva. Un compuesto marcado en forma fluorescente, cuando es excitado por una luz linealmente polarizada, emite fluorescencia que tiene un grado de polarización inversamente proporcional a su velocidad de rotación. Cuando un complejo de anticuerpo-rastreador marcado en forma fluorescente es excitado por una luz linealmente polarizada, la luz emitida permanece altamente polarizada debido a que el fluoróforo está limitado a no girar entre el tiempo en que la luz es absorbida y el tiempo en que la luz es emitida. Cuando un compuesto rastreador "libre" (es decir, un compuesto que no está unido a un anticuerpo) es excitado por luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que la del conjugado anticuerpo-rastreador correspondiente que se produce en un inmuno-ensayo de unión competitiva. Los FPIAs son convenientes con respecto a los RIAs ya que no hay sustancias radioactivas que requieran de manejo y eliminación especial. Además, los FPIAs son pruebas homogéneas que se pueden efectuar fácil y rápidamente.

En vista de lo anterior, se provee un método para determinar la presencia, cantidad, o concentración de analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El método comprende analizar la muestra de prueba respecto a un analito (o un fragmento del mismo) mediante una prueba (i) que emplea (i') por lo menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) que se pueda unir a un analito, y (?') por lo menos una marca detectable y (ii) que comprende comparar una señal generada por la marca detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en la muestra de prueba con una señal generada como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o un fragmento del mismo) en un control o calibrador. El calibrador es opcionalmente parte de una serie de calibradores, en los cuales cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores en la concentración del analito.

El método puede comprender (i) poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) que se selecciona a partir del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) que se pueda unir a un analito para formar un complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo) , (ii) poner en contacto el complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo) con por lo menos un segundo compañero de unión específica para el analito (o fragmento del mismo) que se selecciona a pa rtir del grupo que consiste de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable, un fragmento de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable q ue se pueda unir al analito, una variante de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable que se pueda unir al analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo anti-analito marcado en forma detectable que se pueda unir al analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) marcada en forma detectable para formar un complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo)/segundo compañero de unión específica, y (iii) determinar la presencia, cantidad o concentración de analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la. marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo)/segundo compañero de unión específica formado en (ii). Puede ser preferido un método en el cual por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) y/o por lo menos u n segundo compañero de unión específica para el analito (o un fragmento del mismo) sea una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de una variante de la misma) como se describe en la presente solicitud .

De manera alternativa, el método puede comprender poner en contacto la muestra de prueba con por lo menos un primer compañero de unión específica para el analito (o u n fragmento del mismo) que se selecciona a partir del grupo q ue consiste de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo q ue se pueda unir a un analito, u na variante de u n anticuerpo que se pueda unir a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo q ue se pueda unir a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante o un fragmento de u na variante de la misma) y simultáneamente o de manera secuencial, en cualquier orden , poner en contacto la muestra de prueba con un segundo compañero de unión específica , el cual puede competir con el analito (o un fragmento del mismo) por la unión a dicho por lo menos un primer compañero de u nión específica y que se selecciona a partir del grupo que consiste de un analito marcado en forma detectable, un fragmento del analito marcado en forma detectable que se pueda unir al primer compañero de u nión específica, una variante del analito marcada en forma detectable que se pueda unir al primer compañero de unión específica , y un fragmento de una variante del analito marcado en forma detectable que se pueda un ir al primer compañero de unión específica . Cualquier analito (o un fragmento del mismo) presente en la muestra de prueba y dicho por lo menos un segundo compañero de unión específica compiten entre sí para formar u n complejo de primer compañero de unión específica/analito (o fragmento del mismo) y un complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica, respectivamente. El método también comprende determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba detectando o midiendo la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica formado en (ii) , en donde la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer compañero de unión específica/segundo compañero de unión específica es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba.

Los métodos anteriores también pueden comprender diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente a partir del cual se obtiene la muestra de prueba. Si el método comprende además evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente a partir del cual se obtuvo la muestra de prueba , el método comprende también de manera opcional modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según sea necesario para mejorar la eficacia. El método se puede adaptar para ser utilizado en un sistema automatizado o en un sistema semi-automatizado.

Con respecto a los métodos de prueba (y el estuche para lo mismo) , es posible utilizar anticuerpos anti-analito comercialmente disponibles o métodos para la producción de anti-analito como se describe en la literatura. Los suministros comerciales de varios anticuerpos incluyen , pero no se limitan a , Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) , Gen Way Biotech , I nc. (San Diego, CA) , y R&D Systems (RDS; M in neapolis, MN) .

En términos generales, se puede utilizar un nivel predeterminado como una marca de referencia contra la cual se evalúan los resultados obtenidos después de analizar una muestra de prueba respecto al analito o un fragmento del mismo, por ejemplo, para detectar la enfermedad o el riesgo de enfermedad . En términos generales, al efectuar dicha comparación , el nivel predeterminado se obtiene corriendo una prueba particular un n úmero suficiente de veces y bajo condiciones apropiadas tales q ue se pueda efectuar un vínculo o asociación de la presencia, cantidad o concentración del analito con una etapa o punto final particular de u na enfermedad, trastorno o condición o con indicios cl ínicos particulares. Típicamente, el n ivel predeterminado se obtiene con pruebas de individuos de referencia (o poblaciones de individuos) . El analito medido puede incluir fragmentos del mismo, productos de deg radación del mismo, y/o productos de corte enzimático del mismo.

En particular, con respecto a un nivel predeterminado como el utilizado para monitorear el avance y/o tratamiento de la enfermedad , la cantidad o concentración del analito o un fragmento del mismo puede ser "sin cambio", "favorable" (o "alterada favorablemente") , o "desfavorable" (o "alterada desfavorablemente"). "Elevada" o "incrementada" se refiere a una cantidad o u na concentración en una muestra de prueba que es mayor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o es más alto que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra más temprana o de línea basal) . El término "disminuida" o "reducida" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o que es menor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra más temprana o de línea basal) . El término "alterada" se refiere a una cantidad o una concentración en una muestra que está alterada (incrementada o disminuida) con respecto a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado) , o con respecto a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, muestra más temprana o de línea basal).

El nivel o intervalo típico o normal para el analito se define de conformidad con la práctica estándar. Debido a que los niveles del analito en algunos casos son muy bajos, se puede considerar que ha ocurrido u n denominado nivel alterado o alteración cuando existe cualquier cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal, o nivel o intervalo de referencia, que no puede ser explicado por el error experimental o la variación de la muestra. Por lo tanto, el nivel medido en una muestra particular será comparado con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares provenientes de un denominado individuo normal. En este contexto , un "individuo normal" es un individuo sin enfermedad detectable, por ejemplo, y un paciente o población "normal" (algunas veces denominado "control") es aquel o aquella que no presenta(n) enfermedad detectable, respectivamente, por ejemplo. Asimismo, dado que el analito no se encuentra rutinariamente a un nivel alto en la mayoría de la población humana, un "individuo normal" puede ser considerado un individuo sustancialmente sin cantidad o concentración incrementada o elevada detectable del analito, y un paciente o población "normal" (algunas veces denominados "control") es aquel o aquella que no presenta cantidad o concentración sustancial detectable incrementada o elevada del analito. Un "individuo aparentemente normal" es uno en el cual el analito no ha sido evaluado o actualmente está siendo analizado. Se dice que el nivel de un analito está "elevado" cuando el analito normalmente es indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o está dentro de un intervalo de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 75 percentiles de las poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba, así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba a un nivel más alto que el normal. Por lo tanto, entre otras cosas, la descripción provee un método para someter a tamizaje a un individuo que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno, o condición particular. El método de prueba también puede implicar el análisis de otros marcadores y similares.

Por consiguiente, los métodos descritos en la presente solicitud también se pueden utilizar para determinar si un individuo tiene o no, o está o no en riesgo de desarrollar, una enfermedad, trastorno o condición dada. Específicamente, dicho método puede comprender los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba proveniente de un individuo (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud, o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad de analito (o un fragmento del mismo) determinada en el paso (a) con un nivel predeterminado, en el cual si la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el individuo no tiene o no está en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición dada. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a) es desfavorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el individuo tiene o está en riesgo de una enfermedad, trastorno o condición dada.

De manera adicional, en la presente solicitud se provee un método para monitorear el avance de la enfermedad en un individuo. De manera óptima, el método comprende los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba proveniente de un individuo; (b) determinar la concentración o cantidad de analito en una muestra de prueba posterior proveniente del individuo; y (c) comparar la concentración o cantidad del analito como se determinó en el paso (b) con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), en el cual si la concentración o cantidad determinada en el paso (b) está sin cambio o es desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito determinada en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo ha continuado, avanzado o empeorado. Por comparación, si la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo se descontinuó, presentó regresión o mejoró.

De manera opcional, el método también comprende comparar la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, de manera opcional el método comprende tratar al individuo con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (b), por ejemplo, está alterada desfavorablemente con respecto al nivel predeterminado.

Incluso, los métodos se pueden utilizar para monitorear el tratamiento en un individuo que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, dichos métodos implican proveer una primera muestra de prueba proveniente de un individuo antes que el individuo haya sido administrado con una o más composiciones farmacéuticas. Después, se determina la concentración o cantidad de analito en una primera muestra de prueba proveniente de un individuo (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud o como se conozcan en la técnica). Después que se determina la concentración o cantidad de analito, opcionalmente, después se compara la concentración o cantidad de analito con un nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de analito según se determina en la primera muestra de prueba es más baja que el nivel predeterminado, entonces el individuo no se trata con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo, si la concentración o cantidad de analito tal como se determina en la primera muestra de prueba es más alta que el nivel predeterminado, entonces el individuo se trata con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo que se trata al individuo con dicha una o más composiciones farmacéuticas puede ser determinado por el experto en la técnica (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días hasta aproximadamente dos años, de preferencia desde aproximadamente catorce (14) días hasta aproximadamente un (1) año).

Durante el curso del tratamiento con dichas una o más composiciones farmacéuticas, después se obtienen la segunda muestra de prueba y muestras de prueba subsiguientes a partir del individuo. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual dichas muestras de prueba se obtienen a partir del individuo no son críticos. Por ejemplo, una segunda muestra de prueba se puede obtener siete (7) días después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba se podría obtener dos (2) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba se podría obtener tres (3) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba se podría obtener cuatro (4) semanas después que al individuo se le administra por primera vez dichas una o más composiciones farmacéuticas, etc.

Después que se obtiene cada segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes a partir del individuo, se determina la concentración o cantidad de analito en la segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes (por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la presente solicitud o como se conozcan en la técnica). La concentración o cantidad de analito tal como se determina en cada una de la segunda muestra de prueba y muestras de prueba subsiguientes después se compara con la concentración o cantidad de analito tal como se determinó en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que originalmente se comparó opcionalmente con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (c) es favorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo se detuvo, presentó regresión o mejoró, y al individuo se le debe seguir administrando dicha una o las composiciones farmacéuticas del paso (b). Sin embargo, si la concentración o cantidad determinada en el paso (c) no cambió o es desfavorable cuando se compara con la concentración o cantidad de analito como se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el individuo ha continuado, avanzó o empeoró, y el individuo se debe tratar con una concentración más alta de dicha una o más composiciones farmacéuticas administradas al individuo en el paso (b) o el individuo debe ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de dichas una o más composiciones farmacéuticas administradas al individuo en el paso (b). Específicamente, el individuo puede ser tratado con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de dichas una o más composiciones farmacéuticas que el individuo ha recibido previamente para disminuir o reducir dicho nivel de analito del individuo.

En términos generales, para pruebas en las cuales se puede efectuar repetición del análisis (por ejemplo, monitoreo del avance y/o respuesta de la enfermedad al tratamiento), se obtiene una segunda muestra de prueba o muestras de prueba subsiguientes en un periodo de tiempo después que se obtuvo la primera muestra de prueba a partir del individuo. Específicamente, se puede obtener una segunda muestra de prueba a partir del individuo minutos, horas, días, semanas o años después que se obtiene la primera muestra de prueba a partir del individuo. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba se puede obtener a partir del individuo en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 1 5 semanas, aproximadamente 1 6 semanas , aproximadamente 1 7 semanas, aproximadamente 1 8 semanas, aproximadamente 1 9 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas , aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2. 5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3.5 años, aproximadamente 4.0 años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 años, aproximadamente 5. 5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8.5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 1 0.0 años después que se obtiene la primera muestra de prueba a partir del individuo.

Cuando se utiliza para monitorear el avance de la enfermedad , la prueba anterior se puede utilizar para monitorear el avance de la enfermedad en individ uos que padecen de condiciones agudas. Condiciones agudas, también conocidas como condiciones de cuidado crítico, se refieren a enfermedades agudas, potencialmente letales u otras condiciones méd icas críticas que implican , por ejemplo, al sistema cardiovascular o al sistema excretor. Típicamente, las condiciones de cuidado crítico se refieren a aquellas condiciones que requieren intervención médica aguda en un instalación basada en hospital (incluyendo, pero sin limitarse a , la sala de emergencias, unidad de cuidado intensivo, centro de trauma , u otra instalación para cuidado de urgencias) o administración por un paramédico u otro personal médico basado en el campo. Para condiciones de cuidado crítico, el monitoreo repetido generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más corto, específicamente , minutos, horas o d ías (por ejemplo, aproximadamente 1 min uto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 1 0 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 d ías, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 d ías, aproximadamente 5 d ías, aproximadamente 6 d ías o aproximadamente 7 días) , y la prueba inicial, de igual manera, generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más corto, por ejemplo, aproximadamente minutos, horas o días del inicio de la enfermedad o condición.

Las pruebas también se pueden utilizar para monitorear el avance de enfermedad en individuos que padecen de condiciones crónicas o no agudas. Las condiciones de cuidado no critico o, condiciones no ag udas, se refiere a condiciones diferentes de una enfermedad ag uda, potencialmente letal u otras condiciones médicas críticas que implican, por ejemplo, el sistema cardiovascular y/o el sistema excretor. Típicamente, las condiciones no agudas incluyen aquellas de duración a largo plazo o crónicas. Para las condiciones no ag udas , la repetición del monitoreo generalmente se efectúa con un marco de tiempo más largo, por ejemplo, horas, d ías , semanas , meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 1 1 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 3 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 1 5 horas, aproximadamente 1 6 horas, aproximadamente 1 7 horas, aproximadamente 1 8 horas, aproximadamente 1 9 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 d ías, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas , aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas , aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 1 0 semanas, aproximadamente 1 1 semanas , aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 1 3 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 1 5 semanas, aproximadamente 1 6 semanas, aproximadamente 1 7 semanas, aproximadamente 1 8 semanas, aproximadamente 1 9 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1 .5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2.5 años, aproximadamente 3.0 años, aproximadamente 3. 5 años, aproximadamente 4.0 años, aproximadamente 4.5 años, aproximadamente 5.0 años, aproximadamente 5.5 años, aproximadamente 6.0 años, aproximadamente 6.5 años, aproximadamente 7.0 años, aproximadamente 7.5 años, aproximadamente 8.0 años, aproximadamente 8 5 años, aproximadamente 9.0 años, aproximadamente 9.5 años o aproximadamente 10.0 años), y de igual manera, la prueba inicial generalmente se efectúa dentro de un marco de tiempo más largo, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años del inicio de la enfermedad o condición .

Asimismo, las pruebas anteriores se pueden efectuar utilizando una primera muestra de prueba q ue se obtiene a partir de un individuo, en donde la primera muestra de prueba se obtiene a partir de una fuente, tal como orina , suero o plasma . De manera opcional , las pruebas anteriores se pueden repetir después utilizando una segunda muestra de prueba que se obtiene a partir del individuo, en donde la seg unda muestra de prueba se obtiene a partir de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtiene a partir de orina , la segunda muestra de prueba se puede obtener a partir de suero o plasma . Los resultados obtenidos de las pruebas utilizando la primera muestra de prueba y la seg unda muestra de prueba se pueden comparar. La comparación se puede utilizar para evaluar el estatus de una enfermedad o condición en el individuo.

Asimismo, la presente descripción también se refiere a métodos para determinar si un individuo predispuesto a, o que padece de una enfermedad , trastorno o condición dada se puede beneficiar o no del tratamiento. En particular, la descripción se refiere a métodos y productos de diagnóstico acompañados de analito. Por lo tanto, el método para "monitorear el tratamiento de la enfermedad en un individuo" como se describe en la presente solicitud también puede abarcar de manera óptima seleccionar o identificar candidatos para terapia.

Por lo tanto, en modalidades particulares, la descripción también provee un método para determinar si un individuo que tiene, o que está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o condición dada es o no un candidato para terapia. En términos generales, el individuo es uno que ha experimentado algún síntoma de una enfermedad, trastorno o condición dada o que realmente ha sido diagnosticado con, o que está en riesgo de, una enfermedad, trastorno o condición dada, y/o que demuestra una concentración o cantidad desfavorable de analito o un fragmento del mismo, como se describe en la presente solicitud.

El método comprende opcionalmente una prueba como la descrita en la presente solicitud, en la cual el analito se analiza antes y después del tratamiento del individuo con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, particularmente con un farmacéutico relacionado con un mecanismo de acción que implica al analito), con terapia inmuno-supresora, o mediante terapia de inmuno-absorción, o en el cual el analito se evalúa después de dicho tratamiento y la concentración o la cantidad de analito se compara contra un nivel predeterminado. Una concentración desfavorable de cantidad de analito observada después del tratamiento confirma que el individuo no se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado, mientras que una concentración o cantidad favorable de analito observada después del tratamiento confirma que el individuo se beneficiará de recibir tratamiento adicional o continuado. Esta confirmación ayuda con el manejo de estudios clínicos, y la provisión de cuidado mejorado para el paciente.

No es necesario decir que, aunque algunas modalidades en la presente solicitud son convenientes cuando se utilizan para evaluar una enfermedad, trastorno o condición dada como se discute en la presente solicitud, las pruebas y estuches se pueden utilizar para evaluar el analito en otras enfermedades, trastornos y condiciones. El método de prueba también puede implicar el análisis de otros marcadores y similares.

El método de prueba también se puede utilizar para identificar un compuesto que alivie una enfermedad, trastorno o condición dada. Por ejemplo, se puede poner en contacto una célula que exprese al analito con un compuesto candidato. El nivel de expresión del analito en la célula puesta en contacto con el compuesto se puede comparar con el de una célula de control utilizando el método de prueba descrito en la presente solicitud.

II. Estuche También se provee un estuche para analizar una muestra de prueba respecto a la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento del mismo) en una muestra de prueba. El estuche comprende por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo) e instrucciones para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo). Dicho por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto al analito (o un fragmento del mismo) puede incluir una composición que comprenda una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma) , la cual opcionalmente está inmovilizada en una fase sólida.

El estuche puede comprender por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba respecto a un analito mediante inmuno-ensayo, por ejemplo, in muno-ensayo de micropartícula quimioluminiscente, e instrucciones para analizar la muestra de prueba respecto a un analito mediante inmuno-ensayo, por ejemplo inmuno-ensayo de micropartícula quimioluminiscente. Por ejemplo, el estuche puede comprender por lo menos un compañero de unión específica para un analito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que se pueda unir al analito, una variante del mismo que se pueda unir al analito , o un fragmento de una variante que se pueda unir al analito) anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma), de los cuales cualquiera puede estar marcado en forma detectable. De manera alternativa o adicionalmente, el estuche puede comprender analito marcado en forma detectable (o un fragmento del mismo q ue se pueda u nir a un anticuerpo monoclonal/policlonal anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de la misma)), el cual puede competir con cualq uier analito en una muestra de prueba por la unión a un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo que se pueda u nir al analito, u na variante del mismo que se pueda unir al analito, o un fragmento de una variante que se pueda unir al analito) anti-analito o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, u na variante, o un fragmento de una variante de la misma) , de los cuales cualquiera puede estar inmovilizado en un soporte sólido. El estuche puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, analito aislado o purificado. El estuche puede comprender por lo menos un contenedor (por ejemplo , tubo, placas de microtitulación o tiras, los cuales pueden estar revestidos de antemano con un primer compañero de unión específica, por ejemplo) para efectuar la prueba, y/o una solución amortig uadora , tal como una solución amortiguadora para análisis o una solución amortig uadora para lavado, de las cuales cualquiera puede ser provista como una solución concentrada, una solución de substrato para la marca detectable (por ejemplo una marca enzimática) , o u na solución de detención . De preferencia, el estuche comprende todos los componentes, es decir, reactivos, patrones de referencia, soluciones amortiguadoras, diluyentes, etc. , q ue sean necesarios para llevar a cabo la prueba . Las instrucciones pueden estar en forma impresa o en forma legible con computadora , tal como un disco, C D , DVD , o similares.

Cualesq uiera anticuerpos, tales como u n anticuerpo anti-analito o una DVD-lg anti-analito, o rastreador pueden incorporar u na marca detectable como se describe en la presente solicitud , tal como un fluoróforo, una porción radioactiva, una enzima, una marca de biotina/avidina, un cromóforo, una marca quimiolumin iscente, o similares, o el estuche puede incluir reactivos para efectuar el marcado detectable. Los anticuerpos, calibradores y/o controles se pueden proveer en contenedores separados o pre-dispensados en un formato de prueba apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación .

Opcionalmente, el estuche incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad , calibradores, y controles positivos) . La preparación de los reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en las hojas de inserto para una variedad de productos de inmuno-diagnóstico. Opcionalmente se utilizan miembros de panel de sensibilidad para establecer las características de desempeño de la prueba, y opcionalmente también son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del estuche de inmuno-ensayo, y de la normalización de las pruebas.

El estuche también puede incluir opcionalmente otros reactivos requeridos para efectuar una prueba diagnóstica o facilitar las evaluaciones de control de calidad , tales como soluciones amortiguadoras, sales, enzimas, cofactores de enzima , substratos para enzima, reactivos de detección , y similares. También pueden estar incluidos en el estuche otros componentes , tales como soluciones amortig uadoras y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento) . El estuche puede incluir adicionalmente uno o más de otros controles. U no o más de los componentes del estuche pueden estar liofilizados, en cuyo caso el estuche también puede comprender reactivos apropiados para la reconstitución de los componentes liofilizados.

Los diversos componentes del estuche se proveen opcionalmente en contenedores apropiados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación . El estuche también puede incluir contenedores para contener o almacenar una muestra (por ejemplo, un contenedor o cartucho para una muestra de orina) . En donde sea apropiado, el estuche también puede contener opcionalmente recipientes de reacción , recipientes de mezclado, y otros componentes que faciliten la preparación de los reactivos o de la muestra de prueba. El estuche también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar en la obtención de una muestra de prueba, tal como una jeringa, pipeta, fórceps, cuchara grad uada , o similares.

