CN104560894B

CN104560894B - 编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒

Info

Publication number: CN104560894B
Application number: CN201310484616.6A
Authority: CN
Inventors: 高斌; 王磊; 何嫣然; 陶华
Original assignee: BEIJING ZHONGKE YONGBANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2033-10-16
Also published as: CN104560894A

Abstract

本发明公开了一种编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒。本发明提供的重组蛋白包括功能区甲和功能区乙；所述功能区甲特异结合肿瘤细胞上面的肿瘤相关抗原或HLA多肽复合物；所述功能区乙特异结合T细胞的表面标志物或NK细胞的表面标志物。本发明提供的重组腺病毒侵染肿瘤细胞之后，肿瘤细胞就变成了双特异性重组蛋白表达的工厂，与直接给予融合蛋白相比可以减少治疗次数通过原位注射的方式将腺病毒导入肿瘤，表达的融合蛋白可以立即与肿瘤细胞结合，无需经过体内代谢，相比直接注射融合蛋白而言，效率更高，一旦肿瘤周围有效应细胞的存在可以立即进行杀伤。本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。

Description

编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒

技术领域

本发明涉及一种编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒。

背景技术

肿瘤（tumor，neoplasm）是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致异常增生，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。恶性肿瘤生长迅速，可转移到身体其它部位，使机体功能失调，威胁生命。

恶性肿瘤也叫癌症（cancer），是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。据我国2000年卫生事业发展情况统计公报，城市地区居民死因第一位为恶性肿瘤，其次为脑血管病、心脏病。最为常见和危害性严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。

双特异性重组蛋白是含有两种特异性抗原结合位点的人工蛋白，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，其中利用抗体序列作为导向的双特异性抗体是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

双特异性重组蛋白中比较有效的是介导效应T细胞和杀伤细胞（如NK细胞）的双特异性重组蛋白。此类双特异性重组蛋白的一端靶向肿瘤细胞上面的肿瘤相关抗原或MHC-多肽复合物，另一端靶向杀伤细胞的表面分子（如CD3,CD16,CD56等），可以克服MHC限制性，更大程度的发挥CTL等杀伤细胞的功能。双特异性重组蛋白多为哺乳动物细胞表达体系，融合蛋白的表达和纯化都相对复杂，制备成本较高。采用双特异性重组蛋白治疗肿瘤的局限性在于其半衰期比较短，尤其是对一些小分子蛋白而言，只有几个小时的半衰期。抗体工程的发展促使许多新的不同形式的双特异性重组蛋白的产生，虽然大部分滞留在临床前阶段，但是仍然有许多分子进入临床研究阶段并展示出良好的治疗效果。双特异性重组蛋白中，比较引人注目的有triomab和BiTE形式，尤其是catumaxomab在欧洲的批准后，双特异性重组蛋白更成为研究的热点。除了抗体形式之外，还有许多其他可以特异结合细胞表面受体的蛋白质也可以作为重组蛋白的功能区。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒。

本发明提供了一种表达双特异性重组蛋白的重组病毒；所述双特异性重组蛋白包括功能区甲和功能区乙；所述功能区甲特异结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或HLA多肽复合物；所述功能区乙特异结合T细胞的表面标志物或NK细胞的表面标志物。

所述重组病毒具体可为重组腺病毒、重组疱疹病毒或反转录病毒。

所述功能区甲包括但不限于特异结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原的单区抗体、单链抗体、Fc片段或受体。所述肿瘤相关抗原具体可为HER2抗原。所述功能区甲具体可如序列表的序列2第246-483位氨基酸残基所示或序列表的序列4第1-242位氨基酸残基所示。

所述功能区甲包括但不限于特异结合肿瘤细胞表面的HLA多肽复合物的单区抗体、单链抗体、Fc片段或受体。所述HLA多肽复合物可为HLA-A2多肽复合物，具体可为HLA-A2/IMDQVPFSV多肽复合物（又称HLA-A2-MART1多肽复合物）或HLA-A2/ELAGIGILTY多肽复合物（又称HLA-A2-gp100多肽复合物）。所述功能区甲具体可如序列表的序列6第1-117位氨基酸残基所示或序列表的序列8第1-125位氨基酸残基所示。

