CN110066344A - 一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Fc融合蛋白FGFR1‑MIP3a‑CTLA4及其应用，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明所述Fc融合蛋白FGFR1‑MIP3a‑CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过内毒素检测结果显示Fc融合蛋白FGFR1‑MIP3α‑CTLA4融合蛋白＜6EU/mg；且能够识别FGFR1、MIP3a，并具有与CTLA4配体B71、B72结合的活性。本发明所述融合蛋白可使促进免疫反应、清除肿瘤微环境免疫抑制作用、抗肿瘤血管生成和靶向作用有机地结合在一起，从而实现靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成多重抗癌功效。

Description

一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用。
背景技术
以DC疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为研究的热点，传统上制备DC疫苗往往需要通过体外扩增DC，再把患者的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞进行体外共同培养，让这些DC在体外对抗原进行适当处理修饰后再回输患者体内，这种DC疫苗体外制备方法存在操作复杂、成本高、规范难等不足。此外，传统DC疫苗免疫治疗还存在细胞数量少、功能障碍和单次致敏效能低等诸多瓶颈问题。因此，寻找一种更加简单高效的“体内”DC疫苗显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用，使促进免疫反应(MIP3α)、清除肿瘤微环境免疫抑制作用(CTLA4-Fc)、抗肿瘤血管生成和靶向作用(FGFR1-Fc)有机地结合在一起，从而实现靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成多重抗癌功效。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，编码所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种表达所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的重组载体。
本发明还提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增，得第一轮PCR产物；所述第一轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(2)以所述第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.60所示引物为引物对进行第二轮PCR扩增，得P2407A片段；所述第二轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物SEQ ID NO.30.5μL，SEQ ID NO.60所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第一轮PCR产物2μL；
(3)以SEQ ID NO.61～106所示的引物组进行第三轮PCR扩增，得第三轮PCR产物；所述第三轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(4)以所述第三轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.106为引物对进行第四轮PCR扩增，得P2407B片段；所述第四轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.61所示引物0.5μL，SEQ ID NO.106所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第三轮PCR产物2μL；
(5)将所述P2407A片段和所述P2407B片段与pcDNA3.4质粒连接，得重组载体；
步骤(1)、(2)和步骤(3)、(4)之间不存在时间上的先后关系。
优选的，步骤(1)所述第一轮PCR扩增和步骤(3)所述第三轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸3min。
优选的，步骤(2)所述第二轮PCR扩增和步骤(4)所述第四轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸5min。
优选的，步骤(5)所述连接前，还包括对所述pcDNA3.4质粒进行线性化处理，所述线性化处理为利用NotI和XbaI双酶切。
本发明还提供了一种包含所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或所述重组载体或利用所述构建方法构建得到的重组载体的表达细胞。
本发明还提供了所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或所述重组载体或利用所述构建方法构建得到的重组载体或所述表达细胞在制备具有多重抗癌功效药物中的应用。
优选的，所述多重抗癌功效表现为靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成。
本发明提供了一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4以FGFR1为靶标，利用基因工程技术构建含有FGFR1抗体抗肿瘤血管生成、MIP3α促进免疫反应和CTLA4有效清除免疫抑制作用的复方FGFR1-MIP3α-CTLA4/Fc融合蛋白，使促进免疫反应(MIP3α)、清除肿瘤微环境免疫抑制作用(CTLA4-Fc)、抗肿瘤血管生成和靶向作用(FGFR1-Fc)有机地结合在一起，从而实现靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成多重抗癌功效。
在本发明实施例中，利用重组载体表达所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，经SEC-HPLC检测，214nm纯度为77.559％，280nm纯度为78.080％；通过内毒素检测，结果显示Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4融合蛋白＜6EU/mg；且能够识别FGFR1、MIP3a，并具有与CTLA4配体B71、B72结合的活性，因此本发明所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4可应用于抗肿瘤治疗，并且具有多重抗癌功效。
附图说明
图1为pcDNA3.4质粒的结构示意图；
图2为本发明PCR扩增产物电泳分离图；
图3为本发明阳性克隆筛选鉴定结果图；
图4为本发明质粒酶切鉴定结果图；
图5为本发明重组质粒测序验证结果图；
图6为本发明SDS-PAGE检测结果图；
图7为本发明SEC-HPLC检测结果图；
图8为本发明融合蛋白与B7-1结合曲线；
图9为本发明融合蛋白与B7-2结合曲线；
图10为本发明融合蛋白与抗体CTLA4结合实验；图中：Lane 1为P2407(FT1812902)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2407(FT1812902)非还原；
图11为本发明融合蛋白与抗体FGFR1结合实验；图中：Lane 1为P2407(FT1812902)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2407(FT1812902)非还原；
图12为本发明融合蛋白与抗体MIP3a结合实验；图中：Lane 1为P2407(FT1812902)还原，Lane M：Marker，Lane 2为P2407(FT1812902)非还原。
具体实施方式
本发明提供了一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4内包括依次连接的信号肽、mCCL20[MIP-3a](Ala28-Met97)、Linker(GGGS4)、mFGFR1(Arg22-Glu 376)、鼠源抗体Fc段Mouse IgG2a和FcCTLA4(Ala37-Phe162)。编码所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中信号肽序列如SEQ IDNO.107所示，MIP-3a序列如SEQ ID NO.108所示，mFGFR1序列如SEQ ID NO.109所示，MouseIgG2a序列如SEQ ID NO.110所示，FcCTLA4序列如SEQ ID NO.111所示。在本发明实施例中，为方便记录Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4也称之为P2407。
本发明提供了一种表达所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的重组载体。本发明所述重组载体优选为所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4与所述pcDNA3.4质粒连接构建得到的重组载体，所述pcDNA3.4质粒的结构示意图如图1所示。本发明对所述pcDNA3.4质粒的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，本发明实施例中所述pcDNA3.4质粒购自江苏省弗泰生物科技有限公司。
本发明还提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增，得第一轮PCR产物；所述第一轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(2)以所述第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.60所示引物为引物对进行第二轮PCR扩增，得P2407A片段；所述第二轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物SEQ ID NO.30.5μL，SEQ ID NO.60所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第一轮PCR产物2μL；
(3)以SEQ ID NO.61～106所示的引物组进行第三轮PCR扩增，得第三轮PCR产物；所述第三轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(4)以所述第三轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.106为引物对进行第四轮PCR扩增，得P2407B片段；所述第四轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.61所示引物0.5μL，SEQ ID NO.106所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第三轮PCR产物2μL；