Si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el estuche puede comprender por lo menos una acridinio-9-carboxamida, por lo menos un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo , o cualquier combinación de los mismos. Si la marca detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el estuche también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como una solución amortiguadora, u na solución , y/o por lo menos una solución básica . Si se desea , el estuche puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, glóbulo, tubo de ensayo, placa de microtitulación , celda, membrana, molécula de andamiaje, película , papel filtro, disco o chip.

I I I . Adaptación del estuche v método El estuche (o componentes del mismo), así como el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba mediante una prueba , tal como un inmuno-ensayo como se describe en la presente solicitud, se puede adaptar para ser utilizado en una variedad de sistemas automatizados y semi-automatizados (incluyendo aquellos en los cuales la fase sólida comprende u na micropartícula) , como se describe, por ejemplo, en las patentes E. U .A. Nos. 5,089,424 y 5,006,309, y como se vende comercialmente, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCH ITECT®.

Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semi-automatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el substrato al cual se une el primer compañero de unión específica (por ejemplo, u n anticuerpo monoclonal/policlonal, (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) anti-analito, o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento de la misma, una variante de la misma , o un fragmento de u na variante de la misma) ; de cualqu ier manera , la formación del emparedado y la reactividad del analito se pueden ver afectadas) , y la longitud y sincronización de la captura, detección y/o cualesquiera pasos de lavado opcionales. M ientras que un formato no automatizado, tal como una ELISA, podría requerir de un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas) , un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARC H ITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 18 min utos para ARCH ITECT®). De manera similar, mientras q ue un formato no automatizado, tal como una ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección , tal como el reactivo conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, aproximadamente 2 horas) , un formato automatizado o semi-automatizado (por ejemplo, ARCH ITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para el ARCH ITECT®).

Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen , pero no se limitan a, AxSYM®, I Mx® (véase, por ejemplo, patente E. U .A. No. 5,294,404, la cual se incorpora en la presente solicitud para referencia en su totalidad) , PRI SM®, EIA (glóbulo) , y Quantum™ I I , así como otras plataformas. De manera adicional , las pruebas, estuches y componentes del estuche se pueden utilizar en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de prueba electroqu ímicos u otros sistemas de prueba portátiles o en el sitio de atención . La presente solicitud , por ejemplo, se puede aplicar al sistema de inmuno-ensayo electroqu ímico Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) comercial que efectúa inmuno-ensayos en emparedado. Los inmuno-detectores y sus métodos de fabricación y funcionamiento en dispositivos de prueba de un solo uso se describen , por ejemplo en , patente E. U .A. No. 5,063,081 , publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2003/0170881, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2004/0018577, publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2005/0054078, y publicación de solicitud de patente E.U.A. No. 2006/0160164, las cuales se incorporan en sus totalidades para referencia por sus enseñanzas referentes a lo mismo.

En particular, con respecto a la adaptación de una prueba de analito al sistema l-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Se fabrica un chip de silicio micro-fabricado con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. En uno de los electrodos de trabajo, se adhieren glóbulos de poliestireno (0.2 mm de diámetro) con anticuerpo monoclonal/policlonal (o fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo) anti-analito, inmovilizado, o DVD-lg (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma) anti-analito, a un revestimiento polimérico de alcohol polivinílico con patrón sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho I-STAT® con un formato fluido apropiado para inmuno-ensayo. En una porción de la pared de la cámara que contiene la muestra de cartucho está presente una capa que comprende un compañero de unión específica para un analito, tal como un anticuerpo monoclonal/policlonal (o un fragmento del mismo, una variante del mismo, o un fragmento de una variante del mismo que se pueda unir al analito) anti-analito, o una DVD-lg (o un fragmento de la misma, una variante de la misma, o un fragmento de una variante de la misma que se pueda unir al analito) anti-analito, de las cuales cualquiera se puede marcar en forma detectable. Dentro de la bolsa de fluido del cartucho está un reactivo acuoso q ue incluye fosfato de p-aminofenol.

En fu ncionamiento, se agrega u na mezcla de la que se sospecha que contiene un analito a la cámara de contención del cartucho de prueba , y el cartucho se inserta en el lector de l-STAT®. Después que el compañero de unión específica para un analito se disuelve en la muestra , un elemento de bombeo dentro del cartucho obliga a la muestra a pasar a un conducto q ue contiene el chip. En este punto, ésta se hace oscilar para promover la formación del emparedado. En el penúltimo paso de la prueba, el fluido se obliga a salir de la bolsa y a pasar al interior del conducto para lavar la muestra del chip y hacia una cámara de desecho. En el paso final de la prueba, la marca de fosfatasa alcalina reacciona con el fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado se oxide electroqu ímicamente en el electrodo de trabajo. Tomando como base la corriente medida , el dispositivo de lectura puede calcular la cantidad de analito en la muestra por medio de un algoritmo incrustado y curva de calibración determinada en la fábrica.

No es necesario decir que los métodos y estuches como se describen en la presente solicitud abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para efectuar el inmuno-ensayo. Por ejemplo, se abarcan varias soluciones amortig uadoras tales como las conocidas en la técnica y/o que se puedan preparar fácilmente u optimizar para ser utilizadas, por ejemplo, para lavado, como un diluyente de conjugado, diluyente de micropartícula, y/o como un diluyente del calibrador. U n diluyente de conjugado de ejemplo es el diluyente de conjugado ARCH ITECT® empleado en algu nos estuches (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico (M ES), una sal, un bloqueador de proteína , un agente antimicrobiano, y un detergente. U n ejemplo de diluyente del calibrador es el diluyente de calibrador de humano ARCH ITECT® empleado en algunos estuches (Abbott Laboratories, Abbott Park, I L) , el cual comprende una solución amortiguadora que contiene M ES , otra sal , un bloqueador de proteína, y un agente antimícrobiano. De manera adicional, como se describe en la solicitud de patente E. U .A. No. 61 /142 ,048 presentada el 31 de diciembre de 2008, se puede obtener generación de señal mejorada , por ejemplo, en un formato de cartucho l-Stat, utilizando una secuencia de ácido nucleico ligada al anticuerpo de señal como un amplificador de la señal.

EJEM PLOS EJEM PLO 1 Diseño, construcción, y análisis de una DVD-lq EJEMPLO 1 .1 Corte proteolítico de DVD-lq con enlazadores susceptibles de corte Se generan muestras de proteína de DVD699 (denotada DVD699-C) y DVD701 (denotada DVD701 -C) cortadas con enterocinasa de la siguiente manera . Se combinan 1 80 µ ? de DVD-lg purificada a 1 .1 mg/ml con 20 µ? de solución amortiguadora 1 0X para corte con enterocinasa [500 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 10 mM de CaCI2, 1 % de Tween-20]. A esta mezcla, se agregan 5 U/mg de EKMax (I nvitrogen, Cat# E 1 80-01 ) , y la mezcla se incuba durante 2 d ías a temperatura ambiente. Para confirmar q ue toda la cadena ligera ha sido procesada hasta finalización en el sitio diseñado, las muestras (reductoras y no reductoras) se corren en SDS-PAG E antes y después del corte , y se considera que la reacción llegó a finalización cuando deja de aparecer una banda de -36 kDa (es decir, cadena ligera intacta) presente en las muestras reductoras y en su lugar se presentan bandas de -24 kDa y -1 2 kDa , correspondientes a los fragmentos LC esperados cortados. Para confirmar que el fragmento de 12 kDa sig ue estando asociado con la molécula de DVD-lg después del corte, la mezcla se pu rifica adicionalmente a través de una columna de Proteína-A, y la presencia de los fragmentos de proteína de 1 2 kDa (y 24 kDa) se confirma mediante SDS-PAGE (de las muestras reducidas).

Se generan muestras de proteína DVD700 cortada con trombina (denotada DVD700-C) en una manera similar excepto que se utilizan 5 U/mg de trombina (GE Healthcare , Cat# 27-0846-01 ) .

TABLA 5 Enlazadores utilizados para construir DVD-lgs de NRP1 -VEGF "-C" denota que el enlazador de la cadena ligera diseñada ha sido tratado con cualquiera de trombina (DVD700-C) o enterocinasa (DVD699-C, DVD701 -C).

TABLA 6 Enlazadores utilizados contrucción DVD-lgs de SOST-TNF "-C" denota que el enlazador de la cadena ligera diseñada ha sido tratado con cualquiera de trombina (DVD700-C) o enterocinasa (DVD699-C, DVD701-C).

EJEMPLO 1 .2 Pruebas uti lizadas para identificar y caracterizar los anticuerpos progenitores y DVD-lg Las siguientes pruebas se utilizan a través de todos los Ejemplos para identificar y caracterizar los anticuerpos progenitores y DVD-lg a menos q ue se indique de otra manera.

EJ EM PLO 1 .2.1 Pruebas utilizadas para determ i nar la unión y afinidad de los anticuerpos progenitores y DVD-lg para su(s) antígeno(s) obietivo Ejemplo 1 .2.1 . A ELISA de unión directa Las pruebas con inmuno-sorbente ligado a enzima para el tamizaje respecto a anticuerpos que se unen a un antígeno objetivo deseado se efectúan de la siguiente manera. Se revisten placas de ELISA de unión alta (Corning Costar # 3369, Acton, MA) con 1 00 ml/cavidad del antígeno objetivo deseado a 10 mg/ml (R&D Systems, Mineápolis, M N) o la proteína de fusión dominio extracelular/FC del antígeno objetivo deseado (R&D Systems, Mineápolis, M N) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-polihistidina (R&D Systems # MAB050, Mineápolis, M N) en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS 1 0X, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA) durante la noche a 4°C . Las placas se lavan cuatro veces con PBS que contiene Tween-20 al 0.02%. Las placas se bloquean mediante adición de 300 ml/cavidad de solución amortiguadora para bloqueo (polvo de leche seca descremada, varios proveedores al menudeo, diluida hasta 2% en PBS) durante 1/2 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan cuatro veces después de bloquear con PBS que contiene Tween-20 al 0.02%.

De manera alternativa, se agregan cien microlitros por cavidad del antígeno objetivo deseado marcado con histidina (His), 10 mg/ml, (R&D Systems, inneapolis, MN) a placas de ELISA revestidas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-poliHistidina como se describió anteriormente y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan cuatro veces con PBS que contiene Tween 20 al 0.02%.

Se agregan cien microlitros de preparaciones de anticuerpo o DVD-lg diluidas en solución para bloqueo como se describió anteriormente a la placa de antígeno objetivo deseado o a la placa de fusión de antígeno objetivo deseado/FC o a la placa de anticuerpo anti-poliHistidina/antígeno objetivo deseado marcado con His preparadas como se describió anteriormente y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan cuatro veces con PBS que contiene Tween 20 al 0.02%.

Se agregan cien microlitros de anticuerpo de cabra conjugado con HRP específico de anti-lgG de humano-FC, 10 ng/ml, (Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL) a cada cavidad de la placa de antígeno objetivo deseado o la placa de anticuerpo anti-poliHistidina/antígeno objetivo deseado marcado con histidina. De manera alternativa, se agregan cien microlitros de anticuerpo de cabra conjugado con HRP específico para anti-lgG de humano-cadena ligera kappa, 10 ng/ml, (Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL) a cada cavidad de la placa de fusión de antígeno objetivo deseado/FC y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 4 veces con PBS que contiene Tween 20 al 0.02%.

Se agregan cien microlitros de solución TMB mejorada (Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY) a cada cavidad y se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene mediante la adición de 50 mi de ácido sulfúrico 1N. Las placas se leen espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm.

La Tabla 7 contiene una lista de los antígenos utilizados en la Prueba de Unión Directa de NRP1/VEGF.

La Tabla 8 contiene los datos de unión expresados como CE50 en nM para aquellos anticuerpos y construcciones de DVD-lg analizadas la prueba ELISA de unión directa de NRP1/VEGF.

En la ELISA de unión directa, algunas veces no se observa unión, probablemente debido a que el sitio de unión al anticuerpo en el antígeno objetivo o estaba "enmascarado" o el antígeno se "distorsionó" cuando se aplicó como revestimiento a la superficie de plástico. La incapacidad de una DVD-lg para unirse a su objetivo también se puede deber a la limitación estérica impuesta sobre la DVD-lg por el formato de la ELISA de unión directa. Los anticuerpos progenitores y las DVD-lgs que no se unen en el formato de ELISA de unión directa se unen al antígeno objetivo en otros formatos de ELISA, tales como FACS, Biacore o bioensayo. La no unión de una DVD-lg también se restaura ajustando la longitud del enlazador entre los dos dominios variables de la DVD-lg, como se demostró previamente.

TABLA 7 Antígenos utilizados en la ELISA de unión directa TABLA 8 ELISA de unión directa de NRP1 y VEGF de 4 construcciones de DVD con varias secuencias. orientaciones y combi naciones de enlazador 5 10 15 La unión de todas las construcciones de DVD-lg se mantiene y es comparable con la de los anticuerpos progenitores. Todos los dominios variables N-terminales y C-terminales de las construcciones de DVD-lg DVD695, DVD696, DVD697, y DVD698 se unen a sus antígenos objetivo con una afinidad alta similar a la del anticuerpo progenitor.

La Tabla 9 contiene una lista de los antígenos utilizados en la Prueba de Unión Directa de SOST/TN F .

La Tabla 10 contiene los datos de u nión expresados como CE50 en n M para aquellos anticuerpos y construcciones de DVD-lg analizados en la Prueba ELISA de unión directa de SOST/TN F.

TABLA 9 Antígenos utilizados en ELISA de unión directa Prueba Antígenos Desig nación del vendedor Vendedor # de catálogo SOST SOST SOST/His R&D 21 0-TA TN Fa TN Fa T N FC3/TN FSF 1 A R&D 293-VE-01 0 TABLA 10 ELISA de unión directa de SOST & TNFa de 9 construcciones de DVD con varias secuencias. orientaciones v com binaciones de enlazador ID de ID de CE50 (nM) ID de antiCE50 (nM) Enlazador Enlazador ID de CE50 ID de antiCE50 (nM) DVD-lg secuencia de de VD N- cuerpo de de antide HC de LC secuencia de (nM) de cuerpo de de anti¬ 5 VD N- terminal referencia cuerpo de VD C-terminal VD C- referencia cuerpo de terminal N-terminal referencia terminal C-terminal referencia N-terminal C-terminal SOST LK-(EK)- DVD699 0.33 AB050 0.30 HG-corto TNFa 17.76 AB017 0.14 (secuencia 2) corto SOST LK-(THR)- DVD700 0.26 AB050 0.30 HG-corto TNFa 7.76 AB017 0.14 (secuencia 2) corto SOST DVD702 2.44 AB050 0.30 H-7GP L-6GP TNFa 12.43 AB017 0.14 (secuencia 2) SOST DVD703 0.32 AB050 0.30 H-8GP L-7GP TNFa 6.91 AB017 0.14 (secuencia 2) SOST LH-N- DVD704 0.44 AB050 0.30 HH-largo TNFa 2.92 AB017 0.14 (secuencia 2) corto SOST LH-N- DVD705 0.18 AB050 0.30 HH-largo TNFa 3.33 AB017 0.14 (secuencia 2) corto SOST LH-N- DVD706 0.42 AB050 0.37 HH-corto TNFa 6.50 AB017 0.14 (secuencia 2) corto SOST LH-N- DVD707 0.4 AB050 0.37 HH-corto TNFa 3.09 AB017 0.14 (secuencia 2) largo SOST LH-N- DVD708 0.57 AB050 0.37 HH-corto TNFa 3.60 AB017 0.14 (secuencia 2) largo La u nión de todas las construcciones de DVD-lg se mantiene. Todos los dominios variables N-terminales y C-terminales de las construcciones de DVD-lg DVD699, DVD700, DVD702 , DVD703, DVD704, DVD705, DVD706, DVD707 , DVD708 se unen a sus antígenos objetivo con una afinidad alta similar a la del anticuerpo progenitor.

EJ EM PLO 1 .2.1 . B Determinación de la afinidad utilizando tecnología BIACORE La prueba BIACO RE (Biacore, I nc, Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos o DVD-lg con mediciones cinéticas de las constantes de velocidad de asociación y velocidad de disociación . La unión de los anticuerpos o DVD-lg a u n antígeno objetivo (por ejemplo, un antígeno objetivo recombinante purificado) se determina mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón de superficie con un instrumento Biacore® 1 000 o 3000 (Biacore® AB , Uppsala , Suecia) utilizando H BS-EP para corrida (HEPES 1 0 mM [pH 7.4], NaCI 1 50 mM , EDTA 3 mM , y 0.005% de agente tensoactivo P20) a 25°C. Todos los productos químicos se obtienen a partir de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de lo contrario a partir de una fuente diferente como se describe en el texto. Por ejemplo, aproximadamente 5000 U R de anticuerpo policlonal de cabra específico de fragmento anti-lgG , (Fcy) de ratón (Pierce Biotechnology Inc, Rockford , I L) diluidas en acetato de sodio 1 0 m M (pH 4.5) se inmovilizan directamente a través de un chip biosensor C 5 de grado investigación utilizando un estuche para copulación de amida estándar de conformidad con las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 pg/ml . Las porciones sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina. Se utiliza superficie de carboximetildextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4 como una superficie de reacción. El carboximetil-dextrano no modificado sin anti-lgG de ratón , de cabra , en las celdas de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión 1 : 1 de Langmuir se ajustan simultáneamente a las fases de asociación y disociación de todas las ocho inyecciones (utilizando análisis de ajuste global) con el uso del software Biaevaluation 4.0.1 . Los anticuerpos o DVD-lg purificados se diluyen en solución salina amortiguada con H EPES para captu ra a través de las superficies de reacción específicas de anti-lgG de ratón , de cabra. Los anticuerpos o DVD-lg que se van a capturar como un ligando (25 g ml) se inyectan sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 µ?/min . Las constantes de velocidad de asociación y disociación , kas 0c (M"1 S"1 ) y kdisoc (s 1) se determinan bajo una velocidad de flujo continuo de 25 µ?/min . Las constantes de velocidad se obtienen efectuando mediciones de unión cinética a concentraciones diferentes de antígeno que varían desde 1 0 - 200 n M . La constante de disociación en eq uilibrio ( ) de la reacción entre los anticuerpos o DVD-lgs y el antígeno objetivo se calcula después a partir de las constantes de velocidad cinética mediante la siguiente fórmula: KD = kdisoc/kas0c- La unión se registra como una función del tiempo y se calculan las constantes de velocidad cinética. En esta prueba se pueden medir velocidades de asociación tan rápidas como 106 M'1S"1 y velocidades de disociación tan lentas como 10"6 s"1.

TABLA 11 Análisis BIACORE de DVD-lqs de SOST v TNF Nota: "-C" indica que el enlazador de la cadena ligera diseñada ha sido tratado con cualquiera de trombina (DVD700-C) o enterocinasa (DVD699-C, DVD701-C) El corte del enlazador de la cadena ligera con cualquiera trombina (DVD700-C) o enterocinasa (DVD699-C, DVD701C) mejora la unión del dominio interior a TN F en comparación con la unión a TN F del dominio interior del enlazador no cortado DVD278 y DVD699. El enlazador obtenido a partir de la reg ión de gozne en DVD-lg 704 y DVD-lg 707 mejora la unión del dominio interior.

EJEMPLO 1 .2.2 Pruebas uti lizadas para determ i nar la actividad fu ncional de los anticuerpos progenitores y DVD-lg EJ EM PLO 1 .2.2. A: Bioensayo de citocina La capacidad de un anticuerpo progenitor anti-citocina o anti-factor de crecimiento o de una DVD-lg que contiene secuencias anti-citocina o anti-factor de crecimiento para in hibir o neutralizar u na bioactividad de citocina o una bioactividad anti-factor de crecimiento del objetivo se analiza determinando el potencial inhibidor del anticuerpo o DVD-lg . Por ejemplo, se puede utilizar la capacidad de un anticuerpo anti-I L-4 para inhibir la producción de IgE mediada por IL-4. Por ejemplo, se aislan células B de humano no afectadas por tratamiento a partir de sangre periférica , respectivamente, capas leucocíticas mediante centrifugación por densidad de Ficoll-paque, seguido por separación magnética con glóbulos MACS (Miltenyi Biotech , Bergisch Gladbach , Alemania) específicos para anticuerpos humanos F(ab)2 de cabra marcados con slgD FITC seguido por glóbulos MACS anti-F ITC. Las células no afectadas por tratamiento clasificadas mag néticamente se ajustan a 3 x 1 05 células por mi en XV15 y se siembran en 100 µ? por cavidad de placas de 96 cavidades en un arreglo 6 x 6 en el centro de la placa, rodeadas por cavidades llenas con PBS durante los 10 días de cultivo a 37°C en presencia de 5% de C02. Se prepara una placa de cada uno por anticuerpo a ser analizado, que consiste de 3 cavidades cada uno de controles no inducidos e inducidos y repeticiones por quintuplicado de titulaciones de anticuerpo comenzando en 7 ig/m\ y que se corren en dilución de 3 veces hasta concentraciones finales de 29 ng/ml agregadas en 50 µ? de predilución cuatro veces concentrada. Para inducir la producción de IgE, se agregan a cada cavidad rhlL-4 a 20 ng/ml más anticuerpo monoclonal anti-CD40 (Novartis, Basilea, Suiza) a 0.5 pg/ml de concentraciones finales en 50 µ? cada uno, y las concentraciones de IgE se determinan al final del periodo de cultivo mediante un método estándar de ELISA en emparedado.

