CN108383911A

CN108383911A - 一种双特异性抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108383911A
Application number: CN201810118019.4A
Authority: CN
Inventors: 孙瑞霞
Original assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗体及其制备方法和应用。所述双特异性抗体，其从N端到C端包含：肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体；重链恒定区；和免疫细胞表面抗原对应抗体。本发明的双特异性抗体可同时识别肝癌细胞表面抗原和免疫细胞表面抗原，实现免疫细胞对肝癌细胞的靶向杀伤。同时，本发明的双特异性抗体作为桥梁连接免疫细胞和肝癌细胞，可增加免疫细胞与肝癌细胞的接触时间，有效增强免疫细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于同时结合了两种抗原，本发明的双特异性抗体可有效激活免疫细胞，拉近免疫细胞与肝癌细胞的距离，增加效靶比，增强免疫细胞的杀瘤能力。

Description

一种双特异性抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫领域，特别是涉及一种双特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，其在免疫治疗中具有广阔的应用前景。

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，死亡率较高，分为原发性和继发性两大类，目前的治疗方法有手术治疗、放射治疗等。

如何提供一种用于治疗肝癌的双特异性抗体，对于肝癌治疗具有重要的意义。

目前，常见的双特异性抗体构型以简单地串联两个单链抗体(single—chainantibody fragment，scFv)为主，这种构型分子量小，容易到达肿瘤微环境，但是由于不含重链恒定区(也称为Fc(Fragment crystallizable)段)，稳定性差。

发明内容

本发明提供一种双特异性抗体及其制备方法和应用。所述双特异性抗体为Fc单链构型，能够同时结合免疫细胞和肝癌细胞，提高杀瘤效率。

本发明一方面提供一种双特异性抗体，其从N端到C端包含：

肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体；

重链恒定区；和

免疫细胞表面抗原对应抗体。

本发明的双特异性抗体中，优选地，所述肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)

本发明的双特异性抗体中，优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)

本发明的双特异性抗体中，优选地，所述免疫细胞表面抗原对应抗体可为CD16a对应抗体或CD3对应抗体，其中，CD16a对应抗体的氨基酸序列可如SEQ ID NO:3所示，CD3对应抗体的氨基酸序列可如SEQ ID NO:4所示。

DTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGHSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPASFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRAGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS(SEQ ID NO:4)

本发明的双特异性抗体中，优选地，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:13或14所示。

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDTVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGHSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTTSNLESGIPASFSASGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSSGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRAGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS(SEQ ID NO:14)

本发明的双特异性抗体中，所述双特异性抗体为Fc单链构型。

本发明的双特异性抗体中，优选地，所述双特异性抗体为人源化抗体。

本发明另一方面提供一种编码上述双特异性抗体的核苷酸序列，其从5’端到3’端包含：

编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列；

编码重链恒定区的核苷酸序列；和

编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列。

优选地，所述编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示：

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:15)。

优选地，所述编码重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示：

ggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa(SEQ ID NO:16)。

优选地，所述编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列可为：编码CD16a对应抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:17所示；或编码CD3对应抗体的核苷酸序列，如SEQ IDNO:18所示。

gataccgtgctgacccagagcccggcgagcctggcggtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgcaaagcgagccagagcgtggattttgatggccatagctttatgaactggtatcagcagaaaccgggccagccgccgaaactgctgatttataccaccagcaacctggaaagcggcattccggcgagctttagcgcgagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagataccgcgacctattattgccagcagagcaacgaagatccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:17)

gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgcgcgggcggcggcggcagccaggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagccgggccgcagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagccgcgataacagcaaaaacaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccggcgtgtatttttgcgcgcgctattatgatgatcattatagcctggattattggggccagggcaccccggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:18)

本发明的编码双特异性抗体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:19或20所示。

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaagataccgtgctgacccagagcccggcgagcctggcggtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgcaaagcgagccagagcgtggattttgatggccatagctttatgaactggtatcagcagaaaccgggccagccgccgaaactgctgatttataccaccagcaacctggaaagcggcattccggcgagctttagcgcgagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagataccgcgacctattattgccagcagagcaacgaagatccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:19)

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgcgcgggcggcggcggcagccaggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagccgggccgcagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagccgcgataacagcaaaaacaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccggcgtgtatttttgcgcgcgctattatgatgatcattatagcctggattattggggccagggcaccccggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:20)

本发明另一方面提供一种双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)以人血液总RNA反转录的cDNA为模板，根据引物扩增出编码重链恒定区的核苷酸序列、编码肝癌细胞表面抗原GPC3(即磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)对应抗体的核苷酸序列、编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列，

其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；

其中，扩增所需的引物为：

引物1，正向引物：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG(SEQ ID NO:5)，酶切位点为HindIII；

引物2，反向引物：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT(SEQ ID NO:6)，酶切位点为EcoRI；

引物3，正向引物：CCGCTCGAGCCTAGAACCATGTCACCCTGACCT(SEQ ID NO:7)，酶切位点为XhoI；

引物4，反向引物：CCCAAGCTTCAAGGCGCGACAGCTGCCCTAG(SEQ ID NO:8)，酶切位点为HindIII；

引物5，正向引物：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC(SEQ ID NO:9)，酶切位点为XhoI；

引物6，反向引物：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA(SEQ ID NO:10)，酶切位点为HindIII；

引物7，正向引物：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG(SEQ ID NO:11)，酶切位点为EcoRI；