(5)将所述P2407A片段和所述P2407B片段连接与pcDNA3.4质粒连接，得重组载体；
步骤(1)、(2)和步骤(3)、(4)之间不存在时间上的先后关系。
在本发明构建所述重组载体的方法中，以SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增，得第一轮PCR产物；所述第一轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。本发明利用所述SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增时，优选将SEQ ID NO.3～60所示的引物5μL与200μL的水混合制备引物混合物。本发明所述第一轮PCR扩增时，不使用模板DNA，目标序列通过各条引物拼接，程序优选的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸3min。本发明在所述第一轮PCR扩增结束后，优选还包括在10℃中保存其第一轮PCR产物。
得第一轮PCR产物后，本发明以所述第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQID NO.60所示引物为引物对进行第二轮PCR扩增，得P2407A片段；所述第二轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.3所示引物0.5μL，SEQ ID NO.60所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第一轮PCR产物2μL。本发明所述第二轮PCR扩增的程序优选的为：95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸5min。本发明在所述第二轮PCR扩增结束后，优选还包括在10℃中保存其第二轮PCR产物。本发明得所述P2407A片段后，优选还包括使用1.8％的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳分离，在紫外透射仪中切下含有目的PCR产物的琼脂糖凝胶，如图2中标号1和2所示，显示P2407A克隆目标片段长度为1488bp。
本发明以SEQ ID NO.61～106所示的引物组进行第三轮PCR扩增，得第三轮PCR产物；所述第三轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。本发明所述第三轮PCR与步骤(1)之间并没有时间上的先后顺序。本发明所述第三轮PCR扩增的反应程序优选与所述第一轮PCR扩增的程序相同，在此不再赘述。本发明在进行所述第三轮PCR扩增时，不使用模板DNA，目标序列通过各条引物拼接。
得第三轮PCR产物后，本发明以所述第三轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.61和SEQID NO.106为引物对进行第四轮PCR扩增，得P2407B片段；所述第四轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.61所示引物0.5μL，SEQID NO.106所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第三轮PCR产物2μL。本发明所述第四轮PCR扩增的反应程序优选与所述第二轮PCR扩增的程序相同，在此不再赘述。本发明得所述P2407B片段后，优选还包括使用1.8％的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳分离，在紫外透射仪中切下含有目的PCR产物的琼脂糖凝胶，如图2中标号3和4所示，显示P2407B克隆目标片段长度为1113bp。
得P2407A片段和P2407B片段后，本发明将所述P2407A片段和所述P2407B片段与pcDNA3.4质粒连接，得重组载体。本发明在所述连接前，优选还包括对所述pcDNA3.4质粒进行线性化处理，所述线性化处理为利用NotI和XbaI双酶切。本发明所述双酶切的体系优选为50μL体系：pcDNA3.4载体质粒6μL，10×buffer 10μL，NotI 10μL，XbaI 10μL，ddH2O 30μL。本发明所述双酶切的程序优选为在37℃条件下水浴2h，然后65℃15min灭活限制性内切酶，酶切产物胶回收。
本发明所述连接为重组反应体系，优选包括：P2407A片段和P2407B片段各2μL，线性化载体3.5μL，重组酶2.5μL。本发明所述连接的反应条件优选为：50℃水浴25min，放置2～3min使温度降低后，进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜。本发明在得到所述重组载体后，优选还包括菌落筛选验证和测序验证。本发明对所述菌落筛选验证和测序验证的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了一种包含所述重组载体或利用所述构建方法构建得到的重组载体的表达细胞。
本发明还提供了所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或所述重组载体或利用所述构建方法构建得到的重组载体或所述表达细胞在制备具有多重抗癌功效药物中的应用。
本发明所述多重抗癌功效优选表现为靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成，更优选表现为使促进免疫反应(MIP3α)、清除肿瘤微环境免疫抑制作用(CTLA4-Fc)、抗肿瘤血管生成和靶向作用(FGFR1-Fc)有机地结合在一起。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照如表1所示信息进行PCR扩增，获取克隆目标序列：
表1扩增P2407A片段和P2407B片段的PCR信息
PCR反应后，使用1.8％的琼脂糖胶对PCR产物进行电泳分离，在紫外透射仪中用手术刀切下含有目的PCR产物的琼脂糖凝胶，结果如图2所示，其中图2中标号1和2为P2407A克隆目标片段(1488bp)，标号3和4为P2407B克隆目标片段(1113bp)。胶回收上述步骤克隆目标片段PCR产物(参考Axygen产品说明书)，准备连接实验。
载体酶切线性：利用NotI和XbaI双酶切，双酶切的体系为50μL体系：pcDNA3.4载体质粒6μL，10×buffer 10μL，NotI 10μL，XbaI 10μL，ddH2O 30μL。在37℃条件下水浴2h，然后65℃15min灭活限制性内切酶，酶切产物胶回收。
重组反应体系包括：P2407A片段和P2407B片段各2μL，线性化载体3.5μL，重组酶2.5μL。本发明所述连接的反应条件优选为：50℃水浴25min，放置2～3min使温度降低后，进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜。
菌落筛选实验：1)挑取过夜平板中单菌落；
2)用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.106所示的引物进行菌落PCR；
3)所得产物以1.2％琼脂糖电泳鉴定阳性克隆。结果如图3所示，其中1～4泳道表明扩增得到大小约为2567bp特异性DNA分子片段与MouseCCL20[MIP-3a]-FGFR1-CTLA4-mFc片段大小一致，表明MouseCCL20[MIP-3a]-FGFR1-CTLA4-mFc片段成功插入pcDNA3.4载体质粒中；
4)随机选择4个阳性菌，阳性菌液用CMV-F(SEQ ID NO.112:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)/BI-seq-R(SEQ ID NO.113:AGCGTAAAAGGAGCAACATAGT)引物测序；
5)选择测序正确克隆的阳性菌液，扩大培养后抽提低内毒素质粒，测序验证。结果如图4所示，图4泳道3中用NotI和XbaI双酶切鉴定分析，切下来的片段大小约2560bp，与Mouse CCL20[MIP-3a]-FGFR1-CTLA4-mFc片段大小一致，表明MouseCCL20[MIP-3a]-FGFR1-CTLA4-mFc重组质粒构建成功。阳性克隆寄送南京一道生物科技有限公司进行测序，测序结果与目标序列一致(如图5所示)，说明重组载体构建成功。
实施例2
实验名称：细胞培养与表达
实验日期：2018.11.18
实验材料：摇床、离心机、水浴锅、293CD05Medium培养液、转染试剂、各种规格的移液管、各种规格的摇瓶。
1.细胞培养方案如表2所示：
表2 HEK293细胞培养条件
2.瞬时转染与表达
溶液1：用培养液稀释质粒，混匀；
溶液2：用培养液稀释转染试剂，混匀将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周，收集上清，8000rpm离心5min。
3.细胞培养上清纯化
实验日期：2018.11.30
实验材料：蠕动泵、搅拌器、玻璃纯化柱、1XPBS、柠檬酸钠、ProteinAt Beads4FF、各种规格的离心管
实验方法：ProteinA亲和层析柱纯化
1)装柱：填料混匀后，用移液枪吸取填料悬浮液加入层析柱中。将泵，连接管路，层析柱三者连接好，做好柱子标签。
2)用1×PBS溶液平衡层析柱。
3)平衡后上样。
4)上样结束后，先用1×PBS溶液洗杂。
5)洗杂结束后，1×PBS溶液走净，用柠檬酸钠溶液(PH3.4)洗脱，分管收集，每管约500μL。共收集9管，使用NanoDrop仪器读取280 nm吸光度值。
6)混合蛋白：将有浓度的蛋白混合到适宜的离心管中，进行透析前体积浓度记录。
7)蛋白透析：将混合蛋白吸至透析袋中，扎紧透析袋，做好标记，放至含1×PBS溶液的1L烧杯中置于搅拌器上帮助透析。
8)透析结束后，用一次性无菌注射器将蛋白取出并取样，进行质控。
实验结果如表3所示：透析前，蛋白浓度是1.9 mg/mL，体积4 mL。
表3透析结果表
样品名称 等电点 消光系数 交付蛋白量mg 浓度mg/mL 蛋白量/表达体积mg/L
P2407 5.69 1.201 1.0 1.9 3.6
4.纯度检测
①实验名称：SDS-PAGE电泳检测
实验日期：2018.12.3
实验材料：电泳仪、垂直电泳槽、恒温金属浴，30％丙烯酰胺，1.5M Tris-HCl，1MTris-HCl，10％SDS，2×SDS-PAGELoading Buffer，10％AP，5×SDS-PAGE电泳缓冲液，脱色液，染色液
实验方法：
1)样品处理
还原样品处理：还原上样缓冲液中入1.5μg蛋白，99℃处理10分钟。
非还原样品处理：非还原上样缓冲液中入1.5μg蛋白。
2)电泳
先用80V电压跑15min，再用170V电压跑40min。
3)凝胶的染色及脱色
将凝胶放入染色液中，沸水中煮15min后置60 rpm摇床摇晃1h。换脱色液在沸水中煮15min后置60rpm摇床摇晃1h，更换脱色液，置60rpm摇床继续摇晃2h，拍照保存。