EJEMPLO 1.2.2.B: Prueba de liberación de citocina Se analiza la capacidad de un anticuerpo progenitor o DVD-lg para ocasionar la liberación de citocina. Se extrae sangre periférica a partir de tres donadores sanos mediante perforación de la vena hacia tubos vacutainer heparinizados. Las sangre entera se diluye 1:5 con medio RPMI-1640 y se coloca en placas de cultivo de tejidos de 24 cavidades a 0.5 mi por cavidad. Los anticuerpos anti-citocina (por ejemplo, anti-IL-4) se diluyen en RPMI-1640 y se colocan en las placas a 0.5 ml/cavidad para obtener concentraciones finales de 200, 100, 50, 10, y 1 pg/ml. La dilución final de la sangre entera en las placas de cultivo es 1:10. Se agregan LPS y PHA a cavidades separadas a concentraciones finales de 2 pg/ml y 5 pg/ml como un control positivo para la liberación de citocina. Se utiliza IgG policlonal de humano como anticuerpo de control negativo. El experimento se efectúa por duplicado. Las placas se incuban a 37°C a 5% de C02. Veinticuatro horas después los contenidos de las cavidades se transfieren a tubos de ensayo y se centrifugan durante 5 minutos a 1200 rpm. Se recolectan los sobrenadantes libres de célula y se congelan para las pruebas de citocina. Las células que quedan en las placas y en los tubos se Usan con 0.5 mi de solución de lisis, y se colocan a -20°C y se descongelan. Se agregan 0.5 mi de medio (para llevar el volumen hasta el mismo nivel que el de las muestras de sobrenadante libre de célula) y las preparaciones de células se recolectan y congelan para pruebas de citocina. Los sobrenadantes libres de célula y los Usados celulares se analizan respecto a niveles de citocina mediante ELISA, por ejemplo, respecto a los niveles de IL-8, IL-6, IL-?ß, IL-1RA, o TNF-a.

EJEMPLO 1.2.2.C: Estudio de reactividad cruzada de citocina Se analiza la capacidad de un anticuerpo progenitor anti-citocina o DVD-lg dirigida contra una o unas citocinas de interés para reacción cruzada con otras citocinas. Los anticuerpos progenitores o DVD-lg se inmovilizan en una matriz de biosensor Biacore. Un mAb anti-Fc de humano se enlaza covalentemente a través de los grupos amina libres a la matriz de dextrano activando primero los grupos carboxilo en la matriz con N-hid roxisuccinimida (N HS) 100 mM y clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) 400 mM . Se inyectan aproximadamente 50 µ? de cada preparación de anticuerpo o DVD-lg a una concentración de 25 pg/ml , diluida en acetato de sodio, pH 4.5, a través del biosensor activado y las aminas libres en la proteína se unen directamente a los grupos carboxilo activados. Típicamente, se inmovilizan 5000 U nidades de Resonancia (U R's) . Los EDC-ésteres de matriz sin reaccionar se desactivan mediante una inyección de etanolamina 1 M. Se prepara una segunda celda de flujo como un patrón de referencia inmovilizando lgG1 /K de humano utilizando el estuche de copulación de amina estándar. Las mediciones de SPR se efectúan utilizando el chip de biosensor CM . Todos los antígenos que se van a analizar en la superficie del biosensor se diluyen en solución amortiguadora para corrida HBS-EP que contiene 0.01 % de P20.

Para examinar la especificidad de unión a citocina , se inyecta un exceso de la citocina de interés (1 00 n M , por ejemplo, soluble recombinante de humano) a través de la superficie del biosensor con anticuerpo progenitor o DVD-lg anti-citocina inmovilizado (tiempo de contacto 5 min utos) . Antes de la inyección de la citocina de interés e inmediatamente después de esto, la solución amortig uadora H BS-EP sola fluye a través de cada celda de flujo. Se toma la diferencia neta en las señales entre la línea basal y el punto correspondiente a aproximadamente 30 segundos después de completar la inyección de citocina para representar el valor de unión final. De nuevo, la respuesta se mide en Unidades de Resonancia. Las matrices de biosensor se regeneran utilizando HCI 10 mM antes de inyectar la siguiente muestra en caso que se observe un evento de unión, de lo contrario se inyecta solución amortiguadora para corrida a través de las matrices. Las citocinas de humano (por ejemplo, IL-1a, IL-13, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-22, IL-23, IL-27, TNF-a, TNF-ß, e IFN-?, por ejemplo) también se inyectan simultáneamente a través de la superficie de referencia con lgG1/K inmovilizada de ratón para registrar cualquier fondo de unión no específica. Mediante preparación de una superficie de referencia y una superficie de reacción, Biacore puede restar automáticamente los datos de la superficie de referencia de los datos de la superficie de reacción para eliminar la mayoría del cambio de índice de refracción y ruido de inyección. Por lo tanto, es posible establecer la respuesta de unión real atribuida a una reacción de unión de anticuerpo o DVD-lg anti-citocina.

Cuando una citocina de interés se inyecta a través de un anticuerpo anti-citocina inmovilizado, se observa unión significativa. La regeneración con HCI 10 mM elimina completamente todas las proteínas no asociadas covalentemente. El examen del sensorgrama muestra que el anticuerpo o DVD-lg anti-citocina inmovilizado que se une a la citocina soluble es fuerte y robusto. Después de confirmar el resultado esperado con la citocina de interés, se analiza el panel de citocinas humanas recombinantes remanentes, para cada anticuerpo o DVD-lg por separado. Se registra la cantidad de citocina unida o no unida a anticuerpo o DVD-lg anti-citocina para cada ciclo de inyección . Se utilizan los resultados de tres experimentos independientes para determinar el perfil de especificidad de cada anticuerpo o DVD-lg . Se seleccionan los anticuerpos o DVD-lg con la unión esperada a la citocina de interés y que no se une a ningu na otra citocina.

EJ EM PLO 1 .2.2. D: Reactividad cruzada tisular Los estudios de reactividad cruzada tisular se efectúan en tres etapas, la primera etapa incluye criosecciones de 32 tejidos, la segunda etapa incluye hasta 38 tejidos, y la tercera etapa incluye tejidos adicionales provenientes de 3 adultos no relacionados como se describe más adelante. Los estudios se hacen típicamente a dos niveles de dosis.

Etapa 1 Se fijan y secan sobre vidrio de objeto criosecciones (de aproximadamente 5 m) de tejidos humanos (32 tejidos (típicamente: glánd ula ad renal , tracto gastrointestinal , próstata, vejiga urinaria , corazón, músculo esquelético, células sangu íneas, riñon , piel , médula ósea, h ígado, médula espinal, tejido mamario, pu lmón , bazo, cerebelo, nodo linfático, testículos, corteza cerebral , ovario, timo, colon , páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uretra, ojo, pituitaria, útero, trompas de Falopio y placenta) provenientes de un donador humano obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.

Etapa 2 Se fijan y secan sobre vidrio de objeto criosecciones (de aproximadamente 5 µ? ) de tejidos humanos, 38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uretra, vejiga urinaria, y útero) provenientes de 3 adultos no relacionados obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.

Etapa 3 Se fijan y secan sobre vidrio de objeto criosecciones (de aproximadamente 5 µ??) de tejidos de mono cynomolgus (38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vaso sanguíneo, médula ósea, cerebelo, cerebro, cuello uterino, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino grueso, hígado, pulmón, nodo linfático, glándula mamaria de la mama, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salival, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uretra, vejiga urinaria, y útero) provenientes de 3 monos adultos no relacionados obtenidos en la autopsia o biopsia). Se efectúa la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, utilizando el sistema de avidina-biotina.

El anticuerpo o DVD-lg se incuba con el anti-lgG de humano secundario conjugado con biotina y se desarrolla como un complejo inmune. El complejo inmune se agrega a las concentraciones finales de 2 y 10 pg/ml de anticuerpo o DVD-lg sobre las secciones de tejido en el vidrio de objeto y después las secciones de tejido se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina), un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción del tejido. Se utilizan glóbulos de antígeno-sefarosa como secciones de tejido de control positivo. Los estudios de bloqueo de antígeno objetivo y suero humano sirven como controles adicionales. El complejo inmune a las concentraciones finales de 2 y 10 [iglm\ de anticuerpo o DVD-lg se pre-incuba con el antígeno objetivo (concentración final de 100 pg/ml) o suero humano (concentración final 10%) durante 30 minutos, y después se agrega sobre las secciones de tejido en el vidrio de objeto y después las secciones de tejido se hacen reaccionar durante 30 minutos con un estuche de avidina-biotina-peroxidasa.

Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina) , un substrato para la reacción de peroxidasa, durante 4 minutos para tinción del tejido.

Cualquier tinción específica se juzga como reactividad esperada (por ejemplo, consistente con la expresión de antígeno) o como reactividad inesperada tomando como base la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión . Cualquier tinción juzgada como específica se califica respecto a intensidad y frecuencia. La tinción de tejido entre la etapa 2 (tejido de humano) y la etapa 3 (tejido de mono cynomolgus) se juzga ya sea como similar o diferente.

EJ EM PLO 1 .2.2. E: Efecto tumoricida de un anticuerpo progenitor o de DVD-lg in vitro Los anticuerpos progenitores o DVD-lg que se unen a antígenos objetivo en células tumorales se pueden analizar respecto a la actividad tumoricida. Brevemente, los anticuerpos progenitores o DVD-lg se diluyen en D-PBS-BSA (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco con 0.1 % de BSA) y se agregan a las células de tumor humano a concentraciones finales de 0.01 pg/ml a 200 g/ml . Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera humidificada, 5% de C02 du ra nte 3 d ías. Se cuantifica el n úmero de células vivas en cada cavidad utilizando reactivos MTS de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) para determinar el por ciento de inhibición de crecimiento del tumor. Las cavidades sin tratamiento con anticuerpo se utilizan como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin células se consideran representativas de 100% de inhibición.

Para evaluación de apoptosis, se determina la activación de caspasa 3 utilizando el siguiente protocolo: se lisan células tratadas con anticuerpo en placas de 96 cavidades en 120 µ? de solución amortiguadora para lisis 1x (Hepes 1.67 mM, pH 7.4, KCI 7 mM, MgCI2 0.83 mM, EDTA 0.11 mM, EGTA 0.11 mM, 0.57% de CHAPS, DTT 1mM, tabletas de coctel de inhibidor de proteasa 1x; sin EDTA; Roche Pharmaceuticals, Nutley, NJ) a temperatura ambiente con agitación durante 20 minutos. Después de lisar las células, se agregan 80 µ? de una solución amortiguadora para reacción de caspasa-3 (Hepes 48 mM, pH 7.5, sacarosa 252 mM, 0.1% de CHAPS, DTT 4 mM, y substrato Ac-DEVD-AMC 20 µ?; Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA) y las placas se incuban durante 2 horas a 37°C. Las placas se leen en un contador 1420 VICTOR Multilabel (Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL) usando los siguientes ajustes: excitación = 360/40, emisión = 460/40. Un incremento de unidades de fluorescencia proveniente de las células tratadas con anticuerpo con relación a las células tratadas con control de anticuerpo de isotipo es indicativo de apoptosis.

EJEMPLO 1.2.2.F: Inhibición de activación del receptor mediante anticuerpos o DVD-lg in vitro Los anticuerpos progenitores o DVD-lg que se unen a los receptores de célula o sus ligandos se pueden analizar respecto a inhibición de activación del receptor. Los anticuerpos progenitores o DVD-lg diluidos en D-PBS-BSA (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco con 0.1% de BSA) se agregan a células de carcinoma humano a concentraciones finales de 0.01 pg/ml a 100 Mg/ml. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera humidificada, 5% de C02 durante 1 hora. A las células se agregan factores de crecimiento (por ejemplo, IGF1 o IGF2) a una concentración de 1-100 ng/ml durante 5-15 minutos para estimular la auto-fosforilación del receptor (por ejemplo, IGF1R). Las cavidades sin tratamiento con anticuerpo se utilizan como controles de 0% de inhibición mientras que las cavidades sin estimulación del factor de crecimiento se consideran representativas del 100% de inhibición. Los Usados celulares se preparan mediante incubación con solución amortiguadora para extracción celular (Tris 10 mM, pH 7.4, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, 1% de Tritón X-100, 10% de Glicerol, 0.1% de SDS, y coctel de inhibidor de proteasa). El fosfo-IGF1R en estos Usados celulares se determina utilizando estuches de ELISA específicos adquiridos en R&D System (Minneapolis, MN).

EJEMPLO 1.2.2.G: Eficacia de un anticuerpo o DVD-lg anti-antígeno de célula tumoral por sí mismo o en combinación con guimioterapia sobre el crecimiento de xenoiniertos de carcinoma de humano (flanco subcutáneo, ortotópico, o metástasis espontánea) Se cultivan células de cáncer de humano ¡n vitro hasta 99% de viabilidad , 85% de confluencia en matraces para cultivo de tejidos. Se marcan en la oreja y se afeitan ratones SC I D de género femenino o masculino (Charles Rivers Labs, Wilmington , MA) de 1 9-25 gramos. Los ratones se inoculan después por vía subcutánea en el flanco derecho con 1 x 106 células de tumor h uma no (matrigel 1 : 1 ) en el día 0 del estudio. La administración (IP, QD , 3x/semana) de anticuerpo o DVD-lg de control de IgG de humano, y/o qu imioterapia se inicia después que los ratones se agrupan por tamaño en grupos de ratones con volúmenes de tumor promedio de aproximadamente 200 a 320 mm3. Los tumores se miden utilizando un par de calibradores dos veces por semana comenzando aproximadamente el día 1 0 después de la inyeción de célula de tumor. Se observa reducción en el volumen del tumor en animales tratados con anticuerpo o DVD-lg solos o en combinación con quimioterapia con relación a tumores en animales que reciben solamente veh ículo o un mAb de control de isotipo.

EJ EM PLO 1 .2.2. H : U nión de anticuerpos monoclonales a la superficie de l íneas de célula de tu mor de h umano segú n se evalúa mediante citometría de flujo Se recolectan l íneas de células estables que sobre-expresan un antígeno de superficie celular de interés o líneas de célula de tumor de humano a partir de matraces de cu ltivo de tejidos y se vuelven a suspender en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 5% de suero fetal de bovino (PBS/FCS) . Antes de la tinción , las células de tumor humano se incuban en hielo con 1 00 µ? de IgG de humano a 5 pg/ml en P BS/FCS. Se incuban 1 -5 x1 05 células con anticuerpo o DVD-lg ( 1 -2 pg/ml) en PBS/FCS durante 30-60 min utos en hielo. Las células se lavan dos veces y se agregan 1 00 µ? de F(ab')2 anti-lgG de cabra, Fcy-ficoeritrina (dilución 1 :200 en PBS/BSA) (Jackson ImmunoResearch , West G rove, PA, Cat.#1 09-1 16-1 70) . Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se lavan dos veces y se vuelven a suspender en PBS/FCS. La fluorescencia se mide utilizando u n aparato Becton Dickinson FACSCalibur (Becton Dickinson , San José, CA).

EJEMPLO 1 .3 Generación de anticuerpos monoclonales progenitores para un antígeno humano de interés Los mAbs de ratón progenitores que se pueden unir a y neutralizar un antígeno humano de interés y una variante del mismo se obtienen de la siguiente manera: EJEMPLO 1 .3. A inmunización de ratones con un antígeno humano de interés Se inyectan por vía subcutánea veinte microgramos de antígeno humano purificado recombinante (por ejemplo, IG F1 .2) mezclado con coadyuvante completo de Freu nd o coadyuvante I mmunoeasy (Qiagen , Valencia , CA) en cinco ratones Balb/C , cinco ratones C57B/6, y cinco ratones AJ , de 6-8 semanas de edad en el día 1 . En los d ías 24, 38, y 49, se inyectan por vía subcutánea veinte microgramos de variante de antígeno humano purificado recombinante mezclado con coadyuvante incompleto de Freu nd o coadyuvante Immunoeasy en los mismos ratones. En el d ía 84 o el día 1 1 2 o el día 144, a los ratones se les inyecta por vía intravenosa 1 g del antígeno h umano purificado recombinante de interés.

EJEMPLO 1 .3. B Generación de hibridomas Los esplenocitos obtenidos a parti r de los ratones inmunizados descritos en el ejemplo 1 .3. A se fusionan con células SP2/0-Ag-14 a una proporción de 5: 1 de conformidad con el método establecido descrito en Kohler, G. y Milstein ( 1975) Nature, 256:495 para generar hibridomas. Los productos de la fusión se siembran en medio para selección que contiene azaserina e hipoxantina en placas de 96 cavidades a una densidad de 2.5 x 1 06 esplenocitos por cavidad. Siete a diez d ías después de la fusión , se observan colon ias de hibridoma macroscópicas. El sobrenadante proveniente de cada cavidad q ue contiene colonias de h ibridoma se analiza mediante ELISA respecto a la presencia de anticuerpo para el antígeno de interés (como se describe en el ejemplo 1 .3. A) . Los sobrenadantes que presentan actividad antígeno-específica se analizan después respecto a actividad (como se describe en las pruebas del Ejemplo 1 .2.2) , por ejemplo, la capacidad para neutralizar al antígeno de interés en un bio-ensayo tal como el que se describe en el ejemplo 1 .2.2. A).

EJ EMPLO 1 .3.C Identificación y caracterización de anticuerpos monoclonales progenitores para un antígeno objetivo humano de interés EJ EM PLO 1 .3.C.1 : Análisis de la actividad neutralizante del anticuerpo monoclonal progenitor Los sobrenadantes de hibridoma se analizan respecto a la presencia de anticuerpos progenitores que se unen a un antígeno de interés, generado de conformidad con los Ejemplos 1 .3. A y 1 .3. B, y que también se pueden unir a una variante del antígeno de interés ( "variante del antígeno") . Los sobrenadantes con anticuerpos positivos en ambas pruebas se analizan después respecto a su potencia de neutralización de antígeno, por ejemplo, en el bioensayo de citocina del Ejemplo 1 .2.2. A. Los hibridomas que producen anticuerpos con valores de CI5o en el bioensayo menores de 1000 pM , en u na modalidad , menores de 1 00 pM se escalan y se clonan mediante dilución limitante. Las células de hibridoma se expanden en medio que contiene 10% de suero fetal de bovino con bajo contenido de IgG (Hyclone #SH30151 , Logan, UT.). En promedio, se recolectan 250 mi de cada sobrenadante de hibridoma (obtenido a partir de u na población clonal) , se concentran y pu rifican mediante cromatografía por afinidad de proteína A, como se describe en Harlow, E . y Lañe, D. 1988 "Antibodies : A Laboratory Manual". La capacidad de los mAbs purificados para inhibir la actividad de su antígeno objetivo se determina, por ejemplo, utilizando el bioensayo de citocina como el descrito en el ejemplo 1 .2.2. A.

Ejemplo 1 .3. C.2 : Análisis de reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal progenitor contra el antígeno objetivo de cvnomolg us de interés Para determinar si los mAbs seleccionados descritos en la presente solicitud reconocen o no al antígeno de interés de cynomolgus, se efectúa el análisis BIACORE como se describe en la presente solicitud (ejemplo 1 .2. 1 . B) utilizando antígeno objetivo recombinante de cynomolg us. Además , también se pueden medir las potencias de neutralización de los mAbs contra el antígeno recombinante de cynomolgus de interés en el bioensayo de citocina (Ejemplo 1 .2.2. A) . Los mAbs con reactividad cruzada buena para cyno (en una modalidad, dentro de 5 veces la reactividad para antígeno humano) se seleccionan para caracterización futura.

EJEMPLO 1 .3.D Determi nación de la secuencia de am inoácido de la región variable para cada anti-anticuerpo monoclonal humano de m úrido El aislamiento de las moléculas de ADNc, la expresión y caracterización de los mAbs anti-humano, de ratón, recombinantes se conduce de la siguiente manera. Para cada determinación de secuencia de aminoácido, se aislan aproximadamente 1 x 106 células de hibridoma mediante centrifugación y se procesan para aislar el ARN total con Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se somete a síntesis de la primera cadena de ADN utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se utiliza Oligo(dT) para cebar la síntesis de la primera cadena para seleccionar respecto al ARN poli(A)+. El producto de ADNc de la primera cadena se amplifica después mediante PCR con iniciadores diseñados para amplificación de regiones variables de inmunoglobulina de múrido (Conjuntos de iniciadores para Ig (Ig-Primer Sets), Novagen, Madison, Wl). Los productos de PCR se resuelven en un gel de agarosa, se cortan, se purifican, y después se subclonan con el estuche para clonación TOPO en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transforman en E. coli químicamente competente TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La PCR de colonia se efectúa en los transformantes para identificar clones que contengan el inserto. El ADN de plásmido se aisla a partir de los clones que contienen el inserto utilizando un estuche QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Los insertos en los plásmidos se someten a determinación de secuencia en ambas cadenas para determinar las secuencias de ADN de la cadena ligera variable o cadena pesada variable utilizando los iniciadores M 1 3 sentido (forward) y M 1 3 anti-sentido (reverse) (Fermentas Life Sciences, Hanover M D). Se identifican las secuencias de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de los mAbs. En u na modalidad , los criterios de selección para un panel de mAbs l íderes para el desarrollo del siguiente paso (humanización) incluyen los siguientes: • El anticuerpo no contiene ningún sitio de glucosilación N-ligado (NXS), excepto el normal en CH2 · El anticuerpo no contiene ninguna cisteína adicional además de las cisteínas normales en cada anticuerpo • La secuencia del anticuerpo está alineada con las secuencias de línea germinal de humano más cercanas para VH y VL y cualesqu iera aminoácidos inusuales se deben inspeccionar respecto a su ocurrencia en otros anticuerpos humanos naturales • La glutamina N-terminal (Q) se cambia a ácido glutámico (E) si esto no afecta la actividad del anticuerpo. Esto puede reducir la heterogeneidad debido a cicllización de Q • El corte eficiente de la secuencia de señal se confirma mediante espectrofotometría de masas. Esto se puede hacer con material de célula COS o de célula 293 • La secuencia de la proteína se inspecciona respecto al riesgo de desamidación de Asn que pudiera dar como resultado pérdida de actividad • El anticuerpo tiene un nivel bajo de agregación • El anticuerpo tiene solubilidad >5-1 0 mg/ml (en fase de investigación) ; >25 mg/ml • El anticuerpo tiene un tamaño normal (5-6 nm) mediante dispersión de luz dinámica (DLS) • El anticuerpo tiene una heterogeneidad de carga baja • El anticuerpo carece de liberación de citocina (véase Ejemplo 1 .2.2. B) • El anticuerpo tiene especificidad para la citocina pretendida (véase Ejemplo 1 .2.2.C) • El anticuerpo carece de reactividad cruzada tisular (véase Ejemplo 1 .2.2.D) • El anticuerpo tiene similitud entre la reactividad cruzada tisular en humano y cynomolgus (véase Ejemplo 1 .2.2. D) EJEMPLO 1 .3.2 Anticuerpos progenitores humanizados recombinantes EJEMPLO 1 .3.2.1 Construcción v expresión de anticuerpos progenitores antihumano quiméricos recom binantes El ADN que codifica para la región constante de la cadena pesada de mAbs progenitores anti-humano de múrido se reemplaza por un fragmento de ADNc que codifica para la región constante de IgG 1 de humano q ue contiene 2 mutaciones de aminoácido en la región de gozne mediante recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración UE) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al , 1 991 , J . I mmunol , 147:2657). La región constante de la cadena ligera de cada u no de estos anticuerpos se reemplaza con una región constante kappa de humano. Los anticuerpos quiméricos de longitud completa se expresan en forma transitoria en células COS mediante co-transfección de los ADNc de la cadena ligera y de la cadena pesada quiméricos ligados en el plásmido de expresión pBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research 1 990, Vol 1 8 , pg 5322). Los sobrenadantes celulares que contienen anticuerpo quimérico recombinante se purifican mediante cromatografía con Proteína A-Sefarosa y el anticuerpo unido se eluye mediante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.

