KR20220024104A - 파킨슨병을 위한 자가 세포 대체 요법 - Google Patents

파킨슨병을 위한 자가 세포 대체 요법 Download PDF

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Abstract

파킨슨병에서 자가유래 세포 요법에 유용한 중뇌 도파민 (mDA) 뉴런 전구 세포를 생성하는 방법, 상기 세포를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법.

Description

파킨슨병을 위한 자가 세포 대체 요법
우선권 주장
본 출원은 2019년 5월 23일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/852,008, 및 2019년 12월 18일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/949,906의 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 NS070577 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
기술 분야
본원에서는 파킨슨병 (PD)에서 자가유래 세포 요법에 유용한 중뇌 도파민 (mDA) 뉴런 전구 세포를 생성하는 방법, 세포를 포함하는 조성물, 및 그의 사용 방법을 기술한다.
운동계 및 비운동계 병리 둘 모두를 특징으로 하는 파킨슨병 (PD)은 알츠하이머병 다음으로 두 번째로 가장 흔한 신경변성 장애이다. 60세 초과 인구의 약 1%가 이환되고 있고, 2030년까지 전 세계적으로 1,400만 명이 넘는 사람들이 PD를 앓을 것으로 예상되며, 인구 고령화에 따라 PD의 유병률은 증가하는 사회적 부담을 나타낸다 (1). 1960년대에 도입된 이후로 도파민 (DA) 대체 요법 (예컨대 L-DOPA 및 DA 효능제)은 여전히 최적의 표준 약리학적 치료로 남아 있다. PD 환자의 삶의 질을 유의하게 향상시키지만, 이들 약물의 장기간 사용은 보통 (>80%) 운동이상증 및 운동 변동과 같은 바람직하지 않은 부작용을 초래한다 (2).
파킨슨병 (PD)은 흑색질에서 중뇌 도파민 (mDA) 뉴런의 변성에 이차적으로 발생하는 선조체 도파민 손실과 연관된 일반적인 신경변성 장애로, 이로 인해 세포 이식이 유망한 치료 전략법이 된다. PD를 위한 인간 유도 만능성 줄기 세포 (hiPSC) 기반 자가유래 세포 요법을 확립하기 위해, 본 발명자들은 안전하고, 효과적인 치료제로서 mDA 전구체 생산을 위한 핵심 기술의 플랫폼을 개발하였다. 첫째, 본 발명자들은 대사 조절 마이크로RNA를 리프로그래밍 인자와 조합하여 게놈 보존 및 비편향적인 만능성 잠재력으로 입증된 바와 같이 임상 등급 iPSC를 더욱 효율적으로 생성하는 방법을 개발하였다. 둘째, 본 발명자들은 세포 손실은 유의하게 더 적게 감소된 상태로, 확장가능한 방식으로 기능적이고 건강한 mDA 세포를 생성하는 "스폿팅" 기반 시험관내 분화 방법을 확립하였다. 셋째, 본 발명자들은 신생물성 잠재력이 있는 미분화 세포를 최종 생성물로부터 매우 효율적으로 안전하게 제거하는 화학적 방법을 개발하였다. 이러한 방식으로 생성된 도파민성 세포는 높은 수준의 특징적인 mDA 마커를 발현하고, 도파민을 생성 및 분비하며, mDA 세포의 전형적인 전기생리학적 특징을 나타낸다. 추가로, PD의 설치류 모델에 이들 세포를 이식한 결과, 이식된 세포의 재분포 또는 종양 형성의 증거는 보이지 않으면서, 숙주 뇌에 현저한 신경재분포와 함께 운동 기능장애를 강건하게 회복시켰다. 추가로, PD를 앓고 있는 인간에게 상기 방법을 사용하여 유래된 세포를 이식하면, 질환 프로세스는 정지되고, 아마도 역전될 수 있을 것으로 보인다 (실시예 10 참조). 따라서, 상기 플랫폼은 PD를 위한 개인맞춤화된, 자가유래, 세포 대체 요법의 성공적인 구현에 적합하다.
따라서, 본원에서는 분화된 세포 집단, 예컨대 뉴런, 예컨대 중뇌 도파민성 전구 세포 (mDAP)를 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC), 바람직하게는 인간 iPSC의 집단을 제공하는 단계; 영역당 약 5,000-20,000개, 예컨대 약 10,000개 세포의 밀도로 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체에서 영역 사이의 격리를 유지하는 데 충분한 거리를 영역 사이에 두고 별개의, 개별적인, 바람직하게는 실질적으로 원형인 영역 ("스폿")에 세포 집단을 플레이팅하는 단계; 및 iPSC가 예컨대 뉴런, 예컨대 mDAP로 분화하는 데 충분한 조건하에서 세포를 유지시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체는 기저막 추출물 또는 합성 매트릭스이다.
일부 실시양태에서, 플레이팅 이전에 세포를 겔 중에, 예컨대 약 10 ㎕의 겔 중에 현탁시킨다.
일부 실시양태에서, 영역의 직경은 약 2-10 mm, 예컨대 약 5 mm이다.
일부 실시양태에서, 영역 사이의 거리는 1-3 cm이다.
일부 실시양태에서, iPSC는 알칼리성 포스파타제 (AP) 및 TRA-1-60을 발현한다.
일부 실시양태에서, mDAP는 FOXA2, OTX2, LMX1A, 및/또는 EN1, 바람직하게는 적어도 FOXA2 및 LMX1A를 포함하는 1, 2개 또는 그 초과의 마커를 발현하고; 임의적으로 여기서 mDAP는 FOXA2, LMX1A 및 NURR1을 공동 발현하는 TH+ 세포이다.
일부 실시양태에서, iPSC는 대상체로부터 1차 세포 집단을 수득하는 단계이며, 바람직하게는 여기서 1차 세포는 섬유모세포, 모발 각질세포, 혈액 세포, 또는 골수 중간엽 줄기 세포 (MSC)인 단계; 세포에서 적어도 OCT4, KLF4, 및 SOX2, 및/또는 L-MYC, 및/또는 C-MYC의 발현을 유도하는 단계; 및 1차 세포가 iPSC가 되는 데 충분한 조건하에서 세포를 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, 적어도 OCT4, KLF4, 및 SOX2, 및/또는 L-MYC, 및/또는 C-MYC의 발현을 유도하는 단계는 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 및 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및/또는 L-MYC 코딩 서열, 및/또는 C-MYC 코딩 서열을 포함하는 폴리시스트론 에피솜 벡터로 1차 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, iPSC는 miR-106a, -106b, -136s, -200c, -302s, -369s, 및 -371/373으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 마이크로RNA (miRNA)를 세포에서 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. miR-302s는 302a, 302b, 302c, 302d, 및 367을 포함하는 5개의 miRNA를 포함하는 miR-302 클러스터를 나타낸다.
일부 실시양태에서, miRNA는 miR-302s 및 miR-200c 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 miR-302s 및 miR-200c를 코딩하는 서열을 포함하는 에피솜 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, iPSC는 1차 세포에서 OCT4, KLF4, SOX2, miR-302s 및 miR-200c; 또는 OCT4, KLF4, SOX2, L-MYC/C-MYC, miR-302s 및 miR-200c 모두를 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 내로 (i) 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), L-MYC 코딩 서열, 및 C-MYC 코딩 서열, 또는 Oct4, KLF4, SOX2, L-MYC/C-MYC, 또는 상응하는 단백질 중 어느 하나 이상의 것의 성숙한 RNA를 포함하는 바이러스 벡터 (예컨대 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 AAV 벡터) 또는 폴리시스트론 에피솜 벡터, 및 (ii) miR-302s 및 miR-200c, 또는 성숙한 miR-302s 및 miR-200c를 코딩하는 서열을 포함하는 바이러스 벡터 또는 에피솜 벡터 중 어느 하나 이상의 것을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, C-MYC는 L-MYC 대신 사용되고/거나, 그 반대의 경우도 그러하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 바람직하게는 BIRC5 유전자를 억제시킴으로써 미분화된 iPSC를 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 mDAP를 포함하는 세포 집단, 및 상기 세포를 포함하는 조성물도 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 1차 세포에는 존재하지 않는 하나 이상의 체세포 돌연변이를 갖고/거나, 현재 암과 인과적으로 연루된 것으로 알려진 체세포 돌연변이를 갖지 않는다.
추가로, 본원에서는 파킨슨병 (PD)을 앓거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하기 위해 상기 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 본 방법은 바람직하게는 PD를 앓거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체, 또는 자가유래 대상체로부터 1차 체세포를 수득하고, 1차 세포로부터 iPSC를 생성하는 단계; 바람직하게는 SOX1 양성, KI67 양성, SOX1/KI67 이중 양성, SOX1/PAX6 이중 양성, 및 SOX1/PAX6/KI67 삼중 양성 세포의 개수를 감소시키는 데 충분한 시간 동안 iPSC를 케르세틴으로 처리하는 단계; mDAP를 포함하는 세포 집단을 본원에 기술된 방법에 의해 제조하는 단계; 및 대상체에게 상기 세포 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 임의적으로 자기 공명 영상-유도 정위 수술을 사용하여 대상체 뇌의 이환 영역 내로 또는 그 근처에, 바람직하게는 미상핵, 피각, 및 흑색질 중 하나 이상의 것 내로 양측으로 직접 이식함으로써 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포는 바람직하게는 피각의 시상 범위에 걸쳐 칼럼을 생성하는 장치 (예컨대 문헌 [Schweitzer et al., Oper Neurosurg (Hagerstown) 2019]에 기술되어 있는 것과 같은 것)를 이용하여, 바람직하게는 3개의 트랙을 이용하여, 바람직하게는 단일의 높은 시상주변부 피질 엔트리 포인트를 이용하여 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 100만, 200만, 300만, 400만, 500만, 600만, 700만, 또는 800만 개 세포 용량으로, 바람직하게는 여기서 세포는 3개의 트랙 사이에서 동등하게 분할된다. 일부 실시양태에서, 세포는 단일 치료로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 2회 이상의 치료로 투여된다.
일부 실시양태에서, 뇌의 양측 반구 모두가 치료되고, 세포는 첫 번째 치료에서 제1 반구에 투여되고, 두 번째 치료에서 나머지 다른 반구에 투여된다. 일부 실시양태에서, 첫 번째 치료와 두 번째 치료 사이의 시간은 약 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 48개월, 54개월, 또는 60개월이다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 항생제는 수술전, 수술전후, 및/또는 수술후에 투여된다.
본원에서는 또한 예컨대 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 세포 배양을 위한 배양 접시로서, 여기서 상기 접시의 밑면은 라인 사이의 거리가 1.5-2.5 cm, 예컨대 약 2 cm인 그리드, 예컨대 2x2 cm 그리드가 새겨져 있는 것인 배양 접시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 그리드는 밑면에 접시의 일부로서 형성되거나, 프린팅되거나 또는 에칭된다. 일부 실시양태에서, 접시는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 및 폴리비닐 열가소성 수지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접시는 그 안에 배치된, 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체, 바람직하게는 기저막 추출물 또는 합성 매트릭스 층을 포함한다.
별첨 1 및 2, 및 그 안에서 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 언급된 다른 참고문헌은 그 전문이 임의의 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 물질은 본 발명에서의 사용을 위해 본원에 기술되며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적절한 방법 및 물질 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시일 뿐이며, 제한하고자 하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 언급된 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1a-h. Y4F 및 대사 조절 miRNA를 조합한 개선된 리프로그래밍 방법. (a-d) 공 벡터 (모의) 대조군 대비 hDF로부터 Y3F (a), Y4F (b), Y3F+3 (c) 또는 Y4F+3 (d)에 의해 hiPSC 유사 콜로니 생성을 증진시키는 miRNA의 스크리닝. 평균 ± s.d., n = 5, *p<0.05; **p<0.01, 터키 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA. (e-f) Y4F, miR-302s, 및/또는 miR-200c로 감염된 hDF에서 OCR (e) 및 ECAR (f)의 시간 경과. 평균 ± s.d., n = 3, *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.005, 터키 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA. (g) Y4F, Y4F+3, 또는 Y4F+3+2를 코딩하는 렌티바이러스 감염 후 AP+ 콜로니 중 TRA-1-60+ 콜로니의 비율(%). 평균 ± s.d., n = 6, ***p<0.005, 터키 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA. (h) Y4F, Y4F+3, 또는 Y4F+3+2를 코딩하는 에피솜 벡터로의 형질감염 후 AP+ 콜로니 중 TRA-1-60+ 콜로니의 비율(%). 평균 ± s.d., n = 4, **p<0.01, 터키 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA.
도 2a-d. 본 발명자들의 개선된 리프로그래밍 방법으로부터 생성된 더 높은 고품질 hiPSC 세포주. (a) 원래의 hDF 및 hESC 세포주 (H9)와 비교하여 확립된 hiPSC 세포주 중 만능성 마커의 유전자 발현 수준을 나타내는 히트맵. n = 3. (b) 훽스트 33342 핵 염색 (인렛)과 함께 만능성 마커 (예컨대 OCT4, NANOG, TRA-1-60, 및 SOX2)에 대한 특이적 항체와의 상이한 조합에 의해 생성된 hiPSC 세포주의 면역염색. 스케일 바: 100 ㎛. (c) 7일 동안 자발적 분화 후 외배엽 (OTX2), 중배엽 (BRACHYURY) 및 내배엽 (SOX17)에 대한 계통 특이적 마커에 대한 면역염색. 스케일 바: 100 ㎛. (d) pY4F, pY4F+3 또는 pY4F+3+2에 의해 생성된 hiPSC 세포주에서 외배엽 마커 (PAX6 및 MAP2), 내배엽 마커 (FOXA2, SOX17 및 CK8) 및 중배엽 마커 (MSX1, MYL2A 및 COL6A2)의 초기 분화 마커의 유전자 발현 수준을 나타내는 히트맵. n = 2.
도 3a-c. 산발성 PD 환자의 피부 생검에서 생성된 hiPSC 세포주의 게놈 보존. (a) 4개의 hiPSC 세포주에서 발견된 체세포 돌연변이. 칼럼은 각 hiPSC 세포주의 싱글톤 돌연변이 개수 (hiPSC 세포주마다 다른 색상) 및 2개 이상의 hiPSC 세포주에서 발견된 고유 돌연변이 개수 (검정색 칼럼)를 보여준다. 검은색 칼럼 아래, 돌연변이를 공유하는 hiPSC 세포주는 가장자리와 연결된 점으로 표시된다. 좌측 하단 막대는 싱글톤과 2개 이상의 hiPSC 세포주에서 발견된 것, 둘 모두를 포함한 돌연변이의 총 개수를 나타낸다. C4는 가장 적은 개수의 체세포 돌연변이 (n=92)를 가졌으며, 그 중 80개는 싱글톤이고, 12개는 C4 및 다른 hiPSC 세포주에서 발견되었다. (b) 코딩 영역 및 암 연관 유전자에 대한 돌연변이 부하를 공공 이용가능한 데이터 세트와 비교하였다. 본 발명자들의 hiPSC 세포주에서 비동의 돌연변이의 개수는 hESC 세포주에 대한 것보다 유의하게 더 낮았다. 평균적으로, HipSci 프로젝트의 iPSC 세포주에서 비동의 돌연변이 개수는 본 발명자들의 hiPSC 세포주의 개수와 유사하다. 전반적으로, C4는 가장 낮은 돌연변이 부하 (적색)를 나타낸다. 암 연관 유전자에서의 체세포 돌연변이의 경우, 널리 사용되는 2개의 hESC 세포주 (H1 및 H9, 청색)와 C4 hiPSC 세포주 (적색)에서 체세포 돌연변이가 발견되지 않았다 (오른쪽 패널). (c) 4개의 hiPSC 세포주에서 모든 체세포 돌연변이의 작은 대립유전자 분율 (MAF)의 분포. MAF가 약 0.5인 피크는 클론 체세포 돌연변이를 나타낸다. MAF가 0.1 서브클론 돌연변이 미만인 두 번째 피크. 각 플롯에 대해, 2개의 피크가 있는 밀도 곡선은 체세포 돌연변이 MAF의 분포를 나타내고, 곡선의 색상은 각 hiPSC 세포주에 대해 (a)와 일치하고, 다른 색상의 곡선 (MAF 0.0 부근에서 피크)은 다른 hiPSC 세포주에 의해 검출된 체세포 돌연변이에 대한 것이다.
도 4a-d. 스폿팅 기반 시험관내 분화는 생성된 도파민 세포의 수율과 품질을 개선시킨다. (a) 최적화된 신체 배양 조건을 찾기 위한 실험 방식. 0일부터 15일째까지, 생존율과 상관없이 모든 세포를 FACS 및/또는 화살표로 표시된 수동 세포 계수에 의해 정량화하였다. D15에서 면역세포화학적 분석을 위해 세포를 커버 유리에 다시 플레이팅하거나, 정량적 실시간 PCR을 위해 수확하였다. (b-c) hESC (H9 및 H7) 및 hiPSC (C4 및 N3), 둘 모두에 대한, 1일부터 14일까지의 (탈리로 인한) 세포 손실 정도 및 D15의 세포 수확 (b) 및 D15의 사멸 세포의 비율(%) (c)에 대한 종래의 단층 기반 방법과 스폿팅 기반 방법 간의 비교. 11,000/㎠ 및 10,000/스폿의 세포 밀도가 각각 종래 방법 및 스폿팅 기반 방법에 사용되었다. 제시된 데이터는 측정가능한 결과와 함께 실험을 반영한다 (도 13a의 범례 참조). 평균 ± s.d., n = 4, 일원 ANOVA. (d) 면역세포화학적 분석을 사용하여 D15에 최종 세포 수확으로부터 죽어가는 세포의 정량화. 절단된 카스파제-3에 대한 항체를 사용하여 세포 아폽토시스 세포를 검출하였다. 핵 응축은 훽스트 33342 염색에 의해 시각화하여 사멸 또는 죽어가는 세포를 검출하였다. 스폿팅 기술로 플레이팅된 세포는 유의하게 감소된 절단된 카스파제-3 양성 세포수를 보였다. 스케일 바: 100 ㎛.
도 5a-g. 케르세틴 처리가 미분화 세포 및 분화된 세포에 미치는 효과. (a) 최적의 케르세틴 처리 조건을 결정하기 위한 스크리닝. 상이한 케르세틴 농도 및 기간으로 처리한 후 혈구계산기를 사용하여 생존한 hiPSC를 계수하였다. (b-c) D9에 케르세틴 처리 후 D11에 도파민성 세포의 생존율 (b) 및 총 세포수 (c). 배양물을 5, 10, 20, 40 및 100 μM으로 16시간 동안 처리하였다. 평균 ± s.d., n = 4, 일원 ANOVA. (d) 일정 개수의 섬유모세포 (105)와 함께 105에서 1로 10배로 연속 희석된 hiPSC에 의한 콜로니 형성. 세포를 40 μM 케르세틴 (QC)으로 16시간 동안 처리하거나, 또는 처리하지 않은 상태로 그대로 둔 후, 6일 동안 배양한 후, 이어서, 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 염색하였다. 2개의 개별 실험으로부터의 대표적인 결과. (e) 원래 투입 hiPSC 개수에 대해 계수된 최종 콜로니 개수의 플롯팅. (f) qRT-PCR에 의한 투입 hiPSC 수에 대한 OCT4 카피수에 대한 표준 곡선의 작성. OCT4 카피수는 qRT-PCR에 의해 측정되었고, 105에서 102 세포까지 10배 연속 희석된 hiPSC로부터 계산되었다. (g) QC 처리 또는 처리되지 않은 상태에서 다양한 시점에 hiPSC로부터 분화된 mDA 세포 중 OCT4-양성 세포수의 OCT4 qRT-PCR을 사용한 측정. 평균 ± s.d., n = 2, ***p<0.005, 이원 ANOVA.
도 6a-i. 시험관내 분화된 C4 hiPSC의 분자적, 세포 및 생리학적 특징화. (a) 스폿팅 프로토콜을 기반으로 하는 mDA 분화 방법의 개략적 개요. 수치는 ng/ml의 농도를 나타내고, 괄호 안의 수치는 μM을 나타낸다. AA, 아스코르브산; β-mer, 베타-메르캅토에탄올; BDNF, 뇌 유래 신경영양 인자; CHIR, CHIR99021; dbcAMP, 디부티릴 시클릭 아데노신 모노포스페이트; FGF-8, 섬유모세포 성장 인자 8; GDNF, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자; KSR, 넉아웃 혈청 대체물; LDN, LDN193189; L-Glu, L-글루타민; NEAA, 비필수 아미노산; PMN, 푸르모르파민; QC, 케르세틴; SB, SB431542; SHH, 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog); TGF-β3, 형질전환 성장 인자 베타 3. (b) mDA 분화된 세포에서 단계 특이적 신경 마커의 유전자 발현의 히트맵. (c) 분화 동안 FOXA2, LMX1A, NURR1 및 TH 유전자 발현의 점진적인 증가. (d) 분화된 D28 세포에서 신경 전구체 마커 (NESTIN), mDAP 마커 (FOXA2/LMX1A/TH), mDAN 마커 (MAP2, NURR1/TH), 및 증식 마커 PAX6/SOX1/KI67의 면역형광 염색. 스케일 바; 100 ㎛. (e) 총 D28 세포 중 NESTIN+, MAP2+, TH+, 및 NURR1+ 세포의 비율(%) (n = 6). (f) 총 D28 세포 중 FOXA2+, LMXA1+, 및 FOXA2+/LMX1A+ 세포의 비율(%) (n = 6). (g) TH+ D28 세포 중 FOXA2+/LMX1A+ 및 NURR1+ 세포의 비율(%) (n = 6). (h) 총 D28 세포 중 PAX6+, SOX1+, 및 PAX6+/SOX1+/KI67+ 세포의 비율(%) (n = 6). N.D, 검출되지 않음. (i) D47에서 도파민 및 도파민 대사산물 (DOPAC)의 KCl 유도 방출의 HPLC 분석. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다.
도 7a-h. NOD-SCID 마우스에서 C4 유래 mDA 세포의 생체내 안전성. (a) D14 (중간) 또는 D28 (우측)에서 C4 iPS 세포 (D0, 좌측) 또는 C4 유래 mDA 전구체의 선조체 이식 후 NOD-SCID 마우스 뇌의 H&E 염색. D14 군의 흰색 원은 로제트 유사 구조를 나타낸다. (b) 케르세틴으로 처리하지 않는 경우의 D0 (n = 4) 및 D14 (n = 4), 및 케르세틴 처리 군인 경우의 D14 (n = 19) 및 D28 (n = 23)에서 기형종 형성 비율(%)의 정량화. QC = 케르세틴. (c) 케르세틴으로 처리하지 않는 경우의 분화 D14 및 케르세틴 처리시의 D14 및 D28에서 로제트 형성의 정량화. (d) D14 및 D28 군에서 비멘틴(Vimentin)의 면역조직화학법. (e-f) D14 (e) 및 D28 군 (f)에서 SOX1, PAX6 및 KI67의 면역형광 염색. (g) D14 및 D28 군에서 SOX1+, KI67+, SOX1+/KI67+, SOX1+/PAX6+, SOX1+/PAX6+/KI67+ 집단의 정량화. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있고, n = 4, ***p<0.001, 스튜던츠 t 검정. (h) 생체분포 검정. 6개월 전에 선조체내 hiPSC 유래 D28 도파민성 전구체 이식편을 받은 NOD SCID 마우스의 "뇌 믹스" (후신경구 및 소뇌의 혼합물), 척수, 폐, 심장, 비장, 신장 및 간에서 인간 또는 마우스 특이적 유전자 발현의 RT-PCR. hiPSC는 양성 대조군 역할을 한다. 인간 특이적 유전자는 10번 염색체 29125650 내지 29125967에 위치한다. 마우스 특이적 유전자는 마우스 TNFα의 일부이다. N.D, 검출되지 않음. 달리 명시되지 않는 한, 모든 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 8a-n. C4 hiPSC 유래 mDA 세포의 생체내 생존 및 기능. (a-d) D28 및 냉동보존된 ("Cryo")-D28 군 (n = 9)에서 약물 유도 회전 테스트 (a), 코리더(corridor) 테스트 (b), 실린더 테스트 (c) 및 스테핑 테스트 (d)를 사용한 행동 평가. (e-f) 숙주 뇌의 이식편 유래 hNCAM+ 신경분포 및 TH+ 신경분포에 관한 개요. (g-l) 이식편 유래 hNCAM+ 뉴런 (g-i) 또는 TH+ 뉴런 (j-l)에 의한 무손상 쪽, 이식받은 쪽 및 병변이 있는, 이식을 받지 않은 쪽의 숙주 STR, NAc 및 PFC로의 신경분포. (m) 이식편 유래 신경분포를 보여주는 고배율 이미지. (n) 이식된 뉴런에서 인간 특이적 시냅스 마커 시냅토피신, TH 및 DARPP32의 면역형광 염색. 모든 이식편 분석 데이터 (e-m)는 이식 26주 후에 수득하였다. AC, 전교련; cc, 뇌량; dSTR, 등쪽 선조체; LV, 측뇌실; NAc, 측좌핵; PFC, 전전두엽 피질; T, 이식체. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 스튜던츠 t 검정. 스케일 바: 500 ㎛ (g-l); 100 ㎛ (m-n).
도 9a- n. 대사 리프로그래밍을 조절하는 마이크로RNA의 확인 및 Y4F와 그의 조합을 기반으로 한 개선된 리프로그래밍 방법. (a-b) 형질감염 후 3일째 대조군 (Scr) 또는 miR-200c (200c)에 대한 마이크로RNA 모방체로 형질감염된 hDF의 산소 소비율 (OCR) (a) 및 세포외 산성화율 (ECAR) (b)을 XFp 분석기를 사용하여 평가하였다. 평균 ± s.d., n = 3, *p<0.05, 양측 독립표본 t 검정. (c) 형질감염 후 3일째 Scr 또는 miR-200c로 형질감염된 hDF의 OXPHOS 능력. 평균 ± s.d., n = 3. (d-e) 기초 호흡, ATP 전환, 최대 호흡, 산화적 예비량 (d) 또는 FCCP 주입 후 상대적인 OCR 변화 (e). 평균 ± s.d., n = 3, *p<0.05, 양측 독립표본 t 검정. (f-g) OCR은 형질도입 후 3일째 (f) 또는 8일째 (g) Y4F 및/또는 miR-200c (200c)를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 hDF에 대해 제시되어 있다. 평균 ± s.d., n = 3. (h-i) f-g에 제시된 바와 같이, 형질도입 후 3일째 (h) 또는 8일째 (i) hDF에서의 기초 호흡, ATP 전환, 최대 호흡, 및 산화적 예비량. 평균 ± s.d., n = 3, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005, 터키 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA. (j-k) f-g에 제시된 바와 같이, 형질도입 후 hDF에서의 OCR/ECAR 비 (j) 또는 FCCP 주사 후 상대적인 OCR 변화 (k). 평균 ± s.d., n = 3, * p<0.05; ** p<0.01, 터키 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA. (l-m) 형질도입 후 3일째 개별 miRNA를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입된 hDF에서의 OCR (l) 및 ECAR (m). 평균 ± s.d., n = 9, * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005, 터키 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA. (n) l-m에 제시된 바와 같은, OCR/ECAR 비. 평균 ± s.d., n = 9, *** p<0.005, 터키 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA.
