CN101864452A - 一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双特异抗肿瘤重组腺病毒，其包括腺病毒载体和引入其中的表达盒，所述腺病毒载体的复制必须基因突变，所述表达盒包括由肿瘤特异性启动子与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子与Apoptin基因组成的表达盒。本发明还同时提供了上述双特异抗肿瘤重组腺病毒的构建模式及其肿瘤治疗药物用途。本发明重组腺病毒具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤的双重特异性；可用于制备治疗各种肿瘤药物及预防术后肿瘤复发药物。同时也可与任何药物联合使用，或作为与手术治疗、放射治疗、化学治疗联合应用的药物。

Description

一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因领域，具体涉及一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的发展是多因素参与的动态过程，若未及时发现并采取有效控制措施，其强大繁殖能力所导致的惊人蔓延速度将成为所有疗法必然面对的挑战。此时，如何有效清除恶性肿瘤是患者生命的最后防线。

多年来对肿瘤基因治疗研究的经验表明，怎样在与恶性肿瘤的竞速中取得完胜是实现绝地反击的关键。因此，可以得出恶性肿瘤无坚不摧，但唯快不破的结论，即无论恶性肿瘤如何肆虐，只要实现快速抑瘤，从而使抑瘤过程在恶性肿瘤发展的动态平衡中占得上风，就能达成治疗恶性肿瘤的目的。

当然，上述唯快不破的结论是以安全性为基础的。无疑，手术治疗、化疗和放疗是目前肿瘤治疗的首选方式，而上述疗法对机体的不可逆创伤和对生理的次生影响却如饮鸩止渴，令所有人谈之色变。目前，肿瘤基因治疗研究应摒弃拆东补西的传统方案，通过将特异性作为研究重点来夯实候选药物的安全性基础。

多数化疗药物和射线通过p53发挥作用，而各类肿瘤中50％～60％存在p53突变，从而严重影响治疗效果。另外，bcl-2可抑制细胞凋亡，从而成为一些肿瘤化疗耐药的物质基础。因此，如何在抗肿瘤候选药物研究伊始即着眼解决耐药问题，也是抗肿瘤药物研发成功与否的关键之一。

恶性肿瘤超过100种，几乎可以发生在身体任何部位。全世界70％的恶性肿瘤死亡病例发生在中低收入国家，发达国家以不计成本的方式治疗只能将个别恶性肿瘤类型的5年平均生存率提高至50％～60％。虽然宫颈癌、乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤，若发现及时，辅以适当疗法，可以得到有效治疗。但在欠发达国家，由于公共卫生水平、医疗质量和诊治费用等诸多限制，这些极易控制的恶性肿瘤也难以得到有效治疗，这已使中国成为名副其实的“癌症大国”。研发高效、安全、廉价的抗肿瘤新药是惠国利民之举，已成当务之急。

总之，对于恶性肿瘤，人们需要更迅速、更特异、更安全、更温和、更广谱、更经济和无耐药之忧的治疗方式，这种渴望催生了全世界科研工作者数十年的孜孜以求。

研究表明，hTERTp(人端粒酶逆转录酶启动子)在肿瘤细胞系中明显激活，除了干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞外，hTERTp的活性几乎仅限于肿瘤细胞。如此，hTERTp可实现目的基因表达的肿瘤特异性。基于此构建hTERTp调控的自杀基因、药物前体激活基因和抑瘤基因的各类肿瘤生物治疗制剂，具有对肿瘤高特异和对正常细胞低毒的优势，已成为肿瘤特异性基因治疗的研究热点。

研究发现，Apoptin能够在不影响正常细胞的前提下，在8～12小时内特异性地诱导肝癌、淋巴瘤、血液系统肿瘤、乳腺癌、肺癌细胞和鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞发生凋亡。另外，无论肿瘤细胞的p53基因是否存在突变，Apoptin均可有效诱导肿瘤细胞凋亡。并且，bcl-2的过表达不仅对Apoptin的凋亡诱导作用无影响，反而能增强Apoptin的凋亡诱导功能。值得说明的是，bcl-2对Apoptin所诱导凋亡的促进作用不是这两者直接作用的结果，因为正常细胞即使过表达bcl-2，Apoptin也不会对其产生影响。Apoptin的应用将大大降低产生耐药性的可能。