El ADNc de la cadena pesada que codifica para un mAb quimérico se co-transfecta con su ADNc de la cadena ligera quimérico (ambos ligados en el vector pBOS) en células COS. El sobrenadante celular que contiene el anticuerpo q uimérico recombinante se purifica mediante cromatografía con Proteína A-Sefarosa y el anticuerpo unido se eluye mediante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.

Los mAbs progenitores anti-h umano quiméricos purificados se analizan después respecto a su capacidad para unirse (mediante Biacore) y respecto a la actividad funcional , por ejemplo, para inhibir la producción de IgE inducida por citocina como se describe en los Ejemplos 1 .2.1 .B y 1 .2.2. B . Los mAbs quiméricos q ue mantienen la actividad de los mAbs de hibridoma progenitores se seleccionan para desarrollo futuro.

EJ EMPLO 1 .3.2.2 Construcción y expresión de anticuerpos progenitores anti- humano humanizados EJ EM PLO 1 .3.2.2. A: Selección de estructu ras base de anticuerpo de h umano Cada secuencia de gen de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de múrido se alinean por separado contra 44 secuencias de la cadena pesada variable de l ínea germinal o 46 secuencias de la cadena ligera variable de línea germinal de inmunoglobulina de humano (obtenidas a partir del sitio en red de Ig Blast del NCB I en http://www. ncbi . nlm . nih.gov/igblast/retrieveig . html.) utilizando el software Vector NTI .

La humanización se basa en homolog ía de secuencia de aminoácido, análisis de agrupamiento de CDR, frecuencia de uso entre los anticuerpos humanos expresados, e información disponible sobre las estructuras cristalinas de los anticuerpos humanos.

Tomando en consideración los posibles efectos sobre la unión del anticuerpo, apareamiento VH-VL, y otros factores, los residuos de múrido se mutan a residuos de humano en casos en los que los residuos de la estructura base de múrido y de humano sean diferentes, con unas cuantas excepciones. Las estrategias de humanización adicionales se diseñan tomando como base un análisis de secuencias de anticuerpo de línea germinal de h umano, o un subgrupo de las mismas, que posean un alto grado de homolog ía, es decir, similitud de secuencia , con la secuencia de aminoácido real de las regiones variables del anticuerpo de mú rido.

El modelado de homología se utiliza para identificar residuos únicos para las secuencias de anticuerpo de múrido pronosticados como críticos para la estructura del sitio de combinación del anticuerpo, las CDRs. El modelado de homolog ía es un método por computadora en el cual se generan coordenadas tridimensionales aproximadas para una proteína. La fuente de las coordenadas iniciales y el lineamiento para su refinamiento adicional es una seg unda proteína, la proteína de referencia , para la cual se conocen las coordenadas tridimensionales y cuya secuencia está relacionada con la secuencia de la primera proteína . La relación entre las secuencias de las dos proteínas se utiliza para generar una correspondencia entre la proteína de referencia y la prote ína para la cual se desean las coordenadas, la proteína objetivo. Las secuencias primarias de las proteínas de referencia y objetivo se alinean con coordenadas de porciones idénticas de las dos proteínas transferidas directamente desde la proteína de referencia hacia la proteína objetivo. Las coordenadas para las porciones no coincidentes de las dos proteínas , por ejemplo, de mutaciones, inserciones, o deleciones de residuos, se construyen a partir de plantillas estructurales genéricas y se refinan en cuanto a energ ía para asegurar la consistencia con las coordenadas del modelo ya transferidas. Esta estructura de proteína por computadora se puede refinar adicionalmente o utilizar directamente en estudios de modelado. La calidad de la estructura del modelo queda determinada por la exactitud de la contención con que las proteínas de referencia y objetivo están relacionadas y por la precisión con la cual se construye la alineación de secuencia.

Para los mAbs de múrido, se utiliza una combinación de búsqueda BLAST e inspección visual para identificar estructuras de referencia apropiadas. La identidad de secuencia de 25% entre las secuencias de aminoácido de referencia y objetivo es considerada como el mínimo necesario para intentar un ejercicio de modelado por homolog ía. Las alineaciones de secuencia se construyen manualmente y las coordenadas de modelo se generan con el programa Jackal (véase Petrey, D . et al. (2003) Proteins 53 (Supl. 6) : 430-435).

Las secuencias primarias de las regiones de estructu ra base de múrido y de humano de los anticuerpos seleccionados comparten identidad significativa. Las posiciones de residuo que difieren son candidatos para inclusión del residuo de múrido en la secuencia humanizada con el fin de retener la potencia de unión observada del anticuerpo de múrido. Se construye manualmente una lista de residuos de estructura base que difieren entre las secuencias de humano y de múrido. La Tabla 12 muestra las secuencias de estructura base elegidas para este estudio.

TABLA 12 Secuencia del dominio constante de la cadena pesada y del dominio constante de la cadena ligera de IgG de humano SEQ Secuencia Proteína ID NO 12345678901234567890123456789012345678901 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW Región NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV constante de FLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG 80 VEVHNAKT PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNG EY C hlgGl de tipo VSNKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF silvestre FLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV VPSSSLGTQTYI Región CNVNH PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPP PKDTLMISRTPEVTC VVDVSHEDPEVKFNWYVDG constante de 81 VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV hlgGl mutante SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYS LTVD SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK Región TVAAPSVFIFPPSDEQLKAGTASVVCLLNNFYPREA VQWK constante 82 VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC kappa de Ig Región QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW constante 83 KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ KSHR SYSCQVTHEGSTVE TVAPTECS Lambda de Ig La probabilidad de que un residuo de estructura base dado pueda afectar las propiedades de unión del anticuerpo depende de su proximidad a los residuos de CDR. Por lo tanto, utilizando las estructuras de modelo, los residuos que difieren entre las secuencias de múrido y de humano se clasifican de conformidad con su distancia desde cualquier átomo en las CDRs. Aquellos residuos que caen dentro de 4.5 A de cualquier átomo de CDR se identifican como los más importantes y son recomendados como candidatos para retención del residuo de múrido en el anticuerpo humanizado (es decir, mutación de retroceso).

Los anticuerpos humanizados construidos in silico se construyen utilizando oligonucleótidos. Para cada ADNc de la región variable, se diseñan 6 oligonucleótidos de 60-80 nucleótidos cada uno para que se traslapen uno al otro por 20 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3' de cada oligonucleótido. En una reacción de fijación, todos los 6 oligonucleótidos se combinan, hierven, y fijan en presencia de dNTPs. Se agrega ADN polimerasa I, fragmento largo (Klenow) (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA) para llenar los espacios de aproximadamente 40 pares de bases entre los oligonucleótidos que se traslapan. Se efectúa PCR para amplificar el gen de la región variable completo utilizando dos iniciadores más remotos que contienen secuencias colgantes complementarias al sitio de clonación múltiple en un vector pBOS modificado (Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18:17). Los productos de PCR obtenidos a partir de cada ensamble de ADNc se separan en un gel de agarosa y la banda correspondiente al tamaño de ADNc de la región variable pronosticada se corta y se purifica. La región pesada variable se inserta en marco en un fragmento de ADNc que codifica para la región constante de lgG 1 de humano que contiene 2 mutaciones de aminoácido en la región de gozne mediante recombinación homologa en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración U E) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lu nd et al . (1991 ) J . Immu nol. 147 :2657) . La región de la cadena ligera variable se inserta en marco con la región constante kappa de h umano mediante recombinación homologa. Las colonias bacterianas se a islan y se extrae el ADN de plásmido. Los insertos de ADNc se someten a determinación de secuencia en su totalidad . Las cadenas pesada y ligera humanizadas correctas correspondientes a cada anticuerpo se co-transfectan en células COS para producir en forma transitoria anticuerpos anti-humano humanizados de longitud completa . Los sobrenadantes celulares que contienen el anticuerpo quimérico recombinante se purifican mediante cromatografía de proteína A-sefarosa y el anticuerpo unido se eluye med iante adición de solución amortiguadora ácida. Los anticuerpos se neutralizan y dializan en PBS.

EJEMPLO 1 .3.2.3 Caracterización de anticuerpos humanizados La capacidad de los anticuerpos humanizados purificados para in hibir una actividad funcional se determina, por ejemplo, utilizando el bioensayo para citocina como el descrito en los Ejemplos 1 .2.2. A. Las afinidades de unión de los anticuerpos humanizados para antígeno humano recombinante se determinan utilizando medición de resonancia de plasmón de superficie (Biacore®) como se describe en el ejemplo 1 .2.1 . B . Se clasifican los valores de Cl50 de los bioensayos y la afinidad de los anticuerpos humanizados. Los mAbs humanizados que mantienen completamente la actividad de los mAbs de hibridoma progenitor se selecciona n como candidatos para desarrollo futuro. Los mejores 2-3 mAbs humanizados más favorables se caracterizan adicionalmente.

EJEM PLO 1 .3.2.3. A. Análisis farmacocinético de anticuerpos humanizados Se efectúan estudios farmacocinéticos en ratas Sprague-Dawley y monos cynomolgus. Las ratas y los monos cynomolgus de ambos géneros se dosifican por vía intravenosa o por vía subcutánea con una sola dosis de 4 mg/kg de mAb y las muestras se analizan utilizando ELISA para captura de antígeno, y los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante análisis no compartimental. Brevemente, se revisten placas ELISA con anticuerpo anti-biotina , de cabra , (5 mg/ml, 4°C, durante la noche) , se bloquean con Superblock (Pierce) , y se incuban con antígeno de humano conjugado con biotina a 50 ng/ml en TTBS con 1 0% de Superblock a temperatura ambiente durante 2 horas. Las muestras de suero se diluyen en serie (0.5% de suero, 1 0% de Superblock en TTBS) y se incuban en la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección se lleva a cabo con anticuerpo anti-humano, de cabra, marcado con H RP y las concentraciones se determinan con ayuda de cu rvas patrón utilizando el ajuste log ístico de cuatro parámetros. Los valores para los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante modelo no compartimental utilizando el software Win Nonlin (Pharsig ht Corporation , Mountain View, CA). Se seleccionan los mAbs humanizados con buen perfil farmacocinético (T1 /2 es 8-1 3 d ías o mejor, con baja depuración y excelente biodisponibilidad 50-1 00%) .

EJ EM PLO 1 .3.2.3.B: Análisis fisicoqu ímico v de estabilidad in vitro de anticuerpos monoclonales h umanizados Cromatografía por exclusión de tamaños Los anticuerpos se diluyen hasta 2.5 mg/ml con agua y se analizan 20 mi en un sistema de H PLC Shimadzu utilizando una columna G3000 SWXL de gel de TSK (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k). Las muestras se eluyen de la columna con sulfato de sodio 21 1 mM , fosfato de sodio 92 mM , pH 7.0, a una velocidad de flujo de 0.3 ml/minutos. Las condiciones de operación del sistema de H PLC son las siguientes: Fase móvil: Na2S04 21 1 mM , Na2H PGv7H20 92 mM , pH 7.0 Gradiente: Isocrático Velocidad de flujo: 0.3 ml/min uto Longitud de onda del detector: 280 nm Temperatura del enfriador del auto-muestrador: 4°C Temperatura de horno de la columna: Ambiente Tiempo de corrida: 50 minutos Las Tablas 1 3 y 14 contienen datos de pureza de los anticuerpos progenitores y de las construcciones de DVD-lg expresados como monómero en por ciento (proteína no agregada del peso molecular esperado) según se determina mediante el protocolo anterior.

TABLA 1 3 Pureza de las construcciones de DVD-lg según se determi na mediante cromatografía por exclusión de tamaño (N RP1 . VEGR DVD695 y DVD696 muestran perfil SEC excelente >90% de monómero. Este perfil de DVD-lg es similar al observado para los anticuerpos progenitores.

TABLA 14 Pureza de las construcciones de DVD-lg según se determ ina mediante cromatografía por exclusión de tamaño DVD699 , DVD700 y DVD701 muestran un perfil SEC excelente en el que la mayoría de DVD-lg muestra >90% de monómero. Este perfil de DVD-lg es similar al observado para los anticuerpos progenitores.

SDS-PAGE Los anticuerpos se analizan mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAG E) bajo condiciones tanto reductoras como no red uctoras. Se utiliza Adalimumab lote AFP04C como un control . Para las condiciones red uctoras, las muestras se mezclan 1 : 1 con 2X solución amortiguadora para muestra de tris glicina SDS-PAG E (Invitrogen , cat# LC2676, lote# 1 323208) con DTT 1 00 mlvl , y se calientan a 60°C durante 30 minutos. Para las condiciones no reductoras, las muestras se mezclan 1:1 con solución amortiguadora para muestra y se calientan a 100°C durante 5 minutos. Las muestras reducidas (10 mg por carril) se cargan en un gel de tris-glicina al 12% pre-vaciado (Invitrogen, cat# EC6005box, lote# 6111021), y las muestras no reducidas (10 mg por carril) se cargan en un gel de tris-glicina al 8%-16% pre-vaciado (Invitrogen, cat# EC6045box, lote# 6111021). Se utiliza SeeBlue Plus 2 (Invitrogen, cat#LC5925, lote# 1351542) como un marcador de peso molecular. Los geles se corren en una caja de gel de minicelda XCell SureLock (Invitrogen, cat# EI0001) y las proteínas se separan aplicando primero un voltaje de 75 para apilar las muestras en el gel, seguido por un voltaje constante de 125 hasta que el frente del colorante alcance el fondo del gel. La solución amortiguadora para corrida utilizada es solución amortiguadora 1X tris glicina SDS, que se prepara a partir de una solución amortiguadora 10X de tris glicina SDS (ABC, MPS-79-080106)). Los geles se tiñen durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destiñen con agua Milli-Q hasta que el fondo sea claro. Los geles teñidos se barren después utilizando un Escudriñador de Expresión Epson (modelo 1680, No. de serie DASX003641).

Análisis de velocidad de sedimentación Los anticuerpos se cargan en la cámara de muestra de cada una de tres piezas centrales epon de carbono de dos sectores estándar. Estas piezas centrales tienen una longitud de trayectoria óptica de 1 .2 cm y están construidas con ventanas de zafiro. Se utiliza PBS para una solución amortiguadora de referencia y cada cámara contiene 140 µ?. Todas las muestras se examinan simultáneamente utilizando un rotor de 4 agujeros (AN-60TÍ) en u na ultracentrífuga analítica ProteomeLab XL-1 de Beckman (serie # PL106C01 ) .

Se programan las condiciones de corrida y el control de la centrifuga se efectúa utilizando ProteomeLab (v5.6). Se deja que las muestras y el rotor se equilibren térmicamente durante una hora antes del análisis (20.0 ± 0.1 °C). La confirmación de la carga apropiada de la celda se efectúa a 3000 rpm y se registra un solo barrido para cada celda . Las condiciones de velocidad de sedimentación son las siguientes: Volumen de la celda de muestra: 420 mi Volumen de la celda de referencia: 420 mi Temperatura: 20°C Velocidad del rotor: 35,000 rpm Tiempo: 8:00 horas Longitud de onda UV: 280 nm Tamaño del incremento radial : 0.003 cm Recolección de datos: Un pu nto de dato por incremento sin promediar la señal.

N úmero total de barridos: 1 00 Medición del peso molecular de anticuerpos intactos con LC-MS Se analiza el peso molecular de los anticuerpos intactos mediante LC-MS. Cada anticuerpo se diluye hasta aproximadamente 1 mg/ml con agua. Se utiliza u n sistema de H PLC 1 1 00 (Agilent) con una micro-trampa para proteína (M ichrom Bioresources , I nc, cat# 004/251 09/03) para desalar e introducir 5 mg de la muestra en un espectrómetro de masas API Qstar pulsar i (Applied Biosystems) . Se utiliza un gradiente corto para eluir las muestras. El g radiente se corre con la fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en ag ua g rado HPLC) y la fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masas se hace fu ncionar a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con un intervalo de barrido de relación masa a carga de 2000 a 3500.

Medición del peso molecular de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con LC-MS La medición del peso molecular de la cadena ligera (LC), cadena pesada (HC) y HC desglucosilada del anticuerpo se analizan mediante LC-MS. El anticuerpo se diluye hasta 1 mg/ml con agua y la muestra se reduce para LC y HC con una concentración final de DTT 10 mM durante 30 minutos a 37°C . Para desglucosilar el anticuerpo, 100 mg del anticuerpo se incuban con 2 mi de PNGasa F, 5 mi de N-octilglucósido al 1 0% en u n volumen total de 1 00 mi du rante la noche a 37°C. Después de la desglucosilación la muestra se reduce con una concentración final de DTT 10 mM durante 30 minutos a 37°C. Se utiliza un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna C4 (Vydac, cat# 214TP5115, No. de serie 060206537204069) para desalar e introducir la muestra (5 mg) en un espectrómetro de masas API Qstar pulsar i (Applied Biosystems). Se utiliza un gradiente corto para eluir la muestra. El gradiente se corre con la fase móvil A (0.08% de FA, 0.02% de TFA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.08% de FA y 0.02% de TFA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masas se hace funcionar a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios con un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 3500.

Mapeo de péptido El anticuerpo se desnaturaliza durante 15 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de clorhidrato de guanidina 6 M en bicarbonato de amonio 75 mM. Las muestras desnaturalizadas se reducen con una concentración final de DTT 10 mM a 37°C durante 60 minutos, seguido por alquilación con ácido yodoacético 50 mM (IAA) en la oscuridad a 37°C durante 30 minutos. Después de la alquilación, la muestra se dializa durante la noche contra cuatro litros de bicarbonato de amonio 10 mM a 4°C. La muestra dializada se diluye hasta 1 mg/ml con bicarbonato de amonio 10 mM, pH 7.8 y 100 mg de anticuerpo se digieren ya sea con tripsina (Promega, cat# V5111) o Lys-C (Roche, cat# 11 047 825 001) a una relación 1 :20 (p/p) de tripsina/Lys-C:anticuerpo a 37°C durante 4 horas. Las digestiones se detienen con 1 mi de HCI 1 N . Para el mapeo de péptido con detección de espectrómetro de masas, 40 mi de los digeridos se separan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RPHPLC) en una columna C 18 (Vydac, cat# 218TP51 , No. de serie N E9606 1 0.3.5) con u n sistema de H PLC Agilent 1 100. La separación de péptido se corre con un gradiente utilizando la fase móvil A (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado H PLC) y la fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a una velocidad de flujo de 50 ml/minuto. El espectrómetro de masas AP I QSTAR Pulsar i se hace funcionar en modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 2500.

Mapeo del puente de disulfuro Para desnaturalizar el anticuerpo , se mezclan 1 00 mi del anticuerpo con 300 mi de clorhidrato de guanidina 8 M en bicarbonato de amonio 100 mM . El pH se inspecciona para asegu rar que éste esté entre 7 y 8 y las muestras se desnaturalizan du rante 1 5 minutos a temperatu ra ambiente en una concentración final de clorhid rato de guanidina 6 M . Una porción de la muestra desnaturalizada ( 100 mi) se diluye a 600 mi con agua Milli-Q para obtener una concentración final de clorhidrato de guanidina de 1 M . La muestra (220 mg) se digiere ya sea con tripsina (Promega, cat # V51 1 1 , lote# 22265901 ) o Lys-C (Roche, cat# 1 1 047825001 , lote# 12808000) a relaciones de 1 :50 de tripsina o 1 :50 de Lys-C :anticuerpo (p/p) (4.4 mg de enzima:220 mg de muestra) a 37°C durante aproximadamente 16 horas. Se agregan 5 mg adicionales de tripsina o Lys-C a las muestras y la digestión se deja continuar du rante 2 horas adicionales a 37°C. Las digestiones se detienen agregando 1 mi de TFA a cada muestra . Las muestras digeridas se separan mediante RPH PLC utilizando una columna C18 (Vydac, cat# 218TP51 No. de serie NE020630-4-1 A) en un sistema de H PLC Agilent. La separación se corre con el mismo g radiente utilizado para el mapeo de péptido utilizando la fase móvil A (0.02% de TFA y 0.08% de FA en agua grado HPLC) y la fase móvil B (0.02% de TFA y 0.08% de FA en acetonitrilo) a u na velocidad de flujo de 50 ml/minuto. Las condiciones de operación de H PLC son las mismas que aq uellas utilizadas para el mapeo de péptido. El espectrómetro de masas AP I QSTAR Pulsar i se hace funcionar en modo positivo a un voltaje de aspersión de 4.5 kvoltios y un intervalo de barrido de relación masa a carga de 800 a 2500. Los puentes de disulfuro se asignan comparando los pesos moleculares observados de los péptidos con los pesos moleculares pronosticados de los péptidos trípticos o Lys-C ligados mediante puentes de disulfu ro.

Determi nación de sulfhidrilo libre El método utilizado para cuantificar las cisteínas libres en un anticuerpo se basa en la reacción del reactivo de Ellman , 5, 50-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTN B), con los grupos sulfhidrilo (SH) lo cual da origen a un prod ucto cromofórico característico, 5-tio-(ácido 2-nitrobenzoico) (TN B). La reacción se ilustra en la fórmula: DTN B + RSH ® RS-TN B + TN B- + H + La absorbancia del TN B- se mide a 412 nm utilizando un espectrofotómetro Cary 50. Se gráfica una curva de absorbancia utilizando diluciones de 2 mercaptoetanol (b-ME) como el patrón de referencia de SH libre y las concentraciones de los g rupos sulfhid rilo libres en la proteína se determinan a partir de la absorbancia de la muestra a 412 nm .

