CN114174498A - 用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法 - Google Patents

用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN114174498A
CN114174498A CN202080052998.3A CN202080052998A CN114174498A CN 114174498 A CN114174498 A CN 114174498A CN 202080052998 A CN202080052998 A CN 202080052998A CN 114174498 A CN114174498 A CN 114174498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
months
mir
inventors
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080052998.3A
Other languages
English (en)
Inventor
K-S.金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mccollin Hospital Co
Original Assignee
Mccollin Hospital Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mccollin Hospital Co filed Critical Mccollin Hospital Co
Publication of CN114174498A publication Critical patent/CN114174498A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)

Abstract

用于生成可用于帕金森氏病中的自体细胞疗法的中脑多巴胺(mDA)神经元祖细胞的方法、包含该细胞的组合物及其使用方法。

Description

用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法
优先权要求
本申请要求于2019年5月23日提交的美国临时专利申请序列号62/852,008和于2019年12月18日提交的美国临时专利申请序列号62/949,906的权益。前述申请的全部内容在此通过引用并入。
联邦资助的研究或开发
本发明是在美国国家卫生研究院授予的拨款号NS070577下由政府支持进行的。政府在本发明中拥有某些权利。
技术领域
本文描述了用于生成可用于帕金森氏病(PD)中的自体细胞疗法的中脑多巴胺(mDA)神经元祖细胞的方法、包含该细胞的组合物及其使用方法。
背景技术
帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)以运动和非运动系统病状为特征，是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)的第二最常见神经变性性病症。影响到约1％的60岁以上人口，随着人口老龄化，其患病率呈现出越来越大的社会负担，预计到2030年全世界将有1400多万人患有PD(1)。自20世纪60年代投入使用以来，多巴胺(DA)替代疗法(例如，L-DOPA和DA激动剂)一直是药理治疗的黄金标准。虽然显著改善了PD患者的生活质量，但长期使用这些药物通常(>80％)会导致不良副作用，如运动障碍和运动波动(2)。
发明内容
帕金森氏病(PD)是一种常见的神经变性性病症，其与继发于黑质中的中脑多巴胺(mDA)神经元变性的纹状体多巴胺丢失相关联，从而使得细胞移植是一种有希望的治疗策略。为了建立用于PD的基于人诱导多能干细胞(hiPSC)的自体细胞疗法，我们开发了用于产生mDA祖细胞的核心技术平台，该mDA祖细胞作为安全有效的治疗性产物。首先，通过将调控代谢的微小RNA与重编程因子进行组合，我们开发了一种更有效地生成临床级IPSC的方法，如通过基因组完整性和无偏多能潜能所证明的。第二，我们建立了一种基于“点样(spotting)”的体外分化方法，以用于以可扩展的方式生成功能性和健康的mDA细胞，其中细胞丢失显著减少。第三，我们开发了一种化学方法，其以较大的效率从最终产物中安全地消除具有赘生性潜能的未分化细胞。以这种方式产生的多巴胺能细胞表达高水平的特征性mDA标志物，产生和分泌多巴胺，并且表现出mDA细胞典型的电生理特性。此外，将这些细胞移植到PD的啮齿动物模型中，可稳健地恢复运动功能障碍，对宿主大脑具有显著的神经再支配(reinnervation)，而没有示出肿瘤形成或植入细胞重新分布的证据。此外，将使用这种方法衍生出的细胞植入到患有PD的人中，似乎已经阻止并可能逆转了疾病过程(参见实例10)。因此，这种平台适合于成功实施用于PD的个性化、自体、细胞替代疗法。
因此，本文提供了生成分化细胞(例如神经元，例如中脑多巴胺能祖细胞(mDAP))群体的方法。该方法包括：提供诱导多能干细胞(iPSC)群体，优选人iPSC；将该细胞群体铺板在离散的、单独的、优选基本上圆形的区域(“斑点”)中，区域之间有足够的距离以保持区域之间的分离，在生物基质水凝胶支持物中，密度为每区域约5,000-20,000个细胞，例如约10,000个细胞；以及将细胞保持在足以将iPSC分化成例如神经元(例如，mDAP)的条件下。
在一些实施方案中，生物基质水凝胶支持物是基底膜提取物或合成基质。
在一些实施方案中，在铺板之前，将细胞悬浮在凝胶中，例如，悬浮在约10μl的凝胶中。
在一些实施方案中，区域的直径为约2-10mm，例如，约5mm。
在一些实施方案中，区域之间的距离为1-3cm。
在一些实施方案中，iPSC表达碱性磷酸酶(AP)和TRA-1-60。
在一些实施方案中，mDAP表达一种、两种或多种标志物，其包含FOXA2、OTX2、LMX1A和/或EN1，优选至少FOXA2和LMX1A；任选地，其中mDAPS是共表达FOXA2、LMX1A和NURR1的TH+细胞。
在一些实施方案中，iPSC通过包含以下方式的方法来生成：从受试者获得原代细胞群体，优选地，其中该原代细胞是成纤维细胞、毛发角质形成细胞、血细胞或骨髓间充质干细胞(MSC)；诱导细胞中至少OCT4、KLF4和SOX2和/或L-MYC和/或C-MYC的表达；以及将细胞保持在足以将该原代细胞变成iPSC的条件下。
在一些实施方案中，诱导至少OCT4、KLF4和SOX2和/或L-MYC和/或C-MYC的表达包含用多顺反子附件体载体转染原代细胞，该多顺反子附件体载体包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4和与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和/或L-MYC编码序列和/或C-MYC编码序列。
在一些实施方案中，iPSC通过包含以下方式的方法来生成：在细胞中表达一种或多种选自下组的外源性微小RNA(miRNA)，该组由以下各项组成：miR-106a、-106b、-136s、-200c、-302s、-369s和-371/373。miR-302s指示miR-302簇，其涵盖五种miRNA，包括302a、302b、302c、302d和367。
在一些实施方案中，miRNA包含miR-302s和miR-200c中的一种或两种。
在一些实施方案中，该方法包括将包含编码miR-302s和miR-200c的序列的附件体载体引入到细胞中。
在一些实施方案中，iPSC通过包含以下方式的方法来生成：在原代细胞中表达OCT4、KLF4、SOX2、miR-302s和miR-200c；或OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC/C-MYC、miR-302s和miR-200c中的全部。
在一些实施方案中，该方法包括将以下中的任何一种或多种引入到细胞中：(i)病毒载体(例如，慢病毒、腺病毒或AAV载体)或多顺反子附件体载体，其包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒(teschovirus)2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)、L-MYC编码序列和C-MYC编码序列，或Oct4、KLF4、SOX2和L-MYC中的任何一种或多种的成熟RNA，或相应的蛋白质；以及(ii)病毒载体或附件体载体，其包含编码miR-302s和miR-200c或成熟miR-302s和miR-200c的序列。
在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，使用C-MYC代替L-MYC，和/或反之亦然。
在一些实施方案中，本文描述的方法包含减少未分化的iPSC，优选地通过抑制BIRC5基因来进行。
本文还提供了通过本文描述的方法制备的包含mDAP的细胞群体，以及包含该细胞的组合物。在一些实施方案中，该细胞具有一种或多种不存在于原代细胞中的体细胞突变和/或不具有目前已知与癌症有因果关系的体细胞突变。
进一步地，本文提供了使用该细胞治疗患有或有风险形成帕金森氏病(PD)的受试者的方法。该方法可以包括：获得原代体细胞，优选地从该患有或有风险形成PD的受试者或者自体受试者获得，并且从该原代细胞生成iPSC；优选地，iPSC用槲皮素处理足够的时间以减少SOX1阳性、KI67阳性、SOX1/KI67双阳性、SOX1/PAX6双阳性和SOX1/PAX6/KI67三阳性细胞的数目；通过本文描述的方法生成包含mDAP的细胞群体；以及将该细胞群体施用于受试者。在一些实施方案中，通过直接植入所述受试者脑的受影响区域中或在该受影响区域附近植入施用所述细胞，优选地双侧植入尾状核、壳核(putamen)和黑质中的一个或多个中，任选地使用磁共振成像引导的立体定向手术。
在一些实施方案中，该细胞经由注射来施用，优选地使用产生跨越壳核矢状范围的柱的装置(例如，如在Schweitzer等人，Oper Neurosurg(Hagerstown)2019中所描述的)，优选地具有三条轨道，优选地具有单个高的旁矢状面皮质进入点。在一些实施方案中，剂量为约1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万或8百万个细胞，优选地，其中将该细胞平均分配在该三条轨道中。在一些实施方案中，在单次治疗中施用该细胞。在一些实施方案中，在两次或多次治疗中施用该细胞。
在一些实施方案中，对两个半球进行治疗，并且在第一次治疗中将该细胞施用于第一半球，并且在第二次治疗中将该细胞施用于另一半球。在一些实施方案中，第一次和第二次治疗之间的时间为约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、48个月、54个月或60个月。
在一些实施方案中，在术前、围手术期和/或术后施用至少一种抗生素。
本文还提供了用于培养细胞(例如用于本文描述的方法)的培养皿，其中该皿的下侧刻有线间间距为1.5-2.5cm(例如，约2cm)的网格，例如，2x2 cm网格。在一些实施方案中，网格作为该皿的一部分形成，打印或蚀刻在下侧上。在一些实施方案中，该皿包含聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚乙烯基热塑性树脂。在一些实施方案中，该皿包含布置于其中的生物基质水凝胶支持物层，优选基底膜提取物或合成基质。
出于任何和所有目的，附录1和2以及其中提到的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在是限制性的。本文提及的所有公开出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将是明显的。
附图说明
图1A至H.一种改进的重编程方法，其将Y4F和调控代谢的miRNA进行组合。(A至D)筛选miRNA，其相对于空载体(模拟)对照，增强通过Y3F(A)、Y4F(B)、Y3F+3(C)或Y4F+3(D)从hDF生成hiPSC样集落。平均值±标准差，n＝5，*p<0.05；**p<0.01，单向ANOVA和Tukey后检验(post test)。(E至F)在用Y4F、miR-302s和/或miR-200c感染的hDF中OCR(E)和ECAR(F)的时间进程。平均值±标准差，n＝3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005，双向ANOVA和Tukey后检验。(G)慢病毒感染后编码Y4F、Y4F+3或Y4F+3+2的AP+集落中TRA-1-60+集落的百分比。平均值±标准差，n＝6，***p<0.005，双向ANOVA和Tukey后检验。(H)用编码Y4F、Y4F+3或Y4F+3+2的附件体载体进行转染后AP+集落中TRA-1-60+集落的百分比。平均值±标准差，n＝4，**p<0.01，双向ANOVA和Tukey后检验。
图2A至D.通过我们的改进的重编程方法生成的更高质量的hiPSC系。(A)热图描绘了与原始hDF和hESC系(H9)相比，已建立的hiPSC系中的多能性标志物的基因表达水平。n＝3。(B)通过与针对多能性标志物(例如OCT4、NANOG、TRA-1-60和SOX2)的特异性抗体的不同组合生成的hiPSC系的免疫染色以及Hoechst 33342核染色(插入图)。比例尺条：100μm。(C)自发分化7天后，外胚层(OTX2)、中胚层(BRACHYURY)和内胚层(SOX17)的谱系特异性标志物的免疫染色。比例尺条：100μm。(D)热图描绘了由pY4F、pY4F+3或pY4F+3+2生成的hiPSC系中外胚层(PAX6和MAP2)、内胚层(FOXA2、SOX17和CK8)和中胚层标志物(MSX1、MYL2A和COL6A2)的早期分化标志物的基因表达水平。n＝2。
图3A至C.通过散发性PD患者的皮肤生检生成的hiPSC系的基因组完整性。(A)存在于四种hiPSC系中的体细胞突变。柱示出了每种hiPSC系中的单元素突变的数目(每种hiPSC系的颜色不同)和存在于两种或更多种hiPSC系中的独特突变的数目(黑色柱)。在黑色柱下方，共享突变的hiPSC系由与边缘连接的点指示。左下角比例尺条表示突变的总数目，所述突变包括单元素和存在于两种或更多种hiPSC系中的突变两者。C4具有最小数目的体细胞突变(n＝92)，其中80种是单元素，并且12种存在于C4和其他hiPSC系中。(B)将编码区和癌症相关联基因上的突变负荷与公开可用的数据集进行比较。本发明人的hiPSC系中非同义突变的数目显著低于hESC系的。平均而言，来自HiPSC项目的iPSC系中非同义突变的数目与本发明人的hiPSC系中非同义突变的数目类似。总体而言，C4示出了最低的突变负荷(红色)。对于癌症相关联基因中的体细胞突变，在两种广泛使用的hESC系(H1和H9，蓝色)和C4hiPSC系(红色)中不存在体细胞突变(右图)。(C)四种hiPSC系中所有体细胞突变的次要等位基因分数(MAF)的分布。0.5的MAF附近的峰表示克隆体细胞突变。具有0.1的较低MAF的第二峰表示亚克隆突变。对于每个图，具有两个峰的密度曲线示出了体细胞突变MAF的分布，并且曲线的颜色与用于每种hiPSC系的(A)匹配，并且具有不同颜色的曲线(MAF值0.0附近达到最高峰)表示由其他hiPSC系检测到的体细胞突变。
图4A至D.基于点样的体外分化改善所得多巴胺细胞的产量和质量。(A)寻找优化物理培养条件的实验方案。在第0天到第15天，通过FACS和/或手动细胞计数对所有细胞(无论其存活力如何)进行定量，如用箭头所标记的。在第15天，将细胞重新铺板在盖玻片上以进行免疫细胞化学分析，或收获细胞以进行实时定量PCR。(B至C)基于单层的常规方法与基于点样的方法之间的比较，以针对hESC(H9和H7)和hiPSC(C4和N3)二者，确定第1天至第14天的细胞丢失(由于脱落)程度和D15的细胞收获(B)，以及确定D15的死亡细胞百分比(C)。11,000/cm2和10,000/斑点的细胞密度分别用于常规方法和基于点样的方法。呈现的数据反映了具有可测量结果的实验(参见图13A的图例)。平均值±标准差，n＝4，单向ANOVA。(D)使用免疫细胞化学分析对D15的最终细胞收获中的濒死细胞进行定量。针对切割的半胱天冬酶(caspase)-3的抗体用于检测凋亡细胞。通过Hoechst 33342染色对核凝聚进行可视化，以检测死亡或濒死细胞。用点样技术铺板的细胞示出，切割的半胱天冬酶-3阳性细胞的数目显著减少。比例尺条：100μm。
图5A至G.槲皮素处理对未分化和分化细胞的影响。(A)筛选以确定最佳槲皮素处理条件。在用不同的槲皮素浓度和持续时间处理后，使用血细胞计数器对存活的hiPSC进行计数。(B至C)D9时的槲皮素处理后D11时多巴胺能细胞的存活力(B)和总细胞数目(C)。在5、10、20、40和100μM下处理培养物16小时。平均值±标准差，n＝4，单向ANOVA。(D)与恒定数目的成纤维细胞(105)一起的按10的倍数从105连续稀释至1的hiPSC的集落形成。细胞用40μM槲皮素(QC)处理16小时或未经处理，然后培养6天，随后染色以确定碱性磷酸酶活性。来自两个单独实验的代表性结果。(E)针对原始输入hiPSC数目进行计数的最终集落数目的绘图。(F)通过qRT-PCR生成OCT4拷贝数目对输入hiPSC数目的标准曲线。OCT4拷贝数目通过qRT-PCR测量，并且从10倍连续稀释的hiPSC，从105至102个细胞中计算。(G)使用OCT4 qRTPCR测量在不同时间点处在经或未经QC处理的情况下从hiPSC分化的mDA细胞中的OCT4阳性细胞数目。平均值±标准差，n＝2，***p<0.005，双向ANOVA。
图6A至I.体外分化的C4 hiPSC的分子、细胞和生理表征。(A)基于点样方案的mDA分化方法的示意性概述。数字表示以ng/ml为单位的浓度，括号中的数字表示以μM为单位。AA表示抗坏血酸；β-mer表示β-巯基乙醇；BDNF表示脑源性神经营养因子；CHIR表示CHIR99021；dbcAMP表示二丁酰基环单磷酸腺苷；FGF-8表示成纤维细胞生长因子8；GDNF表示胶质细胞系源性神经营养因子；KSR表示敲除血清替代物；LDN表示LDN193189；L-Glu表示L-谷氨酰胺；NEAA表示非必需氨基酸；PMN表示Purmorphamine；QC表示槲皮素；SB表示SB431542；SHH表示Sonic Hedgehog；TGF-β3表示转化生长因子β3。(B)mDA分化细胞中阶段特异性神经标志物的基因表达的热图。(C)分化期间FOXA2、LMX1A、NURR1和TH基因表达逐渐增加。(D)分化的D28细胞中神经前体标志物(NESTIN)、mDAP标志物(FOXA2/LMX1A/TH)、mDAN标志物(MAP2、NURR1/TH)和增殖标志物PAX6/SOX1/KI67细胞的免疫荧光染色。比例尺条；100μm。(E)总D28细胞中NESTIN+、MAP2+、TH+和NURR1+细胞的百分比(n＝6)。(F)总D28细胞中FOXA2+、LMXA1+和FOXA2+/LMX1A+细胞的百分比(n＝6)。(G)TH+D28细胞中FOXA2+/LMX1A+和NURR1+细胞的百分比(n＝6)。(H)总D28细胞中PAX6+、SOX1+和PAX6+/SOX1+/KI67+细胞的百分比(n＝6)。N.D表示未检测到。(I)在D47，对KCl诱导的多巴胺和多巴胺代谢物(DOPAC)释放的HPLC分析。数据呈现为平均值±SEM。
