CN110331166A - Cre和flp双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用 - Google Patents

Cre和flp双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用，将改造后的基因片段H2B‑EGFP‑2a‑TVA和改造后的基因RVG酶切后，分别与酶切后的病毒载体连接，该辅助载体只有在CRE和FLP重组酶同时存在的细胞中才能正常表达，并辅助ENVA外膜包裹的缺陷型重组狂犬病毒特异性识别感染和逆向跨突触标记特定脑区的上游神经网络，可以实现特定类型神经元的逆行跨突触标记。该方法在解析特定脑区交集神经元类群或投射到特定区域的特定类型神经元的上游输入、环路功能研究、神经元稀疏标记或稀疏跨单突触等方面具有广泛的应用价值和前景。

Description

CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用。
背景技术
解析大脑神经网络连接，是理解大脑工作机制及脑疾病网络变异机制的基础。传统的神经网络示踪方法，少数蛋白质类示踪剂，如WGA、HRP等，能初步实现大脑核团间的投射关系，但这些示踪方法具有信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等问题。上述传统示踪方法促进了人们对大脑神经网络结构的认识，但难以用于研究由多个脑区、多种类型神经元通过突触连接形成的复杂神经网络。利用改造的嗜神经工具病毒，跨突触追踪大脑的神经网络，是目前最有效的标记结构神经网络的技术之一。嗜神经病毒是一类能感染神经细胞，且能沿神经环路传播增殖的病毒。利用嗜神经病毒作为示踪工具，与传统的示踪剂相比有如下特点：(1)可以跨突触传播；(2)跨突触方向可控，可特异顺行或逆行传播；(3)病毒跨突触后可复制，信号不衰减；(4)可携带多种标示物。上述特性使其在示踪大脑神经网络结构的研究中显示出独特优势。
改造的狂犬工具病毒(RV)能实现严谨的跨单突触标记，可精确解析神经回路，在近几年广泛应用于神经科学研究，成为神经结构回路解析的工具之一，Wickersham等在2007报道了基于RV疫苗株SAD-B19感染性克隆构建的重组狂犬病毒，其G蛋白基因被敲除，并携带GFP、mCherry等荧光蛋白基因，可使外源蛋白在神经元中高丰度表达，从而清晰地标记神经元的精细形态。他们建立了RV的ENVA-TVA系统，利用CRE重组酶控制的分别表达TVA和RVG的AAV载体作为辅助病毒实现了RV特异逆行跨突触标记，并已被多个实验室使用。然而，此种方法只受单一重组酶控制，应用范围比较有限，而大脑中还存在两种及两种以上特定类型神经元同时存在的交集神经元类群，现有技术无法实现这类交集神经元的特异性标记及其上游输入网络的研究，而多个重组酶级联控制辅助病毒的表达具有更多的选择性，可结合重组狂犬病毒实现多种特异类型神经元的逆向跨突触标记。因此，发展用于特异性类型神经元逆行跨单突触的多个重组酶同时控制表达的辅助病毒载体具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用，克服了单一重组酶控制的逆行跨单突触系统只能研究某一特定类型神经元的上游输入网络的应用范围限制，通过CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触系统解决了两种及两种以上特定类型神经元同时存在的交集神经元类群的逆向跨突触标记。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体，其构建方法为：
(1)将改造后的基因片段H2B-EGFP-2a-TVA(SEQ ID NO.1)和改造后的基因RVG(SEQ ID NO.2)酶切后，分别与酶切后的病毒载体连接；
在本发明的具体实施中，改造后的基因片段H2B-EGFP-2a-TVA(SEQ ID NO.1)用AscI和XbaI双酶切，与经AscI和XbaI双酶切pAAV-nEF Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP载体进行连接；改造后的片段RVG(SEQ ID NO.2)用AscI和SacI双酶切，与AscI和SacI双酶切的pAAV-hSyn Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA载体进行连接反应，转化StbI3感受态进行菌落PCR鉴定；
(2)上述辅助病毒采用传统的三质粒包装方法，并用碘克沙醇梯度离心法进行纯化。
进一步地，辅助载体构建方法中选用的病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、腺病毒载体、伪狂犬病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其扩增子载体。
进一步地，上述病毒载体的启动子包括广谱启动子如CAG、CMV、CBA、EF1α、hUbC、PGK，可控制辅助病毒中外源基因在神经元中的表达强度，从而实现特定类型神经元更高效的标记和逆行跨突触；诱导型启动子如TRE3G，可通过四环素药物在时间上控制辅助病毒的表达，从而可在某一时间段对环路进行研究；活动依赖的启动子如C-fos、E-SARE，可实现响应某种刺激或行为活动的神经元类群的环路解析；神经细胞特异性启动子如CaMKIIα、mDlX、TH，可实现两种以上的交集神经元类群的上游输入网络的解析。