La solución de reserva del patrón de referencia b-M E se prepara mediante una dilución en serie de b-M E 14.2 M con ag ua grado HPLC hasta una concentración final de 0.142 m M. Después se preparan patrones de referencia por triplicado para cada concentración . El anticuerpo se concentra hasta 10 mg/ml utilizando un filtro de centrífuga amicon ultra 10,000 MWCO (Millipore, cat# UFC801 096, lote# L3KN5251 ) y la solución amortiguadora se cambia a la solución amortiguadora de formulación utilizada para adalimumab (fosfato de sodio monobásico 5.57 mM , fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 1 06.69 mM, citrato de sodio 1 .07 mM , ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM , pH 5.2, 0.1 % (p/v) de Tween). Las muestras se mezclan en una agitadora a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después se agregan 1 80 mi de solución amortiguadora Tris 1 00 m M , pH 8.1 a cada muestra y patrón de referencia seg uido por la adición de 300 mi de DTN B 2 mM en solución amortiguadora de fosfato 10 mM , pH 8.1 . Después de mezclado minucioso, las muestras y los patrones de referencia se miden respecto a absorción a 41 2 nm en un espectrofotómetro Cary 50. La curva patrón se obtiene graficando la cantidad de SH libre y la D0 12 nm de los patrones de referencia de b-M E. El contenido de SH libre de las muestras se calcula tomando como base esta cu rva después de restar el testigo.

Cromatog rafía de intercambio catiónico débil El anticuerpo se diluye hasta 1 mg/ml con fosfato de sodio 1 0 mM , pH 6.0. La heterogeneidad de carga se analiza utilizando un sistema de H PLC Shimadzu con u na columna anal ítica WCX-10 ProPac (Dionex, cat# 054993, No. de serie 02722) . Las muestras se cargan en la columna en 80% de la fase móvil A (fosfato de sodio 10 mM , pH 6.0) y 20% de la fase móvil B (fosfato de sod io 1 0 mM , NaCI 500 mM , pH 6.0) y se eluyen a una velocidad de flujo de 1 .0 ml/minuto.

Determinación del perfil de oliqosacárido Los oligosacáridos liberados después del tratamiento del anticuerpo con PNGasa F se convierten en derivados con el reactivo para marcación 2-aminobenzamida (2-AB) . Los oligosacáridos con marca fluorescente se separan mediante cromatografía líq uida de alto rendimiento de fase normal (N PH PLC) y las diferentes formas de los oligosacáridos se caracterizan tomando como base la comparación del tiempo de retención con patrones de referencia conocidos.

El anticuerpo se digiere primero con PNGasa F para cortar los oligosacáridos N-ligados de la porción Fe de la cadena pesada. El anticuerpo (200 mg) se coloca en u n tubo de Eppendorf de 500 mi junto con 2 mi de PNGasa F y 3 mi de N-octilglucósido al 1 0% . Se agrega solución salina amortiguada con fosfato para llevar el volumen final a 60 mi. La m uestra se incuba d urante la noche a 37°C en un aparato termomixer de Eppendorf ajustado a 700 RPM . Adalimumab lote AFP04C también se digiere con PNGasa F como un control .

Después del tratamiento con PNGasa F, las muestras se incuban a 95°C d urante 5 minutos en un termomixer Eppendorf ajustado a 750 RPM para precipitar las proteínas, después las muestras se colocan en una centrífuga Eppendorf d urante 2 minutos a 10 ,000 RPM para centrifugar las proteínas precipitadas. El sobrenadante que contiene los oligosacáridos se transfiere a u n tubo Eppendorf de 500 mi y se seca en un aparato speed-vac a 65°C.

Los oligosacáridos se marcan con 2AB utilizando un estuche para marcación con 2AB adquirido de Prozyme (cat# G KK-404, lote# 1 32026) . El reactivo para marcación se prepara de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se agrega ácido acético (1 50 mi, provisto en el estuche) al frasco de DMSO (provisto en el estuche) y se mezcla pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces. La mezcla de ácido acético/DMSO (1 00 mi) se transfiere a u n frasco del colorante 2-AB (j usto antes de utilizar) y se mezcla hasta que el colorante se disuelva completamente. La solución del colorante se agrega después a un frasco de agente red uctor (provisto en el estuche) y se mezcla bien (reactivo para marcación) . El reactivo para marcación (5 mi) se agrega a cada frasco de muestra de oligosacárido seco, y se mezcla minuciosamente. Los frascos de reacción se colocan en un termomixer Eppendorf ajustado a 65°C y 700-800 RPM durante 2 horas de reacción .

Después de la reacción de marcado, se retira el exceso de colorante fluorescente utilizando cartuchos GlycoClean S de Prozyme (cat# GKI-4726) . Antes de agregar las muestras, los cartuchos se lavan con 1 mi de ag ua milli-Q seguido con 5 ishes de 1 mi de solución de ácido acético al 30% . J usto antes de agregar las muestras, se agrega 1 mi de acetonitrilo (Burdick y Jackson , cat# AH01 5-4) a los cartuchos.

Después que todo el aceton itrilo pasa a través del cartucho, la muestra se aplica de manera pu ntiforme en el centro del disco recién lavado y se permite que se adsorba en el disco durante 10 minutos. El disco se lava con 1 mi de acetonitrilo seguido por cinco ishes de 1 mi de acetonitrilo al 96%. Los cartuchos se colocan sobre u n tubo de Eppendorf de 1 .5 mi y los oligosacáridos marcados con 2-AB se eluyen con 3 ishes (400 m i cada ish) de agua milli Q .

Los oligosacáridos se separan utilizando una columna Glycosep N H PLC (cat# G KI-4728) conectada a un sistema de H PLC Shimadzu . El sistema de H PLC Shimadzu consiste de un controlador del sistema, desgasificador, bombas binarias, auto-muestreador con un enfriador de muestra, y un detector fluorescente.

Estabilidad a temperaturas elevadas La solución amortiguadora de anticuerpo puede ser fosfato de sodio monobásico 5.57 mM, fosfato de sodio dibásico 8.69 mM, NaCI 106.69 mM, citrato de sodio 1.07 mM, ácido cítrico 6.45 mM, manitol 66.68 mM, 0.1% (p/v) de Tween, pH 5.2; o histidina 10 mM, metionina 10 mM, 4% de manitol, pH 5.9 utilizando filtros de ultracentrífuga Amicon. La concentración final de los anticuerpos se ajusta a 2 mg/ml con las soluciones amortiguadoras apropiadas. Las soluciones de anticuerpo después se esterilizan por filtración y se preparan alícuotas de 0.25 mi bajo condiciones estériles. Las alícuotas se dejan ya sea a -80°C, 5°C, 25°C, o 40°C durante 1, 2 o 3 semanas. Al final del periodo de incubación, las muestras se analizan mediante cromatografía por exclusión de tamaño y SDS-PAGE.

Las muestras para estabilidad se analizan mediante SDS-PAGE bajo condiciones tanto reductores como no reductoras. El procedimiento utilizado es el mismo que el descrito en la presente solicitud. Los geles se tiñen durante la noche con tinción azul coloidal (Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016) y se destinen con agua Milli-Q hasta que el fondo sea claro. Los geles teñidos después se barren utilizando un Escudriñador de Expresión Epson (modelo 1680, No. de serie DASX003641). Para obtener más sensibilidad, los mismos geles se tiñen con plata utilizando el estuche para tinción con plata (Owl Scientific) y se utilizan los procedimientos recomendados suministrados por el fabricante.

EJEMPLO 1 .3.2.3.C Eficacia de un anticuerpo monoclonal humanizado por sí m ismo o en com binación con quimioterapia sobre el crecimiento de xenoiniertos de carcinoma de humano Se cultivan células de cáncer de humano in vitro hasta 99% de viabilidad , 85% de confluencia en matraces para cultivo de tejidos. Se marcan en la oreja y se afeitan ratones SC I D de género femenino o masculino (Charles Rivers Labs) de 1 9-25 gramos. Los ratones después se inoculan por vía subcutánea en el flanco derecho con 0.2 mi de 2 x 1 06 células de tumor humano (matrigel 1 : 1 ) en el d ía 0 del estudio. La administración (I P, Q3D/semana) de veh ículo (PBS) , anticuerpo humanizado, y/o q uimioterapia se inicia después que lo ratones se agrupan por tamaño en jaulas separadas de ratones con volúmenes de tumor promedio de aproximadamente 1 50 a 200 mm3. Los tumores se miden utilizando un par de calibradores dos veces por semana comenzando aproximadamente el d ía 1 0 después de la inoculación y los volúmenes de tumor se calculan de conformidad con la fórmula V = L x W2/2 (V: volumen , mm3; L: longitud , mm, W: anchura, mm). Se observa reducción en el volumen del tumor en animales tratados con mAb sólo o en combinación con quimioterapia con relación a tumores en animales q ue reciben solamente vehículo o un mAb de control de isotipo.

Example 1.3.2.3.D Prueba de citotoxicidad redirigida (rCTL) basada en FACS Se aislan células T CD3+ de humano a partir de células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) aisladas previamente congeladas mediante una columna para enriquecimiento por selección negativa (R&D Systems, Minneapolis, MN; Cat. # HTCC-525). Las célulsa T se estimulan durante 4 días en matraces (tapa con ventila, Corning, Acton, MA) revestidas con 10 mg/ml de anti-CD3 (OKT-3, eBioscience, Inc., San Diego, CA) y 2 ig/ml de anti-CD28 (CD28.2, eBioscience, Inc., San Diego, CA) en D-PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cultivan en 30 U/ml de IL-2 (Roche) en medio RPMI 1640 completo (Invitrogen, Carlsbad, CA) con L-glutamina, á-ME 55mM, Pen/Estrep, 10% de FBS). Las células T después se dejan reposar durante la noche en 30 U/ml de IL-2 antes de utilizarlas en la prueba. Las células objetivo DoHH2 o Raji se marcan con PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se utiliza medio RPMI 1640 (sin fenol, Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene L-glutamina y 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT) a través de toda la prueba de rCTL. (Véase Dreier et al. (2002) Int J Cáncer 100:690).

Las células T efectoras (E) y objetivo (T) se siembran a una concentración final de células de 105 y 104 células/cavidad en placas de 96 cavidades (Costar #3799, Acton, A), respectivamente para dar una relación E:T de 10:1. Las moléculas de DVD-lg se diluyen para obtener las curvas de titulación dependientes de la concentración. Después de una incubación durante la noche las células se convierten en comprimidos con D-PBS una vez antes de volver a supender en solución amortiguadora para FACS que contiene 0.1% de BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1% de azida de sodio y 0.5 ig/ml de yoduro de propidio (BD) en D-PBS. Los datos de FACS se recolectan en una máquina FACS Canto II (Becton Dickinson, San José, CA) y se analizan en Flowjo (Treestar). Se calcula el por ciento de objetivos vivos en las muestras tratadas con DVD-lg dividido entre el por ciento de objetivos totales (control, sin tratamiento) para determinar el por ciento de lisis específica. Las CI50s se calculan en Prism (Graphpad).

La DVD-lg CD3/CD19 (IDs de secuencia de AB, AB002 + AB006; Ejemplo 2.7) se analiza en la prueba de toxicidad redirigida respecto a aniquilación de célula de tumor. Esta DVD-lg muestra aniquilación de tumor in vitro con una CI50 = 5.0 pM Una DVD-lg CD3/CD20 también se analiza respecto a toxicidad redirigida y muestra aniquilación de tumor in vitro con una CI50 = 325pM. La secuencia de esta DVD-lg CD3/CD20 se describe en la Solicitud de patente E.U.A. No. de Serie 20070071675.

EJEMPLO 1 .4 Generación de una DVD-lg Se construyen moléculas de DVD-lg que pueden ligar a dos antígenos utilizando dos anticuerpos monoclonales progenitores, uno contra el antígeno A de humano, y el otro contra el antígeno B de humano, seleccionados como se describe en la presente solicitud .

EJEM PLO 1 .4.1 Generación de una DVD-lg que tiene dos longitudes de enlazador Se utiliza una región constante que contiene ?1 Fe con mutaciones en 234 , y 235 para eliminar las funciones efectoras de ADCC/C DC . Se generan cuatro construcciones diferentes de DVD-lg anti-A/B: 2 con en lazador corto y 2 con enlazador largo, cada una en dos orientaciones de dominio diferentes: VA-VB-C y VB-VA-C (véase Tabla 1 5). Las secuencias de enlazador, obtenidas a partir de la secuencia N-terminal del dominio C1 /Ck o CH 1 de humano, son las siguientes: Para construcciones DVDAB: cadena ligera (si anti-A tiene ?) : Enlazador corto: QPKAAP (SEQ I D NO: 15) ; Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ I D NO : 1 6) cadena ligera (si anti-A tiene ?) : Enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO: 21); Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) Para construcciones DVDBA: cadena ligera (si anti-B tiene ?): Enlazador corto: QPKAAP (SEQ ID NO: 15); Enlazador largo: QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16) cadena ligera (si anti-B tiene ): Enlazador corto: TVAAP (SEQ ID NO: 13); Enlazador largo: TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) cadena pesada (?1): Enlazador corto: ASTKGP (SEQ ID NO .21 ); Enlazador largo: ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22).

Las construcciones de la cadena pesada y la cadena ligera se subclonan en el vector de expresión pBOS, y se expresan en células COS, seguido por purificación mediante cromatografía con Proteína A. Los materiales purificados se someten a análisis de SDS-PAGE y SEC.

La siguiente Tabla 15 describe las construcciones de la cadena pesada y la cadena ligera utilizadas para expresar cada proteína de DVD-lg anti-A/B.

TABLA 1 5 Construcciones de DVD-lq Anti-A/B EJEMPLO 1 .4.2 Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDABSL y DVDABLL Para generar las construcciones DVDABHC-LL y DVDABHC-SL de la cadena pesada, se amplifica un dominio VH del anticuerpo A mediante PC R utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente) ; mientras tanto el dominio VH del anticuerpo B se amplifica utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' q ue contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente) . Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PC R. Los dos productos de PCR se purifican en gel , y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCyl ,?,???-a (Abbott) digerido dos veces con Srf I y Sal I utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.

Para generar las construcciones DVDABLC-LL y DVDABLC-SL de la cadena ligera, se amplifica el dominio VL del anticuerpo A mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VL del anticuerpo B se amplifica utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 5' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente). Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con técnicas y procedimientos estándar para PCR. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCk (Abbott) digerido dos veces con Srf I y Not I utilizando estrategia de recombinación homologa estándar. Se ha utilizado una estrategia similar para generar DVDBASL y DVDBALL como se describe más adelante: EJEMPLO 1.4.3 Clonación molecular de construcciones de ADN para DVDBASL y DVDBALL Para generar las construcciones DVDBAHC-LL y DVDBAHC-SL de la cadena pesada, se amplifica el dominio VH del anticuerpo B mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VH del anticuerpo A se amplifica utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 5' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente) . Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con las técnicas y procedimientos estándar para PC R. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan juntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCyl ,z, non-a doblemente digerido con Srf I y Sal I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.

Para generar las construcciones DVDBALC-LL y DVDBALC-SL de la cadena ligera , se amplifica el dominio VL del anticuerpo B mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente); mientras tanto el dominio VL del anticuerpo A se amplifica utilizando iniciadores específicos (iniciadores 5' q ue contienen secuencia lineal corta/larga para las construcciones SL/LL, respectivamente) . Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con las técnicas y procedimientos estándar para PC R. Los dos productos de PCR se purifican en gel, y se utilizan ju ntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente utilizando condiciones estándar de PCR. Los productos de PC R de traslape se subclonan en el vector de expresión mam ífero pBOS-hCk doblemente digerido con Srf I y Not I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.

EJEMPLO 1 .4.4 Construcción y expresión de DVD-lq adicional Ejem plo 1 .4.4.1 Preparación de construcciones de vector de DVD-lq Las secuencias de aminoácido de anticuerpo progenitor para anticuerpos específicos, los cuales reconocen antígenos específicos o epítopes de los mismos, para incorporación en una DVD-lg se pueden obtener mediante preparación de hibridomas como se describió anteriormente o se pueden obtener mediante determinación de secuencia de proteínas o ácidos nucleicos de anticuerpo conocidos. Además, se pueden obtener secuencias conocidas a partir de la literatura. Las secuencias se pueden utilizar para sintetizar ácidos nucleicos utilizando tecnolog ías estándar de síntesis o amplificación de ADN y ensamblando los fragmentos de anticuerpo deseados en vectores de expresión , utilizando tecnolog ía de ADN recombinante estándar, para expresión en células.

Por ejemplo, los codones de ácido nucleico fueron determinados a partir de secuencias de aminoácidos y el ADN de oligonucleótido fue sintetizado por Blue Heron Biotechnology, Inc. (www.blueheronbio.com) Bothell, WA E.U.A. Los oligonucleótidos se ensamblan en fragmentos de ADN de doble cadena de 300-2,000 pares de bases, se clonan en un vector de plásmido y se confirma la secuencia. Los fragmentos clonados se ensamblan utilizando un proceso enzimático para producir el gen completo y se subclonan en un vector de expresión. (Véase 7,306,914; 7,297,541; 7,279,159; 7,150,969; 20080115243; 20080102475; 20080081379; 20080075690; 20080063780; 20080050506; 20080038777; 20080022422; 20070289033; 20070287170; 20070254338; 20070243194; 20070225227; 20070207171; 20070150976; 20070135620; 20070128190; 20070104722; 20070092484; 20070037196; 20070028321; 20060172404; 20060162026; 20060153791; 20030215458; 20030157643).

Se utiliza un grupo de vectores pHybE (Solicitud de Patente E.U.A. No. de Serie 61/021,282) para clonación de anticuerpo progenitor y DVD-lg. Se utiliza V1, obtenido a partir de pJP183; pHybE-hCgl ,z, non-a V2, para clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo y DVD con una región constante de tipo silvestre. Se utiliza V2, obtenido a partir de pJP191; pHybE-hCk V2, para clonación de las cadenas ligeras del anticuerpo y DVD con una región constante kappa. Se utiliza V3, obtenido a partir de pJP192; pHybE-hC1 V2, para clonación de las cadenas ligeras del anticuerpo y los DVDs con una región constante lambda . Se utiliza V4, construido con un péptido de señal lambda y una región constante kappa , para clonación de las cadenas ligeras del DVD con un dominio V h íbrido lambda-kappa . Se utiliza V5, construido con un péptido de señal kappa y una región constante lambda, para clonación de las cadenas ligeras de DVD con un dominio V h íbrido kappa-lambda. Se utiliza V7, obtenido a partir de pJ P 1 83; pHybE-hCg l ,z, non-a V2, para clonación de las cadenas pesadas del anticuerpo y DVD con una región constante mutante (234,235 AA).

Con referencia a la Tabla 1 6, se utilizan u n número de vectores en la clonación de las cadenas VH y VL de los anticuerpos progenitores y DVD-lg .

TABLA 1 6 Vectores utilizados para clonar anticuerpos progenitores y DVD- Igs I D Vector de la cadena Vector de la cadena pesada ligera DVD050 V1 V2 DVD695 V1 V2 DVD695-C V1 V2 DVD696 V1 V2 DVD696-C V1 V2 DVD697 V1 V2 DVD698 V1 V2 DVD278 V1 V2 DVD699 V1 V2 DVD699-C V1 V2 TABLA 16 (cont.) EJEMPLO 1.4.4.2 Transfección y expresión en células 293 Las construcciones de vector de DVD-lg se transfectan en células 293 para producción de la proteína de DVD-lg. El procedimiento de transfección transitorio 293 utilizado es una modificación de los métodos publicados en Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2):E9 y Pham et al. (2005) Biotech. Bioengineering 90(3):332-44. Los reactivos que se utilizan en la transfección incluyen: • células HEK 293-6E (línea de célula de riñon embrionario de humano que expresa establemente a EBNA1; obtenidas a partir del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (National Research Council Canadá)) cultivadas en matraces Erlenmeyer desechables en una incubadora humidificada ajustada a 130 rpm, 37°C y 5% de C02.

• Medio de cultivo: Medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen 12338-018) más 25 pg/ml de Geneticina (G418) (Invitrogen 10131-027) y 0.1% de Pluronic F-68 (Invitrogen 24040-032).

• Medio de transfección: Medio de expresión FreeStyle 293 más HEPES 10 mM (Invitrogen 15630-080).

• Solución de reserva de polietilenimina (PEI): 1 mg/ml de solución de reserva estéril, pH 7.0, preparada con PEI lineal de 25 kDa (Polysciences) y almacenada a menos de -15°C.

• Medio de alimentación con triptona: Solución de reserva estéril al 5% p/v de Triptona N1 (Organotechnie, 19554) en Medio de expresión FreeStyle 293.

Preparación de las células para transfección Aproximadamente 2-4 horas antes de la transfección, se recolectan células HEK293-6E mediante centrifugación y se vuelven a suspender en medio de cultivo a una densidad celular de aproximadamente 1 millón de células viables por mi. Para cada transfección, se transfieren 40 mi de la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer desechable de 250 mi y se incuba durante 2-4 horas.

Transfección El medio de transfección y la solución de reserva de PEI se pre-calientan hasta temperatura ambiente (TA) . Para cada transfección , se combinan 25 pg del ADN de plásmido y 50 pg de polietilenimina (PEI) en 5 mi de medio de transfección y se incuban durante 1 5-20 minutos a TA para permitir que se forman los complejos de ADN : PEI . Para las transfecciones de BR3-lg , se utilizan 25 pg del plásmido BR3-lg por transfección . Cada 5 mi de la mezcla de complejo ADN : PEI se agregan a un cultivo de 40 mi previamente preparado y se regresan a la incubadora humidificada ajustada a 1 30 rpm, 37°C y 5% de C02. Después de 20-28 horas, se agregan 5 mi de medio de alimentación con triptona a cada transfección y los cultivos se continúan du rante seis días.

Las tablas 1 7 y 18 contienen los datos de rendimiento para los anticuerpos progenitores o las construcciones de DVD-lg expresados como miligramos por litro en células 293.

TABLA 1 7 Expresión transitoria en rendim ientos de anticuerpos progenitores v construcciones de DVD-lg en células 293 (N RP1 .

VEGF) I D del anticuerpo Dominio Dominio Rendimiento de progenitor o DVD- variable (VD) variable (VD) expresión (mg/l) lg N-terminal C-terminal AB014 VEGF 52.4 AB016 N RP1 1 14.6 TABLA 17 (cont.

Todas las DVD-lgs con enlazadores d iferentes se expresan bien en células H EK293.

TABLA 1 8 Expresión transitoria en rendim ientos de anticuerpos progenitores v construcciones de DVD-lg en células 293 (SOST.