图7A至H.在NOD-SCID小鼠中C4衍生的mDA细胞的体内安全性。(A)在C4 iPS细胞(D0(第0天)，左)的纹状体移植或D14(第14天)(中)或D28(第28天)(右)C4衍生的mDA祖细胞的纹状体移植后，NOD-SCID小鼠脑的H&E染色。D14组中的白色圆圈鉴定玫瑰花结样结构。(B)在D0(n＝4)和没有槲皮素的情况下D14(n＝4)，以及在D14(n＝19)和D28(n＝23)在有槲皮素处理组的情况下的畸胎瘤形成百分比定量。QC＝槲皮素。(C)在无槲皮素的情况下分化的D14的玫瑰花结形成定量，以及在D14和D28在经槲皮素处理的情况下的定量。(D)D14和D28组中波形蛋白的免疫组织化学。(E至F)D14组(E)和D28组(F)中SOX1、PAX6和KI67的免疫荧光染色。(G)D14和D28组中SOX1+、KI67+、SOX1+/KI67+、SOX1+/PAX6+、SOX1+/PAX6+/KI67+群体的定量。数据呈现为平均值±SEM，n＝4，***p<0.001，Student t检验。(H)生物分布测定。6个月前已接受纹状体内hiPS衍生的D28多巴胺能祖细胞移植物的NOD SCID小鼠的“脑混合物”(嗅球和小脑的混合物)、脊髓、肺、心脏、脾、肾和肝中人或小鼠特异性基因表达的RT-PCR。hiPSC用作阳性对照。人特异性基因位于10号染色体29125650至29125967处。小鼠特异性基因是小鼠TNFα的一部分。N.D表示未检测到。除非另有说明，否则所有比例尺条都指示100μm。
图8A至N.C4 hiPSC衍生的mDA细胞的体内存活和功能。(A至D)在D28组和冷冻保存(“Cryo”)D28组(n＝9)中，使用药物诱导旋转测试(A)、廊道测试(B)、圆柱体测试(C)和步进测试(D)进行的行为评估。(E至F)宿主脑的移植物衍生的hNCAM+神经支配和TH+神经支配的概述。(G至L)进入宿主STR、NAc和PFC中的移植物衍生的hNCAM+神经元(G至I)或TH+神经元(J至L)对完整侧、移植侧和损伤未移植侧的神经支配。(M)示出移植物衍生的神经支配的高倍放大图像。(N)移植神经元中的人特异性突触标志物突触囊泡蛋白，TH和DARPP32的免疫荧光染色。所有移植物分析数据(E至M)都在移植后26周获得。AC表示前连合；cc表示胼胝体；dSTR表示背侧纹状体；LV表示侧脑室；NAc表示伏核；PFC表示前额皮层；T表示移植物。数据呈现为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student t检验。比例尺条：500μm(G至L)；100μm(M至N)。
图9A至N.调控代谢重编程的微小RNA的鉴定和基于它们与Y4F组合的改进的重编程方法。(A至B)在转染后3天，使用XFp分析仪对用对照微小RNA模拟物(Scr)或miR-200c(200c)转染的hDF的耗氧率(OCR)(A)和细胞外酸化率(ECAR)(B)进行评估。平均值±标准差，n＝3，*p<0.05，双尾未配对t检验。(C)在转染后3天，用Scr或miR-200c转染的hDF的OXPHOS能力。平均值±标准差，n＝3。(D至E)基础呼吸、ATP周转、最大呼吸、氧化储备(oxidative reserve)(D)或FCCP注射后相对的OCR变化(E)。平均值±标准差，n＝3，*p<0.05，双尾未配对t检验。(F至G)示出了在转导后3(F)或8(G)天，用表达Y4F和/或miR-200c(200c)的慢病毒感染的HDF的OCR。平均值±标准差，n＝3。(H至I)转导后3(H)或8(I)天hDF(如F至G中所示)的基础呼吸、ATP周转、最大呼吸和氧化储备。平均值±标准差，n＝3，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005，单向ANOVA和Tukey后检验。(J至K)转导后hDF(如F至G中所示)的OCR/ECAR比率(J)或FCCP注射后相对的OCR变化(K)。平均值±标准差，n＝3，*p<0.05；**p<0.01,双向ANOVA和Tukey后检验。(L至M)在转导后3天，用表达单个miRNA的慢病毒转导的hDF的OCR(L)和ECAR(M)。平均值±标准差，n＝9，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005，单向ANOVA和Tukey后检验。(N)OCR/ECAR比率，如L至M中所示。n＝9，***p<0.005，单向ANOVA和Tukey后检验。
图10A至E.Y4F+3+2重编程方案的鉴定。(A)转导后14天TRA-1-60(上)或AP(下)阳性集落的代表性图片。(B)在成人成纤维细胞(GM03529)中，慢病毒转导Y4F、Y4F+3或Y4F+3+2后AP+集落中TRA-1-60+集落的百分比。平均值±标准差，n＝6，**p<0.01，双向ANOVA和Tukey后检验。(C至D)编码pY4F(OCT4、SOX2、KLF4和L-MYC)(C)以及miR-302s和-200c(p3+2)(D)的质粒图谱。(E)本发明人建立的基于附件体系统的重编程方法的示意性图像，该方法使用用pY4F和pY3+2的单次转染。
图11A至B.通过本发明人改进的重编程方法生成的hiPSC系的免疫细胞化学染色。通过本发明人的附件体方法从多种来源的各种成人成纤维细胞生成的人iPSC的免疫细胞化学染色，这些成纤维细胞包括来自Coriell研究所的9个成纤维细胞系(3个家族性PD、3个散发性PD和3个健康受试者，A)和来自新皮肤生检的4个样品(3个健康受试者和1个散发性PD患者，B)。
图12A至G.通过本发明人改进的重编程方法生成的hiPSC系的表征。(A)EBNA-1特异性序列(EB-01)的qRT-PCR检测的标准曲线。(B)在任何hiPSC系的细胞质中都未检测到残留的质粒DNA。还测试了来自原始成纤维细胞(Fib)、人ESC系(H9)和阴性对照(蒸馏水:DW)的样品。基于EBNA序列(EB-01)的质粒特异性引物用于qRT-PCR分析。(C)检测宿主基因组中整合的质粒DNA。发现一种系(N17)在宿主染色体DNA中整合了质粒DNA序列。(D)整合的质粒序列的qRT-PCR分析。平均值±标准差，n＝3，***p<0.005，单向ANOVA。(E)衍生自散发性PD患者的皮肤生检的hiPSC系的染色体基因分型(genotyping)(MCL540)。将模式与分别作为阳性和阴性对照的原始成纤维细胞(Fib)和hESC系(H9)的样品进行比较。DW表示蒸馏水。(F)C4和N3正常核型的代表性图像。(G)来自WiCell(上)、C4(中)和N3(下)的19-9-11ThiPSC系的畸胎瘤形成和三种胚层组织的代表性图像。比例尺条：100μm。
图13A至C.基于点样的分化方案的示意性图像。(A)使用基于单层或基于点样的方法对hESC和HIPSC进行分化的成功率(对于hESC，n＝76，并且对于HIPSC，n＝48)。当1)细胞在D15可以以>50％汇合度存活并且2)可以将细胞收获并铺板在盖玻片上以通过ICC进一步表征时，体外分化认为是成功的。(B至C)带有6个斑点的6cm培养板和带有12个点的10cm培养板的点样示意性图像。
图14A至C.基于点样和基于单层的体外分化的比较。在基于单层和点样的方法使用体外分化，在C4和H9(n＝4)二者的分化D15比较细胞丢失率和细胞收获率(A)。通过FACS获得丢失和收获的细胞数目；在C4和H9(n＝4)二者的不同时间点收获的上清液的pH值(B)；C4在D4(第4天)、D8(第8天)、D12(第12天)和D15的形态特征(C)。比例尺条呈现20μm。数据呈现为平均值±SEM，*p<0.05；***p<0.005。双尾配对t检验(A)、单向ANOVA和Tukey多重比较检验(B)用于确定统计显著性。
图15A至C.通过槲皮素处理去除未分化的hiPSC。(A)100K个总细胞中用成纤维细胞按10的倍数连续稀释的未分化HIPSC的抗SSEA-4和TRA-1-60FACS分析。(B)输入hiPSC数目对SSEA-4+和TRA-1-60+细胞的所得百分比的图。(C)在经或未经槲皮素处理的情况下，D14细胞中NANOG的免疫染色。比例尺条：100μm。
图16A至B.体外分化的C4 hiPSC的表征。(A)D3(第3天)至D40(第40天)的分化细胞的明场图像。(B)mDA分化D14、D21(第21天)、D28和D50(第50天)期间神经前体(NESTIN)、mDAP(FOXA2/LMX1A)、mDAN(MAP2和TH)、GABA能神经元(GABA)和羟色胺能神经元(5-HT)阳性细胞的免疫荧光染色和百分比。比例尺条：100μm。数据呈现为平均值±SEM，n＝6。
图17A至B.体外分化的C4 hiPSC的细胞命运分析。(A)电生理记录的D70(第70天)细胞的免疫荧光染色，共表达TH、MAP2、SYP(突触囊泡蛋白)、DAT(多巴胺转运体)、VMAT2(囊泡单胺转运体2)和PITX3。比例尺条：100μm。(B)用TH阳性细胞的ALDH1A1、GIRK2和钙结合蛋白的免疫荧光染色。比例尺条：100μm。
图18A至H.体外分化的C4 hiPSC的电生理特性。(A)在D70，通过去极化电流注入(500ms)诱导的动作电位的代表性电压轨迹。(B)电压钳模式下由电压脉冲诱发的代表性电流轨迹。左：由-70mV至+40mV的电压脉冲以10mV增量(100ms持续时间)诱导的瞬态内向和持续外向电流。中：内向电流被TTX(1μM)完全阻断。右：从在对照条件下记录的轨迹中减去在存在TTX的情况下记录的轨迹，以隔离不同膜电位下的电压门控Na+电流。(C)电压钳模式下以-70mV记录的自发突触后电流。(D)在静息膜电位下，在电流钳模式下，分化细胞的自发点火(firing)。(E)单独记录细胞的免疫荧光染色。神经生物素填充细胞(红色)示出TH阳性(绿色)。比例尺条：100μm。(F)使用多电极阵列的体外分化C4 hiPSC在D30、D37和D44的累积活动图和尖峰形成(spiking)活动。(G至H)在经或未经用谷氨酸受体拮抗剂NBQX+AP5和GABAA受体拮抗剂印防己毒素的组合处理的情况下，D44(第44天)分化C4 hiPSC的平均尖峰数目(G)和活性电极数目(H)。数据呈现为平均值±SEM，n＝4。
图19A至M.PD无胸腺大鼠模型中体内移植结果的分析。(A)在4、8、12和16周移植C4衍生的D28 DA祖细胞(100,000或300,000个细胞)之前和之后，6-OHDA损伤Taconic大鼠安非他命(Amphetamine)诱导旋转测试。数据呈现为平均值±SEM。**意指p<0.01，***意指p<0.001。(B)移植第28天细胞后6个月无胸腺大鼠脑的H&E染色。(C)hNCAM的免疫组织化学显示，在连续的冠状切片中，对整个宿主脑中的多个区域中广泛的纤维长出。(D至G)hNCAM染色的更高的放大倍数显示，从移植物对前额皮层(D)、隔核(E)、伏核(F)和胼胝体(G)中的长出。(H至J)在移植后6个月，由D28 DA祖细胞产生的移植物中TH+多巴胺能神经元的组织学分析。注意具有大的角状细胞胞体(angular cell somata)的A9样神经元形态(I)以及较小的球形A10样神经元(J)。(K)体内Charles River无胸腺大鼠实验的示意性图像。(L)新鲜制备的D28细胞与在液氮中1周后解冻的Cryo-D28细胞之间的细胞存活力以及FOXA2、LMX1A和TH阳性细胞数目的比较(n＝3-4)。(M)D28细胞和Cryo-D28细胞移植后24至52周安非他命诱导的旋转测试(n＝3-4)。数据呈现为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student t检验。AC表示前连合；cc表示胼胝体；NAc表示伏核；PFC表示前额皮层。除非特别描述，否则所有比例尺条都指示100μm。
图20A至C.体内移植的功能和神经支配分析。(A)移植H9 hESC和C4 hiPSC衍生的D28细胞后安非他命诱导的旋转测试(n＝5-8)。(B)每组的6-OHDA损伤脑的代表性图像。(C)移植物对STR和NAc的神经支配的高倍放大图像。数据呈现为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，Student t检验。STR表示纹状体；NAc表示伏核。
图21A-O.移植C4衍生的mDA细胞后的移植物分析。(A)D28和Cryo-D28移植物中TH+神经元(A9样和A10样)的免疫染色。(B)估计D28和Cryo-D28移植物中存活的TH+神经元的数目(n＝4)。(C)估计D28和Cryo-D28移植物的移植物体积(n＝4)。(D-F)D28移植物中FOXA2、LMX1A(D)和NURR1(E)和TH的免疫荧光共染色(n＝4)。(F)在D28和Cryo-D28移植物中共表达FOXA2、LMX1A、两个标志物或NURR1的TH+神经元的定量(n＝4)。(G)DAT和TH的免疫荧光共染色。(H)移植神经元中PAX6、SOX1和Ki67的免疫荧光染色。(B)D28和Cryo-D28移植物中PAX6+、SOX1+和Ki67+细胞的定量(n＝4)。(J至L)D28和Cryo-D28移植物中TH的GIRK2+(J)和钙结合蛋白+(K)神经元免疫荧光共染色(n＝4)。(L)D28和Cryo-D28移植物中钙结合蛋白+和GIRK2+神经元的定量。(M至O)D28移植物中TH+、ALDH1A1+和SOX6+(M)、TH+、ALDH1A1+和GIRK2+(N)、TH+、ALDH1A1+和钙结合蛋白+(O)的免疫荧光共染色。Taconic大鼠的所有移植物分析数据都在移植后18周获得。Charles River大鼠的所有移植物分析数据都在移植后26周获得。AC表示前连合；cc表示胼胝体；NAc表示伏核；PFC表示前额皮层；SNpc表示黑质致密部；STR表示纹状体；T表示移植物；VTA表示腹侧被盖区。比例尺条：50μm(A)；100μm(D至O)。
图22A至I.GMP分化方案示意性概述和质量控制结果。(A)GMP分化方案的示意性概述，每个阶段的细胞产量以红色显示。QC指示质量控制。(B)OCT4和SSEA-4的D0免疫细胞化学QC染色。(C)使用qRT-PCR对Oct4和Nanog mRNA表达水平进行D0 QC。(D)C4 D26 DNA指纹分析QC示出了与原始成纤维细胞相同的模式，然而阴性对照不同，这证实工作细胞库中的C4 iPS细胞源于患者的成纤维细胞。Fib：成纤维细胞。M：DNA标志物。(C)使用qRT-PCR对FOXA2、LMX1A和TH mRNA表达水平进行D26 QC。(F)使用D0未分化细胞作为阴性对照，对FOXA2、LMX1A和Nurr1进行D26免疫细胞化学QC染色。(G)(F)中FOXA2、LMX1A和Nurr1表达的定量。(H)TH、5-HT、TPH、OCT4和SSEA-4的D26免疫细胞化学质量控制染色，针对OCT4和SSEA-4对Do未分化细胞染色以作为阴性对照。(I)(H)中TH、5-HT、TPH、OCT4和SSEA-4表达的定量。在D26收获一些细胞以进行免疫细胞化学QC，以允许细胞粘附到盖玻片，并且在D28的最终收获之前完成染色和分析过程。比例尺条：100μm。对于每个实验，n＝3。
图23A至C.mDA祖细胞在人源化小鼠中的免疫原性。A和B示出了在移植自体和同种异体mDAP后2周，用抗hNCAM(A)和TH/hNCAM(B)的抗体染色的小鼠脑切片，以检测存活移植物的存在和多巴胺能分化。(C)，用抗CD4染色，表明仅在放置在患者人源化动物中的同种异体移植物中的主要细胞丢失和T细胞浸润。所有比例尺条都指示100μm。NSG表示NOD/SCID/IL2rγnull小鼠；C4-hu表示用患者衍生的PBMC人源化的NSG小鼠；K1-hu表示用志愿者衍生的PBMC人源化的NSG小鼠。C4-mDAP表示患者衍生的mDAP；H9-mDAP表示人胚胎细胞系衍生的mDAP。
图24A至B.成像。(A)，所指示时间点的基底神经节水平下的轴18F-DOPA PET图像：基线(首次手术前4个月)、左侧植入物后3个月、右侧植入物后6个月和左侧植入物后12个月以及左侧植入物后24个月和右侧植入物后18个月。初始左侧植入物后3个月，18F-DOPA摄取短暂降低，随后双侧多巴胺摄取逐步适度增加(右侧大于左侧)，主要在移植物位点附近的后壳核。(B)，左侧植入后18个月和右侧植入后12个月的T2刀片MR图像。箭头指示植入物的位置。
图25A至B.帕金森相关运动功能、非运动功能和生命质量的纵向临床评估。第一(左)和第二(右)半球植入物的时间用垂直虚线来表示。(A)左旋多巴过夜停用(“关闭”)后和左旋多巴峰值剂量(“开启”)下的MDS-UPDRS第III部分运动评分。(B)所指示的PDQ评定量表的时间进程；较低的数字指示较低的症状严重程度。
具体实施方式
由于黑质(SN)中A9 mDA神经元(mDAN)的选择性变性是帕金森氏病的关键病理特征，并且与该病的主要运动症状直接相关，因此多巴胺能细胞移植已被提议作为一种潜在的治疗策略(3)。为了支持这一观点，先前使用胎儿细胞移植的干预措施提供了“概念证明”，其中许多移植物成功地使靶标区域重新神经支配，有不同程度的功能恢复，包括一些示出持续二十年或更长时间的显著恢复的患者(4-7)。尽管取得了这些有希望的结果，但衍生自流产的人胎儿的组织作为治疗PD的可行细胞来源具有基本的伦理、实践和医学局限性。
2006年，Yamanaka及其同事发表了一项开创性研究，其示出通过引入四种转录因子，即，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(以下表示为Y4F，Yamanaka4因子)，可以将哺乳动物成纤维细胞转化成胚胎干细胞(ESC)样诱导多能干细胞(iPSC)(8)。Yamanaka和另外两个小组随后用人体细胞完成了这一壮举，将它们重新编程为人iPSC(hiPSC)(9-11)，提供了生成患者特异性干细胞的可能性。尽管最初令人兴奋，但仍不确定这种hiPSC技术是否可以容易地用于自体细胞疗法。实际上，大多数hiPSC研究的主要目标已经从个性化细胞疗法转向人类疾病和发展的机制研究(12)。实施用于PD的基于hiPSC的细胞疗法存在若干主要障碍。首先，可能由于我们对重编程过程的了解有限，单个hiPSC系的分化潜能之间存在宽的可变性(13,14)。第二，基于hiPSC的细胞疗法的安全性尚未完全确定。具体地，由于任何保持未分化或带有亚克隆致瘤突变的hiPSC都具有赘生性潜能(15,16)，因此至关重要的是从治疗性产物中完全消除此类细胞。如通过首次基于hiPSC的人体试验的两名患者中的一名所展示的(17)，安全的临床应用需要通过全基因组/外显子组测序(WGS/WES)来确认HIPSC的基因组完整性。第三，尽管多个实验室进行了大量研究，但将hiPSC体外分化成功能性mDAN的方案仍然是亚最佳的，增加了最终产物的可变性(7,18)。最后，长期的成本效益和可重复性对于使尽可能多的患者受益将是必要的。