引物8，反向引物：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG(SEQ ID NO:12)，酶切位点为XbaI；

其中，引物1、引物2用于扩增编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列，引物3、引物4用于扩增编码CD3对应抗体的核苷酸序列，引物5、引物6用于扩增编码作为免疫细胞表面抗原对应抗体的序列的CD16a对应抗体的核苷酸序列，引物7、引物8用于扩增编码作为免疫细胞表面抗原对应抗体的序列的GPC3对应抗体的核苷酸序列；

扩增出的编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的一端和编码GPC3对应抗体的核苷酸序列具有相同的酶切位点，

扩增出的编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的另一端和编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列具有相同的酶切位点，

(2)将扩增序列利用酶切、连接获得拼接序列；其中，拼接序列为编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD16a对应抗体的核苷酸序列，或编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD3对应抗体的核苷酸序列；

(3)对获得的拼接序列利用载体构建包含拼接序列的质粒；

(4)将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。

在一个实施方式中，所述编码重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

在一个实施方式中，所述编码GPC3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

在一个实施方式中，所述编码CD16a对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

在一个实施方式中，所述编码CD3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

在一个实施方式中，获得的拼接序列是编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD16a对应抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:19所示；或者是编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD3对应抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:20所示。

在一个实施方式中，构建质粒的载体没有具体限定，只要能够用于构建包含拼接序列的质粒即可，例如可以为pcDNA6-Myc/His B。

在一个实施方式中，哺乳动物细胞可以为293T细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

本发明再一方面提供上述双特异性抗体用于制备治疗肝癌的药物的应用，特别是用于制备杀伤肝癌细胞的基因工程药物的应用。

本发明再一方面提供治疗肝癌的方法，所述方法包括：将上述双特异性抗体体外负载免疫细胞，而后输送，例如静脉回输，至患者体内。

本发明再一方面提供包含上述双特异性抗体的药物制剂，所述药物制剂优选为冻干粉制剂。

为了提高本发明所述双特异性抗体的贮存稳定性和运输稳定性的问题，本发明再一方面提供了一种冻干粉制剂，其原料包括如下组分：上述双特异性抗体30～60mg/mL，冻干保护剂20～40mg/mL，稳定剂5～40mg/mL，表面活性剂5～10mg/mL，余量为水。

所述冻干保护剂选自明胶、甘油、甘露醇、海藻糖、蔗糖、N-甲基-D-葡萄糖胺、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、组氨酸等中的一种或多种；优选地，所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比(5～7)：1的混合物。

所述表面活性剂选自吐温80、吐温20、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。

所述稳定剂选自壳聚糖、N-精氨酸壳聚糖、O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖等中的一种或多种；优选地，所述稳定剂为N-精氨酸壳聚糖与O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖质量比(1～3)：(1～3)的混合物。

所述冻干粉制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)按配比制备含有上述双特异性抗体，冻干保护剂，稳定剂，表面活性剂的水溶液；

(2)用pH调节剂调节pH至6.0～8.0，过滤；

(3)冷冻干燥。

其中，

步骤(2)所述过滤是使用0.22μm的微孔滤膜进行过滤；

步骤(2)所述pH调节剂可以为饱和Na₂HPO₄溶液；优选地，调节pH至6.0～6.5；

步骤(3)所述冷冻干燥为真空冷冻干燥，具体工艺步骤为：

a.以降温速度0.5-1℃/分钟的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-45℃，当样品温度降至-40℃时，保持2-3h；

b.抽真空，当真空度(绝对压强)达到20±2Pa时，将搁板温度以0.1-0.5℃/分钟的速度升温，待视镜处样品水线消失后，结束第一次干燥；

c.将搁板温度以0.5-1℃/分钟的速度升温，升至25℃，真空度设置为0.01Pa，保温4-8h，结束第二次干燥。

有益效果

区别于现有技术的情况，本发明的双特异性抗体的制备方法包括以下步骤：根据引物扩增出抗体的重链恒定区序列、肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的序列、免疫细胞表面抗原对应抗体的序列，其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；扩增出的重链恒定区序列的一端和GPC3对应抗体的序列具有相同的酶切位点，扩增出的重链恒定区序列的另一端和免疫细胞表面抗原对应抗体的序列具有相同的酶切位点，利用酶切、连接获得拼接序列；构建包含拼接序列的质粒，拼接序列为人源化处理后的序列；将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。

本发明的双特异性抗体可同时识别肝癌细胞表面抗原和免疫细胞表面抗原，实现免疫细胞对肝癌细胞的靶向杀伤。同时，本发明的双特异性抗体作为桥梁连接免疫细胞和肝癌细胞，可增加免疫细胞与肝癌细胞的接触时间，有效增强免疫细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于同时结合了两种抗原，本发明的双特异性抗体可有效激活免疫细胞，拉近免疫细胞与肝癌细胞的距离，增加效靶比，增强免疫细胞的杀瘤能力。此外，本发明的双特异性抗体以人源化单抗序列为基本序列，Fc单链构型为基本构型，人源化的双特异性抗体可消除人抗鼠抗体反应，Fc单链构型可确保双特异性抗体结构稳定，同时使其分子量与普通单抗的分子量相似，且延长其在体内的半衰期。