传统重组腺病毒污染RCA往往发生在穿梭载体与基因组骨架在含E1基因的293细胞内重组过程中。有时RCA污染比例很高，不得不经过额外的、耗时的蚀斑纯化过程以纯化重组腺病毒。研究发现，腺病毒基因组骨架若缺失包装必需信号，可有效降低RCA污染的可能性，从而避免蚀斑纯化过程。

发明内容

本发明目的在于针对现有抗肿瘤药物的缺陷，提供一种新型双特异抗肿瘤重组腺病毒，用于肿瘤的治疗和预防。

本发明另一目的在于提供上述重组腺病毒的构建方法。

本发明的再一目的在于提供双特异抗肿瘤重组腺病毒在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。

本发明抗肿瘤重组腺病毒，其包括腺病毒载体和引入其中的表达盒，所述腺病毒载体的复制必须基因突变，所述表达盒包括由肿瘤特异性启动子与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子与Apoptin基因组成的表达盒。

所述腺病毒载体的基因组左侧ITR和包装信号区缺失。

所述肿瘤特异性启动子为hTERTp(人端粒酶逆转录酶核心启动子)或PEG-3p启动子等。

所述真核启动子为任意一种真核启动子，比如CMV启动子(人类巨细胞病毒启动子)，当然也可以采用肿瘤特异性启动子。

所述腺病毒载体源自为人5型腺病毒。

所述腺病毒载体的基因组左侧ITR和包装信号区缺失。

所述的腺病毒复制必需基因为人5型腺病毒早期区1A基因(E1a)。

所述的抗肿瘤重组腺病毒，其由腺病毒载体、CMV启动子(人类巨细胞病毒启动子)、Apoptin基因、hTERTp(人端粒酶逆转录酶核心启动子)、人5型腺病毒E1a基因和多聚腺苷酸(poly A)组成。

所述的抗肿瘤重组腺病毒，其序列为：人5型腺病毒基因组左侧序列-SEQ ID NO：1-人5型腺病毒基因组右侧序列。

其中：

人5型腺病毒基因组左侧序列见Genbank NO：NC_001406的人5型腺病毒基因组全序列，其3’末端位于正向353位；

SEQ ID NO：1见序列表：

1～746：CMV启动子序列；

747～764：非编码区1；

765～1130：Apoptin序列；

1131～1157：非编码区2；

1158～1439：poly A序列；

1440～2006：hTERTp序列；

2007～2017：非编码区3；

2018～2887：E1a序列；

2888～2908：非编码区4；

2909～3190：polyA序列；

人5型腺病毒基因组右侧序列见Genbank NO：NC_001406的人5型腺病毒基因组全序列，其5’末端位于正向3328位。

本发明所述抗肿瘤重组腺病毒的构建方法，其包括构建含有由肿瘤特异性启动子(hTERTp、PEG-3p启动子等)与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子(包括肿瘤特异性启动子)与Apoptin基因组成的表达盒的穿梭质粒载体，并将所述穿梭质粒载体与腺病毒重组。

所述穿梭质粒载体为pAd-VT或pAd-VP，所述腺病毒为5型腺病毒。

本发明采用腺病毒载体系统，其基因组骨架除缺失腺病毒复制必需基因外，还缺失了基因组左侧ITR和包装信号区，而将所缺失ITR和包装信号区置于穿梭载体，大大降低了重组腺病毒污染RCA的可能性，同时也提高了重组腺病毒的可操作性。