实验结果如图6所示，该蛋白理论分子量为89KDa，实际分子量约为120Kda，纯度＞95％。
②试验名称：HPLC-SEC检测
实验日期：2019.3.26
实验材料：高效液相色谱仪、凝胶色谱柱、去离子水、流动相(Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl)
实验方法：使用高效液相色谱仪Lc-20AT及凝胶色谱柱进行SEC实验，实验条件为：流速1mL/min，样品浓度1.9mg/mL，进样量20μL，柱温35℃，检测波长214nm和280nm，采集时间15min。
将水更换为流动相，流速缓慢提升至1mL/min，至基线平稳，取50μL P2407蛋白至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的文职，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h，实验结果如图7所示，214nm纯度为77.559％，280nm纯度是78.080％。
5.内毒素检测
实验日期：2018.12.3
实验材料：涡旋振荡器、电热恒温培养箱、内毒素工作标准品、鲎试剂、内毒素检测用水(安度斯)
实验方法：1)样品阳性对照页配制：2倍供试液浓度溶液+内毒素标准品(0.12EU/mL)，1:1混合；
2)供试液制备：样品稀释倍数：MVD＝C·L/λ＝(1.9mg/mL*6EU/mg)÷0.06EU/mL＝190
注：MVD为供试品细菌内毒素限值(6EU/mg)；C为供试品浓度；λ为鲎试剂标示灵敏度(0.06EU/mL)
110μL供试液取样量＝1.9mg/mL÷190*110μL＝1.1μg；具体如表4所示：
表4内毒素检测试剂及用量
鲎试剂(0.06EU/mL) 内毒素检测用水 样品
阴性对照管 200μL 无
阳性对照管 100μL 100μL内毒素标准品(0.12EU/mL)
样品阳性对照管 100μL 100μL样品阳性对照液
供试品管 100μL 100μL供试液
封闭管口，轻轻摇匀，纯质放入37℃恒温培养箱孵育60min。
实验结果，鲎试剂状态是澄清透明不凝固，通过内毒素检测，P2407内毒素＜6EU/mg，符合要求。
实施例3
Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4c/mFc与Mouse CD80(B7-1)/mFc
结合EALISA实验
一、实验步骤
1、Mouse CD80(B7-1)/mFc生物素标记；
2、Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4/mFc酶标板包被，1μg/孔，50μL包被液；
3、PBS/吐温清洗板子5次；
4、封闭：3％BSA，200μL/孔，37℃反应1.0h后，PBS/吐温清洗板子3次；
5、加样：Mouse CD80(B7-1)/mFc，浓度依次为250μg/mL，50μg/mL,10μg/mL,5μg/mL……1/5梯度稀释，空白孔不加样，37℃反应1.0h后，PBS/吐温清洗板子5次；
6、加Avidin-HRP，用PBS稀释到1000×，100μL/孔，37℃反应40min后，PBS/吐温清洗板子5次；
7、加底物缓冲液，100μL/孔，37℃反应10min后，加终止液，50μL/孔，OD492nm处读数。
实验结果如表5和图8所示：
表5 P2407与B7-1结合实验数据
AntibodyConc.(μg/mL) MouseCD80(B7-1)/mFc
250.0000 A 1.771
50.0000 B 1.686
10.0000 C 1.62
2.0000 D 1.581
0.4000 E 0.791
0.0800 F 0.248
0.0160 G 0.103
阴性对照 H 0.079
Ec50(μg/mL) 0.4661
由表5和图8可知，Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4/mFc与Mouse CD80(B7-1)/mFc有结合，EC50＝0.4661μg/mL。
实施例4
Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4c/mFc与Mouse CD80(B7-2)/mFc
结合EALISA实验：
一、实验步骤
1、Mouse CD80(B7-2)/mFc生物素标记；
2、Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4/mFc酶标板包被，1μg/孔，50μL包被液；
3、PBS/吐温清洗板子5次；
4、封闭：3％BSA，200μL/孔，37℃反应1.0h后，PBS/吐温清洗板子3次；
5、加样：Mouse CD80(B7-1)/mFc，浓度依次为250μg/mL，50μg/mL,10μg/mL,5μg/mL……1/5梯度稀释，空白孔不加样，37℃反应1.0h后，PBS/吐温清洗板子5次；
6、加Avidin-HRP，用PBS稀释到1000×，100μL/孔，37℃反应40min后，PBS/吐温清洗板子5次；
7、加底物缓冲液，100μL/孔，37℃反应10min后，加终止液，50μL/孔，OD492nm处读数。
实验结果如表6和图9所示：
表6 P2407与B7-2结合实验数据
AntibodyConc.(μg/mL) MouseCD86(B7-2)/mFc
250.0000 A 1.611
50.0000 B 1.581
10.0000 C 1.57
2.0000 D 1.419
0.4000 E 0.794
0.0800 F 0.286
0.0160 G 0.113
阴性对照 H 0.077
Ec50(μg/mL) 0.4291
由表6和图9可知，Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4/mFc与Mouse CD80(B7-2)/mFc有结合，EC50＝0.4291μg/mL。
实施例5
利用Western Blot印迹的方法对Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4-Fc融合蛋白中的CTLA4进行定性验证，确定CTLA4在融合蛋白中的存在。
使用抗体：一抗：CTLA4克隆抗体(来源兔)；二抗：羊抗兔HRP辣根过氧化物酶标记。
标准操作：
一、SDS-PAGE操作获得浓缩胶
二.转膜及显影操作
1转膜准备
1.1剪切胶大小的滤纸和NC或PVDF膜，一块胶需准备6-8张滤纸和1张NC膜。
1.2浸泡
1)转膜用的两块海绵板、滤纸放入转膜电泳液中浸泡5-10min。
2)NC膜要置于去离子水上浸一下，完全润湿才可使用；若是PVDF膜使用前在甲醇溶液中浸泡20分钟。
2转膜
2.1取出电泳结束的SDS-PAGE胶除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，避免将分离胶刮破。
2.2将剥下分离胶在转膜电泳液中浸泡5min。
2.3将夹板阴极(黑色一半)朝下，在上面垫一张浸泡过的海绵板，用玻璃棒擀走的气泡(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动)。
2.4在海绵板上垫三至四张浸过的滤纸，用玻棒擀去气泡。
2.5取出浸泡后的SDS-PAGE放在滤纸上，注意将滤纸全部覆盖，用玻棒擀去气泡。
2.6将浸泡过的PVDF或NC膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
2.7在膜上盖三至四张滤纸并除去气泡，注意不要与底层滤纸直接接触，避免短路。
2.8最后盖上另一个海绵板，合起夹子。
2.9将夹板放入转移槽中，要使夹板的黑面对槽的黑面(白面对槽的红面)。
2.10将转移槽放入冰柜或者冰上转膜，转膜过程中电转液用磁力搅拌器搅拌。
2.11接通电源一般用恒压60V或恒流200mA转移2-3h。
2.12转膜完成后将SDS-PAGE胶染色观察，确认蛋白是否完全转移。
3免疫反应
3.1漂洗：取膜，注意在膜的正面作上标记(可以将膜的一角剪去)，将膜正面朝向TBST溶液中漂洗5min。
3.1封闭：将膜移至含有封闭液(5％脱脂牛奶或者5％BSA)的平皿中，室温下脱色摇床上封闭1小时或者4度静置过夜。
3.2漂洗：将膜放入TBST缓冲液漂洗5min。
3.3加一抗：将膜移至含有一抗的TBST缓冲液中，一抗(CTLA4克隆抗体(来源兔))稀释浓度根据抗体说明书自行调整确定。室温下孵育1～2h或者4度静置过夜。
3.4漂洗：用TBST在室温下脱色摇床上漂洗四次，每次5min。
3.5加二抗：将膜移至含有二抗(偶联HRP的二抗)(羊抗兔HRP辣根过氧化物酶标记)的TBST溶液中，室温下孵育1～2h。
3.6漂洗：用TBST溶液在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min；再用TBS溶液洗两次每次5min。
4化学发光
4.1将A和B两种试剂(碧云天BeyoECL Plus)在离心管中上等体积混合，避光保存。
注意吸取A/B溶液时，一定要更换枪头，避免交叉污染。
4.2用滤纸从边缘处吸去转印膜上残留液体，正面朝上置于平整的保鲜膜上，加上A、B混合液(按每10平方厘米膜加1ml BeyoECL Plus使用)，使膜正面与液体充分接触，避光静置3分钟。
4.3用滤纸从边缘处吸去转印膜上残留液体(尽量吸取完全，避免曝光背景较重)，置与另一平整的保鲜膜上，包好，放入X-光片夹中。
5显影、定影
5.1在暗室红光灯下，用剪刀剪取适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)X－光片。
5.2打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，(一旦放上，便不能移动)
5.3曝光：关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般1至5min，也可选择不同时间多次曝光，以达最佳效果。
5.4显影：曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影。
显影时间一般为1～2min(20～25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间。
5.5定影：待X-光片出现明显条带后，立即将X-光片自显影液中取出，放入定影液中定影(定影时间一般为1～5min，以胶片透明为止)。
5.6冲洗：用自来水冲去残留的定影液，室温下晾干。结果如图10所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-CTLA4/Fc融合蛋白能够与CTLA4抗体有结合。
实施例6
利用与实施例5相同的Western Blot印迹的方法对Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4-Fc融合蛋白中的CTLA4进行定性验证，确定FGFR1在融合蛋白中的存在。
使用抗体：一抗：FGFR1克隆抗体(来源兔)；二抗：羊抗兔HRP辣根过氧化物酶标记。结果如图11所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-CTLA4/Fc融合蛋白能够与FGFR1抗体有结合。
