CN112592900A - 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用。本发明分别包装表达位点特异重组酶的腺相关病毒oAAV‑SSR，及携带位点特异序列和倒转GSDM‑NT序列的腺相关病毒oAAV‑SS‑GSDM‑NT，从而避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白的表达，成功获得了安全，高效，高滴度的溶瘤腺相关病毒oAAVs，该溶瘤腺相关病毒在体外可使多种肿瘤细胞发生焦亡，具有很好的肿瘤细胞杀伤作用，在体内可用于治疗动物肿瘤模型。oAAVs与免疫调节剂组合构成的肿瘤治疗组合药剂，在动物肿瘤模型上比单独使用oAAVs或免疫调节剂都具有更显著的溶瘤效果，说明该肿瘤治疗组合药剂具有很好的肿瘤治疗应用前景。

Description

构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其 应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用。
背景技术
细胞焦亡是一种由成孔蛋白家族gasdermins N段结构域介导的细胞胀大破裂并释放出大量炎症物质的细胞程序化死亡。诱使肿瘤细胞发生焦亡，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，又可以触发强烈的抗肿瘤免疫反应，与免疫筛查位点PD-1/PD-L1阻断联合应用，可以发挥很好的溶瘤效果。
诱发肿瘤焦亡的方法是运用载体递送成孔蛋白家族gasdermins N段结构域(GSDM-NT)基因至肿瘤细胞内。目前已有的溶瘤病毒载体包装方法在包装时都无法避免目的基因(GSDM-NT)的表达，而GSDM-NT具有很强的细胞毒性，一旦在内部表达连细菌都会发生焦亡，最终无法包装获得表达焦亡蛋白的溶瘤病毒载体。目前没有表达焦亡蛋白(GSDM-NT)的溶瘤病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用，该溶瘤腺相关病毒安全、高效、可用于人体及宠物治疗肿瘤。
为实现上述目的，本发明所设计一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，包括以下步骤：
1)扩增获得焦亡蛋白基因
从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因(GSDM-NT)；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；
2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
2.1构建核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT
a.将pAAV-SS质粒用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；
b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；
2.2三质粒共转染包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
a.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，按照摩尔比1:1:1的比例，用阳离子转染试剂PEI共转染HEK 293T细胞，72小时后收取细胞，按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬HEK 293T细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清，后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV-SS-GSDM-NT滴度进行测定；
b.利用上述方法，使用核心质粒pAAV-SSR、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR，采用荧光定量PCR对oAAV-SSR滴度进行测定；
3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs
将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR滴度均调整至2×1012病毒粒子/毫升(vg/ml)后等比例混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。
进一步地，所述步骤1)中，人类焦亡蛋白基因选自GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～5所示；具体如下：
GSDMA-NT序列：
5’-atgaccatgtttgaaaatgtcacccgggccctggccagacagctaaaccctcgaggggacctgacaccacttgacagcctcatcgacttcaagcgcttccatcccttctgcctggtgctgaggaagaggaagagcacgctcttctggggggcccggtacgtccgcaccgactacacgctgctggatgtgcttgagcccggcagctcaccttcagacccaacagacactgggaattttggctttaagaatatgctggacacccgagtggagggagatgtggatgtaccaaagacggtgaaggtgaagggaacggcagggctctcgcagaacagcactctggaggtccagacactcagtgtggctcccaaggccctggagaccgtgcaggagaggaagctggcagcagaccacccattcctgaaggagatgcaagatcaaggggagaacctgtatgtggtgatggaggtggtggagacggtgcaggaggtcacactggagcgagccggcaaggcagaggcctgcttctccctccccttcttcgccccattggggctacagggatccataaatcacaaggaggctgtaaccatccccaagggctgcgtcctggcctttcgagtgagacagctgatggtcaaaggcaaagatgagtgggatattccacatatctgcaatgataacatgcaaaccttccctcctggagaaaagtcaggagaggagaaggtcatccttatccaggcatctgatgttgggtga-3’；
GSDMB-NT序列：
5’-atgttcagcgtatttgaggaaatcacaagaattgtagttaaggagatggatgctggaggggatatgattgccgttagaagccttgttgatgctgatagattccgctgcttccatctggtgggggagaagagaactttctttggatgccggcactacacaacaggcctcaccctgatggacattctggacacagatggggacaagtggttagatgaactggattctgggctccaaggtcaaaaggctgagtttcaaattctggataatgtagactcaacgggagagttgatagtgagattacccaaagaaataacaatttcaggcagtttccagggcttccaccatcagaaaatcaagatatcggagaaccggatatcccagcagtatctggctacccttgaaaacaggaagctgaagagggaactacccttttcattccgatcaattaatacgagagaaaacctgtatctggtgacagaaactctggagacggtaaaggaggaaaccctgaaaagcgaccggcaatataaattttggagccagatctctcagggccatctcagctataaacacaagggccaaagggaagtgaccatccccccaaatcgggtcctgagctatcgagtaaagcagcttgtcttccccaacaaggagacgatgaatattcatttcaggggcaaaacaaaatcctttccagaagagaaggatggtgcttcatcctgtttaggaaagtctttgggttcggaggattccagaaacatgaaggagaagttggaggacatggagagtgtcctcaaggacctgacagaggagaagagaaaagattag-3’；