TN F) I D del anticuerpo Dominio Dominio Rendimiento de progenitor o DVD- variable (VD) variable (VD) expresión (mg/l) lg N-terminal C-terminal AB017 TN F 52.4 AB050 SOST 77.8 DVD278 SOST TN F 58.8 DVD699 SOST TNF 56.0 DVD700 SOST TNF 42.0 DVD701 SOST TNF 25.0 DVD702 SOST TNF 35.2 DVD703 SOST TNF 45.0 DVD704 SOST TNF 24.4 DVD705 SOST TNF 55.0 TABLA 1 8 fcont.) Todas las DVD-lgs con enlazadores diferentes se expresan bien en células H EK293. Los rendimientos de DVD-lg son similares a los de los anticuerpos progenitores.

EJEM PLO 1 .4.5 Caracterización v selección de l íder de las DVD-lgs A/B Las afinidades de unión de las DVD-lgs anti-A/B se analizan en Biacore tanto contra la proteína A como contra la proteína B. La propiedad tetravalente de la DVD-lg se examina mediante estudios de unión múltiples en Biacore. Por otra parte, la potencia de neutralización de las DVD-lgs para la proteína A y la proteína B se evalúa mediante bioensayos, respectivamente, como se describe en la presente solicitud . Se seleccionan las moléculas de DVD-lg que retienen mejor la afinidad y potencia de los mAbs progenitores originales para caracterizaciones fisicoq u ímicas y bio-analíticas (PK en ratas) más profundas como se describe en la presente solicitud para cada mAb. Tomando como base la colección de análisis, la DVD-lg líder final se hace avanzar al desarrollo en línea de célula estable CHO, y el material derivado de CHO se utiliza en estudios de estabilidad, farmacocinética y eficacia en mono cynomolgus, y en actividades de pre-formulación.

EJEMPLO 2.0 Generación v caracterización de una DVD-lg anti-TNF/IL-13 EJEMPLO 2.1 Generación de anticuerpos monoclonales ímAbs) contra TNF e IL- 11 Se construyen moléculas de DVD-lg que pueden ligar a TNF e IL-13 utilizando dos pares de mAbs progenitores, uno con D2E7.1 (anti-TNF) y 13C5.5 (anti-IL-13), y el segundo par es D2E7 (anti-TNF) y 13C5.5L3F (anti-IL-13). Los dos anticuerpos D2E7 y D2E7.1 anti-TNF se han descrito previamente (patente E.U.A. No. 7,541,031). Los dos anticuerpos 13C5.5 y 13C5.5L3F anti-IL-13 han sido descritos previamente (solicitud de patente E.U.A. No. US20080171014). Las secuencias de aminoácido del dominio variable para los cuatro anticuerpos se muestran en las Tablas 42 y 43.

EJEMPLO 2.2 Producción v caracterización de anticuerpos monoclonales contra TNF e IL-13 Los cuatro anticuerpos monoclonales se producen en células de mamífero mediante coexpresión de la construcción de la cadena pesada y la cadena ligera de cada mAb, y se purifican mediante cromatog rafía con proteína A. La composición y pureza de los mAbs purificados se analizan mediante SDS-PAGE en condiciones tanto reducidas como no red ucidas. Las proteínas purificadas se caracterizan mediante las siguientes pruebas: EJEMPLO 2.1.

Espectrometría de masas y análisis de SEC de mAbs anti-TNF y anti-IL-1 3 Para medir el peso molecular (PM) de las cadenas ligera y pesada de los mAbs, 1 0 µ? de mAbs (0.8 pg/µ?) se red ucen mediante solución 1 .0 M de DTT (5 µ?) . Se utiliza una columna de proteína PLRP-S, 8u , 4000 A, y 1 x 1 50 mm (M ichrom BioResource, Aubu rn , MA) para separar las cadenas pesada y ligera de los mAbs. Se utiliza un aparato de de H PLC capilar Agilent H P1 1 00 (Agilent Technologies Inc. , Palo Alto, CA) con el espectrómetro de masas QSTAR (Applied Biosystems, Foster City, CA) . La válvula valco se ajusta a 1 0 minutos para cambiar el flujo desde desecho hacia MS para el desalado de la muestra . La solución amortiguadora A es 0.02% de TFA, 0.08% de FA, 0.1 % de ACN y 99.8% de H20 para HPLC. La solución amortiguadora B contiene 0.02% de TFA, 0.08% de FA, 0. 1 % de H20 para H PLC, y 99.8% de ACN . La velocidad de flujo de H PLC es de 50 µ?/min , y el volumen de inyección de la muestra es de 8.0 mi. La temperatura del horno de la columna se ajusta a 60°C , y el g radiente de separación es: 5% de B durante 5 minutos ; 5% de B hasta 65% de B durante 35 minutos; 65% de B hasta 95% de B du rante otros 5 minutos, y 95% de B hasta 5% de B durante 5 minutos . El barrido de TOFMS es desde 800 hasta 2500 urna , y los ciclos son 3600. Para determinar el peso molecular de los mAbs de longitud completa, se utiliza u n cartucho de micro-trampa para proteína (Michrom BioResou rce, Auburn , MA) para desalar la muestra. El gradiente de H PLC es : 5% de B durante 5 minutos; 5% de B hasta 95% de B en 1 minuto; y de 95% de B hasta 5% de B en otros 4 minutos. El barrido de QSTAR TO FMS es desde 2000 hasta 3500 urna , y los ciclos son 899. Todos los datos de MS sin tratamiento se analizan utilizando el software Analyst QS (Applied Biosystems) . Para el análisis de SEC de los mAbs, se aplican mAbs pu rificados y Abs quiméricos, en PBS , en una columna Superóse 6 10/300 G2, 300 x 10 mm (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) . Se utiliza un instrumento de H PLC , Modelo 1 0A (Shimadzu , Columbia, MD) para SEC . Todas las proteínas se determinan utilizando detección UV a 280 nm y 214 nm. La elución es ¡socrática a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. Para el estudio de estabilidad , las muestras en el intervalo de concentración de 0.2-0.4 mg/ml en PBS se someten a 3 ciclos de congelación-descongelación entre -80°C y 25°C, o se incuban a 4°C , 25°C, o 40°C , du rante 4 semanas y 8 semanas, seg uido por análisis de SEC.

EJEMPLO 2.2. B Determinación de la afinidad de unión a antíqeno de mAbs anti- TNF v anti-IL-1 3 La cinética de la unión de mAb a rhTN Fa y rh l L-1 3 se determina mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón de su perficie con u n instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, U ppsala , Suecia) utilizando HBS-EP (HEPES 1 0 mM , pH 7.4, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM , y 0.005% de agente tensoactivo P20) a 25°C . Todos los productos químicos se obtienen a partir de Biacore AB (Uppsala , Suecia) o de lo contrario a partir de una fuente diferente como se describe en la presente solicitud . Aproximadamente 5000 U R de anticuerpo policlonal específico de fragmento Fcy anti-lgG de humano, de cabra (Pierce Biotechnology I nc, Rockford , I L) diluidas en acetato de sodio 10 mM (pH 4.5) se inmovilizan directamente a través de un chip biosensor CM5 de grado investigación utilizando un estuche para copulación de amina estándar de conformidad con las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 g/ml . Las porciones sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina. Se utiliza superficie de carboximetildextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4 como una superficie de reacción . El carboximetil dextrano no modificado sin anti-lgG de humano, de cabra, en las celdas de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de u nión 1 : 1 de Langmuir se ajustan simultáneamente a las fases de asociación y disociación de todas las diez inyecciones (utilizando análisis de ajuste global) utilizando el software Bioevaluation 4.0.1 . Las muestras de mAb purificadas se diluyen en solución salina amortig uada con H EPES para captu rar a través de las superficies de reacción específicas de Fe anti-lgG de humano, de cabra , y se inyectan sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 ml/min . Las constantes de velocidad de asociación y disociación , ka S0c (M"1 S 1) y kdisoc (s' 1 ) se determinan bajo una velocidad de flujo continuo de 25 ml/min . Las constantes de velocidad se obtienen efectuando mediciones de unión cinética a diez concentraciones diferentes de antígeno que varían desde 1 .25 hasta 1000 n M . La constante de disociación en eq uilibrio (M) de la reacción entre el mAb y el antígeno se calcula después a partir de las constantes de velocidad cinética mediante la sig u iente fórmula : KD = kd¡soc/kasoc. También se inyectan simultáneamente al ícuotas de muestra del antígeno a través de una superficie de referencia y una de reacción de CM para registrar y sustraer cualquier fondo de unión no específica para eliminar la mayoría del cambio del índice de refracción y ruido de la inyección . Las superficies se regeneran con dos inyecciones subsiguientes de 25 mi de glicina 1 0 mM (pH 1 .5) a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Las superficies inmovilizadas con anticuerpo anti-Fc se regeneran completamente y conservan su capacidad de captura completa a través de doce ciclos. La esteq uiometría aparente del complejo mAb-antígeno captu rado se calcula bajo condiciones de unión en satu ración (equilibrio en estado constante) utilizando la siguiente fórmula: respuesta del antígeno (UR) peso molecular del mAb Estequiometria =— - — -x respuesta del mAb (UR) peso molecular del antígeno Los parámetros cinéticos de unión de estos cuatro anticuerpos contra sus antígenos se muestran en la Tabla 19.

EJEMPLO 2.2. C Determinación de la actividad biológica de mAbs anti-TNF y anti- IL-13 La actividad biológica de proteínas de DVD-lg anti-TNF/IL-13 se mide utilizando los bio-ensayos L929 (para anti-TNF) y A549 (para anti-IL-13).

EJEMPLO 2.2.C.1 Determinación de la actividad biológica de mAbs anti-TNF mediante el bio-ensayo L929 TNFa recombinante de humano (rhTNFa) ocasiona citotoxicidad celular a las células L929 de múrido después de un periodo de incubación de 18-24 horas. Los anticuerpos anti-hTNFa de humano se evalúan en pruebas L929 mediante co-incubación de los anticuerpos con rhTNFa y las células de la siguiente manera. Una placa de micro-titulación de 96 cavidades que contiene 100 µ? de Abs anti-hTN Fa se diluye en serie 1 /3 hacia abajo de la placa en duplicados utilizando medio RPM I que contiene 1 0% de suero fetal de bovino (FBS). Se agregan cincuenta microlitros de rhTN Fa para una concentración final de 500 pg/ml en cada cavidad de la muestra. Las placas después se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregan 50 µ? de células de fibroblastos de ratón L929 sensibles a TN Fa para una concentración final de 5 x 1 04 células por cavidad , incluyendo 1 pg/ml de actinomicina D . Los controles incluyen medio más células y rhTN Fa más células. Estos controles, y una curva patrón de TN Fa, que varía desde 2 ng/ml hasta 8.2 pg/ml, se utilizan para determinar la calidad de la prueba y proveer una ventana de neutralización . Las placas después se incuban d urante la noche (1 8-24 horas) a 37°C en 5% de C02. Se retiran cien microlitros de med io de cada cavidad y se ag regan 50 µ? de bromuro de 3,(4,4-dimetiltiazol-2-il)2 ,5-difenil-tetrazolio (MTT; disponible comercialmente de Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) 5 mg/ml en PBS. Las placas después se incuban du rante 4 horas a 37°C . Después se ag regan cincuenta microlitros de dodeciisulfato de sodio (SDS) al 20% a cada cavidad y las placas se incuban durante la noche a 37°C. Se mide la densidad óptica a 570/630 nm, se grafican las cu rvas para cada muestra y se determinan las Cl50 utilizando métodos estándar.

EJEMPLO 2.2.C.2 Determinación de la actividad biológica de mAbs anti-IL-13 Se analiza la capacidad de los anticuerpos anti-IL-13 de humano para inhibir la producción de TARC (CCL-17) inducida por IL-13 de humano utilizando células A-549 de la siguiente manera. Se siembran células A-549 en el día uno en placa de 96 cavidades (2E5 células/cavidad) en medio de crecimiento RPMI (con 10% de FBS). En el día dos, el medio se remplaza con medio de crecimiento RPMI nuevo que contiene 400 ng/ml de rhTNF (100 ml/cavidad). Mientras tanto, se pre-incuban varias concentraciones de suero de ratón inmunizado, sobrenadante de hibridoma de múrido o anticuerpos anti-IL-13 de humano purificados durante una hora a 37°C con 10 ng/ml de IL-13 recombinante purificada de humano o variante de IL-13 en 100 mi de medio RPMI completo en una placa de microtitulación (fondo en U, 96 cavidades, Costar). Después se agrega la mezcla de anticuerpo más IL-13 recombinante purificada de humano (100 ml/cavidad) a las células A-549 tratadas con TNF, con el volumen final de 200 ml/cavidad (las concentraciones finales de IL-13 y TNF son 5 ng/ml y 200 ng/ml, respectivamente), y se incuba durante 18 horas a 37°C. Después de la incubación, se retiran 150 mi de sobrenadante libre de células de cada cavidad y se mide el nivel de TARC de humano producido utilizando una ELISA para TARC de humano (R&D Systems Cat#DDN00). Se calculan las potencias de neutralización de los antagonistas de IL-13 tomando como base el promedio de los valores de TARC para cada punto de datos y los valores de Cl50 se determinan utilizando el software GraphPad Prism. La potencia de neutralización de los dos mAbs anti-IL-13 se muestra en la Tabla 19.

TABLA 19 Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-TNF y anti-IL 13 mAb Especificidad KD(nM) CIS0(n ) D2E7 TNF 0.04 0.08 D2E7.1 TNF 0.05 0.05 13C5.5 IL-13 0.15 0.20 13C5.5L3F IL-13 0.24 0.31 EJEMPLO 2.3 Construcción de Inmunoglobulinas de Dominio Variable Dual (DVD-lq) Anti-TNF/IL-13 Se construyen moléculas de DVD-lg que pueden ligar a TNF e IL-13 utilizando dos pares de mAbs progenitores, uno con D2E7.1 (anti-TNF) y 13C5.5 (anti-IL-13), y el segundo par es D2E7 (anti-TNF) y 13C5.5L3F (anti-IL-13). Se utiliza una región constante que contiene gamma Fe con mutaciones en 234, y 235 para eliminar las funciones efectoras de ADCC/CDC. Se generan varias construcciones diferentes de DVD-lg anti-TNF/IL-13 con varios enlazadores, todos en la orientación de VTNF-V|L-i3-C. Se construyen las cadenas pesada y ligera de DVD-lg con varias longitudes de enlazador, que varían desde 0 hasta 12 en VL y 0-13 en VH con el fin de examinar la longitud óptima de enlazador para cada una de la LC y HC. Las secuencias de enlazador, obtenidas a partir de la secuencia N-terminal del dominio C1/Ck o CH1 de humano, son las siguientes: Enlazadores de la cadena pesada (con identificadores): AS (HC2), ASTK (HC4) (SEQ ID NO: 58), ASTKGP (HC6) (SEQ ID NO: 21), ASTKGPSV (HC8) (SEQ ID NO: 59), ASTKGPSVFP (HC10) (SEQ ID NO: 60), y ASTKGP SVFPLAP (HC13) (SEQ ID NO: 22) Enlazadores de la cadena ligera (con identificadores): TVA (LC3), TVAAP (LC5) (SEQ ID NO: 13), TVAAPSV (LC7) (SEQ ID NO: 61), TVAAPSVFI (LC9) (SEQ ID NO: 62), y TVAAPSVFIFPP (LC12) (SEQ ID NO: 14) Para generar las construcciones de la cadena pesada de las DVD-lgs, el dominio de VH de D2E7.1 o D2E7 se amplifica mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 3' contienen una secuencia de enlazador apropiada) ; mientras tanto el dominio de VH de 1 3C5.5 o 1 3C5.5L3F se amplifica utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 5' contienen una secuencia de enlazador apropiada). Ambas reacciones de PC R se efectúan de conformidad con las técnicas y procedimientos normales de PC R . Los dos prod uctos de PCR se purifican en gel , y se utilizan ju ntos como la plantilla de traslape para la reacción de PCR de traslape subsiguiente. Los prod uctos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCgl.z non-a doblemente digerido con Srf I y Sal I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.

Para generar las construcciones de la cadena ligera de las DVD-lgs, el dominio de VL de D2E7.1 o D2E7 se amplifica mediante PCR utilizando iniciadores específicos (los en lazadores 3' contienen u na secuencia de enlazador apropiada); mientras tanto el dominio de VL de 1 3C5.5 o 1 3C5.5L3F se amplifica utilizando iniciadores específicos (los iniciadores 5' contienen una secuencia de enlazador apropiada) . Ambas reacciones de PCR se efectúan de conformidad con las técnicas y procedimientos normales de PCR . Los dos productos de PCR se purifican en gel , y se utilizan j untos como la plantilla de traslape para la reacción de PC R de traslape subsiguiente utilizando condiciones normales de PCR. Los productos de PCR de traslape se subclonan en el vector de expresión mamífero pBOS-hCk doblemente digerido con Srf I y Not I (Abbott) utilizando estrategia de recombinación homologa estándar.

La secuencia de aminoácido de VH y VL de las proteínas de DVD-lg anti-hTN F/I L-1 3 generadas a partir de los anticuerpos monoclonales D2E7.1 (anti-TN F) y 1 3C5.5 (anti-I L-1 3) se muestran en la Tabla 42. La secuencia de aminoácido de VH y VL de las proteínas de DVD-lg anti-hTN F/I L-1 3 generadas a partir de los anticuerpos monoclonales D2E7 (anti-TNF) y 1 3C5.5L3F (anti-I L-1 3) se muestran en la Tabla 43. Todas las construcciones de la cadena pesada y la cadena ligera contienen una región constante de h lgG 1 mutante y la región constante kappa de Ig (Tabla 12) y se subclonan en el vector de expresión pBOS, y se expresan en células COS, seguido por purificación mediante cromatografía con Proteína A. Los materiales purificados se someten a SDS-PAGE y análisis de SEC.

Además, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras con diferentes tamaños de enlazador se aparean como se muestra en la matriz (Tablas 20 y 21 ) con el fin de identificarla combinación óptima de elecciones de enlazador para este par de mAb.

EJEMPLO 2.4 Expresión y purificación de DVD-lqs anti-TNF/IL-13 La cadena pesada y ligera de cada construcción se subclona en vectores de expresión de mam ífero, respectivamente, y se someten a determinación de secuencia para asegurar la exactitud . Los plásmidos que codifican para las cadenas pesada y ligera de cada construcción se expresan en forma transitoria en células 293 de riñon embrionario de humano (Depósito Americano de Cultivos Tipo, Manassas, VA). El medio de cultivo celular se cosecha 72 horas después de la transfeccion transitoria y los anticuerpos se purifican utilizando cromatografía con proteína A (Pierce, Rockford, IL) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los Abs se analizan mediante SDS-PAGE y se cuantifican mediante A280 y BCA (Pierce, Rockford, IL). La Tabla 20 muestra que se generan moléculas de DVD-lg de D2E7.1 -13C5.5 diferentes mediante co-expresión de pares diferentes de construcciones de la cadena pesada y de la cadena ligera, en las cuales se utilizan varios enlazadores de longitudes diferentes tanto en HC como en LC y se aparean en todas las posibles combinaciones. De manera similar, se generan moléculas de DVD-lg de D2E7-13C5.5L3F diferentes mediante co-expresión de pares diferentes de construcciones de la cadena pesada y la cadena ligera, en las cuales se utilizan 2 enlazadores de longitudes diferentes tanto en HC como en LC y se aparean en todas las combinaciones posibles (Tabla 21).

TABLA 20 Generación de proteínas de DVD-lg de D2E7.1 -13C5.5 diferentes mediante co-expresión de pares diferentes de la cadena pesada y de la cadena ligera Construcción Cadena ligera D2E7.1 -13C5.5 Longitud de LCO LC3 LC5 LC7 LC9 LC12 enlazador Cadena pesada HCO LC0HC0 LC3HC0 LC5HC0 LC7HC0 LC9HC0 LC12HC0 D2E7.1- 13C5.5 TABLA 20 (con TABLA 21 Generación de proteínas de DVD-lg de D2E7-13C5.5L3F diferentes mediante co-expresión de pares diferentes de la cadena pesada y de la cadena ligera EJEMPLO 2.5 Espectrometría de masas y análisis de SEC de DVD-lg anti- TN F/I L-13 Para medir el peso molecular (PM) de las cadenas ligera y pesada de la DVD-lg , 1 0 µ? la DVD-lg (0.8 Mg/µ?) se red ucen mediante solución 1.0 M de DTT (5 µ?). Se utiliza una columna de proteína PLRP-S, 8u, 4000 A, y 1 x 150 mm (Michrom BioResource, Auburn, MA) para separar las cadenas pesada y ligera la DVD-lg. Se utiliza un aparato de de HPLC capilar Agilent HP1100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA) con el espectrómetro de masas QSTAR (Applied Biosystems, Foster City, CA). La válvula valco se ajusta a 10 minutos para cambiar el flujo desde desecho hacia MS para el desalado de la muestra. La solución amortiguadora A es 0.02% de TFA, 0.08% de FA, 0.1% de ACN y 99.8% de H20 para HPLC. La solución amortiguadora B contiene 0.02% de TFA, 0.08% de FA, 0.1% de H20 para HPLC, y 99.8% de ACN. La velocidad de flujo de HPLC es de 50 ul/min, y el volumen de inyección de la muestra es de 8.0 mi. La temperatura del horno de la columna se ajusta a 60°C, y el gradiente de separación es: 5% de B durante 5 minutos; 5% de B hasta 65% de B durante 35 minutos; 65% de B hasta 95% de B durante otros 5 minutos, y 95% de B hasta 5% de B durante 5 minutos. El barrido de TOFMS es desde 800 hasta 2500 urna, y los ciclos son 3600. Para determinar el peso molecular de la DVD-lg de longitud completa, se utiliza un cartucho de micro-trampa para proteína (Michrom BioResource, Auburn, MA) para desalar la muestra. El gradiente de HPLC es: 5% de B durante 5 minutos; 5% de B hasta 95% de B en 1 minuto; y de 95% de B hasta 5% de B en otros 4 minutos. El barrido de QSTAR TOFMS es desde 2000 hasta 3500 urna, y los ciclos son 899. Todos los datos de MS sin tratamiento se analizan utilizando el software Analyst QS (Applied Biosystems). Para el análisis de SEC de la DVD-lg, se aplican la DVD-lg purificadas y Abs qu iméricos, en PBS, en una col umna Superóse 6 1 0/300 G2, 300 x 10 mm (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) . Se utiliza un instrumento de H PLC , Modelo 1 0A (Shimadzu , Columbia, M D) para SEC . Todas las proteínas se determinan utilizando detección UV a 280 nm y 214 nm . La elución es ¡socrática a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min . Para el estudio de estabilidad, las muestras en el intervalo de concentración de 0.2-0.4 mg/ml en PBS se someten a 3 ciclos de congelación-descongelación entre -80°C y 25°C, o se incuban a 4°C, 25°C, o 40°C , du rante 4 semanas y 8 semanas, seguido por análisis de SEC .