CRE和FLP双重组酶级联控制的辅助载体用于特异性类型神经元逆行跨单突触标记的方法，包括以下步骤：
(1)按照上述方法构建的2个辅助载体分别包装成病毒，按照病毒颗粒数1:1混合，将混合后的病毒立体定位注射到所要研究的脑区，该脑区同时表达CRE和FLP重组酶；
(2)待辅助病毒表达2周后，在同一位置注射重组狂犬病毒，1周后取材、切片成像。
所述的重组狂犬病毒包括但不限于SAD-B19株、CVS-N2C株、CVS-B2C株、Pasteur株、自失活SiRV变种。
本发明所述的特异性类型神经元包括GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、长程投射神经元、多巴胺能神经元以及这些神经元两个或两个以上并存的交集神经元。
本发明提供了一种CRE和FLP双重组酶级联控制的辅助逆行跨单突触标记大脑神经网络结构的病毒载体，其只能在Cre和Flp同时控制下才能实现分别介导重组狂犬病毒感染和逆向跨单突触的TVA受体和RVG的表达，便于多种特异类型神经元的研究。该重组病毒载体为脑科学问题的研究提供了全新的辅助工具与技术方案，填补了该领域的空白:
1、本发明解决了单一重组酶控制的逆行跨单突触系统只能研究某一特定类型神经元的上游输入网络的应用范围限制，因为大脑中还存在两种及两种以上特定类型神经元同时存在的交集神经元类群，现有技术无法实现这类交集神经元的特异性标记及其上游输入网络的研究，而多个重组酶级联控制辅助病毒的表达具有更多的选择性，可结合重组狂犬病毒实现多种特异类型神经元的逆向跨突触标记。
2、本发明可进一步结合其他类型神经细胞特异性启动子，用于两种及两种以上特定类型神经元同时存在的交集神经元类群的特异性标记及其上游输入网络的研究；
3、本发明还可以结合其他弱毒或减毒的重组狂犬病毒用于结构网络与功能网络的解析。
4、本发明在解析特定脑区交集神经元类群或投射到特定区域的特定类型神经元的上游输入、环路功能研究、神经元稀疏标记或稀疏跨单突触等方面具有广泛的应用价值和前景。
附图说明
图1：CRE和FLP双重组酶级联控制的表达TVA和RVG的AAV载体构建和工作原理示意图。A：CRE和FLP双重组酶级联控制的表达TVA的AAV载体构建和工作原理示意图，构建载体时将目的基因H2B-GFP-2a-TVA分成三部分，其中中间部分正向放置，受cre控制翻转，两端序列倒置，受flp控制翻转；B：CRE和FLP双重组酶级联控制的表达RVG的AAV载体构建和工作原理示意图，构建载体时将目的基因RVG分成三部分，其中中间部分正向放置，受cre控制翻转，两端序列倒置，受flp控制翻转；C：交集神经元示意图，Cre+和flp+代表两种不同的神经元类群，Cre+flp+代表这两种不同类型神经元的交集，未标识的为其他类型神经元。括号中的“N”代表序列氮端；括号中的“C”代表序列碳端；括号中的“M”代表序列中间部分。
图2：CRE和FLP双重组酶级联控制表达的携带核定位绿色荧光的TVA载体的细胞验证示意图。A：pAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA质粒单独转染BHK-21细胞，未观察到荧光信号，表明TVA没有表达，系统严谨；B：pAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA质粒与pCAG-CRE质粒共转染BHK-21细胞，未观察到荧光信号，表明TVA没有表达，系统严谨；C：pAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA质粒与pCAG-Flp质粒共转染BHK-21细胞，未观察到荧光信号，表明TVA没有表达，系统严谨；D：pAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA质粒与pCAG-CRE、pCAG-Flp质粒共转染BHK-21细胞，观察到明显的绿色荧光信号，表明TVA只在CRE和FLP双重组酶级联控制下表达。
图3：CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触系统的活体测试示意图。A图为注射位点(腹侧海马)，a′图为DAPI对细胞核进行染色；a″图绿色表明携带TVA的AAV辅助病毒表达，a″′图红色是ENVA-RV-△G-dsred感染效果，a″″图是两个病毒之间的共标效果，黄色为起始共标细胞，表明TVA介导ENVA-RV-△G-dsred病毒高效感染。B图、C图、D图为逆行跨单突触的脑区，表明CRE和FLP双重组酶级联控制的分别携带TVA和RVG的AAV辅助病毒与ENVA-RV-△G-dsred组合系统可实现特定类型神经元的逆行跨单突触标记。CA3表示海马CA3区域；LEnt表示外侧内嗅皮层；MS表示中间隔阂。标尺：A/B/C/D图为1mm；a′/a″/a″′/a″″/b/c/d图为50μm。
具体实施方式
实施例
一、CRE和FLP双重组酶级联控制的表达TVA和RVG的AAV载体构建与病毒包装
1.CRE和FLP双重组酶级联控制的表达TVA和RVG的AAV载体构建