所述功能区乙可特异结合T细胞的表面标志物CD3、NK细胞的表面标志物CD16或NK细胞的表面标志物CD56。

所述功能区乙包括但不限于单区抗体、单链抗体、Fc片段或受体。

所述功能区乙具体可如序列表的序列2第1-243位氨基酸残基所示、序列表的序列4第260-502位氨基酸残基所示、序列表的序列6第137-379位氨基酸残基所示或序列表的序列8第145-387位氨基酸残基所示。

所述重组病毒中，所述双特异性重组蛋白优选在肿瘤特异性启动子的作用下启动表达。所述肿瘤特异性启动子具体可如序列表的序列9所示。

所述双特异性重组蛋白中还可包括检测标签，如myc标签和/或His标签等。

所述双特异性重组蛋白具体可为序列表的序列2所示的Fcab-anti-CD3蛋白、序列表的序列4所示的HER2-anti-CD3蛋白、序列表的序列6所示的Mart1-anti-CD3蛋白或序列表的序列8所示的GPA-anti-CD3蛋白。

所述重组病毒具体可为将重组质粒和质粒pBHGlox（delta）E1，3Cre导入293A细胞并培养细胞得到的重组病毒；所述重组质粒为含有所述双特异性重组蛋白的编码基因的重组表达载体。所述重组质粒具体可为将序列表的序列1所示DNA分子、序列表的序列3所示的DNA分子、序列表的序列5所示的DNA分子或序列表的序列7所示的DNA分子插入质粒PDC316的多克隆位点（如EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间）得到的重组质粒。

本发明还保护以上任一所述的重组病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（a）或（b）：（a）治疗肿瘤；（b）促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤具体可为肺癌，更具可为肺腺癌。所述肿瘤细胞可为肺癌细胞，更具体可为肺腺癌细胞，更具体可为A549细胞或A549-luc细胞。

本发明还保护一种药物，其活性成分为以上任一所述的重组病毒；所述药物的功能为如下（a）或（b）：（a）治疗肿瘤；（b）促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤具体可为肺癌，更具可为肺腺癌。所述肿瘤细胞可为肺癌细胞，更具体可为肺腺癌细胞，更具体可为A549细胞或A549-luc细胞。

采用腺病毒作为载体的优势如下：（1）借助腺病毒载体表达的融合蛋白的翻译后修饰同人体的天然蛋白是一致的，可以降低融合蛋白的免疫原性；（2）能感染大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的；（3）有较大的容量（约8kb）；（4）有较高的重组蛋白表达水平，滴度高；（5）不整合；（6）毒性较小。

本发明提供的重组腺病毒侵染肿瘤细胞之后，肿瘤细胞就变成了融合蛋白（双特异性重组蛋白）表达的工厂，与直接给予融合蛋白相比可以减少治疗次数（仅一次注射腺病毒即可维持至少两周的融合蛋白表达时间），通过原位注射的方式将腺病毒导入肿瘤，表达的融合蛋白可以立即与肿瘤细胞结合，无需经过体内代谢，相比直接注射融合蛋白而言，效率更高，一旦肿瘤周围有效应细胞的存在可以立即进行杀伤。

本发明将双特异性重组蛋白介导的高效杀瘤作用以及腺病毒载体非整合性持续表达融合蛋白的特点相结合，利用复制缺陷型腺病毒载体将双特异性重组蛋白的编码基因导入肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞持续的表达融合蛋白，高效的介导杀伤细胞有效杀伤肿瘤细胞。本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。

附图说明

图1为质粒PDC316的结构示意图。

图2为实施例1的步骤一的4中，37℃培养7天左右的细胞病变照片。

图3为实施例1的步骤五中重组病毒的鉴定结果。

图4为实施例1的步骤五中排除野生型腺病毒的鉴定结果。

图5为实施例1的步骤六中Western blot的结果。

图6为实施例1的步骤七中杀伤实验的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ADmax腺病毒包装系统购自加拿大Microbix公司，含有质粒PDC316和质粒pBHGlox（delta）E1，3Cre。质粒PDC316即重组腺病毒穿梭质粒，其结构示意图见图1A，其多克隆位点及其周边的核苷酸序列见图1B。质粒PDC316和质粒pBHGlox（delta）E1，3Cre在293A细胞中可以包装得到腺病毒（293A细胞的基因组中含有腺病毒复制所需的片段，转染所述两个质粒后可以得到复制缺陷型腺病毒，该复制缺陷型腺病毒在293A细胞以外的其它细胞中不能复制；293A细胞的基因组与所述两个质粒有极小的几率发生重组，得到在293A细胞以外的其它细胞中具有复制的能力的野生型腺病毒）。