附图说明

图1显示GPC3-CD16A双抗大小为80kD左右，变性前后未发生构型变化。

图2显示GPC3-CD3双抗大小为80kD左右，变性前后未发生构型变化。

图3显示双抗在4℃放置3天、6天后，仍能保持结构的完整性而不降解，第8天、第10天时开始出现少量降解片段。

图4显示GPC3-CD16A双抗既可以和NK细胞结合，又可以与HepG2细胞结合，具有双亲和性。

图5显示GPC3-CD3双抗既可以和T细胞结合，又可以与HepG2细胞结合，具有双亲和性。

图6显示双特异性抗体可以有效增强NK细胞和T细胞分泌TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的能力。

图7显示在不同效靶比的条件下，双抗在终浓度为50nM的条件下均可有效增强NK细胞和T细胞对HepG2的细胞毒作用。

图8显示双抗负载的NK细胞和T细胞在与HepG2细胞共孵育后，可以使肿瘤细胞的K-ras和cMyc原癌基因表达下调，而抑癌基因Rb和P53的表达上调。

具体实施方式

以下将结合实施例进一步描述本发明。提供下列实施例是为了使本领域普通技术人员更容易理解本发明，但本发明不限于下列实施例。

实施例1

如下制备GPC3-CD16A双特异性抗体，以下有时简称为GPC3-CD16A双抗。

A.根据引物扩增编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列、编码GPC3对应抗体的核苷酸序列、编码CD16a对应抗体的核苷酸序列，其中，编码GPC3为肝癌细胞表面抗原，编码CD16a为NK细胞表面抗原。

编码重链恒定区的核苷酸序列:

ggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaa(SEQ ID NO:16)

编码GPC3对应抗体的核苷酸序列:

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:15)

编码CD16a对应抗体的核苷酸序列：

其中，用于扩增编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的引物为：

正向引物：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG(SEQ ID NO:5)，酶切位点为HindIII；

反向引物：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT(SEQ ID NO:6)，酶切位点为EcoRI。

其中，用于扩增编码GPC3对应抗体的核苷酸序列的引物为：

正向引物：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG(SEQ ID NO:11)，酶切位点为EcoRI；

反向引物：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG(SEQ ID NO:12)，酶切位点为XbaI。

其中，用于扩增编码CD16a对应抗体的核苷酸序列的引物为：

正向引物：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC(SEQ ID NO:9)，酶切位点为XhoI；

反向引物：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA(SEQ ID NO:10)，酶切位点为HindIII。

其中，在扩增过程中，以人血液总RNA反转录的cDNA为模板进行扩增。

采用Takara ExTaq/rTaq试剂，反应体系如下(50μL)：

PCR反应程序：首先94℃变性5min；然后进行30个循环；94℃，30s；59℃，30s；72℃，60s；最后72℃延伸7min。

B.对于扩增的序列，利用酶切、连接获得拼接序列。

1、用HindIII和EcoRI内切酶双酶切编码重链恒定区的核苷酸序列，酶切体

37℃水浴1h，回收酶切产物。

采用相同方法，用EcoRI和XbaI内切酶双酶切编码GPC3对应抗体的核苷酸序列，XhoI和HindIII内切酶双酶切编码CD16a对应抗体的核苷酸序列。内切酶均购自takara公司。

2、先用T4连接酶(takara)连接双酶切后的编码重链恒定区的核苷酸序列和编码GPC3对应抗体的核苷酸序列，体系如下：

16℃连接过夜。回收连接产物，随后采用相同方法，用T4连接酶将连接后的序列与双酶切后的编码CD16a对应抗体的核苷酸序列相连，获得编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD16a对应抗体的核苷酸序列的拼接序列(SEQ ID NO:19)：

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaagataccgtgctgacccagagcccggcgagcctggcggtgagcctgggccagcgcgcgaccattagctgcaaagcgagccagagcgtggattttgatggccatagctttatgaactggtatcagcagaaaccgggccagccgccgaaactgctgatttataccaccagcaacctggaaagcggcattccggcgagctttagcgcgagcggcagcggcaccgattttaccctgaacattcatccggtggaagaagaagataccgcgacctattattgccagcagagcaacgaagatccgtatacctttggcggcggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc

C.构建包含拼接序列的质粒。

1、用XbaI和XhoI内切酶双酶切载体pcDNA6-Myc/His B，酶切体系如下：

37℃水浴1h，回收双酶切后的载体。用T4连接酶连接拼接序列和双酶切后的载体，连接体系如下：

D.将质粒转染于中国仓鼠卵巢CHO细胞(购自ATCC)，筛选鉴定，以protein A柱(Cloud-Clone)提取纯化双特异性抗体。具体操作如下：

1、取CHO细胞，按2x10⁶个/瓶铺于T175瓶，待细胞回合度达70％-80％时可用于转染。

2、制备质粒-Lipofectamine 2000(Lipofectamine 2000购自Invitrogen)复合物，如下:

a、用50μL无血清培养基稀释质粒(0.8g)，轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48μL无血清培养基稀释2μLLipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使质粒-Lipofectamine2000复合物形成；

3、将100μL DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37℃孵箱中培养24～48h后，1：10传代，加入G418筛选。