도 10a-e. Y4F +3+2 리프로그래밍 프로토콜 확인. (a) 형질도입 후 14일째의 TRA-1-60 (상단) 또는 AP (하단)-양성 콜로니의 대표적인 사진. (b) 인간 성인 섬유모세포 (GM03529)에서 Y4F, Y4F+3, 또는 Y4F+3+2의 렌티바이러스 형질도입 후 AP+ 콜로니 중 TRA-1-60+ 콜로니의 비율(%). 평균 ± s.d., n = 6, **p<0.01, 터키 사후 검정을 사용한 이원 ANOVA. (c-d) pY4F (OCT4, SOX2, KLF4, 및 L-MYC) (c) 및 miR-302s 및 -200c (p3+2) (d)를 코딩하는 플라스미드 맵. (e) pY4F 및 pY3+2에 의한 단일 형질감염을 사용하는 본 발명자들의 확립된 에피솜 시스템 기반 리프로그래밍 방법의 개략도.
도 11a-b. 본 발명자들의 개선된 리프로그래밍 방법으로 생성된 hiPSC 세포주의 면역세포화학 염색. 코리엘 인스티튜트(Coriell Institute)로부터의 9개의 섬유모세포 세포주 (가족성 PD 대상체 3명, 산발성 PD 대상체 3명, 및 건강한 대상체 3명, a) 및 새로운 피부 생검으로부터의 4개 샘플 (건강한 대상체 3명 및 산발성 PD 환자 1명, b)을 포함하여 다수의 공급원으로부터의 다양한 인간 성인 섬유모세포에서 본 발명자들의 에피솜 방법에 의해 생성된 인간 iPSC의 면역세포화학 염색.
도 12a-g. 본 발명자들의 개선된 리프로그래밍 방법에 의해 생성된 hiPSC 세포주의 특징화. (a) EBNA-1 특이적 서열 (EB-01)의 qRT-PCR 검출의 표준 곡선. (b) 어느 hiPSC 세포주의 세포질에서도 잔류 플라스미드 DNA는 검출되지 않았다. 원래 섬유모세포 (Fib), 인간 ESC 세포주 (H9) 및 음성 대조군 (증류수: DW)의 샘플도 시험하였다. EBNA 서열 (EB-01)을 기반으로 하는 플라스미드 특이적 프라이머를 qRT-PCR 분석에 사용하였다. (c) 숙주 게놈에서 통합된 플라스미드 DNA의 검출. 한 계통 (N17)은 숙주 염색체 DNA에 통합된 플라스미드 DNA 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. (d) 통합 플라스미드 서열의 qRT-PCR 분석. 평균 ± s.d., n = 3, ***p<0.005, 일원 ANOVA. (e) 산발성 PD 환자 (MCL540)의 피부 생검에서 유래된 hiPSC 세포주의 염색체 유전형결정. 패턴은 각각 양성 및 음성 대조군으로서 원래의 섬유모세포 (Fib) 및 hESC 세포주 (H9)의 샘플과 비교되었다. DW, 증류수. (f) C4 및 N3 정상 핵형의 대표적인 이미지. (g) 와이셀 (상단), C4 (중간) 및 N3 (하단)의 19-9-11T hiPSC 세포주에서 기형종 형성 및 3 배엽층 조직의 대표적인 이미지. 스케일 바: 100 ㎛.
도 13a- c. 스폿팅 기반 분화 프로토콜의 개략도. (a) 단층 기반 또는 스폿팅 기반 방법을 사용하는 hESC 및 hiPSC의 분화 성공률 (hESC의 경우, n = 76, hiPSC의 경우, n = 48). 시험관내 분화는 1) 세포가 D15에서 >50% 전면생장률로 생존할 수 있고, 2) 세포를 수확하고, ICC에 의한 추가 특징화를 위해 커버 유리에 플레이팅할 수 있는 경우 성공적인 것으로 간주되었다. (b-c) 6개 스폿이 있는 6 cm 배양 플레이트 및 12개 스폿이 있는 10 cm 배양 플레이트에 대한 스폿팅 개략도.
도 14a- c. 스폿팅 기반 및 단층 기반 시험관내 분화의 비교. 단층 기반 방법 및 스폿팅 기반 방법에서 시험관내 분화를 사용하는, (a) C4 및 H9 둘 모두에서 분화 D15에서 세포 손실 및 세포 수확의 비율의 비교 (n = 4). 손실 및 수확의 세포수는 FACS에 의해 수득하였다. (b) C4와 H9 둘 모두에서 상이한 시점에서 수확된 상청액의 pH 값 (n = 4); (c) C4의 D4, D8, D12 및 D15에서의 형태학적 특징. 스케일 바는 20 ㎛를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있고, * p<0.05; *** p<0.005. 양측 대응표본 t 검정 (a), 터키 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA (b)를 사용하여 통계적 유의도를 결정하였다.
도 15a-c. 케르세틴 처리에 의한 미분화된 hiPSC 제거. (a) 100K 총 세포 중 10배만큼 섬유모세포로 연속 희석된 미분화된 hiPSC의 항-SSEA-4 및 TRA-1-60 FACS 분석. (b) 투입 hiPSC 수 대 SSEA-4+ 및 TRA-1-60+ 세포의 결과 비율(%)의 플롯. (c) 케르세틴 처리시 또는 처리하지 않은 경우의 D14 세포에서 NANOG에 대한 면역염색. 스케일 바: 100 ㎛.
도 16a-b. 시험관내 분화된 C4 hiPSC의 특징화. (a) D3에서 D40까지 분화된 세포의 명시야 이미지. (b) mDA 분화 D14, D21, D28 및 D50 동안 신경 전구체 (NESTIN), mDAP (FOXA2/LMX1A), mDAN (MAP2 및 TH), GABA성 뉴런 (GABA) 및 세로토닌성 뉴런 (5-HT) 양성 세포의 면역형광 염색 및 비율(%). 스케일 바: 100 ㎛. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있고, n = 6.
도 17a- b. 시험관내 분화된 C4 hiPSC의 세포 운명 분석. (a) TH, MAP2, SYP (시냅토피신), DAT (도파민 수송체), VMAT2 (소포체모노아민 수송체 2) 및 PITX3을 공동 발현하는 D70 세포의 면역형광 염색은 전기생리학적으로 기록되었다. 스케일 바: 100μm. (b) TH 양성 세포를 사용한 ALDH1A1, GIRK2 및 칼빈딘의 면역형광 염색. 스케일 바: 100 ㎛.
도 18a- h. 시험관내 분화된 C4 hiPSC의 전기생리학적 특징. (a) D70에서 탈분극 전류 주입 (500 ms)에 의해 유도된 활동 전위의 대표적인 전압 트레이스. (b) 전압 클램프 모드로 전압 펄스에 의해 유발되는 대표적인 전류 트레이스. 좌측: 10 mV 증분 (100 ms 지속 시간)으로 -70mV에서 +40mV의 전압 펄스에 의해 유도되는 과도 내부 및 지속적인 외향 전류. 중간: 내향 전류가 TTX (1 μM)에 의해 완전히 차단되었다. 우측: 상이한 막 전위에서 전압 개폐 Na+ 전류를 분리하기 위해 대조군 조건에서 기록된 트레이스에서 TTX의 존재하에 기록된 트레이스를 감산한다. (c) 전압 클램프 모드로 -70 mV에서 기록된 자발적인 시냅스후 전류. (d) 휴지 막 전위에서 전류 클램프 모드로 분화된 세포의 자발적 발화. (e) 기록된 개별 세포의 면역형광 염색. 뉴로비오틴으로 충전된 세포 (적색)는 TH 양성 (녹색)을 나타낸다. 스케일 바: 100 ㎛. (f) 다중 전극 어레이를 사용하여 D30, D37 및 D44에서 시험관내 분화된 C4 hiPSC의 누적 활성 맵 및 스파이킹 활성. (g-h) 글루타메이트 수용체 길항제인 NBQX + AP5, 및 GABAA 수용체 길항제인 피크로톡신의 조합으로 처리되거나, 또는 처리되지 않은 D44 분화된 C4 hiPSC의 스파이크의 평균 개수 (g) 및 활성 전극수 (h). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있고, n = 4.
도 19a- m. PD의 무흉선 래트 모델에서 생체내 이식 결과 분석. (a) 6-OHDA 병변이 있는 타코닉(Taconic) 래트 암페타민은 4, 8, 12 및 16주에 C4 유래 D28 DA 전구체 (100,000 또는 300,000개 세포)로 이식 전후에 회전 테스트를 유도하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. ** 평균 p< 0.01, *** 평균 p<0.001. (b) 28일 세포 이식 후 6개월째 무흉선 래트 뇌의 H&E 염색. (c) hNCAM의 면역조직화학법을 통해 연속적인 관상 절편에서 숙주 뇌 전체의 여러 영역으로 광범위한 섬유 성장을 나타낸다. (d-g) hNCAM 염색의 더 높은 고배율은 이식편에서 전전두엽 피질 (d), 중격 핵 (e), 측좌핵 (f), 및 뇌량 (g)으로의 성장 패턴을 보여준다. (h-j) D28 DA 전구체에 의해 생성된 이식편에서 TH+ 도파민성 뉴런의 이식 후 6개월째 조직학적 분석. 큰 각진 세포 소마타가 있는 A9 유사 뉴런 형태 (i) 및 더 작은 구형 A10 유사 뉴런 (j)에 주목한다. (k) 생체내 찰스 리버(Charles River) 무흉선 래트 실험의 개략도. (l) 신선하게 제조된 D28 세포 및 액체 질소에서 1주일 후 해동된 Cryo-D28 세포 간의 세포 생존율 및 FOXA2, LMX1A 및 TH 양성 세포수의 비교 (n = 3-4). (m) D28 세포 및 Cryo-D28 세포 이식 후 24 내지 52주 사이의 암페타민 유도 회전 테스트 (n = 3-4). 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 스튜던츠 t 검정. AC, 전교련; cc, 뇌량; NAc, 측좌핵; PFC, 전전두엽 피질. 달리 명시되지 않는 한, 모든 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 20a- c. 생체내 이식의 기능 및 신경분포 분석. (a) H9 hESC 유래 D28 세포 및 C4 hiPSC 유래 D28 세포 이식 후 암페타민 유도 회전 테스트 (n = 5-8). (b) 각 군으로부터의 6-OHDA 병변이 있는 뇌의 대표적인 이미지. (c) STR 및 NAc로의 이식 신경분포의 고배율 이미지. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 스튜던츠 t 검정. STR, 선조체; NAc, 측좌핵.
도 21a- o. C4 유래 mDA 세포 이식 후 이식편 분석. (a) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 TH+ 뉴런 (A9 유사 및 A10 유사 둘 모두)의 면역염색. (b) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 살아남은 TH+ 뉴런의 개수 추정 (n = 4). (c) D28 및 Cryo-D28 이식편의 이식편 부피 추정 (n = 4). (d-f) D28 이식편에서 FOXA2, LMX1A (d) 및 NURR1 (e) 및 TH에 대한 면역형광 공동염색 (n = 4). (f) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 FOXA2, LMX1A, 마커 둘 모두 또는 NURR1을 공동 발현하는 TH+ 뉴런의 정량화 (n = 4). (g) DAT 및 TH에 대한 면역형광 공동 염색. (h) 이식된 뉴런에서 PAX6, SOX1 및 Ki67에 대한 면역형광 염색. (i) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 PAX6+, SOX1+ 및 Ki67+ 세포의 정량화 (n = 4). (j-l) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 TH에 대한 GIRK2+ (j) 및 칼빈딘+ (k) 뉴런의 면역형광 공동 염색 (n = 4). (l) D28 및 Cryo-D28 이식편에서 칼빈딘+ 및 GIRK2+ 뉴런의 정량화. (m-o) D28 이식편에서 TH+, ALDH1A1+ 및 SOX6+ (m), TH+, ALDH1A1+ 및 GIRK2+ (n), TH+, ALDH1A1+ 및 CALBINDIN+ (o)의 면역형광 공동 염색. 타코닉 래트의 모든 이식편 분석 데이터는 이식 후 18주째 수득하였다. 찰스 리버 래트의 모든 이식편 분석 데이터는 이식 후 26주째 수득하였다. AC, 전교련; cc, 뇌량; NAc, 측좌핵; PFC, 전전두엽 피질; SNpc, 흑색질 치밀부; STR, 선조체; T, 이식체; VTA, 복부 피개 영역. 스케일 바: 50 ㎛ (a); 100 ㎛ (d-o).
도 22a-i. GMP 분화 프로토콜 개략도 및 품질 관리 결과. (a) 적색으로 표시된 각 단계에서 세포 수율이 있는 GMP 분화 프로토콜의 개략도에 의한 개요. QC는 품질 관리를 나타낸다. (b) OCT4 및 SSEA-4에 대한 D0 면역세포화학 QC 염색. (c) qRT-PCR을 사용한 Oct4 및 Nanog mRNA 발현 수준에 대한 D0 QC. (d) C4 D26 DNA 핑거프린팅 QC는 원래 섬유모세포와 동일한 패턴을 보여주지만, 음성 대조군은 다르며, 이를 통해 작업 세포 은행으로부터의 C4 iPS 세포가 환자의 섬유모세포에서 유래함을 확인하였다. Fib: 섬유모세포. M: DNA 마커. (e) qRT-PCR을 사용한 FOXA2, LMX1A 및 TH mRNA 발현 수준에 대한 D26 QC. (f) D0 미분화 세포를 음성 대조군으로 사용하는 FOXA2, LMX1A 및 Nurr1에 대한 D26 면역세포화학 QC 염색. (g) (f)로부터 FOXA2, LMX1A 및 Nurr1 발현의 정량화. (h) 음성 대조군으로서 OCT4 및 SSEA-4에 대한 TH, 5-HT, TPH, OCT4 및 SSEA-4 염색 Do 미분화 세포를 위한 D26 면역세포화학 품질 관리 염색. (i) (h)로부터 TH, 5-HT, TPH, OCT4 및 SSEA-4 발현의 정량화. 일부 세포는 면역세포화학 QC를 위해 D26에 수확하여 세포가 커버 슬립에 부착되도록 하고, D28의 최종 수확 전에 염색 및 분석 프로세스를을 완료하였다. 스케일 바: 100 ㎛. 각 실험당 n = 3.
도 23a-c. 인간화 마우스에서 mDA 전구 세포의 면역원성. a 및 b는 생존 이식편의 존재 및 도파민성 분화를 검출하기 위해 자가유래 및 동종이계 mDAP 이식 후 2주째에 hNCAM (a) 및 TH/hNCAM (b)에 대한 항체로 염색된 마우스 뇌 절편을 보여주는 것이다. (c) 항-CD4로 염색하여, 환자-인간화 동물에 배치된 동종이계 이식편에서만 주요 세포 손실 및 T 세포 침윤을 입증한다. 모든 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다. NSG, NOD/SCID/IL2rγ널 마우스; C4-hu, 환자 유래 PBMC로 인간화된 NSG 마우스; K1-hu, 지원자 유래 PBMC로 인간화된 NSG 마우스. C4-mDAP, 환자 유래 mDAP; H9-mDAP, 인간 배아 세포주 유래 mDAP.
도 24a-b. 영상화. (a) 명시된 시점의 기저핵 수준에서 축방향 18F-DOPA PET 이미지: 기준선 (첫 번째 수술 4개월 전), 왼쪽 이식 후 3개월째, 오른쪽 이식 후 6개월째 및 왼쪽 이식 후 12개월째, 및 왼쪽 이식 후 24개월째, 및 오른쪽 이식 후 18개월째. 초기 왼쪽 이식 후 3개월째 18F-DOPA 흡수의 일시적인 감소 후, 이어서, 주로 이식 부위 근처의 후 피각에서 양측으로 (오른쪽이 왼쪽보다 큼) 도파민 흡수가 점진적으로 완만하게 증가하였다. (b) 왼쪽 이식 후 18개월 및 오른쪽 이식 후 12개월째 T2 블레이드 MR 이미지. 화살표는 이식 위치를 나타낸다.
도 25a- b. 파킨슨병 관련 운동 기능, 비운동 기능 및 삶의 질에 대한 종단적 임상 평가. 첫 번째 (왼쪽) 및 두 번째 (오른쪽) 반구 이식 시간은 수직 점선으로 표시되어 있다. (a) 레보도파를 밤새도록 중단한 후 ("오프") 및 최고 용량의 레보도파 ("온")에서의 MDS-UPDRS 파트 III 운동 점수. (b) 시간 경과에 따른 PDQ 등급 척도가 명시되어 있고; 수치가 낮을수록 증상의 중증도는 낮다는 것을 나타낸다.
흑색질 (SN)에서 A9 mDA 뉴런 (mDAN)의 선택적 변성은 파킨슨병의 주요 병리학적 특징이고, 질환의 기본적인 운동 증상과 직접적으로 연관이 있어, 도파민성 세포 이식이 잠재적인 치료 전략법으로 제안되어 왔다 (3). 이를 뒷받침하는 것으로, 태아 세포 이식을 사용한 이전 개입은 20년 이상 지속되는 상당한 회복을 보인 일부 환자를 포함하여, 다수의 이식편이 다양한 정도의 기능 회복으로 성공적으로 표적 영역에 신경을 재분포시켰다는 "개념 증명"을 제공하였다 (4-7). 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 유산된 인간 태아로부터 유래된 조직은 PD 치료를 위한 생존가능한 세포 공급원으로서 근본적인 윤리적, 실용적 및 의학적 한계를 갖고 있다.
2006년 야마나카(Yamanaka)와 동료들은 4개의 전사 인자, 즉, Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc (이하 Y4F (야마나카 4 인자)로 지칭)를 도입하여 포유동물 섬유모세포가 배아 줄기 세포 (ESC)-유사 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC)로 전환될 수 있음을 보여주는 획기적인 연구를 발표하였다 (8). 이어서, 야마나카와 다른 두 그룹은 인간 체세포를 이용하여 인간 체세포를 인간 iPSC (hiPSC)로 리프로그래밍함으로써 상기 위업을 달성하였으며 (9-11), 환자 특이적 줄기 세포를 생성할 수 있는 가능성을 제공하였다. 초기의 흥분에도 불구하고, 이러한 hiPSC 기술이 자가유래 세포 요법을 위해 쉽게 사용될 수 있는지 여부는 불확실하다. 실제로, 대부분의 hiPSC 연구의 주요 목표는 개인맞춤화된 세포 요법에서 인간 질환 및 발생에 대한 기계론적 연구로 옮겨졌다 (12). PD에 대한 hiPSC 기반 세포 요법의 구현에는 몇 가지 주요 장벽이 존재한다. 첫째, 아마도 리프로그래밍 프로세스에 대한 본 발명자들의 제한된 이해로 인해 개별 hiPSC 세포주들의 분화 잠재력 사이에 넓은 가변성이 존재한다 (13, 14). 둘째, hiPSC 기반 세포 요법의 안전성이 아직 완전히 확립되지 않았다. 특히, 미분화된 상태로 그대로 남아 있거나, 또는 서브클로날 종양형성 돌연변이를 보유하는 임의의 hiPSC는 신생물성 잠재력을 갖고 있기 때문에 (15, 16), 치료제에서 상기와 같은 세포를 완전히 제거하는 것이 중요하다. 첫 번째 hiPSC 기반 인간 시험에서 2명의 환자 중 1명의 환자에 의해 예시되는 바와 같이 (17), 안전한 임상 사용을 위해서는 hiPSC의 게놈 보존이 전체 게놈/엑솜 시퀀싱 (WGS/WES)에 의해 확인되어야 한다. 셋째, 다수의 실험실에서 수행한 많은 연구에도 불구하고, hiPSC의 기능적 mDAN으로의 시험관내 분화 프로토콜은 최종 생성물에 가변성을 추가하면서, 여전히 차선책으로 남아 있다 (7, 18). 마지막으로, 가능한 한 많은 환자에게 혜택을 주기 위해서는 장기적인 비용 효율성과 재현성이 필요할 것이다.
본 개시내용은 이러한 문제를 해결하여 hiPSC 기반 개인맞춤화된 세포 요법을 PD 치료를 위한 실행가능한 옵션으로 만든다. 첫째, 본 발명자들은 리프로그래밍 프로세스 동안 대사 변화를 직접 조절하는 다수의 마이크로RNA (miRNA)를 확인하였고, 이들 miRNA (miR-302s 및 miR-200c)와 정규 리프로그래밍 인자의 최적 조합이 고품질 iPSC를 효율적이고 안정적으로 생성할 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 새로운 에피솜 리프로그래밍 방법은 13개의 다른 공급원으로부터 유래된 성인 인간 섬유모세포를 사용하여 다수의 hiPSC를 생성하는 데 성공적으로 적용되었다. 단일 산발성 PD 환자의 피부 생검으로부터 유래된 섬유모세포를 사용하여 생성된 결과물인 hiPSC의 전체 엑솜 시퀀싱 (WES) 및 핵형분석에 의한 분석은 알려진 암 유발 돌연변이 없이 안정적인 염색체 및 게놈 보존을 보여주었다. 둘째, 본 발명자들은 미분화된 hiPSC를 효율적이고, 안정적으로 제거하여, 이식 후 종양 형성을 방지할 수 있는 화학적 (케르세틴) 방법을 확립하였다. 예컨대 US20160002604를 참조한다. 셋째, 본 발명자들은 신규 "스폿팅" 방법을 기반으로 하는 효율적인 시험관내 분화 프로토콜을 확립하여 종래의 단층 방법에 비해 세포 손실을 극적으로 감소시키고 더 건강한 세포의 수율을 더 높게 증가시켰다. 넷째, 이러한 시험관내 분화 프로토콜에 의해 생성된 mDA 세포의 이식은 PD의 무흉선 래트 모델에서 운동 기능장애를 강력하게 교정하였고, 신선한 세포, 또는 냉동보존된 세포가 사용되었는지 여부에 관계없이, 숙주 뇌로의 현저한 신경재분포를 나타내었다. 마지막으로, 본 발명자들은 우수의약품 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Practice: GMP) 시설에서 본 발명자들의 플랫폼을 성공적으로 구현하여 고품질 mDA 세포를 대량으로 생산하였다. 따라서, 본원에 설명된 핵심 기술은 PD를 위한 개인맞춤화된, 자가유래, 세포 대체 요법의 성공적인 구현에 적합한 프로토콜을 제공한다.
잘 특징화된 세포 유형--A9-타입 mDAN--의 선택적 변성이 본 병태와 연관된 운동 기능장애의 주요 원인이기 때문에, PD는 세포 대체 요법의 특히 유망한 표적이다. 수많은 연구원들이 태아 조직, 자가유래 성체 줄기 세포 및 동종이계 mDA 세포를 비롯한 다양한 세포 공급원을 사용하여 PD를 위한 세포 요법을 광범위하게 연구해왔다 (5-7, 54). 본 발명자들은 대신 hiPSC 유래의 자가유래 세포 대체에 주력하였는데, 그 이유는 윤리적, 실용적, 의학적 문제를 완화시키는 그의 고유한 이점 때문이다. PD를 위한 개인맞춤화된 자가유래 세포 요법의 잠재력이 실현될 수 있도록 돕기 위해, 본 발명자들은 이러한 치료 전략법의 실행에 대한 현재의 기술 및 과학적 장벽을 해결하고자 하였다.