GSDMC-NT序列：
5’-atgccctccatgttggaacgcattagcaaaaatttggtcaaagagattggaagcaaagacctgacacctgtcaaatacctattgagtgccaccaaattacgtcagtttgttatattacgaaagaagaaggattctcgttcatcattttgggaacaatctgactatgttccagttgaattctccctcaatgacatcctggagccaagttcttcagtcctagaaactgttgtgacaggaccgttccacttcagtgacattatgatccagaagcataaggctgacatgggtgtgaatgttggtatagaagtgagtgtgtcaggggaggcctctgtggaccatggatgctccctcgagtttcaaattgttaccatcccatcaccaaacctggaagactttcaaaaaaggaaactgttggatccagagccatcatttctgaaggagtgccggaggagaggggacaacctgtacgtggtgacagaggctgttgaactgatcaacaatactgtgctgtacgatagcagtagtgtgaatattttagggaaaattgctctttggattacctatggcaagggtcaaggccaaggagagagtctcagagtgaagaagaaggcgctgactcttcagaaaggcatggtgatggcttataagagaaagcagctggttatcaaggagaaagccattctcatctcagatgatgatgaacagagaacctttcaagatgagtacgaaatttccgaaatggtaggctactgtgctgcgaggagtgaggggtga-3’；
GSDMD-NT序列：
5’-atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggggagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctacgatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgctgtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagattag-3’；
GSDME-NT序列：
5’-atgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagattga-3’；
小鼠焦亡蛋白基因选自mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6～8所示；具体如下：
mGSDMA3-NT序列：
5’-atgcctgtgtttgaggatgtcacccgggccctggttagagagctgaaccctcgaggggatctgacacccctagacagcctcatcgacttcaaacactttcgtcccttctgcctggtgctgaggaagaggaagagcacattgttctggggagcccgctatgtgcgcaccgactacactctcctggatttgctggagccgggcagctccccctcagatctgacagacagtggcaactttagctttaagaatatgctggatgtccaagtacagggacttgtggaagtgccaaagacagtgaaggtaaaggggactgcgggtctgtcacaaagcagcacactggaggtgcagacactcagcgtggctccctcggctctggagaacttgaagaaggagaggaaactgtcagcagaccactcgttcctgaacgagatgaggtatcatgagaagaacctgtatgtggtgatggaggcagtagaagccaagcaggaagttactgtggagcaaactggcaacgcaaatgccatcttctctctccccagcttggctctactgggactacagggatccttgaacaacaacaaggctgtaaccatccccaagggctgtgtcctggcctatcgagtgagactactgagagtctttttgttcaatctttgggatattccgtacatttgcaatgacagcatgcaaaccttccctaagatcaggcgtgtaccttgcagtgccttcatatctcctacccagatgatatctgaagagccagaagaagagaagctcattggggagtga-3’；
mGSDMD-NT序列：
5’-atgccatcggcctttgagaaagtggtcaagaatgtgatcaaggaggtaagcggcagcagaggcgatctcattccggtggacagcctgcggaactccaccagcttcaggccctactgccttctgaacaggaaattttcaagctcaaggttctggaaaccccgttattcatgtgtcaacctgtcaatcaaggacatcctggagcccagtgctccagaaccagaaccggagtgttttggctccttcaaagtctctgatgtcgtcgatgggaacattcagggcagagtgatgttgtcaggcatgggagaagggaaaatttctggtggggctgcagtgtctgacagttccagtgcctccatgaatgtgtgtatactgcgtgtgactcagaagacctgggagaccatgcagcatgaaaggcaccttcagcagcctgagaacaaaatcctgcaacagcttcggagtcgtggggatgacctgtttgtggtgaccgaggtgctgcagacaaaggaggaagtgcagatcactgaggtccacagccaagagggctcaggccagtttacgctgcctggggctttatgcttgaagggtgaaggcaagggccaccaaagccggaagaagatggtgaccattcctgcaggcagcatcctggcattccgagtggcccaactgcttattggctctaaatgggatatccttctcgtctcagatgagaaacagaggacctttgagccctcctcaggtgacagaaaagcagtgggccagaggcaccatggcctcaatgtgcttgctgcgctttgttccatcggaaagcagctcagtctcctgtcagattag-3’；
mGSDME-NT序列：
5’-atgtttgccaaagcaactcgaaattttcttaaagaagttgatgctggaggagacctgatttcagtctcacacttgaacgactctgacaagctgcaacttctaagtctggtgaccaaaaagaagagatactggtgctggcagagacccaagtaccagattttatctgccaccctggaagatgtactcacagaagggcactgtctcagtccagtggttgtggagtcagacttcgtgaaatacgagagcaagtgtgagaaccataagagcggggctattgggacagtcgtggggaaggtcaagctgaacgttggtggcaaaggcgtggtggagagtcactcttcgtttggaaccctgaggaagcaggaggtggacgtgcagcagctcatccaggatgccgtcaagagaacagttaatatggacaacctggtacttcagcaggtgctagagagcaggaacgaggtcctgtgtgtgctgacgcagaagatcatgaccacgcagaagtgcgtgatttctgagcatgtgcagtcggaggagacgtgtggaggcatggtggggatccagaccaagactatacaggtgtcagcaacggaggatgggacggtcaccacggacaccaatgtagtgctggagatccctgctgccaccaccattgcctatggcatcatggagctgtttgtgaaacaagatggccagtttgaattctgcctcctccaagggaaacatggtggcttcgagcatgagaggaaactagactctgtctacttggaccccctggcctacagagagttcgcctttctggacatgctggattag-3’。
