KR20110053446A - ｉＰＳ 세포의 생산 방법 - Google Patents

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KR20110053446A KR1020117005571A KR20117005571A KR20110053446A KR 20110053446 A KR20110053446 A KR 20110053446A KR 1020117005571 A KR1020117005571 A KR 1020117005571A KR 20117005571 A KR20117005571 A KR 20117005571A KR 20110053446 A KR20110053446 A KR 20110053446A
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Abstract

만능 줄기 세포를 유도하는 방법 및 조성물을 개시한다. 예를 들어, 특정 관점에서 리포터 유전자를 이용하여 유도된 만능 줄기 세포를 생산하는 방법을 기술한다. 더욱이, 본 발명은 리포터 유전자를 이용하는 신규 재프로그래밍 벡터를 제공한다.

Description

ｉＰＳ 세포의 생산 방법{Methods for the production of iPS cells}
본 출원은 2008년 8월 12일에 출원된 미국출원번호 61/088,054를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 내용은 포기 없이 전문이 분명하게 참고인용된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 줄기 세포 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 체세포의 재프로그래밍(reprogramming)에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
일반적으로, 줄기 세포는 성숙한 기능적 세포의 자손을 발생시킬 수 있는 미분화 세포이다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포는 임의의 여러 종류의 최종 분화된 혈액 세포를 발생시킬 수 있다. 배아 줄기(ES) 세포는 배아에서 유래되고 만능성이어서, 임의의 기관 또는 조직 종류로, 또는 적어도 잠재적으로는 완전 배아로 발달할 능력을 갖고 있다.
보통 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되는 유도된 만능 줄기 세포는 비-만능 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 특정 유전자의 삽입에 의해 인공적으로 유도되는 만능 줄기 세포의 한 종류이다. 유도된 만능 줄기 세포는 많은 관점에서, 예컨대 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 배가 시간, 배상체 형성, 기형종 형성, 생육성 키메라 형성 및 효능과 분화능 등에서 천연 만능 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포와 동일한 것으로 생각되지만, 천연 만능 줄기 세포와의 완전한 관련 정도는 여전히 평가 중이다.
iPS 세포는 2006년(Takahashi et al., 2006)에 마우스 세포로부터, 2007년에 사람 세포로부터(Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007) 최초 생산되었다. 이것은 연구자들이 논란의 여지가 있는 배아 사용 없이, 연구에 중요하고 잠재적으로 치료 용도가 있는 만능 줄기 세포를 수득할 수 있게 하여, 줄기 세포 연구에 중요한 진보라고 언급되고 있다.
하지만, 현재 이러한 유도된 만능 줄기(iPS) 세포의 연구 단계에서, iPS 세포를 발생시키는 효율이 낮아서, 임상 연구에 iPS 세포의 이용가능성을 방해한다. 따라서, 유도된 만능 줄기 세포를 생산하는 효율을 향상시키는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명은 향상된 효율로 유도된 만능 줄기 세포를 제공함으로써 당업계의 주요 결함을 극복한다. 제1 양태로, 본 발명은 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 집단을 생산하는 방법으로서, (a) (i) 전사 조절 요소; (ii) 상기 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합되고 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열; (iii) 제1 뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한 IRES; 및 (iv) 상기 IRES의 해독 조절하에 있도록 IRES의 3'에 위치하는 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(여기서, (1) 제1 핵산이 재프로그래밍 인자를 암호화하면 제2 뉴클레오타이드 서열은 다른 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하고, (2) 제1 핵산이 리포터를 암호화하면 제2 뉴클레오타이드 서열은 재프로그래밍 인자를 암호화한다)을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 재프로그래밍 벡터를 수득하는 단계; (b) 상기 재프로그래밍 벡터를 체세포 집단의 세포 내로 도입시키는 단계; (c) 상기 세포를 배양하여 상기 집단을 증대시키는 단계; (d) 상기 증대된 집단에서 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특성을 가진 자손 세포를 선택하는 단계; 및 (e) 상기 선택한 자손 세포를 배양하여 iPS 세포 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 관점에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 재프로그래밍 인자를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 리포터를 암호화하며, 또는 그 반대일 수도 있어, 리포터 유전자의 동시 발현이 후술한 바와 같이 재프로그래밍된 세포의 선택을 돕는다.
동일한 전사 조절 요소 하에 여러 재프로그래밍 인자를 공동발현하기 위해, 발현 카세트는 제2 IRES 및 상기 제2 IRES의 해독 조절하에 있도록 제2 IRES의 3'에 위치한 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 다른 재프로그래밍 인자를 암호화할 수 있다. 상기 어떤 시나리오에서든지, 리포터는 형질감염 및 iPS 세포 선택 효율을 향상시키기 위해 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 능력은 부분적으로 감염 효율의 지시인자로 작용하고 동일한 폴리시스트론성 전사체에서 재프로그래밍 유전자 유래의 발현 수준과 일반적으로 상관성이 있고 세포가 만능성으로 완전히 유도된 후 사일런싱(silencing) 되는, 형광 단백질과 같은 리포터의 발현에 의존한다. 예를 들어, 상기 방법의 단계 c)는 체세포가 리포터를 발현하는 체세포 집단을 선택하고, 선택된 세포를 배양하여 집단을 증대시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 관점에 따르면, 리포터의 발현 수준, 예컨대 형광-보조 세포 분류법(FACs)을 이용한 형광 단백질의 발현 수준에 기초하여, 최소 내지 가장 효율적으로 감염된 세포를 선택하는 것이 가능할 것이다.
예시적 양태에서, 리포터는 세포 표면 마커, 형광 단백질, 에피토프, 클로람페니콜, 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제일 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 청색 형광 단백질(BFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP) 또는 이의 변형일 수 있다. 사용된 리포터에 따라, 단계 c)에서의 선택은 형광-활성화 세포분류법(FACS), CAT 분석법, 발광 분석법 또는 효율적으로 형질감염된 세포를 선택하기 위해 리포터 발현을 검출하거나 선별하는 것으로 당업자에게 공지왼 임의의 방법을 포함할 수 있다. 대안적인 또는 보완적인 시도는 자손 세포에서 외인성 리포터 전사체의 부재를 RT-PCR, 원위치 하이브리드화, RNA 어레이 또는 하이브리드화(예, 노던 블롯)와 같은 통상적인 방법으로 검사하는 것이다.
본 발명의 추가 양태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 벡터에 포함된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 iPS 재프로그래밍 인자는 Sox 패밀리의 적어도 하나의 구성원과 Oct 패밀리의 적어도 하나의 구성원을 포함할 수 있다. Sox 및 Oct는 ES 세포 동일성을 명시하는 전사 조절 체계에 중심인 것으로 생각된다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-15 또는 Sox-18일 수 있고, Oct는 Oct-4일 수 있다. 추가 인자는 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같이 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있고; 재프로그래밍 인자의 특정 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog 및 경우에 따라 Lin-28을 포함하는 세트; 또는 Sox-2, Oct4, Klf 및 경우에 따라 c-Myc를 포함하는 세트일 수 있다.
또 다른 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 더 구체적으로 레트로바이러스 벡터, 예컨대 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV), Akv-MLV, SL-3-3-MLV 또는 다른 근연성이 있는 바이러스일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 특정 관점에서, 전사 조절 요소는 바이러스 유전자의 통합을 매개하는 긴 말단 반복 영역(LTR)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 폴리시스트론성 전사체는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하여 사용될 수 있다. 예시적인 IRES는 뇌척수심근염 바이러스 IRES, 피코나바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, A형 간염 바이러스 IRES, C형 간염 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 IRES, 폴리오바이러스 IRES, 돼지 수포성 질환 바이러스 IRES, 순무 모자이크 포티바이러스 IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, 페스티바이러스 IRES, 레이슈마니아 RNA 바이러스 IRES, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 14 IRES, 아프토바이러스 IRES, 사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 mRNA IRES, 초파리 안테나페디아(Antennapedia) mRNA IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, G형 간염 바이러스 IRES, 토바모바이러스 IRES, 혈관 내피세포 성장인자 mRNA IRES, 콕사키 B 그룹 바이러스 IRES, c-myc 원종양유전자 mRNA IRES, 사람 MYT2 mRNA IRES, 사람 파레코바이러스 타입 1 바이러스 IRES, 사람 파레코바이러스 타입 2 바이러스 IRES, 진핵생물 개시 인자 4GI mRNA IRES, 갈색날개노린재 장 바이러스 IRES, 타일러 쥐 뇌척수염 바이러스 IRES, 소 장내바이러스 IRES, 코넥신 43 mRNA IRES, 호메오도메인 단백질 Gtx mRNA IRES, AML1 전사인자 mRNA IRES, NF-카파 B 억제인자 mRNA IRES, 아폽토시스의 X-연관 억제제 mRNA IRES, 귀뚜라미 마비병 바이러스 RNA IRES, p58(PITSLRE) 단백질 키나제 mRNA IRES, 오르니틴 데카르복실라제 mRNA IRES, 코넥신-32 mRNA IRES, 소 바이러스 설사 바이러스 IRES, 인슐린-유사 성장인자 I 수용체 mRNA IRES, 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 gag 유전자 IRES, 고전적 돼지열바이러스 IRES, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 IRES, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 라이브러리에서 선택되는 짧은 IRES, 젬브라나병 바이러스 IRES, 아폽토시스 프로테아제-활성화 인자 1 mRNA IRES, 기장테두리진딧물 바이러스 IRES, 양이온성 아미노산 트랜스포터 mRNA IRES, 사람 인슐린-유사 성장인자 II 리더 2 mRNA IRES, 지아디아바이러스 IRES, Samd5 mRNA IRES, 돼지 테스코바이러스-1 탈판 IRES, 초파리 무모(Hairless) mRNA IRES, hSNM1 mRNA IRES, Cbfa1/Runx2 mRNA IRES, 엡스타인-바르 바이러스 IRES, 히비스커스 퇴록둥근무늬병 바이러스(hibiscus chlorotic ringspot virus) IRES, 래트 뇌하수체 바소프레신 V1b 수용체 mRNA IRES, 사람 hsp70 mRNA IRES 또는 이의 변형체일 수 있다. 특히, IRES 요소는 뇌척수심근염 바이러스 IRES일 수 있다.
추가 양태에서, 재프로그래밍 벡터는 리포좀 형질감염, 전기천공, 입자 포격, 인산칼슘, 폴리양이온 또는 폴리음이온에 의해 도입되거나 또는 외인성 유전 인자를 세포 내로 도입시키는데 적합한 임의의 방법으로 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 체세포는 포유동물 유래, 더 구체적으로 사람 유래일 수 있다. 체세포는 최종 분화 세포, 또는 조직 줄기 세포일 수 있고, 구체적으로 섬유아세포, 조혈세포 또는 간엽세포를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 체세포는 섬유아세포이다. 체세포는 조직 세포 은행으로부터 또는 선택된 사람 피검체, 구체적으로 살아있는 사람으로부터 입수할 수 있다. 이러한 체세포 자손 유래의 게놈은 선택된 사람 개체와 같이 특정 근원의 체세포에서 유래된 것으로 간주할 수 있다.
특정 관점에서, 자손 세포는 본질적인 리포터 발현 상실, 미분화된 형태, 배아 줄기 세포-특이적 마커 또는 만능성 또는 다중계열 분화 잠재성 또는 당업계에 공지된 임의의 특성 또는 이의 조합에 대해 선택할 수 있다. 이러한 선택 단계는 세포가 만능 상태에 있고 분화 상태로 돌아가지 않도록 형질감염 후에 하나 이상의 시점에서 이용될 수 있다. 따라서, 선택 단계는 자손 세포가 자립성 만능 상태가 된 후의 한 시점, 예컨대 재프로그래밍 벡터가 세포 내로 도입된 후 적어도 약 10일 내지 적어도 30일째일 수 있다.
구체적으로, 자손 세포는 편의성 때문에 미분화된 형태에 대해 선택될 수 있다. 배아 줄기 세포-특이적 마커는 SSEA-3, SSEA-1, Tra-1-60 또는 Tra-1-81, Tra-2-49/6E, GDF3, REX1, FRF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 특이적 마커일 수 있다.
특정 관점에서, 자손 세포는 세포가 만능성이 되면 재프로그래밍된 세포는 외인성 도입 물질을 사일런싱시킬 수 있기 때문에 도입된 리포터 유전자의 본질적인 발현 부재를 기초로 하여 iPS 세포를 선택할 수 있다. 따라서, 리포터 발현, 예컨대 형광의 본질적 상실은 세포가 재프로그래밍되었다는 형태학적 특징 외에 또 다른 지표이다. 이러한 특징은 도입된 리포터 유전자에 기초한 형광-활성화 세포 분류법(FACS), CAT 분석 또는 발광 분석을 통해 선택할 수 있다. 리포터 유전자 발현의 "본질적 상실"은 iPS 세포 집단의 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 임의의 중간 백분율 이하의 세포가 외인성 리포터 발현을 포함한다는 것을 의미한다.
추가 관점에서, 재프로그래밍 벡터는 (a) 전사 조절 요소; (b) 상기 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합되고 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열; (c) 제1 뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한 IRES; 및 (d) 상기 IRES의 해독 조절 하에 있도록 IRES의 3'에 위치하는 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것으로 개시되고, 여기서 (i) 제1 핵산이 재프로그래밍 인자를 암호화하면 제2 뉴클레오타이드 서열은 다른 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하고, (ii) 제1 핵산이 리포터를 암호화하면 제2 뉴클레오타이드 서열은 재프로그래밍 인자를 암호화한다.