实施例7
利用与实施例5相同的Western Blot印迹的方法对Mouse FGFR1-MIP3a-CTLA4-Fc融合蛋白中的CTLA4进行定性验证，确定MIP3a在融合蛋白中的存在。
使用抗体：一抗：MIP3a克隆抗体(来源兔)；二抗：羊抗兔HRP辣根过氧化物酶标记。结果如图12所示，即本发明提供的MIP3α-FGFR1-CTLA4/Fc融合蛋白能够与MIP3α抗体有结合。
本发明提供了一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用，利用重组载体表达所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，经SEC-HPLC检测，214nm纯度为77.559％，280nm纯度为78.080％；通过内毒素检测，结果显示＜6EU/mg；且Fc融合蛋白FGFR1-MIP3α-CTLA4融合蛋白能够识别FGFR1、MIP3a，并具有与CTLA4配体B71、B72结合的活性。因此本发明所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4可使促进免疫反应(MIP3α)、清除肿瘤微环境免疫抑制作用(CTLA4-Fc)、抗肿瘤血管生成和靶向作用(FGFR1-Fc)有机地结合在一起，从而实现靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成多重抗癌功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南医学院第一附属医院
<120> 一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用
<160> 113
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 818
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Arg Ser Phe Ala Ser Asn Tyr Asp Cys Cys Leu Ser Tyr
20 25 30
Ile Gln Thr Pro Leu Pro Ser Arg Ala Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln
35 40 45
Met Ala Asp Glu Ala Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys
50 55 60
Lys Arg Lys Ser Val Cys Ala Asp Pro Lys Gln Asn Trp Val Lys Arg
65 70 75 80
Ala Val Asn Leu Leu Ser Leu Arg Val Lys Lys Met Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Pro Ala Pro Thr Leu Pro Glu
100 105 110
Gln Ala Gln Pro Trp Gly Val Pro Val Glu Val Glu Ser Leu Leu Val
115 120 125
His Pro Gly Asp Leu Leu Gln Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val
130 135 140
Gln Ser Ile Asn Trp Leu Arg Asp Gly Val Gln Leu Val Glu Ser Asn
145 150 155 160
Arg Thr Arg Ile Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Arg Asp Ser Ile Pro
165 170 175
Ala Asp Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Val Thr Ser Ser Pro Ser Gly Ser
180 185 190
Asp Thr Thr Tyr Phe Ser Val Asn Val Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ser
195 200 205
Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr
210 215 220
Asp Asn Thr Lys Pro Asn Arg Arg Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser
225 230 235 240
Pro Glu Lys Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr
245 250 255
Val Lys Phe Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg
260 265 270
Trp Leu Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly
275 280 285
Tyr Lys Val Arg Tyr Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val
290 295 300
Pro Ser Asp Lys Gly Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Ile Asn His Thr Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His
325 330 335
Arg Pro Ile Leu Gln Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu
340 345 350
Gly Ser Asn Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro
355 360 365
His Ile Gln Trp Leu Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly
370 375 380
Pro Asp Asn Leu Pro Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn
385 390 395 400
Thr Thr Asp Lys Glu Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe
405 410 415
Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu
420 425 430
Ser His His Ser Ala Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg
435 440 445
Pro Ala Val Met Thr Ser Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Pro Arg Gly Pro
450 455 460
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
465 470 475 480
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
485 490 495
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
500 505 510
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
515 520 525
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
530 535 540
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
545 550 555 560
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
565 570 575
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
580 585 590
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
595 600 605
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
610 615 620
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
625 630 635 640
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
645 650 655
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
660 665 670
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
675 680 685
Thr Pro Gly Lys Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
690 695 700
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
705 710 715 720
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
725 730 735
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
740 745 750
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
755 760 765
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
770 775 780
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
785 790 795 800
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
805 810 815
Asp Phe
<210> 2
<211> 2567
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaccgggac cgatccagcc tccggacgcg gccgctaatc actcctcaca gtgacctcaa 60
gtcctgcagg catgtacagc atgcagctcg catcctgtgt cacattgaca cttgtgctcc 120