개인맞춤화된 세포 요법은 치료되는 각 환자로부터 임상 등급의 hiPSC 생성을 필요로 하기 때문에, 상기 세포주가 효율적이고, 신뢰할 수 있게 생성되도록 허용하는 리프로그래밍 기술을 확립하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 2개의 대사 조정 miRNA (miR-302s 및 miR-200c)와 정규 야마나카 인자 (Y4F)의 조합이 엄격한 품질 기준을 충족하는 hiPSC 생성을 촉진시킨다는 것을 발견하였다: 첫째, 본 발명자들의 hiPSC 세포주는 H9의 것과 유사한, OCT4, SOX2, NANOG, ESRRB, REX1, GDF3, ECAT1, GBX2, 및 TRA-1-60을 비롯한, 실제 만능성 마커의 발현 수준을 보여주었다 (도 2, a 및 b). 둘째, Y4F+3+2 (본 발명자들의 최종 방법)에 의해 생성되었지만, Y4F 또는 Y4F+3에 의해 생성되지 않은 H9 hESC 및 hiPSC 세포주는 3 배엽층 특이적 마커의 면역염색 및 유전자 발현에 의해 결정된 바와 같이 (도 2, c 및 d), 모든 3 배엽층 계통으로 동일하게 잘 분화되었다. 셋째, 다중 hDF로부터 유래된 본 발명자들의 hiPSC 세포주는 경계가 잘 정의된 전형적인 hESC 유사의 조밀한 콜로니 형태를 보여주었다 (도 10a 및 11a). 이 방법의 강건성은 13개의 상이한 성인 hDF 공급원으로부터 다수의 hiPSC 세포주를 성공적으로 생성함으로써 검증되었다. 이러한 동일한 조합이 대체 전달 방법 (예컨대 성숙한 RNA/miRNA 또는 센다이 바이러스)을 사용하여, 및 다른 세포 유형 (예컨대 혈액 및 소변 세포)에서 어떻게 수행되는지는 추가 연구를 필요로 한다.
hiPSC의 게놈 보존은 그가 요법에 사용되기 이전에 확립되어야 한다. 예를 들어 머클(Merkle)과 동료들은 H9를 비롯한, 수개의 hESC 세포주가 인간 암에서 흔히 관찰되는 돌연변이인, 종양 억제인자 P53을 코딩하는 TP53 유전자의 돌연변이를 발생시킨다고 보고하였다 (28). 특히, 첫 번째 hiPSC 기반 인간 시험에서 2명의 환자 중 1명으로부터 유래된 hiPSC에 작은 암 유발 돌연변이가 있는 것으로 밝혀져 상기 두 번째 환자의 세포 치료는 취소되었다 (17). 게놈 보존을 확인하기 위해, 본 발명자들은 산발성 PD 환자로부터 유래된 5개의 독립적인 hiPSC 세포주 (표 B의 MCL540)를 핵형분석, qRT-PCR, 및 WES 분석에 의해 분석하였고, 5개 중 4개의 클론 (C4, N3, C11, C5)에는 통합된 플라스미드 DNA가 없었고, 암과 인과적으로 관련된 체세포 돌연변이를 포함하지 않는다는 것을 발견하게 되었으며, 이를 통해 본 발명자들의 리프로그래밍 방법이 임상적으로 생존가능한 hiPSC 세포주를 안정적으로 생성할 수 있다는 것을 보여주었다 (표 2). 상기 4개의 hiPSC 클론은 머클과 동료들에 의해 연구된 140개의 hESC 세포주와 비교하여 세포주당 유의하게 더 적은 개수의 변이체를 포함하였다 (28). 특히, COSMIC 데이터베이스에 보고된 유전자에 유의하게 더 적은 개수의 코딩 변이체를 포함하였다 (도 3). hiPSC 기반 요법이 직면한 또 다른 중요한 안전 문제는 잔여 미분화 세포의 신생물성 잠재력을 제거해야 하는 필요성이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 >99.99%의 효율로 미분화된 PSC를 제거한, hPSC-특이적 BIRC5를 표적화하는 (40), 케르세틴을 사용하는 화학적 방법을 확립하였다 (도 5). OCT4 발현의 qRT-PCR 분석을 기반으로 한 이론적 계산에 따르면, 케르세틴 처리 후 1000만 개의 D28 세포당 0.0017개의 미분화 세포가 있을 것으로 예측된다. 모든 유형의 신경아교종의 자발적 발병률 범위가 100,000명당 4.67 내지 5.73명이라는 점을 감안할 때 (55), 따라서, 종양 형성 위험은 신경아교종의 자발적 발병률에 비해 나을 것이다. 본 방법은 간단하고, 효과적이며, 예컨대 세포 분류 또는 감마선 조사 (45, 56)와 같은 추가 처리를 필요로 하지 않으며, 이에 GMP 표준을 쉽게 충족시킬 수 있다. 그러나, 케르세틴 처리는 로제트 형성 상피 세포로부터 신경 과성장을 직접 제거하지 않고, 이는 케르세틴 처리와 충분한 시험관내 분화 (예컨대 28일)를 조합하는 것의 중요성을 강조한다 (도 7).
본 방법은, 더 적은 개수의 초기 세포를 성장시키고, 높은 세포 밀도의 스폿으로의 물리적 분리를 사용하여 분화시킴으로써 그 결과로 전통적 전면생장 단층에 비해 세포 손실이 유의하게 감소되고, 사멸 또는 죽어가는 세포가 현저히 더 적으면서 더 건강한 mDA 세포가 생산되는 (도 4), "스폿팅" 방법을 기반으로 하는 효율적인 시험관내 분화 프로토콜을 제공한다. 중요하게도, 스폿팅 배양 배지가 아닌, 단층 배양 배지는 배지 교체 빈도와 상관없이 유의하게 더욱 산성이 되고 (도 14b), 이는 아마도 단층 배양에서 세포 건강이 불량한 것의 원인이 될 것이다. 상기 D28 세포는 시험관내에서 추가로 분화되었을 때, 성숙되었고, D47에서 도파민 (3.1 ng/ml)을 현저하게 방출하였고, D70까지 특징적인 mDAN 전기생리학적 특성을 나타냈다. 이러한 데이터는 상기 분화 프로토콜의 D28의 배양물이 대부분 실제 mDAP로 이루어지고, 이식을 위한 유망한 공급원을 나타낸다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 GMP 시설에서 상기 프로토콜을 성공적으로 확장시켜 임상적으로 적절한 양의 고품질 mDAP를 생산하였다 (도 22a-f).
수많은 연구에서 hESC/hiPSC의 mDA 표현형으로의 매우 효율적인 분화가 입증되었지만, 그의 생체내 효능은 잘해도 가변적이었고, 종종 시험관내 데이터와도 좋지 않은 상관관계를 보였다 (7). 일부 이전 임상 시험에서, 적절한 동물 모델에서 먼저 광범위한 기능 검증을 거치지 않은 DA 생산 세포의 이식은 임상적 이익을 생성하지 못했다 (5, 6). 본원에 기술된 세포 이식편의 효능은 예컨대 PD의 생체내 동물 모델을 사용하여 (1) 충분한 mDAN이 이식편에서 분화되고, 장기간 생존함; (2) 이들 mDAN가 광범위하게 숙주 선조체의 표적 영역에 신경을 재분포시킴; 및 (3) 운동 기능장애가 다중의 적절한 행동 테스트에서 상당히 개선됨과 같은 여러 기준에 의해 확인되었다. D28 C4 세포를 일측성 6-OHDA 병변이 있는 타코닉 또는 찰스 리버(Charless River) 무흉선 래트에 이식하였을 때, DA 수율이 높았고, 이식편은 숙주 구조의 광범위하고, 적절한 신경재분포를 나타냈다. 이식은 약리학적으로 유도된 회전 행동의 완전한 회복을 가져왔다. 본 연구에서 DA 수율 (이식된 세포수 대비 생존 DA 뉴런의 비) 및 행동 회복 정도는 비교가능한 hiPSC 기반 연구보다 현저히 더 높았다 (표 4) (44, 45, 57-64). 특히, 회전 행동의 회복은 최대 52주까지 지속되었으며 (도 19m), 자발적이고 약리학적으로 자극받은 것이 아니기 때문에, 임상 PD 종합적 증상의 더욱 가까운 유사물이 될 수 있는, 코리더, 실린더 및 스테핑 테스트를 포함한 여러 테스트에서 상당한 회복이 관찰되었다 (도 8).
hiPSC 기반 개인맞춤화된 세포 요법의 임상적 타당성을 확립하기 위해, 치료제를 확립된 "최적의 표준"과 비교하는 것이 중요하다. 줄기 세포 분야에서, H9 hESC는 인간 만능성 줄기 세포에 대한 이러한 표준을 대표해왔고, 인간 태아 VM 세포는 PD를 위한 이식가능한 세포 공급원으로서 최적의 표준이 되어 왔다. 파마(Parmar)와 동료들은 H9 유래 mDA 세포와 인간 태아 VM 세포의 효능을 운동 기능 회복에 대한 생체내 효능에 대해 정밀하게 비교하여 H9 유래 도파민 세포가 인간 태아 VM 세포만큼 효과적임을 입증하였다 (53). 본 동물 이식 연구는 H9 (hESC) 또는 C4 (hiPSC)가 공급원인지 여부와 상관없이, 회전 행동의 회복의 동일한 정도 및 시간 경과를 확인하였다 (도 20a). 추론하면, 상기 데이터는 본 발명자들의 프로토콜에 의해 환자 유래 hiPSC로부터 생성된 도파민 세포가 기능적으로 태아 VM 세포만큼 효과적이라는 것을 강력하게 제안한다. 다카하시(Takahashi) 등의 최근 연구는 hiPSC 유래 DA 세포가 MPTP 병변 원숭이 모델에서 생존하고, 운동 행동을 호전시킬 수 있다는 것을 정밀하게 보여주었지만 (65), 이러한 결과를 본 발명자들의 연구와 직접 비교하는 데 있어 사용된 다른 종 플랫폼이 방해가 된다. 본 발명자들은 신선한 세포 및 냉동보존된 C4 D28 세포가 모든 테스트에서 생존 DA 뉴런의 유사한 수율과 행동 개선을 초래한다는 것을 발견했으며, 이는 hiPSC로부터 유래된 mDAP가 냉동보존, 보관 및 이식을 위한 수술 위치로 배송될 수 있다는 것을 시사한다. 실용적이고, 비용면에서 효과적인 임상 요법을 개발하는 데 있어 이것이 중요하다는 것은 아무리 강조해도 지나치지 않다.
따라서, 본 방법은 PD를 위한 임상적으로 적용가능한 개인맞춤화된 자가유래 세포 요법을 제공한다.
US 20180371422; US20120128655; US20130052268; US20160002604; US 20140199274; 및 US 20090226401 뿐만 아니라, US 9657273 및 US 9750768 또한 참조한다.
세포 요법을 위한 자가유래 세포 생성
본원에 기술된 방법은 예컨대 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있는, 신경성 바닥판 세포와 유사한 유도 만능성 줄기 세포 (hiPSC)의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, hiPSC를 생성하는 방법은 대상체, 예컨대 PD를 앓고 있고, PD 치료를 필요로 하는 대상체로부터 1차 체세포 집단을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는 대상체는 포유동물, 예컨대 인간이다. 일부 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포이다. 섬유모세포는 예컨대 공지된 생검 방법을 사용하여 포유동물 신체의 결합 조직으로부터, 예컨대 피부, 예컨대 눈꺼풀, 귀 뒤쪽, 흉터 (예컨대 복부 제왕 절개 흉터) 또는 사타구니 (예컨대 문헌 [Fernandes et al., Cytotechnology. 2016 Mar; 68(2): 223-228] 참조) 피부로부터 수득할 수 있다. hiPSC를 위한 체세포의 다른 공급원으로는 모발 각질세포 (Raab et al., Stem Cells Int. 2014;2014:768391), 혈액 세포, 또는 골수 중간엽 줄기 세포 (MSC) (Streckfuss-Boemeke et al., Eur Heart J. 2013 Sep;34(33):2618-29)를 포함한다.
본 방법에 따라, 세포 (예컨대 섬유모세포)를 iPSC로의 리프로그래밍을 유도하는 인자에 노출시킨다. (예컨대 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술된 것과 같은) 프로그래밍을 위한 다른 프로토콜이 사용될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 4개의 전사 인자, 즉, Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 예컨대 코딩 서열 사이에 '자가-절단' 2A 펩티드를 코딩하는 개재 서열을 포함하는 OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC-발현 폴리시스트론 에피솜 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 2A 펩티드는 진핵 세포에서 번역 동안 폴리펩티드의 절단을 매개하는 18-22개의 아미노산 길이의 바이러스 펩티드이다. 2A 펩티드는 F2A (구제역 바이러스), E2A (말 비염 A 바이러스), P2A (돼지 테스코바이러스-1 2A), 및 T2A (토세아 아시그나(thosea asigna) 바이러스 2A)를 포함하고, 일반적으로 C-말단에 서열 GDVEXNPGP (서열식별번호(SEQ ID NO:) 1)를 포함한다. 예컨대 문헌 [Liu et al., Sci Rep. 2017; 7: 2193]을 참조한다. 하기 표는 예시적인 2A 서열을 제공한다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 본 방법은 OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC의 발현을 위해 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 및 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및 L-MYC 코딩 서열을 포함하는 폴리시스트론 에피솜 벡터로 1차 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC에 대한 예시적인 서열에 대한 참조는 하기 표에서 제공된다.
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본 방법은 또한 또는 대안적으로 세포에서 하나 이상의 외인성 마이크로RNA, 예컨대 miR-106a, -106b, -136s, -200c, -302s, -369s, 및 -371/373 중 하나 이상의 것을 발현시키는 단계를 포함한다. miR-302s는 302a, 302b, 302c, 302d, 및 367을 포함하는 5개의 miRNA를 포함하는 miR-302 클러스터를 지칭하고; 그 중 어느 하나 이상의 것이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 세포에서 예컨대 단일 에피솜 벡터로부터 miR-302s 및 miR-200c를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 내로 miR-302s 및 miR-200c를 코딩하는 서열을 포함하는 에피솜 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.
miRNA에 대한 예시적인 서열은 하기 표에서 제공된다. 굵은체로 표시된 서열은 성숙한 miRNA를 나타낸다.
Figure pct00003
사용된 서열은 본원에 제공된 예시적인 (참조) 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 또는 100% 동일하여야 하지만, 예시적인 (참조) 서열의 원하는 활성을 유지하여야 한다. 두 서열 사이의 "동일성" 계산은 하기와 같이 수행될 수 있다. 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬한다 (예컨대 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있고, 비-동일 서열은 무시할 수 있다). 비교 목적을 위해 정렬되는 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 60% (예컨대 적어도 70%, 80%, 90% 또는 100%)이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되어 있다면, 이때 상기 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 사이의 동일성(%)은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 개수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다.
두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성(%) 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(%)은 갭 패널티 12, 갭 확장 패널티 4 및 프레임시프트 갭 패널티 5인 블로썸(Blossum) 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 세포에서 OCT4, KLF4, SOX2, L-MYC, miR-302s 및 miR-200c 모두를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 세포 내로 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및 L-MYC 코딩 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 또는 폴리시스트론 에피솜 벡터, 및 miR-302s (예컨대 상기 제시된 바와 같은 것) 및 miR-200c (예컨대 상기 제시된 바와 같은 서열 또는 uaauacugccggguaaugaugga (서열식별번호 21))를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터 또는 에피솜 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.
1차 체세포는 바로 형질감염될 수 있거나, 또는 형질감염 수행 이전에, 먼저 배양되고, 배양 플레이트로부터 제거되고, 재현탁될 수 있다. 세포는 예컨대 그들의 게놈에 안정적으로 통합되도록 외인성 핵산 서열과 조합되고, 형질감염을 달성하기 위해 처리된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "형질감염"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 침전, 미세주사, DEAE-덱스트린-매개 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 비롯한, 외인성 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 다양한 기술을 포함하며, 이들 모두는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 벡터가 바이러스 벡터인 경우, 형질감염은 세포에 바이러스 입자를 형질도입시키는 것을 포함할 수 있다.
이들 인자를 세포에 도입한 후, 세포를 인자의 발현 및 iPS 세포, 예컨대 알칼리성 포스파타제 (AP) 뿐만 아니라, 더욱 엄격한 만능성 마커, TRA-1-60을 발현하는 세포로의 리프로그래밍 유도에 충분한 조건하에서 그 시간 동안 유지시킨다 (Chan et al., 2009; Tanabe et al., 2013). 다수의 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예컨대 문헌 [Malik and Rao, Methods Mol Biol. 2013;997:23-33]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 조건은 배지, 예컨대 DMEM/F-12, L-글루타민 (예컨대 2 mM), 혈청, 예컨대 우태아 혈청 (FBS) (예컨대 10%), 비필수 아미노산 (NEAA, 예컨대 1x), 니코틴아미드 (NAM, 예컨대 1 mM), 부티르산나트륨 (NaB) (예컨대 25 mM), 및 아스코르브산 (AA, 예컨대 50 ㎍/ml)을 포함하는 배지 중에서 세포를 유지시키는 것을 포함하고; 대안적으로, 넉아웃 혈청 대체물 (KSR, 정의된 FBS가 없는 배지), 글루타민 및 β-메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM 배지가 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 농도가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 세포는 4-6일, 예컨대 5-6일 동안 인큐베이션된다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체, 예컨대 기저막 추출물, 예컨대 마트리겔(MATRIGEL), 패치클리어(PATHCLEAR) 등급 기저막 추출물 (에이엠에스바이오(Amsbio)), 또는 예컨대 문헌 [Nguyen et al., Nat Biomed Eng. 2017;1. pii: 0096]에 기술된 바와 같은, 다른 합성 대체물, 예컨대 약 10 ㎕의 겔을 사용하여 직경이 2-10 mm, 예컨대 약 5 mm인 별개의, 개별적인, 바람직하게는 실질적으로 원형 또는 타원형 영역 (또한 본원에서 "스폿"으로 지칭)의 플레이트 상에 플레이팅될 수 있다. 스폿은 예컨대 (스폿이 서로 닿지 않도록) 스폿 사이의 격리를 유지하기 위해 예컨대 2 x 2 cm 그리드의 교차점에 약 1-3cm 간격으로 플레이트 위에 적절한 부피의 액적을 배치함으로써 생성될 수 있다 (도 11c). 예를 들어, 약 10 ㎕의 겔을 그리드형 배양 플레이트 상의 그리드 교차점에 배치하여 직경이 약 2-10 mm, 예컨대 약 5 mm인 스폿을 생성할 수 있다. 충분한 시간, 예컨대 10-60분, 예컨대 25-45분, 예컨대 약 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 겔을 부분적으로 스폿으로부터 흡인시켜 (완전히 건조되기 전에 중지), 스폿에 겔 층을 남긴다. 이러한 방식으로 제조된 (예컨대 본원에 기술된 바와 같은 겔 스폿을 가진) 플레이트 또한 본원에서 제공한다. 플레이트 제조 후, 이어서, 세포를 예컨대 스폿당 약 5,000-20,000개, 예컨대 약 10,000개의 밀도로, 예컨대 밀도가 10,000개/㎕인 세포 현탁액 약 10 ㎕를 플레이팅한다.
iPSC로의 리프로그래밍 후, 예컨대 임의적으로 (1) 3 배엽층 마커 (OTX2, 외배엽 마커; SOX17, 내배엽 마커; 및 BRACHYURY, 중배엽 마커)에 대한 항체로 염색 및 (2) 계통 특이적 마커 (예컨대 외배엽인 경우, PAX6 및 MAP2, 내배엽인 경우, FOXA2, SOX17 및 CK8, 및 중배엽인 경우, MSX1, MYL2A 및 COL6A2)의 유전자 발현에 의해 확인될 수 있는 ES-유사 콜로니가 형성될 때까지, 세포를 예컨대 DMEM/F-12, L-글루타민 (예컨대 2 mM), KSR (예컨대 20%), NEAA, NAM, NaB, 및 bFGF를 포함하는 hiPSC 배지 중에서 유지시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, iPSC 세포를 에센셜 8(ESSENTIAL 8) 배지 또는 그의 등가물, 즉, DMEM F-12, L-스코르브산, 셀레늄, 트랜스페린, NaHCO3, 인슐린, FGF2, 및 TGFβ1을 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 이루어진 것 중에서 유지시킨다. 예컨대 문헌 [Chen et al., Nat Methods 8(5):424-429]를 참조한다.
일단 iPS 세포가 생성되고 나면, 이는 iPS 세포주로서 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 환자를 위해, 다수의 iPSC 세포주를 생성하고, 특징화한 후, 이어서, 최상의 세포주 (예컨대 최상의 1, 2, 3개 또는 그 초과의 세포주)를 선택한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 세포, 예컨대 iPS 세포주, 및 상기 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
바이러스 벡터
본 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
본 방법에서 내이로의 핵산 전달에 유용한 바람직한 바이러스 벡터 시스템은 아데노 연관 바이러스 (AAV)이다. AAV는 25 nm 캡시드를 갖는 외피가 없는 작은 바이러스이다. 어떤 질환도 공지된 바 없거나, 또는 야생형 바이러스와 연관이 있는 것으로도 보이지 않는다. AAV는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 가지고 있다. AAV는 장기간 에피솜 트랜스진 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌고, AAV는 뇌, 특히, 뉴런에서 우수한 트랜스진 발현을 보였다. AAV의 최소 300개 염기쌍을 포함하는 벡터를 패키징하고, 통합할 수 있다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.7 kb로 제한된다. 예컨대 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]에 기술된 것과 같은 AAV 벡터가 DNA를 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 다양한 핵산이 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 유형에 도입되었다 (예를 들어, 문헌 [Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)]; [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)]; [Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)]; [Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)]; 및 [Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)] 참조). 다수의 대안적인 AAV 변이체가 존재하고 (100개 초과의 것이 클로닝됨), AAV 변이체는 바람직한 특성에 기초하여 확인되었다. 예를 들어, AAV9는 혈액-뇌 장벽을 효율적으로 통과하는 것으로 나타났다. 추가로, 예컨대 비오티닐화된 AAV 벡터, 방향적 분자 진화, 자가-상보성 AAV 게놈 등과 같이, AAV 캡시드는 형질도입 효율 및 선택성을 증가시키도록 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV1이 사용된다.
대안적으로, 레트로바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스 벡터는 생체내, 특히, 인간으로의 외인성 유전자의 전달을 위한 재조합 유전자 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 유전자를 세포 내로 효율적으로 전달하고, 전달된 핵산은 숙주의 염색체 DNA에 안정적으로 통합된다. 복제 결함 레트로바이러스만을 생산하는 특수 세포주 ("패키징 세포"로 명명)의 개발은 유전자 요법을 위한 레트로바이러스의 유용성을 증가시켰고, 결함 레트로바이러스는 유전자 요법 목적을 위한 유전자 전달에 사용하기 위해 특징화된다 (리뷰를 위해, 문헌 [Miller, Blood 76:271 (1990)] 참조). 복제 결함 레트로바이러스는 표준 기술에 의해 헬퍼 바이러스를 사용하여 표적 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있는 비리온으로 패키징될 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 생산하기 위한 프로토콜 및 세포를 시험관내 또는 생체내에서 상기 바이러스로 감염시키기 위한 프로토콜은 문헌 [Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14], 및 다른 표준 실험실 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다. 적합한 레트로바이러스의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM을 포함한다. 제한숙주역 및 양쪽성 레트로바이러스 시스템, 둘 모두를 제조하는 데 적합한 패키징 바이러스 계통의 예로는 ψCrip, ψCre, ψ2 및 ψAm을 포함한다. 레트로바이러스는 시험관내 및/또는 생체내에서 상피 세포를 비롯한 다수의 상이한 세포 유형으로 다양한 유전자를 도입하는 데 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398]; [Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464]; [Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018]; [Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145]; [Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043]; [Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381]; [Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805]; [van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644]; [Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647]; [Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895]; [Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115]; 미국 특허 번호 4,868,116; 미국 특허 번호 4,980,286; PCT 출원 WO 89/07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출원 WO 92/07573 참조).
본 방법에 유용한 또 다른 바이러스 유전자 전달 시스템은 아데노바이러스 유래 벡터를 사용한다. 아데노바이러스의 게놈은 관심 유전자 생성물을 코딩하고, 발현하지만, 정상적인 용균성 바이러스 생활사에서 그의 복제하는 능력의 관점에서 불활성화되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkner et al., BioTechniques 6:616 (1988)]; [Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)]; 및 [Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)]를 참조한다. 아데노바이러스 균주 Ad 타입 5 dl324 또는 아데노바이러스의 다른 균주 (예컨대 Ad2, Ad3, 또는 Ad7 등)로부터 유래된 적합한 아데노바이러스 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 그들이 비분열 세포는 감염시키지 못하고, 상피 세포를 비롯한 매우 다양한 세포 유형을 감염시키는 데 사용될 수 있다는 점에서 특정 상황에서 유리할 수 있다 (Rosenfeld et al., (1992) 상기 문헌 동일). 추가로, 바이러스 입자는 비교적 안정적이고, 정제 및 농축이 용이하며, 상기와 같이 감염 스펙트럼에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 추가로, 도입된 아데노바이러스 DNA (및 그 안에 포함된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고, 에피솜으로 남아 있게 되고, 이에 의해, 도입된 DNA가 숙주 게놈에 통합되는 (예컨대 레트로바이러스 DNA) 계내 삽입 돌연변이의 결과로 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 피할 수 있다. 추가로, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 운반 능력은 다른 유전자 전달 벡터에 비해 크다 (최대 8 킬로베이스) ([Berkner et al., 상기 문헌 동일]; [Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267 (1986)]).
mDAP / mDAN으로의 분화
일부 실시양태에서, 본 방법은 하기와 같이 mDAP 또는 mDAN을 생산하는 데 사용된다. 바닥판 유도를 위해, 형질감염 후, 세포를 15% KSR, 글루타민, β-메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM 배지 중에서 약 6일 동안 (D1-D6) 동안 유지시킨다. 6일째-12일째 (D6-D12)인 신경 전구체 유도 단계 동안, 세포를, L-글루타민, β-메르캅토에탄올 및 비필수 아미노산 (NEAA)을 비롯하여, 11.5% KSR, 0.25% N2 (D6-8), 7.5% KSR, 0.5% N2 (D8-10), 3.75% KSR, 0.75% N2 (D10-12)를 포함하는 DMEM 배지 중에서 유지시킨다. 이중 Smad 억제제인 0.2 μM LDN193189 및 10 μM SB431542를 예컨대 각각 D1-D12, 및 D1-D8부터 첨가할 수 있다. 100 ng/ml FGF8과 함께 하나 이상의 SHH 효능제 (예컨대 2 μM 푸르모르파민 및 100 ng/ml Shh)를 예컨대 D2부터 D10까지 첨가할 수 있다. Wnt 신호전달 활성화제, 예컨대 CHIR99021 (1 μM)은 예컨대 D4부터 D12까지 포함할 수 있다. D9에 세포를 케르세틴, 예컨대 40 μM으로, 예컨대 6-24 또는 12-18시간 동안, 예컨대 16시간 동안 처리할 수 있다.
DA 전구체 유도 및 성숙 단계 (D12+)를 위해, 세포를 감마 세크레타제 억제제 (예컨대 DAPT, 예컨대 10 μM) 및 Wnt 효능제 (예컨대 CHIR99021, 예컨대 1 μM)와 함께 N2, BDNF (예컨대 20 ng/ml), GDNF (예컨대 20 ng/ml), dbcAMP (예컨대 500 μM), 아스코르브산 (예컨대 200 μM), TGF-β3 (예컨대 10 ng/ml)으로 보충된 DMEM:F12 배지 중에서 약 D12-15 동안 유지시킬 수 있다.
약 D15에, 스폿의 세포를 수확하고, 예컨대 EDTA를 사용하여 예컨대 화학적으로, 효소적으로 또는 기계적으로 해리시킬 수 있고, 단일 세포 현탁액을 예컨대 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴/라미닌 코팅 (PLO/FN/L 코팅) 접시에 재플레이팅할 수 있다. D15부터 배지, 예컨대 N2, BDNF (예컨대 20 ng/ml), GDNF (예컨대 20 ng/ml), dbcAMP (예컨대 500 μM), 아스코르브산 (예컨대 200 μM), 및 TGF-β3 (예컨대 10 ng/ml)을 비롯한 성장 인자를 포함하는 DMEM:F12를 적용시킬 수 있다. ROCK 억제제, 예컨대 Y-27632 (예컨대 10 μM)를 해리 당일 그 기간 동안 첨가한 후, 이어서, 제거할 수 있다. 이어서, mDAP 마커 (예컨대 OTX2, LMX1A, 및 EN1)의 발현, 및/또는 mDAN 마커 (예컨대 TH, DAT, 및 PITX3)의 발현을 위해 충분한 mDA 전구체 (mDAP) 및/또는 mDA 뉴런 (mDAN)의 유도시까지, 예컨대 적어도 21-28일 동안 세포를 배양물 중에서 유지시킬 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 시약 및 농도가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, SHH 효능제는 푸르모르파민, 옥시스테롤, 및 스무슨드(Smoothened) 효능제 (SAG)를 포함하고; 다수의 Wnt 효능제가 하기 표 A에 제공되어 있다.
