CN112274650A - 基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用，所述蛋白质纳米颗粒可调控巨噬细胞功能表型的转化。该蛋白质纳米颗能够有效地促进巨噬细胞向M1转化，且该蛋白质纳米颗粒能够有效促进TBK1、IRF3以及STAT1的磷酸化，并能够引起Cxcl11、Cxcl10、Il‑1β、Tnf‑α、Ccl5以及Pdcd1等因子的显著上调，促进机体更加有效地调节免疫反应。

Description

基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程及医药领域，具体涉及基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用。
背景技术
免疫治疗是当前备受欢迎的一种新型的治疗癌症的手段，其主要利用自身的免疫系统，对自身已经发生突变的癌细胞进行杀伤。相比于传统的化学疗法、发射性疗法、手术等，免疫疗法具有毒副作用相对较小、能够有效地防止肿瘤复发等优势。
当前，免疫治疗主要包含固有免疫以及获得性免疫两种，固有免疫是机体内免疫反应的第一道防线，具有反应迅速，持续时间短等特点，同时固有免疫反应的过程当中产生的细胞因子如CXCL5、CXCL10、TNF-α以及IL-1β等能够有效地引起获得性免疫反应，进而有效地促进机体的免疫反应。其中固有免疫过程中的免疫细胞主要包括巨噬细胞(Macrophage)、树突状细胞(Dentric cell)、天然杀伤性细胞(NK cell)以及中性粒细胞(Neutrophil)等。
然而，在肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)中，肿瘤周围存在的很多的免疫细胞不具有免疫反应活性，如T细胞、巨噬细胞等，常见的巨噬细胞分为两种类型，分别是M1巨噬细胞、M2型巨噬细胞。其中M1巨噬细胞属于促炎症型的巨噬细胞，能够有效抑制肿瘤的生长；而M2型巨噬细胞属于抗炎型的巨噬细胞，能够对肿瘤的生长起到一定的促进作用。因此如何有效地将肿瘤周围的巨噬细胞更加有效地转化成M1巨噬细胞，从而更好地促进肿瘤免疫成为当前亟待解决的一大难题。
发明内容
本发明的目的在于提供基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用，所述蛋白质纳米颗粒或所述药物可调控巨噬细胞的功能表型转化。该蛋白质纳米颗粒能够有效地促进巨噬细胞向M1转化，且该蛋白质纳米颗粒能够有效促进TBK1、IRF3以及STAT1的磷酸化，并能够引起Cxcl11、Cxcl10、Il-1β、Tnf-α、Ccl5以及Pdcd1等因子的显著上调，促进机体更加有效地调节免疫反应。
为此，本发明的第一方面，提供一种蛋白质纳米颗粒，所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白。
进一步，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。
谷胱甘肽硫转移酶(GlutathioneS-transferases,GST)主要包括4个家族：A、M、T、P，在本发明的技术方案中，优选GSTP1。
进一步，所述GSTP1可来自不同物种，在具体的实施方式中，所述GSTP1包括但不限于GSTP1_HUMAN、GSTP1_MOUSE、GSTP1_RAT、GSTP1_MACMU、GSTP1_XENLA、GSTP1_PIG、GSTP1_BOVIN、GSTP1_MESAU、GSTP1_PONAB、GSTP1_CRILO、GSTP1_CRIMI、GSTP1_CAPHI；优选为GSTP1_HUMAN，其氨基酸序列见SEQIDNO：1所示。
金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、高金属含量、富含半胱氨酸，普遍存在于生物界的蛋白质。
进一步，本发明所述金属硫蛋白为MT1、MT2或MT3，优选为MT3。
进一步，所述金属硫蛋白可来自不同物种，在具体的实施方式中，所述MT1包括但不限于MT1A_HUMAN、MT1G_HUMAN、MT1_MOUSE、MT1E_HUMAN、MT1X_HUMAN、MT1F_HUMAN、MT1H_HUMAN、MT1_RAT、MT1A_BOVIN、MT1B_HUMAN、MT1A_PIG、MT1A_HORSE、MT1_DANRE、MT1_BOVIN、MT1M_HUMAN、MT1_CRIGR、MT1_CANLF、MT1A_RABIT、MT1A_SHEEP、MT1L_HUMAN、MT1H_BOVIN、MT1E_PIG、MT1F_PIG、MT1B_HORSE、MT1D_PIG、MT1C_PIG、MT1_CAEEL、MT1_CANGA、MT1_CHLAE、M1BL1_HUMAN、MT1C_SHEEP、MT1B_SHEEP、MT1_DROME、MT1_TETPI、MT1_COLLI、APMT1_AMOMA、MT1_SCYSE、MT1_CYPCA、MT1A_ORYSJ、MT1A_ORYSI、MT1_DROSI、MT1C_ARATH、MT1_TETPY、MT1B_ARATH、MT1_DROAN；
所述MT2包括但不限于MT2_HUMAN、MT2_MOUSE、MT2_BOVIN、MT2_DANRE、MT2A_PIG、MT2_RAT、MT2_CANLF、MT2_PONAB、MT2_CRIGR、MT2_DROME、MT2_SHEEP、MT2_CANGA、MT2_MACFA、MT2_CHLAE、MT2_MESAU、MT2_CRILO、MT2_STECO、MT2_CAEEL、MT2_COLLI、MT2_CALSI、MT2_SCYSE、MT2_CYPCA、MT2_YARLI；
所述MT3包括但不限于MT3_BOSMU、MT3_HUMAN、MT3_MACFA、MT3_SHEEP、MT3_HORSE、MT3_MOUSE、MT3_RABIT、MT3_RAT、MT3_BOVIN、MT3_PIG。
进一步，所述金属硫蛋白优选为MT3_HUMAN，其氨基酸序列见SEQIDNO：2所示。
进一步，所述蛋白质纳米颗粒是由金属离子诱导而形成的融合蛋白，所述金属离子选自下组：Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Cr3+，优选为Fe2+。