利用布尔逻辑原理(Fenno LE et al,Nat Methods.2014Jul；11(7):763-72.)对AAV-DIO-H2B-EGFP-2a-TVA(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)上的H2B-EGFP-2a-TVA和AAV-DIO-RVG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)上的RVG基因进行改造合成，改造后的片段H2B-EGFP-2a-TVA(SEQ ID NO.1)用AscI和XbaI双酶切，与经AscI和XbaI双酶切pAAV-nEFCon/Fon hChR2(H134R)-EYFP(addgene编号：55644)载体进行连接；改造后的片段RVG(SEQID NO.2)用AscI和SacI双酶切，与AscI和SacI双酶切的pAAV-hSyn Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA(addgene编号：55645)载体进行连接反应，转化StbI3感受态进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆置于LB培养基，30℃过夜培养，提取质粒进行酶切验证和测序，阳性克隆载体分别命名为rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA和rAAV-hSyn-Con/Fon-RVG-WPRE-pA，同时对带荧光载体进行细胞转染验证。本发明所有PCR使用引物、基因合成、测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2.CRE和FLP双重组酶级联控制的TVA和RVG表达载体的病毒制备
AAV辅助病毒采用传统的三质粒包装方法，并用碘克沙醇梯度离心法进行纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pArAAV-hSyn-Con/Fon-RVG-WPRE-pA病毒的滴度分别为3.47×1012vg/mL和5.4×1012vg/mL。
二、ENVA包裹的缺陷型狂犬病毒RV-△G-dsred的制备
首先利用B7GG细胞系扩增RV-△G-dsred病毒(SAD-B19株)(Osakada et alNeuron.2011Aug 25；71(4):617-31)(来自addgene，编号32638)，然后按感染复数moi＝3感染BHK-ENVA细胞系，6小时后用DMEM洗涤两次，更换新鲜培养基(DMEM+5％FBS+1％双抗)置于35℃，3％CO2培养箱中继续培养36-48小时，消化细胞，按1:5传代于T75细胞培养瓶，每瓶加10-15mL新鲜的培养基(DMEM+5％FBS+1％双抗)，置于35℃，3％CO2培养箱中继续培养48-72小时，收集上清，在4℃，6000×g下离心10min，弃沉淀，将上清用0.22μm的滤膜过滤。将收集到的滤液在4℃，50000×g，离心2.5h，倒掉上清液，倒扣纸上，然后第一次加入700μL的PBS于离心管中，清洗管壁上沉淀到溶液中，第二次加入700μL的PBS于离心管中，清洗管壁残余沉淀到溶液中，最后合并到一个离心管中，吸取冰预冷的700μL 20％的蔗糖加入1.5mL离心管中，在上层加入700μL混匀的病毒液，4℃，50000×g，离心2.5h，吸去上清，将80-150μLPBS加入离心管，盖紧盖子，将离心管插入冰盒，在4℃冰箱溶解2小时，再用枪轻柔重悬沉淀。将重悬病毒液重新离心，6000×g，3min。离心后，将上清分装至平盖PCR管，每管3μL，保存于-80度冰箱。用梯度稀释法对浓缩病毒滴度进行测定，测定细胞为293T-TVA800细胞(Fumitaka Osakada and Edward M.Callaway Nat Protoc.2013August；8(8):1583–1601.)。浓缩纯化的RV病毒滴度为2×108IU/mL。
三、CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触系统的活体测试
将rAAV-Ef1α-DIO-FLP-WPRE-pA(购自武汉枢密脑科学技术有限公司，滴度为2.0×1012vg/mL)、rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA、rAAV-hSyn-Con/Fon-RVG-WPRE-pA病毒按照病毒颗粒数1:1:1混合，取0.2μL混合后的病毒立体定位注射到Thy1-CRE转基因小鼠(The Jackson Laboratory)腹侧海马DG区域，14天后在同一位置注射0.1μlRV-dG-DsRed-ENVA病毒。注射RV病毒7天后麻醉动物，用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛继续灌流以固定鼠脑，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。在注射位点可观察到辅助病毒rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA表达的绿色荧光信号，同时在注射位点观察到红色荧光信号，表示rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA中TVA表达，RV-dG-DsRed-ENVA能够感染表达TVA的神经元。在注射位点以外的脑区，可观察到清楚的红色荧光信号，表示rAAV-hSyn-Con/Fon-RVG-WPRE-pA中RVG大量表达，使得RV-dG-DsRed-ENVA能够逆行跨单突触传播。结果表明辅助病毒rAAV-nEF-Con/Fon H2B-EGFP-2a-TVA-WPRE-pA和rAAV-hSyn-Con/Fon-RVG-WPRE-pA可以辅助重组狂犬病毒SAD-B19株实现特异性神经元(Thy1代表投射神经元类型)上游输入网络的解析。该方法还可以用于其他特异类型神经元的解析，同时可结合其他弱毒或减毒的重组狂犬病毒用于结构网络与功能网络的解析。