本发明双特异性肿瘤重组腺病毒在用于制备抗肿瘤药物中的应用。还可以作为预防术后肿瘤复发的药物。

该药物可与任何药物联合应用，也可以作为与手术治疗、放射治疗、化学治疗联合应用的药物。

本发明双特异性肿瘤重组腺病毒可以按照本领域常规方法制成注射剂、喷雾剂、涂抹剂等剂型。

本发明基于肿瘤特异性启动子hTERTp(人端粒酶逆转录酶核心启动子)、特异性抑癌基因Apoptin(凋亡素)、真核启动子和hAd5E1a(人5型腺病毒复制必需基因)基因，并利用所改造腺病毒载体系统，构建了具有肿瘤特异性杀伤和肿瘤特异性复制能力的双特异抗肿瘤重组腺病毒。在解决了RCA(不携带抑癌基因，却具有非特异性复制能力的腺病毒)污染和产生耐药性问题的同时，大大提高了抑瘤速度和抑瘤特异性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版相关章节进行。

实施例1双特异抗肿瘤重组腺病毒穿梭质粒的构建

1、E1a与Apoptin的克隆

根据GenBank中已登录的人5型腺病毒E1a基因序列(NC_001406)和Apoptin基因序列(NC_001427)，遵循引物设计的基本原则，通过分析、设计、筛选如下2对引物，分别用于扩增E1a和Apoptin的引物：

E1aS：5’-GCCTGCAGACCACCATGGGACATAT TATCTGCCAC-3’

E1aA：5’-GCGGATCCTTATGGCCTGGGGCGTTTACAGC-3’

ApoptinS：5’-GCGATATCACCACCATGGACGCTCTCCAA-3’

ApoptinA：5’-GCGAATTCTTACAGTCTTATACACCTTCT-3’

优化各步反应条件及参与反应试剂的最佳浓度，在PCR仪上进行DNA扩增。反应总体积50μL(10×PCR缓冲液5μL、20μmol/L引物对各1μL，模板DNA 5μL、dNTP(各2.5mmol/L)5μL，25mmol/LMgCl₂4μL，1U/μL Ex-Taq DNA聚合酶1μL、ddH₂O 27μL)，筛选并确定PCR工作程序：94℃4min；然后94℃30s，57℃45s，72℃1min，10个循环最后72℃延伸10min，4℃保温。扩增产物分别连接至pMD18-T载体上，并对所构建质粒，即pMD18-E1a和pMD18-Apoptin进行核苷酸序列测定。

2、肿瘤特异性启动子的合成

分别根据GenBank中已登录的hTERTp(EU650197)和PEG-3p(DL070416)核苷酸序列人工合成hTERTp和PEG-3p，并将其置于pKS载体(购自Stratagen公司)，分别构建含有hTERTp和PEG-3p的质粒pKS-hTERTp和pKS-PEG-3p。

3、穿梭质粒的构建

Pst I/BamH I双酶切质粒pMD18-E1a，获得E1a基因片段，并与经同样双酶切的pKS-hTERTp或pKS-PEG-3p连接，构建pKS-hTERTp-E1a或pKS-PEG-3p-E1a；Xba I/Xho I双酶切质粒pIRES-neo(购自Invitrogen公司)，获得Poly A核苷酸片段，补平，与经Hind III酶切并补平的pKS-hTERTp-E1a或pKS-PEG-3p-E1a连接，构建质粒pKS-PolyA-hTERTp-E1a或pKS-PolyA-PEG-3p-E1a。

Hind III酶切质粒pacAd5CMV K-N pA，补平后用EcoR I酶切，与经EcoR I/EcoR V双酶切pMD18-Apoptin后获得的Apoptin基因片段连接，构建质粒pAd-Apoptin。

BamH I酶切pAd-Apoptin，补平后用Spe I酶切，回收线性化的pAd-Apoptin；Xho I酶切pKS-PolyA-hTERTp-E1a或pKS-PolyA-PEG-3p-E1a，补平后用Spe I酶切，获得含-PolyA-hTERTp-E1a-或-PolyA-PEG-3p-E1a-核苷酸的片段，将其与线性化的pAd-Apoptin连接，构建穿梭载体pAd-Apoptin-PolyA-hTERTp-E1a或pAd-Apoptin-PolyA-PEG-3p-E1a，分别命名为pAd-VT或pAd-VP。