进一步，所述蛋白质单体的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。
本发明的第二方面，提供所述蛋白质纳米颗粒用于调控巨噬细胞的功能表型转换的应用。
进一步，所述调控巨噬细胞的功能表型转换是指抑制巨噬细胞向M2表型极化，和/或促进巨噬细胞向M1表型极化。
进一步，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。
进一步，所述蛋白质纳米颗粒通过上调细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生调控巨噬细胞的功能表型转换。
进一步，所述蛋白质纳米颗粒通过促进TBK1、IRF3以及STAT1的磷酸化调控巨噬细胞的功能表型转换。
在具体的实施方式中，本发明提供的蛋白质纳米颗粒能够诱导细胞内ROS的产生，从而特异性地诱导Raw264.7巨噬细胞向M1转化，诱导细胞内TBK1、IRF3以及STAT1的磷酸化；且可在RNA水平上促进Cxcl11、Cxcl10、Il-1β、Tnf-α、Ccl5、Ifn-β细胞因子的上调；可引起DC细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞、NK细胞等免疫细胞的活化。
本发明的第三方面，提供所述蛋白质纳米颗粒用于制备药物的应用，所述药物用于调控巨噬细胞的功能表型转换。
进一步，所述调控巨噬细胞的功能表型转换是指抑制巨噬细胞向M2表型极化，和/或促进巨噬细胞向M1表型极化。
进一步，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。
进一步，所述药物还用于选自下组的一个或多个用途：
(i)提高M1表型巨噬细胞的比例；
(ii)激活机体的免疫反应；
(iii)调节肿瘤组织免疫微环境；
(iv)治疗由活化的巨噬细胞介导的疾病；
(v)成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病。
进一步，所述由活化的巨噬细胞介导的疾病包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、肿瘤、骨质疏松、糖尿病、克隆氏病、银屑病、骨髓炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、肝纤维化、结节病、系统性硬化、器官移植排斥(GVHD)和慢性炎症。
进一步，所述成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病的药物包括，所述蛋白质纳米颗粒和成像剂制备得到偶联物；进一步，还可包括医学上可接受的佐剂。
进一步，所述成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病的药物的施用量是使局部活化巨噬细胞群能够成像的有效量。
进一步，所述偶联物的成像剂组分的性质根据成像方法而决定。例如，成像剂可为放射性核素或核磁共振成像造影剂，如钆153。
在一个实施方式中，将所述成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病的药物施用于患者，经过一段时间，使成像剂递送和/或富集到目标巨噬细胞群中，经过成像步骤即实现成像或诊断。
本发明的第四个方面，提供一种免疫激动剂，由所述蛋白质纳米颗粒制备得到；进一步，所述免疫激动剂还包括医学上可接受的佐剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
本发明提供的蛋白质纳米颗粒进入细胞后，能够引起细胞内ROS的上升，进而导致精氨酸酶-1(Arginase-1)的下调以及一氧化氮合成酶(iNOS)的上调，促使巨噬细胞更好地向M1巨噬细胞活化。M1巨噬细胞属于促炎症型的巨噬细胞，不仅能够有效抑制肿瘤的生长，而且其有助于治疗多种疾病的作用机制已经被阐明。本发明提供的蛋白质纳米颗粒制备得到的药物，可用于治疗、成像、诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病。
此外，本发明提供的蛋白质纳米颗粒还能够诱导TBK1和IRF3的磷酸化，诱导细胞产生I型干扰素，随后I型干扰素和干扰素受体结合促使细胞内STAT1的磷酸化，加速I型干扰素的分泌，最终对机体的固有免疫反应起到促进作用。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为GSTP1-MT3(Fe2+)作用于巨噬细胞的示意图；
图2为不同物种间的GSTP1的同源序列比对；
图3为不同物种间的MT1的同源序列比对；
图4为不同物种间的MT2的同源序列比对；
图5为不同物种间的MT3的同源序列比对；
图6为金属Fe2+诱导下GSTP1-MT3蛋白表达的电泳图；第1泳道为蛋白质marker，第2泳道为Fe2+诱导获得的蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3(Fe2+)；
图7为GSTP1-MT3(Fe2+)的粒径分布图；
图8为利用DCFH-DA探针对GSTP1-MT3(Fe2+)诱导Raw264.7细胞内ROS的产生进行共聚焦成像；
图9为FACS检测GSTP1-MT3(Fe2+)诱导Raw264.7细胞内ROS的产生；
图10为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的RNASeq分析示意图；
图11为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的Heatmap图分析结果；
图12为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的Volcano分析图；
图13为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的主成分分析图(PCA)；