ttgtcaacag aagcttcgca agcaactacg actgttgcct ctcgtacata cagacgcctc 180
ttccttccag agctattgtg ggtttcacaa gacagatggc cgatgaggct tgtgacatta 240
atgctatcat ctttcacacg aagaaaagaa aatctgtgtg cgctgatcca aagcagaact 300
gggtgaaaag ggctgtgaac ctcctcagcc taagagtcaa gaagatgggt ggaggttcgg 360
gtggaggttc aggtggaggt tctaggccag ccccaacctt gcctgaacaa gctcagccct 420
ggggagtccc tgtggaagtg gagtctctcc tggtccaccc tggcgacctg ctacagcttc 480
gctgtcggct tcgcgatgat gtgcagagca tcaactggct gcgggatggg gtgcagctgg 540
tggagagcaa ccgtacccgc atcacagggg aggaggtgga ggtgcgggac tccatccccg 600
ctgactctgg cctctacgct tgcgtgacca gcagcccctc tggcagcgat accacctact 660
tctccgtcaa tgtctcagat gcactcccat cctcggaaga tgatgacgac gacgatgact 720
cctcctcgga ggagaaagag acggacaaca ccaaaccaaa ccgtaggcct gtagctccct 780
actggacatc cccagagaaa atggagaaga aactgcatgc ggtgcccgct gccaagacgg 840
tgaagttcaa gtgcccgtcg agtgggacac ccaaccccac tctgcgctgg ttgaaaaatg 900
gcaaagagtt taagcctgac caccgaattg gaggctacaa ggttcgctat gccacctgga 960
gcatcataat ggattctgtg gtgccttctg acaagggcaa ctacacctgc atcgtggaga 1020
atgagtatgg gagcatcaac cacacctacc agcttgacgt cgtggaacga tctccgcacc 1080
gacccatcct tcaggcaggg ctgcctgcca acaagacagt ggccctgggc agcaatgtgg 1140
agttcatgtg taaggtgtac agcgatccgc agcctcacat tcagtggctg aagcacatcg 1200
aggtgaacgg gagtaagatc gggccagaca acttgccgta tgtccagatc ctgaagactg 1260
ctggagttaa taccaccgac aaggaaatgg aggtgcttca tctacggaat gtctcctttg 1320
aggatgcggg ggagtatacg tgcttggcgg gtaactctat cggactctcc catcactctg 1380
catggttgac cgttctggaa gccctggaag agagaccagc tgtgatgacc tcaccgctct 1440
acctggagga tcccagaggg cccacaatca agccctgtcc tccatgcaaa tgcccagcac 1500
ctaacctctt gggtggacca tccgtcttca tcttccctcc aaagatcaag gatgtactca 1560
tgatctccct gagccccata gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag 1620
atgtccagat cagctggttt gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc 1680
atagagagga ttacaacagt actctccggg tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg 1740
actggatgag tggcaaggag ttcaaatgca aggtcaacaa caaagacctc ccagcgccca 1800
tcgagagaac catctcaaaa cccaaagggt cagtaagagc tccacaggta tatgtcttgc 1860
ctccaccaga agaagagatg actaagaaac aggtcactct gacctgcatg gtcacagact 1920
tcatgcctga agacatttac gtggagtgga ccaacaacgg gaaaacagag ctaaactaca 1980
agaacactga accagtcctg gactctgatg gttcttactt catgtacagc aagctgagag 2040
tggaaaagaa gaactgggtg gaaagaaata gctactcctg ttcagtggtc cacgagggtc 2100
tgcacaatca ccacacgact aagagcttct cccggactcc gggtaaagcc atacaggtga 2160
cccaaccttc agtggtgttg gctagcagcc atggtgtcgc cagctttcca tgtgaatatt 2220
caccatcaca caacactgat gaggtccggg tgactgtgct gcggcagaca aatgaccaaa 2280
tgactgaggt ctgtgccacg acattcacag agaagaatac agtgggcttc ctagattacc 2340
ccttctgcag tggtaccttt aatgaaagca gagtgaacct caccatccaa ggactgagag 2400
ctgttgacac gggactgtac ctctgcaagg tggaactcat gtacccaccg ccatactttg 2460
tgggcatggg caacgggacg cagatttatg tcattgatcc agaaccatgc ccggattctg 2520
acttctgagt ctagagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttg 2567
<210> 3
<211> 59
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaccgggac cgatccagcc tccggacgcg gccgctaatc actcctcaca gtgacctca 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaggatgcg agctgcatgc tgtacatgcc tgcaggactt gaggtcactg tgaggagtg 59
<210> 5
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcagctcgc atcctgtgtc acattgacac ttgtgctcct tgtcaacaga ag 52
<210> 6
<211> 53
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgagaggca acagtcgtag ttgcttgcga agcttctgtt gacaaggagc aca 53
<210> 7
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgactgttg cctctcgtac atacagacgc ctcttcct 38
<210> 8
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaacccaca atagctctgg aaggaagagg cgtctgtatg t 41
<210> 9
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccagagcta ttgtgggttt cacaagacag atggccgatg aggcttg 47
<210> 10
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtgtgaaag atgatagcat taatgtcaca agcctcatcg gccatct 47
<210> 11
<211> 59
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cattaatgct atcatctttc acacgaagaa aagaaaatct gtgtgcgctg atccaaagc 59
<210> 12
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcccttttca cccagttctg ctttggatca gcgcaca 37
<210> 13
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaactgggt gaaaagggct gtgaacctcc tcagcctaa 39
<210> 14
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctccacccat cttcttgact cttaggctga ggaggttcac a 41
<210> 15
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagtcaagaa gatgggtgga ggttcgggtg gaggttcag 39
<210> 16
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctggcctag aacctccacc tgaacctcca cccgaac 37
<210> 17
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtggaggttc taggccagcc ccaaccttgc ctgaacaa 38
<210> 18
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagactccac ttccacaggg actccccagg gctgagcttg ttcaggcaag gttggg 56
<210> 19
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cctgtggaag tggagtctct cctggtccac cctggcgacc tgctac 46
<210> 20