本公开解决了这些挑战，使基于hiPSC的个性化细胞疗法成为治疗PD的可行选项。首先，本发明人鉴定了在重编程过程期间直接调控代谢变化的多种微小RNA(miRNA)，并且示出这些miRNA(miR-302s和miR-200c)与经典重编程因子的最佳组合可以高效且可靠地生成高质量的IPSC。这种新的附件体重编程方法已成功应用于使用13种不同来源的成人成纤维细胞生成多种hiPSC。对使用来自单个散发性PD患者的皮肤生检的成纤维细胞产生的所得hiPSC的全外显子组测序(WES)和核型分析示出，染色体和基因组完整性稳定且没有任何已知的致癌突变。第二，本发明人建立了一种化学(槲皮素)方法，其可以有效且可靠地消除未分化的hiPSC，从而避免了移植后形成肿瘤。参见，例如，US20160002604。第三，本发明人建立了一种有效的基于新型“点样”方法的体外分化方案，其与常规单层方法相比，可以显著地减少细胞丢失并提高更健康细胞的产量。第四，通过这种体外分化方案生成的mDA细胞的移植在PD的无胸腺大鼠模型中提供了对运动功能障碍的强健纠正，并且无论是利用新鲜细胞还是冷冻保存的细胞，都示出了对宿主大脑的显著再神经支配。最后，本发明人在良好生产规范(GMP)设施中成功实施了本发明人的平台，产生了大量高质量的mDA细胞。因此，此处描述的核心技术提供了一种适合于成功实施用于PD的个性化、自体、细胞替代疗法的方案。
PD是细胞替代疗法的特别有希望的靶标，因为良好表征的细胞类型(A9型MDAN)的选择性变性是与该病况相关联的运动功能障碍的主要原因。许多研究人员已使用多种细胞来源广泛研究了用于PD的细胞疗法，这些细胞来源包括胎儿组织、自体成体干细胞和同种异体mDA细胞(5-7,54)。本发明人转而专注于hiPSC衍生的自体细胞替代物，因为其在减轻伦理、实践和医学问题方面具有独特的优势。为了帮助实现用于PD的个性化自体细胞疗法的潜能，本发明人试图解决该治疗策略实施的目前技术和科学障碍。
由于个性化细胞治疗需要从每个接受治疗的患者中生成临床级hiPSC，因此至关重要的是建立允许高效且可靠地生成此类细胞系的重编程技术。本发明人发现，两种调控代谢的miRNA(miR-302s和miR-200c)与经典Yamanaka因子(Y4F)的组合促进了符合严格质量标准的hiPSC的生成：首先，本发明人的hiPSC系示出的真实多能性标志物(包括OCT4、SOX2、NANOG、ESRRB、REX1、GDF3、ECAT1、GBX2和TRA-1-60)的表达水平与H9示出的类似(图2，A和B)。第二，H9 hESC系和由Y4F+3+2(本发明人的最终方法)生成的但不是由Y4F或Y4F+3生成的hiPSC系同样很好地分化成所有三种胚层谱系，如通过三种胚层特异性标志物的免疫染色和基因表达所确定的。(图2，C和D)第三，本发明人的衍生自多种hDF的hiPSC系示出了典型的hESC样致密型集落形态，其具有定义明确的边界(图10A和11A)。通过从13种不同的成人hDF来源成功生成多种hiPSC系，验证了这种方法的稳健性。这种相同的组合如何使用替代的递送方法(例如，成熟RNA/miRNA或仙台病毒)来进行以及如何在其他细胞类型(例如，血细胞和尿细胞)中进行将值得进一步研究。
在将hiPSC用于疗法之前，应确认其基因组完整性。例如，Merkle及其同事报道，包括H9的若干hESC系在编码肿瘤抑制因子P53的TP53基因中发生突变，这是人癌症中常见的突变(28)。值得注意的是，在第一次基于hiPSC的人体试验中，发现衍生自两名患者之一的hiPSC具有轻微的致癌突变，导致第二名患者的细胞治疗被取消(17)。为了证实基因组完整性，本发明人通过核型分析、qRT-PCR和WES分析对衍生自散发性PD患者(表B中的MCL540)的5种独立hiPSC系进行了分析，并且发现5种克隆中的4种(C4、N3、C11、C5)不含整合的质粒DNA且不含有与癌症有因果关系的体细胞突变，这示出本发明人的重编程方法可以可靠地生成临床上可行的hiPSC系(表2)。与Merkle及其同事研究的140种hESC系相比，这4种hiPSC克隆中的每种系都含有显著更少的变体(28)。具体地，它们在COSMIC数据库中报告的基因中含有显著更少的编码变体(图3)。基于hiPSC的疗法面临的另一关键安全问题是需要消除残留的未分化细胞的赘生性潜能。在本研究中，我们建立了一种使用靶向hPSC特异性BIRC5(40)的槲皮素的化学方法，其以>99.99％的效率消除未分化的PSC(图5)。基于OCT4表达的qRT-PCR分析的理论计算预测，槲皮素处理后每1千万个D28细胞中有0.0017个未分化细胞。考虑到所有类型胶质瘤的自发发病率的范围为4.67至5.73/100,000(55)，因此肿瘤形成的风险与胶质瘤的自发发病率相比是有利的。本方法简单、有效，不需要额外的处理，如细胞分选或γ射线照射(45,56)，并且因此可以容易地符合GMP标准。然而，槲皮素处理并不能直接消除玫瑰花结形成上皮细胞的神经过度生长，这突出显示了将槲皮素处理与足够的体外分化(例如，28天)进行组合的重要性(图7)。
本方法提供了一种有效的基于“点样”方法的体外分化方案，其中使用物理分离将较小数目的初始细胞生长并分化成高细胞密度的斑点，从而显著减少细胞丢失并产生更健康的mDA细胞，与传统的融合单层相比，死亡或濒死细胞明显更少(图4)。重要地，无论培养基更换频率如何，单层培养基(而不是点样培养的培养基)都会变得更加酸性(图14B)，这可能导致单层培养中细胞健康状况不佳。当此类D28细胞在体外进一步分化时，它们在D47(第47天)成熟并显著地释放多巴胺(3.1ng/ml)，并且到D70表现出特征性mDAN电生理特性。这些数据示出，这种分化方案的D28培养物主要由真实mDAP组成，并且表示移植的理想来源。本发明人在GMP设施中成功地按比例放大了这种方案，以产生临床相关数量的高质量mDAP(图22A至F)。
尽管许多研究已经表明hESCs/hiPSCs高效分化成mDA表型，但它们的体内功效在最佳情况下也是可变的，并且通常与体外数据几乎不相关(7)。在一些先前的临床试验中，未首先在适当的动物模型中经受广泛功能验证的DA产生细胞的移植未能产生临床益处(5,6)。本文描述的细胞移植物的功效已例如使用PD的体内动物模型根据若干标准加以证实：(1)足够的mDAN在移植物中分化并长期存活；(2)这些mDAN广泛地使宿主纹状体中的靶标区域重新受神经支配；(3)在多项适当的行为测试中，运动功能障碍得到大幅改善。当将D28C4细胞移植到单侧6-OHDA损伤Taconic或Charless River无胸腺大鼠中时，DA产量高，并且移植物显示出宿主结构的广泛和适当的神经再支配。移植导致药物诱导的旋转行为完全恢复。与可比较的基于hiPSC的研究相比，本研究中的DA产率(存活DA神经元与移植细胞数目的比率)和行为恢复程度明显更高(表4)(44,45,57-64)。值得注意的是，旋转行为的恢复持续长达52周(图19M)，并且在包括廊道、圆柱和步进测试(图8)的若干测试中观察到显著恢复，因为这些测试是自发的并且没有受到药物刺激，所以可能是更接近的临床PD症状学类似物。
为了确认基于hiPSC的个性化细胞疗法的临床有效性，重要的是将治疗性产物与已建立的“黄金标准”进行比较。在干细胞领域，H9 hESC表示这种用于人多能干细胞的标准，并且人胎儿VM细胞已成为PD可移植细胞来源的黄金标准。Parmar及其同事优雅地比较了H9衍生的mDA细胞与人胎儿VM细胞在恢复运动功能方面的体内功效，表明H9衍生的多巴胺细胞与人胎儿VM细胞一样有效(53)。本动物移植研究证实，无论来源是H9(hESC)还是C4(hiPSC)，旋转行为恢复的程度和时间进程都相同(图20A)。根据推断，这些数据强烈表明，通过本发明人的方案从患者衍生的hiPSC生成的多巴胺细胞在功能上与胎儿VM细胞一样有效。Takahashi等人最近的研究优雅地示出，hiPSC衍生的DA细胞可以在MPTP损伤猴模型中存活并改善运动行为(65)，但这些结果与本发明人的研究的直接比较受到所使用的不同物种平台的阻碍。本发明人发现，在所有测试中，新鲜和冷冻保存的C4 D28细胞导致类似的存活DA神经元产量和行为改善，这表明衍生自hiPSC的mDAP可以冷冻保存、储存并运送到手术地点以进行移植。这对于开发切实有效且具有成本效益的临床疗法的重要性怎么强调都不为过。
因此，本方法提供了用于PD的临床适用个性化自体细胞疗法。
另参见US 20180371422；US20120128655；US20130052268；US20160002604；US20140199274；以及US 20090226401，以及US 9657273和US 9750768。
用于细胞疗法的自体细胞的生成
本文描述的方法可以包括使用例如与神经原性底板细胞类似的诱导多能干细胞(hiPSC)，其可以使用本领域已知或本文描述的方法来生成。在一些实施方案中，生成hiPSC的方法可以包括从受试者获得原代体细胞群体，例如，患有PD并且需要治疗PD的受试者。优选地，受试者是哺乳动物，例如，人。在一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞。成纤维细胞可以例如使用已知的生检方法从哺乳动物体内的结缔组织获得，例如从皮肤获得，例如来自眼睑、耳背、疤痕(例如，腹式剖宫产疤痕)或腹股沟的皮肤(参见，例如，Fernandes等人，Cytotechnology.2016Mar；68(2):223–228)。hiPSC的其他体细胞来源包括毛发角质形成细胞(Raab等人，Stem Cells Int.2014；2014:768391)、血细胞或骨髓间充质干细胞(MSC)(Streckfuss-
Figure BDA0003482534650000181
等人，Eur Heart J.2013 Sep；34(33):2618-29)。
根据本方法，将细胞(例如，成纤维细胞)暴露于因子以诱导重编程为iPSC。尽管可以使用其他编程方案(例如，如本领域已知的或本文描述的)，但在优选的实施方案中，该方法包括引入四种转录因子，即，Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc。在一些实施方案中，该方法包含用表达OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的多顺反子附件体载体转染细胞，该多顺反子附件体载体例如包含对编码序列之间的“自切割”2A肽进行编码的间插序列。2A肽是长度为18-22个氨基酸的病毒肽，其可以在真核细胞翻译期间介导多肽的切割。2A肽包括F2A(口蹄疫病毒)、E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(thosea asigna病毒2A)，并且通常在C-末端包含序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO:1)。
参见，例如，Liu等人，Sci Rep.2017；7:2193。下表提供了实例性2A序列。
Figure BDA0003482534650000191
在一些实施方案中，该方法包含用多顺反子附件体载体转染细胞，该多顺反子附件体载体包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列，用于表达OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC。
下表提供了对OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的实例性序列的参考。
Figure BDA0003482534650000192
Figure BDA0003482534650000201
在一些实施方案中，该方法还或替代地包括在细胞中表达一种或多种外源性微小RNA，例如，miR-106a、-106b、-136s、-200c、-302s、-369s和-371/373中的一种或多种。miR-302s指示miR-302簇，其涵盖五种miRNA，包括302a、302b、302c、302d和367；可以使用它们中的任何一种或多种。在优选的实施方案中，该方法包括在细胞中表达例如来自单个附件体载体的miR-302s和miR-200c。在一些实施方案中，该方法包含将包含编码miR-302s和miR-200c的序列的附件体载体引入到细胞中。
下表提供了miRNA的实例性序列。以粗体显示的序列表示成熟miRNA。
Figure BDA0003482534650000202
Figure BDA0003482534650000211
所使用的序列可以与本文提供的实例性(参考)序列至少80、85、90、95或100％相同，但应保留实例性(参考)序列的期望活性。两个序列之间“同一性”的计算可以如下进行。出于最佳比较目的，对序列进行比对(例如，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入空位以进行最佳比对，并且出于比较目的可以忽略不同的序列)。出于比较目的进行比对的序列的长度是参考序列的长度的至少60％(例如，至少70％、80％、90％或100％)。然后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则该位置处的分子是相同的。两个序列之间的百分比同一性是被序列共享的相同位置的数目的函数，这考虑到了空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些空位以进行两个序列的最佳比对。
序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。在一些实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用空位罚分为12、空位扩展罚分为4和移码空位罚分为5的Blossum 62打分矩阵来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。
在一些实施方案中，该方法包含在细胞中表达OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC、miR-302s和miR-200c中的全部。在一些实施方案中，该方法包含将以下各项引入到细胞中：慢病毒载体或多顺反子附件体载体，其包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列；以及载体(例如慢病毒载体或附件体载体)，其包含编码miR-302s(例如，如上文所示)和miR-200c的序列(例如，如上文所示的序列或uaauacugccggguaaugaugga(SEQ ID NO:21))。
可以直接转染原代体细胞，或可以先进行培养，然后从培养板中取出，再悬浮，然后再进行转染。将细胞与外源性核酸序列进行组合以例如稳定地整合到它们的基因组中，并且进行处理以便完成转染。如本文所用，术语“转染”包括多种用于将外源性核酸引入到细胞中的技术，这些技术包括磷酸钙或氯化钙沉淀、显微注射、DEAE-糊精介导的转染、脂质转染或电穿孔，所有这些都是本领域已知的)。当载体是病毒载体时，转染可以包括用病毒颗粒转导细胞。
在将这些因子引入到细胞中之后，将细胞保持在足以表达因子和诱导重编程为iPS细胞(例如，表达碱性磷酸酶(AP)以及更严格的多能性标志物(TRA-1-60)的细胞)的条件和一段时间下(Chan等人，2009；Tanabe等人，2013)。多种方法是本领域已知的；参见，例如，Malik和Rao，Methods Mol Biol.2013；997:23-33。在一些实施方案中，该条件包含将细胞保持在培养基中，例如，包含DMEM/F-12、L-谷氨酰胺(例如，2mM)、血清(例如，胎牛血清(FBS)(例如，10％))、非必需氨基酸(NEAA，例如，1x)、烟酰胺(NAM，例如，1mM)、丁酸钠(NaB)(例如，25mM)和抗坏血酸(AA，例如，50μg/ml)的培养基；替代地，可以使用具有敲除血清替代物(KSR，一种已定义的、不含FBS的培养基)、谷氨酰胺和β-巯基乙醇的DMEM培养基。本领域技术人员将理解，可以使用其他浓度。例如，将细胞孵育4-6天，例如，5-6天。
在优选的实施方案中，可以使用生物基质水凝胶支持物将细胞铺板到板上，在具有直径为2-10mm(例如，约5mm)的离散、单独、优选基本上圆形或椭圆形的区域(在本文中也被称为“斑点”)中，该生物基质水凝胶支持物例如是基底膜提取物(如基质胶、PATHCLEAR级基底膜提取物(Amsbio))或其他合成替代品，如在Nguyen等人，Nat Biomed Eng.2017；1.pii:0096中所描述的，例如，约10μl的凝胶。该斑点可以例如通过以下方式来形成：将适当体积的液滴放置在板上(液滴之间间隔1-3cm)，例如，放置在2x2 cm网格的交叉点上，以保持斑点之间的隔离(使得斑点彼此不会接触)(图11C)。例如，可以将约10μl的凝胶放置在网格培养板上的网格的交叉点上，以形成直径为约2-10mm(例如，约5mm)的斑点。在孵育足够的时间(例如10-60分钟，例如25-45分钟，例如约30分钟)之后，从斑点吸出部分凝胶(在其完全干燥之前停止)，从而在斑点中留下一层凝胶。本文还提供了以这种方式制备的板(例如，具有如本文所描述的凝斑点)。在制备板之后，然后将细胞例如以每斑点约5,000-20,000(例如，约10,000)个细胞的密度铺板，例如，约10μl的细胞悬浮液，其密度为10,000个细胞/μl。
在重编程为iPSC后，可以将细胞保持在例如包含DMEM/F-12、L-谷氨酰胺(例如，2mM)、KSR(例如，20％)、NEAA、NAM、NaB和bFGF的hiPSC培养基中，直到形成ES样集落，例如，其可以任选地通过以下各项来鉴定：(1)用针对三种胚层标志物(OTX2，一种外胚层标志物；SOX17，一种内胚层标志物；以及BRACHYURY，一种中胚层标志物)的抗体进行染色；以及(2)谱系特异性标志物(例如，外胚层的PAX6和MAP2；内胚层的FOXA2、SOX17和CK8；以及中胚层的MSX1、MYL2A和COL6A2)的基因表达。在一些实施方案中，将iPSC细胞保持在ESSENTIAL 8培养基或其等效物中，即包含以下各项或基本上其组成：DMEM F-12、L-抗坏血酸、硒、转铁蛋白、NaHCO3、胰岛素、FGF2和TGFβ1。参见，例如，Chen等人，Nat Methods 8(5):424–429。
一旦生成iPS细胞，则可以将它们作为iPS细胞系来保持。在一些实施方案中，对于每名患者，生成多种iPSC系并对其进行表征，然后选择最佳系(例如，最佳的1、2、3种或更多种系)。
本文还提供了通过本文描述的方法产生的细胞(例如，iPS细胞系)和包含该细胞的组合物。
病毒载体
用于本方法和组合物的病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关联病毒和慢病毒。