实施例2重组腺病毒

1、共转染

质粒pAd-VT(或pAd-VP)利用Nhe I进行酶切线性化，方法如下：将适量质粒DNA与适量水混匀，同时加入4U限制性内切酶NheI及10μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，使其总体积为100μl，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴过夜。

将100μl饱和酚加入线性化的质粒中，适度振荡，于4℃、12000rpm条件下离心10min；取上清，加入100μl饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，适度振荡，于4℃、12000rpm条件下离心10min；取上清，加入100μl氯仿/异戊醇(24∶1)，适度振荡，于4℃、12000rpm条件下离心10min；取上清，加入200μl无水乙醇和20μl醋酸钠，-20℃放置30min，于4℃、12000rpm条件下离心10min；弃上清，加入200μl 70％乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥后加入50μl无菌TE(10mMTris，0.1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀。将人5型腺病毒基因组与线性化的pAd-VT(或pAd-VP)共转染HEK-293细胞。

2、细胞内同源重组

转染后的HEK-293细胞继续培养7～14d，每48～72h更换培养液(视细胞状态确定)。在该继续培养的7～14d期间，若细胞出现病变既重悬细胞，收集于1.5ml离心管内，并于-80℃/37℃反复冻融3次，冻存备用。

若细胞在此期间未出现病变，用10ml完全培养液重悬细胞，并置10cm细胞培养皿内继续培养7～14d，此期间若出现病变则按上法操作，若未出现病变则需重复转染操作。

3、重组病毒的筛选

按上法制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80％融合时弃去培养液，用Hank′s液洗两次。取上述重组病毒原液500μl接种于6孔板的HEK-293细胞，置37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，补加DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。刮取独立病变处细胞，并置于500μl无血清、无抗生素的DMEM培养液中，按上法冻融3次备用。

4、重组腺病毒的扩增及制备

于24孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80％融合时弃去培养液，用Hank′s液洗两次。取单克隆重组腺病毒300μl接种于24孔板的HEK-293细胞，置37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，补加DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。重悬病变细胞并冻融3次，接种于25ml细胞培养瓶内的HEK-293细胞，置37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，补加DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。重悬病变细胞并冻融3次，置-80℃冻存备用(即为Ad-VT或Ad-VP)。

5、重组腺病毒的毒价测定

于96孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80％融合时弃去培养液，用Hank′s液洗两次。取制备的单克隆重组病毒以Hank′s液进行10³～10¹⁴稀释，取30μl接种于96孔板的HEK-293细胞，置37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，补加DMEM完全培养液至200μl，继续培养72～96h。吸弃培养液，补加含1％甲基纤维素和2％小牛血清(FCS)的DMEM作为维持液，37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24～48h。吸弃培养液，用PBS洗涤2次，室温下1％甲醛固定15min，蒸馏水冲洗后用0.1％结晶紫染色5min，蒸馏水冲洗后在倒置显微镜下统计病毒空斑数，按如下公式计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque forming units，PFU)：PFU＝(病毒空斑数×稀释倍数)/接种体积。

成功构建了抗肿瘤双特异重组腺病毒Ad-VT(或Ad-VP)，应用RT-PCR、Western blot和IFA等方法，分别对以上重组腺病毒进行了鉴定，证明重组腺病毒所携带外源基因能够有效转录并表达。通过连续传代的方法，对上述重组腺病毒的稳定性进行鉴定。结果表明，本发明所构建的重组腺病毒具有良好稳定性，且病毒毒价可维持在10⁷～10⁸的水平。