序列表
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgcgcctc aggagaacaa gtctgcctgg ctcttgtcag gcaccagcag ctccttggat 60
gcgctttcaa gactgaagat gtcagacctg ctttttgctt tggacttccc ccatgcagcg 120
ataccaccca cagctaccag gcagcacagg agcactgcag tgatcagcat ccacatgcgg 180
ccgtgattcc tggctggcag agcacgtcca ggagcagggg cagtgggagc ctctgtgccg 240
ttgtccgtgg gcaccgcggg gatcgcgctg gtcccgcagc cccactcgtc ccgcccgtcg 300
tcgcagtcgg ggtgtccgtc gcacagctgt gggacgacat gacttaacca gttaaccatg 360
ttctctgaac atgagaaggg ctggccactc tccagtcgac ataacttcgt ataggatact 420
ttatacgaag ttatgcagaa tggtagctgg attgtagctg ctattagcaa tatgaaacct 480
cttaataact tcgtatagta taccttatac gaagttatac tagttgtgcc cccccttttt 540
tttataaaat tgtattaatg ttatatacat atctcctgta tgtgacccat gtgcttatga 600
ctctatttct catgtgttta ggacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 660
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 720
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 780
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 840
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 900
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 960
gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 1020
ctgtacaagg gtagtggtgt gaaacagact ttgaattttg accttctcaa gttggcggga 1080
gacgtggagt ccaacccagg gcccatggcg cggctgctgc ccgcgctgct gctgctgctg 1140
ctgcccggta acgtgaccgg taacgggtcc ggtaacggtt ctttgtcccg ttgccccccc 1200
ggtcagttcc gctgctcgga gccgcccggt gcccacgggg agtgttaccc gcaggactgg 1260
gtgagtacag gaggggtacc ataacttcgt ataaagtatc ctatacgaag ttatttgcct 1320
taacccagaa attatcactg ttattcttta gaatggtgca aagaataact tcgtataagg 1380
tatactatac gaagttatgc tagcaacccc gacacgtacg tccttgaaga agatggtgcg 1440
ctcctggacg tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc 1500
ggggtagcgg ctgaagcact gcacgccgta ggtcagggtg gtcacgaggg tgggccaggg 1560
cacgggcagc ttgccggtgg tgcagatgaa cttcagggtc agcttgccgt aggtggcatc 1620
gccctcgccc tcgccggaca cgctgaactt gtggccgttt acgtcgccgt ccagctcgac 1680
caggatgggc accaccccgg tgaacagctc ctcgcccttg ctcaccatgg tggcgaccgg 1740
tggatcctta gcgctggtgt acttggtgat ggccttagta ccctcggaca cggcgtgctt 1800
ggccaactcc ccaggcagca gcaggcgcac ggccgtctgg atctccctgg aggtgatggt 1860