在本方法中用于将核酸递送到内耳的优选病毒载体系统是腺相关联病毒(AAV)。AAV是一种极小的无包膜病毒，其具有25nm衣壳。没有已知或已被示出与该野生型病毒相关联的疾病。AAV具有单链DNA(ssDNA)基因组。AAV已被示出表现出长期的附件体转基因表达，并且AAV在大脑中展示出极好的转基因表达，特别是在神经元中。可以包装并可以整合含有仅仅300个AAV碱基对的载体。外源性DNA的空间限于约4.7kb。如描述在Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)中的AAV载体的AAA载体可以用于将DNA引入到细胞中。已使用AAV载体将多种核酸引入到不同的细胞类型中(参见例如Hermonat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470(1984)；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1985)；Wondisford等人，Mol.Endocrinol.2:32-39(1988)；Tratschin等人，J.Virol.51:611-619(1984)；以及Flotte等人，J.Biol.Chem.268:3781-3790(1993)。存在许多种替代性AAV变体(已克隆了100多种)，并且已基于期望的特征对AAV变体进行了鉴定。例如，AAV9已被示出可以有效地穿过血脑屏障。此外，AAV衣壳可以经基因经工程化改造以提高转导效率和选择性，例如，生物素化AAV载体、定向分子进化、自补AAV基因组等。在一些实施方案中，使用AAV1。
替代地，逆转录病毒载体和腺相关联病毒载体可以用作重组基因递送系统，其用于外源性基因体内转移，特别是转移到人体内。这些载体可以有效地将基因递送到细胞中，并且所转移的核酸稳定地整合到宿主的染色体DNA中。仅产生复制缺陷型逆转录病毒的特殊化细胞系(被称为“包装细胞”)的发展增加了逆转录病毒用于基因疗法的实用性，并且缺陷型逆转录病毒的特征是用于出于基因疗法目的的基因转移(综述参见Miller,Blood 76:271(1990))。复制缺陷型逆转录病毒可以被包装成病毒粒子，其可以用于通过标准技术，通过使用辅助病毒来感染靶细胞。用于产生重组逆转录病毒和用于用此类病毒在体外或体内感染细胞的方案可以见于Ausubel等人，eds.,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates,(1989)，第9.10-9.14节以及其他标准实验室手册。合适逆转录病毒的例子包括本领域普通技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。用于制备嗜亲性和双嗜性逆转录病毒系统二者的合适包装病毒系的实例包括ΨCrip、ΨCre、Ψ2和ΨAm。逆转录病毒已用于在体外和/或体内将多种基因导入到多种不同的细胞类型(包括上皮细胞)中(参见例如Eglitis等人，(1985)Science 230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；Wilson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145；Huber等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043；Ferry等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381；Chowdhury等人，(1991)Science 254:1802-1805；van Beusechem等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7640-7644；Kay等人，(1992)Human Gene Therapy 3:641-647；Dai等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895；Hwu等人，(1993)J.Immunol.150:4104-4115；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；以及PCT申请WO 92/07573)。
可用于本方法的另一病毒基因递送系统使用腺病毒衍生的载体。可以操纵腺病毒的基因组，使得其编码和表达感兴趣的基因产物，但该基因产物就其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力而言是失活的。参见，例如，Berkner等人，BioTechniques 6:616(1988)；Rosenfeld等人，Science 252:431-434(1991)；以及Rosenfeld等人，Cell 68:143-155(1992)。衍生自腺病毒品系Ad 5型dl324或其他腺病毒品系(例如，Ad2、Ad3或Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域普通技术人员已知的。重组腺病毒在某些情况下可能是有利的，因为它们不能感染非分裂细胞并且可以用于感染多种细胞类型，其包括上皮细胞(Rosenfeld等人，(1992)同上)。此外，病毒颗粒相对稳定并且适合于纯化和浓缩，并且如上文，可以经修饰以影响感染性谱。另外，引入的腺病毒DNA(和其中所含的外源DNA)没有整合到宿主细胞的基因组中，但任然是附件体的，从而避免了由于原位插入诱变可能发生的潜在问题，其中引入的DNA整合到宿主基因组中(例如，逆转录病毒DNA)。此外，相对于其他基因递送载体，腺病毒基因组对外源DNA的携带能力较大(高达8kb)(Berkner等人，同上；Haj-Ahmand和Graham，J.Virol.57:267(1986)。
分化为mDAP/mDAN
在一些实施方案中，该方法用于如下产生mDAP或mDAN。对于底板诱导，在转染之后，将细胞保持在具有15％KSR、谷氨酰胺、β-巯基乙醇的DMEM培养基中约6天(D1-D6(第6天))。对于第6至第12天(D6-D12)，即神经前体诱导阶段，将细胞保持在具有11.5％KSR、0.25％N2(D6-8)；7.5％KSR、0.5％N2(D8-10)；3.75％KSR,0.75％N2(D10-12)的DMEM培养基中，该培养基包括L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(NEAA)。可以例如分别从D1-D12和从D1-D8添加双Smad抑制剂，即0.2μM LDN193189和10μM SB431542。可以例如从D2-D10添加一种或多种SHH激动剂(例如，2μM Purmorphamine和100ng/ml Shh)和100ng/ml FGF8。可以例如从D4-D12包括Wnt信号传导活化剂，例如，CHIR99021(1μM)。在D9，可以用槲皮素(例如，40μM)处理细胞例如6-24或12-18小时，例如，16小时。
对于DA祖细胞诱导和成熟阶段(D12+)，可以在约D12-15将细胞保持在补充有N2、BDNF(例如，20ng/ml)、GDNF(例如，20ng/ml)、dbcAMP(例如，500μM)、抗坏血酸(例如，200μM)、TGF-β3(例如，10ng/ml)以及γ分泌酶抑制剂(例如，DAPT，例如，10μM)和Wnt激动剂(例如，CHIR99021，例如，1μM)的DMEM:F12培养基中。
在约D15，可以收获斑点中的细胞，并且例如使用EDTA对其进行例如化学、酶促或机械解离，并且单细胞悬浮液重新铺板例如在聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白包被的(PLO/FN/L包被的)培养皿中。从D15，可以使用例如具有生长因子的DMEM:F12等培养基，该生长因子包括N2、BDNF(例如，20ng/ml)、GDNF(例如，20ng/ml)、dbcAMP(例如，500μM)、抗坏血酸(例如，200μM)和TGF-β3(例如，10ng/ml)。可以在解离当天添加ROCK抑制剂，例如，Y-27632(例如，10μM)，然后去除。然后，可以将细胞保持在培养物中，直到诱导mDA祖细胞(mDAP)和/或mDA神经元(mDAN)足以表达mDAP标志物(例如OTX2、LMX1A和EN1)和/或表达mDAN标志物(例如，TH、DAT和PITX3)，例如，保持至少21-28天。
本领域技术人员将理解，可以使用其他试剂和浓度。例如，SHH激动剂包括Purmorphamine、氧化固醇和平滑激动剂(Smoothened Agonist，SAG)；多种Wnt激动剂提供在表A中。
表A.Wnt激动剂
Figure BDA0003482534650000271
Figure BDA0003482534650000281
其他γ分泌酶抑制剂包括选自下组的那些抑制剂，该组由以下各项组成：RO4929097；DAPT(N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙酯)；L-685458((5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羟基-(2R)苄基己酰基)-L-leu-L-phe-酰胺)；BMS-708163(Avagacestat)；BMS-299897(2-[(1R)-1-[[(4-氯苯基)磺酰基](2,5-二氟苯基)氨基]乙基-5-氟苯丁酸)；MK-0752；YO-01027；MDL28170(Sigma)；LY411575(N-2((2S)-2-(3,5-二氟苯基)-2-羟基乙酰基)-N1-((7S)-5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b，d]吖庚因-7-基)-l-氨基丙酰胺，参见US 6,541,466)；ELN-46719(LY411575的2-羟基-戊酸酰胺类似物(其中LY411575是3,5-二氟-扁桃酸酰胺)(美国专利号6,541,466))；PF-03084014((S)-2-((S)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘乙酰胺-3-基氨基)-N-(1-(2-甲基-1-(新戊氨基)丙烷-2-基)-1H-咪唑-4-基)戊酰胺，Samon等人，Mol Cancer Ther 2012；11:1565-1575)；化合物E((2S)-2-{(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基}-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂卓-3-基]丙酰胺；参见WO 98/28268和Samon等人，Mol Cancer Ther 2012；11:1565-1575)；以及Semagacestat(LY450139；(2S)-2-羟基-3-甲基-N-((1S)-1-甲基-2-{[(1S)-3-甲基-2-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂-1-基]氨基}-2-氧代乙基)丁酰胺)或其药物上可接受的盐。
本文还提供了通过本文描述的方法产生的细胞(例如，mDAP或mDAP细胞)和包含该细胞的组合物。
尽管本方法举例说明了iPSC分化为多巴胺能神经元，但点样方法可以用于其他细胞类型(包括其他神经元类型)的分化方案。多种神经元分化方案是本领域已知的；参见，例如，Salimi等人，Mol Biol Rep.2014Mar；41(3):1713-21；Gunhnlar等人，MolecularPsychiatry 23:1336–1344(2018)；Trilck等人，Methods Mol Biol.2016；1353:233-59；Zhang等人，Stem Cell Res Ther.2018Mar 15；9(1):67；D’Aiuto等人，Organogenesis.2014；10(4):365-77；Marton和Ioannidis，Stem Cells TranslationalMedicine 2019；8:366–374；Bell等人，Bio-protocol 9(5):e3188(2019).DOI:10.21769/BioProtoc.3188；Bianchi等人，Stem Cell Research 32:126-134(2018)。
治疗方法
使用本文描述的方法产生的mDAP和mDAN可以用作例如细胞模型，并且用于治疗患有帕金森氏病(PD)(或处于发展其的风险中)的受试者。此类受试者可以由熟练的卫生保健提供者使用本领域已知的方法来鉴定。该方法可以包括：获得原代体细胞；生成包含mDAP的细胞群体并施用这些细胞。优选地，原代体细胞从患有PD(或处于发展其的风险中)的待治疗受试者获得，但在一些实施方案中，该细胞从不同的受试者获得，优选与待治疗的受试者相同的物种(即自体细胞)，优选免疫匹配的受试者。优选地，mDAP通过如本文所描述的方法来生成，该方法足以生成包含表达一种、两种或多种mDAP标志物(例如，FOXA2、OTX2、LMX1A和EN1，例如FOXA2和LMX1A)的细胞；任选共表达FOXA2、LMX1A和NURR1的TH+细胞的群体，并且该群体任选地包含表达一种、两种或更多种mDAN标志物(例如，TH、DAT和PITX3)的细胞，但不包含表达SOX1、PAX6和KI67的细胞。
可以使用本领域已知的方法来施用细胞。在一些实施方案中，例如使用磁共振成像引导的立体定向手术，通过植入将细胞直接施用到受试者大脑的受影响区域或其附近，例如从双侧施用到尾状核、壳核和黑质中的一个或多个。参见，例如，Garitaonandia等人，Stem Cells Dev.2018 Jul 15；27(14):951-957；Kikuchi等人，Nature 548:592–596(31August 2017)；MOrizane等人，Nature Communications 8:385(2017)；Sonntag等人，Prog Neurobiol.2018Sep；168:1-20。
培养皿
本文还提供了用于本文描述的方法的培养皿。该皿在底部具有线间距为1.5-2.5cm(例如，约2cm)的网格，例如2x2 cm网格。网格可以例如形成为该皿的一部分，打印或蚀刻在底部上。培养皿可以例如使用本领域已知的方法和用于培养皿的任何可接受的材料|(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚乙烯热塑性树脂)，例如使用常规的注塑成型或热成型方法来制造。另一合适的材料是玻璃。在一些实施方案中，该皿具有基本上平坦的底部；替代地，在网格线的交叉点处可以有直径为例如约2-10mm(例如约3-7mm，例如约5mm)的圆形或卵形凹陷或坳陷。坳陷的深度可以为例如0.01-0.2mm。在一些实施方案中，该皿具有生物基质水凝胶支持物，即，基底膜提取物或合成基质。
在一些实施方案中，具有网格的培养皿是分别具有12或6个交叉点的10或6cm圆形培养皿，用于铺板细胞。细胞放置区域之间的距离(斑点中心至相邻斑点中心)为2cm，并且细胞斑点的直径为0.5cm。周长为约1.57cm，并且面积为约0.2cm2。因此，在交叉的网格线处，对于6cm培养皿，可能仅有6个斑点，并且对于10cm培养皿，可能仅有12个斑点。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
材料和方法
在以下实施方案中使用以下材料和方法。
所使用的抗体和试剂示出在表B中。
表B.试剂信息
Figure BDA0003482534650000301
Figure BDA0003482534650000311
Figure BDA0003482534650000321
Figure BDA0003482534650000331
Figure BDA0003482534650000341
生检
根据IRB批准的方案(Partners IRB#2010P001100)对三名健康受试者和一名散发性PD患者(表C)进行皮肤生检。
表C.基于附件体质粒的hiPSC生成的汇总
Figure BDA0003482534650000342
Figure BDA0003482534650000351
实验动物
每组中的品系细节和动物数目如下：
6-OHDA损伤无胸腺大鼠(NTac:NIH-Foxn1rnu,Taconic Biosciences)，雄性，12-14周龄。Athymic大鼠(Crl:NIH-Foxn1rnu,Charles River，品系代码#316),雄性，12-14周龄。NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl,Charles River，品系代码#394)，雄性或雌性，8-10周龄。所有动物都放在通风的笼子中，在12小时光照/黑暗循环下，随意获取无菌食物和水。
细胞培养
人BJ真皮成纤维细胞(hDF)和HEK293T细胞购自ATCC，并且根据先前公布的方案(19)生长。对于hiPSC诱导，转染后将受感染细胞保持在含有DMEM/F-12、2mM L-谷氨酰胺、10％FBS、1xNEAA、1mM NAM、25mM NaB和50μg/ml AA的诱导培养基中5天，然后接着保持在含有DMEM/F-12、2mM L-谷氨酰胺、20％KSR、1xNEAA、1mM NAM、25mM NaB和10ng/ml bFGF的hiPSC培养基中。H9 hESC从WiCell研究所获得。使用基质胶基质将所有hiPSC细胞系都保持在Essential 8培养基中，并且使用0.5mM EDTA溶液进行传代以进行温和解离。使用基质胶基质将所有hESC系都保持在mTeSRTM 1培养基中。在由ICLAC和NCBI Biosample维护的常见错误鉴定细胞系的数据库中未发现用于本研究的细胞系。所有细胞系都由提供公司通过种间测定(同工酶分析和STR分析)进行验证，并且定期进行测试以进行支原体检测。
人iPSC生成
对于基于慢病毒的hiPSC生成，用来自单独慢病毒载体或含有Y4因子(OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC；由Gustavo Mostoslavsk博士慷慨提供)和/或miRNA的多顺反子STEMCCA载体的慢病毒颗粒转导细胞过夜。第二天，用诱导培养基更换培养基，并且孵育细胞5天。在第6天，用hiPSC培养基饲养细胞，并且将其保持在该培养基中直到形成ES样集落。手工挑选观察到的ESC样集落，并且将其转移到Essential 8培养基中的基质胶包被的组织培养板上，以生成hiPSC系。
对于基于附件体系统的hiPSC生成，使用Neon转染系统用表达重编程因子的pCXLE载体对细胞进行电穿孔，然后将其铺板到补充有10μM Y-27632的hDF培养基中的基质胶包被的6孔板上。第二天，再用诱导培养基饲养细胞5天。
质粒构建和慢病毒产生