再进一步地，所述步骤2)第2.1的a中，pAAV-SS质粒为带有Cre重组酶特异识别的特异位点序列Lop的pAAV-Lop质粒或带有Flp重组酶特异识别的特异位点序列FRT的pAAV-FRT质粒；其中，pAAV-Lop质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，pAAV-FRT质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
再进一步地，所述步骤2)第2.1的b中，GSDM-NT扩增引物为：
GSDMA-NT的引物：
GSDMA-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgaccatgtttgaaaatgtcac-3’；
GSDMA-NT-R：5’-ctagctagctcacccaacatcagatgcctg-3’；
GSDMB-NT的引物：
GSDMB-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgttcagcgtatttgaggaaatc-3’；
GSDMB-NT-R：5’-ctagctagcctaatcttttctcttctcctc-3’；
GSDMC-NT的引物：
GSDMC-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgccctccatgttggaacgc-3’；
GSDMC-NT-R：5’-ctagctagctcacccctcactcctcgcag-3’；
GSDMD-NT的引物：
GSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatggggtcggcctttgagcg-3’；
GSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
GSDME-NT的引物：
GSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-ctagctagctcaatctggcatgtctatg-3’；
mGSDMA3-NT的引物：
mGSDMA3-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgcctgtgtttgaggatgtcac-3’；
mGSDMA3-NT-R：5’-ctagctagctcactccccaatgagcttctc-3’；
mGSDMD-NT的引物：
mGSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgccatcggcctttgagaaag-3’；
mGSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgacaggagactgagc-3’；
mGSDME-NT的引物：
mGSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaactcg-3’；
mGSDME-NT-R：5’-ctagctagcctaatccagcatgtccagaaaggc-3’；
再进一步地，所述步骤2)第2.2的b中，pAAV-SSR质粒为带有Cre重组酶序列的pAAV-Cre质粒或带有Flp重组酶序列的pAAV-Flp质粒；其中，Cre重组酶的核苷酸序列如SEQID NO：11所示，Flp重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明还提供了一种上述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAVs在制备治疗肿瘤的药品中的应用。
进一步地，所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌及宫颈癌。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的组合药剂，由有效量的溶瘤腺相关病毒oAAVs、免疫调节剂和辅料。
进一步地，免疫调节剂为程序性细胞死亡受体1(Programmed cell Death-1,PD-1)分子阻断剂或程序性细胞死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)分子阻断剂或PD-L1抗体或PD-1抗体。
再进一步地，所述免疫调节剂为PD-L1分子阻断剂。
本发明原理：
腺相关病毒是一种已被应用于临床基因治疗的载体，具有很好的安全性。利用位点特异重组酶(site-specific recombinase，SSR)系统，分别包装表达位点特异重组酶(site-specific recombinase，SSR)的腺相关病毒oAAV-SSR，及携带位点特异序列(site-specific，SS)和倒转GSDM-NT序列的腺相关病毒oAAV-SS-GSDM-NT，可以避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白(GSDM-NT)的表达，从而最终获得可用于人类肿瘤治疗的表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs(oAAV-SSR+oAAV-SS-GSDM-NT)。
本发明的有益效果：
本发明利用位点特异重组酶(site-specific recombinase，SSR)系统，分别包装表达位点特异重组酶(site-specific recombinase，SSR)的腺相关病毒oAAV-SSR，及携带位点特异序列(site-specific，SS)和倒转GSDM-NT序列的腺相关病毒oAAV-SS-GSDM-NT，避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白(GSDM-NT)的表达，成功获得了安全，高效，高滴度的溶瘤腺相关病毒oAAVs，该溶瘤腺相关病毒可在细胞水平上高效杀伤宫颈癌Hela细胞、肝癌Hep3B细胞,乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞等肿瘤细胞。该溶瘤腺相关病毒在活体水平上也可以治疗原位大鼠脑胶质瘤模型，和原位小鼠乳腺癌模型。同时且该溶瘤腺相关病毒与PD-L1阻断剂联合能起到很好的溶瘤效果。该溶瘤腺相关病毒安全，高效，可用于肿瘤治疗。
附图说明
图1为pAAV-Lop质粒图谱；
图2为pAAV-Lop-GSDMD-NT质粒图谱；
图3为pAAV-DJ质粒图谱；
图4为pAAV-Helper质粒图谱；
图5为pAAV-Cre质粒图谱；
图6为oAAVs-1感染导致肿瘤细胞发生焦亡；
图7为oAAVs-1感染肿瘤细胞后的细胞死亡率；
图8为oAAVs-1感染肿瘤细胞后的细胞存活率；
图9为oAAVs-1治疗原位胶质瘤大鼠模型：
图中，图9A为实验时间轴，图9B为荧光素活体成像，图9C为荧光素活体成像定量数据，图9D为生存曲线，图9E为脑组织切片H&E染色；
图10为oAAVs-1治疗原位胶质瘤大鼠模型：
图中，图10A为实验时间轴，图10B为每只小鼠肿瘤体积监测数据，图10C为肿瘤平均体积数据，图10D为肿瘤图片，图10E为肿瘤平均重量数据；
图11为治疗肿瘤的组合药剂1(oAAVs-1和PD-L1抑制剂联合)治疗原位乳腺癌小鼠模型：
图中，图11A为实验时间轴，图11B为荧光素活体成像，图11C为荧光素活体成像定量数据；
图12为治疗肿瘤的组合药剂1(oAAVs-1和PD-L1抑制剂联合)治疗原位乳腺癌小鼠模型肿瘤体积数据：
图13为pAAV-FRT质粒图谱；
图14为pAAV-FRT-GSDME-NT质粒图谱；
图15为pAAV-Flp质粒图谱；
图16为oAAVs-2感染肿瘤细胞发生焦亡；
图17为oAAVs-2感染肿瘤细胞后的细胞死亡率；