cgagcgcttg ttgtaatgcg ccaggcggga agcctcacct gcgatgcgct cgaaaatgtc 1920
gttcacaaac gaattcatga tgcccatggc cttggacgaa atgccggtgt cagggtggac 1980
ctgcttcaga accttgtaca catagatgga atagctctcc ttgcggctgc gcttgcgctt 2040
cttgccgcct ttcttctgcg ccttagtcac cgccttcttg gagccctttt tcggggcggg 2100
agcagacttc gctggctctg gcattctaga 2130
<210> 2
<211> 2049
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcgcgcctc acagtctggt ctcgccgccg ctcttgtggc tctcccagct gctgatgatc 60
ttgccgctct ggggggtcac gctcacctct ctgccggtgc ctctcaggtt gtgctgggtg 120
ggttcgcttc tgttcactct tctgcagcag gtcatcagga agatgatcag catcagggcg 180
gtcagggcgc cggcgctcag cagcacgtac ttgccccagt tgggcaggcc caggtccacg 240
ccgctcacct ggttgtgcac gtcgggcagg tgcacctcca cgaagtcctc ggcctcgtcg 300
ccgtccttga acacggtgct ggggtcggcc agggggtgca ccagggggat cacgctgctc 360
tccagcagct ccatgtgctg ctgcagcagg ctgctctgca tctcggggat cagcacgttg 420
ccgtcggggc ccaggatgat gccgttgaag aacacgccgt tcacgtgggg gtggcatctg 480
ccgcccactc tcaggcagcc tgtgggacga catgacttaa ccagttaacc atgttctctg 540
aacatgagaa gggctggcca ctctccagtc gacataactt cgtataggat actttatacg 600
aagttatgca gaatggtagc tggattgtag ctgctattag caatatgaaa cctcttaata 660
acttcgtata gtatacctta tacgaagtta tactagttgt gccccccctt ttttttataa 720
aattgtatta atgttatata catatctcct gtatgtgacc catgtgctta tgactctatt 780
tctcatgtgt ttaggcagca agtgcagcgg cgtggccgtg agcagcacct actgcagcac 840
caaccacgac tacaccatct ggatgcccga gaaccccaga ctgggcatga gctgcgacat 900
cttcaccaac agcagaggca agagagccag caagggcagc gagacctgcg gcttcgtgga 960
cgagagaggc ctatacaaga gcctgaaggg cgcctgcaag ctgaagctgt gcggcgtgct 1020
gggcctgaga ctgatggacg gcacctgggt gagcatgcag accagcaacg agaccaagtg 1080
gtgccccccc gacaagctgg tgaacctgca cgacttcaga agcgacgaga tcgagcacct 1140
ggtggtggag gagctggtga gaaagagaga ggagtgcctg gacgccctgg agagcatcat 1200
gaccaccaag agcgtgagct tcagaagact gagccacctg agaaagctgg tgcccggctt 1260
cggcaaggcc tacaccatct tcaacaagac cctgatggag gccgacgccc actacaagag 1320
cgtgagaacc tggaacgaga tcctgcccag caagggtgag tacaggaggg gtaccataac 1380
ttcgtataaa gtatcctata cgaagttatt tgccttaacc cagaaattat cactgttatt 1440
ctttagaatg gtgcaaagaa taacttcgta taaggtatac tatacgaagt tatgctagca 1500
accccgacac ttactgggga acactctgct gtgcaggctt ctgtcgtagg ggtccaggtc 1560
ggccacgctg gggctgatga tcaccaggct ctccttggtg gtcttcacgg ttctcagcca 1620
tctgtagtcg gggtaggggt tgtgcaggct ctcctcgtat ctggggtcgc cggccatctt 1680