从H9人胚胎干细胞中PCR扩增miR-17/92、-106a、-106b、-200c、-302s、-369s和-371/373的个别miRNA的编码序列，将其克隆到pGEM-T Easy载体中，并且通过测序证实其身份。随后，将它们引入到FUW-tetO载体的EcoRI位点中。对于表达OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的多顺反子附件体载体，从H9 hESC中PCR扩增与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列，然后将其按顺序引入到经修饰的不含EGFP序列的pCXLE附件体载体中。对于表达miR-302s和/或miR-200c的附件体载体，将人miR-302s或-200c编码序列引入到经修饰的pCXLE载体中。
如先前所描述，稍作修改(Cha等人，2017.Nat Cell Biol 19:445-456)的那样进行慢病毒产生。简而言之，使用PolyJet转染试剂根据制造商说明书将慢病毒载体与包括pMD2.G和psPAX2的包装质粒共转染到293T细胞中，并且保持在补充有10％FBS的DMEM中。转染后48小时收集含有慢病毒的上清液，并且通过0.45μm Millex-HV(Millipore)过滤器过滤以去除细胞碎片。
hiPSC形成测定
对于TRA-1-60染色，细胞用4％甲醛固定5分钟，用PBS洗涤，然后与抗TRA-1-60抗体(1:500)在4℃下一起孵育过夜。用PBS洗涤三次后，将细胞与辣根过氧化物酶(HRP)缀合山羊抗小鼠IgG(1:500)一起孵育1小时。用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤三次后，用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)按照制造商说明书对细胞进行染色。对于AP染色，用PBS洗涤固定细胞，然后用碱性磷酸酶底物NBT/BCIP的溶液染色，随后用PBS洗涤三次以停止反应。
活细胞代谢分析
使用XFp分析仪(Agilent Technologies)根据制造商说明书测量耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。简而言之，将细胞铺板到XF微型板的孔中，并且在37℃下在CO2孵育器中孵育过夜。在非CO2孵育器中将细胞在补充有10mM葡萄糖、5mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的XF测定培养基中平衡1小时后进行测定。通过依次注射1μM寡霉素(Oligo)、2μM FCCP和0.5μM抗霉素A/鱼藤酮(Anti/Rot)来监测hDF的线粒体活性，以计算基础呼吸(＝基线OCR-Anti/Rot OCR)、ATP周转率(＝基础呼吸-Oligo OCR)、最大呼吸(＝FCCP OCR-Anti/Rot OCR)和氧化储备(＝最大呼吸-基础呼吸)。将每个绘制值相对于使用Bradford蛋白质测定定量的总蛋白质标准化。
定量RT-PCR
为了提取总RNA，用Trizol裂解细胞，并且根据制造商建议书分离RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)测量RNA浓度。使用SuperscriptII，用寡聚dT引物逆转录RNA。对于实时定量RT-PCR，本发明人使用SsoAdvanced UniversalSYBR Green Supermix，并且在CFX Connect实时系统(Bio-Rad)上进行反应。使用基因特异性引物生成PCR扩增(表D)。靶基因表达通过比较Ct方法通过相对于内源性肌动蛋白标准化来确定。
表D.用于本研究的引物序列的列表
Figure BDA0003482534650000371
Figure BDA0003482534650000381
Figure BDA0003482534650000391
Figure BDA0003482534650000401
核型分析
为了评估人iPS细胞染色体的数目和结构，将人iPS细胞送到Cell LineGenetics,Inc(Madison,WI)以进行标准G显带核型分析。
附件体质粒检测
用Thermo Scientific GeneJET质粒小量制备试剂盒分离胞质质粒，以检测残留非整合载体的存在。20μl提取物中的每2μl用于95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒的常规PCR扩增，使用EBNA-1特异性引物进行30个循环。用Qiagen的DNeasy血液和组织试剂盒制备基因组DNA。对于质粒衍生序列的检测，本发明人使用相同的PCR条件和EBNA-1引物。GAPDH引物用作输入对照。EBNA-1和GAPDH引物呈现在表D中。
DNA指纹分析
使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒从细胞中提取基因组DNA，并且使用标准缓冲条件进行PCR，采用0.2μg的DNA和GoTaq DNA聚合酶进行35个循环，其中在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并且在72℃下延伸1分钟，总体积为20μl。用于本研究的引物列于表D。
全外显子组测序
为了鉴定因成纤维细胞重编程以及经重编程的iPSC的传代而导致的体细胞突变，本发明人使用Personalis ACE WES服务对成纤维细胞和四种iPSC系进行WES，该服务提供扩充的>8,000个医学有关基因(包括>1,400个癌症相关基因)的覆盖范围(Patwardhan等人，2015.Genome Med 7:71)。在所有样品中，靶标区域覆盖范围的平均深度超过75x。对于四种iPSC系，本发明人对成纤维细胞和每种iPSC系进行配对分析，以使用MuTect2检测体细胞突变(Cibulskis等人，2013.Nat Biotechnol 31:213-219)。
使用BWA-MEM程序(版本0.7.15)，将测序读取与包括替代重叠群和诱饵的GRCh38参考基因组进行比对(Li和Durbin，2010.Bioinformatics 26:589-595)。进一步用SAM工具(版本1.3.1)(Li等人，2009.Bioinformatics 25:2078-2079)、Picard工具(broadinstitute.github.io/picard，版本2.5.0)和基因组分析工具包(GATK)软件(版本3.6)(DePristo等人，2011.Nat Genet 43:491-498)处理映射读取(mapping reads)，以生成分析就绪的BAM文件。使用GATK中的MuTect2模块分析每种iPSC系与成纤维细胞相比的体细胞突变(Cibulskis等人，同上)。使用Ensembl变异效应预测器(版本GRCh38.89)注释经鉴定的体细胞突变(McLaren等人，2016.Genome Biol 17:122)，以研究它们对基因转录和蛋白产物的影响。为了减少假阳性体细胞突变调用(calls)，本发明人仅考虑在所有样品中具有20个或更多个有效的高质量比对读取的覆盖良好的区域中发现的那些。在候选者中，本发明人排除了外显子组聚合联盟(Exome Aggregation Consortium，ExAC)数据库中最大次要等位基因频率>0.01％的突变(Lek等人，2016.Nature 536:285-291)，以过滤掉潜在的种系变体。对于剩余的体细胞突变候选者，本发明人查询了癌症体细胞突变目录(CatalogueOf Somatic Mutations In Cancer，COSMIC)(cancer.sanger.ac.uk，版本80)(Forbes等人，2017.Nucleic Acids Res 45:D777-D783)和癌症基因普查(Cancer Gene Census，CGC)数据库(Futreal等人，2004.Nat Rev Cancer 4:177-183)，以鉴定癌症中经常报告的突变和基因。本发明人使用ngCGH(github.com/seandavi/ngCGH，版本0.4.4)和来自PersonalisACE癌症外显子组传递管线(Personalis,Inc.,CA)的拷贝数目变异(CNV)分析结果调查了染色体畸变和其他区域的拷贝数目变化。本发明人在整合基因组观察器(版本2.3.79)中目视检查了所有CNV候选者的读取比对。
槲皮素处理
为了测试槲皮素对人iPSC去除的影响，将人iPSC铺板在6孔板上。用每种浓度的槲皮素(5、10、20、40和100μM)处理细胞2、6、16和24小时。在每个时间点之后，用新鲜培养基更换含有槲皮素的培养基，并且从最初的槲皮素处理时间开始培养细胞48小时。使用TrypLE解离细胞，并且使用台盼蓝排除法和血细胞计数器测量细胞存活力。
流式细胞术
使用BD Accuri C6系统(BD Bioscience)进行所有FACS分析，并且根据制造商说明书进行数据分析。分别使用TrypLE或细胞消化液解离人iPS细胞，并且通过70μm细胞过滤网过滤。单细胞悬浮液首先用4％甲醛固定10分钟，并且在冰上在透化缓冲液中悬浮15分钟。阻断30分钟后，将细胞与标记一抗(PE缀合抗SSEA-4、TRA-1-60)一起在冰上避光孵育1小时。用具有1％FBS的PBS洗涤后，进行FACS分析。在分析期间使用荧光染料匹配的同种型对照并扣除。
对于细胞丢失/细胞收获分析，收获来自基于单层或点样的培养皿的上清液并运行FACS。计算100μl上清液中的颗粒数目，并且基于100μl与总上清液体积的比率获得总细胞数目。
检测未分化细胞的存在
在总共100,000个细胞中将未分化C4细胞的混合物在hDF中按10的连续倍数(105、104、103、102、101和100)依次稀释，以使用3种不同的方法检测残留的C4细胞。对于集落形成测定，将每种细胞稀释液在E8培养基中培养6天，并且通过AP染色来鉴定多能集落。对于未分化细胞的槲皮素去除，用40μM槲皮素处理细胞16小时，并且在新鲜的E8培养基中进行培养。对于荧光活化细胞分选(FACS)，使用TrypLE解离C4细胞，并且通过70μm细胞过滤网过滤。单细胞悬浮液首先用4％甲醛固定10分钟，并且在冰上在透化缓冲液中悬浮15分钟。阻断30分钟后，将细胞与标记一抗(PE缀合抗SSEA-4、TRA-1-60)一起在冰上避光孵育1小时。用具有1％FBS的PBS洗涤后，使用BD Accuri C6系统(BD Bioscience)进行所有FACS分析，并且根据制造商说明书进行数据分析。在分析期间使用荧光染料匹配的同种型对照并扣除。对于qRT-PCR测定，从所有稀释液中提取总RNA，并且使其经受qRT-PCR以确定OCT4循环时间(Ct)值。根据从纯化的OCT4部分序列的qRT-PCR生成的方程曲线计算OCT4拷贝数目。然后，针对PSC数目绘制OCT4拷贝数目。
带斑点的培养皿的制备
如图13B所示，将由2条水平线和3条垂直线组成的网格绘制在6-cm皿的底部，产生6个连接点(junctions)。在每个连接点处加载10μl冷基质胶以形成有限的斑点包被区域。将带斑点的皿在37℃下孵育至少30分钟，并且在细胞铺板之前吸出基质胶。将均匀悬浮的细胞以730K/皿的密度铺板在60mm细胞培养皿中(常规铺板条件)，而带斑点的皿接受40K/10μl斑点、10K/10μl斑点、2.5K/10μl斑点(点样条件)中的任何一种。
mDA祖细胞分化
分化培养基条件和所有形态发生因子示出在图5A中。在整个分化过程中，没有使用抗生素。对于底板诱导阶段(D1-6)，本发明人使用具有15％KSR、谷氨酰胺、β-巯基乙醇的DMEM培养基。对于神经前体诱导阶段(D6-12)，本发明人使用具有11.5％KSR、0.25％N2(D6-8)；7.5％KSR、0.5％N2(D8-10)；3.75％KSR,0.75％N2(D10-12)的DMEM培养基，该培养基包括L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和非必需氨基酸(NEAA)。分别从D1-D12和从D1-D8添加双Smad抑制剂，即0.2μM LDN193189和10μM SB431542。从D2至D10，用具有100ng/ml FGF8的SHH激动剂(2μM Purmorphamine和100ng/ml Shh)处理细胞。从D4至D12包括Wnt信号传导活化剂CHIR99021(1μM)。在D9，用40μM槲皮素处理细胞16小时。对于DA祖细胞诱导和成熟阶段(D12+)，DMEM:F12培养基补充有N2补充物、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、500μM dbcAMP、200μM抗坏血酸、10ng/ml TGF-3以及10μM DAPT和1μM CHIR(D12-15)。在D15，通过0.5mM EDTA解离细胞，并且将单细胞悬浮液以约250万/皿重新铺板在聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白包被的皿中。从D15以后，使用具有N2补充物、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、500μMdbcAMP、200μM抗坏血酸、10ng/ml TGF-3的DMEM:F12培养基。在收获时，将10μM Y-27632添加到该培养基中。
免疫细胞化学
hiPSC衍生的多巴胺能神经元用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(具有Ca2+和Mg2+)洗涤，并且用含4％甲醛的PBS(pH 7.4)溶液固定10分钟。在室温下，将细胞在封闭溶液(含0.3％Triton X-100和1％马血清的PBS溶液)中孵育1小时。将细胞与一抗一起在含有0.3％Triton X-100和1％马血清的PBS中孵育过夜。然后将细胞与具有Hoechst 33342的适当荧光缀合二抗一起孵育，以在室温下进行细胞核染色1小时。通过共聚焦显微镜(KEYENCE，Osaka，日本)获得细胞图像。使用ImageJ软件从显微图像确定关于特异性细胞群体的数据(11)。为了测量凋亡细胞，针对切割的半胱天冬酶3(一种凋亡标志物)和Hoechst 33342(一种DNA结合核染料)，对细胞进行染色。用Hoechst 33342进行染色后，致密的染色质比在正常细胞中更亮，并且通过荧光显微术对浓缩的细胞核进行计数。通过ImageJ软件从显微图像确定关于特异性细胞群体的数据。
高效液相色谱(HPLC)分析
在分化的第47天，收集上清液，并且以300x g离心5分钟以去除细胞碎片。立即将样品储存在-80℃下并运送到Emory University的HPLC Bioanalytical Core以进行反相HPLC和电化学检测，以确定DA和DOPAC的水平。简而言之，将上清液转移到新鲜的0.22μMPVDF微型离心机过滤管中。在4℃下，通过旋转过滤器以5000rpm过滤5分钟来消除任何残留的颗粒物质。通过反相HPLC和电化学检测来确定单胺浓度。对于HPLC，使用配备有ESA 584型泵和ESA 542冷冻自动进样器的ESA 5600A CoulArray检测系统。在25℃下，使用配备有C18色谱柱保卫筒柱的MD-150×3.2mm C18色谱柱进行分离。流动相由pH 2.95的1.5mM 1-辛烷磺酸钠、75mM NaH2PO4、0.025％三乙胺和8％乙腈组成。注射25μl的样品体积。样品以0.4mL/分钟进行等度洗脱，并且使用配备有5020保卫室的6210电化学室(ESA，Bedford，MA)进行检测。将保卫室电位设置为500mV，而分析细胞室为-175、200、350和425mV。通过保留时间与已知标准(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)的匹配准则来鉴定分析物。通过将峰面积与处于支配地位的传感器上的标准物的峰面积进行比较，对化合物进行定量。
电生理学
对于电生理记录，将第70天多巴胺能细胞放置在记录室中，并且以1.2ml/分钟的速率连续灌注由130mM NaCl、2.5mM KCl、2.5mM CaCl2、1mM MgSO4、1.25mM Na2HPO4、26mMNaHCO3、10mM葡萄糖组成的人工脑脊液，其用95％O2和5％CO2连续鼓泡。在室温(22±1.0℃)下，使用EPC9放大器和Pulse v8.80软件(HEKA Elektronik)进行全细胞膜片钳记录。记录电极(5-6MΩ电阻)填充有移液管溶液，其含有150mM K-葡萄糖酸盐、5mM NaCl、1mM MgCl2、0.2mM EGTA、10mM HEPES、2mM Mg-ATP、0.5mM Na-GTP(292mOsm，用KOH调节至pH 7.3)。使用基于K-葡萄糖酸盐的移液管溶液对15.1mV的液接电位(liquid junction potential)进行校正。在电流钳位模式下，在静息膜电位下记录动作电位放电。串联(接入)电阻没有得到补偿，但被连续监测。使用Mini Analysis v6.0.7(Synaptosoft)和Clampfit 8.2(MolecularDevices)程序离线分析自发突触事件。用1μM河豚毒素(TTX)阻断电压门控钠通道。将神经生物素(0.2％)包括在移液管内溶液中，并且在4℃下将所记录的细胞固定在4％甲醛中并与TH抗体共染色。
多电极阵列(MEA)记录
用聚L-鸟氨酸(0.0015％)、纤连接蛋白(1μg/ml)和层粘连蛋白(1μg/ml)预包被来自Axion Biosystems的24孔微电极阵列(MEA)板一晚，各板放置在37℃的CO2孵育器中。第二天，将C4衍生的D28细胞以20,000/孔铺板在预包被的MEA板上，并且根据与上述相同的时间表来生成。将D28细胞保持在37℃和5％CO2的加湿孵育器中2天，以允许在启动电生理记录之前进行适当的附着。每隔一天进行60％培养基更换。在用化合物处理之前和之后，使用Maestro MEA系统和AxIS软件(Axion Biosystems)在37℃的培养基中进行自发动作电位的细胞外记录。这种MEA平台配置有324个通道，并且当使用24孔板时，该平台被格式化为在4×4网格中每孔具有16个电极。将大约20,000个细胞铺板在遍布于电极网格上的每个孔中。使用AxIS Navigator 1.5.1软件将基线和后处理原始数据文件(*.原始)转换为尖峰文件(spike file)(*.spk)和excel文件(*.csv)。转换为这些文件格式允许进一步对数据进行处理和分析。对于mDA神经元，将AxIS软件内的神经峰测量设置为高通＝200Hz和低通＝3,000Hz。将尖峰检测的阈值设置为每个电极上过滤场电位滚动标准偏差的6倍。五分钟记录用于计算尖峰平均率和每个孔中活性电极(“活性电极”)的数目。活性电极被定义为具有尖峰率≥5spks/分钟的电极。
Axion BioSystems的神经度量工具用于检查尖锋列光栅图，以验证活动的稳健性以及良好活动的质量和一致性。这些光栅图可视化也用于协助解释后处理数据。没有尖峰活动、稀疏尖峰活动或者很少或没有爆发或网络同步的孔被排除在实验之外。在记录开始之前，将板在系统上平衡至少2分钟。为了分离多巴胺能神经元自发活动，用印防己毒素(一种GABA能拮抗剂)、NBQX(一种AMPA受体拮抗剂)和AP5 NMDAR拮抗剂的组合处理细胞，这些拮抗剂在每孔500μl培养基中的浓度均为10μM。添加阻断剂后，计算平均尖峰数目和平均电极数目二者。如上文所提及进行记录和分析。t检验用于比较对照组和处理组之间的平均尖峰数目和平均活性电极数目。