图18为oAAVs-2感染肿瘤细胞后的细胞存活率；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs-1的包装方法，包括以下步骤：
1.扩增获得GSDMD-NT基因
从人类cDNA文库中扩增获得GSDMD-NT基因核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1所示：
5’-atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggggagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctacgatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgctgtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagattag-3’；
2)包装oAAV-Lop-GSDMD-NT和oAAV-Cre
2.1构建核心质粒pAAV-Lop-GSDMD-NT
a.将pAAV-Lop质粒(图1)用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-Lop；
b.设计扩增引物，
GSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatggggtcggcctttgagcg-3’；
GSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
以焦亡蛋白的基因GSDMD-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDMD-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-Lop连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-Lop-GSDMD-NT(图2)；
2.2三质粒共转染包装oAAV-Lop-GSDM-NT和oAAV-Cre
a.无内毒素提取pAAV-Lop-GSDM-NT，pAAV-DJ(图3)和pAAV-Helper(图4)，将核心质粒pAAV-Lop-GSDM-NT与pAAV-DJ和pAAV-Helper，按照摩尔比1：1：1的比例，用阳离子转染试剂PEI共转染HEK 293T细胞，72小时后收取细胞，按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬HEK 293T细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清，后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV-Lop-GSDM-NT滴度进行测定；
b.利用上述方法，使用核心质粒pAAV-Cre(图5)，辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-Cre，采用荧光定量PCR对oAAV-Cre滴度进行测定；
3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs-1
将oAAV-Lop-GSDMD-NT和oAAV-Cre滴度均调整至2×1012病毒粒子/毫升(vg/ml)后等比例混合获得oAAVs-1，分装后于-80℃保存。
根据实际情况，利用上述方法可以从人类cDNA文库中分别扩增获得GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDME-NT；从小鼠cDNA文库中分别扩增获得mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT、mGSDME-NT(它们的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～3，5～8所示)，任意选用上述一个序列代入上述方法中，包装得到溶瘤腺相关病毒oAAVs-1(oAAV-Cre+oAAV-Lop-GSDM-NT)。
实施例2
上述oAAVs-1在细胞水平上可以杀伤肝癌Hep3B细胞,乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞
使用oAAVs-1分别感染肝癌Hep3B细胞,乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞。72小时后，加入碘化丙啶(Propidium Iodide)和膜联蛋白V-APC(Annexin V-APC)检测oAAVs-1感染导致肿瘤细胞的焦亡情况，结果显示oAAVs-1感染可以导致肝癌Hep3B细胞,乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞发生焦亡(图6)。
另外，在oAAVs-1感染肿瘤细胞72小时后，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测细胞死亡率及存活率，结果显示相对于对照组，oAAVs-1感染组的肿瘤细胞死亡率更高(图7)，存活率更低(图8)。
以上数据说明oAAVs-1在细胞水平具有很好的溶瘤效果。
实施例3
上述oAAVs-1治疗原位脑胶质瘤大鼠模型
利用脑立体定位仪，在180-220g体重的雄性Wirstar大鼠的左侧纹状体内注射1×106个C6-luc细胞，构建原位脑胶质瘤大鼠模型。在瘤接种后第7天，瘤内注射10微升利用脑立体定位仪，在180-220g体重的雄性Wirstar大鼠的左侧纹状体内注射1×106个C6-luc细胞，构建原位脑胶质瘤大鼠模型。在瘤接种后第7天，瘤内注射10微升oAAVs-1(2×1012病毒粒子/毫升)或PBS，随后监测大鼠体重。在瘤接种后第20天进行活体成像，结果显示，与对照组比，溶瘤病毒治疗组肿瘤更小，且存活率高；后期取脑切片发现，实验组肿瘤小，且在第50天时肿瘤完全消失(图9)。说明oAAVs-1可以用于治疗脑胶质瘤。
实施例4
上述oAAVs-1治疗原位乳腺癌小鼠模型
在8周龄的雌性Balb/c小鼠的右侧第四对乳房脂肪垫内注射1×106个4T1-luc细胞，构建原位乳腺癌小鼠模型。在瘤接种后第6天，瘤内注射10微升oAAVs-1，AAV对照或PBS，随后监测肿瘤大小。结果显示(图10)，与对照组相比，oAAVs-1治疗组肿瘤体积显著减小，最终肿瘤重量也更小。说明oAAVs-1可以用于治疗乳腺癌。
实施例5
治疗肿瘤的组合药剂1治疗原位乳腺癌小鼠模型
治疗肿瘤的组合药剂1为oAAVs-1和PD-L1分子阻断剂联合药剂，在8周龄的雌性Balb/c小鼠的右侧第四对乳房脂肪垫内注射1×106个4T1-luc细胞，构建原位乳腺癌小鼠模型。在瘤接种后第6天，瘤内注射10微升oAAVs-1或PBS。在瘤接种后第14天，对PD-L1分子阻断剂单独治疗组，治疗肿瘤的组合药剂1治疗组进行连续7天腹腔注射PD-L1分子阻断剂。每3-4天用游标卡尺记录每只小鼠肿瘤的长度(L)和短(W)直径。根据椭球体积计算公式(即1/2×L×W2)计算每只动物的总肿瘤体积。
在瘤接种后第21天进行活体成像，结果显示(图11)，与其他组比，治疗肿瘤的组合药剂1治疗组肿瘤更小；
肿瘤体积监测结果(图12)表明治疗肿瘤的组合药剂1治疗组肿瘤体积更小，可显著抑制肿瘤生长。说明治疗肿瘤的组合药剂1有很好的肿瘤治疗效果。
实施例6
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs-2的包装方法，包括以下步骤：
1.扩增获得GSDME-NT基因
从人类cDNA文库中扩增获得GSDME-NT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggggagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctacgatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgctgtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagattag-3’；
