CN110295195A

CN110295195A - 靶向肝癌的溶瘤腺病毒gd55-gsdme的构建和应用

Info

Publication number: CN110295195A
Application number: CN201910561970.1A
Authority: CN
Inventors: 王毅刚; 王彬蓉; 黄芳
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2019-10-01

Abstract

本发明公开了一种靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：制备携带GSDME基因的pGD55‑GSDME质粒；将pGD55‑GSDME质粒用Pme I线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy‑1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73启动子调控的以及缺失E1B55和E3区携带GSDME基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒GD55‑GSDME。本发明还同时公开了上述溶瘤腺病毒GD55‑GSDME在制备治疗肝癌药物中的应用。

Description

靶向肝癌的溶瘤腺病毒GD55-GSDME的构建和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体涉及携带GP73启动子和细胞焦亡基因及抑癌基因GSDME的溶瘤腺病毒GD55-GSDME的构建和应用。

背景技术

针对肝癌，传统的治疗手段包括手术、放射治疗和化疗，但原发性肝癌对化疗不敏感，单一药物效果较差，长期缓解更是困难。而且肝癌侵袭性强复发率高，疗效往往很差。基因治疗是以改变人类遗传物质为基础的生物医学治疗手段，将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或过表达或表达异常引起的疾病，达到治疗目的。目前基因治疗在恶性肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等重大疾病方面应用广泛。

1996年使用肿瘤复制性腺病毒治疗肿瘤的策略被首次提出，最近几十年病毒治疗肿瘤的研究也取得一系列进展。2001年，中国科学院上海生物化学与细胞研究所刘新垣院士开创性提出了肿瘤的靶向基因-病毒治疗策略(Cancer-Targeting Gene-Virotherapy,CTGVT)，结合基因治疗和病毒治疗两者优点，表现了良好的协同作用。以溶瘤腺病毒作为载体，在病毒DNA 上插入抑癌基因，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抑癌基因也在不断的大量表达，克服了基因治疗中基因转染效率低和拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，大量的体内、外实验均表明靶向基因-病毒治疗的效果明显优于单一的基因治疗或病毒治疗的效果。

溶瘤腺病毒载体具有很多独特的优点：腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒的基因组较大，插入大片段外源基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，可以同时感染增殖细胞和非增殖细胞；体内外实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作，可以运用基因工程手段插入或者删除基因。

构建肿瘤靶向性腺病毒策略包括利用肿瘤特异性启动子替换原本启动子和携带抑癌基因，使得抑癌基因只在肿瘤细胞中表达而在正常细胞中不表达，从而增强腺病毒的肿瘤靶向性和疗效，降低副反应。许多研究表明，GP73在多种疾病中异常表达，与肝脏疾病特别是肝癌的关系尤为密切。2010年，北京协和医院的毛一雷教授等人在一项包括789例HCC患者的4217个大样本的研究中用免疫沉淀法检测，发现GP73诊断肝癌的敏感度和特异性分别达到了75％和95％，传统的肝癌标志物AFP只有58％和85％。2013年汤绍辉博士对2075例肝癌样本进行Meta分析，发现GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了78％和84％，AFP 只有55％和80％。这些研究都表明GP73具有肝癌特异性。

GSDME基因又被称为DFNA5(Deafness,Autosomal Dominant NonsyndromicSensorineural 5)，编码一种496个氨基酸的蛋白质，属于与GSDMD相同的gasdermin超家族。研究发现在原发性胃癌、结直肠癌和乳腺癌中DFNA5高度甲基化，可以作为一种肿瘤抑制因子。同时GSDME还可以将化疗药物诱导的caspase 3调控的细胞凋亡转化成细胞焦亡。当用化疗药物处理肿瘤细胞时，caspase 3被激活启动相应的细胞凋亡，在此过程中GSDME在接头处被 caspase 3特异性剪切生成GSDME-N片断，GSDME-N片段在细胞膜上穿孔并引起细胞焦亡，细胞膜上形成微孔和囊泡，胞内离子平衡丧失，细胞发生渗透性溶解。盐酸阿霉素为广谱抗癌药物，作用机理在于对脱氧核糖核酸的制约及嵌入DNA从而抑制核酸合成。

目前现有的靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用，该方法只能通过细胞凋亡杀死肿瘤细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-GSDME的构建方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种靶向肝癌溶瘤腺病毒GD55-GSDME的构建方法，包括如下步骤：

1)、制备携带GSDME基因的pGD55-GSDME质粒；

用Hind III和Xba I分别双酶切pCA13载体和pCS2-GSDME质粒，将双酶切后的pCA13 载体和双酶切后的GSDME基因连接，得到pCA13-GSDME，

先将pCA13-GSDME用Bgl II单酶切(从而得到完整的基因表达框)，再连接到同样经 Bgl II单酶切的pGD55载体上，得到pGD55-GSDME质粒；