用于移植和冷冻保存的细胞制备
用DPBS冲洗C4衍生的D28细胞两次，然后在37℃下用细胞消化液处理5分钟。使用具有N2补充物、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、500μM dbcAMP、200μM抗坏血酸、10ng/mlTGF-β3和10μM Y-27632的DMEM:F12培养基收获细胞。以300x g离心3分钟后，用移植培养基(DMEM/F-12(不含酚红)、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、10μM Y-27632、20mM Boc-D-FMK)悬浮细胞颗粒。将细胞悬液传递通过70μm过滤网以去除大结块。使用血细胞计数器，通过台盼蓝排除法计算细胞浓度。最终的细胞产物由移植培养基中的50,000或100,000个细胞/μl组成。对于冷冻保存，将细胞团块悬浮在
Figure BDA0003482534650000461
CS10冷冻保存培养基中。将冷冻管中的细胞放置在Mr.FrostyTM冷冻容器(Nalgene)中，以在-80℃下进行受控冷冻。然后将冷冻细胞转移到液氮中。一周后，将冷冻细胞解冻以用于移植。
手术程序
使用SomnoSuite麻醉系统(Kent Scientific Corporation,Torrington,CT)，用异氟醚麻醉动物。在配备有Micro4控制器(World Precision Instruments，Sarasota，FL)的立体定向框架(David KOPF Instruments，Tujunga，CA)上进行立体定向手术。
对于Charles River无胸腺大鼠，通过将6-OHDA立体定向注射到内侧前脑束中来建立黑质纹状体通路的单侧病变。麻醉前15分钟，将地昔帕明(10mg/kg)注射到大鼠体内以保护去甲肾上腺素能突出物。使用2.5μl Hamilton注射器(Hamilton Company,Reno,NV)注射两微升6-OHDA(0.2％抗坏血酸和0.9％盐水中的浓度7.5mg/ml)。参考前囟计算坐标：前后(AP)，-4.0；中间外侧(ML)，-1.3；以及背腹(DV)，-7.0(Torres等人，2011.J NeurosciMethods 200:29-35)。对于H9或C4衍生的D28细胞的纹状体内移植，将一个2μl(50,000个细胞/μl)的沉积物放置在以下坐标处：AP，+0.8；ML，-3.0；以及DV，-5.5。通过装有26G、0.75英寸钝针的10μl Hamilton注射器以0.4μl/分钟的速度注射细胞。对于Taconic无胸腺大鼠，以100,000个细胞/μl的浓度悬浮C4 D28细胞。对于100,000细胞组，将一微升的细胞注射到AP，+0.8；ML，-3.0；以及DV，-5.5中。对于300,000细胞组，将两个1.5μl的沉积物放置在以下坐标处：AP，+0.8；ML，-3.0；以及DV，-5.0和DV，-6.0。对照大鼠仅接受移植培养基注射。对于NOD SCID小鼠纹状体注射，根据以下相对于前囟的坐标(以mm为单位)，将一个2μl(50,000个细胞/μl)的C4 Do、D14或D28细胞沉积物注射到纹状体中：AP+0.5；ML-/+1.8；DV-3.2双侧。
注射后，将针保持在脑内5分钟，然后在5分钟的时间内将针缓慢地拔出。手术后，用
Figure BDA0003482534650000471
手术缝合线(Fine science tools,Foster City,CA)密封切开的皮肤，并且在温暖的垫子上监测动物直到恢复。所有动物均皮下注射酮洛芬(5mg/kg；Ketofen,SantaCruz,SC-363115Rx)以减少疼痛，并且腹膜内注射1ml 0.9％氯化钠以防止脱水。
对于NOD SCID小鼠睾丸注射，在皮肤和腹膜上制造1cm纵切口，并且将睾丸放置在无菌纱布上。将10μl(5,000/μl)C4 iPSC缓慢地注射到远离任何主要血管的睾丸囊中心。缓慢地将针去除以避免细胞回流。将睾丸和脂肪组织重新放置回腹部的原始位置中。
D-安非他命诱导的旋转测试
腹膜内施用D-安非他命(一种突触前(间接)DA激动剂)(4mg/kg)，以诱导已成功用6-OHDA损伤的大鼠的旋转行为。使用自动化系统(SD Instruments,San Diego,CA)记录旋转偏差。记录大鼠90分钟(9个间隔；10分钟/间隔)。仅对全身转动进行计数，然后表达为每分钟净转动，其中向病变一侧的旋转给出为正值。仅示出了每分钟同侧转动超过6圈的动物才被认为是被成功地损伤(Kirkeby等人，2012..Cell Rep 1:703-714)。
廊道测试
为了测量非药物行为改善，本发明人使用廊道测试(corridor test)(Dowd等人，2005.Brain Res Bull 68:24-30)。首先，为了减少测试期间的探究行为，使大鼠习惯于具有散布糖块的廊道10分钟，持续2天。次日，将大鼠放置在具有10对相邻的杯子的廊道的端部，这些杯子填充有5-10个糖块，沿廊道地板始终保持一定距离。允许动物自由地探究廊道。对于组身份而言盲的调查员直接对检索进行计数。“检索”被定义为每次大鼠将鼻子伸入到独特的杯子中。对所有大鼠进行测试，直到完成20次检索或测试持续时间达到5分钟。测试前，将所有大鼠定位在空的廊道中5分钟，以减少环境新奇性。在测试的前一天和测试的4天期间，对大鼠进行食物限制。结果计算为对侧检索(右)的平均值，并且呈现为总检索的百分比。每4周进行测试，直到移植后24周。
圆柱体测试
为了测量探索行为中的前肢不对称性，使用圆柱体任务对大鼠进行评估(Bjorklund等人，2010.Brain 133:496-511)，其中将大鼠放置在玻璃圆柱体(直径为20cm)中，并且记录最多30次爪子对壁的接触。对于组身份而言盲的调查员进行评价。结果计算为使用右侧爪子(对侧)接触次数的平均值，并且呈现为总接触次数平均值的百分比。移植后24周进行测试。
步进测试
为了测量前肢运动不能，使用侧步进测试(side-stepping test)对大鼠进行评估(Olsson等人，1995.J Neurosci 15:3863-3875)，其中前肢调整步数在90cm的总长度上进行定量。步数由对于组身份而言盲的调查员计数。结果计算为右前肢步数(对侧)的数目的平均值，并且呈现为左前肢步数平均值的百分比。移植后24周进行测试。
生物分布分析
为了验证移植人细胞的存在，本发明人使用特定于人特异性基因的扩增的RT-PCR方法。首先，根据制造商说明书，用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒从每种15mg小鼠组织(嗅球和小脑混合物、脊髓、肺、心脏、肝、肾和脾)中提取DNA。在Nanodrop ND-1000分光光度计上测量所提取的DNA的浓度，并且将100ng DNA用于实时RT-PCR反应。人特异性引物序列如下；正向5’-ATTGCCCCAAAACTTTTTTG-3’(SEQ ID NO:106)和反向5’-TTGAAGACCAGTCTGGGAAG-3’。使用以下引物检测内源性小鼠基因：正向：5’-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3’(SEQ ID NO:107)和反向5’-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3’(SEQ ID NO:108)。
脑切片产生和免疫组织化学
经腹膜内注射氯胺酮(75mg/kg)/甲苯噻嗪(7.5mg/kg)诱导深度麻醉，随后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS；0.01M，pH 7.4)心内灌注8分钟，随后用4％甲醛灌注20分钟，流动速率为10ml/分钟。取出脑并将其在4℃下在4％甲醛中固定后过夜，然后通过依次在20％和30％蔗糖中孵育进行冷冻保存。将脑包埋在OCT中，并且连续收集覆盖整个纹状体的冠状切片(30μm)(Leica CM1950,Buffalo Grove,IL)。将脑片与含有30％H2O2的PBS一起孵育30分钟，然后与兔抗TH抗体(1:5000)、小鼠抗hNCAM抗体(1:1000)和小鼠抗hNuc(1:1000)一起孵育过夜。冲洗后，将样品用生物素化二抗(Vector Labs)染色1小时。最后，用VectastainElite ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒按照制造商的方案对切片进行可视化。为了对移植物中的TH+神经元进行计数，在63X油镜下使用Stereo Investigator(MBFBioscience,Williston,VT)的光学分馏器探头，计数框架为50x50μm，并且网格尺寸为200x200μm。最终计数针对系列号(1:6)进行校正，以估计每动物脑的TH阳性神经元的总数目。
波形蛋白免疫组织化学由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院(Harvard MedicalSchool,Boston,MA)的啮齿动物组织病理学中心(Rodent Histopathology Core)进行。
脑切片免疫荧光
在室温下，将整个中脑的自由浮动冠状切片在含有5％正常驴血清、3％BSA和含0.3％Triton X-100的PBS中的封闭溶液中预孵育1小时。将一抗稀释在含3％BSA和0.3％Triton X-100的PBS中，并且在4℃下过夜。在用含有0.3％Tween 20的PBS洗涤三次之后，将切片与稀释在与一抗相同的缓冲液中的Alexa 488-、Alexa 568-或Alexa 647-缀合二抗一起在室温下孵育1小时。所有切片均用Hoechst 33342进行复染。额外洗涤三次后，将盖玻片应用于具有大量培养基的切片，并且用荧光显微镜(KEYENCE，Osaka，日本)观察。在相同的条件下，对单独用二抗染色的切片进行处理和拍照，并且将其用作阴性对照。
苏木精和伊红染色
对于NOD SCID小鼠睾丸的病理学分析，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉每只小鼠，并且取出睾丸并暂时储存在4％甲醛中。对于NOD SCID小鼠脑组织病理学分析，将每第六个覆盖整个纹状体的冠状切片封固在载玻片上。将睾丸和脑组织的载玻片送到马萨诸塞州波士顿哈佛医学院的啮齿动物组织病理学中心，以进行苏木精和伊红染色。
定量和统计分析
除非另有指示，否则所有实验均以生物学一式三份进行。每个实验的“n”可以见于图例，并且表示所有实验独立生成的样品。使用GraphPad Prism v7软件进行统计分析。p<0.05的值被认为是统计上显著的。在所有附图中，星号指示p值的重要性：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。对于每种iPSC系内的细胞分数中存在的突变的测试，p值通过双侧二项式检验来生成，并且通过Bonferroni校正进行调整。使用R对突变数据进行分析和可视化。
实施例1.鉴定调控代谢重编程的微小RNA(miRNA)
本发明人最近示出，由miR-200c直接靶向的SIRT2对于代谢重编程和hiPSC生成是至关重要的(19)。为了验证miR-200c和重编程之间的功能联系，本发明人对miR-200c的强制表达是否会诱导代谢变化进行了测试。实际上，人真皮成纤维细胞(hDF)中的miR-200c过表达(OE)导致显著的代谢变化，其包括耗氧率(OCR)降低和细胞外酸化率(ECAR)增加(图9A和B)。与空载体对照系相比，miR-200c OE细胞示出，氧化磷酸化(OXPHOS)能力显著降低，其中基础呼吸、ATP周转、最大呼吸和氧化储备降低，以及羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP)注射后OCR变化(图9C至E)。本发明人接下来用重编程因子(即，Y4F)与miR-200c一起处理hDF。与仅Y4F相比，添加miR-200c OE显著降低了OXPHOS(图9F至K)，这表明多能性相关联miRNA通过促进代谢重编程来影响重编程过程。为了测试这一点，本发明人研究了其他miRNA是否可以像miR-200c一样诱导代谢变化。基于先前的miRNA表达研究(20-23)，本发明人鉴定了一致地富集在hPSC中的8种候选miRNA簇(miR-17/92、-106a、-106b、-136s、-200c、-302s、-369s和-371/373)。本发明人对hDF中这些miRNA的OE是否会导致代谢变化进行了测试。有趣地，本发明人发现，与用空载体转导的对照细胞相比，这8种miRNA簇中的7种(除miR-17/92之外)导致显著的代谢重编程，其包括OCR降低和ECAR增加，从而导致范围为1/3至1/20的OCR/ECAR比率大幅减少(图9L至N)。
实施例2.将调控代谢的miRNA与重编程因子进行组合有效生成高质量hiPSC
本发明人对将这些调控代谢的miRNA添加到慢病毒载体上的常见重编程因子(Y4F或Y3F(OCT4、SOX2和KLF4))中是否会促进hiPSC的生成进行了测试。在上文鉴定的7种miRNA簇中，当与Y3F或Y4F组合时，miR-302s在增强hiPSC生成方面表现出最高的效力(图1，A和B)。另外，miR-106a、-106b、-200c、-369s或-371/373簇也适度但显著增加了hiPSC生成。本发明人接下来对任何额外的miRNA与Y3F和miR-302s(Y3F+3)或与Y4F和miR-302s(Y4F+3)组合是否会进一步增强hiPSC生成进行了测试。在存在Y3F+3的情况下，添加任何其他miRNA簇确实显著增强了hiPSC生成(图1C)。当使用Y4F+3时，仅miR-200c显著增强了hiPSC生成(图1D)，因此鉴定出Y4F、miR-302s和miR-200c(Y4F+3+2)的组合是最佳的。本发明人对由Y4F、Y4F+3和Y4F+3+2诱导的重编程期间的代谢变化的动态进行了比较。值得注意的是，Y4F+3+2诱导了最显著的代谢变化(图1，E和F)，从而支持代谢变化与高效hiPSC生成之间的联系。本发明人接下来通过对碱性磷酸酶(AP)和更严格的多能性标志物(TRA-1-60)进行染色来对这种组合是否也可影响hiPSC的整体质量进行了研究(24,25)。由Y4F或Y4F+3生成的大约40％的AP+集落是TRA-1-60+。相比之下，由Y4F+3+2生成的90％以上的AP+集落是TRA-1-60+(图1G和图10A)。此外，由Y4F+3+2生成的TRA-1-60+hiPSC集落示出了典型的hESC样致密型集落形态(图10A)。本发明人还对成人HDF(GM03529,Coriell研究所)进行了重编程，并且发现由慢病毒载体上的Y4F+3+2生成的90％以上的集落是AP+/TRA-1-60+(图10B)。
本发明人接下来对这种组合(Y4F+3+2)是否可以使用非病毒载体生成高质量hiPSC进行了测试。本发明人开发了两种附件体载体，其中一种载体含有Y4F(pY4F；图10C)，并且另一种载体含有miR-302s和miR-200c簇(p3+2；图10D)。由于c-Myc的已知转化活性(26)，因此本发明人在pY4F上将其替换为L-MYC。因此，本发明人使用这两种载体的单次转染建立了一种新型附件体重编程方案(图10E)，该方案有效地将hDF重编程为>90％AP+/TRA-1-60+的hiPSC集落(图1H)。本发明人选择了由Y4F、Y4F+3和Y4F+3+2生成的具有hESC样形态的hiPSC系，将它们传代>20次，并且表征了它们的特性。如图2，A和B所示，它们的形态和多能性标志物的表达水平与H9 hESC的那些非常相似。有趣地，H9和由Y4F+3+2生成的hiPSC同样很好地分化成三种胚层谱系，而由Y4F或Y4F+3生成的hiPSC的分化偏向中胚层谱系，如通过以下各项所证明的：(1)用针对三种胚层标志物的抗体进行染色；以及(2)谱系特异性标志物的基因表达(图2，C和D)。这些结果表明，与常规方法(Y4F或Y4F+3)相比，Y4F+3+2组合使得能够从新生儿和成人成纤维细胞二者中生成更高质量的hiPSC，无论递送载体如何，其分化潜能的偏向性都较小(表1)。
表1.通过慢病毒或附件体载体上的因子的不同组合对衍生自新生儿(BJ)或成人成纤维细胞(GM03529)的hiPSC系进行比较
Figure BDA0003482534650000521
实施例3.hiPSC中的基因组完整性和体细胞突变
为了测试本发明人的重编程方法是否可以可靠地生成临床级hiPSC，本发明人尝试使用来自多种来源的成人HDF生成hiPSC系，这些成纤维细胞包括来自Coriell研究所的9个成纤维细胞系(3个家族性PD、3个散发性PD和3个健康受试者)和来自新皮肤生检的4个样品(3个健康受试者和1个散发性PD患者)。如表B和C以及图11A和B所示，本发明人的方法使用pY4F和p3+2的一次转染从所有这些成纤维细胞中生成多种hiPSC系(图10E)，所有这些系均显示出hESC样形态和多能标志物(包括OCT4、TRA-1-60、NANOG和SSEA-4)的显著表达。
专注于个性化细胞疗法，本发明人进一步表征了根据IRB批准的方案(PartnersIRB#2010P001100)从散发性PD患者(表B中的MCL540)的皮肤生检制造的hiPSC克隆。临床级hiPSC的基本标准是保持基因组完整性并且不存在有害(例如，报告的致癌)突变(7,17)。作为实例，本发明人对自最初从MCL540中分离以来传代大约20次的5种独立的hiPSC克隆(N17、C4、N3、C11和C5)以及对照细胞(亲本成纤维细胞和H9)测试将载体DNA整合到宿主基因组中的潜力(表2)。为了检测质粒衍生的序列，本发明人设计了8组EBNA-1特异性引物，并且鉴定了两组(EB-01和EB-02)，该两组特异性检测质粒DNA(图12A)。虽然在细胞质级分中检测不到质粒DNA(图12B)，但五种克隆中的一种(N17)示出了整合的质粒序列(图12C)。qRT-PCR分析示出，N17每100纳克基因组DNA含有1.3-1.7x104个整合质粒序列拷贝(图12D)。由于二倍体细胞中DNA的量为约6微微克(bionumbers.hms.harvard.edu/bionumber.aspx？id＝111206)，因此用于qRT-PCR的100纳克基因组DNA表示约1.76x104个细胞。因此，克隆N17每细胞似乎含有大约1个质粒序列拷贝。相比之下，其他四种克隆和阴性对照(原始成纤维细胞和H9)不含整合的质粒DNA(图12D)。因此，本发明人排除了N17，并且通过DNA指纹分析、核型分析和体内多能分化进一步对剩余的4种hiPSC克隆(C4、N3、C11和C5)(图12，E至G)进行了分析。
表2.MCL540衍生的hiPSC系的汇总.