2)包装oAAV-FRT-GSDME-NT和oAAV-Flp
2.1构建核心质粒pAAV-FRT-GSDME-NT
a.将pAAV-FRT质粒(图13)用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-FRT；
b.设计扩增引物，
GSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-ctagctagctcaatctggcatgtctatg-3’；
以焦亡蛋白的基因GSDME-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDME-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-FRT连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-FRT-GSDME-NT(图14)；
2.2三质粒共转染包装oAAV-FRT-GSDME-NT和oAAV-Flp
a.无内毒素提取pAAV-FRT-GSDME-NT，pAAV-DJ和pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-FRT-GSDME-NT与pAAV-DJ和pAAV-Helper，按照摩尔比1：1：1的比例，用阳离子转染试剂PEI共转染HEK 293T细胞，72小时后收取细胞，按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬HEK293T细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清，后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV-FRT-GSDME-NT滴度进行测定；
b.利用上述方法，使用三质粒pAAV-Flp(图15)，pAAV-DJ和pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-Flp，采用荧光定量PCR对oAAV-Flp滴度进行测定；
3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs-2
将oAAV-FRT-GSDME-NT和oAAV-Flp滴度均调整至2×1012病毒粒子/毫升(vg/ml)后等比例混合获得oAAVs-1，分装后于-80℃保存。
根据实际情况，利用上述方法可以从人类cDNA文库中分别扩增获得GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT；从小鼠cDNA文库中分别扩增获得mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT、mGSDME-NT(它们的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～4，6～8所示)，任意选用上述一个序列代入上述方法中，包装得到溶瘤腺相关病毒oAAVs-2(oAAV-Flp+oAAV-FRT-GSDM-NT)。
实施例7
上述oAAVs-2在细胞水平上可以杀伤宫颈癌Hela细胞
使用oAAVs-2感染宫颈癌Hela细胞。72小时后，加入碘化丙啶(Propidium Iodide)和膜联蛋白V-APC(Annexin V-APC)检测oAAVs-2感染导致肿瘤细胞的焦亡情况，结果显示oAAVs-2感染可以导致宫颈癌Hela细胞(图16)
另外，在oAAVs-2感染肿瘤细胞72小时后，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测细胞死亡率及存活率，结果显示相对于对照组，oAAVs-2感染组的肿瘤细胞死亡率更高(图17)，存活率更低(图18)。
以上数据说明oAAVs-2在细胞水平具有很好的溶瘤效果。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atgaccatgt ttgaaaatgt cacccgggcc ctggccagac agctaaaccc tcgaggggac 60
ctgacaccac ttgacagcct catcgacttc aagcgcttcc atcccttctg cctggtgctg 120
aggaagagga agagcacgct cttctggggg gcccggtacg tccgcaccga ctacacgctg 180
ctggatgtgc ttgagcccgg cagctcacct tcagacccaa cagacactgg gaattttggc 240
tttaagaata tgctggacac ccgagtggag ggagatgtgg atgtaccaaa gacggtgaag 300
gtgaagggaa cggcagggct ctcgcagaac agcactctgg aggtccagac actcagtgtg 360
gctcccaagg ccctggagac cgtgcaggag aggaagctgg cagcagacca cccattcctg 420
aaggagatgc aagatcaagg ggagaacctg tatgtggtga tggaggtggt ggagacggtg 480
caggaggtca cactggagcg agccggcaag gcagaggcct gcttctccct ccccttcttc 540
gccccattgg ggctacaggg atccataaat cacaaggagg ctgtaaccat ccccaagggc 600
tgcgtcctgg cctttcgagt gagacagctg atggtcaaag gcaaagatga gtgggatatt 660
ccacatatct gcaatgataa catgcaaacc ttccctcctg gagaaaagtc aggagaggag 720
aaggtcatcc ttatccaggc atctgatgtt gggtga 756
<210> 2
<211> 828
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
atgttcagcg tatttgagga aatcacaaga attgtagtta aggagatgga tgctggaggg 60
gatatgattg ccgttagaag ccttgttgat gctgatagat tccgctgctt ccatctggtg 120
ggggagaaga gaactttctt tggatgccgg cactacacaa caggcctcac cctgatggac 180
attctggaca cagatgggga caagtggtta gatgaactgg attctgggct ccaaggtcaa 240
aaggctgagt ttcaaattct ggataatgta gactcaacgg gagagttgat agtgagatta 300
cccaaagaaa taacaatttc aggcagtttc cagggcttcc accatcagaa aatcaagata 360
tcggagaacc ggatatccca gcagtatctg gctacccttg aaaacaggaa gctgaagagg 420
gaactaccct tttcattccg atcaattaat acgagagaaa acctgtatct ggtgacagaa 480
actctggaga cggtaaagga ggaaaccctg aaaagcgacc ggcaatataa attttggagc 540
cagatctctc agggccatct cagctataaa cacaagggcc aaagggaagt gaccatcccc 600
ccaaatcggg tcctgagcta tcgagtaaag cagcttgtct tccccaacaa ggagacgatg 660
aatattcatt tcaggggcaa aacaaaatcc tttccagaag agaaggatgg tgcttcatcc 720
tgtttaggaa agtctttggg ttcggaggat tccagaaaca tgaaggagaa gttggaggac 780