2)、将pGD55-GSDME质粒用Pme I线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73启动子调控的以及缺失E1B55和 E3区携带GSDME基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

3)、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒GD55-GSDME。

即，具体为：

1)、将原始质粒pCS2-GSDME用Hind III和Xba I双酶切后得到GSDME片段：

2)、与同样用Hind III和Xba I双酶切的pCA13相连，得到pCA13-GSDME；然后用BglII单酶切得到完整的基因表达框，连接到同样经Bgl II酶切的pGD55载体上，得到 pGD55-GSDME质粒：

3)、将pGD55-GSDME质粒用Pme I线性化后转导含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73启动子调控的以及缺失E1B55和E3 区携带GSDME基因的腺病毒骨架DNA质粒载体：

4)、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到目的溶瘤腺病毒GD55-GSDME。

本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒GD55-GSDME在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明的溶瘤腺病毒GD55-GSDME在用于治疗肝癌时，可采用瘤内注射的方式，用量以小鼠计，为2×10⁹pfu/小鼠。

本发明在GD55的基础上携带了GSDME基因，新构建了GD55-GSDME，所构建的 GD55-GSDME具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡和细胞焦亡的效果，并且抗癌效果强于GD55。将GSDME基因用于肿瘤的靶向基因-病毒治疗。

本发明构建的双靶向溶瘤腺病毒GD55-GSDME经试验证明能够选择性的杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞；而且跟化疗药物联合使用还具有协同效果，能够更加有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为体外实验对肝正常细胞QSG-7701的存活率影响实验图。

图2为体外对肝癌细胞SMMC-7721的特异性杀伤效果图。

图3为体外对肝癌细胞SMMC-7721的细胞焦亡效果图。

图4为肿瘤双靶向性腺病毒GD55-GSDME、化疗药物Dox等在裸鼠体内治疗肝癌细胞抑制瘤的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种靶向肝癌溶瘤腺病毒GD55-GSDME的构建方法，包括如下步骤：

混匀之后置于37℃恒温水浴锅中酶切2-4h后进行0.1％琼脂糖凝胶电泳，135V电泳35 min。电泳之后利用凝胶成像系统查看DNA胶确定条带的大小和位置，GSDME片段的大小为1500bp。

混匀之后置于37℃恒温水浴锅中酶切2-4h后进行0.1％琼脂糖凝胶电泳，135V电泳35 min。电泳之后利用凝胶成像系统查看DNA胶确定条带的大小和位置，pCA13载体的大小约为7000bp。确定正确之后利用捷瑞的DNA胶回收试剂盒分别回收目的片段，使用TOYOBO 的Ligation high进行连接，在16℃恒温连接2-4h，进行DH5ɑ转化。待平板上长出单菌落后进行单菌落挑选和摇床37℃、220rpm培养约12h，使用捷瑞的质粒小抽试剂盒进行质粒提取，之后仍旧利用Hind III和Xba I双酶切鉴定重组质粒，若出现1500bp和7000bp的两条带则表示重组质粒pCA13-GSDME连接成功。

之后分别取pCA13-GSDME和pGD55质粒用Bgl II酶进行单酶切，酶切体系如下所示。

37℃恒温水浴锅中酶切2-4h后进行0.1％琼脂糖凝胶电泳，135V电泳35min。GSDME基因的大小约为1500bp，pGD55载体约为9000bp。将两个目的基因片段利用捷瑞的DNA 胶回收试剂盒进行回收，连接、转化和酶切鉴定步骤同上，但酶切鉴定使用的酶为Bgl II。若出现1500bp和9000bp两条带则证明重组质粒pGD55-GSDME连接成功。

取pGD55-GSDME质粒2μg进行酶切，酶切体系如下：

37℃水浴酶切2-4h，使得pGD55-GSDME质粒线性化，之后进行BJ5183转化。转化步骤同大肠杆菌转化步骤，对转化产物挑取单菌落进行摇床培养16h，然后使用捷瑞的试剂盒进行质粒抽提和酶切鉴定，鉴定体系如下：

37℃水浴酶切2-4h，1％琼脂糖凝胶电泳135V电泳35min，若同时出现1200bp、2000bp、 4800bp、7000bp和20000bp的5条带则证明pGD55-GSDME进行BJ5183重组成功。

取稳定转化后的pshuttle-GSDME质粒2μg进行Pac I酶切线性化处理，酶切体系：

37℃水浴酶切2-4h后进行去磷酸化处理，往EP管里加入1μL的FastAP酶和2μL的FastAP buffer，混匀，37℃水浴15min，75℃水浴5min。置于-20℃保存。包装前一天，在六孔板里铺30×10⁴个293A细胞，每孔2mL的培养基(可包含血清和双抗)。进行转染时细胞密度应为40％-80％，使用QIAGEN的Effectene transfection进行转染，具体步骤参见其说明书。将六孔板放在细胞培养箱箱中培养7-10天，每天观察六孔板里的细胞形态，等待溶瘤腺病毒的包装。等病毒包装出来之后收取六孔板里的细胞和上清于灭菌的EP管中，做好标记并于-80℃冰箱中保存。