图14为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的MolecularFunction分析图；
图15为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)通路分析；
图16为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的BiologicalProcess分析图；
图17为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内mRNA的相关变化的CellularComponent分析图；
图18为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7差异基因的变化结果；
图19为qPCR测定细胞内各细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、CCL5、CXCL10在mRNA水平上的变化；
图20(A)为GSTP1-MT3(Fe2+)刺激Raw264.7巨噬细胞后显著引起iNOS的上调以及Arginase-1的下调；
图20(B)为GSTP1-MT3(Fe2+)刺激巨噬细胞后引起IRF3、TBK1、STAT1的磷酸化。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明提供的蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白。所述谷胱甘肽硫转移酶可以为选自不同物种来源的GSTP1，如图2所示为不同物种间的GSTP1的同源序列比对；所述金属硫蛋白可以为选自不同物种来源的MT1、MT2或MT3，如图3所示为不同物种间的MT1的同源序列比对，图4所示为不同物种间的MT2的同源序列比对，图5所示为不同物种间的MT3的同源序列比对。本发明在以下实施例中以GSTP1_HUMAN、MT3_HUMAN为例进行说明，但这并不代表对本发明技术方案的限定。
以GSTP1-MT3(Fe2+)为例，对其作用机理说明如下：
如图1所示，蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3(Fe2+)进入细胞后，能够引起细胞内ROS的上升，进而导致精氨酸酶-1(Arginase-1)的下调以及一氧化氮合成酶(iNOS)的上调，促使巨噬细胞更好地向M1巨噬细胞活化。
与此同时，GSTP1-MT3(Fe2+)还能够诱导TBK1和IRF3的磷酸化，诱导细胞产生I型干扰素，随后I型干扰素和干扰素受体结合促使细胞内STAT1的磷酸化，加速了I型干扰素的分泌，最终促进了免疫反应。
实施例1蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3的氨基酸序列
基于前期实验研究，本实施例构建了蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3的氨基酸序列，GSTP1-MT3主要由GSTP1和MT3两部分组成，其中MT3在氨基酸序列的N端，GSTP1在氨基酸序列的C端，MT3和GSTP1中间通过GGGGS序列偶联。
GSTP1氨基酸序列：
Figure BDA0002141200100000071
MT3氨基酸序列：
Figure BDA0002141200100000072
GSTP1和MT3之间的linker：
GGGGS(SEQ ID NO：3)。
完整的GSTP1-MT3氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其分子量为30.566kDa，等电点PI为5.14；GSTP1-MT3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
实施例2蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3的表达载体构建
为了后续在重组细胞中表达蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3，本实施例构建了其原核表达载体，选择pET-28a(+)作为原核表达载体，利用其上的酶切位点HindIII、NdeI将如SEQID NO：5所示编码GSTP1-MT3的核苷酸序列连接到pET-28a(+)中，经酶切、电泳及单克隆测序检测后成功获得重组表达载体pET-28a(+)-GSTP1-MT3。
实施例3蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3的表达与纯化
本实施例采用大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达，具体步骤如下：
1、质粒转化
取2μL 42ng/μL pET-28a(+)-GSTP1-MT3质粒，加入到20μL BL21(DE3)感受态细胞，在冰上预混15-30min，然后放在42℃水浴锅中加热90s，随后冰上再放置10min。加入800μL的无抗性的LB培养基，在37℃220rpm培养1h，然后在3500rpm离心10min，移去600μL的上清，剩余的200μL混匀后，待用。
2、抗性筛选
将步骤1中剩余的200μL菌液加入到含有卡那霉素的琼脂糖平板中，37℃培养箱中培养2h后，将平板倒置培养过夜。
3、单克隆挑选
从步骤2培养得到的平板上挑选单个克隆，加入到10mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃220rpm培养10h，溶液逐渐变浑浊。
4、蛋白质诱导表达
将步骤3得到的10mL菌液加入到1L含有卡那霉素的LB培养基中，37℃220rpm培养4h后，再分别加入1mL 0.1mol/L IPTG(使IPTG在培养基中终浓度为0.1mmol/L)和0.3mmol/L金属离子Fe2+，继续诱导表达过夜，4℃4000rpm离心20min，弃去上清，加入20mL GST重悬液(pH＝8.0、50mM Tris/HCl、100mM NaCl、60mMβ-Mercaptoethanol)进行超声波碎(30％的功率,SCIENTZ，JY 92-IIN)，4℃12000rpm超速离心，收集上清，使用0.22μm的滤膜进行过滤，有待进一步纯化。