특정 관점에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 재프로그래밍 인자를 암호화하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 리포터를 암호화하며, 또는 그 반대일 수 있고; 대안적으로, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 다른 재프로그래밍 인자를 암호화한다. 동일한 전사 조절 요소 하에서 여러 재프로그래밍 인자를 공동발현하기 위해, 발현 카세트는 제2 IRES 및 당해 제2 IRES의 해독 조절 하에 있도록 제2 IRES의 3'에 위치한 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 어떤 시나리오에서든지, 리포터는 형질감염 및 iPS 세포 선택 효율을 향상시키기 위해 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
추가 관점으로, 또한 (a) 전사 조절 요소; 및 (b) 상기 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합된, 재프로그래밍 인자를 암호화하는 제1 암호화 서열과 제2 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화하는 제2 암호화 서열을 포함하는 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 재프로그래밍 벡터가 제공된다. 예를 들어, 전사 조절 요소는 긴 말단 반복 영역, 프로모터, 인핸서, 전사 조절 요소 등을 포함할 수 있다. 폴리시스트론성 발현 카세트에 포함되는 것으로, 제2 암호화 서열은 암호화 서열(들)의 발현 또는 본질적인 발현 상실의 선택의 용이성을 돕는 리포터를 암호화할 수 있다. 대안적으로, 제2 암호화 서열은 하나의 폴리시스트론성 전사체로부터 2 이상의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 삽입 돌연변이유발의 기회 및 프로바이러스 복사체를 감소시키는 제2 또는 그 이상의 재프로그래밍 인자일 수 있다. 이와 유사하게, 폴리시스트론성 발현 카세트는 하나 이상의 추가 암호화 서열이 재프로그래밍 인자, 리포터 또는 선택 마커를 암호화하는, 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 추가 암호화 서열(예컨대, 제3, 제4 또는 제5 암호화 서열 등)일 수 있다. 예를 들어, 선택 마커는 항생제 내성 마커 또는 표면 선택 마커일 수 있다.
전술한 재프로그래밍 벡터의 예시적 양태에서, 리포터는 세포 표면 마커, 형광 단백질, 에피토프, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제일 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 청색 형광 단백질(BFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP) 또는 이의 변형, 예컨대 eGFP, eRFP, eBFP, eBFP2, eCFP, eYFP일 수 있다. 특정 관점에서, 재프로그래밍 벡터는 추가로 선택 마커, 예컨대 항생제 내성 마커를 포함할 수 있다.
재프로그래밍 벡터의 추가 양태에서, 재프로그래밍 벡터에 포함된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 iPS 재프로그래밍 인자는 Sox, Oct, Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc를 포함할 수 있다. 예를 들어, Sox는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 또는 Sox-18일 수 있다; Oct는 Oct-4일 수 있다. 추가 인자는 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc처럼 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 더 구체적으로 레트로바이러스 벡터, 예컨대 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV), Akv-MLV, SL-3-3-MLV 또는 다른 근연성 바이러스일 수 있다. 또한, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 엡스타인-바르 바이러스(EBV)계 벡터일 수 있다. 특정 관점에서, 전사 조절 요소는 외인성 유전자의 통합 및 전사를 매개하는 긴 말단 반복 영역(LTR)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 재프로그래밍 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 암호화 서열의 독립적인 해독을 유도하기에 충분한 임의의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 IRES는 뇌척수심근염 바이러스 IRES, 피코나바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, A형 간염 바이러스 IRES, C형 간염 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 IRES, 폴리오바이러스 IRES, 돼지 수포성 질환 바이러스 IRES, 순무 모자이크 포티바이러스 IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, 페스티바이러스 IRES, 레이슈마니아 RNA 바이러스 IRES, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 14 IRES, 아프토바이러스 IRES, 사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 mRNA IRES, 초파리 안테나페디아(Antennapedia) mRNA IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, G형 간염 바이러스 IRES, 토바모바이러스 IRES, 혈관 내피세포 성장인자 mRNA IRES, 콕사키 B 그룹 바이러스 IRES, c-myc 원종양유전자 mRNA IRES, 사람 MYT2 mRNA IRES, 사람 파레코바이러스 타입 1 바이러스 IRES, 사람 파레코바이러스 타입 2 바이러스 IRES, 진핵생물 개시 인자 4GI mRNA IRES, 갈색날개노린재 장 바이러스 IRES, 타일러 쥐 뇌척수염 바이러스 IRES, 소 장내바이러스 IRES, 코넥신 43 mRNA IRES, 호메오도메인 단백질 Gtx mRNA IRES, AML1 전사인자 mRNA IRES, NF-카파 B 억제인자 mRNA IRES, 아폽토시스의 X-연관 억제제 mRNA IRES, 귀뚜라미 마비병 바이러스 RNA IRES, p58(PITSLRE) 단백질 키나제 mRNA IRES, 오르니틴 데카르복실라제 mRNA IRES, 코넥신-32 mRNA IRES, 소 바이러스 설사 바이러스 IRES, 인슐린-유사 성장인자 I 수용체 mRNA IRES, 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 gag 유전자 IRES, 고전적 돼지열바이러스 IRES, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 IRES, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 라이브러리에서 선택되는 짧은 IRES, 젬브라나병 바이러스 IRES, 아폽토시스 프로테아제-활성화 인자 1 mRNA IRES, 기장테두리진딧물 바이러스 IRES, 양이온성 아미노산 트랜스포터 mRNA IRES, 사람 인슐린-유사 성장인자 II 리더 2 mRNA IRES, 지아디아바이러스 IRES, Samd5 mRNA IRES, 돼지 테스코바이러스-1 탈판 IRES, 초파리 무모(Hairless) mRNA IRES, hSNM1 mRNA IRES, Cbfa1/Runx2 mRNA IRES, 엡스타인-바르 바이러스 IRES, 히비스커스 퇴록둥근무늬병 바이러스(hibiscus chlorotic ringspot virus) IRES, 래트 뇌하수체 바소프레신 V1b 수용체 mRNA IRES, 사람 hsp70 mRNA IRES 또는 이의 변형체일 수 있다. 특히, IRES 요소는 뇌척수심근염 바이러스 IRES, 피코나바이러스 IRES 또는 구제역 질환 바이러스 IRES일 수 있다.
추가 양태에서, 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 집단을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 전술한 하나 이상의 재프로그래밍 벡터를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 재프로그래밍 벡터를 체세포 집단의 세포 내에 도입시켜 iPS 세포 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 관점에서, iPS를 생산하는 하나 이상의 재프로그래밍 벡터는 Sox 및 Oct를 포함하는 재프로그래밍 인자를 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다.
본 방법은 (c) 세포를 배양하여 집단을 증대시키는 단계; 및 (d) 증대된 집단에서 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특징을 가진 자손 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 단계는 (e) 선택한 자손 세포를 배양하여 iPS 세포 집단을 제공함을 본 방법에 추가로 포함할 수 있다.
리포터를 암호화하는 암호화 서열(들)을 포함하는 재프로그래밍 벡터를 위해, 단계 c)는 리포터를 발현하는 체세포 집단을 선택함을 추가로 포함하는데, 그 이유는 재프로그래밍 벡터의 도입 후 재프로그래밍 인자와 리포터의 발현 사이에 상관성이 있기 때문이다. 단계 c)에서의 선택은 특정 관점에서 리포터 발현을 검출하기 위한 광학 분석, 형광-활성화 세포 분류(FACS), CAT 분석 또는 발광 분석을 포함할 수 있다.
특정 관점에서, 하나 이상의 재프로그래밍 벡터는 리포좀 형질감염, 전기천공, 입자 포격, 인산칼슘, 폴리양이온, 폴리음이온 또는 뉴클레오타이드의 세포 진입에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 체세포 내로 도입된다.
재프로그래밍을 위해, 체세포는 포유동물의 체세포, 예컨대 사람 체세포일 수 있다. 체세포의 종류는 섬유아세포, 조혈세포, 림프구(예, T 세포 또는 B 세포), 간엽세포, 섬세포 또는 조직 줄기 세포일 수 있다.
자손 세포가 자립성 만능 상태를 확립하기 위한 소정의 기간 후, 바이러스 벡터에 포함된 발현 카세트의 발현은 중단될 것이다. 따라서, 자손 세포는 리포터 발현의 본질적 상질, 또는 다른 공지된 배아 세포-유사 성질, 예컨대 미분화된 형태, 배아 줄기 세포-특이적 마커 또는 만능성과 같은 특성들에 대해 선택될 수 있다. 자손 세포는 리포터 발현의 상실 또는 감소 또는 ES 세포-특이적 표면 마커, 예컨대 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 또는 Tra-1-81, Tra-2-49/6E, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 선택하기 위한 광학 분석, 형광-활성화 세포 분류법(FACS), CAT 분석 또는 발광 분석에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 방법 및/또는 조성물에 대한 설명에서 논의된 양태들은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해서도 이용될 수 있다. 따라서, 한 방법 또는 조성물에 관한 양태는 또한 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 핵산과 관련된 "암호화한다" 또는 "암호화하는"이란 용어는 당업자가 본 발명을 쉽게 이해할 수 있게 하는데 사용되지만, 이 용어들은 각각 "포함한다" 또는 "포함하는"과 호환해서 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에 사용된 바와 같이, "포함하는"과 함께 사용될 때, 단수 표현은 하나 또는 2 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서는 대안만을 의미하는 정의 및 "및/또는"을 제공하지만, 청구항에서 "또는"이란 용어의 사용은 대안만을 언급하는 분명한 표시가 없거나, 대안이 상호 배타적이지 않은 한, "및/또는"을 의미하는 것이다. 본 명세서에 사용된 "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서를 통해, "약"이란 용어는 장치의 고유 오류 변화, 값을 측정하는데 사용된 방법, 또는 연구 피검체 간에 존재하는 변화를 포함하는 값이라는 것을 나타내기 위해 사용되고 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 이하 상세한 설명을 통해 분명해질 것이다. 하지만, 이러한 상세한 설명과 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내지만, 단지 예시하기 위한 것으로서, 이러한 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것은 당업자에게 자명하다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 발명의 특정 관점을 더 상세히 입증하기 위한 것이다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 이하 도면 중 하나를 참고로 하면 보다 잘 이해될 것이다.
도 1A 및 1B는 IRES-의존적 폴리시스트론성 시스템의 예이다.
I. 본 발명
체세포 또는 완전 분화된 사람 세포를 다시 만능 상태 또는 "줄기 세포" 상채로 역유도하는 능력은 배아-유래 줄기 세포의 사용에 대한 다수의 중요한 과학적 및 사회적 문제를 극복할 수 있고 재생 의학의 전망을 실현하는데 도움을 줄 것이다. 하지만, 현행 재프로그래밍 과정은 비효율적이어서, 그 적용을 방해한다. 본 발명은 향상된 효율로 유도된 만능 줄기 세포를 발생시킴으로써 현행 재프로그래밍 기술의 여러 주요 문제를 극복한다. 배아 줄기 세포-유사 형태학만을 기본으로 한 선택을 일반적으로 이용하는 종래 방법과 달리, 본 방법의 특정 관점은 재프로그래밍 인자 외에 리포터를 암호화하는 폴리시스트론성 전사체를 발현하는 벡터를 이용하여, 재프로그래밍 세포의 효율을 최적화하고 선택을 개선한다. 본 발명의 추가 양태 및 장점은 이하에 설명한다.
II . 정의
"재프로그래밍"은 재프로그래밍 없이 동일 조건 하에 제공될 수 있는 것보다 배양물내 또는 생체내에서 적어도 하나의 신규 세포 타입의 자손을 형성하는 능력을 측정가능하게 증가된 정도로 세포에 부여하는 과정이다. 더 구체적으로, 재프로그래밍은 체세포에 만능 잠재성을 부여하는 과정이다. 이것은, 충분한 증식 후에 재프로그래밍 전에 거의 형성할 수 없었던, 신규 세포 타입의 표현형 특성을 가진 측정가능한 비율의 자손; 달리 표현하면 신규 세포 타입의 특성을 가진 비율이 재프로그래밍 전보다 측정가능할 정도로 높은 것을 의미한다. 특정 조건 하에서, 신규 세포 타입의 특성을 가진 자손의 비율은 바람직한 순서대로 열거하면 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
"벡터" 또는 "작제물"(유전자 전달 또는 유전자 이동 "비히클"이라고도 종종 지칭됨)은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 의미한다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트"는 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 적어도 프로모터 또는 프로모터와 기능적 등가인 구조를 포함한다. 또한, 추가 인자, 예컨대 인핸서 및/또는 전사 종결 시그널도 포함할 수 있다.
세포 또는 유기체 내의 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용되었을 때, "외인성"이란 용어는 인공 또는 자연 수단에 의해 세포 또는 유기체로 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 또는 세포와 관련해서는 분리 후 인공 또는 자연 수단에 의해 다른 세포 또는 유기체로 도입된 세포를 의미한다. 외인성 핵산은 다른 유기체 또는 세포에서 유래되거나, 또는 상기 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 생기는 핵산의 하나 이상의 추가 복사체일 수 있다. 외인성 세포는 다른 유기체 유래인 것 또는 동일 유기체 유래인 것일 수 있다. 비제한적 예로서, 외인성 핵산은 자연 세포의 위치와 다른 염색체 위치에 있거나, 또는 자연에서 발견되는 것과 다른 핵산 서열에 인접해 있다.