5、等细胞在G418作用下，长满后收集培养上清，4℃，5000rpm/min离心20min，收集上清。

6、收集的上清过protein A柱，具体步骤如下：

a取Protein A柱平衡至室温，用10倍柱体积的PBS洗涤平衡层析柱；

b将上清与等体积2×PBS缓冲液混合，缓慢加入层析柱；

c用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出；

d加入2-5倍柱体积0.1M柠檬酸(pH 2.7)或者0.1M甘氨酸(pH 3.0)，收集洗脱液；

e洗脱后的抗体加入饱和Na₂HPO₄溶液进行中和；

f浓缩洗脱液后加入50％甘油-20℃保存，即为GPC3-CD16A双抗。

GPC3-CD16A双抗的氨基酸序列：

实施例2

编码重链恒定区的核苷酸序列和编码GPC3对应抗体的核苷酸序列与实施例1中相同。除下述内容外，实施例2的操作与实施例1相同。

编码CD3对应抗体的核苷酸序列：

如下制备GPC3-CD3双特异性抗体，以下有时简称为GPC3-CD3双抗。

A.根据引物扩增编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列、编码GPC3对应抗体的核苷酸序列、编码CD3对应抗体的核苷酸序列，其中，GPC3为肝癌细胞表面抗原，CD3为T细胞表面抗原。

其中，用于扩增编码GPC3对应抗体的核苷酸序列的引物为：

反向引物：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG(SEQ IDNO:12)，酶切位点为XbaI。

其中，用于扩增编码CD3对应抗体的核苷酸序列的引物为：

正向引物：CCGCTCGAGCCTAGAACCATGTCACCCTGACCT(SEQ ID NO:7)，酶切位点为XhoI；

反向引物：CCCAAGCTTCAAGGCGCGACAGCTGCCCTAG(SEQ ID NO:8)，酶切位点为HindIII。

B.对于扩增的序列，利用酶切、连接获得拼接序列。

其中，获得的拼接序列是编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD3对应抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)：

gatgtggtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagccagagcctggtgcatagcaacggcaacacctatctgcattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttataaagtgagcaaccgctttagcggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcagccagaacacccatgtgccgccgacctttggccagggcaccaaactggaaattaaaggcggcggcggcagccaggtgaccctgcgcgaaagcggcccggcgctggtgaaaccgacccagaccctgaccctgacctgcacctttagcggctttagcctgagcaccagcggcatgggcgtgggctggattcgccagccgccgggcaaagcgctggaatggctggcgcatatttggtgggatgatgataaacgctataacccggcgctgaaaagccgcctgaccattagcaaagataccagcaaaaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggatccggtggataccgcgacctattattgcgcgcgcattaacccggcgtggtttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcgaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcaaagatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgcgcgggcggcggcggcagccaggtgcagctggtgcagagcggcggcggcgtggtgcagccgggccgcagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagccgcgataacagcaaaaacaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccggcgtgtatttttgcgcgcgctattatgatgatcattatagcctggattattggggccagggcaccccggtgaccgtgagcagc

C.构建包含拼接序列的质粒。

D.将质粒转染于中国仓鼠卵巢CHO细胞(购自ATCC)，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体GPC3-CD3。

获得的GPC3-CD3双抗的氨基酸序列：

实验实施例1双特异性抗体构型分析

如下对实施例1和2制备的双特异性抗体进行构型分析。

取80μL双特异性抗体，加入20μL 5x loading buffer，混匀，100℃煮沸10min，作为变性组。

另取80μL双特异性抗体，加入20μL 5x loading buffer，混匀，不作处理，作为非变性组。

将两组样品跑10％的SDS-PAGE胶检测双特异性抗体构型，具体步骤如下：

1、分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和5％的浓缩胶。按表中各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止，约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水，约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。

待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。

2、加样，用移液枪取处理过的样品溶液10μL，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，将标记(marker)加入到其中一个槽内。

3、电泳，将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

4、染色，将胶剥离后，放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

5、脱色，取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。

6、拍照，将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出(用前也可用酒精棉球擦干净文件夹)，放到扫描仪上，拍照。

结果如图1和2所示，其中，M为Marker，泳道1为非变性双抗，泳道2为变性双抗，图1为GPC3-CD16A双抗，图2为GPC3-CD3双抗。从图1和图2结果中可以看出，双抗变大小为80kD左右，变性前后未发生构型变化，为Fc单链构型。

实验实施例2双特异性抗体稳定性、亲和性分析

如下对实施例1和2制备的双特异性抗体进行稳定性、亲和性分析。

稳定性分析：取3份双抗，每份80μL，分别在4℃放置3天、6天、8天和10天，并对其进行SDS-PAGE电泳检测双抗完整性。实验步骤如实验实施例1所述。结果如图3所示，其中，M为Marker，泳道1、2、5、6分别为GPC3-CD16A在4℃放置3天、6天、8天和10天后的双抗，泳道3、4、7、8分别为GPC3-CD3在4℃放置3天、6天、8天和10天后的双抗。从图3中可以看出，双抗在4℃放置3天、6天后，仍能保持结构的完整性而不降解，第8天、第10天时开始出现少量降解片段。

亲和性分析：

1、将双抗与1X10⁶NK细胞或HepG2细胞共孵育2h，双抗终浓度为10nM。

2、双抗孵育后的细胞悬液加入2mL圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。用含1％多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍。

3、用生物素标记的羊抗人IgG，F(ab’)2片段的特异性抗体室温孵育2h，PBS清洗1遍。

4、加入PE标记的链酶亲和素200μL，吹打混匀，室温避光孵育1h。PBS 2mL离心洗涤2次。

5、将细胞重新悬浮于500μL PBS中，混匀，置流式管中，上机检测。

结果如图4和5所示，其中，图4为GPC3-CD16A双抗与NK细胞或HepG2细胞的亲和性检测结果，图5为GPC3-CD3双抗与NK细胞或HepG2细胞的亲和性检测结果。结果表明，GPC3-CD16A双抗既可以和NK细胞结合，又可以与HepG2细胞结合，具有双亲和性。GPC3-CD3双抗既可以和T细胞结合，又可以与HepG2细胞结合，具有双亲和性。