5、蛋白纯化
利用AKTA纯化系统进行纯化，首先使用5倍(5V)柱体积的PBS平衡，然后利用AKTA将步骤4中上清结合到GST柱子上，继续使用5V柱体积的PBS进行冲洗待基线平稳后，使用GST洗脱液(pH＝8.0、10mmol/L GSH、50mM Tris/HCl、100mM NaCl、60mMβ-Mercaptoethanol)洗脱并收集。收集的蛋白使用10kDa超滤管除去蛋白中的GSH，最后使用0.22μm的滤膜过滤。4℃短期保存(如长期-80℃保存，需要保存在10％的甘油中)。
如图6所示，经由Fe2+诱导能获得分子量约30kDa的蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3(Fe2 +)。蛋白质纳米颗粒GSTP1-MT3(Fe2+)的粒径分布图如图7所示，由图7可知，GSTP1-MT3经由Fe2+诱导后形成了大小分布均匀的纳米颗粒。将本实施例制备得到的GSTP1-MT3(Fe2+)用于以下实施例中。
实施例4GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7细胞内ROS含量上升
本实施例分别应用DCFH-DA探针和流式细胞仪检测了GSTP1-MT3(Fe2+)对Raw264.7细胞内ROS含量的影响。具体步骤如下：
(1)DCFH-DA探针是一种具有细胞膜渗透性的氧化应激指示剂，可用于检测活性氧(ROS)含量水平，应用DCFH-DA探针检测GSTP1-MT3(Fe2+)对Raw264.7细胞内ROS含量的影响，具体步骤如下：
向4孔的共聚焦皿中铺上适量的Raw264.7细胞(DMEM++High Glucose)(含马血清和双抗)，37℃，5％CO2培养过夜，次日移去培养基，向其中加入适量的DPBS(300μL/次)，清洗三次。
取3个干净的1.5mL EP管，分别加入DPBS、0.025mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)、0.10mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)以及0.50mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)，37℃、5％CO2培养24h。移除培养液，利用DPBS清洗3次。然后将100mM DCFH-DA，使用生物级的DMSO逐级稀释10000倍(先稀释100倍使其浓度为1mM，然后取3mL无血清的High Glucose DMEM，向其中加入30μL 1mM DCFH-DA探针)。向各孔中加入600μL含有10μM DCFH-DA探针的无血清、High Glucose DMEM37℃、5％CO2培养40min，移除培养液，利用DPBS清洗3次，最后向其中加入300μL DPBS，进行共聚焦成像。
成像结果见图8所示，由图8可知，一定浓度的GSTP1-MT3(Fe2+)可引起Raw264.7细胞内ROS含量的显著上升。
(2)应用流式细胞仪(FACS)检测GSTP1-MT3(Fe2+)对Raw264.7细胞内ROS含量的影响，具体步骤如下：
向6孔板中分别加入2×105个Raw264.7细胞，37℃、5％CO2培养过夜，次日移去培养基，DPBS清洗三次，向其中分别加入含有DPBS、0.025mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL以及0.50mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)的High Glucose DMEM培养基，37℃5％CO2培养24h。
移除上清，DPBS清洗三次，再向其中加入含有10μM DCFH-DA无血清的HighGlucose DMEM培养基37℃、5％CO2培养40min，随后移去上清，DPBS清洗三次，最后用1mLDPBS重悬，FACS检测。
检测结果如图9所示，由图9可知，一定浓度的GSTP1-MT3(Fe2+)可引起Raw264.7细胞内ROS含量的显著上升。
实施例5RNA测序分析
向6孔板中分别加入2×105-106个Raw264.7细胞，37℃，5％CO2培养过夜，向其中分别加入PBS和0.1mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)继续培养4h；利用TRIGENT提取总的RNA，用于RNA测序分析；cDNA文库的构建和测序由康旭医学科技有限公司完成；每一个样品的目的基因均通过β-actin归一化处理，用2-ΔΔt计算目的基因的相对表达量。
图10为RNASeq分析示意图。如图11所示，为Heatmap图分析结果，显示GSTP1-MT3(Fe2+)能够引起Raw264.7巨噬细胞基因的显著性变化。图12为Volcano分析图，是对图11的一种可视化处理，其中主要包含上调以及下调的基因。图13为主成分分析图(PCA)，结果显示GSTP1-MT3(Fe2+)和对照组之间存在着显著性差异，也说明样品的可重复性较好。图14为Molecular Function分析图，结果显示差异的基因与某些信号通路相关。图15为KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，该结果是对图11-13结果的综合分析。图16为Biological Process分析图，图17为Cellular Component分析图。图18为GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7差异基因的变化结果。
实施例6qPCR分析Raw264.7巨噬细胞的活化
向准备好的6孔板中加入一定细胞密度的Raw264.7(2×105-2×106)，当细胞密度达到～80％时，分别向其中加入PBS、0.025mg/mLGSTP1-MT3(Fe2+)、以及100ng/mL LPS，37℃、5％CO2培养4h。
mRNA提取：
1、将上述培养基移除干净，向其中加入1mL TRIGENT，反复吹打细胞，转移至1.5mLEP管中；