본 명세서에 사용된 "~에 상응한다"란 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 폴리뉴클레오타이드 서열 전부 또는 일부와 상동성(즉, 엄격하게는 진화적으로 관련된 것이 아니라 동일한 것)인 것을 의미하거나, 또는 폴리펩타이드 서열이 참조 폴리펩타이드 서열과 동일한 것을 의미한다. 이에 대비하여, 본 명세서에 사용된 "~에 상보적인"이란 용어는 상보성 서열이 참고 폴리뉴클레오타이드 서열 전부 또는 일부에 상동성인 것을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 상응하고 참조 서열 "GTATA"에 상보적이다.
특정 단백질을 "암호화"하는 "유전자", "폴리뉴클레오타이드", "암호화 영역", "서열", "분절", "단편" 또는 "전이유전자"는 적당한 조절 서열의 조절 하에 배치되었을 때 시험관내 또는 생체내에서 전사되고 경우에 따라 유전자 산물, 예컨대 폴리펩타이드로 해독되는 핵산 분자이다. 암호화 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 핵산 분자는 일본쇄(즉, 센스 가닥) 또는 이본쇄일 수 있다. 암호화 영역의 경계는 5'(아미노) 말단의 개시 코돈과 3'(카르복시) 말단의 해독 종결 코돈으로 결정된다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA 유래의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 전사 종결 서열은 보통 유전자 서열의 3'에 위치할 것이다.
"조절 요소"란 용어는 프로모터 영역, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 오리진, 내부 리보솜 진입 부위("IRES"), 인핸서, 스플라이스 이음부를 통칭하는 것으로, 이들은 함께 수용체 세포에서 암호화 서열의 복제, 전사, 전사후 프로세싱 및 해독을 제공한다. 선택된 암호화 서열이 적당한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 해독할 수 있다면, 이러한 조절 요소들 전부가 항상 존재해야 하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "LTR"이란 용어는 프로바이러스(예컨대, 레트로바이러스의 통합 형태)의 각 말단에서 발견된 긴 말단 반복체를 의미한다. LTR은 전사 조절 요소, 폴리아데닐화 시그널 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 비롯한 다수의 조절 시그널을 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5라 불리는 3개의 영역으로 나뉘어 있다. U3 영역은 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 폴리아데닐화 시그널을 함유한다. R(반복체) 영역은 U3과 U5 영역을 분리하고 R 영역의 전사 서열은 바이러스 RNA의 5' 및 3' 말단 모두에서 나타난다.
"형광 단백질"은 형광 발색단을 포함하는 단백질 클래스를 의미하며, 이 발색단은 적어도 3개의 아미노산으로 구성되고 p-하이드록시벤질리덴-이미다졸리디논 발색단을 형성하는 폐환 반응을 특징으로 한다. 발색단은 보결분자단을 함유하지 않고 선택 에너지의 빛을 방출할 수 있고, 이 에너지는 정확한 파장(들)을 포함하는 외부 광원으로부터 사전 조명에 의해 발색단에 저장된 에너지이다. 자발적 형광 단백질은 발색단이 전술한 바와 같이 p-하이드록시벤질리덴-이미다졸리디논 환 구조를 포함한다면 임의의 수의 아미노산을 포함하는 발색단을 보유한 임의의 구조일 수 있다. SFP는 일반적으로 녹색 형광 단백질에서 발견되고 문헌[Chalfie et al.(1994)]에 기술된 바와 같은 β-원통(barrel) 구조를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
형광 단백질은 특징적으로 단백질에 의해 흡수된 특정 파장의 입사광에 반응하여 더 긴 파장의 빛을 생산하는 능력인 "형광성"을 나타낸다.
통상적인 의미로 본 명세서에 사용된 "프로모터"란 용어는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 의미하며, 이 조절 서열은 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자에서 유래하는 것이다.
"인핸서"란, 프로모터에 근접 위치했을 때, 인핸서 도메인의 부재 하에 프로모터로부터 산출되는 전사 활성에 비해 증가된 전사 활성을 부여하는 핵산 서열을 의미한다.
핵산 분자와 관련하여 "작동가능하게 결합된"이란, 2 이상의 핵산 분자(예, 전사될 핵산 분자, 프로모터 및 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자와 관련하여 "작동가능하게 결합된"은 2 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 분자가 융합체의 각 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 적어도 하나의 성질을 가진 단일 폴리펩타이드 사슬, 즉 융합 폴리펩타이드를 산출하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 융합 폴리펩타이드는 키메라성, 즉 이종 분자로 구성된 것이 바람직하다.
당업계에서의 가장 넓은 의미로 본 명세서에 사용되고 있는 "세포"란 용어는 다세포 유기체 조직의 구조 단위인 생체를 의미하고, 외부로부터 세포를 분리하는 막 구조로 둘러싸여 있고, 자기 복제하는 능력이 있고, 유전자 정보 및 이를 발현할 수 있는 기전을 보유한다. 본 명세서에 사용된 세포는 자연발생 세포 또는 인공변형된 세포(예, 융합 세포, 유전자 변형 세포 등)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "줄기 세포"란 용어는 자기 복제할 수 있고 만능성인 세포를 의미한다. 일반적으로, 줄기 세포는 손상된 조직을 재생할 수 있다. 본 명세서의 줄기 세포는 배아 줄기(ES) 세포 또는 조직 줄기 세포(또한, 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포성 줄기 세포라고 불리기도 함)일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전술한 능력이 있을 수 있는 임의의 인공 생산된 세포(예, 본원에 사용된 융합 세포, 재프로그래밍된 세포 등)는 줄기 세포일 수 있다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 초기 배아 유래의 만능 줄기 세포이다. ES 세포는 1981년에 처음 확립되었고, 또한 1989년 이후 녹아웃 마우스의 생산에 적용되었다. 1998년에는 사람 ES 세포가 확립되었고, 이는 현재 재생 의학에 이용되기 시작하고 있다.
ES 세포와 달리, 조직 줄기 세포는 분화능에 한계가 있다. 조직 줄기 세포는 조직의 특정 위치에 존재하고 미분화 세포내 구조를 보유한다. 따라서, 조직 줄기 세포의 만능성은 일반적으로 낮다. 조직 줄기 세포는 핵/세포질 비가 더 높고 몇몇 세포내 소기관을 보유한다. 대부분의 조직 줄기 세포는 만능성이 낮고, 세포 주기가 길며, 개체의 수명 이상인 증식능을 보유한다. 조직 줄기 세포는 이 세포가 유래되는 부위에 따라 카테고리로 분리되는데, 예컨대 피부계, 소화계, 골수계, 신경계 등이 있다. 피부계의 조직 줄기 세포는 상피 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등을 포함한다. 소화계의 조직 줄기 세포는 췌장(일반) 줄기 세포, 간 줄기 세포 등을 포함한다. 골수계의 조직 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 등을 포함한다. 신경계의 조직 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 등을 포함한다.
일반적으로 iPS 세포 또는 iPSC로 약칭되는 "유도된 만능 줄기 세포"는 비-만능 세포, 일반적으로 성숙 체세포, 또는 최종 분화 세포, 예컨대 섬유아세포, 조혈세포, 근세포, 뉴런, 상피세포 등으로부터, 재프로그래밍 인자라고 불리는 특정 유전자의 삽입에 의해 인공적으로 제조된 만능 줄기 세포 타입을 의미한다.
"만능성"은 하나 이상의 조직 또는 기관, 또는 바람직하게는 3개의 배층, 즉 내배엽(위 내막, 위장관, 폐), 중간엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽(상피조직 및 신경계) 중 임의의 층을 구성하는 모든 세포로 분화하는 잠재능이 있는 줄기 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "만능 줄기 세포"는 상기 3개의 배층 중 임의의 층에서 유래된 세포, 예컨대 분화전능성 세포의 후손 또는 유도된 만능 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.
"자기-재생"은 미분화 상태를 유지하면서 수회의 세포 분열 사이클을 반복하는 능력을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "체세포"란 용어는 생식세포 외에 다른 임의의 세포, 예컨대 자신의 DNA를 다음 세대로 직접 전달하지 않는, 난자, 정자 등을 의미한다. 일반적으로, 체세포는 만능성 한계가 있거나 전혀 만능성이지 않다. 본 명세서에 사용된 체세포는 자연 발생 또는 유전자 변형 체세포일 수 있다.
III . 유도된 만능 줄기 세포에 대한 일반적 배경
본 발명의 특정 양태에 따르면, 리포터 및 재프로그래밍 인자를 모두 암호화하는 폴리시스트론성 전사체를 발현하는 재프로그래밍 벡터로 체세포를 재프로그래밍하는 방법이 개시된다. 예를 들어, 이러한 세포는 먼저 리포터 유전자의 발현에 대해 선택하여 형질전환된 세포를 모으고, 그 다음 그 자손을 리포터 유전자가 사일런싱된 유도된 만능 줄기 세포에 대해 선택할 수 있다. 배아 줄기 세포 특징의 이해는 이 방법 외에 유도된 만능 줄기 세포를 선택하는 것을 도울 수 있다. 줄기 세포 재프로그래밍 연구로부터 공지된 재프로그래밍 인자는 당해의 신규 방법에 사용될 수 있다. 또한, 이러한 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포 사용 시의 윤리적 장애로 인해 치료 및 연구 적용 시 배아 줄기 세포의 대체용으로 잠재적으로 사용될 수 있을 것으로 고찰된다.
A. 줄기 세포
줄기 세포는 모든 다세포 유기체는 아니지만, 대부분의 다세포 유기체에서 발견되는 세포이다. 이 세포는 유사 세포 분열을 통해 스스로 재생하고 다양한 범위의 특수 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 2가지 광범위한 타입의 포유동물 줄기 세포는 다음과 같다: 포배에서 발견되는 배아 줄기 세포 및 성숙 조직에서 발견되는 성숙 줄기 세포. 발생 배아에서, 줄기 세포는 모든 특수 배아 조직으로 분화할 수 있다. 성숙 유기체에서, 줄기 세포 및 선조 세포는 신체의 수복계로 작용하고 특수 세포를 보충하지만, 역시 혈액, 피부 또는 장 조직과 같은 재생 기관의 정상적인 회전을 유지하기도 한다.
줄기 세포는 세포 배양을 통해 근육 또는 신경과 같은 다양한 조직의 세포와 일치하는 특징을 가진 특수 세포로 성장 및 형질전환될 수 있으므로, 의학적 치료법에 이들의 사용이 제안되었다. 구체적으로, 배아 세포주, 치료적 클로닝을 통해 생성된 자가 배아 줄기 세포, 및 제대혈 또는 골수 유래의 고 증식성 성숙 줄기 세포가 전망있는 후보로 조사되고 있다. 최근에 성숙 세포의 유도된 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍은 배아 줄기 세포를 대체할 막강한 잠재능이 있다.
B. 배아 줄기 세포
배아 줄기 세포주(ES 세포주)는 포배 또는 그 이전 상실기 배아의 내세포괴(ICM)의 외배판 조직 유래의 세포 배양물이다. 포배는 사람의 경우 약 4 내지 5일령의 초기 단계 배아이고 50 내지 150개 세포로 이루어져 있다. ES 세포는 만능성이고 발달 동안 3가지 원시 배층, 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 모든 유도체를 발생시킨다. 환언하면, 특정 세포 타입에 충분하고 필요한 자극을 주었을 때 200가지 이상의 성체 세포 타입으로 각각 발달할 수 있다. 하지만, 태반이나 배아외 막에는 기여하지 않는다.
현재까지 거의 모든 연구는 마우스 배아 줄기 세포(mES) 또는 사람 배아 줄기 세포(hES)를 이용하여 실시했다. 둘 모두 필수 줄기 세포 특성은 갖고 있지만, 미분화 상태를 유지하기 위해 매우 다른 환경을 필요로 한다. 마우스 ES 세포는 젤라틴 층에서 성장할 수 있고 백혈병 억제인자(LIF)의 존재를 필요로 한다. 사람 ES 세포는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 피더(feeder) 층에서 성장할 수 있고 종종 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF 또는 FGF-2)의 존재를 필요로 한다. 최적의 배양 조건 또는 유전자 조작 없이(Chambers et al., 2003), 배아 줄기 세포는 빠르게 분화할 것이다.
또한, 사람 배아 줄기 세포는 여러 전사 인자 및 세포 표면 단백질의 존재에 의해 정의될 수 있다. 전사 인자 Oct-4, Nanog 및 Sox2는 분화 및 만능 유지를 유도하는 유전자를 확실하게 억제해주는 핵심 조절 네트워크를 형성한다(Boyer et al., 2005). hES 세포를 동정하는데 가장 일반적으로 사용되는 세포 표면 항원은 당지질 SSEA3 및 SSEA4와 케라탄 설페이트 항원 Tra-1-60 및 Tra-1-81을 포함한다.
20년간의 연구 후에도, 배아 줄기 세포를 이용한 사람 실험이나 승인된 치료법은 없다. 만능 세포인 ES 세포는 정확한 분화를 위해 특정 시그널을 필요로 하고, 만일 체내에 직접 주사하면, ES 세포는 다수의 여러 세포 타입으로 분화하여 기형종을 유발한다. 이식 거부를 피하면서 유용한 세포로 ES 세포를 분화시키는 것은 배아 줄기 세포 연구자가 여전히 직면해 있는 단지 몇 가지의 장애이다. 많은 국가들은 현재 ES 세포 연구 또는 신생 ES 세포주의 생산을 일시 정지시키고 있다. 이들의 무제한적 증대와 만능성의 병합 능력으로 인해, 배아 줄기 세포는 손상이나 질환 후 재생 의학 및 조직 대체를 위한 이론적으로 잠재적인 근원을 유지한다. 하지만, 상기 문제를 우회하는 1가지 방법은 직접 재프로그래밍에 의해 체세포에 만능 상태를 유도하는 것이다.
