CN105177045B - 表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表达人白介素15的新型重组溶瘤腺病毒，其是将5型腺病毒E1区基因启动子替换成转录因子E2F‑1基因，且在E3区插入hIL‑15基因而构建得到的重组溶瘤腺病毒。本发明以E2F‑1作为启动子实现病毒特异性在肿瘤细胞内复制的同时，在病毒基因E3区载人IL‑15基因可以进一步提高病毒抗肿瘤作用：由于pRb/E2F通路缺陷广泛存在于实体肿瘤中，通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的肿瘤抗原，且不受抗原亚细胞定位的局限性，有利于产生具有自身肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答，具有个性化和普遍性的治疗意义；另外，病毒复制过程中带动IL‑15基因表达，在病毒感染的肿瘤细胞局部获得高浓度IL‑15，有利于刺激免疫细胞的活性，激活全身免疫反应，增强抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种表达人白介素15的新型重组溶瘤腺病毒及其构建方法。
背景技术
恶性肿瘤是威胁我国人民健康的重大疾病。传统手术、化疗和放疗只减低了肿瘤负荷，无法根治肿瘤的复发和转移。由于恶性肿瘤的发生和发展有其分子遗传学基础，所以基因疗法有望成为肿瘤治疗新的选择。其中，对腺病毒进行基因改造使其靶向杀伤肿瘤细胞同时避免对正常细胞的影响(即溶瘤腺病毒)，已经成为肿瘤基因治疗的新成员。
为了实现溶瘤病毒的肿瘤靶向性，在其构建策略中，常常在病毒基因组中加载肿瘤或组织特异性启动子以启动E1A、E1B或E4基因。由于E2F-1是一种在细胞周期的调节过程中起重要作用的转录因子,其过表达既可引导静止期细胞进入分裂周期，也可以调控许多与细胞分裂有关的转录因子的表达。利用E2F-1基因在大多数实体肿瘤高表达的特点，构建以E2F-1基因作启动子调控E1A基因表达的溶瘤腺病毒能够选择性的在肿瘤细胞中复制，而不影响正常细胞的功能，见CN00813593.2。
然而，由于机体存在抗病毒免疫，且肿瘤存在很强的免疫抑制网络，单纯溶瘤病毒难以激发理想的免疫应答。最早被应用于临床试验的溶瘤病毒ONYX-015的试验数据表明其作为单一疗法治疗肿瘤抑瘤作用并不明显，需要联合辅助疗法提高抗肿瘤作用。这促使研究者在病毒基因组中插入免疫调节基因使得病毒在直接杀伤肿瘤细胞的同时释放免疫调节因子，优化抗肿瘤免疫反应，这成为抗肿瘤“病毒-基因”策略新方向。
基于这一思路，我们注意到IL-15是T细胞产生细胞因子及其受体的化学诱导剂，可以促进T细胞增殖，长时间维持扩增的CTL细胞的活力并增加其细胞毒性，同时促进T细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子从而增强其杀瘤活性。在IL-15的功能研究中，已有实验证实，IL-15不仅可以促进中性粒细胞、巨噬细胞的活性，对树突状细胞的功能起关键作用；而且还可促进淋巴效应细胞，尤其是NK细胞、NKT细胞、B细胞和CD8+T细胞的产生、激活、归巢和存活。IL-15能够调节记忆性T细胞的存活和增殖，有效抑制Treg细胞对效应T细胞的负向作用。因此，IL-15是非常具有潜力的用于肿瘤治疗的细胞因子，以此构建溶瘤病毒或可取得良好抗肿瘤效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达人白介素15的新型重组溶瘤腺病毒及其构建方法。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒，其是将5型腺病毒E1区基因启动子替换成转录因子E2F-1基因(GenBank：S74230)，且在E3区插入人白介素15基因，即hIL-15基因(GenBank：HSU14407)而构建得到的重组溶瘤腺病毒。
本发明的表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)质粒PXC20-E2Fp的构建：用EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp，回收大小为1088bp的DNA片段，同时用EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20，回收大小为8965bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PXC20-E2Fp。
2)质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建：根据hIL-15基因序列设计PCR扩增引物，
上游引物：
5’-ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3’，
下游引物：
5’-CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3’，
以质粒hIL2SPIL15为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，用EcoRI和SalI双酶切扩增产物，回收大小为477bp的DNA片段；再用EcoRI和SalI双酶切质粒pENTER12，回收大小为3002bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为pENTER12-IL2SP-IL15。
3)质粒PPE3-IL2SP-IL15的构建：质粒pPE3-RC与pENTER12-IL2SP-IL15进行LR重组反应，所得产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15。
4)重组溶瘤腺病毒的制备：将质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15共转染至HEK293细胞，转染后9-14天出现病毒空斑，经过病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定。经鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-E2F1/IL15。
前述的方法，步骤2)中进行PCR扩增hIL-15基因的反应条件为：94℃5min；94℃40sec，56℃40sec，68℃90sec，共30个循环；68℃10min。