实施例3重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤作用

消化处于对数生长期的肿瘤细胞(人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG-2)、人宫颈癌细胞(Hela))。计数并用完全细胞培养液调整细胞浓度至5×10⁴个/ml，按100μl/孔接种于上96孔细胞培养板(即5×10³个/孔)，待细胞贴壁后(24h左右)，吸弃培养液，用Hank’s液洗涤2次。用无血清无抗生素的RPMI-1640培养液调整Ad-VT滴度至1×10⁷PFU/ml、1×10⁶PFU/ml和1×10⁵PFU/ml。取上述病毒稀释液50μl(即100moi(感染复数单位)、10moi和1moi)，加入经Hank’s液洗涤的培养于96孔细胞培养板的肿瘤细胞相应孔内，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，补加完全RPMI-1640培养液至200μl/孔。以未做任何处理的细胞作为对照。

分别于感染12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h，于每孔加入MTT溶液(5mg/ml，溶于PBS中，0.22μm滤器过滤除菌)20μl，于37℃、5％CO₂细胞培养箱内作用4h，小心吸弃孔内原培养上清液。每孔加入150μl DMSO，于37℃条件下放置10min(使结晶物充分溶解)，取溶解有紫色结晶有DMSO 135μl，置96孔酶标板中，于490nm处酶联免疫检测仪上测各孔A值。按以下公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值。每种处理均设3个重复孔(n＝3)，所得数据进行统计学分析。

上述实验表明，本发明所提供双特异抗肿瘤重组腺病毒在6～12小时对人肺癌、人肝癌、人宫颈癌等肿瘤细胞产生抑制作用，且其作用随作用浓度增加和作用时间延长而加强，至48小时后可实现完全抑制，有作为肿瘤基因治疗药物的应用前景。

所构建重组腺病毒对体外培养的A549、HepG-2和Hela细胞具有不同程度的抑制作用，并且在一定时间范围内(24h～96h)，具有剂量效应相关性。

感染剂量为100moi的条件下，对A549、HepG-2和Hela细胞的抑制具有时间效应相关性。

MTT检测分析表明，Ad-VT在48小时可完全抑制A549、HepG-2和Hela细胞的生长，抑制率分别为91.43％、81.26％、87.07％。

按照上述试验过程，检测Ad-VP对肿瘤细胞的杀伤作用，MTT检测分析表明，Ad-VP在48小时可完全抑制A549、HepG-2和Hela细胞的生长，抑制率分别为83.13％、64.58％、87.42％。

另外，实验证明本发明所提供双特异抗肿瘤重组腺病毒的构建模式可在短期内制备出高稳定性、高特异性的重组腺病毒。为此类重组腺病毒在肿瘤基因治疗药物研发领域成系列、成规模的应用奠定了基础。

实施例4双特异性抗肿瘤重组腺病毒的体内抑瘤作用研究

取对数生长期的LLC肺癌细胞，用无血清Hanks液洗涤2遍后，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，右后肢皮下接种LLC肺癌细胞0.1ml，即1×10⁶个肿瘤细胞。10d后长出米粒大小的结节，表明荷瘤成功。

待荷瘤小鼠肿瘤生长至直径为5mm左右时，随机分为3组，每组10只。分组情况如下：第1组为生理盐水对照组；第二组为Ad-VT治疗组；第三组为为正常小鼠对照组。

分组后既进行治疗，每10天一次，共接种三次。方法如下：用生理盐水稀释重组腺病毒至1×10¹⁰PFU/ml，治疗组瘤内注射100μl病毒/只/次(即1×10⁹PFU/只/次)；生理盐水对照组瘤内注射100μl生理盐水/只/次，末次治疗后16d处死小鼠，进行指标检测。

每日观察小鼠的精神状态、采食情况和存活情况。荷瘤后既开始测量肿瘤体积，每2天一次，方法如下：游标卡尺测量肿瘤长径及短径长度(包括皮肤厚度在内)。应用下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(V)＝A²×B×0.52(式中A为肿瘤短径长度；B为肿瘤长径长度)。根据末次测量荷瘤小鼠的肿瘤体积计算抑瘤率，计算公式如下：抑瘤率(％)＝[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。