2、将均浆样品剧烈震荡后，室温条件下放置5min以使核蛋白完全解离；
3、4℃、12000rpm离心10min，取上清(转移至干净的1.5mL EP管)；
5、向EP管中加入200μL CHCl3，盖紧瓶盖，剧烈震荡15s，在室温下放置2-3min；
6、将上层(水相)转移至干净的1.5mL EP管中，向其中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温下放置10min；
7、室温、12000rpm离心10min，弃上清；
8、加入1mL 75％乙醇，洗涤沉淀；
9、室温、12000rpm离心3min，弃上清；
10、室温12000rpm离心3min，弃上清；
11、室温放置10min，使EP管中的乙醇挥发干净；
12、加入50μL DPEC H2O，充分溶解RNA；
13、-80℃保存，待用。
mRNA反转录：
各目的基因的引物见下表：
Figure BDA0002141200100000111
1、加样
Figure BDA0002141200100000112
Figure BDA0002141200100000121
2、轻轻混匀，42℃加热30min；
3、85℃加热2min，失活TransScript RT/RI和gDNA Remover；
4、-80℃保存，待用。
qPCR定量：
1、加样
Figure BDA0002141200100000122
2、程序(SYBR Green)
Figure BDA0002141200100000123
通过qPCR测定细胞内各细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、CCL5、CXCL10在mRNA水平上的变化如图19所示，由图19可知，GSTP1-MT3(Fe2+)能够引起Raw264.7内上述细胞因子的上调。
实施例7GSTP1-MT3(Fe2+)引起Raw264.7巨噬细胞向M1活化
向6孔板中加入一定细胞密度的Raw264.7(2×105-2×106)，当细胞密度达到～80％时，分别向其中加入PBS、100ng/mL LPS、0.025mg/mL GSTP1-MT3(Fe2+)以及0.050mg/mLGSTP1-MT3(Fe2+)做好相应的标记37℃、5％CO2培养24h
移除培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，向培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂(M5Protease Inhibition Cooktail,EDTA-free)以及磷酸酶抑制剂(M5HiperPhosphatase Inhibitor Cooktail 1/2)的RIPA(中)裂解液，200μL/孔，冰上放置，15min；用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5mL离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干(注意冰上操作)。
超声处理，(注意蛋白悬液放于冰上)，处理15sec，duty cycle 50-60每次处理后清水洗探头、擦干，再做下一个Turn on 5sec/turn off 5sec 4℃duty cycle 7times；4℃下12000rpm离心20min，BCA定量。
电泳：80V,30min；随后120V 90min。
转膜：转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套(因为手上蛋白会污染膜)。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转模缓冲液浸湿。夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵，将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手除去其中的气泡。先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡在膜上盖2张滤纸并除去气泡(膜盖下后不可再移动)[做好标记：可以在PVDF膜上剪下一小角等]；最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子[尽可能是所有的操作都在转膜液中进行]。将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用70V转移70min(两块胶也是如此)。转膜结束前配制封闭液(5％BSA)及1×TBST缓冲液。
免疫反应：
(1)封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上用5％BSA封闭1h。
(2)一抗
a.用parafilm膜制作与膜大小相同的槽；
b.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min3次；
c.将一抗(Arginase-1,iNOS,p-TBK1,IRF3,p-IRF3,STAT1,p-STAT1,GAPDH,β-actin)用封闭液稀释至适当浓度(一抗1:1000)；
d.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，4℃培养过夜，次日用1×TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
(3)二抗
同上方法准备二抗稀释液(二抗：1:5000)并与膜接触，室温下孵育90min后，用1×TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
化学发光，显影，定影：
(1)将A和B两种试剂等量(常用各350μL)在1.5mL离心管中等体积混合；
将混合液均匀加入到显色板上，再将NC膜缓慢放到显色板上，放置3min(注意：一定不能留有气泡)
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后(见到荧光)，用保鲜膜包好。(经典做法)