C. 재프로그래밍 인자
iPS 세포의 생성은 유도를 위해 사용된 유전자에 중요하다. 다음과 같은 인자 또는 이의 배합물은 본 발명에 개시된 벡터계에 사용될 수 있다. 특정 관점에서, Sox 및 Oct(바람직하게는 Oct3/4)를 암호화하는 핵산은 재프로그래밍 벡터에 포함될 것이다. 예를 들어, 재프로그래밍 벡터는 Sox2, Oct4, Nanog 및 경우에 따라 Lin28을 암호화하는 발현 카세트 또는 Sox2, Oct4, Klf4 및 경우에 따라 c-myc를 암호화하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 재프로그래밍 인자를 암호화하는 핵산은 동일한 발현 카세트에, 다른 발현 카세트들에, 동일한 재프로그래밍 벡터에 또는 다른 재프로그래밍 벡터들에 포함될 수 있다.
Oct-3/4 및 Sox 유전자 패밀리(Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15)의 특정 구성원은 유도 과정에 관여하는 중요한 전사 조절 요소로서, 그 부재는 유도를 불가능하게 하는 것으로 동정되었다. 하지만, Klf 패밀리(Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 패밀리(C-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 Lin28의 특정 구성원들을 비롯한 다른 유전자들은 유도 효율을 증가시키는 것으로 동정되었다.
Oct-3/4(Pou5f1)는 옥타머("Oct") 전사 인자 패밀리 중 하나로, 만능성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 난할구 및 배아 줄기 세포와 같은 Oct-3/4+ 세포에서 Oct-3/4의 부재는 자발적인 영양세포 분화를 야기하고, Oct-3/4의 존재는 배아 줄기 세포의 만능성 및 분화 잠재성을 발생시킨다. "Oct" 패밀리 중에 다양한 다른 유전자, 예컨대 Oct-3/4의 가까운 관련물인, Oct1 및 Oct6은 유도를 이끌어내지 못하므로, 유도 과정에 Oct-3/4의 배타성을 입증한다.
유전자의 Sox 패밀리는 Oct-3/4와 유사하게 만능성 유지와 관련이 있지만, 만능 줄기 세포에서만 발현되는 Oct-3/4와 달리 다분화능(multipotent) 및 단분화능(unipotent) 줄기 세포와 관련이 있다. Sox2는 문헌[Yamanaka et al.(2007), Jaenisch et al.(1988) 및 Yu et al.(2007)]에 따르면 유도에 사용되는 초기 유전자이지만, Sox 패밀리 중의 다른 유전자들 역시 유도 과정에서 작용하는 것으로 밝혀져 있다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율로 iPS 세포를 생산하고, 유전자 Sox3, Sox15 및 Sox18 역시 효율은 떨어지지만 iPS 세포를 생성한다.
배아 줄기 세포에는 적어도 Oct 구성원, 예컨대 Oct-3/4 및 적어도 Sox 구성원, 예컨대 Sox2가 만능성을 조성하는데 필요하다. 야마나카 등(Yamanaka et al. 2007)은 Nanog가 유도에 불필요하다고 보고한 반면, 유 등(Yu et al, 2007)은 인자들 중 하나로서 Nanog를 이용하여 iPS 세포를 발생시킬 수 있고, Nanog가 재프로그래밍 효율을 용량-의존적으로 확실하게 증가시킨다고 보고했다.
LIN28은 분화 및 증식과 관련이 있는 배아 줄기 세포 및 배아 암종 세포에서 발현되는 mRNA 결합 단백질이다. 유 등(2007)은 LIN28이 불필요하더라도 iPS 생성의 한 인자라는 것을 입증했다.
Klf 패밀리 유전자의 Klf4는 야마나카 등에 의해 처음 동정되고 제니쉬 등(Jaenisch et al.(1988))에 의해 마우스 iPS 세포 발생의 한 인자로서 확인되었으며, 야마나카 등(Yamanaka et al.(2007))에 의해 사람 iPS 세포 발생의 한 인자로서 증명되었다. 하지만, 톰슨 등(Thompson et al.)은 Klf4가 사람 iPS 세포 발생에 불필요하고, 사실상 사람 iPS 세포를 발생시키지 못한다고 보고했다. Klf2와 Klf4는 iPS 세포를 발생시킬 수 있는 인자인 것으로 발견되었고, 관련 유전자인 Klf1과 Klf5도 역시 효율은 낮지만 iPS 세포를 발생시킬 수 있는 인자였다.
Myc 패밀리의 유전자는 암에 관련된 원종양유전자이다. 야마나카 등과 제니쉬 등(1988)은 c-myc가 마우스 iPS 세포의 발생에 관련된 인자인 것을 증명했고, 야마나카 등은 사람 iPS 세포의 발생에 관련된 인자인 것을 증명했다. 하지만, 톰슨 등과 야마나카 등(2007)은 c-myc가 사람 iPS 세포의 발생에 불필요하다고 보고했다. iPS 세포의 유도에 있어서 "myc" 패밀리 유전자의 사용은 임상 치료법으로서 iPS 세포의 예측 못한 사태로 문제가 되어, c-myc-유도된 iPS 세포가 이식된 마우스의 25%는 치명적인 기형종을 발생시켰다. N-myc 및 L-myc는 c-myc 대신에 유사한 효율로 유도하는 것으로 동정되었다.
D. 재프로그래밍 인자를 이용한 만능 줄기 세포의 유도
iPS 세포는 일반적으로 비-만능 세포, 예컨대 성숙 섬유아세포에 특정 줄기 세포-관련 유전자의 형질감염에 의해 유도된다. 형질감염은 일반적으로 현행 관습에 따르면 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터의 통합을 통해 달성된다. 형질감염된 유전자는 마스터 전사 조절 요소 Oct-3/4(Pouf51) 및 Sox2를 포함하지만, 다른 유전자도 유도 효율을 향상시킨다는 것이 시사되어 있다. 결정적인 기간 후, 소수의 형질감염 세포는 만능 줄기 세포와 형태학적 및 생화학적으로 유사해지기 시작하고, 일반적으로 형태학적 선택, 배가 시간 또는 리포터 유전자 및 항생제 감염을 통해 분리된다.
2007년 11월에, 독립적인 두 연구 팀의 연구를 통해(Yu et al., 2007; Yamanaka et al., 2007) 성숙 사람 세포로부터 iPS를 발생시키는 이정표가 달성되었다. 종래 마우스 모델에 사용했던 것과 같은 원리를 이용하여 야마나카는 사람 섬유아세포를 동일한 4가지 중추 유전자, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc와 레트로바이러스 시스템(단, c-Myc는 종양원성이다)을 이용하여 만능 줄기 세포로 성공적으로 형질전환시켰다. 톰슨과 동료들은 c-Myc의 사용을 피하면서 렌티바이러스 시스템을 사용하여 Oct4, Sox2, NANOG 및 다른 유전자 LIN28을 이용했다.
하지만, 유도된 만능 줄기 세포를 발생시키는 현행 방법은 느리고 비효율적이며, 대부분의 세포에서 실패한다. 이 과정의 효율을 향상시키기 위해, 특정 관점으로, 당해 방법과 벡터는 리포터 존재에 대해 선택하여 형질감염 효율을 최적화하기 위해 리포터와 재프로그래밍 인자를 함유하는 폴리시스트론성 작제물을 이용하고, 이후에 전이유전자 사일런싱이 만능 세포에서 매우 효과적이기 때문에 리포터 유전자 발현에 대항한 선택에 의해 만능 세포의 선택을 향상시킨다.
IV . 유도된 만능 줄기 세포를 발생시키기 위한 폴리시스트론성 시스템
본 발명의 특정 관점에서, 이 IRES-의존적 폴리시스트론성 시스템으로부터의 효율적인 발현과 유연성은 이의 장점에 기초가 되고 iPS 세포를 생산하는 효율을 향상시키는 유용한 도구로 확립된다. 이 시스템의 다양한 과돌연변이는 1) 사용된 리포터 변경(예, 청록색 형광 단백질, 적색 형광 단백질 등), 2) 바이러스가 더 적은 수로 합성될 필요가 있도록 리포터 유전자의 다른 재프로그래밍 유전자로의 대체, 또는 3) LTR이 Oct4 IRES Sox-2 IRES eGFP의 발현을 유도할 수 있도록 2개의 IRES를 보유한 카세트의 형성을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, 도 1 참조).
A. 내부 리보솜 진입 부위( IRES )
IRES 서열은 폴리시스트론성 전사체를 만들기 위해 본 발명에 포함되는 것이다. 이 서열은 본 발명의 발현 시스템이 단일 전사 단위로부터 다수의 재프로그래밍 인자를 생산할 수 있게 하거나, 또는 융합 단백질을 형성함이 없이 또는 추가 유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 조절 요소의 필요성 없이 리포터를 폴리시스트론성 전사체 내로 쉽게 혼입시킬 수 있게 한다.
대부분의 진핵생물 메시지 및 바이러스 메시지는 mRNA의 5' 말단에서 7-메틸구아노신 캡의 인식을 수반하는 기전에 의해 해독을 개시한다. 하지만, 몇몇 경우에는 mRNA의 캡 영역으로부터 해독된 유전자의 3' 하류에 위치한 내부 리보솜 진입 부위(IRES)가 리보솜에 의해 인식되는 캡과 무관한 기전을 통해 해독이 일어나서, 전사체로부터 제2 암호화 영역의 해독을 가능하게 한다. 따라서, IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존적 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 피하고 내부 부위에서 해독을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988).
이것은 IRES 서열이 단일 유전자좌로부터 다중 단백질의 동시 발현을 가능하게 하기 때문에 본 발명에 특히 중요하다. IRES 요소는 이종성 개방 판독 프레임에 결합될 수 있다. 다수의 개방 판독 프레임은 함께 전사되고 각각 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론성 메시지를 만들어낼 수 있다. IRES 요소에 의해, 각 개방 판독 프레임은 효율적 해독을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다수의 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 이용하여 효율적으로 발현될 수 있다(예컨대, 참고인용된 미국 특허 5,925,565 및 5,935,819 참조).
특히 바람직한 양태는 동일한 폴리시스트론성 전사체 내에 리포터 및 원하는 재조합 산물에 대한 암호화 서열을 포함하는 것을 수반한다. 성공적인 형질전환 사건은 원하는 재프로그래밍 인자 및 성공적인 형질감염 세포의 선택을 용이하게 하는 쉽게 검출가능한 리포터의 발현에 의해 표시된다.
피코나바이러스 패밀리의 두 구성원(소아마비 및 뇌척수심근염)으로부터의 IRES 요소(Pelletier and Sonenberg, 1998)뿐만 아니라 포유동물 메시지 유래의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)는 개시되어 있다. 특정 예로는 폴리오바이러스 타입 I 유래의 IRES 요소, 뇌척수심근염 바이러스(EMV), "타일러 쥐 뇌척수염 바이러스"(TMEV), "구제역 바이러스"(FMDV), "소 장내바이러스"(BEV), "콕사키 B 바이러스"(CBV), 또는 "사람 라이노바이러스"(HRV)의 5'UTR 또는 "사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질"(BIP) 5'UTR, 초파리 안테나페디아(antennapedia) 5'UTR 또는 초파리 울트라비토락스(ultrabithorax) 5'UTR, 또는 전술한 서열들의 유전자 하이브리드 또는 단편을 포함한다. IRES 서열은 문헌[Kim et al.(1992) 및 McBratney et al.(1993)]에 기술되어 있다.
B. 리포터
본 발명의 특정 양태는 성공적인 형질전환을 나타내는 리포터 유전자를 이용한다. 예를 들어, 리포터 유전자는 발현 카세트 내에, 일반적으로 동시 발현용 재프로그래밍 유전자의 암호화 영역과 관련된 조절 요소의 조절 하에 위치할 수 있다. 리포터는 재프로그래밍 벡터를 함유하는 세포가 세포 생육성을 위협하는 약물이나 다른 선택압 등에 처하지 않고 분리될 수 있게 한다. 추가 장점은 리포터의 사일런싱된 발현으로 유도된 만능 줄기 세포를 농축할 수 있다는 것이다.
이러한 리포터의 예로는 세포 표면 단백질(예, CD4, HA 에피토프), 형광 단백질, 항원 결정인자 및 효소(예, β-갈락토시다제)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 벡터 함유 세포는, 예컨대 벡터에 의해 암호화된 효소에 의해 형광 산물로 변환될 수 있는 기질 또는 세포 표면 단백질에 대한 형광-태그화된 항체를 이용한 FACS에 의해 분리될 수 있다.
특정 양태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질이다. 광범위한 형광 단백질 유전자 변형체는 거의 전 영역의 가시광선 스펙트럼에 걸친 형광 방출 스펙트럼 프로파일을 특징으로 하는 것이 개발되었다(비제한적인 예는 표 1을 참조한다). 본래 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 해파리 녹색 형광 단백질에서의 돌연변이유발 노력은 청색 내지 황색 범위의 새로운 형광 프로브를 산출했고, 이들은 생물학적 연구에서 가장 널리 사용되는 생체내 리포터 분자 중 일부이다. 오렌지색과 적색 스펙트럼 영역에서 방출하는 장파장 형광 단백질은 동물 산호충류에 속하는 산호초, 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 말미잘로부터 개발되었다. 또 다른 종들은 청록색, 녹색, 황색, 오렌지색 및 진홍색 형광을 방출하는 유사 단백질을 생산하는 것으로 조사되었다. 개발 연구 노력은 형광 단백질의 휘도 및 안정성을 향상시키고자 진행중이고, 이에 따라 전반적인 유용성을 향상시키고 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
V. 벡터 작제 및 전달
특정 양태에서, 재프로그래밍 벡터는 이 재프로그래밍 벡터를 세포에서 발현하는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 당해 방법의 신규 특징은 전술한 바와 같은 폴리시스트론성 전사체의 사용으로, 이는 형질전환된 세포 및 유도된 만능 세포의 선택을 용이하게 할 것이다. 이러한 벡터의 작제 및 전달 방법에 대한 상세한 설명은 이하에 개시한다.