前述的方法，步骤4)中质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15通过Lipofectamine2000共转染至HEK293细胞。
本发明还涉及所述重组溶瘤腺病毒或所述方法在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
可选的，所述应用包括将所述重组溶瘤腺病毒与药物可接受的载体混合制备药物。
可选的，所述药物可接受的载体包括但不限于PBS缓冲液、生理盐水和细胞培养液。其中，所述细胞培养液可以为含牛血清的1640培养液或DMEM培养液。
本发明以E2F-1作为启动子实现病毒特异性在肿瘤细胞内复制的同时，在病毒基因E3区装载人IL-15基因可以进一步提高病毒抗肿瘤作用：(1)pRb/E2F通路缺陷广泛存在于实体肿瘤中，通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的肿瘤抗原，且不受抗原亚细胞定位的局限性，有利于产生具有自身肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答，具有个性化和普遍性的治疗意义；(2)病毒复制过程中带动IL-15基因表达，在病毒感染的肿瘤细胞局部获得高浓度的IL-15，有利于刺激免疫细胞的活性，激活全身免疫反应，增强抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中质粒PXC20-E2Fp的构建流程示意图。
图2为本发明实施例1中质粒PXC20-E2Fp的酶切鉴定结果；其中A：Mix DNALadder；B：EcoRI+XhoI酶切，M：Mix DNA Ladder，1-6为PXC20-E2Fp的6个克隆；C：M：Mix DNALadder1，EcoRI+XhoI 8965bp+1088bp，2：AgeI+XhoI 9771bp+282bp，3：EcoRV 9158bp+895bp，4：HINDIII 6725bp+3328bp，5：NheI+XbaI 8390bp+1163bp，6：BstXI 6059bp+3672bp+322bp，7：HincII 5139bp+2581bp+2333bp，8：PvuII 3473bp+2226bp+1861bp+1482bp+908bp+76bp+27bp。
图3为本发明实施例1中质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建流程示意图。
图4为本发明实施例1中LR重组反应示意图。
图5为本发明实施例1中质粒pENTER12-IL2SP-IL15和PPE3-IL2SP-IL15的酶切鉴定结果；其中，A：M：Mix DNA Ladder，M左为XbaI酶切：2280bp+1199bp，M右为XhoI+EcoRV酶切：2633bp+846bp；B：M1：Mix DNA Ladder，M2：λDNA EcoRI+HindIII marker，1：HindIII8010bp+6034bp+5322bp+4597bp+4360bp+2937bp+2791bp+2081bp+1522bp+75bp，2：EcoRI23815bp+8564bp+3159bp+2121bp+70bp，3：XbaI 27716bp+7468bp+1346bp+1199bp，4：BamHI20674bp+14913bp+1741bp+401bp，5：SalI 14221bp+6903bp+6037bp+6006bp+4183bp+379bp，6：SpeI 34330bp+3399bp，7：XhoI 14500bp+8322bp+4995bp+4908bp +2466bp+1445bp+595bp+498bp，8：EcoRV 8904bp+7637bp+4546bp+3840bp+2990bp+2623bp+2542bp+2052bp+1357bp+1238bp，9：NheI 11917bp+10342bp+6192bp+4743bp+3848bp+687bp，10：XbaI+SpeI 26206bp+7468bp+1510bp+1346bp+656bp+543bp，11：PacI 36422bp+991bp+316bp；C：λDNA EcoRI+HindIII marker。
图6为本发明实施例1中HEK293细胞内重组示意图。
图7为本发明实施例1中溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15的PCR鉴定结果；其中，N：阴性对照；P1：PXC20质粒；P2：PXC20-E2Fp质粒；P3：PPE3-IL2SP-IL15质粒；1-2：Ad-E2F1/IL15病毒的2个克隆；M：Mix DNA Ladder。
图8为本发明实施例1中重组腺病毒Ad-E2F1/IL15的DNA结构示意图。
图9为本发明实施例1中重组腺病毒Ad-E2F1/IL15构建总流程图。
图10为本发明实施例2中溶瘤腺病毒对细胞增殖的影响。
图11为本发明实施例3中Ad-E2F1/IL15感染的细胞培养上清中IL-15蛋白含量。
图12为本发明实施例4中不同重组腺病毒局部注射后肿瘤生长曲线比较。
图13为HEK293细胞的培养。
图14为病毒的扩增。
图15为50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法
1、实验材料及试剂
质粒PXC20及腺病毒骨架质粒pPE3-RC由由上海东方肝胆外科医院病毒及基因治疗实验室提供。携带hIL-15基因的质粒hIL2SPIL15。限制性内切酶EcoRI、XhoI、SalI、PvuII、NcoI等购自美国NEB公司，DNA连接酶溶液I购自TakaRa公司，胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒DNA制备试剂盒、病毒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，LipofectAmine2000试剂盒购自GIBCO BRL公司。人胚肾293细胞(HEK293细胞)购自加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司，人结肠癌细胞系SW620和人胚胎成纤维细胞系Wi38由中国人民解放军总医院普通外科研究所提供。MTT购自美国Sigma公司，IL15的ELISA检测试剂盒购自美国BD公司。
2、主要实验仪器
3、实验方法
3.1 PCR引物设计与合成
参考E2F启动子(E2Fp)序列(GenBank：S74230)设计引物，上游引物(SEQ ID No.1所示序列)：