Figure BDA0003482534650000531
本发明人对这四种hiPSC克隆进行了全外显子组测序(WES)，并且发现，与亲本成纤维细胞DNA序列相比共有524个体细胞突变，其包括编码外显子或±2bp剪接受体和供体位点中的137个突变。每种hiPSC系携带中值为126的体细胞突变(范围92-205)，其包括中值为114.5的单元素突变(范围80-195)。hiPSC系之间存在一些共享突变(n＝1-4)(图3A)。C5具有最大数目的体细胞突变(n＝205)，并且C4具有最少数目的体细胞突变(n＝92)，其包括80个单元素突变。在蛋白质编码区的体细胞突变中，hiPSC系携带36.5(范围17-50)的中值，其包括27(中值，范围14-35)非同义突变。再者，C4具有最少的突变。本发明人研究了127个基因中的突变，这些基因被报告为在多种癌症类型中经常发生突变(27)。本发明人的hiPSC系在这些基因中携带至多一个突变(同义或非同义)，并且未从C4或N3中发现非同义突变。总之，在发现于所有四种hiPSC系中的体细胞突变中，没有一个与癌症有因果关系。最后，本发明人将本发明人的hiPSC系中的体细胞突变负荷与公开可用的数据集进行了比较(图3B)。在人诱导多能干细胞倡议(Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative，HipSci)中，本发明人收集了来自基于140种hESC系(28)的WES的高可信度体细胞突变和来自299种hiPSC系(通过Sendai病毒方法生成)的WGS数据的体细胞编码突变(29)。本发明人的hiPSC系示出了与HipSci hiPSC系(中值25，范围5-492)类似且显著少于hESC系(中值70，范围34-223)的整体突变负荷(Wilcoxon秩和检验，p值为0.00071)(图3B；左)。而且，本发明人的hiPSC系在癌症中经常发生突变的基因中携带较小数目的突变(图3B；右)。
本发明人还检查了可能存在于每种hiPSC系的亚群体中的体细胞突变。本发明人估计了观察到的体细胞突变中等位基因分数的分布，并且进行了二项式检验，其中45％的零模型(null model)作为SNV的中心，并且35％作为插入/缺失的中心(28,30)。对于每种hiPSC系，中值为16(范围为9-18)的变体，其中Bonferroni校正的p值<0.01，被认为是源自一定分数细胞的体细胞突变的潜在候选者。在所有hiPSC系中发现的所有体细胞突变的次要等位基因分数的分布(图3C)示出，在每种hiPSC系中均观察到克隆和亚克隆突变(在图中被鉴定为两个峰)，但亚克隆突变对于个别iPSC系来说是独特的。本发明人观察到在两种或更多种hiPSC系中保守的20个突变，但对来自WES的比对短读数的目视检查显示了在14个体细胞突变候选者的亲本成纤维细胞中具有突变等位基因的一或两个短读段，这表明了这些亚克隆突变候选者的潜在种系起源。值得注意的是，在本发明人的hiPSC细胞系中，在癌症驱动基因(如TP53)中不存在克隆或亚克隆体细胞突变(28)。在四种hiPSC系中，C4和N3具有最低的体细胞突变负荷，并且进一步进行了表征。
实施例4.“点样”培养方法可靠地产生高产量和高质量的mDA细胞
许多实验室已研究了小鼠和人PSC向mDA细胞命运的体外分化。基于mDAN源于神经源性底板以及Wnt和Sonic Hedgehog信号起着关键作用的发现(31-33)，最近的mDA分化方案利用这些信号的活化剂(7,34,35)。由于基于胚状体衍生的神经球的方法在实验之间变化很大(18,35,36)，因此本发明人试图建立基于“双重SMAD抑制”的更有效和可重现的单层方法(36,37)。用于移植研究的mDA细胞通常已在体外分化16-32天(7)。因此，本发明人试图根据先前公布的优化条件(37)，首先使用经过充分研究的H9(传代次数<36)，从每60mm皿730,000个细胞(即，34,000/cm2)开始来优化前15天，这至关重要地确定了基于底板的mDA祖细胞(mDAP)诱导。令人惊讶地，本发明人观察到从D8-D10开始的严重细胞死亡/丢失，其导致结果变化很大。在本发明人的实验室，4名独立研究人员对多个实验(对于hESC，n＝76，对于hiPSC，n＝48)进行了评估，由于严重的细胞丢失，>50％的评估未能为hESC和hiPSC二者提供有意义的数据(图13A)。因此，本发明人通过在培养基更换期间使用荧光活化细胞分选(FACS)确定脱落细胞的数目来仔细监测分化过程期间的细胞丢失(图4A)。在第15天(D15)，本发明人对总收获细胞数目进行计数，然后进一步表征这些细胞。显著地，在对两种hESC系(H9和H7)和两种hiPSC系(C4和N3)进行测试时，从D1至D14的脱落/丢失细胞的总数目远高于收获细胞的总数目(图4B和表3)。因此，本发明人尝试用较小数目的H9和C4细胞(240,000(11,000个细胞/cm2)和60,000(3,500个细胞/cm2))开始单层培养。使用11,000个细胞/cm2，本发明人发现了类似的显著细胞丢失模式(表3)。在3,500个细胞/cm2的更低密度下，H9和C4细胞均示出较差的存活力，并且类似地因脱落而丢失，使得最终的细胞收获低得令人无法接受。这种与初始细胞浓度无关的严重细胞丢失模式表明，均匀分布的单层条件对于hiPSC和hESC的体外分化并不理想。因此，本发明人假设将单层分成较小的分离部分(此处称为“点样”)可能会改善体外分化。为了测试这一点，本发明人通过在2x2 cm网格的交叉点上使用10μl基质胶预包被直径约5mm的圆形区域(“斑点”)来限制初始细胞附着到指定区域(图13B和C)。
为了找到最佳细胞密度，本发明人在每个斑点使用H9或C4细胞铺板三种不同数目的细胞(40,000、10,000和2,500)。显著地，与单层方法相比，这种点样方法显著减少了细胞丢失，并且提高了D15的产量。具体地，本发明人发现，每斑点10,000个细胞(每60mm培养皿总共60,000个细胞)导致体外分化几乎100％成功(图13A)，并且在D15最终收获6-8百万个mDA细胞，而总细胞丢失少于300万个细胞(图4B，表3)。本发明人证实了H7 hESC和N3 hiPSC系具有类似的模式(图4B)，这表明这种点样方法可广泛应用于hPSC系的mDA分化。更重要地，在D15收获的细胞包括更少的死亡细胞(图4C)和显著更少的切割半胱天冬酶-3阳性细胞以及降低的核凝聚(图4D)，这是众所周知的程序性细胞死亡标志物(38,39)。本发明人推测点样方法与单层方法之间的结果差异是由于单层条件下细胞的氧气和营养不足而导致的，并且因此尝试通过更频繁地更换培养基来纠正这一点。然而，每日更换培养基既不会减少细胞丢失，也不会提高细胞收获。相反，这实际上增加了细胞丢失(图14A)。在点样方法中，每日更换培养基不会影响细胞丢失或收获，这再次证实使用点样方法进行分化比使用单层方法更稳定。值得注意的是，本发明人观察到，无论培养基更换频率如何，培养基仅在单层培养中显著变酸(图14B)，这至少部分解释了细胞健康状况不佳的原因。综合而言，与常规单层方法相比，这种新型基于点样的方法减少了细胞丢失，增加了最终细胞产量，并且产生了更健康的mDA细胞。
表3示出了使用3种不同细胞密度(34,000/cm2、11,000/cm2、3,500/cm2)的基于单层的方法与使用3种不同细胞密度(40,000/斑点、10,000/斑点、2,500/斑点)的基于点样的方法针对H9和C4体外分化期间细胞丢失水平的比较的结果。使用FACS对培养基更换后存在于上清液中的脱落细胞进行计数。
表3.单层方法和基于点样的方法的细胞丢失和产量
Figure BDA0003482534650000571
Figure BDA0003482534650000572
实施例5.槲皮素处理消除体外分化期间未分化的细胞
基于hPSC的细胞疗法的最关键问题在于通过去除具有赘生性潜能的残留未分化细胞来建立安全性。基于先前发现与体细胞相比BIRC5(编码生存素)在hPSC中高度表达(40)，本发明人假设对生存素的化学抑制将选择性地消除剩余的未分化hiPSC。然而，由于已知生存素对神经元前体很重要(41,42)，因此重要的是测试这种策略是否会干扰mDAP生成。在生存素抑制剂中(40)，本发明人选择了黄酮类槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮)，因为这种天然化合物以高浓度存在于经常消费的蔬菜和水果中(43)。本发明人首先用5、10、20、40和100μM槲皮素处理100,000个未分化的C4细胞2、6、16和24小时。用新鲜培养基洗涤后，将细胞进一步培养总共48小时。如图5A所示，当用>20μM槲皮素处理>16小时时，检测不到活细胞，这指示了可以以>99.99％的效率消除未分化的hiPSC。为了测试槲皮素是否会影响mDAP的存活，本发明人用不同浓度的槲皮素处理D9 C4细胞(主要是神经元前体)16小时，并且在D11检查结果。在D11，细胞存活力和数目均未受到影响(图5，B和C)，这表明槲皮素不影响hiPSC衍生的mDAP。
为了建立一种灵敏性且特异性的测定，本发明人在总共100,000个细胞中的hdF中创建了未分化C4细胞的测试混合物，并且进行了三种不同的测定。首先，本发明人使用具有针对SSEA-4和TRA-1-60的单克隆抗体的FACS(图15A)，并且发现输入与检测到的细胞数目之间存在显著差异，特别地低于100个细胞(图15B)，这指示了这种方法对小数目的未分化细胞不灵敏。第二，本发明人将稀释细胞的样品培养6天，并且将AP+集落计数为未分化细胞的替代标志物(图5D)。尽管存在线性关系，但AP+集落的数目为预期给定的输入细胞数目的约十分之一(图5E)。这种差异可能是由于个别hiPSC的生存和生长有限和/或它们在集落形成期间发生聚集的趋势而导致的。尽管存在这种限制，但由于即使在铺板105个hiPSC后，用槲皮素处理后也未检测到AP+集落，因此该结果证实了槲皮素处理的功效>99.99％。尽管如此，由于这种方法无法检测到每100,000个中少于10个未分化细胞的数目，因此本发明人接下来使用qRT-PCR方法，其使用OCT4表达作为替代标志物。使用对从102至105个未分化C4细胞制备的mRNA的qRT-PCR分析，生成OCT4拷贝数目的标准曲线(图5F)，这允许本发明人预测未分化细胞的数目。使用这种测定，在未经槲皮素处理的情况下，计算出的D14、21和28未分化C4细胞数目分别为每100,000个细胞30、2和0.17个(图5G)。因此，如果将1千万个D14、D21或D28分化细胞移植到PD患者体内，则移植物将分别含有大约3,000、200和17个未分化细胞。由于槲皮素处理可以以>99.99％的效率消除未分化细胞，因此在槲皮素处理后，未分化细胞的预期数目将为每1千万个D28细胞至多17x0.01％＝0.0017个细胞。与此一致，在槲皮素处理(在D9，用40μM槲皮素处理16小时)后，在D14、D21和D28使用qRT-PCR曲线计算出的未分化细胞数目远小于每100,000个细胞1个细胞(图5G)。与这些结果一致，在未经槲皮素处理的情况下，在D14观察到一些NANOG+细胞，但在经槲皮素处理的情况下，没有检测到NANOG+细胞(图15C)。综合而言，本发明人的结果指示，槲皮素处理可将未分化细胞的数目减少到使用灵敏性技术检测不到的水平，因此即使在移植了几百万个分化细胞后，也大大减少了肿瘤形成的风险。
实施例6.mAP和mEAN的功能表征
基于上文描述的点样方法和槲皮素处理，本发明人建立了一种改进的体外方案，其用于将hiPSC分化成mDAP/mDAN(图6A)。使用这些方法分化的C4细胞示出了逐步更致密的形态、极少的脱落(图14C)和神经突起从边缘的双极性长出(图16A)。在D15，将细胞解离成单细胞悬浮液，重新铺板，并且进一步分化。如图6的B和C所示，神经前体标志物(例如，SOX2、SOX1和NESTIN)和底板/基板标志物(例如，GLI1、FOXA2和CORIN)的表达在D7(第7天)开始，并且以高水平持续到D28，最后在D40降低。mDAP标志物(例如，OTX2、LMX1A和EN1)的表达在D21和28升高，而mDAN标志物(例如TH、DAT和PITX3)的表达随后增加。阶段特异性免疫细胞化学分析证实了这些数据，该分析示出，NESTIN逐渐降低，并且mDAN标志物逐渐增加(图16B)。由于D28细胞比D14细胞表现出更成熟的表型(图16B)，因此本发明人预期D28细胞可能比早些时候的细胞更合适，并且因此使用免疫细胞化学针对典型的mDAP和mDAN标志物分析D28细胞(图6，D至H)。大约40％和15％的总细胞分别表达MAP2和TH，并且38％的细胞表达NURR1(图6，D和E)。超过80％的总细胞共表达FOXA2和LMX1A(图6，D和F)，并且大多数TH+细胞共表达FOXA2、LMX1A和NURR1(图6，D和G)，这是mDA表型的特征。本发明人观察到，大约30％和20％的D28细胞分别表达背侧模式化标志物PAX6和增殖标志物KI67(图6，D和H)。重要地，检测不到共表达PAX6、SOX1和KI67的细胞，已知其在移植后会形成异常长出(44,45)(图6，D和H)。在任何分化阶段几乎都检测不到GABA+或5-HT+细胞(图16B)。
为了确定这些细胞是否成为生理功能性神经元，本发明人从D70培养物进行了全细胞膜片钳记录，该培养物含有许多共表达MAP2、多巴胺转运体(DAT)和突触囊泡蛋白(SYP)的TH+神经元(图17A)。这些D70 TH+神经元共表达额外的成熟mDA标志物，其包括PITX3和VMAT2(图17A)。此外，TH+ALDH1A1+神经元共表达GIRK2或有时共表达钙结合蛋白(图17B)，它们分别表征A9型和A10型mDAN。在电流钳记录模式下，本发明人评估了这些细胞的固有膜特性(静息膜电位，-55.93±2.43mV；输入电阻，1.52±0.44GΩ；n＝7个神经元)，并且观察到响应于去极化电流注入的动作电位(AP)(图18A；AP的平均幅度为54.96±4.66mV；半宽：6.04±0.82ms；后超极化幅度(AHP)：3.55±1.46mV；n＝7个细胞)。在电压钳记录模式下，从-70mV至+40mV的电压脉冲诱发由河豚毒素(TTX；一种电压门控Na+通道阻断剂)完全阻断的瞬态内向电流以及持续的外向电流(图18B)，该内向电流指示电压门控Na+通道的表达，该外向电流表示钾电流。此外，在全细胞电压钳记录期间，本发明人观察到自发突触后电流(sPSC)，其指示功能性突触的存在(在-70mV的保持电位下，sPSC的频率为0.11±0.03Hz；峰值幅度，14.71±3.05pA；上升时间，0.73±0.14ms；衰减时间，1.72±0.19ms；n＝5个细胞)(图18C)。与静息膜电位下的起搏器活动一致(46)，在不存在注入电流的情况下观察到自发放电。记录细胞以4.4±0.8Hz(n＝4)的平均频率自发放电，如通常在A9 mDAN中所观察到的(图18D)。个别记录的神经元(通过记录膜片移液管加载有神经生物素，红色)与TH阳性共定位，这证实了这些细胞作为多巴胺能神经元的身份(图18E)。除单细胞膜片钳记录之外，本发明人还使用多电极阵列(MEA)测量了群体水平的电活动。分化细胞发展出强健的同步爆发模式，这指示神经元网络正在成熟(图18F)。累积活动图示出了D30至D44之间mDA内的尖峰密度和尖峰面积增加(图18F)。为了从mDAN中分离出自发活动，用谷氨酸受体拮抗剂NBQX+AP5和GABAA受体拮抗剂印防己毒素的组合处理培养物。当施用这种混合物时，总体尖峰形成以及活性电极的数目仅适度减少(图18G和H)，这表明这些培养物中存在大量的mDAN。最后，培养基的HPLC分析进一步示出，D47细胞释放多巴胺(3.1±0.1ng/ml)和DOPAC(0.2±0.0ng/ml)(图6I)。
实施例7.移植后的体内安全性测试
本发明人的体外表征示出，D14至D28的大多数细胞表示适合作为可移植细胞来源的mDAP。为了测试它们的安全性，本发明人将D14或D28 C4细胞(未经或经槲皮素处理；每动物100,000个细胞)移植到免疫缺陷NOD SCID小鼠的纹状体中。如预期，未分化C4细胞(D0)的移植在所有4只测试小鼠中诱导了含有特征性三胚层的畸胎瘤的形成(图7A，左栏)，这是PSC的定义性特征。通过比较，在移植未经(n＝8)或经槲皮素(n＝19，图7A，中栏)处理的D14和经槲皮素(n＝23；图7A，右栏)处理的D28后，未观察到畸胎瘤形成(图7B)。有趣地，本发明人在约40％的移植有D14细胞的宿主脑中观察到玫瑰花结样结构(未经槲皮素处理的情况下，D14的8中的3个；经槲皮素处理的情况下，D14的19中的8组；图7A的中线中的白色圆圈)。相比之下，在移植D28细胞后，没有玫瑰花结样结构(23只小鼠中0只；图7，A和C)。免疫组织化学示出，与D28移植物相比，D14移植物含有更多的波形蛋白阳性未成熟细胞(图7D)。另外，D28细胞移植物中的SOX1阳性、KI67阳性、SOX1/KI67双阳性、SOX1/PAX6双阳性和SOX1/PAX6/KI67三阳性细胞也少于D14细胞移植物中的那些阳性细胞(33％对4.5％；5.9％对1.2％；2.1％对0.15％；1.2％对ND；0.75％对ND，图7，E至G)，这指示了D28移植物比D14移植物含有更少的具有增殖性潜能的细胞。这些结果表明，尽管已去除完全未分化的细胞，并且未形成畸胎瘤，但D14移植物仍含有能够形成玫瑰花结样结构的未成熟祖细胞。另外，由于在D28移植物中检测不到SOX1/PAX6/KI67三阳性细胞，因此本发明人得出结论，D28细胞表示比D14细胞更安全的移植细胞来源。本发明人通过评估D28细胞的生物分布进一步测试了其安全性。在将D28细胞移植到纹状体中之后6个月，本发明人收获了中枢神经系统区域(嗅球和小脑的混合物以及脊髓)和五种外周器官(肺、心脏、肝、肾和脾)，以搜索来自纹状体移植物的人源细胞的迁移。基因组qPCR在任何这些区域均未检测到人DNA序列，而hiPSC阳性对照示出了显著的表达(图7H)，这表明了没有可检测到的移植细胞在脑内或外周器官中的重新分布。
实施例8.PD动物模型中的体内功效测试和移植物分析