A. 벡터
당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하는 준비가 잘 되어 있을 것이다(예컨대, Sambrook et al., 2001 및 Ausubel et al., 1996, 모두 참고 인용됨). 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스), 및 합성 염색체(예, YAC), 예컨대 레트로바이러스 벡터(예, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등), 렌티바이러스 벡터(예, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등에서 유래되는 것), 복제 컴피턴트, 복제 결손성 및 이의 무기력 형태를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하베이(Harvey) 쥐 육종 바이러스 벡터, 쥐 유방종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
바람직한 한 시도에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특히, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 재프로그래밍 체세포에서 성공적으로 사용되었다. 바이러스 벡터는 세포에 효과적으로 형질도입할 수 있고, 자신의 DNA를 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 재조합 바이러스 벡터의 생산에 있어서, 일반적으로 이종(또는 비-천연) 단백질의 유전자 또는 암호화 서열은 비-필수 유전자 대신에 대체된다.
바이러스 벡터는 바이러스 서열을 이용하여 핵산 및 가능하다면 단백질을 세포 내로 도입시키는 발현 작제물의 한 종류이다. 수용체-매개의 세포내이입을 통해 세포로 유입되거나 또는 세포를 감염시키고 숙주 세포 게놈에 통합되어 바이러스 유전자를 안정하고 효율적으로 발현하는 특정 바이러스의 능력은 이종 핵산을 세포(예, 포유동물 세포) 내로 전달하기에 매력적인 후보로 만들었다. 본 발명의 폴리시스트론성 전사체를 전달하는데 사용할 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적 예는 이하에 설명한다.
a. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주 게놈 내로 통합하여, 다량의 이종 유전자 물질을 전달하고, 광범위한 스펙트럼의 종 및 세포 종류를 감염시키고, 특정 세포주 내에 패키징되는 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 가능성이 있다(Miller, 1992).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입되어 복제-결손성인 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해, LTR 및 패키징 성분없이 gag, pol 및 env 유전자를 함유하는 패키징 세포주를 작제한다(Mann et al., 1983). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특정 세포주에 도입될 때(예컨대, 인산칼슘 침전에 의해), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내에 패키징되게 하고, 이후 입자는 배양 배지 중으로 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지는 이후 수집해서, 경우에 따라 농축하고, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 매우 다양한 세포 종류를 감염시킬 수 있다. 하지만, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., 1975).
b. 렌티바이러스 벡터
렌티바이러스는 복잡한 레트로바이러스로서, 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 외에 조절 기능 또는 구조 기능을 가진 다른 유전자를 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 익히 공지되어 있다(예컨대, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; 미국 특허 6,013,516 및 5,994,136 참조).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 핵산 서열의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적당한 숙주 세포가 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat를 운반하는 2 이상의 벡터로 형질감염된, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본 발명에 참고인용된 미국 특허 5,994,136에 기술되어 있다.
B. 조절 요소:
벡터는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나, 또는 표적 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능성을 또한 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는, 예컨대 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분(예컨대, 세포-종류 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후 세포 내에서 폴리뉴클레오타이드의 국재화에 영향을 미치는 성분(예컨대, 핵 국재화를 매개하는 제제); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다.
벡터에 포함된 진핵생물 발현 카세트는 단백질-암호화 서열에 작동가능하게 결합된 진핵생물 전사 프로모터, 중재 서열을 포함하는 스플라이스 시그널, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열(5'에서 3' 방향으로)을 함유하는 것이 바람직하다.
a. 프로모터/ 인핸서
"프로모터"는 개시 및 전사 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이것은 핵산 서열의 특이적 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 인자를 함유할 수 있다. "작동가능하게 위치된", "작동가능하게 결합된", "조절 하에" 및 "전사 조절 하에"란 어구는 프로모터가 전사 개시 및/또는 그 서열의 발현을 조절하기 위해 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 의미한다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성의 출발 부위에 위치하도록 기능하는 서열을 포함한다. 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, TATA 박스가 없는 일부 프로모터, 예컨대 포유동물 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제 유전자의 프로모터 및 SV40 후기 유전자의 프로모터에서는 출발 부위 자체에 중첩하는 별도의 인자가 개시 위치를 고정하도록 돕는다. 다른 프로모터 요소들은 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이 인자들은 출발 부위의 30 내지 110 bp 상류 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터들은 또한 출발 부위의 하류에 기능성 요소를 함유하는 것으로 밝혀져 있다. 암호화 서열을 프로모터의 "조절 하에" 두기 위해, 선택된 프로모터의 "하류"(즉, 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "상류" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소들 간의 간격은 유연성이 있어서, 이 인자들이 서로 역위되거나 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 간의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전인 50 bp 간격까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 인자들은 전사 활성화를 위해 협력해서 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 나타난다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하여 시스(cis)-작용성 조절 서열을 의미하는 "인핸서"와 함께 사용되거나, 함께 사용되지 않아도 좋다.
프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-암호화 서열을 분리하여 수득할 수 있으므로, 핵산 서열에 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라 부를 수 있다. 이와 유사하게, 인핸서는 이 서열의 상류 또는 하류에 위치한, 핵산 서열과 자연 결합된 것일 수 있다. 대안적으로, 암호화 핵산 분절을, 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 결합되어 있지 않은 프로모터를 의미하는 재조합 또는 이종 프로모터의 조절 하에 위치시키면 특정한 장점이 수득될 것이다. 또한, 재조합 또는 이종 인핸서는 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 결합되어 있지 않은 인핸서를 의미한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌, 즉 다른 전사 조절 영역의 다른 인자 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에 가장 통용되는 프로모터로는 β-락타마제(페니실리나제), 락토오스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열은 합성 생산하는 것 외에도, 본 명세서에 개시된 조성물과 연계하여 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술, 예컨대 PCR™을 이용하여 서열을 생산할 수도 있다(예컨대, 참고 인용된 미국 특허 4,683,202 및 5,928,906 참조). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 조절 서열도 이용할 수 있는 것으로 생각된다.
물론, 프로모터 및/또는 인핸서는 발현을 위해 선택한 소기관, 세포 종류, 조직, 기관 또는 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 유도하는 것을 이용하는 것이 중요할 것이다. 분자생물학 기술 분야에 숙련된 자들은 일반적으로 단백질 발현에 사용되는 프로모터, 인핸서 및 세포 종류의 조합을 알고 있다(예컨대, 참고인용된 Sambrook et al., 1989 참조). 이용된 프로모터는 도입된 DNA 분절의 다량 발현을 유도하기에 적당한 조건, 예컨대 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대량 생산에 유리한 조건 하에 유용하고/하거나 구성적이거나, 조직-특이적이거나, 유도성일 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
또한, 발현을 유도하기 위해 임의의 프로모터/인핸서 조합이 사용될 수 있다(예컨대, 진핵생물 프로모터 데이터베이스 EPDB, http://www.epd.isb-sib.ch/에 따라). T3, T7 또는 SP6 세포질 발현계의 이용도 역시 또 다른 가능한 양태이다. 진핵생물 세포는 적당한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가 유전자 발현 작제물로서 제공되면 특정 세균 프로모터로부터 세포질 전사를 지지할 수 있다.
프로모터의 비제한적 예로는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예컨대 SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵생물 세포 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터(Ng, 1989, Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터(Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 연쇄형 반응 요소 프로모터, 예컨대 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르 프로모터(TPA) 및 최소 TATA 박스 부근의 반응 요소 프로모터(tre)를 포함한다. 또한, 사람 성장호르몬 프로모터 서열(예, 진뱅크 수탁번호 X05244, 뉴클레오타이드 283-341에 기술된 사람 성장호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유방종양 프로모터(ATCC 카탈로그 번호 ATCC 45007로부터 입수가능함)를 이용하는 것도 가능하다. 특정 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터일 수 있다.
b. 개시 시그널
특정 개시 시그널도 암호화 서열의 효율적인 해독에 필요할 수 있다. 이 시그널로는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. 외인성 해독 조절 시그널, 예컨대 ATG 개시 코돈도 필요로 할 수 있다. 당업자는 이것을 쉽게 결정하고 필요한 시그널을 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈이 원하는 암호화 서열의 판독 프레임과 "프레임내(in-frame)"여야만 전체 삽입체의 해독이 보장된다는 것은 공지되어 있다. 외인성 해독 조절 시그널 및 개시 코돈은 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소의 혼입에 의해 향상될 수 있다.
c. 다중 클로닝 부위
벡터는, 다수의 제한효소 부위를 포함하고 이 중 임의의 제한효소 부위가 벡터를 분해하는데 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다(예컨대, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, 및 Cocea, 1997, 참고 인용됨). "제한효소 분해"는 핵산 분자 내의 특정 위치에서만 기능하는 효소를 이용한 핵산 분자의 촉매적 분열을 의미한다. 이러한 제한효소들의 대부분은 시판되고 있다. 이러한 효소들의 사용은 당업자에게 널리 알려져 있다. 흔히, 벡터는 MCS 내에서 절단하는 제한효소를 이용해 선형화 또는 단편화되어 외인성 서열이 벡터에 연결될 수 있게 한다. "연결"은 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한효소 및 연결 반응을 수반하는 기술은 재조합 기술분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다.
d. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 1차 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱(splicing)이 일어날 것이다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적당한 프로세싱을 보장하기 위해 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다(예컨대, Chandler et al., 1997, 참고인용됨).
e. 종결 시그널
본 발명의 벡터 또는 작제물은 적어도 하나의 종결 시그널을 포함할 수 있다. "종결 시그널" 또는 "종결인자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이적 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성되어 있다. 따라서, 특정 양태에 따르면, RNA 전사체의 생산을 끝내는 종결 시그널이 고찰된다. 종결인자는 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요로 할 수 있다.
진핵생물 시스템에서, 종결인자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 새로운 전사체의 부위-특이적 절단을 허용하는 특정 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이것은 특수 내인성 폴리머라제에 신호를 보내어 전사체의 3' 말단에 약 200 A 잔기(폴리A)의 스트레치를 첨가하게 한다. 이러한 폴리A로 변형된 RNA 분자는 더욱 안정한 것으로 보이고 더욱 효율적으로 해독된다. 따라서, 진핵생물을 수반하는 다른 양태에서, 종결인자는 RNA 절단을 위한 시그널을 포함하는 것이 바람직하고, 종결인자 시그널이 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더욱 바람직하다. 종결인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 인자는 메시지 수준을 향상시키고 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 작용을 할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위해 고찰된 종결인자는 본 명세서에 기술되거나 또는 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결인자를 포함하며, 예컨대 유전자의 종결 서열, 예컨대 소 성장 호르몬 종결인자 또는 바이러스 종결 서열, 예컨대 SV40 종결인자를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 특정 양태에서, 종결 시그널은 서열 절두 등에 의한 전사가능 또는 해독가능 서열의 결여일 수 있다.
f. 폴리아데닐화 시그널
발현, 특히 진핵생물 발현에서, 전사체의 적당한 폴리아데닐화를 달성하기 위해 보통 폴리아데닐화 시그널을 포함할 것이다. 폴리아데닐화 시그널의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것으로 생각되지 않고, 이러한 모든 서열이 이용될 수 있다. 바람직한 양태는, 다양한 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 알려져 있고 편리한 SV40 폴리아데닐화 시그널 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있고, 또는 세포질 수송을 촉진할 수 있다.
C. 벡터 전달
본 발명을 이용한 재프로그래밍 벡터의 체세포 내로의 도입은 본 명세서에 기술되거나 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 세포를 형질전환하기 위한 핵산 전달에 적합한 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는, DNA의 직접 전달, 예컨대 생체외 형질감염(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), 주사(미국 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각각 참고인용됨), 예컨대 미세주사(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 5,789,215, 참고인용됨); 전기천공(미국 특허 5,384,253, 참고인용됨; Tur-Kaspa et al ., 1986; Potter et al ., 1984); 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　et　al.,　1990); DEAE-덱스트란과 이어서 폴리에틸렌 글리콜의 이용(Gopal, 1985); 직접 초음파 부하(Fechheimer　 et 　 al .,　1987); 리포좀 매개의 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley　 et 　 al .,　1979; Nicolau　 et 　 al .,　1987; Wong　et　al., 1980; Kaneda　 et 　 al .,　1989; Kato　 et 　 al .,　1991) 및 수용체 매개의 형질감염(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 미세발사체 포격(microprojectile bombardment)(PCT 출원 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880, 각각 참고인용됨); 탄화규소 섬유와의 진탕(Kaeppler　 et 　 al .,　1990; 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765, 각각 참고인용됨); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환(미국 특허 5,591,616 및 5,563,055, 각각 참고인용됨); 원형질체의 PEG-매개 형질전환(Omirulleh　 et 　 al .,　1993; 미국 특허 4,684,611 및 4,952,500, 각각 참고인용됨); 건조/억제-매개의 DNA 흡수(Potrykus　 et 　 al .,　1985), 및 상기 방법들의 임의의 조합에 의한 전달을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이와 같은 기술들의 적용을 통해 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
a. 리포좀 -매개의 형질감염
본 발명의 특정 양태에서, 핵산은 리포좀과 같은 지질 복합체에 포획될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다층(multilamellar) 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 보유한다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조를 형성하기 전에 자가-재배열을 경험하고 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한, 리포펙타민(Gibco BRL) 또는 Superfect(Qiagen)와 복합체화된 핵산도 고찰된다. 사용된 리포좀의 양은 사용된 세포뿐만 아니라 리포좀의 성질에 따라 달라질 수 있고, 예컨대 세포 1 내지 107개당 벡터 DNA 약 5 내지 약 20㎍이 고찰될 수 있다.