293A细胞：invitrogen公司，货号为R705-07。

A549-luc细胞，又称A549-luc-C8Cell Line(P/N119266)：caliper公司，链接如下：http://www.caliperls.com/products/reagents/in-vivo-imaging-reagents/light-producing-cells-and-microorganisms/bioware-cell-lines/lung-bioware/a549luc c8-bioware-cell-line.htm。

抗人CD3单克隆抗体(OKT3)：北京同立海源生物科技有限公司，货号TL-98。

IL-2：注射用重组人白介素-2(德路生)，100万IU/瓶，批准文号“国药准字S10970015”，产品编号“P20100325144708531”；北京四环生物制药有限公司。

实施例1、重组腺病毒的构建和鉴定

一、重组腺病毒的制备

1、将序列表的序列1所示的双链DNA分子插入质粒PDC316的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

序列表的序列1所示的双链DNA分子编码序列表的序列2所示的蛋白质（序列1中，第1-51位核苷酸编码信号肽，最终将被切除）。将序列表的序列2所示的蛋白质命名为F3蛋白，又称Fcab-anti-CD3蛋白。序列2中，第1-243位为anti-CD3片段（anti-CD3片段靶向T细胞），第246-483位为Fcab片段（Fcab片段靶向肿瘤细胞表面的HER2抗原），第484-493位为myc标签。

2、将293A细胞铺六孔板（每孔约6×10⁵个细胞，采用含10%血清的DMEM培养基），37℃培养1天。

3、取2μg步骤1得到的重组质粒和2μg质粒pBHGlox（delta）E1，3Cre，用转染用水稀释至50μl，再加入50μl0.5M CaCl₂水溶液，混匀，将混合液慢慢滴入100μl的2×HEPES缓冲盐溶液中，室温静置15分钟。

4、完成步骤2后，吸弃培养上清，每孔加入1ml无血清DMEM培养基，然后加入200μl步骤3得到的混合液，37℃孵育4-6小时，吸弃培养上清，然后每孔加入5ml含5%血清的DMEM培养基，37℃培养7天左右即可见明显的细胞病变的出现（照片见图2）。

5、完成步骤2后，吸弃培养上清，每孔加入1ml无血清DMEM培养基，然后加入200μl步骤3得到的混合液，37℃孵育4-6小时，吸弃培养上清，然后每孔加入5ml含5%血清和1%低熔点琼脂糖的DMEM培养基使其平铺在细胞表面，待凝固之后，放回培养箱，37℃培养。

6、步骤5中培养10天左右，用巴斯德吸管取出细胞病变区域的琼脂糖，溶解在1ml含10%血清的DMEM培养基中，可-80℃冻存。

7、将293A细胞铺六孔板（每孔约6×10⁵个细胞，采用含10%血清的DMEM培养基），37℃培养1天。

8、取1体积份步骤6的产物，加入4体积份含10%血清的DMEM培养基。

9、取完成步骤7的六孔板，弃除培养上清，加入步骤8得到的混合物（每孔500μl），每隔15分钟晃动六孔板，90分钟后每孔补加2ml含10%血清的DMEM培养基，37℃培养（培养2-3天即可发现细胞病变），待细胞完全病变之后，收集细胞以及上清，反复冻融三次，然后3000rpm离心15min，收集上清液，即为P0代目的病毒液，分装冻存。

二、大量扩增病毒

准备8个10cm培养皿，每皿大约接种3×10⁶个293A细胞（采用含10%血清的DMEM培养基），37℃培养1天，然后用P0代目的病毒液感染（MOI=3），37℃培养至细胞完全病变，收集细胞和上清液，反复冻融三次，然后3000rpm离心15min，收集上清液，即为P1代目的病毒液，分装冻存。