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagccgacag cgaagctgta gcaggtcgcc aggg 34
<210> 21
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcttcgctg tcggcttcgc gatgatgtgc agagc 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcccgcagcc agttgatgct ctgcacatca tcgcg 35
<210> 23
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atcaactggc tgcgggatgg ggtgcagctg gtggagagca accgtacc 48
<210> 24
<211> 53
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtcccgca cctccacctc ctcccctgtg atgcgggtac ggttgctctc cac 53
<210> 25
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtggaggtgc gggactccat ccccgctgac tctggcctct a 41
<210> 26
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tggtatcgct gccagagggg ctgctggtca cgcaagcgta gaggccagag tcagcg 56
<210> 27
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctctggcag cgataccacc tacttctccg tcaatgtctc agatgcact 49
<210> 28
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catcatcttc cgaggatggg agtgcatctg agacattgac g 41
<210> 29
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cccatcctcg gaagatgatg acgacgacga tgactcctcc tcgg 44
<210> 30
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gttgtccgtc tctttctcct ccgaggagga gtcatcgt 38
<210> 31
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aggagaaaga gacggacaac accaaaccaa accgtaggcc tgtagctccc tactgg 56
<210> 32
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctccattttc tctggggatg tccagtaggg agctacaggc 40
<210> 33
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acatccccag agaaaatgga gaagaaactg catgcggtgc ccgctgccaa ga 52
<210> 34
<211> 59
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtggggttgg gtgtcccact cgacgggcac ttgaacttca ccgtcttggc agcgggcac 59
<210> 35
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gggacaccca accccactct gcgctggttg aaaaatggca a 41
<210> 36
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggtggtcagg cttaaactct ttgccatttt tcaaccagcg 40
<210> 37
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agagtttaag cctgaccacc gaattggagg ctacaaggtt cg 42
<210> 38
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gatgctccag gtggcatagc gaaccttgta gcctccaatt c 41
<210> 39
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctatgccacc tggagcatca taatggattc tgtggtgcct 40
<210> 40
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caggtgtagt tgcccttgtc agaaggcacc acagaatcca ttat 44
<210> 41
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gacaagggca actacacctg catcgtggag aatgagtatg gg 42
<210> 42
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccacgacgtc aagctggtag gtgtggttga tgctcccata ctcattctcc acgatg 56
<210> 43
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccagcttgac gtcgtggaac gatctccgca ccga 34
<210> 44
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ccctgcctga aggatgggtc ggtgcggaga tcgtt 35
<210> 45
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cccatccttc aggcagggct gcctgccaac aagaca 36
<210> 46
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctgcccagg gccactgtct tgttggcagg cag 33
<210> 47
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gtggccctgg gcagcaatgt ggagttcatg tgtaaggt 38
<210> 48
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
actgaatgtg aggctgcgga tcgctgtaca ccttacacat gaactccaca tt 52
<210> 49
<211> 36
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgcagcctca cattcagtgg ctgaagcaca tcgagg 36
<210> 50
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aagttgtctg gcccgatctt actcccgttc acctcgatgt gcttcagcc 49
<210> 51
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agatcgggcc agacaacttg ccgtatgtcc agatcctg 38
<210> 52
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tggtattaac tccagcagtc ttcaggatct ggacatacgg c 41
<210> 53
<211> 54
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aagactgctg gagttaatac caccgacaag gaaatggagg tgcttcatct acgg 54
<210> 54
<211> 57
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aagcacgtat actcccccgc atcctcaaag gagacattcc gtagatgaag cacctcc 57
<210> 55
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgggggagta tacgtgcttg gcgggtaact ctatcgga 38
<210> 56
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
catgcagagt gatgggagag tccgatagag ttacccgcc 39
<210> 57
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctctcccatc actctgcatg gttgaccgtt ctggaagccc tggaagagag a 51
<210> 58
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gcggtgaggt catcacagct ggtctctctt ccagggcttc c 41
<210> 59
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctgtgatgac ctcaccgctc tacctggagg atcccagagg gcccac 46
<210> 60
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgcatggagg acagggcttg attgtgggcc ctctgggatc 40
<210> 61
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
agagggccca caatcaagcc 20
<210> 62
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ctgggcattt gcatggagga cagggcttga ttgtgggccc 40
<210> 63
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cctccatgca aatgcccagc acctaacctc ttgggtggac catccgt 47