5’-GTTTCATCCGGACAAAGCC-3’，
下游引物(SEQ ID No.2所示序列)：
5’-CTCGAGGATATCATCGAG-3’。根据人IL15基因序列(GenBank：HSU14407)设计引物，上游引物(SEQ ID No.3所示序列)：
5’-ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3’，
下游引物(SEQ ID No.4所示序列)：
5’-CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3’。
以质粒hIL2SPIL15(包含IL2信号肽基因)为模板进行PCR扩增。反应循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，56℃退火40sec，68℃延伸90sec，共30个循环；最后68℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.2质粒PXC20-E2Fp的构建
内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp(购于上海白泽生物科技有限公司，包含E2F-1启动子-218～+51，具体结构见图1)，胶回收1088bp的DNA片段(表1)；内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20，胶回收8965bp的DNA片段(表2)。二者按载体连接试剂盒说明连接12h后(表3)，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，铺含AMP的琼脂板后，于37℃生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，于含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PXC20-E2Fp。PXC20-E2Fp的构建流程示意图如图1所示，酶切鉴定结果如图2所示。
表1 质粒P55-E2Fp的酶切回收
| P55‐E2Fp | 5μl |
| EcoRI | 3μl |
| XhoI | 3μl |
| NEB4 | 10μl |
| 10×BSA | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 69μl |
| 总体系 | 100μl |
表2 质粒PX20的酶切回收
| PXC20 | 5μl |
| EcoRI | 3μl |
| XhoI | 3μl |
| NEB4 | 10μl |
| 10×BSA | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 69μl |
| 总体系 | 100μl |
表3 质粒P55-E2Fp和PX20的连接
| PXC20/EcoRI+XhoI | 3μl |
| P55‐E2Fp/EcoRI+XhoI | 7μl |
| 溶液I | 10μl |
| 总体系 | 20μl |
3.3质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建
内切酶EcoRI和SalI双酶切质粒hIL2SPIL15的PCR扩增产物PCR-hIL2SPIL15(表4)，胶回收477bp的DNA片段，内切酶EcoRI和SalI双酶切质粒pENTER12(表5)，胶回收3002bp的DNA片段。二者按载体连接试剂盒说明连接12h后(表6)，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，铺含AMP的琼脂板后，于37℃生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，于含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为pENTER12-IL2SP-IL15。pENTER12-IL2SP-IL15的构建流程示意图如图3所示。
表4 PCR-hIL2SPIL15的酶切回收
| PCR‐hIL2SPIL15 | 30μl |
| EcoRI | 3μl |
| SalI | 3μl |
| NEB4 | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 54μl |
| 总体系 | 100μl |
表5 pENTER12载体的酶切回收
| pENTER12 | 3μl |
| EcoRI | 3μl |
| SalI | 3μl |
| NEB4 | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 81μl |
| 总体系 | 100μl |
表6 PCR-hIL2SPIL15和pENTER12连接
| pENTER12/EcoRI+SalI | 3μl |
| PCR‐hIL2SPIL15/EcoRI+SalI | 7μl |
| 溶液I | 10μl |
| 总体系 | 20μl |
3.4 PPE3-IL2SP-IL15的构建
质粒pPE3-RC与pENTER12-IL2SP-IL15进行LR重组反应。25℃水浴6h后，加1μl蛋白酶K，37℃水浴10min。转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，铺含AMP的琼脂板后，于37℃生化培养箱内培养10-12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15。LR重组反应如图4所示。
质粒pENTER12-IL2SP-IL15和PPE3-IL2SP-IL15的酶切鉴定结果如图5所示。
3.5重组及鉴定
将质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15通过Lipofectamine2000共转染至HEK293细胞。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA BloodMini Kit提取腺病毒DNA，用PCR进行鉴定。经鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-E2F1/IL15。HEK293细胞内重组示意图如图6所示，溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15的PCR鉴定结果如图7所示。