표 A. Wnt 효능제
Figure pct00004
Figure pct00005
다른 감마 세크레타제 억제제는 RO4929097; DAPT (N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신-1,1-디메틸에틸 에스테르); L-685458 ((5S)-(t-부톡시카르보닐아미노)-6-페닐-(4R)히드록시-(2R)벤질엑사노일)-L-leu-L-phe-아미드); BMS-708163 (아바가세스타트(Avagacestat)); BMS-299897 (2-[(1R)-1-[[(4-클로로페닐)술포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산); MK-0752; YO-01027; MDL28170 (시그마(Sigma)); LY411575 (N-2((2S)-2-(3,5-디플루오로페닐)-2-히드록시에타노일)-N1-((7S)-5-메틸-6-옥소-6,7-디히드로-5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)-1-알라닌아미드 (US 6,541,466 참조); ELN-46719 (LY411575의 2-히드록시-발레르산 아미드 유사체 (여기서 LY411575은 3,5-디플루오로-만델산 아미드이다) (미국 특허 번호 6,541,466)); PF-03084014 ((S)-2-((S)-5,7-디플루오로-1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌-3-일아미노)-N-(1-(2-메틸-1-(네오펜틸아미노)프로판-2-일)-1H-이미다졸-4-일)펜탄아미드 (문헌 [Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575]); 화합물 E ((2S)-2-{[(3,5-디플루로페닐)아세틸]아미노}-N-[(3S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-1,4-벤조디아제핀-3-일]프로판아미드 (WO 98/28268 및 문헌 [ Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575] 참조); 및 세마가세스타트(Semagacestat) (LY450139; (2S)-2-히드록시-3-메틸-N-((1S)-1-메틸-2-{[(1S)-3-메틸-2-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-3-벤즈아제핀-1-일]아미노}-2-옥소에틸)부탄아미드), 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 세포, 예컨대 mDAP 또는 mDAN 세포, 및 상기 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 방법은 iPSC의 도파민성 뉴런으로의 분화를 예시하지만, 스폿팅 방법은 다른 뉴런 유형을 비롯한 다른 세포 유형에 대한 분화 프로토콜에 사용될 수 있다. 다수의 뉴런 분화 프로토콜이 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예컨대 문헌 [Salimi et al., Mol Biol Rep. 2014 Mar;41(3):1713-21]; [Gunhnlar et al., Molecular Psychiatry 23:1336-1344 (2018)]; [Trilck et al., Methods Mol Biol. 2016;1353:233-59]; [Zhang et al., Stem Cell Res Ther. 2018 Mar 15;9(1):67]; [D'Aiuto et al., Organogenesis. 2014;10(4):365-77]; [Marton and Ioannidis, Stem Cells Translational Medicine 2019;8:366-374]; [Bell et al. Bio-protocol 9(5): e3188 (2019). DOI: 10.21769/BioProtoc.3188]; [Bianchi et al., Stem Cell Research 32:126-134 (2018)]을 참조한다.
치료 방법
본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 mDAP 및 mDAN은 예컨대 세포 모델로서, 및 파킨슨병 (PD)을 앓는 (또는 그의 발생 위험이 있는) 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 대상체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 숙련된 의료 제공자에 의해 확인될 수 있다. 본 방법은 1차 체세포를 수득하는 단계; mDAP를 포함하는 세포 집단을 생성하고, 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는 1차 체세포는 PD를 앓는 (또는 그의 발생 위험이 있는), 치료하고자 하는 대상체로부터 수득되지만, 일부 실시양태에서, 세포는 바람직하게는 치료하고자 하는 대상체와 동일한 종의 상이한 대상체 (즉, 자가유래 세포), 바람직하게는 면역학적으로 매칭되는 대상체로부터 수득된다. 바람직하게는 mDAP는 1, 2개 또는 그 초과의 mDAP 마커 (예컨대 FOXA2, OTX2, LMX1A, 및 EN1, 예컨대 FOXA2 및 LMX1A; 임의적으로 FOXA2, LMX1A 및 NURR1을 공동 발현하는 TH+ 세포)를 발현하는 세포, 및 임의적으로 1, 2개 또는 그 초과의 mDAN 마커 (예컨대 TH, DAT, 및 PITX3)를 발현하는 세포를 포함하지만, SOX1, PAX6, 및 KI67을 발현하는 세포는 포함하지 않는, 집단을 생성하는 데 충분한, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 생성된다.
세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 예컨대 자기 공명 영상-유도 정위 수술을 사용하여 대상체 뇌의 이환 영역 내로 또는 그 근처에, 예컨대 미상핵, 피각, 및 흑색질 중 하나 이상의 것 내로 양측으로 직접 이식함으로써 투여된다. 예컨대 문헌 [Garitaonandia et al., Stem Cells Dev. 2018 Jul 15;27(14):951-957]; [Kikuchi et al., Nature 548:592-596 (31 August 2017)]; [MOrizane et al., Nature Communications 8:385 (2017)]; [Sonntag et al., Prog Neurobiol. 2018 Sep;168:1-20]을 참조한다.
배양 접시
본원에서는 또한 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 배양 접시도 제공한다. 접시는 바닥에 라인 사이의 거리가 1.5-2.5 cm, 예컨대 약 2 cm인 그리드, 예컨대 2x2 cm 그리드를 갖는다. 그리드는 예컨대 바닥 상에 접시의 일부로서 형성되거나, 프린팅되거나, 또는 에칭될 수 있다. 배양 접시는 공지된 관련 기술분야, 및 배양 접시용으로 허용되는 임의의 물질, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 및 폴리비닐 열가소성 수지를 사용하여 예컨대 종래의 사출 성형 또는 열성형 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 또 다른 적합한 물질은 유리이다. 일부 실시양태에서, 접시는 실질적으로 평평한 바닥을 갖고; 대안적으로, 그리드 라인의 교차점에 예컨대 직경이 약 2-10 mm, 예컨대 약 3-7 mm, 예컨대 약 5 mm인 원형 또는 타원형 딥 또는 함몰부가 있을 수 있다. 함몰부의 깊이는 예컨대 0.01-0.2 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 접시는 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체, 즉, 기저막 추출물 또는 합성 매트릭스를 갖는다.
일부 실시양태에서, 그리드를 갖는 배양 접시는 세포를 플레이팅하기 위한, 각각 12 또는 6개의 교차점을 갖는 10 또는 6 cm의 원형 배양 접시이다. 세포 배치 영역 사이의 거리 (스폿의 중심에서 인접 스폿의 중심까지의 거리)는 2 cm이고, 셀 스폿의 직경은 0.5 cm이다. 둘레는 약 1.57 cm이고, 면적은 약 0.2 ㎠이다. 따라서, 교차하는 그리드 라인에는 6 cm 접시의 경우, 가능한 스폿은 단 6개만이 존재하고, 10 cm 접시의 경우, 12개의 가능한 스폿이 존재한다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
물질 및 방법
하기 실시예에서는 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
사용된 항체 및 시약은 하기 표 B에 제시되어 있다.
표 B. 시약 정보
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
생검
3명의 건강한 대상체 및 1명의 산발성 PD 환자로부터의 피부 생검 (표 C)을 IRB 승인 프로토콜 (파트너스(Partners) IRB #2010P001100)하에 채취하였다.
표 C. 에피솜 플라스미드 기반 hiPSC 생성 요약
Figure pct00010
실험 동물
각 군의 동물의 계통에 관한 세부 사항 및 마리수는 하기와 같다:
6-OHDA 병변이 있는 무흉선 래트 (NTac:NIH-Foxn1rnu, 타코닉 바이오사이언시스(Taconic Biosciences)), 수컷, 12-14주령. 무흉선 래트 (Crl:NIH-Foxn1rnu, 찰스 리버, 계통 코드 번호 316), 수컷, 12-14주령. NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl, 찰스 리버 계통 코드 번호 394), 수컷 또는 암컷, 8-10주령. 모든 동물을 멸균 사료 및 식수에 자유롭게 접근할 수 있도록 하면서, 12시간 명기/암기 사이클하에 환기형 케이지에서 하우징하였다.
세포 배양
인간 BJ 진피 섬유모세포 (hDF) 및 HEK293T 세포를 ATCC로부터 구입하고, 앞서 공개된 프로토콜에 따라 성장시켰다 (19). hiPSC 유도를 위해, 감염된 세포를 형질감염 후 5일 동안 DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 10% FBS, 1x NEAA, 1 mM NAM, 25 mM NaB, 및 50 ㎍/ml AA를 함유하는 유도 배지 중에서 유지시킨 후, 이어서, DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 20% KSR, 1x NEAA, 1 mM NAM, 25 mM NaB, 및 10 ng/ml bFGF를 함유하는 hiPSC 배지 중에서 유지시켰다. H9 hESC 세포주는 와이셀 인스티튜트로부터 입수하였다. 모든 hiPSC 세포주를 마트리겔 매트릭스를 이용하여 에센셜 8 배지 중에서 유지시키고, 부드러운 해리를 위해 0.5 mM EDTA 용액을 사용하여 계대배양하였다. 모든 hESC 세포주를 마트리겔 매트릭스를 이용하여 mTeSR™ 1 배지 중에서 유지시켰다. 본 연구에 사용된 세포주 중 어느 것도 ICLAC 및 NCBI 바이오샘플에 의해 유지되는 일반적으로 잘못 식별된 세포주의 데이터베이스에서 발견되지 않았다. 모든 세포주는 제공 회사의 종간 결정 (동종효소 분석 및 STR 분석)에 의해 인증되었고, 마이코플라스마 검출에 대해 통상적으로 시험되었다.
인간 iPSC 생성
렌티바이러스 기반 hiPSC 생성을 위해, Y4 인자 (OCT4, SOX2, KLF4, 및 C-MYC; 구스타보 모스토슬라프스키 박스(Dr. Gustavo Mostoslavsky)에 의해 아낌없이 제공) 및/또는 miRNA를 함유하는 개별 렌티바이러스 벡터 또는 폴리시스트론 STEMCCA 벡터로부터의 렌티바이러스 입자로 세포를 밤새도록 형질도입시켰다. 다음날, 배지를 유도 배지로 교체하고, 세포를 5일 동안 인큐베이션시켰다. 6일째, 세포에 hiPSC 배지를 공급하고, ES-유사 콜로니가 형성될 때까지, 상기 배지에서 보관하였다. 관찰된 ESC-유사 콜로니를 엄선하고, 에센셜 8 배지 중에서 마트리겔 코팅 조직 배양 플레이트로 옮겨 hiPSC 세포주를 생성하였다.
에피솜 시스템 기반 hiPSC 생성을 위해, 네온(Neon) 형질감염 시스템을 사용하여 리프로그래밍 인자-발현 pCXLE 벡터로 세포를 전기천공시킨 후, 이어서, 10 μM Y-27632가 보충된 hDF 배지 중에서 마트리겔 코팅 6 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 세포에 추가로 5일 동안 유도 배지를 공급하였다.
플라스미드 구축 및 렌티바이러스 제조
miR-17/92, -106a, -106b, -200c, -302s, -369s 및 -371/373에 대한 개별 miRNA에 대한 코딩 서열을 H9 hESC로부터 PCR 증폭시키고, pGEM-T 이지(pGEM-T Easy) 벡터에 클로닝하고, 그의 아이덴티티를 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이어서, FUW-tetO 벡터의 EcoRI 부위에 도입하였다. OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC-발현 폴리시스트론 에피솜 벡터의 경우, 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및 L-MYC 코딩 서열을 H9 hESC로부터 PCR 증폭시킨 후, 이어서, EGFP 서열이 없는 변형된 pCXLE 에피솜 벡터에 순차적으로 도입하였다. miR-302s 및/또는 miR-200c 발현 에피솜 벡터의 경우, 인간 miR-302s 또는 -200c 코딩 서열을 변형된 pCXLE 벡터에 도입하였다.
렌티바이러스 제조는 약간 변형하여 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다 (Cha et al., 2017. Nat Cell Biol 19:445-456). 간략하면, 제조사의 설명서에 따라 폴리제트 형질감염 시약을 사용하여 10% FBS로 보충된 DMEM 중에서 유지시킨 293T 세포를 pMD2.G, 및 psPAX2를 포함한 패키징 플라스미드와 함께 렌티바이러스 벡터로 공동 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 형질감염 48 h 후에 수집하고, 0.45 ㎛ 밀렉스-HV(Millex-HV) (밀리포어) 필터를 통해 여과하여 세포 파편을 제거하였다.
hiPSC 형성 검정
TRA-1-60 염색을 위해, 세포를 4% 포름알데히드로 5 min 동안 고정시키고, PBS로 세척한 후, 항-TRA-1-60 항체 (1:500)와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 염소 항-마우스 IgG (1:500)와 함께 1 h 동안 인큐베이션시켰다. PBS 중 0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 3회 세척한 후, 제조사의 설명서에 따라 세포를 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)으로 염색하였다. AP 염색을 위해, 고정된 세포를 PBS로 세척한 후, 알칼리성 포스파타제 기질 NBT/BCIP 용액으로 염색한 후, 이어서, PBS로 3회 세척하여 반응을 정지시켰다.
생세포 대사 분석
산소 소비율 (OCR) 및 세포외 산성화율 (ECAR)을 제조사의 설명서에 따라 XFp 분석기 (애질런트 테크놀로지즈)를 사용하여 측정하였다. 간략하면, 세포를 XF 미니 플레이트의 웰에 플레이팅하고, CO2 인큐베이터에서 37℃하에 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세포를 비-CO2 인큐베이터에서 10 mM 글루코스, 5mM 피루브산나트륨 및 2mM L-글루타민이 보충된 XF 검정 배지에서 1 h 동안 평형화시킨 후, 검정을 수행하였다. hDF의 미토콘드리아 활성은 1 μM 올리고마이신 (올리고(Oligo)), 2 μM FCCP, 및 0.5 μM 안티마이신 A/로테논 (Anti/Rot)을 순차적으로 주입하여 모니터링하여 기초 호흡 (= 기준선 OCR - Anti/Rot OCR), ATP 전환 (= 기초 호흡 - 올리고 OCR), 최대 호흡 (= FCCP OCR - Anti/Rot OCR), 및 산화적 예비량 (= 최대 호흡 - 기초 호흡)을 계산하였다. 각각의 플롯팅된 값을 브래드퍼드(Bradford) 단백질 검정법을 이용하여 정량화된 총 단백질로 정규화하였다.
정량적 RT- PCR
총 RNA를 추출하기 위해, 트리졸(Trizol)로 세포를 용해시키고, 제조사의 권장 사항에 따라 RNA를 분리하였다. RNA 농도는 나노드롭 ND-1000(Nanodrop ND-1000) 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지즈(NanoDrop Technologies))를 사용하여 측정하였다. RNA는 슈퍼스크립트 II(Superscript II)를 사용하여 올리고 dT 프라이머로 역전사시켰다. 실시간 정량적 RT-PCR을 위해, 본 발명자들은 Sso어드밴스드 유니버셜 SYBR 그린 슈퍼믹스(SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix)를 사용하였고, CFX 컨넥트 리얼-타임 시스템(CFX Connect Real-Time System) (바이오-래드(Bio-Rad))에서 반응을 수행하였다. 유전자 특이적 프라이머 (표 D)를 사용하여 PCR 증폭을 생성하였다. 표적 유전자 발현은 비교 Ct 방법에 의해 내인성 액틴으로 정규화하여 결정하였다.
표 D. 본 연구에서 사용된 프라이머 서열 목록
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
핵형 분석
인간 iPS 세포 염색체의 개수 및 구조를 평가하기 위해 표준 G-밴드 핵형 분석을 위해 인간 iPS 세포를 셀 라인 제네틱스, 인크.(Cell Line Genetics, Inc: 미국 위스콘신주 매디슨)로 송부하였다.
에피솜 플라스미드 검출
써모 사이언티픽 진제트 플라스미드 미니프렙 키트(Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit)로 세포질 플라스미드를 분리하여 통합되지 않은 잔류 벡터의 존재를 검출하였다. 20 ㎕ 추출물로부터 각 2 ㎕씩을 EBNA-1 특이적 프라이머를 사용하는 95℃에서 30 sec, 55℃에서 30 sec 및 72℃에서 30 sec, 30 사이클의 종래의 PCR 증폭에 사용하였다. 퀴아젠 DN이지 블러드 & 티슈 키트(Qiagen's DNeasy Blood & Tissue Kit)를 이용하여 게놈 DNA를 제조하였다. 플라스미드 유래 서열 검출을 위해, 본 발명자들은 동일한 PCR 조건 및 EBNA-1 프라이머를 사용하였다. GAPDH 프라이머를 투입 대조군으로 사용하였다. EBNA-1 및 GAPDH 프라이머 서열은 표 D에 제시되어 있다.
DNA 핑거프린팅
QIAamp DNA FFPE 티슈 키트(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)를 이용하여 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, 표준 완충제 조건, 0.2 ㎍의 DNA 및 GoTaq DNA 폴리머라제를 이용하여, 95℃에서 30 sec 동안 변성, 55℃에서 30 sec 동안 어닐링, 및 72℃에서 1 min 동안 연장으로 35 사이클을 이용하여 총 부피 20 ㎕로 PCR을 수행하였다. 본 연구에서 사용된 프라이머는 표 D에 열거되어 있다.
전체 엑솜 시퀀싱
섬유모세포 리프로그래밍 및 리프로그래밍된 iPSC의 계대배양으로부터 생성된 체세포 돌연변이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 >1,400개의 암 관련 유전자를 포함하여 >8,000개의 의학적으로 관련된 유전자의 증강된 커버리지를 제공하는 페르소나리스 ACE WES(Personalis ACE WES) 서비스를 사용하여 섬유모세포 및 4개 iPSC 세포주의 WES를 수행하였다 (Patwardhan et al. 2015. Genome Med 7:71). 표적 영역에 대한 커버리지의 평균 범위 깊이는 모든 샘플에 걸쳐 75x를 초과하였다. 4개의 iPSC 세포주에 대해, 본 발명자들은 MuTect2를 사용하여 섬유모세포 및 각 iPSC 세포주의 대응표본 분석을 수행하여 체세포 돌연변이를 검출하였다 (Cibulskis et al., 2013. Nat Biotechnol 31:213-219).
BWA-MEM 프로그램 (버전 0.7.15) (Li and Durbin, 2010. Bioinformatics 26:589-595)을 사용하여 대체 콘티그 및 디코이를 포함하는 GRCh38 참조 게놈에 대해 시퀀싱 리드를 정렬시켰다. SAMtools (버전 1.3.1) (Li et al., 2009. Bioinformatics 25:2078-2079), 피카드(Picard) 툴 (broadinstitute.github.io/picard, 버전 2.5.0) 및 게놈 애널리시스 툴 키트(Genome Analysis Tool Kit: GATK) 소프트웨어 (버전 3.6) (DePristo et al. 2011. Nat Genet 43:491-498)로 매핑된 리드를 추가로 프로세싱하여 분석 준비가 된 BAM 파일을 생성하였다. 각 iPSC 세포주를 GATK에서 MuTect2 모듈을 이용하여 섬유모세포와의 비교로 체세포 돌연변이에 대해 분석하였다 (Cibulskis et al., 상기 문헌 동일). 확인된 체세포 돌연변이는 앙상블 배리언트 이펙터 프레딕터(Ensembl Variant Effect Predictor) (버전 GRCh38.89) (McLaren et al., 2016. Genome Biol 17:122)를 사용하여 주석을 달아 유전자 전사 및 단백질 생성물에 미치는 영향을 조사하였다. 위양성 체세포 돌연변이 호출을 줄이기 위해, 본 발명자들은 잘 커버된 영역에서 모든 샘플에서 20개 이상의 효과적인 고품질의 정렬된 리드가 있는 것으로 발견된 것만을 고려하였다. 본 발명자들은 후보 중에서 엑솜 애그리게이션 컨소시엄(Exome Aggregation Consortium: ExAC) 데이터베이스 (Lek et al. 2016. Nature 536:285-291)에서 최대 소수 대립유전자 빈도가 > 0.01%인 돌연변이를 제외하여 잠재적 생식계열 변이체를 여과시켰다. 남은 체세포 돌연변이 후보의 경우, 본 발명자들은 암에서의 체세포 돌연변이 카탈로그(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer: COSMIC) (cancer.sanger.ac.uk, 버전 80) (Forbes et al. 2017. Nucleic Acids Res 45:D777-D783) 및 암 유전자 센서스(Cancer Gene Census: CGC) 데이터베이스 (Futreal et al. 2004. Nat Rev Cancer 4:177-183)를 질의하여 암에서 자주 보고되는 돌연변이 및 유전자를 확인하였다. 본 발명자들은 ngCGH (github.com/seandavi/ngCGH, 버전 0.4.4) 및 페르소나리스 ACE 암 엑솜(Personalis ACE Cancer Exome) 파이프라인 (페르소나리스 인크.(Personalis, Inc.: 미국 캘리포니아주))으로부터의 카피수 변이 (CNV) 분석 결과를 이용하여 염색체 이상 및 다른 영역의 카피수 변동을 조사하였다. 본 발명자들은 인터그레이티드 게놈 뷰어(Integrated Genome Viewer) (버전 2.3.79)에서 리드 정렬에 대한 모든 CNV 후보를 시각적으로 검사하였다.
케르세틴 처리
케르세틴이 인간 iPSC 제거에 미치는 효과를 시험하기 위해, 인간 iPSC를 6웰 플레이트에 플레이팅하였다. 2, 6, 16, 24시간 동안 각 농도의 케르세틴 (5, 10, 20, 40, 및 100 μM)으로 세포를 처리하였다. 각 시점 이후에, 케르세틴 함유 배지를 신선한 배지로 교체하고, 초기 케르세틴 처리 시간으로부터 48시간 동안 세포를 배양하였다. TrypLE를 사용하여 세포를 해리시키고, 트리판 블루(Trypan blue) 배제 및 혈구계산기를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
유세포 분석법
모든 FACS 분석은 BD 어큐리 C6(BD Accuri C6) 시스템(BD 바이오사이언스((BD Bioscience))을 사용하여 수행하였고, 데이터 분석은 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 인간 iPS 세포를 각각 TrypLE 또는 어큐타제(Accutase)를 사용하여 해리시키고, 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과시켰다. 먼저, 단일 세포 현탁액을 10 min 동안 4% 포름알데히드로 고정시키고, 얼음 위에서 15 min 동안 투과화 완충제에 현탁시켰다. 30 min 동안 차단시킨 후, 세포를 암실에서 얼음 위에서 1시간 동안 1차 표지된 항체 (PE 접합된 항 SSEA-4, TRA-1-60)와 함께 인큐베이션시켰다. 1% FBS가 포함된 PBS로 세척한 후, FACS 분석을 수행하였다. 형광색소가 매치되는 이소형 대조군을 사용하였고, 분석 동안 감산하였다.
세포 손실/세포 수확 분석을 위해, 단층 기반 또는 스폿팅 기반 배양 접시로부터 상청액을 수확하고, FACS를 실행하였다. 100 ㎕의 상청액 중 입자의 개수를 계산하고, 총 상청액 부피 대비 100 ㎕의 비를 기준으로 총 세포수를 수득하였다.
미분화 세포의 존재 검출
미분화된 C4 세포의 혼합물을 총 100,000개 세포에서 10배 (105, 104, 103, 102, 101 및 100)의 연속 배율로 hDF 중에서 연속 희석하여 3가지 다른 방법을 사용하여 잔류 C4 세포를 검출하였다. 콜로니 형성 검정을 위해, 각 세포 희석액을 E8 배지에서 6일 동안 배양하고, AP 염색에 의해 만능성 콜로니를 확인하였다. 미분화 세포의 케르세틴 제거를 위해, 세포를 40 μM 케르세틴으로 16시간 동안 처리하고, 신선한 E8 배지에서 배양하였다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 위해, C4 세포를 TrypLE를 사용하여 해리시키고, 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과시켰다. 먼저, 단일 세포 현탁액을 10 min 동안 4% 포름알데히드로 고정시키고, 얼음 위에서 15 min 동안 투과화 완충제에 현탁시켰다. 30 min 동안 차단시킨 후, 세포를 암실에서 얼음 위에서 1시간 동안 1차 표지된 항체 (PE 접합된 항 SSEA-4, TRA-1-60)와 함께 인큐베이션시켰다. 1% FBS가 포함된 PBS로 세척한 후, BD 어큐리 C6 시스템 (BD 바이오사이언스)을 사용하여 FACS 분석을 수행하고, 데이터 분석은 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 형광색소가 매치되는 이소형 대조군을 사용하였고, 분석 동안 감산하였다. qRT-PCR 검정을 위해, 모든 희석액으로부터 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR을 수행하여 OCT4 사이클 시간 (Ct) 값을 결정하였다. OCT4 카피수는 정제된 OCT4 부분 서열의 qRT-PCR로부터 작성된 방정식 곡선으로부터 계산하였다. 이어서, OCT4 카피수를 PSC 수에 대해 플롯팅하였다.