La DVD-lg y los anticuerpos qu iméricos se pu rifican mediante cromatografía con proteína A. el rendimiento de purificación (3-5 mg/l) es consistente con la cuantificación de h lgG del medio de expresión para cada proteína. La composición de pu reza de las DVD-lg y anticuerpos quiméricos purificados se analiza med iante SDS-PAGE en condiciones tanto reducidas como no red ucidas. En condición no reducida, cada una de las cuatro proteínas migra como una banda individual . Las proteínas de DVD-lg muestran peso molecular más grande de los anticuerpos quiméricos , como se esperaba. En la condición no reducida, cada u na de las cuatro proteínas produce dos bandas, u na cadena pesada y u na cadena ligera. De nuevo, las cadenas pesada y ligera de las DVD-lgs son más grandes en tamaño que las de los anticuerpos quiméricos. La SDS-PAGE muestra que cada DVD-lg se expresa como una especie individual , y que las cadenas pesada y ligera se aparean eficientemente para formar una molécula tipo IgG . Los tamaños de las cadenas pesada y ligera así como de la proteína de longitud completa de dos moléculas de DVD-lg son consistentes con su masa molecular calculada basada en las secuencias de aminoácido.

Con el fin de determinar el peso molecular preciso de la DVD-lg , se utiliza espectrometría de masas. La masa molecular determinada experimentalmente de cada DVD-lg , incluyendo la cadena ligera, la cadena pesada, y la proteína de longitud completa , está en concordancia con el valor pronosticado. Para estudiar adicionalmente las propiedades físicas de la DVD-lg en solución, se utiliza cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) para analizar cada proteína , la cual exhibe en su gran mayoría propiedades monoméricas.

EJEMPLO 2.6 Determinación de la actividad de unión a IL-1 3 de las DVD-lqs anti-TN F/IL-1 3 mediante ELISA La actividad de unión de todas las DVD-lgs se caracteriza primero o se tamiza utilizando una ELI SA de alto rendimiento para su actividad anti-I L-13. Se inmoviliza I L-1 3 de h umano conjugada con biotina en una placa ELISA revestida con anticuerpo policlonal anti-biotina. Las DVD-lgs se titulan a varias concentraciones y se agregan a la placa I L-1 3-captu rada, seguido por incubación durante 1 hora a 27°C . Después de de lavar, las proteínas de DVD-lg unidas se detectan mediante anticuerpo policlonal anti-Fc de humano, de cabra , conjugado con H RP . Las moléculas de DVD-lg que presentan mejores propiedades de u nión se analizan adicionalmente respecto a la afinidad de unión cinética tanto para TN F como para I L-1 3 utilizando Biacore y bioensayos basados en célula de potencia de neutralización .

EJEMPLO 2.7 Determinación de la afinidad de unión a antígeno de las DVD-lgs anti-TNF/IL-1 3 mediante Biacore La cinética de la unión de DVD-lg a rhTNFa y rh l L- 13 se determina mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón de superficie con un instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala , Suecia) utilizando H BS-EP (HEPES 1 0 mM , pH 7.4, NaCI 1 50 mM , EDTA 3 mM , y 0.005% de agente tensoactivo P20) a 25°C. Todos los productos qu ímicos se obtienen a partir de Biacore AB (Uppsala , Suecia) o de lo contrario a partir de una fuente diferente como se describe en la presente solicitud . Aproximadamente 5000 UR de anticuerpo policlonal específico de fragmento Fcy anti-lgG de humano, de cabra (Pierce Biotechnology Inc, Rockford , I L) diluidas en acetato de sodio 10 mM (pH 4.5) se inmovilizan directamente a través de un chip biosensor CM5 de grado investigación utilizando un estuche para copulación de amina estándar de conformidad con las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 g/ml. Las porciones sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquean con etanolamina . Se utiliza superficie de carboximetildextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4 como una superficie de reacción . El carboximetil dextrano no modificado sin anti-lgG de humano, de cabra, en las celdas de flujo 1 y 3 se utiliza como la superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de un ión 1 : 1 de Langmuir se ajustan simultáneamente a las fases de asociación y disociación de todas las diez inyecciones (utilizando análisis de aj uste global) utilizando el software Bioevaluation 4.0.1 . Las muestras de DVD-lg pu rificadas se diluyen en solución salina amortiguada con H EPES para capturar a través de las superficies de reacción específicas de Fe anti-lgG de humano, de cabra , y se inyectan sobre matrices de reacción a una velocidad de flujo de 5 ml/min . Las constantes de velocidad de asociación y disociación , kasoc (M" S" 1) y kdisoc (s 1) se determinan bajo una velocidad de flujo continuo de 25 ml/min. Las constantes de velocidad se obtienen efectuando mediciones de unión cinética a diez concentraciones diferentes de antígeno que varían desde 1 .25 hasta 1000 nM . La constante de disociación en eq uilibrio (M) de la reacción entre la DVD-lg y el antígeno se calcula después a partir de las constantes de velocidad cinética mediante la sig uiente fórmula: KD = kdisoc kasoc - También se inyectan simultáneamente alícuotas de muestra del antígeno a través de una superficie de referencia y una de reacción de CM para registrar y sustraer cualquier fondo de unión no específica para eliminar la mayoría del cambio del índice de refracción y ruido de la inyección . Las superficies se regeneran con dos inyecciones subsiguientes de 25 mi de glicina 1 0 m (pH 1 .5) a una velocidad de flujo de 5 ml/min . Las superficies inmovilizadas con anticuerpo anti-Fc se regeneran completamente y conservan su capacidad de captura completa a través de doce ciclos. La estequiometría aparente del complejo DVD-lg-antígeno captu rado se calcula bajo condiciones de unión en saturación (equilibrio en estado constante) utilizando la sig uiente fórmu la: _ . . . respuesta del antígeno (UR) peso molecular de la DVD- Ig Estequiometría =— - -— -x - respuesta de DVD (UR) peso molecular del antígeno El análisis Biacore indica que todas las DVD-lgs analizadas presentan unión tanto a TN F como a I L-1 3. Los parámetros de afinidad de unión de todas las DVD-lgs contra TN F e I L-1 3 se muestran en las Tablas 22 y 23.

TABLA 22 Afi nidad de unión de las moléculas de DVD-lq D2E7.1 -1 3C5.5 para IL-1 3 y TNF TABLA 22 (cont.) TABLA 22 (cont.) TABLA 23 Afinidad de unión de las moléculas de DVD-lq D2E7-1 3C5.5L3F para IL-13 y TNF EJEMPLO 2.7 Determinación de la actividad biológica de DVD-lg anti-TNF/IL-13 La actividad biológica de las proteínas de DVD-lg anti- TNF/IL-13 se mide utilizando bio-ensayos L929 (para anti-TNF) y A549 (para anti-IL-13).

Como se muestra en las Tablas 24 y 25, todas las DVD-Igs analizadas pudieron neutralizar a TNF e IL-13.

TABLA 24 Actividad de neutralización de moléculas de DVD-lg D2E7.1- 13C5.5 para IL-13 y TNF Actividad de anti-IL-13 Actividad de anti-TNF DVD-lg mediante bioensayo mediante bioensayo D2E7.1-13C5.5 A549 (CIS0,nM) L929 (CI50,nM) LC0HC0 LC0HC2 5.32 0.362 LC0HC4 7.66 0.575 LC0HC6 4.76 0.529 TABLA 24 (cont.i Actividad de anti-IL-13 Actividad de anti-TNF DVD-lg mediante bioensayo mediante bioensayo D2E7.1-13C5.5 A549 (CIso.nM) L929 (CI50,nM) LC0HC8 LC0HC10 LC0HC13 3.82 0.616 LC3HC0 2.51 1.63 LC3HC2 LC3HC4 LC3HC6 LC3HC8 LC3HC10 LC3HC13 LC5HC0 4.26 0.063 LC5HC2 LC5HC4 LC5HC6 4.29 0.67 LC5HC8 LC5HC10 LC5HC13 0.691 0.372 LC7HC0 LC7HC2 LC7HC4 LC7HC6 LC7HC8 TABLA 24 (cont.) TABLA 25 Actividad de neutralización de moléculas de DVD-lq D2E7- 13C5.5L3F para IL-1 3 v TNF EJEM PLO 3 Generación y caracterización de inm unoqlobulinas de Dom i nio Variable Dual (DVD-lg) Se generan inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD-lg) utilizando anticuerpos progenitores con secuencias de aminoácido conocidas sintetizando los fragmentos de polinucleotido que codifican para las secuencias de cadena pesada variable de DVD-lg y cadena ligera variable de DVD-lg y clonando los fragmentos en un vector pHybC-D2 de conformidad con el Ejemplo 1 .4.4.1 . Las construcciones de DVD-lg se clonan y se expresan en células 293 como se describe en el Ejemplo 1 ,4.4.2. La proteína de DVD-lg se purifica de conformidad con métodos estándar. Las características funcionales se determinan de conformidad con los métodos descritos en los Ejemplos 1 .2.1 y 1 .2.2 como se indica.

Las cadenas de VH y VL de DVD-lg para las DVD-lgs de la invención se proveen a continuación .

EJEMPLO 3.1 Generación de DVD-lqs de N RP1 (sec. 1 ) v VEGF (sec. 1 ) con el conjunto de enlazadores 1 TABLA 26 EJEMPLO 3.2 Generación de DVD-lqs de NRP1 (sec. 1 ) y VEGF (sec. 1 ) con el conj unto de enlazadores 2 TABLA 27 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable de DVD Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSEPIS WVRQAPGKGLEWVSSITGKNGYTYYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGKKVYG MDVWGQGTLVTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPG 86 DVD695H AB016VH AB014VH GSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGW INTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNS LRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVT VSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAW YQQKPGKAPKLLIYGASSRASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQYMSVPITFGQGTKVE 87 DVD695L AB016VL AB014VL IKRTVDDDDKAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYS TVPWTFGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.3 Generación de DVD-lgs de NRP1 (sec. 1 ) y VEGF (sec. 1 ) con el conjunto de enlazadores 3 TABLA 28 EJEMPLO 3.4 Generación de DVD-lgs de NRP1 (sec. 1 ) y VEGF (sec. 1 ) con el conjunto de enlazadores 4 TABLA 29 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable 12345678901234567890123456789012345 de DVD Exterior Interior EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSEPIS WVRQAPGKGLEWVSSITGKNGYTYYADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGKKVYG MDVWGQGTLVTVSSGGGGG6GPEVQLVESGGGLVQ 90 DVD697H AB016VH AB014VH PGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWV GWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQM NSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL VTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAW YQQKPGKAPKLLIYGASSRASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQYMSVPITFGQGTKVE 91 DVD697L AB016VL AB014VL IKRGGGGGGPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSA SQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVP WTFGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.5 Generación de DVD-lqs de NRP1 (sec. 1 ) v VEGF (sec. 1 ) con el conjunto de enlazadores 5 TABLA 30 EJEMPLO 3.6 Generación de DVD-lqs de SOST y TNF (sec. 1 ) con el conj unto de enlazadores 1 TABLA 31 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable variable Variable 12345678901234567890123456789012345 de DVD Exterior Interior EVQLQQSGPELMKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPEVQLVESGGGL 94 DVD278H AB050VH AB017VH VQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMH VRQAPGKGLE WVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTL VTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQ PDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 95 DVD278L AB050VL AB017VL IKRTVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ GIRNYLAWYQQKPG APKLLIYAASTLQSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYT FGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.7 Generación de DVD-lgs de SOST y TNF con el conjunto de enlazadores 2 TABLA 32 EJEMPLO 23.8 Generación de DVD-lgs de SOST v TNF con el conjunto de enlazadores 3 TABLA 33 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable 12345678901234567890123456739012345 de DVD Exterior Interior EVQLQQSGPELMKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPEVQLVESGGGL 98 DVD700H AB050VH AB017VH VQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLE WVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAK SLYL QM SLRAEDTAVYYCA VSYLSTASSLDYWGQGTL VTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQ PDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 99 DVD700L AB050VL AB017VL IKRLVP GSAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNR APYTFGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.9 Generación de DVD-lgs de SOST y TN F con el coni unto de enlazadores 4 TABLA 34 EJEMPLO 3.10 Generación de DVD-lgs de SOST y TNF con el coniunto de enlazadores 5 TABLA 35 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable de DVD Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLQQSGPELMKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWYFDV GAGTTVTVSSGGG66GGPEVQLVESGG 102 DVD702H AB050VH AB017VH GLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKG LEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQG TLVTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQKPDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 103 DVD702L AB050VL AB017VL IKRGGGGGGPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA SQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVA YYCQRYNRAP YTFGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.1 1 Generación de DVD-lqs de SOST v TN F con el coniunto de enlazadores 6 TABLA 36 EJEMPLO 3.12 Generación de DVD-lqs de SOST v TN F con el coni unto de enlazadores 7 TABLA 37 SEQ Hombre de Hombre do Hombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable de DVD Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLQQSGPELMKPGASV MSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWYFDVWGAGTTVTVSSPAPHLLGGPEVQLVESG 106 DVD704H AB050VH AB017VH GGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGK GLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQ GTLVTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQKPDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 107 DVD704L AB050VL AB017VL IKRPAPNLL6GPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPGKAP LLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNR APYTFGQGT VEIKR EJEMPLO 3.1 3 Generación de DVD-lgs de SOST y TNF con el coni unto de enlazadores 8 TABLA 38 EJEMPLO 3.14 Generación de DVD-lgs de SOST y TNF con el coniunto de enlazadores 9 TABLA 39 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable de DVD Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLQQSGPELMKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVD SSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWY DVWGAGTTVTVSSPNLLGGPEVQLVESGGG 110 DVD706H AB050VH AB017VH LVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL EWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGT LVTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQKPDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 111 DVD706L AB050VL AB017VL IKRPAPNLLGGPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPG APKLLIYAASTLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNR APYTFGQGTKVEIKR EJ EMPLO 3.1 5 Generación de DVD-lqs de SOST y TN F con el conjunto de enlazadores 1 0 TABLA 40 EJEMPLO 3.16 Generación de DVD-lqs de SOST y TN F con el conj unto de enlazadores 1 1 TABLA 41 SEQ Nombre de Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio Dominio NO. Variable Variable Variable de DVD Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLQQSGPELMKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMH WMKQNQGKSLEWIGEINPNSGGSGYNQKFKGKATL TVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARLGYYGNY EDWYFDVWGAGTTVTVSSPNLLGGPEVQLVESGGG 114 DVD708H AB050VH AB017VH LVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMH VRQAPGKGL EWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGT LVTVSS DLQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNW YQQKPDGTVKLLIFYTSTLQSGVPSRFSGSGSGTN YSLTITNLEQDDAATYFCQQGDTLPYTFGGGTKLE 115 DVD708L AB050VL AB017VL IKRPTISPAPNLLGGPDIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQ RYNRAPYTFGQGTKVEIKR EJEMPLO 3.1 7 Generación de las cadenas pesada y ligera de DVD-lgs de TNF (sec. 3 - D2E7.1 ) e IL-1 3 (sec. 1 - 1 3C5.51 TABLA 42 SEQ Descriptor Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio NO. Variable Variable Exterior Interior 123456789012345678901234567890123456 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW D2E7.1- VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR 13C5.5 DNANSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 116 (HCO) AB230VH AB231VH DYWGQGTLVTVSSEVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCT LYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHIWWDDVK VH RY PALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPVDTATY YCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA HW D2E7.1- VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR 13C5.5 DNAKNSLYLQM SLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 117 (HC2) AB230VH AB231VH DYWGQGTLVTVSSASEVTLRESGPGLVKPTQTLTLT CTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHIWWDD VH VKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPVDTA TYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW D2E7.1- VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR 13C5.5 DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 118 (HC4) AB230VH AB231VH DYWGQGTLVTVSSASTKEVTLRESGPGLVKPTQTLT LTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHIWW VH DDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPVD TATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW D2E7.1- VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRF ISR 13C5.5 DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 119 (HC6) AB230VH AB231VH DYWGQGTLVTVSSASTKGPEVTLRESGPGLVKPTQT LTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHI VH WWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQWLKLTSVDP VDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT DDYAMHW D2E7.1- VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR 13C5.5 DNAK SLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 120 (HC8) AB230VH AB231VH DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVEVTLRESGPGLVKPT QTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLA VH HIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSV DPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR D2E7.1- DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 13C5.5 DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPEVTLRESGPGLVK 121 (HC10) AB230VH AB231VH PTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEW LAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLT VH SVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTV SS TABLA 42 (cont.) SEQ Descriptor Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio NO. Variable Variable Exterior Interior 123456789012345678901234567890123456 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMH VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR D2E7.1- DNAKNSLYLQ NSLRAEDTAVYYCAKVAYLSTASSL 13C5.5 DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPEVTLRESGPG 122 (HC13) AB230VH AB231VH LVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKG LEWLAHIWWDDVKRY PALKSRLTIS DTSKNQVVL VH KLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTL VTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPG APKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 LTISSLQPEDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR 123 (LCO) AB230VL AB231VL DIQ TQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRNYLNWY QQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYT VL LTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPLTFGGGTKVEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 LTISSLQPEDVATY CARYNRAPYTFGQGTKVEI R 124 (LC3) AB230VL AB231VL TVADIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRNYL NWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGSGSGT VL DYTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPLTFGGGTKVE IKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 LTISSLQPEDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR 125 (LC5) AB230VL AB231VL TVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRN YLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGSGS VL GTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPLTFGGGTK VEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 LTISSLQPEDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR 126 (LC7) AB230VL AB231VL TVAAPSVDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDI RNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGS VL GSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPLTFGGG TKVEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 L ISSLQPEDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR 127 (LC9) AB230VL AB231VL TVAAPSVFIDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQ DIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFS VL GSGSGTDY LTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPLTFG GGTKVEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5 LTISSLQPEDVATYYCARYNRAPYTFGQGTKVEIKR 128 (LC12) AB230VL AB231VL TVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCR ASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPS VL RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPL TFGGGTKVEIKR EJEMPLO 3.1 8 Generación de las cadenas pesada v ligera de DVD-lg de TNF (sec. 2 - D2E7) e IL-1 3 ísec. 2 - 1 3C5.5L3F) TABLA 43 SEQ Descriptor Nombre de Nombre de Secuencia ID Dominio Dominio NO. Variable Variable Exterior Interior 12345678901234567890123456789012345 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW D2E7.1- VRQAPGKGLE VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR 13C5.5L3F DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSL 129 (HC6) AB229VH AB232VH DYWGQGTLVTVSSASTKGPEVTLRESGPGLV PTQT LTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLE LAHI VH WWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSK QWLKLTSVDP VDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISR D2E7.1- DNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA VSYLSTASSL 13C5.5L3F DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPEVTLRESGPG 130 (HC13) AB229VH AB232VH LVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKG LEWLAHIWWDDVKRY PALKSRLTISKDTSKNQWL VH KLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYWGQGTL VTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5L3F LTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGT VEI R 131 (LC5) AB229VL AB232VL TVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIRN YLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPSRFSGSGS VL GTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQGLTPPLTFGGGTK VEIKR DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWY D2E7.1- QQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFT 13C5.5L3F LTISSLQPEDVATYYCARYNRAPY FGQGTKVEIKR 132 (LC12) AB229VL AB232VL VAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCR ASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIFYTSKLHSGVPS VL RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQGLTPPL TFGGGTKVEIKR EJ EM PLO 3.1 9 Secuencias de vector de clonación utilizadas para clonar las secuencias de anticuerpo progenitor v de DVD-lq TABLA 44 SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID vector NO 123456789012345678901234567890123456789012345678901 133 VI GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA TABLA 44 (cont.i SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID vector NO 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID vector NO 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGC GCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT TABLA (cont.) SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 134 V2 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGC AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG ACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA TABLA (cont.) SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 134 V2 CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ArGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT TAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC TTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA TABLA 44 (cont.) SEQ ID Nombre Secuencias de nucleótidos NO del vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCC AGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC 135 V3 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCT C GC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAAC CAACATTGCCTTTATGTGTA TABLA 44 (cont.) SEQ ID Nombre del Secuencias de nucleótidos NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 135 V3 ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG AGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTA CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAA ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAG TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTT TAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGA GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTC ACCAGTCAC GAAAAGCATCT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC TABLA 44 (cont.l SEQ ID Nombre Secuencias de nucleótidos NO del vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCG CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCT TCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTA ACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA TABLA 44 (cont.) SEQ ID Nombre del Secuencias de nucleótidos NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCTTC CTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG 136 V4 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TABLA 44 (cont.

SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG ACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAG ATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAAT ATATTGAAAAAGGAAGAG AT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCÁCAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT TAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC TTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT TABLA 44 (cont.

SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCT TCCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG 137 V5 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC TABLA 44 (cont.) SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 137 V5 AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG AGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTA CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT TABLA 44 (cont.

SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAG TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTT TAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGA GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTC ACCAGTCACAG AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCG CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCT TCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTA ACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT TABLA 44 (conU SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAG CTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC 138 V7 GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC TABLA 44 (cont.

SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID NO vector 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT TABLA 44 (con SEQ Nombre del Secuencias de nucleótidos ID vector NO 1234 5678 9012345678 901234 567890123456789012345678901 CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TABLA 44 (cont.

La presente invención incorpora para referencia en su totalidad técnicas bien conocidas en los campos de biología molecular y suministro de fármacos. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, las técnicas descritas en las siguientes publicaciones: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Bioloqy, John Wiley SSons, NY (1993); Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Bioloqy (4a ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X).

Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crvstallization of Nucleic Acids and Proteins. a Practical Approach. 2a ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999); Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, vol.2, pp. 115-138 (1984); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hvbridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981; Harlow et al., Antibodies: A Laboratorv Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991); Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Lu y Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analvsis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA.298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).

Medical Applications of Controlled Reléase. Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Oíd, R. W. & S.B. Primrose, Principies of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3a ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).

Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).

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Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technoloav (1987) VCH Publishers, NY (traducido por Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).

J Neuroscience 29 (14): 4605-15 (2009) - para glioblastoma y Cáncer Biol Ther. 2006 Jun; 5(6):657-64. para Her2 Incorporación para referencia Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de la literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitios en la red) que pudieran ser citadas a través de toda esta solicitud quedan expresamente incorporadas en la presente para referencia en sus totalidades, al igual que las referencias citadas en las mismas. La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular y biología celular, las cuales son bien conocidas en la técnica.