3.5.1 HEK293细胞的培养流程图如图13所示。
3.5.2病毒的扩增流程图如图14所示。
3.5.3 50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度流程图如图15所示。
重组腺病毒Ad-E2F1/IL15的DNA结构示意图如图8所示，构建总流程图如图9所示。
实施例2 重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15对细胞增殖的影响实验
将人结肠癌细胞SW620和人胚肺成纤维细胞Wi38以每孔5000个的量铺入96孔板，培养6h(细胞贴壁)后加入感染系数(MOI)为10PFU/细胞的Ad-E2F1/IL15病毒(实施例1中制备)及不含IL15基因的溶瘤病毒Ad-E2F1，每组3个平行孔，病毒作用2h后弃去含病毒的培养液，换成100μL 5％胎牛血清的培养液继续培养。第0、1、3、5、7天取相应的96孔板，加入MTT液体(每孔30μL)，37℃孵育4小时，用移液器小心吸弃孔内培养上清液，加入二甲基亚砜溶液150μL，振荡器震荡20min，使结晶物充分融解，选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
细胞体外增殖实验结果显示，溶瘤腺病毒Ad-E2F1和Ad-E2F1/IL15均能明显抑制人结肠癌SW620细胞的增殖，第7天时抑制率均达70％以上，而对人正常细胞系Wi38的增殖无明显影响(图10)，说明重组腺病毒能够选择性杀伤高增殖细胞，实现了其肿瘤特异性杀伤作用。
实施例3 重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15感染细胞后ELISA法检测IL-15的表达量
取对数生长期的人结肠癌细胞SW620和人胚肺成纤维细胞Wi38，分别接种至6孔板中(1×105/mL)培养24h，以MOI为5PFU/细胞加入病毒Ad-E2F1/IL15(实施例1中制备)，2h后换成100μL 5％胎牛血清的培养液继续培养，收集感染12、24、48h的细胞培养上清，用ELISA法检测IL-15的表达量。
Ad-E2F1/IL15感染48h后，SW620细胞培养上清中的IL-15含量明显增加，而Wi38细胞细胞上清中的IL-15始终维持在较低水平(图11)。说明Ad-E2F1/IL15在选择性裂解肿瘤细胞SW620的同时IL-15表达显著增高，符合免疫增强型溶瘤病毒的构建要求。
实施例4 重组溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15对肿瘤生长的抑制实验
在BALB/c裸鼠(雄性，6周龄)右侧腋下皮下注射人结肠癌细胞SW620(1×/106/只)，构建皮下瘤动物模型。肿瘤长至40-50mm3时，将小鼠随机分为4组，分别进行PBS(100μl)、Ad-EGFP(只表达绿色荧光的5型腺病毒作为对照病毒)或Ad-E2F1或Ad-E2F1/IL15(5×108PFU/100μl)瘤内注射治疗，隔天进行1次，共3次。每3天观察并记录肿瘤生长情况，按照“肿瘤体积＝(短径2×长径)/2”公式计算肿瘤体积。于第24天，Ad-E2F1/IL15治疗组肿瘤生长被显著抑制，治疗效果显著优于其他治疗组(PBS&Ad-E2F1/IL15，p＝0.0002；Ad-EGFP&Ad-E2F1/IL15，p＝0.0008；Ad-E2F1&Ad-E2F1/IL15，p＝0.0054)。(图12)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)质粒PXC20-E2Fp的构建：用EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp，回收大小为1088bp的DNA片段，所述质粒P55-E2Fp的图谱如图1所示，同时用EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20，回收大小为8965bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PXC20-E2Fp；
2)质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建：根据hIL-15基因序列设计PCR扩增引物，
上游引物：
5’-ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3’，
下游引物：
5’-CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3’，
以质粒hIL2SPIL15为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，用EcoRI和SalI双酶切扩增产物，回收大小为477bp的DNA片段；再用EcoRI和SalI双酶切质粒pENTER12，回收大小为3002bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为pENTER12-IL2SP-IL15；
3)质粒PPE3-IL2SP-IL15的构建：质粒pPE3-RC与pENTER12-IL2SP-IL15进行LR重组反应，所得产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15；
4)重组溶瘤腺病毒的制备：将质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15共转染至HEK293细胞，转染后9-14天出现病毒空斑，经过病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定；经鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-E2F1/IL15。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行PCR扩增hIL-15基因的反应条件为：94℃5min；94℃40sec，56℃40sec，68℃90sec，共30个循环；68℃10min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15通过Lipofectamine2000共转染至HEK293细胞。
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