스폿팅된 접시 제조
도 13b에 제시된 바와 같이, 6 cm 접시의 바닥에 2개의 수평선과 3개의 수직선으로 이루어진 그리드를 그려 6개의 접합부를 수득하였다. 10 ㎕의 냉 마트리겔을 각 접합부에 로딩하여 제한된 스팟 코팅 영역을 만들었다. 스폿팅된 접시를 37℃에서 적어도 30 min 동안 인큐베이션시키고, 세포 플레이팅 직전에 마트리겔을 흡인하였다. 균질하게 현탁된 세포를 60 mm 세포 배양 접시에 730 K/접시의 밀도 (일반 플레이팅 조건)로 플레이팅한 반면, 스폿팅된 접시는 40K/10 ㎕ 스폿, 10K/10 ㎕ 스폿, 2.5K/10 ㎕ 스폿 (스폿팅 조건)을 받았다.
mDA 전구체 분화
분화 배지 조건 및 모든 모르포겐 인자는 도 5a에 제시되어 있다. 전체 분화 전 과정 동안 항생제는 사용되지 않았다. 바닥판 유도 단계 (D1-6)를 위해, 본 발명자들은 15% KSR, 글루타민, β-메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 신경 전구체 유도 단계 (D6-12)를 위해, 본 발명자들은 L-글루타민, β-메르캅토에탄올 및 비필수 아미노산 (NEAA)을 비롯하여, 11.5% KSR, 0.25% N2 (D6-8), 7.5% KSR, 0.5% N2 (D8-10), 3.75% KSR, 0.75% N2 (D10-12)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 이중 Smad 억제제인 0.2 μM LDN193189 및 10 μM SB431542를 각각 D1-D12, 및 D1-D8부터 첨가하였다. D2부터 D10까지, 세포를 100 ng/ml FGF8과 함께 SHH 효능제 (2 μM 푸르모르파민 및 100 ng/ml Shh)로 처리하였다. Wnt 신호전달 활성화제, CHIR99021 (1 μM)를 D4부터 D12까지 포함시켰다. D9에 세포를 40 μM 케르세틴으로 16시간 동안 처리하였다. DA 전구체 유도 및 성숙 단계 (D12+)를 위해, DMEM:F12 배지를 10 μM DAPT 및 1 μM CHIR과 함께 N2 보충제, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 500 μM dbcAMP, 200 μM 아스코르브산, 10 ng/ml TGF-β3으로 보충하였다 (D12-15). D15에 세포를 0.5 mM EDTA로 해리시키고, 단일 세포 현탁액을 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴/라미닌 코팅된 접시에 대략 250만개/접시로 재플레이팅하였다. D15부터 계속해서 DMEM:F12 배지에 N2 보충제, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 500 μM dbcAMP, 200 μM 아스코르브산, 10 ng/ml TGF-β3을 적용하였다. 수확시 10 μM Y-27632를 배지에 첨가하였다.
면역세포화학법
hiPSC 유래 도파민성 뉴런을 포스페이트 완충처리된 염수(PBS) (Ca2+ 및 Mg2+ 포함)로 세척하고, PBS (pH 7.4) 중 4% 포름알데히드로 10 min 동안 고정시켰다. 세포를 실온에서 차단 용액 (PBS 중 0.3% 트리톤 X-100 및 1% 말 혈청)에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 0.3% 트리톤 X-100 및 1% 말 혈청을 함유하는 PBS에서 1차 항체와 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 실온에서 1 hr 동안 핵 염색을 위해 훽스트 33342와 함께 적절한 형광 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포 이미지는 공초점 현미경법 (키엔스(KEYENCE: 일본 오사카))으로 수득하였다. 특정 세포 집단에 관한 데이터는 이미지J(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지로부터 결정하였다 (11). 아폽토시스 세포를 측정하기 위해, 아폽토시스 마커인 절단된 카스파제 3, 및 DNA 결합 핵 염료인 훽스트 33342에 대해 염색하였다. 훽스트 33342로 염색한 후, 조밀하게 압축된 염색질은 정상 세포보다 밝고, 응축된 핵은 형광 현미경법으로 계수하였다. 특정 세포 집단에 관한 데이터는 이미지J 소프트웨어에 의한 현미경 이미지로부터 결정하였다.
고성능 액체 크로마토그래피 ( HPLC ) 분석
분화 47일째, 상청액을 수집하고, 300 x g로 5 min 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 샘플은 즉시-80℃에서 보관하고, DA 및 DOPAC의 수준을 결정하기 위해 전기화학적 검출과 함께 역상 HPLC를 위해 에모리 대학의 HPLC 바이오애널리티컬 코어(Emory University's HPLC Bioanalytical Core)로 송부하였다. 간략하면, 상청액을 신선한 0.22 μM PVDF 미세원심 분리기 여과 튜브로 옮겼다. 남아 있는 임의의 입자상 물질은 4℃에서 5 min 동안 5000 rpm으로 회전 필터를 통해 여과하여 제거하였다. 모노아민 농도는 전기화학적 검출과 함께 역상 HPLC에 의해 결정하였다. HPLC를 위해, ESA 모델 584 펌프 및 ESA 542 냉장 자동샘플러가 장착된 ESA 5600A 쿨어레이(ESA 5600A CoulArray) 검출 시스템을 사용하였다. C18 칼럼 가드 카트리지가 장착된 MD-150 x 3.2 mm C18 칼럼을 사용하여 25℃에서 분리를 수행하였다. 이동상은 pH 2.95에서 1.5 mM 1-옥탄술폰산 나트륨, 75 mM NaH2PO4, 0.025% 트리에틸아민 및 8% 아세토니트릴로 이루어졌다. 25 ㎕ 부피의 샘플을 주입하였다. 샘플을 0.4 mL/min로 등용매로 용리시키고, 5020 가드 셀이 장착된 6210 전기화학 셀 (ESA: 미국 매사추세츠주 베드퍼드)을 사용하여 검출하였다. 가드 셀 전위는 500 mV로 설정하였고, 분석 셀 전위는 -175, 200, 350 및 425 mV였다. 공지된 표준 (시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Co.: 미국 미주리주 세인트루이스))에 대한 체류 시간의 매칭 기준에 의해 피분석물을 확인하였다. 화합물은 피크 영역을 주요 센서의 표준 영역과 비교하여 정량화하였다.
전기생리학법
전기생리학적 기록을 위해, 70일째 도파민성 세포를 기록 챔버에 넣고, 95% O2 및 5% CO2로 연속적으로 버블링시킨, 130 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1.25 mM Na2HPO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM 글루코스로 이루어진 인공 뇌척수액으로 1.2 ml/min 속도로 연속하여 관류시켰다. EPC9 증폭기 및 펄스(Pulse) v8.80 소프트웨어 (HEKA 일렉트로니크(HEKA Elektronik))를 사용하여 실온에서 (22 ± 1.0℃에서) 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하였다. 기록 전극 (5-6 MΩ 저항)을 150 mM K-글루코네이트, 5 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM Mg-ATP, 0.5 mM Na-GTP (292 mOsm, KOH로 pH 7.3으로 조정)를 함유하는 피펫 용액으로 충전시켰다. 15.1 mV의 액체 접합 전위를 K-글루코네이트 기반 피펫 용액을 사용하여 보정하였다. 전류 클램핑 모드로 활동 전위 발화는 휴지 막 전위에서 기록되었다. 직렬 (접근) 저항은 보상되지 않았지만, 연속적으로 모니터링하였다. 자발적인 시냅스 이벤트는 미니 애널리시스 v6.0.7(Mini Analysis v6.0.7) (시냅토소프트(Synaptosoft)) 및 클램프피트 8.2(Clampfit 8.2) (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)) 프로그램을 사용하여 오프라인으로 분석하였다. 전압 개폐 나트륨 채널을 1 μM 테트로도톡신 (TTX)으로 차단하였다. 뉴로비오틴 (0.2%)을 피펫내 용액에 포함시키고, 기록된 세포를 4℃에서 4% 포름알데히드에서 고정시키고, TH 항체로 공동으로 염색시켰다.
다중 전극 어레이 (MEA) 기록
액시온 바이오시스템즈(Axion Biosystems)의 24 웰 미세전극 어레이 (MEA) 플레이트를 CO2 인큐베이터 중 37℃에서 각각 하룻밤 동안 폴리 L-오르니틴 (0.0015%), 피브로넥틴 (1 ㎍/ml) 및 라미닌 (1 ㎍/ml)으로 미리 코팅시켰다. 다음날, C4 유래 D28 세포를 미리 코팅된 MEA 플레이트에 20,000개/웰로 플레이팅하고, 상기 기술된 것과 동일한 스케줄에 따라 생성하였다. D28 세포를 전기생리학적 기록을 개시하기 전에 적절히 부착될 수 있도록 하기 위해 2일 동안 5% CO2 하에 37℃에서 가습 인큐베이터에서 유지시켰다. 격일로 60% 배지 교체를 수행하였다. 자발적 활동 전위의 세포외 기록은 화합물 처리 전후에 마에스트로(Maestro) MEA 시스템 및 AxIS 소프트웨어 (액시온 바이오시스템즈)를 사용하여 37℃에서 배양 배지에서 수행하였다. 상기 MEA 플랫폼은 324개의 채널로 구성되며, 24 웰 플레이트를 사용하는 경우, 이는 4 x 4 그리드에서 웰당 16개의 전극을 갖도록 포맷팅되어 있다. 전극 그리드에 도트로 표시된 각 웰에 대략 20,000개 세포를 플레이팅하였다. AxIS 네비게이터(AxIS Navigator) 1.5.1 소프트웨어를 사용하여 기준선 및 처리 후 원시 데이터 파일 (*.raw)을 스파이크 파일 (*.spk) 및 엑셀 파일 (*.csv)로 변환시켰다. 상기 파일 포맷으로 변환시킴으로써 데이터를 추가로 프로세싱하고, 분석할 수 있다. mDA 뉴런의 경우, AxIS 소프트웨어 내의 신경 스파이크 측정은 하이 패스 = 200 Hz 및 로우 패스 = 3,000 Hz로 설정하였다. 스파이크 검출을 위한 임계값은 각 전극에서 필터링된 필드 전위의 롤링 표준 편차의 6배로 설정하였다. 5분 기록을 사용하여 평균 스파이크 속도 및 각 웰 중의 활성 전극수 ("활성 전극")를 계산하였다. 활성 전극은 스파이크 속도가 ≥ 5 spks/min인 전극으로 정의하였다.
액시온 바이오시스템즈의 뉴럴 메트릭 툴(Axion BioSystems' Neural Metric Tool)을 사용하여 스파이크 트레인 래스터 플롯을 검사하여 활동의 강건성 및 웰 활동의 품질 및 일관성 모두를 검증하였다. 상기 래스터 플롯 시각화 또한 사용하여 처리 후 데이터 해석을 지원하였다.
스파이크 활동이 없거나 스파이크 활동이 드물거나, 또는 버스팅 또는 네트워크 동기성이 거의 없거나, 또는 전혀 없는 웰은 실험에서 배제시켰다. 기록을 시작하기 전 적어도 2 min 동안 플레이트를 시스템에서 평형화시켰다. 도파민성 뉴런의 자발적 활동을 단리시키기 위해, 세포를 모두 웰당 500 ㎕의 배지 중 10μM의 농도로, GABA성 길항제인 피크로톡신; AMPA 수용체 길항제인 NBQX; 및 AP5 NMDAR 길항제의 조합으로 처리하였다. 차단제를 첨가한 후, 평균 스파이크 수와 평균 전극수를 둘 모두 계산하였다. 기록 및 분석은 상기에서 언급된 바와 같이 수행하였다. t 검정을 이용하여 대조군과 처리군 사이의 평균 스파이크 수 및 평균 활성 전극수를 비교하였다.
이식 및 냉동보존을 위한 세포 제조
C4 유래 D28 세포를 DPBS로 2회 세정한 후, 37℃에서 5 min 동안 어큐타제로 처리하였다. N2 보충제, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 500 μM dbcAMP, 200 μM 아스코르브산, 10 ng/ml TGF-β3 및 10 μM Y-27632를 포함하는 DMEM:F12 배지를 사용하여 세포를 수확하였다. 300 x g로 3 min 동안 원심분리한 후, 세포 펠릿을 이식 배지 (DMEM/F-12 (페놀 레드 무함유), 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 10 μM Y-27632, 20 mM Boc-D-FMK)를 이용하여 현탁시켰다. 세포 현탁액을 70 ㎛ 스트레이너에 통과시켜 큰 클럼프를 제거하였다. 세포 농도는 혈구계산기를 사용하여 트리판 블루 배제에 의해 계산하였다. 최종 세포 생성물은 이식 배지에서 50,000 또는 100,000개 세포/㎕로 이루어졌다. 냉동보존을 위해, 세포 펠릿을 크리오스토르(CryoStor)® CS10 냉동보존 배지에 현탁시켰다. 냉동바이알 중의 세포를 -80℃에서 제어식 동결을 위해 미스터 프로스티™ 프리징 컨테이너(Mr. Frosty™ Freezing Container) (날진(Nalgene))에 넣었다. 이어서, 동결된 세포를 액체 질소로 옮겼다. 1주일 후, 이식을 위해 동결된 세포를 해동시켰다.
수술 절차
솜노슈트 아네스테시아 시스템(SomnoSuite Anesthesia System) (켄트 사이언티픽 코포레이션(Kent Scientific Corporation: 미국 코네티컷주 토링턴))을 사용하여 동물을 이소플루란으로 마취시켰다. 정위 수술은 마이크로4 컨트롤러(Micro4 controller) (월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments: 미국 플로리다주 새러소타))가 장착된 정위 프레임 (데이빗 KOPF 인스트루먼츠(David KOPF Instruments: 미국 캘리포니아주 터헝가))에서 수행하였다.
찰스 리버 무흉선 래트의 경우, 내측 전뇌 다발에 6-OHDA를 정위 주사하여 흑질선조체 경로의 일측성 병변을 확립하였다. 마취 15 min 전에 노르아드레날린성 돌기를 보호하기 위해 데시프라민 (10 mg/kg)을 래트에 주사하였다. 2 ㎕의 6-OHDA (0.2% 아스코르브산 및 0.9% 염수 중 7.5 mg/ml)를 2.5 ㎕ 해밀턴(Hamilton)주사기 (해밀턴 컴퍼니(Hamilton Company: 미국 네바다주 리노))를 사용하여 주사하였다. 브레그마 기준으로 좌표를 계산하였다: 전-후 (AP), -4.0; 내측-외측 (ML), -1.3; 및 등배 (DV), -7.0 (Torres et al., 2011. J Neurosci Methods 200:29-35). H9 또는 C4 유래 D28 세포의 선조체 내 이식을 위해, 2 ㎕ (50,000개 세포/㎕)의 한 침착물을 하기 좌표에 배치하였다: AP, +0.8; ML, -3.0; 및 DV, -5.5. 무딘 26G, 0.75 인치 바늘이 장착된 10 ㎕ 해밀턴 시린지를 통해 세포를 0.4 ㎕/min의 속도로 주사하였다. 타코닉 무흉선 래트의 경우, C4 D28 세포를 100,000개 세포/㎕의 농도로 현탁시켰다. 100,000개 세포 군의 경우, 1 ㎕의 세포를 AP, +0.8; ML, -3.0; 및 DV, -5.5 내로 주사하였다. 300,000개 세포 군의 경우, 1.5 ㎕의 2개의 침착물을 하기 좌표에 배치하였다: AP, +0.8; ML, -3.0; 및 DV, -5.0 및 DV, -6.0. 대조군 래트는 오직 이식 배지 주사만을 받았다. NOD SCID 마우스 선조체 주사를 위해, 2 ㎕ (50,000개 세포/㎕)의 C4 Do, D14 또는 D28 세포의 한 침착물을 브레그마 기준으로 하기 좌표에 따라 선조체에 주사하였다 (mm): AP +0.5; ML -/+1.8; DV -3.2 (양측으로).
주사 후, 바늘은 5 min 동안 뇌에 유지시킨 후, 이어서, 바늘을 5 min 동안에 걸쳐 천천히 빼냈다. 수술 후, 절개된 피부를 오토클립® 서지컬 수처(Autoclip® Surgical Suture) (파인 사이언스 툴즈(Fine science tools: 미국 캘리포니아주 포스터 시티))로 실링하고, 회복될 때까지 따뜻한 패드에서 동물을 모니터링하였다. 모든 동물에 케토프로펜(케토프로펜) (5 mg/kg; 케토펜(Ketofen), 산타크루즈), SC-363115Rx)을 피하 주사하여 통증을 감소시키고, 1 ml 0.9% 염화나트륨을 복강내로 주사하여 탈수를 예방하였다.
NOD SCID 마우스 고환 주사를 위해, 피부와 복막을 통해 1 cm 길이로 절개하고, 고환을 멸균 거즈에 놓았다. C4 iPSC 10 ㎕ (5,000/㎕)를 임의의 주요 혈관에서 떨어진 고환 캡슐 중앙에 천천히 주사하였다. 바늘은 세포의 역류를 피하기 위해 천천히 제거하였다. 고환과 지방 조직을 복부의 원래 위치로 다시 재배치시켰다.
D-암페타민 유도 회전 테스트
시냅스전 (간접) DA 효능제인 D-암페타민을 복강내로 투여하여 (4 mg/kg) 6-OHDA로 성공적으로 병변이 발생한 래트에서 회전 행동을 유도하였다. 자동화 시스템 (SD 인스트로먼츠(SD Instruments: 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 사용하여 회전 편향을 기록하였다. 래트를 90 min 동안 기록하였다 (9개 간격; 10분/간격). 전신 회전만 계수한 후, 이어서, 분당 순 회전으로 표시하였고, 여기서 병변이 있는 쪽으로 향한 회전에 양의 값을 제공하였다. 분당 6회 초과의 동측 회전을 보인 동물만을 성공적으로 병변이 생성된 것으로 간주하였다 (Kirkeby et al. 2012.. Cell Rep 1:703-714).
코리더 테스트
비약리학적 행동 개선을 측정하기 위해, 본 발명자들은 코리더 테스트를 사용하였다 (Dowd et al. 2005. Brain Res Bull 68:24-30). 먼저, 테스트 중 탐색 행동을 감소시키기 위해, 래트를 2일 동안 10 min 동안 흩어져 있는 설탕 펠릿이 있는 코리더에 적응시켰다. 다음날, 래트를 코리더 끝에 두었고, 여기서 5-10개의 설탕 펠릿으로 채워진 10개의 인접한 컵 쌍을 코리더 바닥을 따라 일정한 거리를 두고 배치시켰다. 동물이 코리더를 자유롭게 탐색할 수 있게 하였다. 군 아이덴티티에 대해 맹검화된 연구원들이 인출을 직접 계수하였다. 래트가 고유 컵에 그의 코를 찔릴 때마다 '인출'인 것으로 정의하였다. 모든 래트는 20회의 인출이 이루어지거나, 테스트 시간이 5분에 도달할 때까지 테스트하였다. 테스트 전에 모든 래트를 새로운 환경에 대한 신기함을 줄이기 위해 5분 동안 빈 코리더에 배치시켰다. 래트는 테스트 전날 및 테스트 4일 동안 사료에 제한을 받았다. 결과는 반대쪽 인출 (우측)의 평균으로 계산되었으며, 총 인출 대비 비율(%)로 제시되었다. 이식 후 24주까지 매 4주마다 테스트를 수행하였다.
실린더 테스트
탐색 행동에서 앞다리 비대칭을 측정하기 위해, 래트를 유리 실린더 (직경 20 cm)에 배치하고, 벽에의 최대 30회에 걸친 발 터치를 기록하는 것인 실린더 작업을 사용하여 래트를 평가하였다 (Bjorklund et al. 2010. Brain 133:496-511). 군 아이덴티티에 대해 맹검화된 연구원들이 평가하였다. 결과는 오른쪽 발 (반대쪽)을 사용한 터치 평균값으로서 계산하였고, 총 터치 대비 평균 비율(%)로 제시하였다. 이식 후 24주에 테스트를 수행하였다.
스테핑 테스트
앞다리 운동불능을 측정하기 위해, 총 90 cm 길이에 걸쳐 앞다리 적응 보행을 정량화하는 사이드-스테핑 테스트 (Olsson et al. 1995. J Neurosci 15:3863-3875)을 사용하여 래트를 평가하였다. 군 아이덴티티에 대해 맹검화된 연구원들이 보행을 계수하였다. 결과는 오른쪽 앞다리 보행수 (반대쪽)의 평균으로 계산하였고, 왼쪽 앞다리 보행의 평균 비율(%)로 제시하였다. 이식 후 24주에 테스트를 수행하였다.
생체 분포 분석
이식된 인간 세포의 존재를 확인하기 위해, 본 발명자들은 인간 특이적 유전자의 증폭에 특이적인 RT-PCR 방법을 사용하였다. 먼저, 제조사의 설명서에 따라, QIAamp DNA FFPE 티슈 키트를 사용하여 각 15 mg 마우스 조직 (후신경구 및 소뇌 혼합물, 척수, 폐, 심장, 간, 신장 및 비장)으로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 농도는 나노드롭 ND-1000 분광광도계로 측정하였고, 100 ng의 DNA를 실시간 RT-PCR 반응에 사용하였다. 인간 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다; 정방향 5'-ATTGCCCCAAAACTTTTTTG-3' (서열식별번호 106) 및 역방향 5'- TTGAAGACCAGTCTGGGAAG-3'. 내인성 마우스 유전자는 하기 프라이머를 사용하여 검출하였다: 정방향: 5'-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3' (서열식별번호 107) 및 역방향 5'-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3' (서열식별번호 108).
뇌 절편 및 면역조직화학법
케타민(Ketamine) (75 mg/kg)/자일라진(Xylazine) (7.5 mg/kg)을 복강내 주사한 후, 이어서, 빙냉 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS; 0.01 M, pH 7.4)를 8 min 동안 심내 관류하고, 이어서, 10 ml/min의 유속으로 20 min 동안 4% 포름알데히드로 관류하여 심부 마취를 유도하였다. 뇌를 제거하고 4℃에서 4% 포름알데히드에서 밤새도록 사후 고정시킨 후, 20% 및 30% 수크로스에서 연속적으로 인큐베이션시켜 냉동보존하였다. 뇌를 OCT에 포매시키고, 전체 선조체를 커버하는 관상 절편 (30 ㎛)을 연속적으로 수집하였다 (레이카 CM1950(Leica CM1950: 미국 일리노이주 버펄로 그로브)). 뇌 슬라이스를 30% H2O2를 함유하는 PBS와 함께 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 토끼 항-TH 항체 (1:5000), 마우스 항-hNCAM 항체 (1:1000) 및 마우스 항-hNuc (1:1000)와 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세정 후, 샘플을 1 h 동안 비오티닐화된 2차 항체 (벡터 랩스(Vector Labs))로 염색하였다. 마지막으로, 절편을 제조사의 프로토콜에 따라 벡타스테인 엘리트 ABC 키트(Vectastain Elite ABC kit) 및 DAB 퍼옥시다제 기질 키트로 시각화하였다. 이식편에서 TH+ 뉴런을 계수하기 위해, 계수 프레임 50 x 50 ㎛ 및 그리드 크기 200 x 200 ㎛의 63X 오일 렌즈하에 스테레오 인베스티게이터(Stereo Investigator) (MBF 바이오사이언스(MBF Bioscience: 미국 버몬트주 윌리스턴))의 광학 분획기 프로브를 사용하였다. 동물 뇌당 TH 양성 뉴런의 총 개수를 추정하기 위해 시리즈 수 (1:6)에 대해 최종 계수를 보정하였다.
미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 하버드 의과 대학의 설치류 조직병리학 코어(Rodent Histopathology Core at Harvard Medical School)에 의해 비멘틴 면역조직화학법을 수행하였다.
뇌 절편 면역형광
전체 중뇌의 자유 부동 관상 절편을 PBS 중 5% 정상 당나귀 혈청, 3% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 차단 용액 중에서 실온에서 1 h 동안 미리 인큐베이션시켰다. 1차 항체를 PBS 중 3% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100에 희석하고, 4℃에서 밤새도록 적용시켰다. 0.3% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 절편을 1차 항체와 동일한 완충제 중에 희석된 알렉사 488-, 알렉사 568- 또는 알렉사 647-접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 모든 절편을 훽스트 33342로 대조염색하였다. 추가로 3회 세척한 후, 커버 슬립을 고정 매질로 절편 위에 적용하고, 형광 현미경 (키엔스: 일본 오사카)으로 시각화하였다. 2차 항체만으로 염색된 절편은 동일한 조건하에서 프로세싱 및 사진 촬영하고, 음성 대조군으로 사용하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색
NOD SCID 마우스 고환의 병리학적 분석을 위해, 각 마우스를 케타민/자일라진으로 마취시키고, 고환을 제거하고, 4% 포름알데히드에 일시적으로 보관하였다. NOD SCID 마우스 뇌 조직 병리학적 분석을 위해, 전체 선조체를 커버하는 매 6번째 관상 절편마다 유리 슬라이드에 탑재하였다. 고환 및 뇌 조직의 유리 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 하버드 의과 대학의 설치류 조직병리학 코어로 송부하였다.
정량화 및 통계 분석
달리 명시하지 않는 한, 모든 실험은 생물학적으로 삼중으로 수행하였다. 각 실험에 대한 "n"은 도면 범례에서 찾을 수 있으며, 모든 실험에 대해 독립적으로 생성된 샘플을 나타낸다. 통계 분석은 그래프패드 프리즘 v7(GraphPad Prism v7) 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 값이 p < 0.05일 때, 통계학상 유의한 것으로 간주되었다. 도면 전역에 걸쳐, 별표 표시는 p 값의 유의도를 나타낸다: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. 각 iPSC 세포주 내의 세포 분획에 존재하는 돌연변이 검정을 위해, 양측 이항 검정에 의해 p 값을 생성하였고, 본페로니(Bonferroni) 보정에 의해 조정하였다. 돌연변이 데이터는 R을 사용하여 분석하고 시각화하였다.