리포좀-매개의 핵산 전달과 시험관내 이종 DNA의 발현은 매우 성공적이었다(Nicolau and Sene, 1982; Fraley　 et 　 al .,　1979; Nicolau　 et 　 al .,　1987). 또한, 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간암종 세포에서 이종 DNA의 리포좀-매개의 전달 및 발현의 실현가능성은 입증되어 있다(Wong　 et 　 al ., 1980).
본 발명의 특정 양태에서, 리포좀은 혈구응집성 바이러스(HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이것은 세포막과의 융합을 용이하게 하고 리포좀-캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Kaneda et al., 1989). 다른 양태에서, 리포좀은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 이용되거나 복합체화될 수 있다(Kato et al., 1991). 또 다른 양태에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1과 함께 이용되거나 복합체화될 수 있다. 다른 양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포좀을 포함할 수 있다.
b. 전기천공
본 발명의 특정 양태에서, 핵산은 전기천공을 통해 세포 내로 도입된다. 전기천공은 세포와 DNA의 현탁액을 고전압 방전에 노출시키는 것을 수반한다. 수용체 세포는 기계적 상해에 의해 형질전환에 더욱 민감해질 수 있다. 또한, 사용된 벡터의 양은 사용된 세포의 성질에 따라 달라질 수 있고, 예컨대 세포 1 내지 107개당 벡터 DNA 약 5 내지 약 20 ㎍이 고려될 수 있다.
진핵생물 세포의 전기천공을 이용한 형질감염은 꽤 성공적이었다. 이러한 방식으로, 마우스 프리(pre)-B 림프구는 사람 카파-면역글로불린 유전자에 의해 형질감염되었고(Potter et al., 1984), 래트 간세포는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자에 의해 형질감염되었다(Tur-Kaspa et al., 1986).
c. 인산칼슘
본 발명의 다른 양태에서, 핵산은 인산칼슘 침전법을 이용하여 세포로 도입한다. 사람 KB 세포는 이 기술에 의해 아데노바이러스 5 DNA로 형질감염되었다(Graham and Van Der Eb, 1973). 또한, 이 방식으로 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포는 네오마이신 마커 유전자에 의해 형질감염되었고(Chen and Okayama, 1987), 래트 간세포는 다양한 마커 유전자에 의해 형질감염되었다(Rippe et al., 1990).
d. DEAE - 덱스트란
다른 양태에서, 핵산은 DEAE-덱스트란과 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 세포로 전달한다. 이러한 방식으로, 리포터 플라스미드가 쥐 골수종 및 적백혈병 세포 내로 도입되었다(Gopal, 1985).
e. 초음파 부하
본 발명의 추가 양태는 직접 초음파 부하를 이용한 핵산의 도입을 포함한다. LTK- 섬유아세포는 초음파 부하에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염되었다(Fechheimer et al., 1987).
f. 수용체 매개의 형질감염
또한, 핵산은 수용체 매개의 전달 비히클을 통해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이것은 표적 세포에서 일어날 수용체-매개의 세포내이입에 의해 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포-종류-특이적 분포를 고려하여, 이 전달 방법은 본 발명에 다른 정도의 특이성을 부가한다.
특정 수용체-매개의 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체-특이적 리간드 및 핵산-결합 제제를 포함한다. 다른 것은 전달되어야 하는 핵산이 작동가능하게 부착된 세포 수용체-특이적 리간드를 포함한다. 여러 리간드가 수용체-매개 유전자 전달에 사용되었고(Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085), 이것은 이 기술의 사용가능성을 확립해준다. 다른 포유동물 세포 종류의 상황에서의 특이적 전달에 대해서도 기술하고 있다(Wu and Wu, 1994; 참고인용됨). 본 발명의 특정 관점에서, 리간드는 표적 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 수용체에 상응하는 것으로 선택될 것이다.
다른 양태에서, 세포-특이적 핵산 표적화 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포좀과 함께 특이적 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달될 핵산(들)은 리포좀 내에 수용되어 있고, 특이적 결합 리간드는 리포좀 막에 기능적으로 혼입되어 있다. 이에 따라 리포좀은 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합할 것이고 함유물을 세포로 전달할 것이다. 이러한 시스템은 EGF 수용체의 상승조절을 나타내는 세포로 핵산을 수용체-매개 전달하는데 있어서 상피성장인자(EGF)가 사용되는 시스템을 이용할 때 기능적인 것으로 밝혀져 있다.
또 다른 양태에서, 표적화된 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포좀 자체일 수 있는데, 이것은 세포-특이적 결합을 유도하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 갈락토스-말단 아시알강글리오사이드인 락토실-세라미드가 리포좀에 혼입되었고, 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수 증가가 관찰되었다(Nicolau et al., 1987). 본 발명의 조직-특이적 형질전환 작제물은 유사한 방식으로 표적 세포에 특이적으로 전달될 수 있는 것으로 고려된다.
g. 미세발사체 포격
미세발사체 포격 기술은 적어도 하나의 소기관, 세포, 조직 또는 유기체 내로 핵산을 도입시키는데 사용될 수 있다(미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 5,610,042; 및 PCT 출원 WO 94/09699; 각각 참고인용됨). 이 방법은 세포막을 관통하여 세포 사멸없이 세포로 유입될 정도의 고속으로 DNA-코팅된 미세발사체를 가속화하는 능력에 좌우된다(Klein et al., 1987). 매우 다양한 미세발사체 포격 기술이 당업계에 공지되어 있고, 이들 대부분이 본 발명에 적용가능하다.
이러한 미세발사체 포격에서, 하나 이상의 입자는 적어도 하나의 핵산으로 코팅되고 추진력에 의해 세포로 전달될 수 있다. 소립자의 가속화를 위해 여러 장치가 개발되었다. 이러한 한 장치는 최종적으로 추진력을 제공하는 전류를 발생하는 고전압 방전에 의존적이다(Yang et al., 1990). 사용된 미세발사체는 텅스텐 또는 금 입자 또는 비드와 같은 생물학적 불활성 물질로 구성되어 있다. 입자의 예로는 텅스텐, 백금 및 바람직하게는 금으로 구성된 것을 포함한다. 일부 경우에는 미세발사체 포격을 이용한 수용체 세포로의 DNA 전달 시, 금속 입자 위에 DNA 침전이 불필요할 수 있는 것도 고려된다. 하지만, 입자가 DNA로 코팅되기보다 DNA를 함유할 수 있는 것도 고려된다. DNA-코팅된 입자는 입자 포격을 통해 DNA 전달의 수준을 증가시킬 수 있으나, 본래 자체가 반드시 필요하지는 않다.
포격을 위해, 현탁액 중의 세포는 필터 또는 고체 배양 배지 위에 농축한다. 대안적으로, 미성숙 배아 또는 다른 표적 세포는 고체 배양 배지 위에 마련될 수 있다. 포격될 세포는 거대발사체(macroprojectile) 정지판 아래에 적당한 거리를 두고 배치한다.
VI . iPS 세포의 선택
본 발명의 특정 관점에서, 재프로그래밍 벡터가 체세포로 도입된 후, 이 세포는 증대를 위해 배양한다. 세포는 형질감염된 세포의 농축을 위해 리포터 또는 선택 마커와 같은 벡터 인자의 존재에 대해 선택될 수 있다. 이 세포에서 재프로그래밍 벡터는 재프로그래밍 인자를 발현하고 복제하고 세포 분열과 함께 분할한다. 이와 같이 발현된 재프로그래밍 인자는 자립 만능 상태를 설립하기 위해 체세포 게놈을 재프로그래밍하고, 그동안 또는 벡터 존재의 양성 선택의 분리 후, 외인성 유전자 인자가 점차 상실될 것이다. 이러한 전이유전자 발현의 사일런싱은 단지 리포터 유전자 발현의 소실에 대한 유도된 만능 줄기 세포의 선택을 허용하거나, 또는 만능 배아 줄기 세포와 실질적으로 동일한 것으로 생각되기 때문에 다른 배아 줄기 세포 특징에 대한 선택과 함께 유도된 만능 줄기 세포의 선택을 가능하게 한다.
A. 리포터 유전자 발현에 대한 선택
본 발명에서 재프로그래밍 벡터가 도입된 세포는 리포터 및 재프로그래밍 인자를 동시에 발현할 수 있고, 다른 시점에서 리포터 유전자발현의 존재 또는 부재에 대해 선택할 수 있다. 예를 들어, 세포는 리포터의 존재에 대해 선택할 수 있고, 형질감염은 리포터를 이용하여 최적화할 수 있다. 유도된 만능 줄기 세포는 재프로그래밍 동안 전이유전자가 사일런싱된 경우, 리포터의 상실에 대해 선별할 수 있다. 이러한 선택 또는 선별은 전이유전자 발현의 지표로서 리포터 유전자의 발현에 의해 발생된 검출가능한 시그널을 기반으로 한다.
검출가능한 시그널은 본 발명의 방법에 이용된 리포터 유전자의 성질에 따라 다수의 방식 중 어느 한 방식으로 발생될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 시그널은 발광 시그널, 예컨대 형광 시그널, 예컨대 GFP일 수 있다. GFP는 기질이나 보조인자의 필요없이 형광 시그널을 생산하는 형광 폴리펩타이드이다. GFP 발현 및 검출 기술은 당업계에 공지되어 있고, 키트는 클론테크(Clontech) 등에서 판매하고 있다. GFP 발현은 세포를 용해하거나 추가시약을 첨가할 필요없이 본래 세포에서 분석될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 시그널은 효소 활성의 결과로서 또는 세포 표면 마커, 예컨대 LNGFR의 인식의 결과로서 발생된 시그널일 수 있다.
유세포분석법, 예컨대 형광-활성화 세포 분류법(FACS)은 리포터 유전자 발현을 기반으로 한 검출가능한 시그널에 대한 선택을 사용하는 것이 일반적이다. FACS는 불균질 세포 혼합물을 2 이상의 용기로, 각 세포의 특이적 광산란 및 형광 특징에 기초하여 한번에 한 세포씩 분류하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유도된 만능 세포의 물리적 분리뿐만 아니라 각 세포로부터 형광 시그널의 빠르고 객관적이며 정량적인 기록을 제공한다.
또한, 루시퍼라제는 분석의 기본으로 사용될 수 있다. 루시퍼라제 발현은 당업계에 공지되어 있고, 루시퍼라제 발현 및 검출 키트는 클론테크(Palo Alto, Calif.)에서 시판하고 있다. 루시퍼라제의 존재는 섬광 계수로 발광 시그널을 모니터하기 전에 세포 용해 및 세포에 루시페린 기질의 첨가에 의해 유리하게 평가된다.
효소-기반 분석은 검출이 반드시 발광을 통해 이루어지는 것이 아니라는 것을 제외하고는, 루시퍼라제-기반 분석과 유사한 방식으로 수행한다. 검출 기술은 효소에 의존할 것이고, 따라서 광학적일 수 있다(예컨대 β-갈락토시다제의 경우).
또한, 물리적 및 생화학적 방법을 이용하여 본 발명의 리포터 유전자의 발현을 동정하거나 정량분석할 수 있다. 이러한 방법으로는, 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출 및 측정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 작제물의 RNA 전사체를 검출 및 조사하기 위한 노던 블롯, S-1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 유전자 산물이 유전자 작제물에 의해 암호화되는 경우, 효소 활성을 검출하기 위한 효소 분석법; 4) 유전자 작제물 산물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소면역분석법; 및 5) 도입된 유전자 작제물의 발현 결과로서 생산된 화합물의 생화학적 측정이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 특정 세포에서 리포터 유전자의 존재 또는 발현을 검출하기 위해, 원위치 하이브리드화, 효소 염색 및 면역염색 등과 같은 추가 기술이 사용될 수도 있다.
B. 배아 줄기 세포 특성에 대한 선택
종래 연구에서 성공적으로 생성된 iPSC는 다음과 같은 관점에서 자연-분리된 만능 줄기 세포(예컨대, 마우스 및 사람 배아 줄기 세포, mESC 및 hESC)와 현저하게 유사하여, 자연-분리된 만능 줄기 세포에 대한 iPSC의 동일성, 진위성 및 만능성을 확인시켜준다. 따라서, 본 발명에 개시된 방법으로부터 생성된 유도된 만능 줄기 세포는 리포터 유전자 발현의 존재 또는 부재 외에도 다음과 같은 배아 줄기 세포 특성 중 하나 이상의 특성을 기초로 하여 선택할 수 있다.
a. 세포의 생물학적 성질
형태학: iPSC는 ESC와 형태학적으로 유사하다. 각 세포는 둥근 형태에 큰 인과 부족한 세포질을 보유할 수 있다. 또한, iPSC의 콜로니는 ESC 콜로니와 유사할 수 있다. 사람 iPSC는 hESC와 유사한, 날카로운 모서리와 편평하고 치밀하게 채워진 콜로니를 형성하고, 마우스 iPSC는 mESC와 유사하고 hESC보다 덜 편평하고 더 응집된 콜로니를 형성한다.