注：原始质粒pCS2-GSDME在已经公开发表于NATURE的《Chemotherapy drugsinduce pyroptosis through caspase-3cleavage of a gasdermin》中有明确告知。

实验1、肝癌双靶向溶瘤腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测

细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将肝癌细胞株SMMC-7721和肝正常细胞QSG-7701细胞以每孔5000个细胞的数量铺96孔板，细胞贴壁后分别加入10MOI的病毒和0.4μg/mL的Dox，每隔24h测量一次，连续4天，每孔加入20μL的5mg/mL的 MTT溶液，37℃继续培养4h后，除去孔内上清，每孔加入150μL的二甲基亚砜，摇床震荡 15min使得结晶物充分溶解，在酶标仪上测定OD490值。细胞存活率＝(病毒感染孔吸光值- 调零孔吸光值)/(对照孔吸光值-调零孔吸光值)×100％。

细胞经病毒和药物处理后发生细胞焦亡的程度由LDH释放量来测定。步骤如下：将肝癌细胞株SMMC-7721以每孔5000个细胞的数量铺96孔板，细胞贴壁后分别加入10MOI的病毒和0.4μg/mL的Dox，每隔24h测量一次，连续4天，提前1小时往细胞最大酶活性孔加10％体积的LDH释放试剂，继续孵育1h。预定时间到时，将96孔板用多孔板离心机400g 离心5min，分别隔空取上清液120μL加入到新的96孔板中，每孔加入60μL的LDH检测工作液。混匀，室温避光孵育30min，在OD490nm处测定吸光度，并用600nm或600nm以上的任一波长作为参考波长进行双波长测定。LDH释放量＝(处理样品吸光度-样品对照吸光度)/(细胞最大酶活性吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。

上述细胞培养均为37℃，5％CO₂培养箱恒温培养；培养基为10％胎牛血清的DMEM培养基(DMEM购自Gibco)。

注：“GD55-GSDME”：10MOI；“Dox”：终浓度0.4μg/mL；“Combination”：10MOI的GD55-GSDME和终浓度0.4μg/mL的Dox联合使用。

结果如图1和图2所示，肝癌靶向性溶瘤腺病毒对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，对正常细胞毒性很小，具有肿瘤靶向性；化疗药物Dox对肝正常细胞和肝癌细胞都具有细胞毒性。 LDH释放量如图3所示，化疗药物和溶瘤腺病毒均能引起细胞释放LDH，但两者联合处理释放的LDH量最多，说明联合处理组发生细胞焦亡的数量更多。

实验2、双靶向溶瘤腺病毒和化疗药物在裸鼠体内治疗肿瘤抑制瘤

将4-5周龄的雌性裸鼠皮下接种肝癌细胞SMMC-7721，每只裸鼠接种5×10⁶个细胞，1-2 周后当肿瘤体积达到100-250mm³时进行随机分组。治疗组为3组分别给予2×10⁹pfu/mice的 GD55-GSDME、2mg/(kg·mice)的Dox、病毒和药物两者联合使用进行治疗，对照组则是注射磷酸缓冲液(PBS)，实验结果如图4所示，两者联合治疗比任一单一处理抑制肿瘤生长的效果更加明显，同时还延长了荷瘤裸鼠的生命周期。

对比例1、以GD55病毒代替本发明的溶瘤腺病毒GD55-GSDME，进行上述实验2。

所得结果与本发明的GD55-GSDME的对比如图4和表1所述。

表1

病毒	GD55	GD55-GSDME
			携带基因	无	GSDME
杀死细胞方式	细胞凋亡	同时引起细胞凋亡和细胞焦亡
			30天体内抗肿瘤结果	肿瘤体积达951mm<sup>3</sup>	肿瘤体积为601mm<sup>3</sup>

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)、制备携带GSDME基因的pGD55-GSDME质粒；

2)、将pGD55-GSDME质粒用Pme I线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73启动子调控的以及缺失E1B55和E3区携带GSDME基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

2.根据权利要求1所述的靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，其特征是所述步骤1)为：

用HindIII和Xba I分别双酶切pCA13载体和pCS2-GSDME质粒，将双酶切后的pCA13载体和双酶切后的GSDME基因连接，得到pCA13-GSDME，

先将pCA13-GSDME用Bgl II单酶切，再连接到同样经Bgl II单酶切的pGD55载体上，得到pGD55-GSDME质粒。

3.如权利要求1或2所述的溶瘤腺病毒GD55-GSDME在制备治疗肝癌药物中的应用。