ccagttgtag gcggctctgc aggcgtcggg ggtgggtctg aagtgctttc tcttgaaggt 1740
ggtggtcacg tagcccacga agttggtgta ggtctcggcc tcggtcacca cgccggtgca 1800
ggtgaagccg ttcaccttga tggccaggat gtagcccacc ttcagctcca tgtagctgaa 1860
gccgctcagg ttggtgcagc cctcgtcctc caccaccagg ttgttggggc agctcaggtg 1920
gtggatgtcg atggggctcc aggggcccag cttgtcgggg atggtgtaga tggggaactt 1980
gccgaagcac agggggaaca ccagcagggg cacgaacagc agggcctggg gcaccatggt 2040
ggcgagctc 2049

Claims (5)

1.CRE和FLP双重组酶级联控制的逆行跨单突触的辅助载体，其特征在于，将改造后的基因片段H2B-EGFP-2a-TVA和RVG基因分别构建至病毒载体，改造后的H2B-EGFP-2a-TVA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，改造后的RVG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的辅助载体，其特征在于，所述的病毒载体包括腺相关病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、腺病毒载体、伪狂犬病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其扩增子载体。
3.根据权利要求1所述的辅助载体，其特征在于，所述病毒载体的启动子包括广谱启动子CAG、CMV、CBA、EF1α、hUbC、PGK，诱导型启动子TRE3G，活动依赖的启动子C-fos、E-SARE，神经细胞特异性启动子CaMKIIα、mDlX、TH。
4.权利要求1至3中任一项所述的辅助载体用于特异性类型神经元逆行跨单突触标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将辅助载体分别包装成病毒，按照病毒颗粒数1:1混合，将混合后的病毒立体定位注射到所要研究的脑区，该脑区同时表达CRE和FLP重组酶；
(2)待辅助病毒表达2周后，在同一位置注射重组狂犬病毒，1周后取材、切片成像。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的重组狂犬病毒包括SAD-B19株、CVS-N2C株、CVS-B2C株、Pasteur株、自失活SiRV变种。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592900A (zh) * 2020-12-15 2021-04-02 华中农业大学 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用
CN114085872A (zh) * 2021-11-10 2022-02-25 中国科学院深圳先进技术研究院 一种表达tva的小鼠模型的构建方法和应用
CN114107231A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
CN114196636A (zh) * 2021-12-09 2022-03-18 中国科学院深圳先进技术研究院 腺相关病毒载体在逆向标记外周组织或器官一级神经网络中的应用
CN114196692A (zh) * 2021-11-08 2022-03-18 中国科学院深圳先进技术研究院 腺相关病毒表达载体及其构建、病毒制备、细胞标记方法
WO2024108594A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 深圳先进技术研究院 可视化肿瘤细胞系及其构建和应用、肿瘤-神经系统互作神经网络的解析方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1118670A1 (en) * 1999-12-07 2001-07-25 Genethon III Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells
US20030054340A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-20 Friedman Jeffrey M. Neural tracing with a conditional herpesvirus and methods and uses thereof
JP2009034029A (ja) * 2007-08-01 2009-02-19 Japan Science & Technology Agency 逆行性輸送能を有するウィルスベクター系
CN107699589A (zh) * 2017-05-22 2018-02-16 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用