Equivalentes La invención se puede modalizar en otras formas específicas sin alejarse del alcance o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores, por lo tanto, se deben considerar, en todos los sentidos, como ilustrativas más que limitativas de la invención descrita en la presente solicitud. Por lo tanto, el alcance de la invención queda indicado por las reivindicaciones anexas más que por la descripción anterior, y se pretende, por lo tanto, que todos los cambios que vengan dentro del significado y rango de equivalencia de las reivindicaciones queden abarcados en la presente solicitud.

Claims (75)

REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 es una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; en donde la cadena pesada comprende un sitio de corte.

2.- Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; en donde la cadena ligera comprende un sitio de corte.

3. - Una proteína de unión que comprende la primera y segunda cadenas de polipéptido, en la cual dicha primera cadena polipeptídica comprende un primer VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en la cual dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe, (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1, en donde por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

4. - Una proteína de unión que puede ligar dos antígenos que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en las cuales, dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en la cual dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; en donde por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

5.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde n es 0.

6.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde X1 o X2 es una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 1-62, TVA, y AS.

7.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión se puede cortar de modo que se incremente la unión a por lo menos uno del VD1 y VD2.

8.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión es cortada por una enzima o agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de enterocinasa, trombina, PreScission, proteasa del Virus del Grabado del Tabaco (TEV), y activador de plasminógeno tisular (tPA) + Prolina.

9.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión es cortada por una enzima o agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de una endopeptidasa dependiente de zinc, metaloproteinasa de matriz ( MP), una serralisina, una astacina, una adamalisina, M P-1; MMP-2; MMP-3; MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-10; MMP-11; MMP-12; MP-13; MP-14; MMP-15; MMP-16; MMP-17; MP-18; MP-19; MP-20; MMP-21; MMP-22; MMP-23A; MMP-23B; MMP-24; MMP-25; MMP-26; MMP-27; MMP-28; una Desintegrina y Metaloproteinasa (ADAM); ADAM17; ADAMTS1; ADAM1 ; ADAM10; ADAM8; ADA TS4; ADAMTS13; ADAM 12; ADAM 15; ADAM9; ADAMTS5; ADAM33; ADAM11; ADAM2; ADAMTS2; ADAMTS9; ADAMTS3; ADAMTS7; ADAM22; ADAM28; ADAMTS12; ADAM19; ADAMTS8; ADAM29; ADAM23; ADAM3A; ADAM18; ADAMTS6; ADAM7; ADAMDES1; ADAM20; ADAM6; ADAM21; ADAM3B; ADAMTSL3; ADAMTSL4; ADAM30; ADAMTS20; ADAMTSL2; una Caspasa; Caspasas 1-12, Caspasa 14; una Catepsina; Catepsina G; Catepsina B; Catepsina D; Catepsina L1 ; Catepsina C; Catepsina K, Catepsina S; Catepsina H; Catepsina A; Catepsina E; Catepsina L; Catepsina Z; Catepsina F; Catepsina 2 tipo G; Catepsina 1 tipo L; Catepsina W; Catepsina 2 tipo L; Catepsina 3 tipo L; Catepsina 4 tipo L; Catepsina 5 tipo L; Catepsina 6 tipo L; Catepsina 7 tipo L; Catepsina O; a Calpaína; Calpaína 3; Calpaína 10; Calpaína 1 (mu/1) subunidad grande; Calpain, subunidad pequeña 1; Calpaína 2, (mu/1); subunidad grande; Calpaína 9; Calpaína 11; Calpaína 5; Calpaína 6; Calpaína 13; Calpaína 8; Calpaína, subunidad pequeña 2; Calpaína 15; Calpaína 12; Calpaína 7; y Calpaína 8.

10. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el sitio de corte está entre por lo menos un VD1 y VD2.

11. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el sitio de corte está en por lo menos un enlazador.

12. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde por lo menos uno del VD1 o VD2 no se une a su objetivo hasta que ocurre un corte entre el VD1 y VD2.

13. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima.

14.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima durante el procedimiento de fabricación.

15.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el enlazador de la proteína de unión es cortado selectivamente por una enzima cuando la DVD-lg está adyacente a por lo menos un objetivo.

16. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión es cortada selectivamente por una enzima cuando la DVD-lg está unida a por lo menos un objetivo.

17. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la región Fe, se selecciona a partir del grupo que consiste de región Fe de la secuencia original y una región Fe de secuencia variante.

18. - La proteína de unión de conformidad con la reivindicación 17, en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe proveniente de una lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.

19. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de velocidad de asociación (Kas0c) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: por lo menos aproximadamente 102 M"1s'1; por lo menos aproximadamente 103 M'V1; por lo menos aproximadamente 104 M"1s"1; por lo menos aproximadamente 105 M^s"1; y por lo menos aproximadamente 106 M"1s'\ según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.

20.- La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de velocidad de disociación (Kdisoc) para uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"3 s" ; cuando mucho aproximadamente 10"4 s"1; cuando mucho aproximadamente 10"5 s1; y cuando mucho aproximadamente 10"6 s1, según se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.

21 - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) para dichos uno o más objetivos que se selecciona a partir del grupo que consiste de: cuando mucho aproximadamente 10"7 M; cuando mucho aproximadamente 10"8 M; cuando mucho aproximadamente 10"9 M; cuando mucho aproximadamente 10"10 ; cuando mucho aproximadamente 10"11 M; cuando mucho aproximadamente 10"12 M; y cuando mucho 10"13 M.

22.- Un conjugado de proteína de unión que comprende una proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, dicho conjugado de proteína de unión también comprende un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de: una molécula de inmuno-adhesión, un agente para formación de imagen, un agente terapéutico, y un agente citotoxico.

23. - El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho agente es un agente para formación de imagen que se selecciona a partir del grupo que consiste de una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética, y biotina.

24. - El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho agente para formación de imagen es una radiomarca que se selecciona a partir del grupo que consiste de: 3H, 1 C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 66Ho, y 153Sm.

25. - El conjugado de proteína de unión de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona a partir del grupo que consiste de: un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, toxina, y un agente apoptótico.

26. - La proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína de unión es una proteína de unión cristalizada.

27. - La proteina de unión de conformidad con la reivindicación 26, en donde dicho cristal es un cristal de liberación controlada farmacéutico libre de vehículo.

28. - Un ácido nucleico aislado que codifica para una secuencia de aminoácido de proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 .

29 - U n vector que comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 8.

30. - El vector de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicho vector se selecciona a partir del grupo que consiste de pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pcDNA3.1 TOPO , pEF6 TOPO y pBJ .

31 . - Una célula hospedera q ue comprende un vector de conformidad con la reivindicación 29.

32.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31 , en donde dicha célula hospedera es una célula procariota.

33.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32 , en donde dicha célula hospedera es E. coli.

34.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 31 , en donde dicha célula hospedera es una célula eucariota .

35. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicha célula eucariota se selecciona a partir del g rupo que consiste de célula protista, célula animal, célula vegetal y célula fúngica.

36. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35, en donde dicha célula animal se selecciona a partir del grupo que consiste de; una célula de mam ífero, una célula de ave, y una célula de insecto.

37. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicha célula hospedera es una célula CHO.

38. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 34 , en donde dicha célula hospedera es COS.

39. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 34, en donde dicha célula hospedera es una célula de levadura .

40. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, en donde dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.

41 . - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 36, en donde dicha célula hospedera es u na célula Sf9 de insecto.

42 - U n método para producir una proteína de unión , que comprende cultivar una célula hospedera descrita en cualquiera de las reivindicaciones 31 -41 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión .

43. - El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde 50%-75% de la proteína de u nión producida es u na proteína de unión tetravalente específica dual.

44. - El método de conformidad con la reivindicación 42 , en donde 75%-90% de la proteína de u nión producida es u na proteína de unión tetravalente específica dual .

45.- El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde 90%-95% de la proteína de unión producida es una proteína de unión tetravalente específica dual.

46.- Una proteína producida de conformidad con el método de la reivindicación 42.

47.- Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

48. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47 que comprende además por lo menos un agente terapéutico adicional.

49. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 48, en donde dicho agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste de: un agente terapéutico, un agente para formación de imagen, un agente citotóxico, inhibidores de angiogénesis; inhibidores de cinasa; bloqueadores de molécula de co-estimulación; bloqueadores de molécula de adhesión; un anticuerpo anti-citocina o fragmento funcional del mismo; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; una marca o reportero detectable; un antagonista de TNF; un anti-reumático; un relajante muscular, un narcótico, un fármaco anti-inflamatorio no esferoidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un anti-psoriático, un corticosteroide, un esferoide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco para reemplazo hormonal, un agente radiofarmacéutico, u n antidepresivo, un anti-psicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina, y un antagonista de citocina.

50.- Un método para tratar un ind ividuo por una enfermedad o un trastorno administrando al individ uo la proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -27 de modo que se logre el tratamiento.

51 .- El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde dicho trastorno se selecciona a partir del grupo que comprende artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica , artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía , lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn , colitis ulcerante, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis escleroderma, enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con transplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada , enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, pú rpura de Henoch-Schoenlein , vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, tumores malignos, insuficiencia cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia circunscripta, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerante, sinovitis enteropática, artropatía asociada con Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoíde, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad del Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis B, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de tejido conectivo , enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de tejido conectivo mixta, enfermedad pulmonar intersticial asociada con esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada con lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada con dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada con enfermedad de Sjógren , enfermedad pulmonar asociada con espondilitis anq uilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis, fibrosis por radiación , bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa , hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis clásica autoinmune o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con transplante de órgano, enfermedad in mune crónica asociada con transplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1 , psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmu nidad por esperma, esclerosis mú ltiple (todos los subtipos) , oftalmía del simpático, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture , manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still , esclerosis sistémica, síndrome de Sjórg ren , enfermedad/arteritis de Takayasu , trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad autoinmune de la tiroides, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashímoto) , hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis facogénica , vasculitis primaria , enfermedad hepática aguda con vitíligo, enfermedades hepáticas crónicas , cirrosis alcohólica , lesión hepática inducida por alcohol , coleosatatis, enfermedad hepática id iosincrática, hepatitis inducida por droga, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma , infección por estreptococos del grupo B (GBS por sus siglas en inglés) , trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia) , enfermedades mediadas tipo Th 1 y tipo Th2 , dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor), y cánceres tales como cáncer de pulmón , de mama, de estómago, de vejiga urinaria, de colon , de páncreas, de ovario, de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma) , Abetalipoprotemia , Acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (A L por sus siglas en inglés) , infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda , insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia por SI DA, hepatitis inducida por alcohol , conjuntivitis alérgica , dermatitis alérgica por contacto, rinitis alérgica , rechazo de aloinjerto, deficiencia de antitripsina alfa-1 , esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de célula del asta anterior, terapia anti-cd3, síndrome antifosfol ipido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismos aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial , arteriesclerosis, fístula arteriovenosa , ataxia , fibrilación atrial (sostenida o paroxística) , aleteo atrial, bloq ueo atrioventricular, linfoma de célula B , rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de médula ósea (BMT por sus siglas en inglés), bloqueo de la rama del fascículo, linfoma de Burkitt, Q uemadu ras, arritmias cardiacas, síndrome de aturdimiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación por bypass cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelares, trastornos del cerebelo, taquicardia atrial caótica o multifocal, trastornos asociados con quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CM L por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patolog ías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD por sus siglas en inglés) , intoxicación con salicilato crónico, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis negativa en cultivo, fibrosis quística, trastornos asociados con terapia con citocina, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica de dengue, dermatitis, condiciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterioesclerótica diabética, enfermedad de cuerpo difuso de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios básales, síndrome de Down en edad intermedia, trastornos del movimiento fármaco-inducidos inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos arteriales periféricos funcionales, sepsis fúngica, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis por Gram negativos, sepsis por Gram positivos, granulomas debido a organismos intracelulares, leucemia de célula pilosa, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombolítica trombocitopénica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del fascículo de His, infección por VIH/neuropatía de VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimiento hiperquinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario- adrenal , enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar ¡diopática , citotoxicidad mediada por anticuerpo, Astenia, atrofia muscular espinal infantil , inflamación de la aorta , influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica , lesión por isquemia-reperfusión , apoplejía isquémica , artritis reumatoide juvenil , atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñon, Legionella , leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal , lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfoedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma malig no, meningitis, meningococcemia, enfermedades metabólicas/idiopáticas , dolor de cabeza por migraña, trastorno multi-sistema mitocóndrico, enfermedad de tejido conectivo mixta, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y achado-Joseph) , miastenia g rave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto al miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I , fiebre neutropénica , linfoma de tipo no hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis , procedimientos de reversión de orq uitis/vasectomia, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, rechazo de trasplante de la paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica , rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad ateroesclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumon ía por Pneumocystis carinii , neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía , organomegalia , endocrinopatía , gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios de la piel), síndrome post perfusión , síndrome post bomba, síndrome de cardiotomía postinfarto al miocardio (post- I) , preeclampsia, Parálisis supranuclear Progresiva , hipertensión pulmonar primaria , terapia con radiación , fenómeno y enfermedad de Raynaud , enfermedad de Raynoud , enfermedad de Refsum , taquicardia de Q RS estrecho regular, hipertensión renovascular, daño por reperfusión , cardiomiopatía restrictiva , sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, choque , anemia de célula falciforme, rechazo de aloinjerto de piel , sínd rome de cambios de la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal , degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de célula T o de FAB, Telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia , toxicidad , transplantes, trauma/hemorragia , reacciones de hipersensibilidad de tipo I I I , hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia , urosepsis, urticaria, enfermedades cardiacas valvulares, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosas, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica , síndrome hemafagocítico asociado con vital , síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson , rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática ag uda , poli-radiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto , alopecia circunscripta , anafilaxis, síndrome de anticuerpo anti-fosfol ípido, anemia aplásica , arteriesclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica , dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmune, pérdida auditiva autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmune, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide ampolloso, enfermedad cardiovascular, síndrome anti-fosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínicamente aislado (cis) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico con inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética , diabetes mellitus, hernia discal , prolapso de disco, anemia hemol ítica inmune inducida por fármaco, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional , síndrome de Guillain-Barré (G BS por sus siglas en inglés), fiebre del heno, sínd rome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática , neumonía intersticial idiopática , alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión , enfermedad inflamatoria ocular infecciosa , enfermedad desmielinizante inflamatoria , enfermedad card iaca inflamatoria , enfermedad renal inflamatoria, I PF/U I P , iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de célula de Langerhan , livedo reticularis, degeneración macular, poliangiitis microscópica, espondilitis anq uilosante (morbus bechterev) , trastornos de neurona motora, penfigoide de membrana mucosa , insuficiencia de órgano múltiple, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz nerviosa , neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica , osteólisis, cáncer de ovario, artritis reumatoide juvenil (J RA por sus siglas en inglés) pauciarticular, enfermedad oclusiva de arteria periférica (PAOD por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD por sus siglas en inglés) , enfermedad de arteria periférica (PAD por sus siglas en inglés) , flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa) , policondritis , polimialgia reumática, poliosis, J RA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR por sus siglas en inglés), síndrome post-bomba , Parkinsonismo primario, cáncer de próstata y rectal y tumores malignos hematopoyéticos (leucemia y linfoma) , prostatitis, aplasia de eritrocito puro, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, reestenosis, enfermedad cardiaca reumática, sapho (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis, y osteítis), escleroderma , amiloidosis secundaria , síndrome de dificultad respiratoria aguda (shock lung), esclerítis, ciática , insuficiencia ad renal secundaria , enfermedad de tejido conectivo asociada a silicón , dermatosis de sneddon-wilkinson , espondilitis anquilosante, sínd rome de Stevens-Johnson (SJS por sus siglas en inglés) , síndrome de respuesta inflamatoria sistémica , arteritis temporal , retinitis toxoplásmica , necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversal, TRAPS (receptor del factor de necrosis tumoral , reacción alérgica tipo 1 , diabetes tipo I I , urticaria, neumonía intersticial usual (U l P por sus siglas en inglés) , vasculitís, conju ntivitis primaveral, retinitis viral , sínd rome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH) , degeneración macular húmeda , cicatrización de heridas, artropatía asociada con Yersinia y Salmonella.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde d icha administración al individuo es mediante por lo menos un modo que se selecciona a partir de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronqu ial , intra-abdominal , intracapsular, intra-cartilaginoso, intra-cavidades, intra-celíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical , intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal , intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal , intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal , intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal , bucal, sublingual, intranasal, y transdérmico.

53.- Un método para generar una I nmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar dos antígenos que comprende los pasos de a) obtener u n primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar u n primer antígeno; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar u n segundo antígeno; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual VD 1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo ; C es un dominio constante de la cadena pesada ; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea C H 1 ; X2 es una región Fe; (X 1 )n es (X1 )0 o (X1 ) 1 ; y (X2)n es (X2)0 o (X2) 1 ; y d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; y e) expresar dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar a dicho primero y dicho segundo antígeno, en donde dicha por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

54. - El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde la región Fe, se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe de la secuencia original y una región Fe de secuencia variante.

55. - El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde la región Fe se selecciona a partir del grupo que consiste de una región Fe proveniente de una IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, e IgD.

56. - Un método para generar una Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar dos antígenos con las propiedades deseadas q ue comprende los pasos de a) obtener un primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, que pueda ligar un primer antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exhibida por la Inmu noglobulina de Dominio Variable Dual; b) obtener un segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo, q ue pueda ligar un segundo antígeno y que posea por lo menos una propiedad deseada exh ibida por la Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual; c) construir la primera y tercera cadenas de polipéptido que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual ; VD 1 es un primer dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición q ue éste no sea CH 1 ; X2 es una región Fe; (X 1 )n es (X 1 )0 o (X 1 )1 ; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1 ; y d) construir la segunda y cuarta cadenas de polipéptido que comprenden VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual ; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho primer anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; VD2 es un seg undo dominio variable de la cadena ligera que se obtiene a partir de dicho segundo anticuerpo progenitor o porción de unión a antígeno del mismo; C es un dominio constante de la cadena ligera ; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 ; X2 no comprende una región Fe; (X 1 )n es (X1 )0 o (X1 ) 1 ; y (X2)n es (X2)0 o (X2) 1 ; y e) expresar dichas primera , segunda , tercera y cuarta cadenas de polipéptido; de modo tal que se genere una I nmunoglobulina de Dominio Variable Dual que pueda ligar a dichos primero y segundo antígenos con las propiedades deseadas, en donde dicha por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

57.- Un método para mejorar u na característica de la proteína de unión de conformidad con la reivindicación 3 o 4, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (a) alterar la longitud y/o secuencia de (X 1 ) i de la cadena pesada y/o la cadena ligera con lo cual se provee una cadena pesada y/o cadena ligera alterada ; (b) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada q ue comprende las cadenas pesada y ligera alteradas; en donde por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

58. - U n método para mejorar una característica de la proteína de unión de conformidad con la reivindicación 3 o 4, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar la primera y la segunda cadenas de polipéptido de manera tal que VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n se cambie a VD2-(X1 )n- VD1 -C-(X2)n, con lo cual se proveen las cadenas pesada y ligera alteradas; (c) determinar la característica mejorada de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas; en donde por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

59. - U n método para mejorar una característica de la proteína de unión de conformidad con la reivindicación 3 o 4, el método comprende los pasos de: (a) determinar la característica de la proteína de unión antes de la alteración; (b) alterar la primera y/o segunda cadenas de polipéptido de modo tal que se cambie la secuencia de solamente uno del VD1 o VD2 de la cadena pesada y/o la cadena ligera ; y (c) determinar la característica de la proteína de unión alterada que comprende las cadenas pesada y ligera alteradas; en donde por lo menos una de la cadena pesada y la cadena ligera comprende un sitio de corte.

60.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57-59, en donde la característica se selecciona a partir del grupo que consiste de unión al antígeno objetivo, rendimiento de expresión a partir de la célula hospedera, tiempo de vida media in vitro, tiempo de vida media in vivo, estabilidad, solubilidad, afinidad, avidez, y función efectora mejorada.

61.- El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde la longitud del eniazador de la cadena pesada alterada está incrementada.

62. - El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde la longitud del eniazador de la cadena pesada alterada está reducida.

63. - El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde la longitud del eniazador de la cadena ligera alterada está incrementada.

64. - El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde la longitud del eniazador de la cadena ligera alterada está reducida.

65. - El método de conformidad con la reivindicación 65, en donde el sitio de corte está entre por lo menos uno del VD1 y VD2.

66. - El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde el sitio de corte está en por lo menos un eniazador.

67. - Un método para tratar un individuo por una enfermedad o un trastorno administrando al individ uo la proteína de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58-66 , de modo que se log re el tratamiento.

68. - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde por lo menos uno de un VD 1 o VD2 no se une a su objetivo hasta que la proteína de unión es cortada.

69. - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde el VD2 no se une a su objetivo hasta que la proteína de unión es cortada.

70. - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde el VD 1 se libera cuando la proteína de unión es cortada.

71 . - El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde el VD1 se libera cuando el VD2 se une a su objetivo.

72. - Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD 1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n , en el cual; VD 1 es un primer dominio variable de la cadena pesada ; VD2 es u n segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada ; X 1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH 1 ; X2 es una región Fe; (X1 )n es (X1 )0 o (X 1 )1 ; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1 ; en donde los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, y 78.

73.- Una proteína de unión que comprende una cadena de polipéptido, en la cual dicha cadena de polipéptido comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual; VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, y 79.

74.- Una proteína de unión que comprende la primera y segunda cadenas de polipéptido, en la cual dicha primera cadena polipeptídica comprende un primer VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en la cual dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe, (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1 , en donde los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, y 78 y en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, y 79.

75.- Una proteína de unión que puede ligar dos antígenos que comprende cuatro cadenas de polipéptido, en las cuales dos cadenas de polipéptido comprenden VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, en el cual, VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; y X2 es una región Fe; y en la cual dos cadenas de polipéptido comprenden VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en el cual VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un enlazador con la condición que éste no sea CH1; X2 no comprende una región Fe; (X1)n es (X1)0 o (X1)1; y (X2)n es (X2)0 o (X2)1; en donde los dominios variables de la cadena pesada VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, y 78 y en donde los dominios variables de la cadena ligera VD1 y VD2 comprenden una secuencia de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, y 79.