实验结果表明，Ad-VT可显著延缓动物模型实体肿瘤的生长。对抑瘤率的分析表明，Ad-VT具有抑瘤作用，抑瘤率为86.99％，显著高于生理盐水对照组。对生存率分析表明，Ad-VT能够显著提高荷瘤动物模型生存率。

同样按照上述试验过程，研究Ad-VP对体内抑瘤的作用，实验结果表明，Ad-VP可显著延缓动物模型实体肿瘤的生长。对抑瘤率的分析表明，Ad-VP具有抑瘤作用，抑瘤率为84.02％，显著高于生理盐水对照组。对生存率分析表明，Ad-VP能够显著提高荷瘤动物模型生存率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120>一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用

<130>KHP09112210.6

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>3190

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc     60

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat    120

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc    180

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc    240

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt    300

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta    360

ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg    420

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ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgct gcgcacgtgg gaagccctgg    1860

ccccggccac ccccgcgatg ccgcgcgctc cccgctgccg agccgtgcgc tccctgctgc    1920

gcagccacta ccgcgaggtg ctgccgctgg ccactgcagc ccgggggatc cactagttct    1980

agagcggccg ccaccgcggt ggagctgaat tcctgcaatg agacatatta tctgccacgg    2040

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tccggtttct atgccaaacc ttgtaccgga ggtgatcgat cttacctgcc acgaggctgg    2400

ctttccaccc agtgacgacg aggatgaaga gggtgaggag tttgtgttag attatgtgga    2460

gcaccccggg cacggttgca ggtcttgtca ttatcaccgg aggaatacgg gggacccaga    2520

tattatgtgt tcgctttgct atatgaggac ctgtggcatg tttgtctaca gtcctgtgtc    2580

tgaacctgag cctgagcccg agccagaacc ggagcctgca agacctaccc gccgtcctaa    2640

aatggcgcct gctatcctga gacgcccgac atcacctgtg tctagagaat gcaatagtag    2700

tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa cacacctcct gagatacacc cggtggtccc    2760

gctgtgcccc attaaaccag ttgccgtgag agttggtggg cgtcgccagg ctgtggaatg    2820

tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca acctttggac ttgagctgta aacgccccag    2880

gccataacac tagttctaga gcggccgcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct    2940

tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt    3000

gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg    3060

tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac    3120

aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc    3180

tggggctcga                                                           3190

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gcctgcagac caccatggga catattatct gccac                                 35

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gcggatcctt atggcctggg gcgtttacag c                                     31

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgatatcac caccatggac gctctccaa    29

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcgaattctt acagtcttat acaccttct    29

Claims (10)

1.一种抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，其包括腺病毒载体和引入其中的表达盒，所述腺病毒载体的复制必须基因突变，所述表达盒包括由肿瘤特异性启动子与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子与Apoptin基因组成的表达盒。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体的基因组左侧ITR和包装信号区缺失。

3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子为hTERTp或PEG-3p启动子。

4.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，所述真核启动子为肿瘤特异性启动子或CMV启动子。

5.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体源自人5型腺病毒。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，其由腺病毒载体、CMV启动子、Apoptin基因、hTERTp、人5型腺病毒E1a基因和多聚腺苷酸组成。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤重组腺病毒，其特征在于，其序列为：人5型腺病毒基因组左侧序列-SEQ ID NO：1-人5型腺病毒基因组右侧序列。

8.构建权利要求1所述抗肿瘤重组腺病毒的方法，其特征在于，包括构建含有由肿瘤特异性启动子与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子与Apoptin基因组成的表达盒的穿梭质粒载体，并将所述穿梭质粒载体与腺病毒重组。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述穿梭质粒载体为pAd-VT或pAd-VP，所述腺病毒为5型腺病毒。

10.权利要求1-7所述抗肿瘤重组腺病毒在制备抗肿瘤药物、预防术后肿瘤复发药物中的应用。