atggagagtg tcctcaagga cctgacagag gagaagagaa aagattag 828
<210> 3
<211> 774
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
atgccctcca tgttggaacg cattagcaaa aatttggtca aagagattgg aagcaaagac 60
ctgacacctg tcaaatacct attgagtgcc accaaattac gtcagtttgt tatattacga 120
aagaagaagg attctcgttc atcattttgg gaacaatctg actatgttcc agttgaattc 180
tccctcaatg acatcctgga gccaagttct tcagtcctag aaactgttgt gacaggaccg 240
ttccacttca gtgacattat gatccagaag cataaggctg acatgggtgt gaatgttggt 300
atagaagtga gtgtgtcagg ggaggcctct gtggaccatg gatgctccct cgagtttcaa 360
attgttacca tcccatcacc aaacctggaa gactttcaaa aaaggaaact gttggatcca 420
gagccatcat ttctgaagga gtgccggagg agaggggaca acctgtacgt ggtgacagag 480
gctgttgaac tgatcaacaa tactgtgctg tacgatagca gtagtgtgaa tattttaggg 540
aaaattgctc tttggattac ctatggcaag ggtcaaggcc aaggagagag tctcagagtg 600
aagaagaagg cgctgactct tcagaaaggc atggtgatgg cttataagag aaagcagctg 660
gttatcaagg agaaagccat tctcatctca gatgatgatg aacagagaac ctttcaagat 720
gagtacgaaa tttccgaaat ggtaggctac tgtgctgcga ggagtgaggg gtga 774
<210> 4
<211> 828
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
atggggtcgg cctttgagcg ggtagtccgg agagtggtcc aggagctgga ccatggtggg 60
gagttcatcc ctgtgaccag cctgcagagc tccactggct tccagcccta ctgcctggtg 120
gttaggaagc cctcaagctc atggttctgg aaaccccgtt ataagtgtgt caacctgtct 180
atcaaggaca tcctggagcc ggatgccgcg gaaccagacg tgcagcgtgg caggagcttc 240
cacttctacg atgccatgga tgggcagata cagggcagcg tggagctggc agccccagga 300
caggcaaaga tcgcaggcgg ggccgctgtg tctgacagct ccagcacctc aatgaatgtg 360
tactcgctga gtgtggaccc taacacctgg cagactctgc tccatgagag gcacctgcgg 420
cagccagaac acaaagtcct gcagcagctg cgcagccgcg gggacaacgt gtacgtggtg 480
actgaggtgc tgcagacaca gaaggaggtg gaagtcacgc gcacccacaa gcgggagggc 540
tcgggccggt tttccctgcc cggagccacg tgcttgcagg gtgagggcca gggccatctg 600
agccagaaga agacggtcac catcccctca ggcagcaccc tcgcattccg ggtggcccag 660
ctggttattg actctgactt ggacgtcctt ctcttcccgg ataagaagca gaggaccttc 720
cagccacccg cgacaggcca caagcgttcc acgagcgaag gcgcctggcc acagctgccc 780
tctggcctct ccatgatgag gtgcctccac aacttcctga cagattag 828
<210> 5
<211> 813
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
atgtttgcca aagcaaccag gaattttctt agagaagttg atgctgatgg tgacctgatt 60
gcagtatcaa atctgaatga ctctgataag ttacagcttc taagtctggt gacaaaaaag 120
aagagattct ggtgctggca gagacccaag taccagtttt tatccctcac ccttggcgat 180
gtactcatag aagaccaatt tccgagtcca gtggtcgtgg agtcggactt tgtgaaatac 240
gagggcaagt ttgcaaacca cgtgagtgga accctggaga ctgcactggg gaaggtcaag 300
ctgaacctgg ggggcagcag ccgcgtagag agccagtctt catttggaac cctgaggaag 360
caggaggtgg atttgcagca gctcatcaga gactctgccg agagaacaat aaatctgaga 420
aaccctgtgc tccagcaggt gctggaagga aggaatgagg tcctgtgcgt tttgacacag 480
aagatcacga cgatgcagaa gtgtgtgatc tctgagcaca tgcaggtcga ggagaagtgt 540
ggtggcatcg tgggcatcca gaccaagacg gtgcaggtgt cagcgacgga ggatgggaat 600
gtcaccaagg actccaacgt ggtgctggag atcccagctg ccaccaccat tgcctacggt 660
gtcattgagt tatacgtgaa actggacggc cagttcgagt tctgccttct ccgagggaag 720
caaggtggct tcgagaacaa gaagagaatt gactctgtct acctggaccc cctggtcttt 780
cgagagtttg cattcataga catgccagat tga 813
<210> 6
<211> 789
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
atgcctgtgt ttgaggatgt cacccgggcc ctggttagag agctgaaccc tcgaggggat 60
ctgacacccc tagacagcct catcgacttc aaacactttc gtcccttctg cctggtgctg 120
aggaagagga agagcacatt gttctgggga gcccgctatg tgcgcaccga ctacactctc 180
ctggatttgc tggagccggg cagctccccc tcagatctga cagacagtgg caactttagc 240
tttaagaata tgctggatgt ccaagtacag ggacttgtgg aagtgccaaa gacagtgaag 300
gtaaagggga ctgcgggtct gtcacaaagc agcacactgg aggtgcagac actcagcgtg 360
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<211> 831