증식 성질: 배가 시간 및 유사분열 활성은 줄기 세포가 자신의 정의의 일부로서 자기-재생해야 하므로, ESC의 초석이다. iPSC는 ESC와 동일한 속도로 유사분열적으로 활성이고, 활발하게 자기-재생, 증식 및 분열할 수 있다.
줄기 세포 마커: iPSC는 ESC에서 발현된 세포 표면 항원 마커를 발현할 수 있다. 사람 iPSC는 hESC에 특이적인 마커, 예컨대 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E 및 Nanog를 포함한, 이에 국한되지 않는 마커를 발현했다. 마우스 iPSC는 mESC와 유사하게 SSEA-1을 발현하지만, SSEA-3 및 SSEA-4는 발현하지 않았다.
줄기 세포 유전자: iPSC는 미분화 ESC에서 발현된 유전자를 발현할 수 있으며, 그 예로는 Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT를 포함한다.
텔로머라제 활성: 텔로머라제는 약 50회 세포 분열의 헤이플릭(Hayflick) 한계에 의해 제한되지 않고 세포 분열을 지속하는데 필수적이다. hESC는 자기-재생 및 증식을 지속하기 위해 높은 텔로머라제 활성을 발현하고, iPSC 역시 높은 텔로머라제 활성을 나타내고 텔로머라제 단백질 복합체의 필수 성분인 hTERT(사람 텔로머라제 역전사효소)를 발현한다.
만능성: iPSC는 ESC와 유사한 방식으로 완전 분화 조직으로 분화할 수 있을 것이다.
신경 분화: iPSC는 βIII-튜불린, 티로신 하이드록실라제, AADSC, DAT, ChAT, LMX1B 및 MAP2를 발현하는 뉴런으로 분화될 수 있다. 카테콜아민-결합 효소의 존재는 hESC와 같이 iPSC가 도파민작용성 뉴런으로 분화될 수 있다는 것을 시사할 수 있다. 줄기 세포-관련 유전자는 분화 후에 하향조절될 것이다.
심장 분화: iPSC는 자발적으로 박동하기 시작한 심근아세포(cardiomyocyte)로 분화될 수 있다. 심근아세포는 TnTc, MEF2C, MYL2A, MYHCβ 및 NKX2.5를 발현했다. 줄기 세포-관련 유전자는 분화 후에 하향조절될 것이다.
기형종 형성: 면역결핍 마우스에 주사된 iPSC는 특정 시점 후, 예컨대 9주 후에 기형종을 자발적으로 형성할 수 있다. 기형종은 3개의 배엽 층, 내배엽, 중배엽 및 외배엽에서 유래된 조직을 함유하는 다중 계열의 종양이다; 이것은 일반적으로 하나의 세포 종류로만 이루어진 다른 종양과 다르다. 기형종 형성은 만능성에 대한 대표적인 검사이다.
배상체: hESC는 배양물에서 "배상체"라 불리는 공처럼 생긴 배아-유사 구조를 자발적으로 형성하며, 이 배상체는 유사분열 활성이고 분화성 hESC의 코어(core)와 3개의 배엽층 전부로부터 완전 분화된 세포 주변으로 이루어진다. iPSC 역시 배상체를 형성할 수 있고 말초 분화 세포를 보유한다.
포배 주사: hESC는 본래 포배의 내세포괴(배아모체) 내에 존재하고, 배아모체에서 배아로 분화하면서 포배 껍질(영양막)이 배아외 조직으로 분화한다. 중공의 영양막은 생 배아를 형성할 수 없고, 이에 따라 배아모체 내에서 배아 줄기 세포가 분화하여 배아를 형성하는 것이 필요하다. 수용체 암컷으로 전달된 포배를 생성하기 위해 영양막 내로 마이크로피펫에 의해 주입된 iPSC는 키메라성 생 마우스 새끼, 즉 전신에 혼입된 iPSC 유도체가 10 내지 90%이고 키메라성인 마우스를 산출한다.
b. 후생적 재프로그래밍
프로모터 탈메틸화: 메틸화는 DNA 염기에의 메틸 그룹의 전달, 일반적으로 CpG 부위(인접 사이토신/구아닌 서열) 내의 사이토신 분자에 메틸 그룹의 전달을 의미한다. 유전자의 광범위한 메틸화는 발현 단백질의 활성을 차단하거나 발현을 방해하는 효소를 보강하여 발현을 방해한다. 따라서, 유전자의 메틸화는 전사를 차단하여 유전자를 효과적으로 사일런싱시킨다. 내인성 만능-관련 유전자의 프로모터, 예컨대 Oct-3/4, Rex1 및 Nanog는 iPSC에서 탈메틸화되어, iPSC에서 자신의 프로모터 활성 및 만능-관련 유전자의 활성 촉진 및 발현을 보여준다.
히스톤 탈메틸화: 히스톤은 다양한 염색질-관련 변형을 통해 활성에 영향을 미칠 수 있는 DNA 서열에 구조적으로 국재화된 조밀한 단백질이다. Oct-3/4, Sox2 및 Nanog와 결합된 H3 히스톤은 Oct-3/4, Sox2 및 Nanog의 발현을 활성화하기 위해 탈메틸화될 수 있다.
VII . iPS 세포의 배양
개시된 방법을 이용하여 체세포에 재프로그래밍 벡터를 도입한 후, 이 세포를 만능을 유지하기에 충분한 배지에서 배양할 수 있다. 본 발명에서 생성된 유도된 만능 줄기(iPS) 세포의 배양은, 미국 특허출원 20070238170 및 미국 특허출원 20030211603에 기술된 바와 같이 영장류 만능 줄기 세포, 더 구체적으로 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술을 이용할 수 있다.
예를 들어, 사람 배아 줄기(hES) 세포와 같이, iPS 세포는 80% DMEM(Gibco #10829-018 또는 #11965-092), 열불활성화되지 않은 20% 한정 소 태아 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산, 1mM L-글루타민 및 0.1mM β-머캅토에탄올에서 유지될 수 있다. 대안적으로, ES 세포는 80% 녹아웃 DMEM(Gibco #10829-018), 20% 혈청 대체제(Gibco #10828-028), 1% 비필수 아미노산, 1mM L-글루타민 및 0.1mM β-머캅토에탄올로 제조된 무혈청 배지에서 유지될 수 있다. 사용 직전, 사람 bFGF는 약 4ng/ml의 최종 농도로 첨가한다(WO 99/20741).
ES 세포와 같이 iPS 세포는 면역조직화학 또는 유세포분석법으로 SSEA-1, SSEA-3 및 SSEA-4(Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Chile Health and Human Development, Bethesda, Md.) 및 TRA-1-60 및 TRA-1-81(Andrews et al., 1987)에 대한 항체를 이용하여 동정할 수 있는 특징적인 항원을 보유한다. 배아 줄기 세포의 만능성은 8 내지 12주령 수컷 SCID 마우스의 뒷다리 근육에 약 0.5 내지 10 x 106 세포를 주사하여 확인할 수 있다. 3개의 배엽 층 각각의 하나 이상의 세포 종류를 나타내는 기형종이 발생한다.
VIII . 실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된 것이다. 당업자라면, 이하 실시예에 개시된 기술들이 본 발명을 실시하는데 잘 작용하는 것으로 본 발명자가 발견한 기술을 나타내며, 이에 따라 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각될 수 있다. 하지만, 당업자는 본 발명의 개시에 비추어 볼 때, 개시되고 본 발명의 취지와 영역에서 벗어남이 없이 같거나 유사한 결과를 수득하는 특정 양태들에 많은 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1 - 레트로바이러스 벡터의 작제
재프로그래밍 유전자와 선택 마커가 도입된 모 레트로바이러스 벡터는 종래 문헌[Kennedy et al.(2003)]에 언급되어 있다. 간략히 설명하면, 최소 벡터는 5' 및 3' MMLV 긴 말단 반복 영역(LTR)을 함유하고, 5' LTR은 재프로그래밍 및 선택에 필요한 유전자의 발현을 유도하는데 사용된 프로모터를 함유한다(도 1). 편리하게는, 5' LTR의 바로 상류에 위치하는 사이토메갈로바이러스 프로모터는 일시적 형질감염에 레트로바이러스 플라스미드가 사용될 수 있게 하지만, 바이러스 합성의 주형으로서 플라스미드가 사용될 때에는 비기능성을 유지하게 할 것이다.
도 1에 제시된 바와 같이, Sox-2, Nanog, Oct4 및 Lin28은 각각 역시 형광 단백질을 암호화하는 MMLV-기반의 레트로바이러스 골격(backbone)에 도입시켰다. Sox-2 및 Oct4는 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP)에 대한 발현을 암호화하는 레트로바이러스 골격에 배치하고, Nanog 및 Lin28은 단량체성 적색 형광 단백질(mRFP) 발현 능력이 있는 골격에 배치했다. 재프로그래밍 유전자를 암호화하는 전사체의 해독은 정규 ATG 개시 코돈에서 개시되며, 하류 형광 단백질은 뇌척수심근염 바이러스 유래의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 통해 해독된다.
실시예 2 - 레트로바이러스 벡터를 이용한 바이러스 생성
레트로바이러스 벡터는 다음과 같은 방식으로 바이러스 생성에 사용했다. 먼저, Sox-2, Oct4, Nanog 또는 Lin-28을 암호화하는 4가지 레트로바이러스 벡터 각각을 별도의 형질감염으로 제조했다. 각 레트로바이러스 벡터 10 ㎍을 수포성 구내염 바이러스-위형 당단백질(1 ㎍), Gag 폴리머라제(3 ㎍) 및 NFkB(1 ㎍)를 암호화하는 DNA와 각각 혼합했다. 그 다음, DNA를 500 ㎕의 OptiMem과 혼합했다. 이와 별도로, 폴리에틸렌이민(1mg/ml) 40 ㎕를 500 ㎕ OptiMem과 혼합했다. 그 다음, DNA/OptiMem 혼합물과 PEI/OptiMem 혼합물은 실온에서 5분 동안 항온처리한 후, 배합하여 약 1ml의 용액으로 만들고, 이는 실온에서 적어도 20분 동안 항온처리해야 한다.
본 발명자들은 형질감염일에 세포 약 80%가 융합성일 정도의 희석률로 형질감염하기 1일 전에 분리한 SV40 T-항원 단백질을 과잉발현하는 293 세포를 형질감염시킨다. 형질감염일에, 세포는 1x PBS로 세척하고, 그 후 OptiMem 또는 DMEM(혈청 및 항생제-무함유)을 첨가했다. 20분 항온처리 기간 동안 친지성 복합체가 형성된 후, DNA 복합체(1ml)를 세포에 적가했다. 배지는 DMEM, 10% 소 태아 또는 송아지 혈청 및 50mM Hepes 완충 식염수로 37℃에서 항온배양 후 4시간째 교환했다. 바이러스는 형질감염된 평판으로부터 배지 5ml를 수집하여 형질감염 48시간 후 수거했다. 바이러스-함유 배지는 그 다음 1000 rpm으로 5분동안 스핀다운시켜 세포 파편을 제거하고 배지는 45㎛ 주사기 필터를 통해 여과했다.
실시예 3 - 감염 및 세포 평판배양
감염 및 재프로그래밍이 일어나게 하는 환경으로의 전이를 수반하는 절차는 2가지 방법 중 한 방법에 따라 수행했다. 한 방법은 감염과 재프로그래밍을 위한 광조사된 MEF 상에서의 감염 및 미감염 세포의 평판배양을 수반했고, 다른 방법은 재프로그래밍 효율을 향상시키기 위한 노력으로 MEF 상의 분류에 의해 감염 세포만을 평판배양하는 것을 수반했다.
방법 1: 재프로그래밍 유전자를 발현하는 바이러스로 감염된 재프로그래밍 미분류 IMR -90 세포
IMR-90 세포는 감염을 위한 수용체 숙주로 성공적으로 사용되었으나, 이 프로토콜은 원시 피부 세포 및 조혈 세포와 같은 대체 세포 타입의 감염에 대해 개조할 수 있다. 약 50,000개 IMR-90 세포를 감염 72시간 전에 6웰 평판의 각 웰에 접종했다. 세포의 다른 평판은 각 바이러스에 대한 감염 효율을 측정하는데 사용하기 위해 준비했다. 예를 들어, 한 웰의 세포는 다중 바이러스가 아닌 단일 바이러스에 대한 수용체가 되었다. 감염은 형질감염된 293T 세포로부터 갓 수거한 바이러스를 이용하여 1 내지 10 범위의 감염다중도(MOI)로 수행했다. MOI 범위는 바이러스 생산을 위한 형질감염과 형질감염 사이에 고유 가변성 때문이다.