实验实施例3双特异性抗体细胞因子检测

如下对实施例1和2制备的双特异性抗体进行细胞因子检测。

1、取对数生长期肝癌细胞HepG2，以10⁵个细胞/孔铺12孔板。

2、第二天加入NK细胞、GPC3-CD16A双抗加载的NK、T淋巴细胞或GPC3-CD3加载的T淋巴细胞，以效靶比10:1的浓度共同培养4小时，双抗终浓度为5mM和10mM。

3、收集上清液，ELISA检测细胞TNF-α、颗粒酶(Granzyme)B和穿孔素(Perforin)的分泌水平。

结果如图6所示。图6中，NK上方的柱状图显示在仅加入NK细胞的情况下TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的分泌水平；GPC3-CD16A上方的柱状图显示加入GPC3-CD16A双抗加载的NK细胞的情况下TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的分泌水平；T上方的柱状图显示在仅加入T淋巴细胞的情况下TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的分泌水平；以及GPC3-CD3上方的柱状图显示在加入GPC3-CD3加载的T淋巴细胞的情况下TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的分泌水平。结果表明，双特异性抗体可以有效增强NK细胞和T细胞分泌TNF-α、颗粒酶B和穿孔素的能力。

实验实施例4双特异性抗体杀瘤效率评估

如下对实施例1和2制备的双特异性抗体进行杀瘤效率评估。

1、取对数生长期HepG2细胞，5000个细胞/孔铺96孔细胞培养板。

2、第二天分别加入NK细胞、GPC3-CD16A双抗加载的NK细胞、T细胞或GPC3-CD3双抗加载的T细胞，终浓度分别为50nM，以效靶比0.5:1、1:1和5:1的浓度共同培养4h,每个浓度3个平行孔。

3、加入WST1细胞计数试剂盒中应用液继续培养2小时，96孔细胞培养板放入酶联仪检测在450nm处吸光度OD值，按公式计算细胞杀伤率：

杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-NK对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100％。

结果如图7所示。结果表明，在不同效靶比的条件下，双抗在终浓度为50nM的条件下均可有效增强NK细胞和T细胞对HepG2的细胞毒作用。

实验实施例5双特异性抗体肿瘤相关基因表达检测

如下对实施例1和2制备的双特异性抗体进行肿瘤相关基因表达检测。

HepG2细胞以每孔4×10⁵个细胞种入6孔板内，第二天分别加入NK细胞或T细胞、50nM GPC3-CD16A双抗加载的NK细胞或GPC3-CD3双抗加载的T细胞，效靶比浓度均为5：1，未处理的肿瘤细胞做空白对照，共同培养24小时，弃上清液，PBS漂洗细胞两次，加入TRIZOL1mL，收集细胞裂解液，用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板逆转录cDNA。以所获得的cDNA为模板，qPCR检测肿瘤相关基因的表达。

所用的引物如下：

GAPDH正向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO:21)

GAPDH反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO:22)

K-ras正向引物：5’-ACAGAGAGTGGAGGATGCTTT-3’(SEQ ID NO:23)

K-ras反向引物：5’-TTTCACACAGCCAGGAGTCTT-3’(SEQ ID NO:24)

c-Myc正向引物：5’-AATAGAGCTGCTTCGCCTAGA-3’(SEQ ID NO:25)

c-Myc反向引物：5’-GAGGTGGTTCATACTGAGCAAG-3’(SEQ ID NO:26)

Rb正向引物：5’-AACATGCCCGACCCAATTACA-3’(SEQ ID NO:27)

Rb反向引物：5’-TGTGTTTCTGCATACCTCATGG-3’(SEQ ID NO:28)

P53正向引物：5’-ACCTATGGAAACTACTTCCTGAAA-3’(SEQ ID NO:29)

P53反向引物：5’-CTGGCATTCTGGGAGCTTCA-3’(SEQ ID NO:30)

结果如图8所示。结果表明，双抗负载的NK细胞和T细胞在与HepG2细胞共孵育后，可以使肿瘤细胞的K-ras和cMyc原癌基因表达下调，而抑癌基因Rb和P53的表达上调。

上述结果表明，本发明的双特异性抗体符合安全、有效性评估，能够有效地特异性的杀伤肝癌细胞，可作为杀伤肝癌细胞的基因工程药物，用于治疗肝癌。

制剂实施例1GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照实施例1的制备方法，在过protein A柱的过程中，收集步骤d的洗脱液，即得到GPC3-CD16A双抗，测试抗体浓度。