三、滴度测定的方法

1、取293A细胞，用含5%FBS的DMEM培养基制备成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，用细胞悬液铺96孔板（每孔100μl，即每孔约1×10⁴个细胞），37℃培养过夜，使细胞贴壁。

2、取待测病毒液，用含5%血清的DMEM培养基制备病毒稀释样品，10倍梯度稀释（一共做8个稀释度，10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11，每个稀释度做十个复孔），按每孔100μL病毒稀释样品分别加入完成步骤1的96孔板。同时设置不加病毒液的对照，即只加入含5%血清的DMEM培养基。

3、37℃培养7天后，观察细胞病变孔数并记录。

计算公式：TCID50=10^{1+d（s-0.5）}；

d=log₁₀稀释度=1（对于十倍稀释度而言）；

s=阳性比率之和（所有稀释度相加）；

PFU=0.7×TCID50。

P1代目的病毒液的滴度在（3-5）×10⁹pfu/ml之间。

四、对照病毒的制备

用质粒PDC316代替重组病毒，按照步骤一的方法进行操作，得到P0代对照病毒液。按照步骤二的方法大量扩增病毒，得到P1代对照病毒液。按照步骤三的方法进行滴度测定。

五、病毒的鉴定

用于鉴定重组病毒的引物序列如下（如果得到扩增条带，说明得到了重组腺病毒）：F3S:5’-ATGCCGCTGCTGCTACTG-3’；F3A:5’-CTACAGATCCTCTTCTGAGATG-3’。P1代目的病毒液的鉴定结果见图3的泳道2，P1代对照病毒液的鉴定结果见图3的泳道1。

用于排除野生型腺病毒存在的引物序列如下（如果得到扩增条带，说明存在野生型腺病毒）：E1S：5’-ATCGAAGAGGTACTGGCTGA-3’；E1R：5’-CCTCCGGTGATAATGACAAG-3’。P1代目的病毒液的鉴定结果见图4的泳道1，P1代对照病毒液的鉴定结果见图4的泳道2，293A细胞的基因组（阳性对照）的鉴定结果见图4的泳道3。

结果表明，得到了含有Fcab-anti-CD3蛋白的编码序列的重组腺病毒，并且没有野生型腺病毒的污染。

六、采用Western blot的方法对表达的双特异性重组蛋白进行鉴定

1、提前一天将A549-luc细胞铺六孔板（每孔约5×10⁵个细胞），过夜贴壁后弃除上清，加入P1代目的病毒液（MOI=5），用含10%血清的DMEM培养基调整每孔的液相体积为0.5ml，37℃感染90min，期间每隔15min晃动一次，以充分接触。

2、完成步骤1后，每孔加入2ml含10%血清的DMEM培养基，37℃培养48小时。

3、完成步骤2后，取上清液，使用非还原的上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳分析，然后按照分子克隆的实验方法进行转膜，之后采用HRP标记的羊抗人二抗（工作浓度为1:3000稀释）进行Western blot。

结果见图5。结果表明，得到了表达Fcab-anti-CD3蛋白的重组腺病毒。

七、重组腺病毒感染细胞后的功能验证（杀伤实验）

待测病毒液为P1代目的病毒液或P1代对照病毒液。

1、取新鲜的人源抗凝浓缩白细胞（购于北京红十字会血液中心），采用Ficoll法分离外周血单个核细胞（PBMC）；采用含10%血清的RPMI1640培养基37℃培养外周血单个核细胞14天，第一天加入抗人CD3单克隆抗体(OKT3)并使其浓度为1μg/ml,第三天加入IL-2并使其浓度为100U/ml，培养结束后收集细胞，采用含10%血清的RPMI1640培养基悬浮，得到T细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml的效应细胞悬液。

2、将靶细胞（A549-luc细胞）用柠檬酸盐细胞消化液进行消化，得到单细胞悬液,接种至96孔板（10⁴个细胞/孔），37℃培养1天，吸弃上清。

3、完成步骤2后，感染待测病毒液（MOI=5），37℃培养24小时（取上清进行Westernblot，方法参见步骤六，确定上清中含有Fcab-anti-CD3蛋白）。