<210> 64
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgatctttgg agggaagatg aagacggatg gtccacccaa 40
<210> 65
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc tccct 45
<210> 66
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cacatgtgac tatggggctc agggagatca tgagtacatc ct 42
<210> 67
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gagccccata gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcg 38
<210> 68
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
accagctgat ctggacatct gggtcatcct cgctcacatc caccacca 48
<210> 69
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agatgtccag atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta ca 42
<210> 70
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gggtttgtgt ctgagctgtg tgtacttcca cgttgttcac aa 42
<210> 71
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cacagctcag acacaaaccc atagagagga ttacaacagt actct 45
<210> 72
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tggatgggga gggcactgac cacccggaga gtactgttgt aatcctctct at 52
<210> 73
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttca 48
<210> 74
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tctttgttgt tgaccttgca tttgaactcc ttgccactca tc 42
<210> 75
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aatgcaaggt caacaacaaa gacctcccag cgcccatc 38
<210> 76
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ccctttgggt tttgagatgg ttctctcgat gggcgctggg agg 43
<210> 77
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgt 47
<210> 78
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cttcttctgg tggaggcaag acatatacct gtggagctct tac 43
<210> 79
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cttgcctcca ccagaagaag agatgactaa gaaacaggtc act 43
<210> 80
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ctgtgaccat gcaggtcaga gtgacctgtt tcttagtcat ct 42
<210> 81
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt acgtggagtg gaccaa 56
<210> 82
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ttgtagttta gctctgtttt cccgttgttg gtccactcca cgtaaatg 48
<210> 83
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc tgg 43
<210> 84
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tacatgaagt aagaaccatc agagtccagg actggttcag tgttc 45
<210> 85
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaa 46
<210> 86
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ctatttcttt ccacccagtt cttcttttcc actctcagct tgct 44
<210> 87
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gaagaactgg gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtcc 44
<210> 88
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cttagtcgtg tggtgattgt gcagaccctc gtggaccact gaacaggagt ag 52
<210> 89
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cacaatcacc acacgactaa gagcttctcc cggactccgg gtaaagccat acaggtga 58
<210> 90
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
ccaacaccac tgaaggttgg gtcacctgta tggctttacc c 41
<210> 91
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ccaaccttca gtggtgttgg ctagcagcca tggtgtcgcc agctttccat 50
<210> 92
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tgttgtgtga tggtgaatat tcacatggaa agctggcgac ac 42
<210> 93
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gtgaatattc accatcacac aacactgatg aggtccgggt ga 42
<210> 94
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ggtcatttgt ctgccgcagc acagtcaccc ggacctcatc ag 42
<210> 95
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tgcggcagac aaatgaccaa atgactgagg tctgtgcc 38
<210> 96
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
agcccactgt attcttctct gtgaatgtcg tggcacagac ctcagtcatt t 51
<210> 97
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cagagaagaa tacagtgggc ttcctagatt accccttctg cag 43
<210> 98
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ctctgctttc attaaaggta ccactgcaga aggggtaatc tagg 44
<210> 99
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tggtaccttt aatgaaagca gagtgaacct caccatccaa gga 43
<210> 100
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gtcccgtgtc aacagctctc agtccttgga tggtgaggtt ca 42
<210> 101
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gagctgttga cacgggactg tacctctgca aggtggaac 39
<210> 102
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gcccacaaag tatggcggtg ggtacatgag ttccaccttg cagaggtac 49
<210> 103
<211> 54
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ccgccatact ttgtgggcat gggcaacggg acgcagattt atgtcattga tcca 54
<210> 104
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cagaatccgg gcatggttct ggatcaatga cataaatctg cg 42
<210> 105
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gaaccatgcc cggattctga cttctgagtc tagagtcgac aatcaa 46
<210> 106
<211> 43
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
caaattttgt aatccagagg ttgattgtcg actctagact cag 43
<210> 107
<211> 63
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tacagcatgc agctcgcatc ctgtgtcaca ttgacacttg tgctccttgt caacagaagc 60
ttc 63
<210> 108
<211> 210