按照如下步骤制备含有GPC3-CD16A双抗的冻干粉制剂：

(1)制备含有GPC3-CD16A双抗40mg/mL、冻干保护剂40mg/mL、稳定剂5mg/mL、表面活性剂5mg/mL的水溶液；

(2)用饱和Na₂HPO₄溶液调节pH至6.0，用0.22μm的微孔滤膜过滤；

(3)真空冷冻干燥，具体工艺步骤为：

a.以降温速度0.8℃/分钟的速率将冷冻干燥机的搁板温度降至-45℃，当样品温度降至-40℃时，保持3h；

b.抽真空，当真空度达到20Pa时，将搁板温度以0.4℃/分钟的速度升温，待视镜处样品水线消失后，结束第一次干燥；

c.将搁板温度以0.8℃/分钟的速度升温，升至25℃，真空度设置为0.01Pa，保温6h，结束第二次干燥。

其中，

所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比1：1的混合物。

所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮。

所述稳定剂为N-精氨酸壳聚糖与O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖质量比1:1的混合物。N-精氨酸壳聚糖按照专利ZL201010017213.7实施例1制备。

O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖按照专利ZL200810068546.5实施例1制备。

制剂实施例2GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比3：1的混合物。

制剂实施例3GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比5：1的混合物。

制剂实施例4GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比1：3的混合物。

制剂实施例5GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为海藻糖与N-甲基-D-葡萄糖胺质量比1：5的混合物。

制剂实施例6GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为海藻糖。

制剂实施例7GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例1的制备方法，其区别仅在于：所述冻干保护剂为N-甲基-D-葡萄糖胺。

制剂实施例8GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例3的制备方法，其区别仅在于：所述稳定剂为N-精氨酸壳聚糖。

制剂实施例9GPC3-CD16A双抗冻干粉制剂

参照制剂实施例3的制备方法，其区别仅在于：所述稳定剂为O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。

制剂稳定性测试

将制剂实施例1-9得到的冻干粉放置在40℃，相对湿度75％的条件下保存12个月，测试稳定性。测定时先用注射用水对实施例1-9得到的冻干粉制剂进行复溶，复溶后的体积为冻干前水溶液体积的2倍。GPC3-CD16A双抗含量测试的方法为HPLC色谱(色谱柱：LiChroCHART^@125-2HPLC柱，Super-spher^@60RP-select B；流速：0.3mL/min；洗脱液：乙腈和水，95：5(v:v)，在波长210nm处测量)，含量保持率(％)＝(保存0个月后含量-保存n个月时含量)×100％。浊度是在波长350nm下测试溶液的吸光度值，小于0.03认为是澄清，大于等于0.03认为是浑浊。结果见下表。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市拜沃思生物科技有限公司

<120> 一种双特异性抗体及其制备方法和应用

<130> zhoujiabin-I889

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu

115 120 125

Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe

130 135 140

Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro

145 150 155 160

Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys

165 170 175

Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr

180 185 190

Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp

195 200 205

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

210 215 220

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly His Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Ser Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val

115 120 125

Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser

130 135 140

Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg

165 170 175

Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

180 185 190

Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr

195 200 205

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

210 215 220

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230

<210> 4

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Ala Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

115 120 125

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

130 135 140

Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

145 150 155 160

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

165 170 175

Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala

180 185 190

Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe

195 200 205

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

210 215 220

Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

225 230

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物1

<400> 5

cccaagctta gctttctggg gcgagccgg 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物2

<400> 6

ccggaattcg acccactctg cctccctcat 30

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物3

<400> 7

ccgctcgagc ctagaaccat gtcaccctga cct 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物4

<400> 8

cccaagcttc aaggcgcgac agctgcccta g 31

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物5

<400> 9

ccgctcgagg tcctgaasga gtctactccc tc 32

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物6

<400> 10

cccaagcttc tctccacaag cacaacacgc a 31

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物7

<400> 11

ccggaattcg ctcatatgta gtgtcgagtg cg 32

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物8

<400> 12

ctagtctaga gggagcagat gacctagaag cag 33

<210> 13

<211> 576

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GPC3-CD16A双抗

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu

115 120 125

Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe

130 135 140

Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro

145 150 155 160

Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys

165 170 175

Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr

180 185 190

Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp

195 200 205

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

210 215 220

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

340 345 350

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser

355 360 365

Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly His Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln

370 375 380

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu

385 390 395 400

Glu Ser Gly Ile Pro Ala Ser Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp

405 410 415

Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

420 425 430

Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

435 440 445

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu

450 455 460

Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys

465 470 475 480

Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp

485 490 495

Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp

500 505 510

Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr

515 520 525

Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn

530 535 540

Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asn Pro

545 550 555 560

Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

565 570 575

<210> 14

<211> 574

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> GPC3-CD3双抗

<400> 14

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu

115 120 125

Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe

130 135 140

Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro

145 150 155 160

Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys

165 170 175

Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr

180 185 190

Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp

195 200 205

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

210 215 220

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu

225 230 235 240

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

245 250 255

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

260 265 270

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

275 280 285

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

305 310 315 320

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

340 345 350

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

355 360 365

Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala

370 375 380

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

385 390 395 400

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile

405 410 415

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

420 425 430

Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr

435 440 445

Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly

450 455 460

Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser

465 470 475 480

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro

485 490 495

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr

500 505 510

Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

515 520 525

Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu

530 535 540

Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser

545 550 555 560

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

565 570

<210> 15

<211> 705

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

gatgtggtga tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccccgggcga accggcgagc 60

attagctgcc gcagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgca gccagaacac ccatgtgccg 300

ccgacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaggcg gcggcggcag ccaggtgacc 360