감염은 6웰 평판 내에서 먼저 배지를 제거하고, 동일 용적의 4가지 바이러스 각각을 배지 1ml 당 약 5 x 104 내지 1 x 105 세포의 최종 농도로 교체했다(즉, 최종 용적 2ml 당 각 바이러스 500㎕). 세포는 점착성을 유지했고 4℃에서 2시간 동안 진동 플랫폼 위에 놓고 37℃, 5% CO2 하에 방치했다. 대안적으로, 세포는 감염 효율에 큰 영향을 미침이 없이 항온배양기에 바로 넣을 수도 있다. 감염일은 시점 0으로 간주하고 그 후 매일은 감염후로 간주했다. 감염된 세포는 그 후 48시간 동안 항온배양하고, 이 시점에 6웰 평판의 각 웰에서 4가지 바이러스 전부로 감염된 세포를 0.2 내지 0.5ml의 0.05% 트립신-EDTA로 수거했다. 세포는 모아서, 수집하고 10% FBS(M10F)가 첨가된 최소 필수 배지로 10 내지 15ml 용적으로 만들었다. 이것을 1000 rpm으로 5분 동안 침전시키고, 상청액은 모으고, 세포는 항생제 무첨가 M10F 10ml에 재현탁시킨 후, 광조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 단층 위에 평판배양했다.
MEF는 0.1% 젤라틴 코팅된 10cm 평판에 평판배양하고, 3일 후 감염된 IMR-90 세포를 약 7.5 x 104 세포/ml의 밀도로 첨가했다. MEF 평판배양한 다음날, 배지를 제거하고 FGF가 첨가되지 않은 사람 ES(hES) 배지(80% DMEM-F12; 20% Knock-out Serum Replacer; 1% 비필수 아미노산; 1mM L-글루타민; 0.1mM b-머캅토에탄올)로 대체했다. 평판배양 후 3일째, MEF는 1 x PBS(Ca 및 Mg-무함유)로 한번 세척하고, 10ml M10F에 재현탁된 감염된 IMR-90 세포를 MEF 위에 접종했다. 밤새 항온배양하여 IMR-90 세포를 점착성이 되게 하고, 배지를 100 ng/ml 제브라피쉬 FGF를 함유하는 조정 배지(CM) 10ml로 교체했다(감염후 3일을 나타낸다). CM은 hES 배지를 고밀도 광조사된 MEF 베드 위에서 밤새 항온처리하고 수집한 뒤, 100ng/ml zFGF를 보충하여 제조했다. 감염된 IMR-90 세포는 그 후 소비된 배지를 zFGF가 첨가된 새 CM 10ml로 교체하여 매일 영양을 공급했다.
방법 2: 재프로그래밍 유전자를 발현하는 바이러스로 감염된 재프로그래밍 분류 IMR -90 세포
감염은 2개의 전체 6웰 평판에 웰당 5 x 104 IMR-90 세포를 감염전에 접종한 것을 제외하고는 방법 1에 제시된 바와 같이 수행했다. 감염된 세포의 더 큰 풀(pool)은 분류를 용이하게 할 뿐만 아니라 분류 후 생육성을 향상시킨다. 분류를 위한 준비에서 IMR-90 세포를 함유하는 모든 웰은 트립신으로 수거하고 방법 1에 제시된 바와 같이 감염 후 3일째 수집했다. 수집한 세포는 덩어리를 없애기 위해 여과하고 분류 시까지 얼음 위에 방치했다.
선택된 세포를 M20F/50mM Hepes 완충액을 함유하는 15ml 원추형 관에 분류하기 위해 팁 크기가 10미크론인 25 psi 압력 하의 FACs DIVA를 이용했다. 분류는 Oct4 및 Sox-2 발현 농도와 상관성이 있는 저 농도 내지 중간 농도의 eGFP 및 Nanog 및 Lin28의 농도와 상관성이 있는 저 농도 내지 중간 농도의 mRFP를 기반으로 했다. 또한, 본 발명자들은 본 실험을 Lin28의 부재 하에도 수행했으며, 이 경우에 다양한 농도의 Nanog를 발현하는 세포가 특별히 분류될 수 있다. 재프로그래밍 효율은 Nanog의 증가량과 상관성이 있고, 이에 따라 mRFP 강도에 의해 반영되는 중간 내지 고 농도의 Nanog를 발현하는 세포가 분류되었다.
평균적으로, FAC에 의해 결정되는 바와 같은 eGFP 또는 mRFP에 양성인 세포의 비율에 따라 약 85%의 IMR-90 세포를 각 바이러스로 감염시키고, 약 3 x 104 내지 2 x 105 세포를 수집했다. 세포는 얼음 위에 방치하고 분류 동안 냉각한 후 평판배양했다. 같은 날, 분류된 세포는 총 용적이 10ml인 M10F에 넣고, 그 후 약 7.5 x 104 세포/ml의 밀도로 1 내지 6일 전에 평판화한 광조사된 MEF 단층에 주입했다. 분류 후 회수 및 부착을 위해 세포는 3일 이상 동안 M10F(항생제 무첨가) 중의 MEF 상에서 배양했다.(MEF는 방법 1에 기술된 바와 같이 준비했다). 감염 후 6일째, 100 ng/ml 제브라피쉬 FGF가 보충된 10ml CM을 M10F 대신 사용하고 재프로그래밍된 콜로니가 형성될 때까지 매일 보충했다.
실시예 4 - 재프로그래밍된 세포의 선택
재프로그래밍된 세포는 먼저 형태학뿐만 아니라 eGFP 및 mRFP 발현의 상실로 동정했다. 콜로니는 확대된 핵과 다수의 인을 보유한 고 치밀성 세포를 함유했다. 현재, 본 발명자들은 감염 후 20 내지 40일 범위의 시간틀 안에서 콜로니를 취했다. 콜로니는 수작업으로 선택하고 광조사된 MEF(7.5 x 104 세포/ml)를 함유하는 웰(48, 24 내지 6웰)로 이동시켰다. 이동 후 다음날에는 영양공급을 하지 않고, 다음 날 CM 공급을 매일 재개하여 콜로니를 분할 및 동결에 충분한 수로 증대시켰다. iPS 클론은 세포 표면 마커(즉, SSEA 3, SSEA 4, Tra-1-60, SSEA 1 및 Oct4)를 이용하여 추가로 특성규명하고, 뿐만 아니라 염색체 내의 임의의 이상을 동정하기 위해 핵형분석했다.
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 양태들에 의거해 설명했지만, 당업자에게는 변경이 본 명세서에 기술된 방법 및 방법의 단계 또는 방법 단계들의 순서에 본 발명의 개념, 취지 및 범위 안에서 적용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 더 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련이 있는 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있으면서 본 명세서에 기술된 제제 대신에 대체될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 당업자에게 명백한 모든 유사 대체 및 변형은 첨부되는 특허청구범위에서 정의하는 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주한다.
참고문헌
다음 참고문헌은 예시적 절차를 제공하거나 또는 본원에 제시된 것에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 정도로, 구체적으로 본원에 참고 인용된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007

Claims (36)

  1. (a) 전사 조절 요소; 및
    (b) 상기 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합된 제1 및 제2 암호화 서열(여기서, 상기 제1 암호화 서열은 재프로그래밍(reprogramming) 인자를 암호화하고 상기 제2 암호화 서열은 제2 재프로그래밍 인자 또는 리포터를 암호화한다)
    을 포함하는 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 재프로그래밍 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 긴 말단 반복 영역(LTR)을 포함하는, 재프로그래밍 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 암호화 서열이 리포터를 암호화하는, 재프로그래밍 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 암호화 서열이 제2 재프로그래밍 인자를 암호화하는, 재프로그래밍 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발현 카세트가 상기 전사 조절 요소에 작동가능하게 결합된 제3 암호화 서열을 추가로 포함하고, 상기 제3 암호화 서열이 재프로그래밍 인자, 리포터 또는 선택 마커를 암호화하는, 재프로그래밍 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제3 암호화 서열이 선택 마커를 암호화하는, 재프로그래밍 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 선택 마커가 항생제 내성 마커인, 재프로그래밍 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포터가 세포 표면 마커, 형광 단백질, 에피토프, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 또는 β-갈락토시다제인, 재프로그래밍 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질이 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 청색 형광 단백질(BFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)인, 재프로그래밍 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 암호화된 재프로그래밍 인자가 Sox, Oct, Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc인, 재프로그래밍 벡터.
  11. 제10항에 있어서, Sox가 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 또는 Sox-18인, 재프로그래밍 벡터.
  12. 제10항에 있어서, Oct가 Oct-4인, 재프로그래밍 벡터.
  13. 제10항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자가 Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc인, 재프로그래밍 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인, 재프로그래밍 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인, 재프로그래밍 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MMLV), Akv-MLV 또는 SL-3-3-MLV인, 재프로그래밍 벡터.
  17. 제14항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 재프로그래밍 벡터.
  18. 제1항에 있어서, 상기 발현 카세트가 하나 이상의 IRES를 추가로 포함하는, 재프로그래밍 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 IRES가 뇌척수심근염 바이러스 IRES, 피코나바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, A형 간염 바이러스 IRES, C형 간염 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 IRES, 폴리오바이러스 IRES, 돼지 수포성 질환 바이러스 IRES, 순무 모자이크 포티바이러스 IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, 페스티바이러스 IRES, 레이슈마니아 RNA 바이러스 IRES, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 IRES, 사람 라이노바이러스 14 IRES, 아프토바이러스 IRES, 사람 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 mRNA IRES, 초파리 안테나페디아(Antennapedia) mRNA IRES, 사람 섬유아세포 성장인자 2 mRNA IRES, G형 간염 바이러스 IRES, 토바모바이러스 IRES, 혈관 내피세포 성장인자 mRNA IRES, 콕사키 B 그룹 바이러스 IRES, c-myc 원종양유전자 mRNA IRES, 사람 MYT2 mRNA IRES, 사람 파레코바이러스 타입 1 바이러스 IRES, 사람 파레코바이러스 타입 2 바이러스 IRES, 진핵생물 개시 인자 4GI mRNA IRES, 갈색날개노린재 장 바이러스 IRES, 타일러 쥐 뇌척수염 바이러스 IRES, 소 장내바이러스 IRES, 코넥신 43 mRNA IRES, 호메오도메인 단백질 Gtx mRNA IRES, AML1 전사인자 mRNA IRES, NF-카파 B 억제인자 mRNA IRES, 아폽토시스의 X-연관 억제제 mRNA IRES, 귀뚜라미 마비병 바이러스 RNA IRES, p58(PITSLRE) 단백질 키나제 mRNA IRES, 오르니틴 데카르복실라제 mRNA IRES, 코넥신-32 mRNA IRES, 소 바이러스 설사 바이러스 IRES, 인슐린-유사 성장인자 I 수용체 mRNA IRES, 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 gag 유전자 IRES, 고전적 돼지열바이러스 IRES, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 IRES, 랜덤 올리고뉴클레오타이드 라이브러리에서 선택되는 짧은 IRES, 젬브라나병 바이러스 IRES, 아폽토시스 프로테아제-활성화 인자 1 mRNA IRES, 기장테두리진딧물 바이러스 IRES, 양이온성 아미노산 트랜스포터 mRNA IRES, 사람 인슐린-유사 성장인자 II 리더 2 mRNA IRES, 지아디아바이러스 IRES, Samd5 mRNA IRES, 돼지 테스코바이러스-1 탈판 IRES, 초파리 무모(Hairless) mRNA IRES, hSNM1 mRNA IRES, Cbfa1/Runx2 mRNA IRES, 엡스타인-바르 바이러스 IRES, 히비스커스 퇴록둥근무늬병 바이러스(hibiscus chlorotic ringspot virus) IRES, 래트 뇌하수체 바소프레신 V1b 수용체 mRNA IRES, 및 사람 hsp70 mRNA IRES로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 재프로그래밍 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 IRES가 뇌척수심근염 바이러스 IRES인, 재프로그래밍 벡터.
  21. (a) 제1항 내지 제20항에 따른 하나 이상의 재프로그래밍 벡터를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 재프로그래밍 벡터를 체세포 집단의 세포 내에 도입시켜, 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 집단을 제공하는 단계
    를 포함하는, 유도된 만능 줄기(iPS) 세포 집단을 생산하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (c) 상기 세포를 배양하여 상기 집단을 증대시키는 단계; 및
    (d) 상기 증대된 집단에서 배아 줄기 세포의 하나 이상의 특징을 가진 자손 세포를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 단계 c)가 상기 리포터를 발현하는 상기 체세포 집단을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 단계 c)에서의 선택이 형광-활성화 세포 분류법(FACS), CAT 분석법 또는 발광 분석법을 포함하는 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    (e) 상기 선택한 자손 세포를 배양하여 iPS 세포 집단을 제공하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 재프로그래밍 벡터가, Sox 및 Oct를 포함하는 재프로그래밍 인자를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 재프로그래밍 벡터가 리포좀 형질감염, 전기천공, 입자충격, 인산칼슘, 폴리양이온(polycation) 또는 폴리음이온(polyanion)에 의해 상기 세포 내로 도입되는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 체세포가 포유동물 체세포인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 체세포가 사람 체세포인 방법.
  30. 제21항에 있어서, 상기 체세포가 섬유아세포, 조혈세포 또는 중간엽 세포인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 체세포가 섬유아세포인 방법.
  32. 제22항에 있어서, 상기 특징이 상기 리포터의 본질적 상실, 미분화된 형태, 배아 줄기 세포-특이적 마커 또는 만능성인 방법.
  33. 제22항에 있어서, 상기 특징이 상기 리포터 발현의 본질적 상실인 방법.
  34. 제22항에 있어서, 상기 특징이 형광-활성화 세포 분류법(FACS), CAT 분석법 또는 발광 분석법에 의해 선택되는 방법.
  35. 제22항에 있어서, 상기 특징이 미분화된 형태인 방법.
  36. 제22항에 있어서, 상기 특징이 SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 또는 Tra-1-81, Tra-2-49/6E, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 hTERT로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 배아 줄기 세포-특이적 마커인 방법.
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