(2)将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中，放于成像系统中成像，成像结果如图20所示。
活化的巨噬细胞主要分为两种类型，分别为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，其中iNOS是作为M1巨噬细胞的主要生物标志物，Arginase-1作为M2巨噬细胞的主要生物标志物，INOS和Arginase-1可用于区分巨噬细胞的分化类型。如图20(A)所示，GSTP1-MT3(Fe2+)刺激Raw264.7巨噬细胞后能够显著引起iNOS的上调以及Arginase-1的下调，表明GSTP1-MT3(Fe2+)能够引起巨噬细胞向M1活化。
同时，由图20(B)可知，GSTP1-MT3(Fe2+)刺激巨噬细胞后，能够引起IRF3、TBK1、STAT1的磷酸化，从而引起机体的固有免疫反应，进而调节免疫反应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 常熟合创生物科技有限公司
<120> 基于蛋白质纳米颗粒的免疫激动剂及其应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Pro Pro Tyr Thr Val Val Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala
1 5 10 15
Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu
20 25 30
Val Val Thr Val Glu Thr Trp Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys
35 40 45
Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr
50 55 60
Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly
85 90 95
Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr
100 105 110
Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys
115 120 125
Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile
130 135 140
Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu
145 150 155 160
Leu Ile His Glu Val Leu Ala Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu
165 170 175
Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala
180 185 190
Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly
195 200 205
Lys Gln
210
<210> 2
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln Gly Gly Gly Gly Ser Met Pro Pro Tyr Thr Val Val
65 70 75 80
Tyr Phe Pro Val Arg Gly Arg Cys Ala Ala Leu Arg Met Leu Leu Ala
85 90 95
Asp Gln Gly Gln Ser Trp Lys Glu Glu Val Val Thr Val Glu Thr Trp
100 105 110
Gln Glu Gly Ser Leu Lys Ala Ser Cys Leu Tyr Gly Gln Leu Pro Lys
115 120 125
Phe Gln Asp Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Gln Ser Asn Thr Ile Leu Arg
130 135 140
His Leu Gly Arg Thr Leu Gly Leu Tyr Gly Lys Asp Gln Gln Glu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Val Asp Met Val Asn Asp Gly Val Glu Asp Leu Arg Cys Lys
165 170 175
Tyr Ile Ser Leu Ile Tyr Thr Asn Tyr Glu Ala Gly Lys Asp Asp Tyr
180 185 190
Val Lys Ala Leu Pro Gly Gln Leu Lys Pro Phe Glu Thr Leu Leu Ser
195 200 205
Gln Asn Gln Gly Gly Lys Thr Phe Ile Val Gly Asp Gln Ile Ser Phe
210 215 220
Ala Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Leu Leu Leu Ile His Glu Val Leu Ala
225 230 235 240
Pro Gly Cys Leu Asp Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ala Tyr Val Gly Arg
245 250 255
Leu Ser Ala Arg Pro Lys Leu Lys Ala Phe Leu Ala Ser Pro Glu Tyr
260 265 270
Val Asn Leu Pro Ile Asn Gly Asn Gly Lys Gln
275 280