ctgcgcgaaa gcggcccggc gctggtgaaa ccgacccaga ccctgaccct gacctgcacc 420

tttagcggct ttagcctgag caccagcggc atgggcgtgg gctggattcg ccagccgccg 480

ggcaaagcgc tggaatggct ggcgcatatt tggtgggatg atgataaacg ctataacccg 540

gcgctgaaaa gccgcctgac cattagcaaa gataccagca aaaaccaggt ggtgctgacc 600

atgaccaaca tggatccggt ggataccgcg acctattatt gcgcgcgcat taacccggcg 660

tggtttgcgt attggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagc 705

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

ggccagccgc gcgaaccgca ggtgtatacc ctgccgccga gccgcgaaga aatgaccaaa 60

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa 120

tgggaaagca acggccagcc ggaaaacaac tataaaacca ccccgccggt gctggatagc 180

gatggcagct tttttctgta tagcaaactg accgtggata aaagccgctg gcagcagggc 240

aacgtgttta gctgcagcgt gatgcatgaa gcgctgcata accattatac ccagaaaagc 300

ctgagcctga gcccgggcaa a 321

<210> 17

<211> 702

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

gataccgtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgcgcgacc 60

attagctgca aagcgagcca gagcgtggat tttgatggcc atagctttat gaactggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttata ccaccagcaa cctggaaagc 180

ggcattccgg cgagctttag cgcgagcggc agcggcaccg attttaccct gaacattcat 240

ccggtggaag aagaagatac cgcgacctat tattgccagc agagcaacga agatccgtat 300

acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaaggcggcg gcggcagcca ggtgaccctg 360

cgcgaaagcg gcccggcgct ggtgaaaccg acccagaccc tgaccctgac ctgcaccttt 420

agcggcttta gcctgagcac cagcggcatg ggcgtgggct ggattcgcca gccgccgggc 480

aaagcgctgg aatggctggc gcatatttgg tgggatgatg ataaacgcta taacccggcg 540

ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat accagcaaaa accaggtggt gctgaccatg 600

accaacatgg atccggtgga taccgcgacc tattattgcg cgcgcattaa cccggcgtgg 660

tttgcgtatt ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gc 702

<210> 18

<211> 696

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgcgagcag cagcgtgagc tatatgaact ggtatcagca gaccccgggc 120

aaagcgccga aacgctggat ttatgatacc agcaaactgg cgagcggcgt gccgagccgc 180

tttagcggca gcggcagcgg caccgattat acctttacca ttagcagcct gcagccggaa 240

gatattgcga cctattattg ccagcagtgg agcagcaacc cgtttacctt tggccagggc 300

accaaactgc agattacccg cgcgggcggc ggcggcagcc aggtgcagct ggtgcagagc 360

ggcggcggcg tggtgcagcc gggccgcagc ctgcgcctga gctgcaaagc gagcggctat 420

acctttaccc gctataccat gcattgggtg cgccaggcgc cgggcaaagg cctggaatgg 480

attggctata ttaacccgag ccgcggctat accaactata accagaaagt gaaagatcgc 540

tttaccatta gccgcgataa cagcaaaaac accgcgtttc tgcagatgga tagcctgcgc 600

ccggaagata ccggcgtgta tttttgcgcg cgctattatg atgatcatta tagcctggat 660

tattggggcc agggcacccc ggtgaccgtg agcagc 696

<210> 19

<211> 1728

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GPC3-CD16A双抗

<400> 19

gatgtggtga tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccccgggcga accggcgagc 60

attagctgcc gcagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgca gccagaacac ccatgtgccg 300

ccgacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaggcg gcggcggcag ccaggtgacc 360

ctgcgcgaaa gcggcccggc gctggtgaaa ccgacccaga ccctgaccct gacctgcacc 420

tttagcggct ttagcctgag caccagcggc atgggcgtgg gctggattcg ccagccgccg 480

ggcaaagcgc tggaatggct ggcgcatatt tggtgggatg atgataaacg ctataacccg 540

gcgctgaaaa gccgcctgac cattagcaaa gataccagca aaaaccaggt ggtgctgacc 600

atgaccaaca tggatccggt ggataccgcg acctattatt gcgcgcgcat taacccggcg 660

tggtttgcgt attggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagcggcca gccgcgcgaa 720

ccgcaggtgt ataccctgcc gccgagccgc gaagaaatga ccaaaaacca ggtgagcctg 780

acctgcctgg tgaaaggctt ttatccgagc gatattgcgg tggaatggga aagcaacggc 840

cagccggaaa acaactataa aaccaccccg ccggtgctgg atagcgatgg cagctttttt 900

ctgtatagca aactgaccgt ggataaaagc cgctggcagc agggcaacgt gtttagctgc 960

agcgtgatgc atgaagcgct gcataaccat tatacccaga aaagcctgag cctgagcccg 1020

ggcaaagata ccgtgctgac ccagagcccg gcgagcctgg cggtgagcct gggccagcgc 1080

gcgaccatta gctgcaaagc gagccagagc gtggattttg atggccatag ctttatgaac 1140

tggtatcagc agaaaccggg ccagccgccg aaactgctga tttataccac cagcaacctg 1200

gaaagcggca ttccggcgag ctttagcgcg agcggcagcg gcaccgattt taccctgaac 1260

attcatccgg tggaagaaga agataccgcg acctattatt gccagcagag caacgaagat 1320

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaaag gcggcggcgg cagccaggtg 1380