4、完成步骤3后，用R10培养基洗去细胞表面的腺病毒，加入步骤1得到的效应细胞悬液（效靶比为1、4、16或32；效靶比即效应细胞与靶细胞的个数比），37℃培养20小时。

5、完成步骤4后，采用promega公司的Bright-Glo^TM Luciferase Assay System，（货号为E2610）测定杀伤效率。

杀伤效率=(C-S)/(C-O)×100%；C：不加入待测病毒液的对照孔的发光值，S是加入待测病毒液的孔的发光值，O是溶液背景值。

结果见图6。结果表明，对于A549-luc细胞而言，重组腺病毒可以高效的对靶细胞进行感染，成功的分泌重组双特异性重组蛋白，并且成功介导T细胞高效的杀伤靶细胞。

也可采用肿瘤特异性启动子（如序列表的序列9所示的Her2的启动子）取代步骤一的1中得到的重组质粒中的MCMV启动子，得到新的重组质粒，进一步按照实施例1的方法制备新的重组腺病毒并进行应用。

实施例2、重组腺病毒的构建

1、将序列表的序列3所示的双链DNA分子插入质粒PDC316的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

序列表的序列3所示的双链DNA分子编码序列表的序列4所示的蛋白质（序列3中，第1-51位核苷酸编码信号肽，最终将被切除）。将序列表的序列4所示的蛋白质命名为H3蛋白，又称HER2-anti-CD3蛋白。序列4中，第1-242位为HER2片段（HER2片段靶向肿瘤细胞表面的HER2抗原），第260-502位为anti-CD3片段（anti-CD3片段靶向T细胞），第505-514位为myc标签，第516-520位为His标签。

其它步骤同实施例1。

实施例3、重组腺病毒的构建

1、将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入质粒PDC316的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

序列表的序列5所示的双链DNA分子编码序列表的序列6所示的蛋白质（序列5中，第1-51位核苷酸编码信号肽，最终将被切除）。将序列表的序列6所示的蛋白质命名为M3蛋白，又称Mart1-anti-CD3蛋白。序列6中，第1-117位为Mart1片段（Mart1片段靶向肿瘤细胞表面HLA-A2-MART1多肽复合物），第137-379位为anti-CD3片段（anti-CD3片段靶向T细胞），第382-391位为myc标签，第393-397位为His标签。

其它步骤同实施例1。

实施例4、重组腺病毒的构建

1、将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入质粒PDC316的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒。

序列表的序列7所示的双链DNA分子编码序列表的序列8所示的蛋白质（序列7中，第1-51位核苷酸编码信号肽，最终将被切除）。将序列表的序列8所示的蛋白质命名为G3蛋白，又称GPA-anti-CD3蛋白。序列8中，第1-125位为GPA片段（GPA片段靶向肿瘤细胞表面HLA-A2-gp100多肽复合物），第145-387位为anti-CD3片段（anti-CD3片段靶向T细胞），第390-399位为myc标签，第401-405位为His标签。

其它步骤同实施例1。

Claims

1.一种表达分泌型介导杀伤细胞导向肿瘤的双特异性重组蛋白的重组病毒；所述双特异性重组蛋白包括功能区甲和功能区乙；所述功能区甲是特异结合肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原的Fc片段；

所述功能区乙特异结合T细胞的表面标志物CD3；

所述双特异性重组蛋白为序列表的序列2所示的Fcab-anti-CD3蛋白。

2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于：所述重组病毒为重组腺病毒、重组疱疹病毒或反转录病毒。

3.如权利要求1或2所述的重组病毒，其特征在于：所述肿瘤相关抗原为HER2抗原。

4.如权利要求1或2所述的重组病毒，其特征在于：所述重组病毒中，所述双特异性重组蛋白在肿瘤特异性启动子的作用下启动表达。

5.如权利要求1或2所述的重组病毒，其特征在于：所述双特异性重组蛋白中还包括检测标签。

6.权利要求1至5中任一所述的重组病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（a）或（b）：（a）治疗肿瘤；（b）促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。

7.一种药物，其活性成分为权利要求1至4中任一所述的重组病毒；所述药物的功能为如下（a）或（b）：（a）治疗肿瘤；（b）促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。