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
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cttgctgcgc tttgttccat cggaaagcag ctcagtctcc tgtcagatta g 831
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<211> 813
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
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<212> DNA
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ttttgctggc cttttgctca catgt 5605
<210> 10
<211> 5605
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 10
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gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 3720
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gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 3840
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caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 3960
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gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 4320
gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 4380
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ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 4740
agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 4800
tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 4860
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ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 5340
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 5400
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<210> 11
<211> 1032
<212> DNA
<213> 噬菌体P1(Enterobacteria phageP1)
<400> 11
atggccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60
gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120
acctggaaga tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180
cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240
cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300
cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360
cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480
ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540
agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600
aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 660
gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacct cccagctatc aactcgcgcc 780
ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 900
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 960
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 1020
gatggcgatt aa 1032
<210> 12
<211> 1296
<212> DNA
<213> 酵母(Saccharomyces)
<400> 12
gctcccaaga agaagaggaa ggtgatgagt caatttgata tattatgtaa aacaccacct 60
aaggtcctgg ttcgtcagtt tgtggaaagg tttgaaagac cttcagggga aaaaatagca 120
tcatgtgctg ctgaactaac ctatttatgt tggatgatta ctcataacgg aacagcaatc 180
aagagagcca cattcatgag ctataatact atcataagca attcgctgag tttcgatatt 240
gtcaacaaat cactccagtt taaatacaag acgcaaaaag caacaattct ggaagcctca 300
ttaaagaaat taattcctgc ttgggaattt acaattattc cttacaatgg acaaaaacat 360
caatctgata tcactgatat tgtaagtagt ttgcaattac agttcgaatc atcggaagaa 420
gcagataagg gaaatagcca cagtaaaaaa atgcttaaag cacttctaag tgagggtgaa 480
agcatctggg agatcactga gaaaatacta aattcgtttg agtatacctc gagatttaca 540
aaaacaaaaa ctttatacca attcctcttc ctagctactt tcatcaattg tggaagattc 600
agcgatatta agaacgttga tccgaaatca tttaaattag tccaaaataa gtatctggga 660
gtaataatcc agtgtttagt gacagagaca aagacaagcg ttagtaggca catatacttc 720
tttagcgcaa ggggtaggat cgatccactt gtatatttgg atgaattttt gaggaattct 780
gaaccagtcc taaaacgagt aaataggacc ggcaattctt caagcaacaa acaggaatac 840
caattattaa aagataactt agtcagatcg tacaacaagg ctttgaagaa aaatgcgcct 900
tatccaatct ttgctataaa gaatggccca aaatctcaca ttggaagaca tttgatgacc 960