accctgcgcg aaagcggccc ggcgctggtg aaaccgaccc agaccctgac cctgacctgc 1440

acctttagcg gctttagcct gagcaccagc ggcatgggcg tgggctggat tcgccagccg 1500

ccgggcaaag cgctggaatg gctggcgcat atttggtggg atgatgataa acgctataac 1560

ccggcgctga aaagccgcct gaccattagc aaagatacca gcaaaaacca ggtggtgctg 1620

accatgacca acatggatcc ggtggatacc gcgacctatt attgcgcgcg cattaacccg 1680

gcgtggtttg cgtattgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 1728

<210> 20

<211> 1722

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GPC3-CD3双抗

<400> 20

gatgtggtga tgacccagag cccgctgagc ctgccggtga ccccgggcga accggcgagc 60

attagctgcc gcagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 120

tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 180

agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240

agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgca gccagaacac ccatgtgccg 300

ccgacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaggcg gcggcggcag ccaggtgacc 360

ctgcgcgaaa gcggcccggc gctggtgaaa ccgacccaga ccctgaccct gacctgcacc 420

tttagcggct ttagcctgag caccagcggc atgggcgtgg gctggattcg ccagccgccg 480

ggcaaagcgc tggaatggct ggcgcatatt tggtgggatg atgataaacg ctataacccg 540

gcgctgaaaa gccgcctgac cattagcaaa gataccagca aaaaccaggt ggtgctgacc 600

atgaccaaca tggatccggt ggataccgcg acctattatt gcgcgcgcat taacccggcg 660

tggtttgcgt attggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagcggcca gccgcgcgaa 720

ccgcaggtgt ataccctgcc gccgagccgc gaagaaatga ccaaaaacca ggtgagcctg 780

acctgcctgg tgaaaggctt ttatccgagc gatattgcgg tggaatggga aagcaacggc 840

cagccggaaa acaactataa aaccaccccg ccggtgctgg atagcgatgg cagctttttt 900

ctgtatagca aactgaccgt ggataaaagc cgctggcagc agggcaacgt gtttagctgc 960

agcgtgatgc atgaagcgct gcataaccat tatacccaga aaagcctgag cctgagcccg 1020

ggcaaagata ttcagatgac ccagagcccg agcagcctga gcgcgagcgt gggcgatcgc 1080

gtgaccatta cctgcagcgc gagcagcagc gtgagctata tgaactggta tcagcagacc 1140

ccgggcaaag cgccgaaacg ctggatttat gataccagca aactggcgag cggcgtgccg 1200

agccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattatacct ttaccattag cagcctgcag 1260

ccggaagata ttgcgaccta ttattgccag cagtggagca gcaacccgtt tacctttggc 1320

cagggcacca aactgcagat tacccgcgcg ggcggcggcg gcagccaggt gcagctggtg 1380

cagagcggcg gcggcgtggt gcagccgggc cgcagcctgc gcctgagctg caaagcgagc 1440

ggctatacct ttacccgcta taccatgcat tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg 1500

gaatggattg gctatattaa cccgagccgc ggctatacca actataacca gaaagtgaaa 1560

gatcgcttta ccattagccg cgataacagc aaaaacaccg cgtttctgca gatggatagc 1620

ctgcgcccgg aagataccgg cgtgtatttt tgcgcgcgct attatgatga tcattatagc 1680

ctggattatt ggggccaggg caccccggtg accgtgagca gc 1722

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH 正向引物

<400> 21

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GAPDH 反向引物

<400> 22

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> K-ras 正向引物

<400> 23

acagagagtg gaggatgctt t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> K-ras 反向引物

<400> 24

tttcacacag ccaggagtct t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> c-Myc正向引物

<400> 25

aatagagctg cttcgcctag a 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> c-Myc反向引物

<400> 26

gaggtggttc atactgagca ag 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Rb正向引物

<400> 27

aacatgcccg acccaattac a 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Rb反向引物

<400> 28

tgtgtttctg catacctcat gg 22

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P53正向引物

<400> 29

acctatggaa actacttcct gaaa 24

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P53反向引物

<400> 30

ctggcattct gggagcttca 20

Claims

1.一种双特异性抗体，其从N端到C端包含：

肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体；

重链恒定区；和

免疫细胞表面抗原对应抗体。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，所述免疫细胞表面抗原对应抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:13或14所示；优选地，所述双特异性抗体为Fc单链构型。

4.一种编码双特异性抗体的核苷酸序列，其从5’端到3’端包含：

编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列；

编码重链恒定区的核苷酸序列；和

编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的编码双特异性抗体的核苷酸序列，其中，所述编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；和/或，所述编码重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；和/或，所述编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

6.如权利要求4所述的编码双特异性抗体的核苷酸序列，其中，所述编码双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:19或20所示。

7.一种双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)以人血液总RNA反转录的cDNA为模板，根据引物扩增出编码重链恒定区的核苷酸序列、编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列、编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列，

其中，扩增所需的引物为：

扩增出的编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的另一端和编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列具有相同的酶切位点；

(3)对获得的拼接序列利用载体构建包含拼接序列的质粒；

(4)将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体；

优选地，所述哺乳动物细胞为293T细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；

优选地，构建质粒的载体为pcDNA6-Myc/His B。

8.如权利要求7所述的制备方法，其中，所述编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；和/或，所述编码重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；和/或，所述编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18所示；

优选地，所述编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD16a对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，和/或所示编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

9.权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体用于制备治疗肝癌的药物的应用。

10.一种冻干粉制剂，其原料包括如下组分：权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体30～60mg/mL，冻干保护剂20～40mg/mL，稳定剂5～40mg/mL，表面活性剂5～10mg/mL，余量为水。