실시예 1. 대사 리프로그래밍을 조절하는 마이크로RNA ( miRNA ) 확인
본 발명자들은 최근 miR-200c에 의해 직접 표적화되는 SIRT2가 대사 리프로그래밍 및 hiPSC 생성에 중요하다는 것을 보여주었다 (19). miR-200c와 리프로그래밍 사이의 기능적 연관성을 검증하기 위해, 본 발명자들은 miR-200c의 강제 발현이 대사 변화를 유도하는지 여부를 시험하였다. 실제로, 인간 진피 섬유모세포 (hDF)에서의 miR-200c 과다발현 (OE)은 산소 소비율 (OCR) 감소 및 세포외 산성화율 (ECAR) 증가를 비롯한, 상당한 대사 변화를 초래하였다 (도 9a 및 b). 공 벡터 대조군 세포주와 비교하여, miR-200c OE 세포는 기초 호흡, ATP 전환, 최대 호흡 및 산화적 예비량의 감소 뿐만 아니라, 카르보닐 시아니드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존 (FCCP) 주사 후 OCR 변화와 함께, 유의하게 감소된 산화적 인산화 (OXPHOS) 능력을 보였다 (도 9c-e). 이어서, 본 발명자들은 miR-200c와 함께 리프로그래밍 인자 (즉, Y4F)로 hDF를 처리하였다. miR-200c OE 추가는 Y4F 단독과 비교하여 OXPHOS를 유의하게 감소시켰으며 (도 9f-k), 이는 만능성 연관 miRNA가 대사 리프로그래밍을 촉진함으로써 리프로그래밍 프로세스에 영향을 미친다는 것을 시사하는 것이다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 miR-200c와 같은 다른 miRNA(들)가 대사 변화를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이전 miRNA 발현 연구 (20-23)를 기반으로, 본 발명자들은 hPSC에 일관되게 풍부하게 존재하는 8개의 후보 miRNA 클러스터 (miR-17/92, -106a, -106b, -136s, -200c, -302s, -369s, 및 -371/373)를 확인하였다. 본 발명자들은 hDF 중 상기 miRNA의 OE가 대사 변화를 유도하는지 여부를 시험하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 상기 8개의 miRNA 클러스터 중 7개 (miR-17/92 제외)가 OCR 감소 및 ECAR 증가를 비롯하여 유의한 대사 리프로그래밍을 초래함으로써, 공 벡터가 형질도입된 대조군 세포와 비교하여 1/3 내지 1/20 범위로 OCR/ECAR 비를 강건하게 감소시켰다는 것을 발견하였다 (도 9l-n).
실시예 2. 대사 조절 miRNA를 리프로그래밍 인자와 조합하여 고품질 hiPSC 를 효율적으로 생성한다.
본 발명자들은 렌티바이러스 벡터에서 일반적인 리프로그래밍 인자 (Y4F 또는 Y3F (OCT4, SOX2 및 KLF4))에 상기 대사 조절 miRNA를 추가하면 hiPSC 생성이 촉진되는지 여부를 시험하였다. 상기에서 확인된 7개의 miRNA 클러스터 중에서 miR-302s는 Y3F 또는 Y4F와 조합되었을 때, hiPSC 생성을 증진시키는 데 가장 높은 효능을 보였다 (도 1, a 및 b). 추가로, miR-106a, -106b, -200c, -369s 또는 -371/373 클러스터는 또한 적당히, 그러나, 유의하게 hiPSC 생성을 증가시켰다. 이어서, 본 발명자들은 임의의 추가 miRNA가 Y3F 및 miR-302s (Y3F+3)와, 또는 Y4F 및 miR-302s (Y4F+3)와의 조합시 hiPSC 생성을 추가로 증진시키는지 여부를 시험하였다. Y3F+3의 존재하에서, 다른 miRNA 클러스터 중 임의의 것을 추가하였을 때, hiPSC 생성이 유의하게 증진되었다 (도 1c). Y4F+3을 사용하였을 때, miR-200c만이 hiPSC 생성을 유의하게 증진시켰으며 (도 1d), 따라서, Y4F, miR-302s, 및 miR-200c (Y4F+3+2)의 조합이 최적인 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 Y4F, Y4F+3에 의해, 및 Y4F+3+2에 의해 유도된 리프로그래밍 동안 대사 변화의 역학적 성질을 비교하였다. 특히, Y4F+3+2는 가장 두드러진 대사 변화를 유도하였으며 (도 1, e 및 f), 이는 대사 변화와 효율적인 hiPSC 생성 사이의 연관성을 뒷받침한다. 이어서, 본 발명자들은 알칼리성 포스파타제 (AP)에 대해, 및 더욱 엄격한 만능성 마커인, TRA-1-60에 대해 염색함으로써 상기 조합이 hiPSC의 전반적인 품질에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다 (24, 25). Y4F 또는 Y4F+3에 의해 생성된 AP+ 콜로니 중 대략 40%는 TRA-1-60+였다. 대조적으로, Y4F+3+2에 의해 생성된 AP+ 콜로니 중 90% 초과가 TRA-1-60+였다 (도 1g 및 도 10a). 추가로, Y4F+3+2에 의해 생성된 TRA-1-60+ hiPSC 콜로니는 전형적인 hESC-유사 조밀한 콜로니 형태를 보였다 (도 10a). 본 발명자들은 또한 성체 hDF (GM03529, 코리엘 인스티튜트)를 리프로그래밍하고, 렌티바이러스 벡터에서 Y4F+3+2에 의해 생성된 콜로니 중 90% 초과가 AP+/TRA-1-60+라는 것을 발견하였다 (도 10b).
이어서, 본 발명자들은 상기 조합 (Y4F+3+2)이 비바이러스 벡터를 사용하여 고품질 hiPSC를 생성할 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 한 벡터에는 Y4F를 보유하고 (pY4F, 도 10c), 나머지 다른 하나에는 miR-302s 및 miR-200c 클러스터를 보유하는 (p3+2; 도 10d) 2개의 에피솜 벡터를 개발하였다. c-Myc의 공지된 형질전환 활성 때문에 (26), 본 발명자들은 pY4F에서 c-Myc를 L-MYC로 대체하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 두 벡터로의 단일 형질감염을 사용하는 신규한 에피솜 리프로그래밍 프로토콜을 확립하였고 (도 10e), 이를 통해 hDF는 >90% AP+/TRA-1-60+인 hiPSC 콜로니로 효율적으로 리프로그래밍되었다 (도 1h). 본 발명자들은 Y4F, Y4F+3, 및 Y4F+3+2에 의해 생성된, hESC-유사 형태를 갖는 hiPSC 세포주를 선택하고, 이를 >20회로 계대배양하고, 그의 특성을 특징화하였다. 도 2, a 및 b에 제시된 바와 같이, 그의 형태 및 만능성 마커의 발현 수준은 H9 hESC의 것과 매우 유사하였다. 흥미롭게도, (1) 3 배엽층 마커에 대한 항체로의 염색 및 (2) 계통 특이적 마커의 유전자 발현에 의해 입증되는 바와 같이 (도 2, c 및 d), Y4F+3+2에 의해 생성된 H9 및 hiPSC는 3개의 모든 배엽층 계통으로 동일하게 잘 분화된 반면, Y4F 또는 Y4F+3에 의해 생성된 것의 분화는 중배엽 계통으로 편향되었다. 상기 결과는 Y4F+3+2 조합이 종래 방법 (Y4F 또는 Y4F+3)과 비교하여 전달 벡터와 상관없이, 편향된 분화 잠재력이 더 적은 상태로 신생아 및 성인 인간 섬유모세포 둘 모두로부터 더 높은 고품질의 hiPSC를 생성할 수 있다는 것을 시사한다 (표 1).
표 1. 렌티바이러스 또는 에피솜 벡터에서의 인자의 상이한 조합에 의한 신생아 (BJ) 또는 성인 섬유모세포 (GM03529)로부터 유래된 hiPSC 세포주 비교
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실시예 3. hiPSC에서의 게놈 보존 및 체세포 돌연변이
본 발명자들의 리프로그래밍 방법이 임상 등급 hiPSC를 신뢰할 수 있게 생성할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 코리엘 인스티튜트로부터 9개의 섬유모세포 세포주 (가족성 PD 대상체 3명, 산발성 PD 대상체 3명, 및 건강한 대상체 3명) 및 새로운 피부 생검으로부터 얻은 4개의 샘플 (건강한 대상체 3명 및 산발성 PD 환자 1명)을 비롯한, 다중 공급원으로부터 성인 hDF를 이용하여 hiPSC 세포주를 생성하고자 시도하였다. 표 B 및 C, 도 11a 및 b에 제시된 바와 같이, 본 발명자들의 방법은 pY4F 및 p3+2로의 1회 형질감염을 사용하여 상기의 모든 섬유모세포로부터 다수의 hiPSC 세포주를 생성하였으며 (도 10e), 이들은 모두 hESC 유사 형태 및 OCT4, TRA-1-60, NANOG, 및 SSEA-4를 비롯한 만능성 마커의 현저한 발현을 보였다.
개인맞춤화된 세포 요법에 초점을 맞춰, 본 발명자들은 IRB 승인 프로토콜 (파트너스 IRB #2010P001100)하에 산발성 PD 환자 (표 B의 MCL540)의 피부 생검으로부터 제조된 hiPSC 클론을 추가로 특징화하였다. 임상 등급 hiPSC에 대한 기본 기준은 게놈 보존의 유지 및 유해한 (예컨대 보고된 암 유발) 돌연변이(들)의 부재이다 (7, 17). 한 예로서, 본 발명자들은 벡터 DNA의 숙주 게놈 내로의 잠재적 통합을 위해 MCL540 (N17, C4, N3, C11, 및 C5) 뿐만 아니라, 대조군 세포 (모체 섬유모세포 및 H9)로부터의 원래의 단리 이후로 대략 20회에 걸쳐 계대배양된 5개의 독립 hiPSC 클론을 시험하였다 (표 2). 플라스미드 유래 서열을 검출하기 위해, 본 발명자들은 8개의 EBNA-1 특이적 프라이머 세트를 디자인하고, 플라스미드 DNA를 특이적으로 검출하는 2개의 세트 (EB-01 및 EB-02)를 확인하였다 (도 12a). 플라스미드 DNA는 세포질 분획에서 검출할 수 없었지만 (도 12b), 5개 클론 중 하나 (N17)는 통합된 플라스미드 서열을 나타내었다 (도 12c). qRT-PCR 분석 결과, N17은 게놈 DNA 100 나노그램당 1.3 - 1.7 x 104개의 통합된 플라스미드 서열 카피를 함유한 것으로 나타났다 (도 12d). 이배체 세포의 DNA 양은 약 6 피코그램이며 (bionumbers.hms.harvard.edu/bionumber.aspx?id=111206), qRT-PCR에서 사용된 100 나노그램의 게놈 DNA는 약 1.76 x 104개 세포를 나타낸다. 따라서, 클론 N17은 세포당 플라스미드 서열 카피를 대략 1개 함유하는 것으로 보인다. 그에 반해, 4개의 다른 클론 및 음성 대조군 (원래의 섬유모세포 및 H9)에는 통합된 플라스미드 DNA가 없었다 (도 12d). 따라서, 본 발명자들은 N17을 배제시키고, DNA 핑거프린팅, 핵형 및 생체내 만능성 분화에 의해 남은 4개의 hiPSC 클론 (C4, N3, C11, 및 C5)을 추가로 분석하였다 (도 12, e-g).
표 2. MCL540 유래 hiPSC 세포주 요약.
Figure pct00015
본 발명자들은 상기 4개의 hiPSC 클론에서 전체 엑솜 시퀀싱 (WES)을 수행하였고, 코딩 엑손 또는 ± 2bp 스플라이싱 수용자 및 공여자 부위 중의 137개의 돌연변이를 포함하여, 모체 섬유모세포 DNA 서열과 비교하여 총 524개의 체세포 돌연변이를 발견하였다. 각 hiPSC 세포주는 114.5개의 싱글톤 돌연변이 (범위 80 - 195)의 중앙값을 포함하여 126개의 체세포 돌연변이 (범위 92 - 205)의 중앙값을 보유하였다. hiPSC 세포주 사이에 몇 가지 공유 돌연변이 (n = 1-4)가 존재하였다 (도 3a). C5는 80개의 싱글톤을 포함하여 가장 많은 수의 체세포 돌연변이 (n = 205)를 가졌고, C4는 가장 적은 수 (n = 92)를 가졌다. 단백질 코딩 영역의 체세포 돌연변이 중에서 hiPSC 세포주는 27개 (중앙값, 범위 14-35)의 비동의 돌연변이를 포함하여 중앙값 36.5 (범위 17 - 50)를 보유하였다. 다시 말하면, C4는 가장 적은 개수의 돌연변이를 가졌다. 본 발명자들은 여러 암 유형에서 빈번하게 돌연변이화되는 것으로 보고된 127개 유전자에서 돌연변이를 조사하였다 (27). 본 발명자들의 hiPSC 세포주는 상기 유전자에서 최대 하나의 돌연변이 (동의 또는 비동의)를 보유하였고, C4 또는 N3에서는 어떤 비동의 돌연변이도 발견되지 않았다. 요약하면, 4개의 hiPSC 세포주 모두에서 발견된 체세포 돌연변이 중 암과 인과적으로 관련된 돌연변이는 없었다. 마지막으로, 본 발명자들은 본 발명자들의 hiPSC 세포주의 체세포 돌연변이 부하를 공공 이용가능한 데이터 세트와 비교하였다 (도 3b). 본 발명자들은 140개의 hESC 세포주를 기반으로 하는 WES로부터의 고신뢰 체세포 돌연변이 (28) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 이니셔티브(Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative: HipSci)의 299개 hiPSC 세포주 (센다이 바이러스 방법에 의해 생성)에 대한 WGS 데이터로부터의 체세포 코딩 돌연변이 (29)를 수집하였다. 본 발명자들의 hiPSC 세포주는 HipSci hiPSC 세포주 (중앙값 25, 범위 5 - 492)와 유사하고, hESC 세포주 (중앙값 70, 범위 34 - 223)보다 유의하게 더 적은 전체 돌연변이 부하를 보였다 (윌콕슨(Wilcoxon) 순위 합 검정, p-값 0.00071) (도 3b; 좌측). 또한, 본 발명자들의 hiPSC 세포주는 암에서 빈번하게 돌연변이화되는 유전자 중 더 적은 개수의 돌연변이를 보유하였다 (도 3b; 우측).
본 발명자들은 또한 각 hiPSC 세포주의 하위 집단에 존재할 수 있는 체세포 돌연변이에 대해 체크하였다. 본 발명자들은 관찰된 체세포 돌연변이에서 대립유전자 분율의 분포를 추정하고, SNV의 중심으로 45%, indel의 중심으로 35%의 널 모델을 사용하여 이항 검정을 수행하였다 (28, 30). 각 hiPSC 세포주에 대해 본페로니 보정된 p-값 < 0.01하에 중앙값이 16 (범위 9 - 18)인 변이체는 세포 분획으로부터 기원하는 체세포 돌연변이의 잠재적 후보로 간주되었다. 모든 hiPSC 세포주에서 발견된 모든 체세포 돌연변이의 작은 대립유전자 분율의 분포 (도 3c)는 클론 및 서브클론 돌연변이 둘 모두가 각 hiPSC 세포주에서 관찰된다는 것을 보여주었지만 (플롯에서 2개의 피크로 확인), 서브클론 돌연변이는 개별 hiPSC 세포주에 고유한 것이었다. 본 발명자들은 2개 이상의 hiPSC 세포주에 걸쳐 보존되는 20개의 돌연변이를 관찰했지만, WES로부터 정렬된 짧은 리드를 시각적으로 검사한 결과, 14개의 체세포 돌연변이 후보에 대한 모체 섬유모세포에서 돌연변이체 대립유전자가 있는 1개 또는 2개의 짧은 리드가 밝혀졌으며, 이는 상기 서브클론 돌연변이 후보가 잠재적 생식계열 기원임을 시사하는 것이다. 특히, 본 발명자들의 hiPSC 세포주에서 TP53과 같은 암 유발 유전자에는 클론 또는 서브클론 체세포 돌연변이가 없었다 (28). C4 및 N3은 4개의 hiPSC 세포주 중에서 가장 낮은 체세포 돌연변이 부하를 가졌고, 이를 추가로 특징화하였다.
실시예 4. " 스폿팅 " 배양 방법은 고수율 및 고품질 mDA 세포를 신뢰할 수 있게 생성한다.
다수의 실험실에서 mDA 세포 운명으로의 마우스 및 인간 PSC의 시험관내 분화를 조사하였다. mDAN이 신경성 바닥판으로부터 기원하고, Wnt 및 소닉 헤지호그 신호가 중요한 역할을 한다는 발견에 기초하여 (31-33), 최근 mDA 분화 프로토콜은 상기 신호의 활성화제를 이용한다 (7, 34, 35). 배아체 유래 신경구 기반 방법은 실험 간에 매우 가변적이기 때문에 (18, 35, 36), 본 발명자들은 "이중 SMAD 억제" (36, 37)를 기반으로 하는 더욱 효율적이고, 재현가능한 단층 방법을 확립하고자 하였다. 이식 연구에 사용된 mDA 세포는 일반적으로 시험관내에서 16-32일 동안 분화되었다 (7). 따라서, 본 발명자들은 앞서 공개된 최적화된 조건에 따라 (37) 먼저 60 mm 접시당 730,000개 세포 (즉, 34,000/㎠)를 시작으로 잘 연구된 H9 (계대수 <36)를 사용하여 바닥판 기반 mDA 전구체 (mDAP) 유도를 임계적으로 결정짓는 처음 15일을 최적화하고자 하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 D8-D10에서 시작하여 심각한 세포 사멸/손실을 관찰하였고, 매우 다양한 결과를 얻었다. 본 발명자들의 실험실에서 4명의 독립 연구원에 의해 수행된 다회의 실험 (hESC의 경우, n=76 및 hiPSC의 경우, n=48)을 평가하였을 때, >50%가 심각한 세포 손실로 인해 hESC와 hiPSC 둘 모두에 대해 의미 있는 데이터를 제공하지 못했다 (도 13a). 따라서, 본 발명자들은 배지 교체 동안 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 탈리된 세포수를 측정하여 분화 프로세스 동안 세포 손실을 주의 깊게 모니터링하였다 (도 4a). 15일째 (D15), 본 발명자들은 수확된 세포의 총 개수를 계수하고, 이어서, 이들 세포를 추가로 특징화하였다. 놀랍게도, 2개의 hESC 세포주 (H9 및 H7) 및 2개의 hiPSC 세포주 (C4 및 N3)에 대해 시험하였을 때, D1부터 D14까지 탈리된/손실된 세포의 총 개수는 수확된 세포의 총 개수보다 훨씬 더 높았다 (도 4b 및 표 3). 따라서, 본 발명자들은 더 적은 개수의 H9 및 C4 세포 (240,000개 (11,000개 세포/㎠) 및 60,000개 (3,500개 세포/㎠))로 단층 배양을 시작하고자 하였다. 11,000개 세포/㎠를 사용하여, 본 발명자들은 유사한 패턴의 상당한 세포 손실을 발견하였다 (표 3). 3,500개 세포/㎠로 훨씬 더 낮은 밀도에서, H9 및 C4 세포 둘 모두 더 낮은 생존율을 보였고, 유사하게 탈리로 손실되어 최종 세포 수확량이 허용할 수 없을 정도로 낮았다. 초기 세포 농도와 상관없이, 이러한 심각한 세포 손실 패턴은 균일하게 분포된 단층 조건이 hiPSC 및 hESC의 시험관내 분화를 위해서는 이상적이지 않다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 단층을 더 작은 단리된 부분으로 나누는 것 (본원에서 "스폿팅"으로 명명)이 시험관내 분화를 개선시킬 수 있다고 가정하였다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 2 x 2 cm 그리드의 교차점에서 10 ㎕의 마트리겔을 사용하여 직경이 ~5 mm인 원형 영역 ("스폿")을 미리 코팅하여 지정된 영역에의 초기 세포 부착을 제한하였다 (도 13b 및 c).
최적의 세포 밀도를 찾기 위해, 본 발명자들은 각 스폿에 H9 또는 C4 세포를 사용하여 3개의 상이한 개수 (40,000, 10,000 및 2,500개)의 세포를 플레이팅하였다. 놀랍게도, 상기 스폿팅 방법은 단층 방법과 비교하여 D15에서 세포 손실을 유의하게 감소시키고, 수율을 개선시켰다. 특히, 본 발명자들은 스폿당 10,000개 세포 (60 mm 접시당 총 60,000개 세포)가 시험관내 분화에서 거의 100% 성공적이었고 (도 13a), D15에서의 최종 수확은 600만-800만 개의 mDA 세포였고, 총 세포 손실은 300만 개 미만의 세포였다는 것을 발견하였다 (도 4b, 표 3). 본 발명자들은 H7 hESC 및 N3 hiPSC 세포주에 대해 유사한 패턴을 확인하였고 (도 4b), 상기 스폿팅 방법이 hPSC 세포주의 mDA 분화에 광범위하게 적용할 수 있다는 것을 시사한다. 더 중요하게는, D15에서 수확된 세포는 더 적은 개수의 사멸 세포를 포함하였고 (도 4c), 프로그래밍된 세포 사멸에 대한 널리 공지된 마커인, 유의하게 더 적은 개수의 절단된 카스파제-3-양성 세포 뿐만 아니라, 감소된 핵 응축 (도 4d)을 포함하였다 (38, 39). 본 발명자들은 스폿팅과 단층 방법 사이의 결과의 차이가 단층 조건에서 세포에 대한 산소와 영양이 충분하지 않았기 때문이라고 추측하였고, 따라서, 더 빈번한 배지 교체로 이를 보정하려고 시도하였다. 그러나, 매일 배지를 교체해도 세포 손실이 감소되거나, 세포 수확이 증진되지는 않았다. 반대로, 이는 실제로 세포 손실을 증가시켰다 (도 14a). 스폿팅 방법에서, 매일 배지를 교체하는 것은 세포 손실 또는 수확에 영향을 미치지 않았으며, 단층 방법보다 스폿팅에서 분화가 더 안정적이라는 것을 다시 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명자들은 배지 교체 빈도와 상관없이, 단층 배양에서만 배양 배지가 유의하게 산성이 되었다는 것을 관찰하였고 (도 14b), 이는 적어도 부분적으로는 불량한 세포 건강을 설명한다. 종합하면, 이러한 신규한 스폿팅 기반 방법이 종래의 단층 방법에 비해 세포 손실을 감소시키고, 최종 세포 수율을 증가시키고, 더 건강한 mDA 세포를 생성하였다.
표 3은 H9 및 C4의 시험관내 분화 동안의 세포 손실 수준에 대한, 3개의 상이한 세포 밀도 (34,000/㎠, 11,000/㎠, 3,500/㎠)를 이용한 단층 기반 방법과 3개의 상이한 세포 밀도 (40,000/스폿, 10,000/스폿, 2,500/스폿)를 이용한 스폿팅 기반 방법 사이의 비교 결과를 보여주는 것이다. 배지 교체 후 상청액에 존재하는 탈리된 세포를 FACS를 사용하여 계수하였다.
표 3. 단층 기반 방법 및 스폿팅 기반 방법에 의한 세포 손실 및 수율
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실시예 5. 케르세틴 처리가 시험관내 분화 동안 미분화 세포를 제거한다.
hPSC 기반 세포 요법의 가장 중요한 문제는 신생물성 잠재력이 있는 잔여 미분화 세포를 제거함으로써 안전성을 확립하는 것이다. (서바이빈을 코딩하는) BIRC5가 체세포에 비해 hPSC에서 높게 발현된다는 이전 발견에 기초하여 (40), 본 발명자들은 서바이빈의 화학적 억제가 남아 있는 미분화된 hiPSC를 선택적으로 제거할 것이라는 가설을 세웠다. 그러나, 서바이빈은 뉴런 전구체에 중요한 것으로 알려져 있기 때문에 (41, 42), 이 전략법이 mDAP 생성을 방해하는지 여부를 시험하는 것이 중요하다. 서바이빈 억제제 (40) 중에서, 본 발명자들은 플라보노이드 케르세틴 (3,3',4',5,7-펜타히드록시플라본)을 선택했는데, 이는 이 천연 화합물이 보편적으로 섭취되는 야채와 과일에 고농도로 존재하기 때문이다 (43). 본 발명자들은 먼저 100,000개의 미분화된 C4 세포를 5, 10, 20, 40 및 100 μM 케르세틴으로 2, 6, 16 및 24시간 동안 처리하였다. 신선한 배지로 세척한 후, 총 48시간 동안 세포를 추가로 배양하였다. 도 5a에 제시된 바와 같이, >20 μM 케르세틴으로 >16시간 동안 처리하였을 때, 생존가능한 세포는 검출할 수 없었고, 이는 미분화된 hiPSC가 >99.99% 효율로 제거될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 케르세틴이 mDAP의 생존에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 16시간 동안 다른 농도의 케르세틴으로 D9 C4 세포 (대부분 뉴런 전구체)를 처리하고, D11에서 결과를 조사하였다. D11에서는 세포 생존율도 세포수도 영향을 받지 않았고 (도 5, b 및 c), 이는 케르세틴이 hiPSC 유래 mDAP에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
민감하고, 특이적인 검정법을 확립하기 위해, 본 발명자들은 총 100,000개 세포의 hDF 중 미분화된 C4 세포의 시험 혼합물을 생성하고, 3개의 상이한 검정법을 수행하였다. 첫 번째로, 본 발명자들은 SSEA-4 및 TRA-1-60에 대한 모노클로날 항체와 함께 FACS를 사용하였고 (도 15a), 투입된 세포수와 검출된 세포수 사이의 현저한 차이, 특히, 100개 미만의 세포의 차이가 있는 것을 발견하였고 (도 15b), 이는 상기 방법이 소수의 미분화 세포에는 둔감하였다는 것을 시사하는 것이다. 두 번째로, 본 발명자들은 희석된 세포 샘플을 6일 동안 배양하고, AP+ 콜로니를 미분화 세포의 대리 마커로 계수하였다 (도 5d). 선형 관계가 있었지만, AP+ 콜로니의 개수는 투입된 세포수를 감안할 때 예상되는 개수의 약 1/10이었다 (도 5e). 이러한 차이는 개별 hiPSC의 제한된 생존 및 성장 및/또는 콜로니 형성 동안 응집되는 그의 경향에 기인하는 것일 수 있다. 이러한 한계에도 불구하고, 105개의 hiPSC를 플레이팅한 경우에도, 케르세틴 처리 후에는 어떤 AP+ 콜로니도 검출되지 않았기 때문에, 이 결과를 통해 케르세틴 처리의 효능이 >99.99%임을 확인하였다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 100,000개당 10개 미만인 개수의 미분화 세포는 검출할 수 없기 때문에, 이어서, 본 발명자들은 OCT4 발현을 대리 마커로 사용하는 qRT-PCR 방법을 사용하였다. 102 내지 105개의 미분화된 C4 세포로부터 제조된 mRNA의 qRT-PCR 분석을 사용하여 OCT4 카피수의 표준 곡선을 작성하였고 (도 5f), 이를 통해 본 발명자들은 미분화 세포의 개수를 예측할 수 있었다. 상기 검정법을 사용하여, 케르세틴으로 처리하지 않았을 때의 D14, 21, 및 28에서의 미분화된 C4 세포의 계산된 개수는 각각 세포 100,000개당 30, 2, 및 0.17개였다 (도 5g). 따라서, 분화 D14, D21 또는 D28에 1,000만 개 세포를 PD 환자에게 이식하면, 이식편은 각각 대략 3,000, 200, 및 17개의 미분화 세포를 함유할 것이다. 케르세틴 처리가 >99.99%의 효율로 미분화 세포를 제거할 수 있기 때문에, 케르세틴 처리 후, 예상되는 미분화 세포의 개수는 1,000만 개의 D28 세포당 최대 17 x 0.01% = 0.0017개 세포가 될 것이다. 이와 일치하여, 케르세틴 처리 (D9에서 16시간 동안 40 μM) 후 D14, D21 및 D28에서 qRT-PCR 곡선을 사용하여 계산된 미분화 세포의 개수는 100,000개 세포당 1개 세포보다 훨씬 더 적었다 (도 5g). 이러한 결과와 일관되게, 수개의 NANOG + 세포는 케르세틴으로 처리하지 않았을 때 D14에서 관찰되었지만, 처리시에는 어느 것도 검출되지 않았다 (도 15c). 종합하면, 본 발명자들의 결과는 케르세틴 처리가 미분화 세포의 개수를 민감한 기술 사용으로 검출할 수 없는 수준으로 감소시켜, 수백만 개의 분화된 세포가 이식된 경우에도 종양 형성의 위험을 크게 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 6. mDAP 및 mDAN의 기능적 특징화
상기 기술된 스폿팅 방법 및 케르세틴 처리를 기반으로, 본 발명자들은 hiPSC를 mDAP/mDAN으로 분화시키기 위한 수정된 시험관내 프로토콜을 확립하였다 (도 6a). 상기 방법을 사용하여 분화된 C4 세포는 점진적으로 더 조밀한 형태, 최소 탈리 (도 14c) 및 가장자리로부터 신경돌기의 양극성 성장 (도 16a)을 보였다. D15에서, 세포를 단일 세포 현탁액으로부터 해리시키고, 다시 플레이팅하고, 추가로 분화시켰다. 도 6, b 및 c에 제시된 바와 같이, 신경 전구체 마커 (예컨대 SOX2, SOX1, 및 NESTIN) 및 바닥판/기저판 마커 (예컨대 GLI1, FOXA2, 및 CORIN)의 발현은 D7에 시작하여, D28까지 높은 수준으로 계속되었고, 최종적으로 D40에 감소하였다. mDAP 마커 (예컨대 OTX2, LMX1A, 및 EN1)의 발현은 D21 및 28에 상승한 반면, mDAN 마커 (예컨대 TH, DAT, 및 PITX3)의 발현은 추후에 증가하였다. 상기 데이터는 NESTIN의 점진적 감소 및 mDAN 마커의 증가를 보이는 단계 특이적 면역세포화학 분석에 의해 확증되었다 (도 16b). D28 세포가 D14 세포보다 더 성숙한 표현형을 보였기 때문에 (도 16b), 본 발명자들은 D28 세포가 이전 세포보다 더 적합할 수 있다고 예상하였고, 따라서, 전형적인 mDAP 및 mDAN 마커에 대한 면역세포화학법을 사용하여 D28 세포를 분석하였다 (도 6, d-h). 총 세포 중 대략 40% 및 15%가 각각 MAP2 및 TH를 발현하고, 세포 중 38%가 NURR1을 발현하였다 (도 6, d 및 e). 총 세포 중 80% 초과는 FOXA2 및 LMX1A를 공동 발현하였고 (도 6, d 및 f), TH+ 세포 대부분은 mDA 표현형의 특징적인 특성인 FOXA2, LMX1A 및 NURR1을 공동 발현하였다 (도 6, d 및 g). 본 발명자들은 D28 세포 중 대략 30% 및 20%는 각각 등쪽 패터닝 마커 PAX6 및 증식 마커 KI67을 발현하였다는 것을 관찰하였다 (도 6, d 및 h). 중요하게도, 이식시 비정상적인 성장을 형성하는 것으로 알려진 PAX6, SOX1 및 KI67을 공동 발현하는 세포 (44, 45)는 검출할 수 없었다 (도 6, d 및 h). GABA+ 또는 5-HT+ 세포는 어느 분화 단계에서도 거의 검출되지 않았다 (도 16b).