CN108359640A (zh) * 2018-01-31 2018-08-03 武汉枢密脑科学技术有限公司 一种标记全脑区神经网络结构的狂犬病毒、其制备和应用
CN109266682A (zh) * 2018-09-29 2019-01-25 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
CN110004118A (zh) * 2019-03-29 2019-07-12 中国科学院武汉物理与数学研究所 用于辅助重组狂犬病毒在神经细胞高效逆向跨单级突触的rAAV病毒的包装方法及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1118670A1 (en) * 1999-12-07 2001-07-25 Genethon III Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells
US20030054340A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-20 Friedman Jeffrey M. Neural tracing with a conditional herpesvirus and methods and uses thereof
JP2009034029A (ja) * 2007-08-01 2009-02-19 Japan Science & Technology Agency 逆行性輸送能を有するウィルスベクター系
CN107699589A (zh) * 2017-05-22 2018-02-16 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用
CN108359640A (zh) * 2018-01-31 2018-08-03 武汉枢密脑科学技术有限公司 一种标记全脑区神经网络结构的狂犬病毒、其制备和应用
CN109266682A (zh) * 2018-09-29 2019-01-25 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用
CN110004118A (zh) * 2019-03-29 2019-07-12 中国科学院武汉物理与数学研究所 用于辅助重组狂犬病毒在神经细胞高效逆向跨单级突触的rAAV病毒的包装方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GINGER 等，: "Revealing the secrets of neuronal circuits with recombinant rabies virus technology", 《FRONTIERS IN NEURAL CIRCUITS》 *
JIAMIN LI 等，: "Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses", 《NEUROSCI. BULL.》 *
NCBI: "MK317918.1", 《GENBANK》 *
SCHIERBERL, K.C. 等，: "Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 *
张志建 等，: "利用嗜神经病毒跨突触追踪神经网络研究进展", 《生命科学》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592900A (zh) * 2020-12-15 2021-04-02 华中农业大学 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的包装方法及其应用
CN114196692A (zh) * 2021-11-08 2022-03-18 中国科学院深圳先进技术研究院 腺相关病毒表达载体及其构建、病毒制备、细胞标记方法
WO2023077621A1 (zh) * 2021-11-08 2023-05-11 中国科学院深圳先进技术研究院 腺相关病毒表达载体及其构建、病毒制备、细胞标记方法
CN114085872A (zh) * 2021-11-10 2022-02-25 中国科学院深圳先进技术研究院 一种表达tva的小鼠模型的构建方法和应用
WO2023082403A1 (zh) * 2021-11-10 2023-05-19 中国科学院深圳先进技术研究院 一种表达tva的小鼠模型的构建方法和应用
CN114196636A (zh) * 2021-12-09 2022-03-18 中国科学院深圳先进技术研究院 腺相关病毒载体在逆向标记外周组织或器官一级神经网络中的应用
CN114107231A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
CN114107231B (zh) * 2021-12-13 2023-08-18 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
WO2024108594A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 深圳先进技术研究院 可视化肿瘤细胞系及其构建和应用、肿瘤-神经系统互作神经网络的解析方法

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