<210> 5
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaccccg agacctgccc ctgtcccagc ggaggaagct gcacctgcgc cgactcctgc 60
aagtgcgagg gctgcaagtg caccagctgc aagaagagct gctgcagctg ctgccccgcc 120
gaatgcgaaa aatgtgccaa ggactgcgtg tgtaaggggg gcgaggccgc cgaggctgag 180
gctgagaagt gctcctgctg ccaaggcgga ggcggcagca tgccccctta taccgtggtg 240
tacttccccg tgagaggcag atgcgccgcc ctgagaatgc tgctggccga ccaaggccaa 300
agttggaagg aggaggtggt cacagtggag acatggcagg agggcagtct gaaggcttcc 360
tgtctgtatg gccagctgcc caaattccaa gacggggatc tgaccctgta ccagagcaac 420
accatactga gacatctggg ccggacactg ggtctctatg ggaaggatca gcaggaggcc 480
gccctggtgg acatggtcaa cgacggagtg gaggacctga gatgcaagta catcagcctg 540
atctacacaa actacgaggc tggcaaagat gattacgtga aagcactgcc cggacagctg 600
aaacctttcg agaccctgct gtctcagaac cagggcggca agaccttcat cgtgggcgac 660
cagatcagct tcgcagatta caacctgctg gacctgctgc tgattcatga ggttctggcc 720
cccggctgtc tcgacgcctt cccactgctc tctgcttacg tgggccggct gagcgccaga 780
cccaagctca aggccttcct ggcctccccc gagtacgtga acctgcccat caacggaaac 840
ggcaagcaat aa 852
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctgctttg cctacctctc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccttcgagt gacaaacacg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccacgtgttg agatcattgc c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggctctct gctgtccatc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgccaccttt tgacagtgat g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctgcaacca ccactcattc 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catccgtaaa gacctctatg ccaac 25
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggagccac cgatccaca 19

Claims (10)

1.一种蛋白质纳米颗粒用于调控巨噬细胞功能表型的转换应用；
所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控巨噬细胞的功能表型转换是指抑制巨噬细胞向M2表型极化，和/或促进巨噬细胞向M1表型极化。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述蛋白质纳米颗粒通过上调细胞内活性氧的产生调控巨噬细胞功能表型的转换；
可选地，所述蛋白质纳米颗粒通过促进TBK1、IRF3以及STAT1的磷酸化调控巨噬细胞的功能表型转换。
5.一种蛋白质纳米颗粒用于制备药物的应用，所述药物用于调控巨噬细胞的功能表型转换；所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物还用于选自下组的一个或多个用途：
(i)提高M1表型巨噬细胞的比例；
(ii)激活机体的免疫反应；
(iii)调节肿瘤组织免疫微环境；
(iv)治疗由活化的巨噬细胞介导的疾病；
(v)成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述由活化的巨噬细胞介导的疾病包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、肿瘤、骨质疏松、糖尿病、克隆氏病、银屑病、骨髓炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、肝纤维化、结节病、系统性硬化、器官移植排斥和慢性炎症。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述成像或诊断由活化的巨噬细胞介导的疾病的药物包括，所述蛋白质纳米颗粒和成像剂制备得到的偶联物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述成像剂为放射性核素或核磁共振成像造影剂。
10.一种免疫激动剂，其特征在于，由蛋白质纳米颗粒制备得到；
所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
可选的，所述免疫激动剂还包括医学上可接受的佐剂。
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