이들 세포가 생리학적으로 기능적인 뉴런이 되는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 MAP2, 도파민 수송체 (DAT) 및 시냅토피신 (SYP)을 공동 발현하는 많은 TH+ 뉴런을 포함하는 D70 배양물로부터 전체 세포 패치-클램프 기록을 수행하였다 (도 17a). 이들 D70 TH+ 뉴런은 PITX3 및 VMAT2를 포함하는 추가의 성숙한 mDA 마커를 공동 발현하였다 (도 17a). 또한, TH+ ALDH1A1+ 뉴런은 각각 A9 타입 및 A10 타입 mDAN을 특징으로 하는 GIRK2 또는 때때로 CALBINDIN을 공동-발현하였다(도 17b). 전류 클램프 기록 모드로, 본 발명자들은 상기 세포의 고유한 막 특성 (휴지 막 전위, -55.93 ± 2.43 mV; 입력 저항, 1.52 ± 0.44 GΩ, n = 7 뉴런)을 평가하고, 탈분극 전류 주입에 대한 반응으로 활동 전위 (AP)를 관찰하였다 (도 18a; AP의 평균 진폭 54.96 ± 4.66 mV; 반폭: 6.04 ± 0.82 ms, 후과분극 (AHP) 진폭: 3.55 ± 1.46 mV; n = 7 세포). 전압 클램프 기록 모드로, -70 mV에서 +40 mV의 전압 펄스는 과도 내향 전류를 유발하였고, 이는 전압 개폐형 Na+ 채널의 발현을 나타내는 테트로도톡신 (TTX; 전압 개폐형 Na+ 채널 차단제) 뿐만 아니라, 칼륨 전류를 나타내는 지속적인 외향 전류 (도 18b)에 의해 완전히 차단되었다. 추가로, 전체 세포 전압 클램프 기록 동안, 본 발명자들은 기능적 시냅스의 존재를 나타내는 자발적인 시냅스 후 전류 (sPSC)를 관찰하였다 (-70 mV의 유지 전위에서 sPSC의 주파수는 0.11 ± 0.03 Hz; 피크 진폭은 14.71 ± 3.05 pA; 상승 시간은 0.73 ± 0.14 ms; 감쇠 시간은 1.72 ± 0.19 ms; n = 5 세포였다) (도 18c). 휴지 막 전위에서의 심박조율기 활동과 일관되게 (46), 주입 전류가 없을 때 자발적 발화가 관찰되었다. 기록된 세포는 A9 mDAN에서 전반적으로 관찰되는 바와 같이 4.4 ± 0.8 Hz (n=4)의 평균 주파수로 자발적으로 발화되었다 (도 18d). 개별적으로 기록된 뉴런 (기록 패치 피펫을 통해 뉴로-비오틴이 로딩된 것, 적색)은 TH 양성과 함께 공동으로 국재화되었고, 이를 통해 이들 세포의 아이덴티티는 도파민성 뉴런인 것으로 확인되었다 (도 18e). 단일 세포 패치 클램프 기록 외에도, 본 발명자들은 다중 전극 어레이 (MEA)를 사용하여 집단 수준의 전기 활동을 측정하였다. 분화된 세포는 성숙한 뉴런 네트워크를 나타내는 강건한 동기성 버스팅 패턴을 발생시켰다 (도 18f). 누적 활동 맵은 D30과 D44 사이의 mDA 내에서 스파이크 밀도 및 스파이크 영역의 증가를 보였다 (도 18f). mDAN으로부터 자발적 활동을 분리하기 위해, 배양물을 글루타메이트 수용체 길항제인 NBQX + AP5, 및 GABAA 수용체 길항제인 피크로톡신의 조합으로 처리하였다. 상기 칵테일을 투여하였을 때, 전체 스파이크와 활성 전극의 수가 약간만 감소했는데 (도 18g 및 h), 이는 상기 배양물에 mDAN이 풍부하다는 것을 시사하는 것이다. 마지막으로, 배양 배지의 HPLC 분석은 D47 세포가 도파민 (3.1±0.1 ng/ml) 및 DOPAC (0.2±0.0 ng/ml)를 방출한다는 것을 추가로 보여주었다 (도 6i).
실시예 7. 이식 후 생체내 안전성 시험
본 발명자들의 시험관내 특징화 결과, D14에서 D28까지의 대부분의 세포가 이식가능한 세포 공급원으로 적합한 mDAP를 나타내는 것으로 나타났다. 그의 안전성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 D14 또는 D28 C4 세포 (케르세틴으로 처리되지 않은 것, 또는 그로 처리된 것; 동물당 100,000개 세포)를 면역결핍 NOD SCID 마우스의 선조체에 이식하였다. 예상대로, 미분화된 C4 세포 (D0)의 이식은 시험된 4마리의 마우스 모두에서, PSC를 정의하는 특징인, 특징적인 3 배엽층을 포함하는 기형종 형성을 유도하였다 (도 7a, 좌측 열). 그에 비해, 케르세틴 처리되지 않은 D14 (n=8) 또는 케르세틴 처리된 것 (n=19, 도 7a, 중간 열) 및 케르세틴 처리된 D28 (n=23; 도 7a, 우측 열)을 이식한 경우, 기형종 형성이 관찰되지 않았다 (도 7b). 흥미롭게도, 본 발명자들은 D14 세포가 이식된 숙주 뇌의 약 40%에서 로제트 유사 구조를 관찰하였다 (케르세틴으로 처리되지 않은 군의 D14에서 8개 중 3개; 케르세틴 처리 군의 D14에서 19개 중 8개; 도 7a의 중간 레인에 흰색 원). 그에 반해, D28 세포가 이식되었을 때, 로제트 유사 구조는 없었다 (23마리 마우스 중 0마리; 도 7, a 및 c). 면역조직화학법 결과, D28 이식편과 비교하였을 때, D14 이식편이 더 많은 비멘틴 양성 미성숙 세포를 포함하는 것으로 나타났다 (도 7d). 추가로, SOX1 양성, KI67 양성, SOX1/KI67 이중 양성, SOX1/PAX6 이중 양성, 및 SOX1/PAX6/KI67 삼중 양성 세포 또한 D14 세포의 이식편보다 D28 세포의 이식편에 더 적게 존재하였고 (33% 대 4.5%; 5.9% 대 1.2%; 2.1% 대 0.15%; 1.2% 대 N.D; 0.75% 대 N.D, 도 7, e-g), 이는 D28 이식편이 증식 잠재력이 있는 세포를 D14 이식편보다 더 적게 포함한다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 결과는 완전히 미분화 세포가 제거되고, 기형종이 형성되지 않았지만, D14 이식편은 로제트 유사 구조를 형성할 수 있는 미성숙 전구 세포를 여전히 포함하고 있다는 것을 시사한다. 추가로, SOX1/PAX6/KI67 삼중 양성 세포는 D28 이식편에서 검출할 수 없었기 때문에, 본 발명자들은 D28 세포가 D14 세포보다 이식을 위해서는 더 안전한 세포 공급원을 나타낸다는 결론을 내렸다. 본 발명자들은 D28 세포의 생체 분포를 평가함으로써 그의 안전성을 추가로 시험하였다. D28 세포를 선조체에 이식한 후 6개월째에, 본 발명자들은 중추 신경계 영역 (후신경구 및 소뇌 혼합물, 및 척수) 및 5개의 말초 기관 (폐, 심장, 간, 신장 및 비장)을 수확하여 선조체 이식편으로부터 인간 기원 세포의 이동을 검색하였다. 게놈 qPCR은 이들 영역에서는 인간 DNA 서열을 검출하지 못한 반면, hiPSC 양성 대조군은 현저한 발현을 보였고 (도 7h), 이식된 세포의 뇌 내 또는 말초 기관으로의 검출가능한 재분포는 없는 것으로 입증되었다.
실시예 8. PD의 동물 모델에서의 생체내 효능 시험 및 이식편 분석
6-OHDA 병변이 있는 래트 모델은 역사적으로 개발된 최초의 PD 동물 모델이었고 (47), 여전히 인기 있는 모델로 남아 있다 (48, 49). 세포 이식의 운동 효과를 정량적으로 평가하는 데 특히 유용하다. 면역억제가 필요하지 않기 때문에, 무흉선 래트에서의 그의 사용이 바람직한 모델로 부상하고 있다. 무흉선 래트의 2개의 상이한 공급원 (타코닉 바이오사이언시스 (미국 뉴욕주 Hudson) 및 찰스 리버 (매사추세츠주 윌밍턴))이 사용되었다. 본 발명자들은 먼저 일측성 6-OHDA 병변이 있는 무흉선 타코닉 래트의 선조체에 100,000 및 300,000개의 C4 D28 세포를 이식하고, 이식 후 매월 암페타민 유도 회전 행동을 모니터링하였다. 12주째에 100,000개 및 300,000개 세포 군 둘 모두 동측 회전 행동의 유의한 감소를 보였다 (도 19a). 16주째에 모든 이식된 래트에서 회전 행동이 완전히 회복되었으며, 일부는 반대쪽 회전을 보이기까지 했다. 그에 반해, 비히클을 받은 래트는 회복을 보이지 않았다. 헤마톡실린 및 에오신 (HE) 염색은 이식편이 기형종도 로제트도 함유하지 않았다는 것을 보여주었다 (도 19b). 인간 신경 세포 부착 분자 (hNCAM)에 대한 면역조직화학법 결과, 선조체 (STR) (도 19c), 전전두엽 피질 (PFC; 도 19d), 중격 핵 (도 19e), 측좌핵 (NAc; 도 19f), 및 뇌량 (CC; 도 19g)에서 조밀한 hNCAM+ 신경분포를 보였다. 면역조직화학법 결과, 이식편에서 풍부한 TH+ 뉴런이 나타났다 (도 19h). 입체학적 정량화는 생존 TH+ 뉴런의 평균 개수가 100,000개의 이식된 세포당 5,621 ± 1029개 (n = 4)였고, 이는 A9 뉴런의 전형적인 큰 각진 세포 소마타 (도 19i) 및 A10 아이덴티티의 전형적인 더 작은 구형 뉴런 (도 19j)을 포함하는 뉴런 형태의 혼합물을 포함하는 것으로 나타났다.
D28 C4 세포의 안전성과 효능을 시사하는 상기 데이터를 통해, 본 발명자들은 타코닉 계통보다 신체적으로 더 강건하고, 장기간 분석을 촉진시킨, 찰스 리버로부터의 무흉선 래트에서 상기 세포를 추가로 광범위하게 시험하였다. 본 발명자들은 이식을 위해 단일 용량 (100,000개)의 D28 C4 세포를 선택하고 (도 19k), 냉동보존된 세포의 효능 및 안전성을 신선하게 제조된 세포와 비교하였다. 냉동보존된 D28 C4 세포 (Cryo-D28)는 신선하게 제조된 등가물과 유사한 생존율 수준을 유지하였고 (약 90%), 액체 질소에서 1주일 동안 보관한 후 동일한 mDA 세포 표현형을 보였다 (도 19l). 암페타민으로 유도된 회전은 16주째에 유의하게 감소하였고, 신선한 또는 Cryo-D28 C4 세포 이식 후 20주 및 24주째에 완전히 구조되었다 (도 8a). 타코닉 래트에 대해 언급된 바와 같이 (도 19a), 일부 동물은 20주 및 24주째에 반대쪽 회전을 보였다. 본 발명자들은 또한 외인성 약리학적 자극을 포함하지 않는 여러 테스트에서 이러한 이식편의 기능적 효능을 평가하여 인간 PD의 것과 더 유사한 운동 결손의 척도를 제공하였다. 측면 감각 운동 반응 선택의 민감성 테스트인 코리더 테스트에서 (50), 신선한 또는 Cryo-D28 C4 세포는 이식 후 24주째에 병변 유도 동측 편향을 유의하게 감소시켰다 (도 8b). 특히, 16주 또는 20주째에는 어떤 유의한 감소도 관찰되지 않았으며, 이는 상기 작업의 개선이 회전 행동보다 더 많은 시간이 소요된다는 것을 시사하는 것이다. 앞다리 운동불능을 측정하는 실린더 및 스테핑 테스트에서 (51, 52), 6-OHDA 병변에 의해 생성된 손상된 앞다리 기능은 이식 후 24주째에 신선한 또는 Cryo-D28 C4 세포를 이식함으로써 유의하게 개선되었다 (도 8, c 및 d). 종합하면, 4개의 모든 행동 테스트에서 신선한 세포 및 Cryo-D28 C4 세포 둘 모두 운동 기능장애를 유의하게 및 유사하게 개선시켰다. 추가로, 후속 시점에 추가로 이식받은 동물은 회전 행동의 회복이 가장 최근의 테스트 시점인 52주째까지 지속되었다는 것을 입증하였으며 (도 19m), 이는 이식으로 인한 기능 개선이 잘 유지된다는 것을 시사하는 것이다.
H9 유래 mDA 세포가 광범위하게 검증되었고, 인간 태아 복부 중뇌 (VM) 세포와 동일한 기능을 하는 것으로 명시적으로 입증되었기 때문에 (53), 본 발명자들은 H9 hESC 유래 D28 세포 및 C4 hiPSC 유래 D28 세포 이식 후 결과를 직접 비교하였다. 1 x 105 및 4 x 105개 세포의 이식은 세포주 둘 모두가 정도 및 시간 경과 둘 모두에서 회전 행동을 동일하게 회복시키는 것으로 나타났다 (도 20a).
이어서, 본 발명자들은 이식 후 26주째에 이식편을 분석하였고, hNCAM+ 세포 및 TH+ 세포, 둘 모두 전체 STR의 광범위한 신경 분포를 나타내며, 예컨대 배측 STR (dl-STR), PFC 및 NAc와 같은 도파민성 표적 영역으로 크게 확장되는 것을 발견하였다 (도 8, e-l 및 도 20b). 상기 이식편 유래 mDAN에 의한 숙주 뇌의 강건한 신경분포는 dl-STR의 도파민성 섬유에서 hNCAM의 광범위한 공동 발현에 의해 추가로 검증되었다 (도 8m). 추가로, TH, 인간 시냅스전 단백질 (시냅토피신; hSyn), 및 선조체 배지 가시 뉴런 마커 (DARPP32)에 대한 항체를 사용하여 삼중 면역형광 염색을 수행하였다. 본 발명자들은 이식된 DAN이 숙주 선조체 뉴런과 시냅스 연결을 형성했음을 나타내는 이식편의 경계에서 선호하는 표적과 숙주 수상돌기 가시 (DARPP32+ 뉴런)에서 TH+/hSyn+ 뉴런 말단을 관찰하였다 (도 8n). Cryo-D28 및 신선한 D28 이식편은 유사한 hNCAM+/TH+ 신경재분포 및 시냅스 형성 패턴을 나타내었다 (도 20c). 신선한 세포 및 Cryo-D28 C4 세포, 둘 모두의 이식편은 A9 유사 또는 A10 유사 형태를 갖는 유사하게 많은 개수의 DA 뉴런을 함유하였다 (D28, 34,560 ± 3,200; Cryo-D28, 46,094 ± 8,967; 도 21, a 및 b). 이식편 부피 또한 D28과 Cryo-D28 사이에 유사하였다 (D28, 12.2 ± 1.1 ㎣; Cryo-D28, 13.0 ± 1.7 ㎣; 도 21c). hNCAM+의 총 개수는 대략 3.0 x 106 및 2.45 x 106개였고, TH+ 세포의 평균 비율(%)은 D28 및 Cryo-D28의 이식편에서 각각 1.48 ± 0.55% 및 2.08 ± 0.65%였다. 이들 TH+ 뉴런들은 대부분 (70-80%)은 FOXA2 및 LMX1A를 공동 발현하였고, 90% 초과는 NURR1을 공동 발현하였다 (도 21, d-f). 성숙한 DA 마커인 DAT는 TH+ 뉴런에서 풍부하게 발현된 반면 (도 21g), 증식 잠재력과 연관된 마커인 KI67+은 <1%의 세포에서 발현되었다 (D28, 0.86 ± 0.09%; Cryo-D28, 0.54 ± 0.21%; 도 21, h 및 i). 로제트 또는 기형종은 관찰되지 않았고, SOX1, PAX6 및 KI67을 공동 발현하는 증식 세포는 거의 없거나 검출되지 않았다 (SOX1+PAX6+, D28, 0.37 ± 0.10%; Cryo-D28, 0.15 ± 0.11%; SOX1+PAX6+KI67+, D28, 0.02 ± 0.02%; Cryo-D28, N/D; 도 21, h 및 i). GIRK2 또는 CALBINDIN은 TH+ 뉴런에서 발현되었고 (도 21j 및 k), 대다수가 GIRK2를 공동 발현하였다 (D28, 79.29 ± 4.88%; Cryo-D28, 81.28 ± 3.50%; 도 21l). 이식편의 이러한 TH+ 뉴런은 예컨대 ALDH1A1과 같은 추가의 A9 마커를 공동 발현한다. TH+ ALDH1A1+ 뉴런은 종종 A9 타입 mDAN을 나타내는 SOX6 및 GIRK2를 공동 발현하는 반면 (도 21, m 및 n); 일부 TH+ ALDH1A1+ 뉴런은 A10 타입 mDAN을 나타내는 CALBINDIN을 공동 발현하였다 (도 21o). 요약하면, 이러한 데이터는 신선한 D28 C4 세포 및 Cryo-D28 C4 세포 이식편 둘 모두의 TH+ 뉴런의 대다수가 A9 타입 mDAN의 특성을 가지며, 이는 행동 테스트에서 운동 기능장애의 광범위하고 장기적인 회복과 일치함을 보여주는 것이다.
이 데이터를 6-OHDA 병변이 있는 래트 모델에서 hiPSC 유래 DA 세포에 대한 최근 발표된 이식 연구와 비교했을 때 (44, 45, 57-64), 본 연구에서 DA 수율 (이식된 세포수에 대한 생존 DA 뉴런의 비)은 상기 다른 연구 중 어느 것에서보다 더 높았다 (표 4).
표 4. 래트의 뇌에서 hiPSC 유래 도파민 세포의 생존 및 기능 (도 7 관련)
Figure pct00018
Figure pct00019
약어: CR, 찰스 리버; cryo, 냉동보존된 세포; N/A, 이용불가; NPC, 뉴런 전구 세포; SD, 스프라구 돌리(Sprague Dawley); X-SCID, X-연관 중증 복합 면역결핍.
* 2,106 ± 313/㎣은 DA 밀도를 나타내며, 본 연구에서 DA 수율 결과는 이용할 수 없었다.
실시예 9. 분화된 세포의 GMP 생산
마지막으로, 본 발명자들은 다나 파버 인스티튜트(Dana Farber Institute)의 GMP 시설에서 상기 프로토콜에 따라 시험관내에서 분화된 C4 세포의 생산 및 특징화를 통해 본 발명자들의 플랫폼의 확장성과 임상 적용가능성을 시험하였다. 본 발명자들은 약 100만 개의 D0 C4 iPS 세포에서 시작하여 >1억 6,000만 개 이상의 D28 세포를 성공적으로 생산하였다 (도 22a-f). 품질 관리 데이터 (예컨대 게놈 풋프린트, 마커 단백질의 ICC, qRT-PCR)는 높은 비율(%)의 FOXA2+ LMX1A+ 세포 (>85%) 및 적절한 마커 (예컨대 각각 세로토닌성, 노르아드레날린성 및 만능성 마커를 나타내는, 5-HT, DBH, OCT4, 및 SSEA-4)의 부재로 입증되는 바와 같이, 이러한 임상적으로 관련된 정량에는 병원체가 없고, 고품질임을 입증하였다.
실시예 10. 인간 대상체에서 생체내 효능 시험
PD를 앓는 인간 환자를 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 자가유래 mDA 전구체의 이식에 의해 치료하였다. 환자는 10년 동안 진행성 특발성 PD의 병력이 있는 69세 오른손잡이 남자 의사였다. 그의 PD 약물은 라이타리(Rytary) (카비도파/레보도파 연장 방출) 23.75/95, 1일 4회 3 캡슐, 1일 4 mg 로티고틴, 및 1일 1 mg 라사길린 (904 mg 레보도파 등가 용량)이었다. 최상의 의학적 요법에도 불구하고, 그는 떨림, 자세 및 미세 운동 제어 악화를 특징으로 하는 자신의 증상을 하루 평균 3시간의 휴식 시간으로 차선으로 조절했다고 보고하였다. 그는 운동이상증은 없었다. 사전 동의는 PD에서 이 기술의 인간에서의 최초 사용과 연관된 위험에 대한 철저한 논의와 심부 뇌 자극을 포함하여 현재 이용가능한 의학적 및 외과적 치료 옵션에 대한 검토를 포함하였다. 피부 생검으로부터 수확한 섬유모세포를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 만능성 분화 잠재력에 대해 광범위하게 시험되고, 전체 엑솜 시퀀싱을 사용하여 체세포 돌연변이에 대해 스크리닝된 다수의 iPSC 세포주를 생성하였다. 상기 데이터에 기초하여, 공지된 암 관련 돌연변이가 없고, 전체 돌연변이 부하가 가장 낮은 단일 클론 (C4로 지정)을 이식가능한 mDAP 세포의 생산을 위해 선택하였다. 엄격한 GMP 및 품질 관리 표준을 충족했으며, 임상 사용을 위한 mDAP 세포를 출시하기 전에 A9 mDA 특이적 마커 및 다른 신경 마커의 유전자 발현과 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)에 의한 게놈 보존에 대한 시험을 수행하였다.
환자는 FDA의 규정 지침에 따라 6개월 간격으로 피각, 좌반구, 이어서, 우반구에 이식하기 위해 MRI 유도 정위 수술 절차를 2회 받았다. 각 수술에서, 각각이 핵의 상위-하위 범위에 걸쳐 있는 3개의 궤도가 전교련 수준 뒤로 피각에 만들어졌다 (Schweitzer et al., Oper Neurosurg (Hagerstown) 2019;18:321-328). 각 수술 절차에서 총 400만 개 세포를 전달하였고, 3개의 트랙에 균등하게 분할하였다. 정맥 세파졸린을 수술 전후에 투여하였다. 어느 시점에서든 면역억제제, 글루코코르티코이드 또는 항경련제도 사용하지 않았다. 각 수술 후, 환자를 밤새도록 모니터링하고, 다음날 퇴원시켰다.