tcatttctgt caatgaaggg cctaacggag ttgactaatg ttgtgggaaa ttggagcgat 1020
aagcgtgctt ctgccgtggc caggacaacg tatactcatc agataacagc aatacctgat 1080
cactacttcg cactagtttc tcggtactat gcatatgatc caatatcaaa ggaaatgata 1140
gcattgaagg atgagactaa tccaattgag gagtggcagc atatagaaca gctaaagggt 1200
agtgctgaag gaagcatacg ataccccgca tggaatggga taatatcaca ggaggtacta 1260
gactaccttt catcctacat aaatagacgc atataa 1296

Claims (10)

1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)扩增获得焦亡蛋白基因
从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为人类焦亡蛋白基因或小鼠焦亡蛋白基因；
2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
2.1构建核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT
a.将pAAV-SS质粒用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；
b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；
2.2三质粒共转染包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR
a.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染HEK 293T细胞；重悬HEK 293T细胞后，反复冻融和离心，收集含重组腺相关病毒上清；然后经孵育、纯化和浓缩；得到oAAV-SS-GSDM-NT；
b.利用上述方法，使用质粒pAAV-SSR、质粒pAAV-DJ和质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR；
3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs
将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。
2.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤1)中，人类焦亡蛋白基因选自GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～5所示；
小鼠焦亡蛋白基因选自mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQID NO：6～8所示。
3.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤2)第2.1的a中，pAAV-SS质粒为带有Cre重组酶特异识别的特异位点序列Lop的pAAV-Lop质粒或带有Flp重组酶特异识别的特异位点序列FRT的pAAV-FRT质粒；其中，pAAV-Lop质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，pAAV-FRT质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示。
4.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤2)第2.1的b中，GSDM-NT扩增引物为：
GSDMA-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgaccatgtttgaaaatgtcac-3’；
GSDMA-NT-R：5’-ctagctagctcacccaacatcagatgcctg-3’；
GSDMB-NT的引物：
GSDMB-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgttcagcgtatttgaggaaatc-3’；
GSDMB-NT-R：5’-ctagctagcctaatcttttctcttctcctc-3’；
GSDMC-NT的引物：
GSDMC-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgccctccatgttggaacgc-3’；
GSDMC-NT-R：5’-ctagctagctcacccctcactcctcgcag-3’；
GSDMD-NT的引物：
GSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatggggtcggcctttgagcg-3’；
GSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
GSDME-NT的引物：
GSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-ctagctagctcaatctggcatgtctatg-3’；
mGSDMA3-NT的引物：
mGSDMA3-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgcctgtgtttgaggatgtcac-3’；
mGSDMA3-NT-R：5’-ctagctagctcactccccaatgagcttctc-3’；
mGSDMD-NT的引物：
mGSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgccatcggcctttgagaaag-3’；
mGSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgacaggagactgagc-3’；
mGSDME-NT的引物：
mGSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaactcg-3’；
mGSDME-NT-R：5’-ctagctagcctaatccagcatgtccagaaaggc-3’。
5.根据权利要求1所述构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法，其特征在于：所述步骤2)第2.2的b中，pAAV-SSR质粒为带有Cre重组酶序列的pAAV-Cre质粒或带有Flp重组酶序列的pAAV-Flp质粒；其中，Cre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，Flp重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
6.一种权利要求1所述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAVs在制备治疗肿瘤的药品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌及宫颈癌。
8.一种治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：由有效量的溶瘤腺相关病毒oAAVs、免疫调节剂和辅料。
9.根据权利要求8所述的用于治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：免疫调节剂为程序性细胞死亡受体1分子阻断剂或程序性细胞死亡配体1分子阻断剂或PD-L1抗体或PD-1抗体。
10.根据权利要求8所述用于治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：所述免疫调节剂为PD-L1分子阻断剂。
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