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gcaagcaact acgactgttg cctctcgtac atacagacgc ctcttccttc cagagctatt 60
gtgggtttca caagacagat ggccgatgag gcttgtgaca ttaatgctat catctttcac 120
acgaagaaaa gaaaatctgt gtgcgctgat ccaaagcaga actgggtgaa aagggctgtg 180
aacctcctca gcctaagagt caagaagatg 210
<210> 109
<211> 1065
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
aggccagccc caaccttgcc tgaacaagct cagccctggg gagtccctgt ggaagtggag 60
tctctcctgg tccaccctgg cgacctgcta cagcttcgct gtcggcttcg cgatgatgtg 120
cagagcatca actggctgcg ggatggggtg cagctggtgg agagcaaccg tacccgcatc 180
acaggggagg aggtggaggt gcgggactcc atccccgctg actctggcct ctacgcttgc 240
gtgaccagca gcccctctgg cagcgatacc acctacttct ccgtcaatgt ctcagatgca 300
ctcccatcct cggaagatga tgacgacgac gatgactcct cctcggagga gaaagagacg 360
gacaacacca aaccaaaccg taggcctgta gctccctact ggacatcccc agagaaaatg 420
gagaagaaac tgcatgcggt gcccgctgcc aagacggtga agttcaagtg cccgtcgagt 480
gggacaccca accccactct gcgctggttg aaaaatggca aagagtttaa gcctgaccac 540
cgaattggag gctacaaggt tcgctatgcc acctggagca tcataatgga ttctgtggtg 600
ccttctgaca agggcaacta cacctgcatc gtggagaatg agtatgggag catcaaccac 660
acctaccagc ttgacgtcgt ggaacgatct ccgcaccgac ccatccttca ggcagggctg 720
cctgccaaca agacagtggc cctgggcagc aatgtggagt tcatgtgtaa ggtgtacagc 780
gatccgcagc ctcacattca gtggctgaag cacatcgagg tgaacgggag taagatcggg 840
ccagacaact tgccgtatgt ccagatcctg aagactgctg gagttaatac caccgacaag 900
gaaatggagg tgcttcatct acggaatgtc tcctttgagg atgcggggga gtatacgtgc 960
ttggcgggta actctatcgg actctcccat cactctgcat ggttgaccgt tctggaagcc 1020
ctggaagaga gaccagctgt gatgacctca ccgctctacc tggag 1065
<210> 110
<211> 699
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gatcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60
ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120
ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180
atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240
gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300
agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360
accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420
gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480
gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540
gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600
aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660
caccacacga ctaagagctt ctcccggact ccgggtaaa 699
<210> 111
<211> 420
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gccatacagg tgacccaacc ttcagtggtg ttggctagca gccatggtgt cgccagcttt 60
ccatgtgaat attcaccatc acacaacact gatgaggtcc gggtgactgt gctgcggcag 120
acaaatgacc aaatgactga ggtctgtgcc acgacattca cagagaagaa tacagtgggc 180
ttcctagatt accccttctg cagtggtacc tttaatgaaa gcagagtgaa cctcaccatc 240
caaggactga gagctgttga cacgggactg tacctctgca aggtggaact catgtaccca 300
ccgccatact ttgtgggcat gggcaacggg acgcagattt atgtcattga tccagaacca 360
tgcccggatt ctgacttctg agtctagagt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg 420
<210> 112
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 113
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
agcgtaaaag gagcaacata gt 22

Claims (10)

1.一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，其特征在于，所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，其特征在于，编码所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的重组载体。
4.权利要求3所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增，得第一轮PCR产物；所述第一轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(2)以所述第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.60所示引物为引物对进行第二轮PCR扩增，得P2407A片段；所述第二轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.3所示引物0.5μL，SEQ ID NO.60所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第一轮PCR产物2μL；
(3)以SEQ ID NO.61～106所示的引物组进行第三轮PCR扩增，得第三轮PCR产物；所述第三轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；
(4)以所述第三轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.106为引物对进行第四轮PCR扩增，得P2407B片段；所述第四轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH2O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.61所示引物0.5μL，SEQ ID NO.106所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第三轮PCR产物2μL；
(5)将所述P2407A片段和所述P2407B片段与pcDNA3.4质粒连接，得重组载体；
步骤(1)和步骤(3)之间不存在时间上的先后关系。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述第一轮PCR扩增和步骤(3)所述第三轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸3min。
6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述第二轮PCR扩增和步骤(4)所述第四轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸5min。
7.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(5)所述连接前，还包括对所述pcDNA3.4质粒进行线性化处理，所述线性化处理为利用NotI和XbaI双酶切。
8.一种包含权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或权利要求3所述重组载体或利用权利要求4～7任一项所述构建方法构建得到的重组载体的表达细胞。
9.权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或权利要求3所述重组载体或利用权利要求4～7任一项所述构建方法构建得到的重组载体或权利要求8所述表达细胞在制备具有多重抗癌功效药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述多重抗癌功效为靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成。
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