물질 및 방법
본 실시예에서는 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
감독
사전 동의는 파킨슨병에서 본 방법의 인간에서의 최초 사용과 연관된 위험에 대한 논의와 심부 뇌 자극을 포함하여 현재 이용가능한 의학적 및 외과적 치료 옵션에 대한 검토를 포함하였다. 본 연구는 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration: FDA)의 규제 지침하에 수행되었다. 웨일 코넬 메디컬 센터((Weill Cornell Medical Center) 및 매사추세츠 종합 병원(Massachusetts General Hospital)의 기관 감사 위원회에서 승인을 받았다. 동물에 대한 모든 절차는 맥린 병원 동물 보호 및 사용 위원회(McLean Hospital Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행하였다.
iPSC 생산, 분화 및 임상전 안전성 및 효능 검사.
iPSC는 상기 기술된 바와 같이 종래의 야마나카 인자와 2종의 마이크로RNA 클러스터를 조합한 프로토콜을 사용하여 생산하였다. 피부 생검으로부터 수확한 섬유모세포를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 만능성 분화 잠재력을 시험하고, 전체 엑솜 시퀀싱에 의해 단백질 코딩 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝된 다수의 iPSC 세포주를 생산하였다. 정상적인 핵형을 보인 단일 iPSC 클론 (C4로 지정)을 추가 특징화 및 우수의약품 제조 및 품질관리 기준 조건에서의 mDAP 생산을 위해 선택하였다. C4 iPSC를 상기 기술된 GMP 조건하에서 "스폿팅" 기반 방법을 사용하여 28일 동안 시험관내에서 mDA 세포로 분화시켰다. 이 프로토콜은 9일째에 케르세틴으로 밤새도록 처리하여 PSC 특이적 항-아폽토시스 유전자인, 서바이빈을 코딩하는 BIRC5를 억제시킴으로써 남아 있는 미분화된 iPSC (즉, 만능성 마커, 예컨대 OCT4, SSEA1, 및 NANOG를 발현하는 세포)를 제거하는 것을 포함하였다. 상기 및 문헌 [Lee et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110:E3281-90]을 참조한다.
시험관내에서 분화된 mDAP의 특징화
C4 iPSC 유래 세포는 정상 핵형을 보였고, 상기 기술된 두 검증 실험에서 도파민 뉴런 특이적 마커 및 다른 신경 마커가 있는 mDAP로 특징화되었다. C4 iPSC 및 C4 유래 전구체 둘 모두의 전체 게놈 시퀀싱을 수행하였고, 전구체를 원래 공급원 섬유모세포와 비교하였고; 그 결과를 통해 공지된 암 연관 및 돌연변이 신경변성 돌연변이 돌연변이의 전구체에 존재하지 않음을 확인하였다.
본 발명자들은 모체 섬유모세포와 비교하여 C4 iPSC 및 mDAP에 미스센스 및 스플라이스 부위 파괴 변이체를 포함하는 23개의 체세포 돌연변이를 발견하였지만; 어떤 공지된 암 연관 유전자 (즉, CENSUS 데이터베이스에 따름), 신경변성 장애에 대해 보고된 질환 유전자 (즉, HGMD 및 ClinVar에 따름) 및 티로신 대사 및 도파민성 시냅스 경로에 관여하는 유전자 (즉, KEGG 데이터베이스에 따름)도 상기 변이체에 의해 영향을 받지 않았다. 특히, FLG2의 미스센스 변이체 (ENSP00000373370.4:p.Val672Gly)가 낮은 분율을 가진 C4 iPSC 샘플에 존재하였고, 이를 C4 iPSC에서 이형접합성 변이체로 명명하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 미스센스 변이체가 C4 iPSC와 mDAP 둘 모두에 서브클론 체세포 돌연변이로 존재한다고 생각하고 있다. C4 iPSC에서 mDAP로 분화하는 동안, 새로운 체세포 돌연변이가 도입되지 않았다. C4 iPSC 또는 mDAP에서 발견된 대부분의 돌연변이는 다른 샘플에서 서브클론으로 나타났다 (각 상자의 가장 왼쪽에 있는 2개의 피크). 이어서, 본 발명자들은 종양의 대립유전자 특이적 카피수 분석 (ASCAT)을 사용하여 리드-깊이 기반 CNV 분석을 수행하였다 (Van Loo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010;107:16910-5). 본 발명자들은 C4 iPSC 및 mDAP에서 인트론과 단일 엑손을 커버하는 PODXL 유전자에서 이형접합성 결실을 발견하였지만, C4 iPSC와 비교하여 mDAP에 도입된 추가 CNV는 발견하지 못했다. 상기 카피수 변이체는 WES를 사용하여 검출되지 않았다. PODXL은 암 유발 유전자로 보고되지 않았다.
임상 사용 전, 이들 전구 세포로부터 유래된 뉴런은 도파민 분비 및 흑색질 치밀부 도파민성 뉴런의 특징을 보이는 시험관내 전기생리학적 특성을 보였고, 동물 모델에서 상기 기술한 바와 같이 태아 중뇌 유래 조직과 유사한 기능적 효능을 보였으며, FDA에서 지정한 출시 기준을 통과하였다. 케르세틴 처리 후, 면역염색 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검정법에 기초하여, 최종 세포 생성물 (28일째)에는 검출가능한 남아 있는 미분화된 iPSC가 없었다 (95% 신뢰 구간의 상한은 10억 개의 28일째 분화된 세포당 ≤1개의 미분화 세포). 이식편 유도 운동이상증의 잠재적 원인인 세로토닌성 뉴런 (Olanow et al. Ann Neurol 2003;54:403-14)은 최종 생성물에서 검출되지 않았다.
인간화 마우스에서 자가유래 대 동종이계 조건하에서의 이식편 생존.
환자 유래 iPSC (C4) 및 동종이계 인간 배아 줄기 세포 (H9)를 28일 mDAP (C4-mDAP 및 H9-mDAP)로 분화시키고, 중증 복합 면역결핍증 (NOD SCID) 및 인터루킨-2 수용체 γ의 고갈을 갖는 비비만 당뇨병 마우스 (NOD SCID 감마 마우스), 환자-인간화 NOD SCID 감마 마우스 (C4-hu; 수술 후 24개월 [좌반구] 및 18개월 [우반구]째에 수득된 환자의 말초-혈액 단핵 세포를 사용) 및 동종이계 인간화 마우스 (K1-hu)의 선조체에 각 세포주의 1x105개 세포를 이식시켰다. 동물을 2주째에 죽이고, 인간 신경 세포 부착 분자 (hNCAM+) 세포에 대해 표지하여 이식편 생존에 대해, 도파민성 뉴런 (티로신 히드록실라제 [TH+] 뉴런)에 대한 마커를 발현하는 뉴런의 이식편 내 존재에 대해 및 세포 면역 반응 (CD4+ 세포)에 대해 조직학적으로 조사하였다.
환자 수술 절차.
환자는 (FDA의 규제 지침에 따라) 좌반구에 이어 우반구에의 세포 이식을 위해 6개월 간격으로 2회의 수술 절차를 받았다. MRI 기반 렉셀(Leksell) 정위 기술을 사용하였다. 각 수술에서, 단일의 높은 전두시상주변부 피질 엔트리 포인트에서 시작하여 3개의 궤도가 생성되었다. 세포는 DF/HCC GMP 셀 매니플레이션 코어(DF/HCC GMP Cell Manipulation Core)에서 제조하였고, 수술 당일 수확하였다. 특수 디자인된 장치 (Schweitzer et al. 2019)를 사용하여 세포를 각 트랙에 주입하여 피각의 시상 범위에 걸쳐 있는 칼럼을 생성하였다. 수술 중 CT를 사용하여 캐뉼러를 영상화하고, 이 영상을 수술 전 수술 계획에 다시 융합하여 국재화 정확도를 확인하고, 출혈을 배제시켰다 (도 24a-b). 각 수술 절차에서 총 400만 개의 생존가능한 세포의 용량이 전달되었으며, 3개의 트랙에 균등하게 분할되었다. 항생제 (세파졸린, 수술전후 3회 투약을 위해 매 8시간마다 2 g 씩 정맥내)를 투여하였지만, 면역억제제, 스테로이드, 항경련제는 사용하지 않았다. 수술 후, 환자는 다음날 퇴원하기 전에 중환자실에서 밤새도록 모니터링되었다.
임상적 척도
신경학적 검사를 수행하였고, 파킨슨병 특이적 척도를 기준선 및 각 이식 후 1, 3, 6, 9, 12개월째 및 그 후 6개월 간격으로 평가하였다. 각 검사시, 신경과 전문의는 환자가 보고한 대로 약물이 운동 증상을 적절하게 제어하지 못하는 "오프" 시간을 기록하였다. 사전 지정된 평가로는 운동 장애 학회 통합 파킨슨병 평가 척도(Movement Disorder Society Unified Parkinson's Disease Rating Scale: MDS-UPDRS), 파트 III (점수 범위는 0에서 132까지이며, 점수가 높을수록 더 나쁜 파킨슨병 운동 징후를 나타냄) (Cha et al., Nat Cell Biol 2017;19:445-56) 및 39개 항목의 파킨슨병 설문지 (PDQ-39, 점수 범위는 0에서 156까지이며, 점수가 높을수록 삶의 질이 더 나쁘다는 것을 나타냄) (Lee et al., 2013)를 포함하였다.
뇌 영상화
컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔은 피각에 세포 주사의 정확한 위치를 확인하기 위해 수술 중 수행하였고, 이식 부위 또는 그 근처에서의 출혈 스크리닝을 위해 수술 직후에 수행하였다. 종양, 뇌졸중 또는 출혈의 증거에 대해 연속 자기 공명 영상 (MRI) 스캔 및 자기 공명 분광 소견을 검토하였다. 연속 블루오린-18-L-디히드록시페닐알라닌 (18F-DOPA) 양전자 방출 단층 촬영 (PET)-CT를 수행하여 생착된 피각 영역에서 시냅스전 도파민 말단 활성의 존재에 대해 평가하였다. 방사성 동위원소 흡수의 변화는 18F-DOPA 표준화된 흡수 값 비에 의해 반정량적으로 판단하였다.
안전 모니터링
2명의 연구 신경과 의사와 1명의 연구 방사선 전문의가 영상 검토와 함께 유해한 신경학적 이벤트를 검출하기 위한 연속 임상 신경학적 검사를 수행하였다. 환자는 그의 지역 사회 신경과 전문의에게 계속해서 독립적으로 치료를 받았다.
결과
인간화 마우스에서 이식 후 이식편의 면역원성
도 23a 및 상기 제시된 바와 같이, 환자 유래 mDAP (C4-mDAP) 및 동종이계 mDAP (H9-mDAP) 둘 모두 NOD SCID 감마 마우스에서 생존하였고, 동종이계 인간화 마우스 (K1-hu)에 이식하였을 때에는 이식편 유형 둘 모두 거부되었다. 환자 인간화 마우스 (C4-hu)는 이식 후 2주째에 hNCAM+ 세포에 대해 양성으로 염색되고, TH+ 뉴런을 함유하는 이식편을 사용하여 자가유래 C4-mDAP의 생존을 허용한 반면, C4-hu 마우스는 현저한 CD4+ 림프구 침윤물을 보이며, 동종이계 H9-mDAP를 거부하였다 (도 23b-c).
환자에서 이식 후 0 내지 24개월째의 영상화
첫 번째 이식 후 3개월째, 18F-DOPA PET-CT 영상화는 피각에서 기준선으로부터 18F-DOPA 흡수의 초기 감소를 보여주었으며, 이후, 우측 및 좌측에서 각각 이식 후 최대 18개월 및 24개월까지 후속 시점에 18F-DOPA 흡수의 약간의 증가를 보였다. 증가된 활성은 좌측보다 우측 (두 번째 이식)에서 더 컸고, 색 강도 척도 및 선택된 하위영역의 정량적 비교에서 볼 수 있는 바와 같이 이식 부위 근처의 후피각에서 가장 두드러졌다 (도 24a-b). 방사성 동위원소의 흡수에 있어서 기준선으로부터의 반정량적 변화는 도 24a-b에 제시되어 있고, 우측은 -4.0%에서 13.5%, 좌측은 -4.8%에서 9.8%로 다양하였다.
첫 번째 이식 후 6개월째 및 후속 시점에서의 MRI는 피각 이식 부위의 위치 뿐만 아니라, 백질 내의 수술 트랙의 일부를 따라서도 유사한 증가된 T2 강조 신호 강도의 영역을 나타냈고, 우측에서 더 뚜렷하게 나타났다 (도 24a-b). 6개의 피각 이식 부위에서 대조 증강이 관찰되지 않았다. 두 번째 수술 후 6개월째에 한 트랙에서 표적 위 3 cm에서 4 mm의 증강 영역이 관찰되었고; 동맥 스핀 표지 자기 공명 관류 영상화 및 자기 공명 분광법을 포함한 CT 및 MRI는 수술 후 신경교증과 일치하는 변화를 보여주었다.
임상적 평가
첫 번째 (좌측) 이식 후 24개월째 및 두 번째 (우측) 이식 후 18개월째에 환자는 부작용이나 기능 저하를 보고하지 않았다. 도파민 대체 요법을 밤새 중단 ("오프")한 후, MDS-UPDRS, 파트 III (파킨슨병 운동 징후 평가)에 대한 점수는 환자가 증상 악화로 인해 약물 중단을 거부했기 때문에 첫 번째 이식 전에는 측정되지 않았다. 오프 기간 중 점수는 첫 번째 이식 후 4주째에 43, 후속 추적 시점에 33 내지 41, 24개월째에 33이었다. 도파민 대체 요법의 피크 용량 ("온")에서 MDS-UPDRS, 파트 III의 점수는 이식 당시 38, 추적 기간 동안 19 내지 35, 24개월째에는 29였다. PDQ-39 점수 (파킨슨병 관련 삶의 질 평가, 점수가 낮을수록 삶의 질이 더 우수하다는 것을 나타냄)는 이식 당시 62, 추적 기간 동안 2 내지 34, 24개월째에는 2였다 (도 25a-b 및 표 5).
표 5. 임상 평가
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B/L = 기준선 이식 전; MDS-UPDRS: 운동 장애 학회 통합 파킨슨병 평가 척도 (Goetz et al., Mov Disord 2008;23:2129-70); MoCA: 몬트리올 인지 평가(Montreal Cognitive Assessment) (Nasreddine et al. J Am Geriatr Soc 2005;53:695-9); BAI: 베크 불안 척도(Beck Anxiety Inventory) (Beck et al., J Consult Clin Psychol 1988;56:893-7); BDI: 베크 우울 척도(Beck Depression Inventory) (Beck AT, Steer RA, Brown GK. BDI-II, Beck depression inventory : manual. San Antonio, Tex.; Boston: Psychological Corp. ; Harcourt Brace; 1996); QUIP-RS: 파킨슨병 평가 척도에서 충동-강박 장애에 대한 설문지(Questionnaire for Impulsive-Compulsive Disorders in Parkinson's Disease-Rating Scale) (Weintraub et al., Mov Disord 2012;27:242-7.); NMS: 비운동 증상 척도(Non-Motor Symptoms Scale) (Chaudhuri et al. Mov Disord 2007;22:1901-11); PDQ-39: 파킨슨병 설문지 - 39 (Peto et al. Qual Life Res 1995;4:241-8).
24개월째, 환자의 파킨슨병 약물은 연장 방출형 카르비도파-레보도파 (각각 23.75 mg 및 95 mg을 함유한 캡슐로 1일 4회 3, 3, 2, 및 3 캡슐 용량), 로티고틴 (매일 4 mg), 라사길린 (매일 1 mg) 및 드록시도파 (매일 100 mg) (총 1일 용량, 레보도파 등가물 847 mg)였고; 이는 이식 전과 비교하여 레보도파 등가물의 6% 감소를 나타낸다. 환자는 하루에 1시간 미만의 "오프" 시간을 보고하였다. 운동이상증은 환자에 의해 보고되지 않았거나, 또는 임상 검사 중에 관찰되지 않았으며, 이는 수술전 그의 부재와 유사하였다.
운동 점수와 운동 ADL의 개선 외에도, 대상체는 REM 수면 행동 장애 증상 감소, 침과다증 및 연하곤란 감소, 불안 및 우울증 감소를 포함한 수면 질이 개선되었다고 보고하였다. 주관적 인지 기능의 감소는 없었고, MoCA 점수는 27 내지 30 사이로 유지되었다.
파킨슨병 환자에서 iPSC 유래 자가유래 도파민성 전구 세포의 생산 및 이식을 보고한 본 연구는 임상 및 영상 결과를 통해 치료상 이익의 증거를 제공한다.
참고문헌
Figure pct00021
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Figure pct00025
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다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하는 것이지, 그를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구 범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE MCLEAN HOSPITAL CORPORATION <120> AUTOLOGOUS CELL REPLACEMENT THERAPY FOR PARKINSON'S DISEASE <130> 04843-0068WO1 <140> PCT/US2020/034098 <141> 2020-05-21 <150> 62/949,906 <151> 2019-12-18 <150> 62/852,008 <151> 2019-05-23 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 1 Gly Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 2 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 gcgccagtaa agcagacatt aaactttgat ttctgaaact tgcaggtgat gtagagtcaa 60 atccaggtcc a 71 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggcagcggaa aacagctgtt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc 60 aacccagggc cc 72 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 ggcagtggac ctcaaagaag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 ctatgtcttg gccctgatcc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 gggtgataac catggacgag g 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 acttggacgt ttttggggtc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 ataaccatgg acgaggacgg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 gcagccaatg caacttggac 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 gggtagagga cgtgaaagag c 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 ggagacccgg atgatgatga c 21 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 caacagagca agactgtc 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 ggaaacagtt aaatggccaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 ttttggtatt ggccatccta 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 gaaaggaaca gagagacagg g 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 attgccccaa aacttttttg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 ttgaagacca gtctgggaag 20 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 aacagaacca ataggctatc tatc 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 tacagtaaat cacttggtag gaga 24 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 aatgggagtg aacctttggt ca 22 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 gtcgggatgt gcagtagaca 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 tcatgaaaca cgaagcctac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 cacccttctc tcctttgaag 20 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 cctggaaggg ctgaccgacg agatcaa 27 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 cttcccagcc aggctctgca gctcc 25 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 acagagggga ggtgcgccag ttcacg 26 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 acggggtgga cctcgctgca cagatc 26 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 cgaaggtagt tcgccttgag 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 cggtgatagt cagccaggtt 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 cgtggcttac tccccattta 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 tctcgctgtc tctccctctc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 tgtcaagcca tgatggaaaa 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 ggtgagccag agatgctttc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 ggtgctttgg ctgacttttt 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 gttgctcacg gaggagtagc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ggtgcaggtg aaaatctggt 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 gctgctgatg ctgacttctg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 aaatgtttgt gttgcggtca 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 tctggcacag gtgtcttcag 20 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 gacctgaagt ggagattcaa cc 22 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 tgtatgcgat caaccaccag a 21 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 gggtgccgga agtcatactc 20 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gctaggatct gtatagcgtt tgg 23 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 acggcctaaa gatggaggag 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 cggtagaagc aggtggtctc 20 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 caggtggcgg acgtgtgaaa attgagagtg 30 <210> 71 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 cacgctggat ctgcctgggg actgtg 26 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 cgagaggacc ccgtggatgc agag 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 ggcggccatc ttcagcttct ccag 24 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 gggccccatc aacttcaccg tcttcc 26 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 tgtagtcgat gttccccgcc aggtcc 26 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 caaaggcaaa caacccactt 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 tctgctggag gctgaggtat 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 ttgcctgcta cccttgagac 20 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 gggctctgat ctctgcatct ac 22 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 ctcgctcatt tgttggcga 19 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 ggagtcgtgt gctttggact 20 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 ccgggccgag aaaggtatg 19 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 ctgtaggcag aaaagggaa 19 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 cactcttcgg gagaatacag 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 catttggtac aagcaaggtg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 gaaggatgtg gtccgagtgt 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 acaagtggcc aattcactcc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 gaggtggaca agggatctga 20 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 acccattatc cagatgtgtt tgcccgag 28 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 atggtgaagc tgggcatagg cggcag 26 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 ggaaccgcta ccccgacatg ag 22 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 tgaaggcgaa tggaaaggtc t 21 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 ggcggaaata gaacctgtca 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 cttccaggat gggttgagaa 20 <210> 96 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 cctccgtcca tcctctg 17 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 aagcatcaaa caacctcaag 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 aaccccaaga tgcacaactc 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 cggggccggt atttataatc 20 <210> 100 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 cgctttcatg gtgtgggcta aggacg 26 <210> 101 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 tagttggggt ggtcctgcat gtgctg 26 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 cgggcttctc ggaccaggtg ta 22 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 ctcctcggcg gtgtactcca ca 22 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 cggtggtgga gccctacaac 20 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 aggtggtgac tccgctcat 19 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 attgccccaa aacttttttg 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 ccacatctcc ctccagaaaa 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 108 agggtctggg ccatagaact 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 109 ttgaagacca gtctgggaag 20

Claims (29)

  1. 유도 만능성 줄기 세포 (iPSC), 바람직하게는 인간 iPSC의 집단을 제공하는 단계;
    영역당 약 5,000-20,000개, 바람직하게는 약 10,000개 세포의 밀도로 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체에서 영역 사이의 격리를 유지하는 데 충분한 거리를 영역 사이에 두고 별개의, 개별적인 영역에 세포 집단을 플레이팅하는 단계; 및
    iPSC가 mDAP로 분화하는 데 충분한 조건하에서 세포를 유지시키는 단계
    를 포함하는, 중뇌 도파민성 전구 세포 (mDAP) 집단을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체가 기저막 추출물 또는 합성 매트릭스인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 플레이팅 이전에 세포를 겔 중에 현탁시키는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 영역의 직경이 약 2-10 mm인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 사이의 거리가 1-3 cm인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가 알칼리성 포스파타제 (AP) 및 TRA-1-60을 발현하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, mDAP가 FOXA2, OTX2, LMX1A, 및/또는 EN1을 포함하는 1, 2개 또는 그 초과의 마커, 바람직하게는 적어도 FOXA2 및 LMX1A를 발현하고; 임의적으로 여기서 mDAP가 FOXA2, LMX1A 및 NURR1을 공동 발현하는 TH+ 세포인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가
    대상체로부터 1차 세포 집단을 수득하는 단계이며, 바람직하게는 여기서 1차 세포는 섬유모세포, 모발 각질세포, 혈액 세포, 또는 골수 중간엽 줄기 세포 (MSC)인 단계;
    세포에서 OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC의 발현을 유도하는 단계; 및
    1차 세포가 iPSC가 되는 데 충분한 조건하에서 세포를 유지시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 생성되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, OCT4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC의 발현을 유도하는 단계가 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 및 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및 L-MYC 코딩 서열을 포함하는 폴리시스트론 에피솜 벡터로 1차 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가 miR-106a, -106b, -136s, -200c, -302s, -369s, 및 -371/373으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 마이크로RNA (miRNA)를 세포에서 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, miRNA가 miR-302s 및 miR-200c 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, miR-302s 및 miR-200c를 코딩하는 서열을 포함하는 에피솜 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가 1차 세포에서 OCT4, KLF4, SOX2, miR-302s 및 miR-200c 모두를 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포 내로 (i) 구제역 바이러스의 2A 서열과 연결된 인간 Oct4 (OCT4-F2A), KLF4, 돼지 테스코바이러스의 2A 서열과 연결된 SOX2 (SOX2-P2A), 및 L-MYC 코딩 서열, 또는 Oct4, KLF4, SOX2, 및 L-MYC, 또는 상응하는 단백질의 성숙한 RNA를 포함하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터 또는 폴리시스트론 에피솜 벡터, 및 (ii) miR-302s 및 miR-200c, 또는 성숙한 miR-302s 및 miR-200c를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터 또는 에피솜 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  16. 제8항에 있어서, 바람직하게는 BIRC5 유전자를 억제시킴으로써 미분화된 iPSC를 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 mDAP를 포함하는 세포 집단.
  18. 제17항의 세포 집단을 포함하는 조성물.
  19. 바람직하게는 파킨슨병 (PD)을 앓거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체로부터 1차 체세포를 수득하고, 1차 세포로부터 iPSC를 생성하는 단계;
    바람직하게는 SOX1 양성, KI67 양성, SOX1/KI67 이중 양성, SOX1/PAX6 이중 양성, 및 SOX1/PAX6/KI67 삼중 양성 세포의 개수를 감소시키는 데 충분한 시간 동안 iPSC를 케르세틴으로 처리하는 단계;
    제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 mDAP를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및
    대상체에게 세포 집단을 투여하는 단계
    를 포함하는, PD를 앓거나, 또는 그의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 임의적으로 자기 공명 영상-유도 정위 수술을 사용하여 대상체 뇌의 이환 영역 내로 또는 그 근처에, 바람직하게는 미상핵, 피각, 및 흑색질 중 하나 이상의 것 내로 양측으로 직접 이식함으로써 투여되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포가 바람직하게는 피각의 시상 범위에 걸쳐 칼럼을 생성하는 장치를 이용하여, 바람직하게는 3개의 트랙를 이용하여, 바람직하게는 단일의 높은 시상주변부 피질 엔트리 포인트를 이용하여 주사를 통해 투여되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 약 100만, 200만, 300만, 400만, 500만, 600만, 700만, 또는 800만 개 세포 용량으로 투여되고, 바람직하게는 여기서 세포는 3개의 트랙 사이에서 동등하게 분할되는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 양측 반구 모두가 치료되고, 세포는 첫 번째 치료에서 제1 반구에 투여되고, 두 번째 치료에서 나머지 다른 반구에 투여되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 첫 번째 치료와 두 번째 치료 사이의 시간이 약 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월, 48개월, 54개월, 또는 60개월인 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항생제가 수술전, 수술전후, 및/또는 수술후 투여되는 것인 방법.
  26. 접시의 밑면이 라인 사이의 거리가 1.5-2.5 cm인 그리드, 바람직하게는 2x2 cm 그리드가 새겨져 있는 것인, 세포 배양을 위한 배양 접시.
  27. 제26항에 있어서, 그리드가 밑면에 접시의 일부로서 형성되거나, 프린팅되거나 또는 에칭된 것인 배양 접시.
  28. 제26항에 있어서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 및 폴리비닐 열가소성 수지를 포함하는 배양 접시.
  29. 제26항에 있어서, 그 안에 배치된, 바이오매트릭스 하이드로겔 지지체, 바람직하게는 기저막 추출물 또는 합성 매트릭스 층을 포함하는 배양 접시.
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