6-OHDA损伤大鼠模型是历史上开发的首个PD动物模型(47)，并且仍然是一种流行的模型(48,49)。它对于定量评估细胞移植的运动效应特别有用。它在无胸腺大鼠中的应用正逐渐成为首选模型，因为免疫抑制是不必要的。使用了两种不同来源的无胸腺大鼠(Taconic Biosciences(Hudson,NY)和Charles River(Wilmington MA))。本发明人首先将100,000和300,000个C4 D28细胞移植到单侧6-OHDA损伤无胸腺Taconic大鼠的纹状体中，并且在移植后每月监测它们的安非他命诱导的旋转行为。在12周时，100,000细胞组和300,000细胞组均示出了同侧旋转行为显著减少(图19A)。在16周时，所有植入大鼠的旋转行为完全恢复，并且其中一些甚至示出了对侧旋转。相比之下，接受载体的大鼠没有示出恢复。苏木精和伊红(HE)染色示出，移植物既不含有畸胎瘤也不含有玫瑰花结(图19B)。人神经细胞粘附分子(hNCAM)的免疫组织化学示出，纹状体(STR)(图19C)、前额皮层(PFC；图19D)、隔核(图19E)、伏核(NAc；图19F)和胼胝体(CC；图19G)中有密集的hNCAM+神经支配。免疫组织化学显示移植物中有大量的TH+神经元(图19H)。立体逻辑定量示出，存活的TH+神经元的平均数目为每100,000个移植细胞5,621±1029个(n＝4)，该移植细胞含有神经元形态的混合物，其包括A9神经元典型的大角细胞体(图19I)和A10身份典型的较小球形神经元(图19J)。
凭借表明D28 C4细胞的安全性和功效的这些数据，本发明人进一步在CharlesRiver无胸腺大鼠身上对该细胞进行了广泛的测试，与Taconic品系相比，该无胸腺大鼠身体更强健，并且有助于长期分析。本发明人选择单剂量(100,000)的D28 C4细胞以进行移植(图19K)，并且将冷冻保存的细胞的功效和安全性与新鲜制备的细胞的功效和安全性进行了比较。冷冻保存D28 C4细胞(Cryo-D28)保留了与新鲜制备的等效物类似的存活力水平(约90％)，并且在液氮中储存1周后显示出相同的mDA细胞表型(图19L)。安非他命诱导的旋转在16周时显著减少，并且在新鲜或Cryo-D28 C4细胞移植后20周和24周时完全恢复(图8A)。如Taconic大鼠所指出的(图19A)，一些动物在20周和24周时表现出对侧旋转。本发明人还在若干不涉及外源性药物刺激的测试中评价了这些移植物的功能性功效，从而提供了对与人PD的运动缺陷更类似的运动缺陷的测量。在廊道测试(一种对侧向感觉运动响应选择的灵敏性测试)中(50)，新鲜或Cryo-D28 C4细胞在移植后24周显著减少了病变诱导的同侧偏差(图8B)。值得注意的是，在16或20周时还没有观察到显著的减少，这表明了改进这项任务比改进旋转行为需要更多的时间。在测量前肢运动不能的圆柱体和步进测试中(51,52)，新鲜或Cryo-D28 C4细胞在移植后24周也显著改善了由6-OHDA损伤产生的受损前肢功能(图8，C和D)。综合而言，在所有4项行为测试中，新鲜和Cryo-D28 C4细胞均显著地和类似地改善了运动功能障碍。进一步地，在随后的时间点，额外的移植动物表明，旋转行为的恢复持续长达52周(图19M)，这是最新测试的时间，这表明了移植导致的功能改善得到了很好的保持。
由于H9衍生的mDA细胞已得到广泛验证并明确示出与人胎腹侧中脑(VM)细胞具有同等功能(53)，因此本发明人直接对移植H9 hESC和C4 hiPSC衍生的D28细胞后的结果进行了比较。1x105和4x105个细胞的移植示出，这两种系导致旋转行为的恢复在程度和时间过程二者方面均相同(图20A)。
本发明人接下来在移植后26周对移植物进行了分析，并且发现hNCAM+和TH+细胞都显示出对整个STR的广泛神经支配并大量延伸至多巴胺能靶区，如背外侧STR(dl-STR)、PFC和NAc(图8的E至L以及图20B)。通过dl-STR多巴胺能纤维中hNCAM的广泛共表达，进一步验证了这些移植物衍生的mDAN对宿主脑的强健神经支配(图8M)。另外，使用针对TH、人突触前蛋白(突触囊泡蛋白；hSyn)和纹状体中等有棘神经元标志物(DARPP32)的抗体进行三重免疫荧光染色。本发明人观察到TH+/hSyn+神经元末端位于其优先靶标上以及移植物边界处的宿主树突棘(DARPP32+神经元)，这指示了移植DAN已与宿主纹状体神经元形成突触连接(图8N)。Cryo-D28和新鲜D28移植物示出了类似的hNCAM+/TH+神经再支配和突触形成模式(图20C)。新鲜和Cryo-D28 C4细胞二者的移植物含有类似大数目的具有A9或A10样形态的DA神经元(D28,34,560±3,200；Cryo-D28,46,094±8,967；图21，A和B)。D28与Cryo-D28之间的移植物体积也类似(D28，12.2±1.1mm3；Cryo-D28，13.0±1.7mm3；图21C)。在D28和Cryo-D28的移植物中，hNCAM+细胞的总数目分别为大约3.0x106和2.45x106，并且TH+细胞的平均百分比分别为1.48±0.55％和2.08±0.65％。这些TH+神经元中的大多数(70-80％)共表达FOXA2和LMX1A，并且超过90％共表达NURR1(图21，D至F)。成熟DA标志物DAT在TH+神经元中大量表达(图21G)，而与增殖潜能相关联的标志物KI67+在<1％的细胞中表达(D28，0.86±0.09％；Cryo-D28，0.54±0.21％；图21，H和I)。未观察到玫瑰花结或畸胎瘤，并且共表达SOX1、PAX6和KI67的增殖细胞很少或未被检测到(SOX1+PAX6+，D28，0.37±0.10％；Cryo-D28，0.15±0.11％；SOX1+PAX6+KI67+，D28,0.02±0.02％；Cryo-D28，N/D；图21，H和I)。GIRK2或钙结合蛋白在TH+神经元中表达(图21J和K)，其中大多数共表达GIRK2(D28，79.29±4.88％；Cryo-D28，81.28±3.50％；图21L)。移植物中的这些TH+神经元共表达额外的A9标志物，如ALDH1A1。TH+ALDH1A1+神经元通常共表达表示A9型mDAN的SOX6和GIRK2(图21，M和N)；而一些TH+ALDH1A1+神经元共表达表示A10型mDAN的钙结合蛋白(图21O)。总之，这些数据示出，新鲜和Cryo-D28 C4细胞移植物中的绝大多数TH+神经元具有A9型mDAN的特征，这与行为测试中运动功能障碍的广泛和长期恢复一致。
当将这些数据与最近发表的对6-OHDA损伤大鼠模型中的hiPSC衍生DA细胞的移植研究(44,45,57-64)进行比较时，本研究中的DA产率(存活的DA神经元与移植细胞的数目的比率)高于任何其他研究(表4)。
表4.hiPSC衍生的多巴胺细胞在大鼠脑中的存活和功能(与图7相关)
Figure BDA0003482534650000641
Figure BDA0003482534650000642
Figure BDA0003482534650000651
缩写：CR表示Charles River；cryo表示冷冻保存的细胞；N/A表示不适用；NPC表示神经元前体细胞；SD表示Sprague Dawley；X-SCID表示x连锁重度联合免疫缺陷
*2,106±313/mm3指示DA密度和DA产率结果在本研究中不适用。
实施例9.分化细胞的GMP产生
最后，本发明人在Dana Farber研究所的GMP设施中，根据本方案，通过体外产生和表征分化C4细胞对本发明人的平台的可扩展性和临床适用性进行了测试。本发明人从约1百万个D0 C4 iPS细胞开始，成功地产生了>1.6亿个D28细胞(图22A至F)。质量控制数据(例如，基因组足迹、标志物蛋白的ICC、qRT-PCR)表明，这些临床相关数量不含病原体且质量高，如通过FOXA2+LMX1A+细胞的高百分比(>85％)和不适当标志物(例如，5-HT、DBH、OCT4和SSEA-4；分别表示羟色胺能、去甲肾上腺素能和多能标志物)的缺乏所证明的。
实施例10.人受试者的体内功效测试
通过植入由本文描述的方法产生的自体mDA祖细胞来治疗患有PD的人患者。患者是一名69岁的右利手男性医师，有10年的进行性特发性PD病史。患者的PD药物为Rytary(卡比多巴/左旋多巴缓释)23.75/95，3粒胶囊，每天四次；罗替戈汀，每天4mg；以及雷沙吉兰，每天1mg(904mg左旋多巴等效剂量)。尽管接受了最好的药物疗法，但患者报告，症状控制不佳，平均每天有3小时的休止时间，其特征是震颤、姿势和精细运动控制恶化。患者没有运动障碍。知情同意书包括对与人类首次在PD中使用该技术相关联的风险的全面讨论，以及对目前可用的医疗和外科治疗方式(包括深部脑刺激)的评述。将从皮肤生检中收获的成纤维细胞用于生成多种iPSC系，对这些系进行广泛的体外和体内多能分化潜能测试，并且使用全外显子组测序来筛查体细胞突变。基于这些数据，选择了一种没有已知癌症相关突变且总体突变负荷最低的单克隆(定名为C4)，以用于产生可移植的mDAP细胞。符合严格的GMP和质量控制标准，并且在释放mDAP细胞以供临床使用之前，通过全基因组测序(WGS)对A9 mDA特异性和其他神经标志物的基因表达以及基因组完整性进行测试。
患者接受了两次MRI引导的立体定向手术程序以植入壳核、左半球和右半球，间隔6个月，符合FDA的监管指导。在每次手术中，在前连合水平后方的壳核中形成三条轨迹，每条轨迹跨越核的上下范围(Schweitzer等人，Oper Neurosurg(Hagerstown)2019；18:321-328)。在每个手术程序中递送了总共4百万个细胞，其在三个轨道中平均分配。围手术期经静脉注射施用头孢唑林。任何时候都没有使用免疫抑制剂、糖皮质激素或抗惊厥剂。每次手术后，对患者进行过夜监测，第二天出院。
材料和方法
在该实例中使用以下材料和方法。
监督
知情同意书包括对与人类首次在帕金森氏病中使用该技术相关联的风险的讨论，以及对目前可用的医疗和外科治疗方式(包括深部脑刺激)的评述。本研究在美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)的监管指引下进行。获得了威尔康奈尔医学中心(Weill Cornell Medical Center)和马萨诸塞州总医院(Massachusetts GeneralHospital)的机构审查委员会的批准。在动物身上进行的所有程序均得到麦克莱恩医院动物护理和使用委员会(McLean Hospital Animal Care and Use Committee)的批准。
iPSC产生、分化以及临床前安全性和功效测试。
使用将常规的Yamanaka因子与上文描述的两种microRNA簇进行组合的方案来产生iPSC。将从皮肤生检中收获的成纤维细胞用于生成多种iPSC系，对这些系进行广泛的体外和体内多能分化潜能测试，并且通过全外显子组测序来筛查体细胞突变的存在。选择示出正常核型的单个iPSC克隆(被定名为C4)，以用于进一步表征和在良好生产规范条件下产生mDAP。在如上文所描述的GMP条件下，使用基于“点样”的方法将C4 IPSC体外分化成mDA细胞28天。该方案包括在第9天用槲皮素处理过夜，以通过抑制编码生存素的PSC特异性抗凋亡基因BIRC5来消除剩余的未分化iPSC(即，表达多能标志物(如OCT4、SSEA1和NANOG)的细胞)。参见上文和Lee等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110:E3281-90。
体外分化的mDAP的表征
在如上文所描述的两个验证实验中，C4 iPSC衍生的细胞示出了正常核型，并且被表征为具有多巴胺神经元特异性和其他神经标志物的mDAP。对C4 iPSC和C4衍生的祖细胞进行全基因组测序，并且将该祖细胞与原始来源成纤维细胞进行比较；结果证实了在该祖细胞中不存在已知的癌症相关联和神经变性相关联突变。
与亲本成纤维细胞相比，本发明人在C4 iPSC和MDAP中发现了23种包括错义和剪接位点破坏变体的体细胞突变；然而，已知的癌症相关基因(即，根据CENSUS数据库)、报告的神经变性性病症疾病基因(即，根据HGMD和ClinVar)以及参与酪氨酸代谢和多巴胺能突触通路的基因(即，根据KEGG数据库)不受这些变体的影响。值得注意的是，C4 iPSC样品中以低分数存在FLG2的错义变体(ENSP00000373370.4:p.Val672Gly)，其称为C4 iPSC中的杂合变体。因此，本发明人怀疑该错义变体作为亚克隆体细胞突变存在于C4 iPSC和mDAP二者中。在从C4 iPSC分化为mDAP期间，没有引入新的体细胞突变。存在于C4 iPSC或mDAP中的大多数突变在另一样品中表现为亚克隆(每个框中最左边的两个峰)。接下来，本发明人使用肿瘤等位基因特异性拷贝数目分析(allele-specific copy number analysis oftumors，ASCAT)进行了基于读取深度的CNV分析(Van Loo等人，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 2010；107:16910-5)。本发明人在C4 iPSC和mDAP中发现了覆盖内含子和单一外显子的PODXL基因的杂合缺失，但与C4 iPSC相比，没有发现任何额外的CNV被引入到mDAP中。使用WES未检测到这种拷贝数目变体。PODXL尚未被报告为癌症驱动基因。
在临床使用之前，衍生自这些祖细胞的神经元在体外示出了黑质致密部多巴胺能神经元的多巴胺分泌和电生理特性，在动物模型中了示出与如上文所描述的胎儿中脑衍生组织的功能性功效类似的功能性功效，并且通过了FDA授权的释放标准。用槲皮素处理后，在免疫染色和基于实时聚合酶链反应的测定的基础上，最终细胞产物(在第28天)没有可检测到的剩余未分化iPSC(95％置信区间的上限为每10亿个第28天分化细胞中≤1个未分化细胞)。在最终产物中未检测到羟色胺能神经元，其是移植物诱导的运动障碍的潜在原因(Olanow等人，Ann Neurol 2003；54:403-14)。
人源化小鼠自体与异体条件下的移植物存活.
将患者衍生的iPSC(C4)和同种异体人胚胎干细胞(H9)分化为第28天mDAP(C4-mDAP和H9-mDAP)，并且将每系的1×105个细胞移植到患有重症联合免疫缺陷(NOD SCID)和白介素-2受体γ消减的非肥胖糖尿病小鼠(NOD SCIDγ小鼠)、患者人源化NOD SCIDγ小鼠(C4 hu；使用患者的外周血单个核细胞，其是在术后24个月[左半球]和18个月[右半球]获得的)和同种异体人源化小鼠(K1 hu)的纹状体中。在2周时处死动物，通过标记人神经细胞粘附分子(hNCAM+)细胞以组织学检查移植物存活情况，检查移植物内是否存在表达多巴胺能神经元(酪氨酸羟化酶[TH+]神经元)标志物的神经元以及细胞免疫应答(CD4+细胞)。
患者手术程序.
患者接受了两次细胞植入手术程序，即左半球，随后是右半球，间隔六个月(根据FDA的监管指引)。使用了基于MRI的Leksell立体定向技术。在每次手术中，从单个高额旁矢状面皮质进入点开始创建三条轨迹。在DF/HCC GMP Cell Manipulation Core制备细胞并在手术当天收获。使用特别设计的设备将细胞注入到每条通道中(Schweitzer等人，2019)，以创建跨越壳核矢状面范围的柱。术中CT用于对套管进行成像，并且用于将该图像重新融合到术前手术计划中，以证实定位准确性，并排除出血(图24A至B)。在每个手术程序中递送了总剂量为4百万个的活细胞，其在三个轨道中平均分配。施用抗生素(头孢唑啉，围手术期每8小时静脉注射2g，共3剂次)，但未使用免疫抑制剂、类固醇或抗惊厥剂。手术后，患者在第二天出院前在重症监护室接受了过夜监测。
临床测量
在基线处和在每次植入后1、3、6、9和12个月以及此后以6个月的每隔进行神经病学检查并评估帕金森氏病特异性测量。在每次检查时，神经科专门医师都会记录如患者所报告的“关闭”时间，即药物不能充分控制运动症状的时间。预先设定的评估包括运动障碍学会统一帕金森氏病评定量表(Movement Disorder Society Unified Parkinson’sDisease Rating Scale，MDS-UPDRS)部分III(得分范围从0至132，得分越高指示帕金森氏病运动体征越差)(Cha等人，Nat Cell Biol 2017；19:445-56)，以及39项帕金森氏病问卷(PDQ-39；得分范围从0至156，得分越高指示生活质量越差)(Lee等人，2013)。
脑成像
术中进行计算机断层扫描(CT)以确认细胞注射在壳核中的准确放置，并且在术后立即进行植入部位或其附近的出血筛查。对连续磁共振成像(MRI)扫描和磁共振波谱检查结果进行评述，以寻找任何肿瘤、中风或出血的证据。进行连续氟-18-L-二羟基苯丙氨酸(18F-DOPA)正电子发射断层扫描(PET)-CT，以对移植壳核区域中突触前多巴胺末端活动的存在进行评估。通过18F-DOPA标准化摄取值比率对放射性同位素摄取的变化进行半定量判断。
安全性监测
两名研究型神经科专门医师和一名研究型放射科医师进行了一系列临床神经病学检查以检测不良神经病学事件，并且进行了成像评述。患者继续由其社区神经科专门医师独立治疗。
结果
植入到人源化小鼠体内之后移植物的免疫原性
如图23A和上文所示，患者衍生的mDAP(C4-mDAP)和同种异体mDAP(H9-mDAP)在NODSCIDγ小鼠中均存活，并且两种移植物类型在移植到同种异体人源化小鼠(K1-hu)后均被排斥。患者人源化小鼠(C4-hu)允许自体C4-MDAP存活，移植物在植入后2周时对hNCAM+细胞呈阳性染色，并且含有TH+神经元，而C4-hu小鼠排斥同种异体H9-mDAP，具有显著的CD4+淋巴细胞浸润(图23B至C)。
植入到患者体内之后0至24个月的成像
在第一次植入后3个月，18F-DOPA PET–CT成像示出，从基线处开始，豆状核(putamina)中的18F-DOPA摄取下降，在之后直到分别在右侧和左侧植入后18个月和24个月的时间内，18F-DOPA摄取略有增加。右侧(第二次植入)的活性增加>左侧，并且移植物位点附近的后壳核的活性增加最为显著，如颜色强度标度和所选亚区域的定量比较所示的(图24A至B)。放射性同位素摄取相对于基线的半定量变化示出在图24A至B中，右侧从-4.0％至13.5％变化，左侧从-4.8％至9.8％变化。
第一次植入后6个月和随后时间点的MRI示出了T2加权信号强度增加的区域，其接近豆状核内移植物位点的位置，以及沿白质内的部分手术通道的位置，右侧更明显(图24A至B)。在六个壳核植入位点处未见到对比增强。在第二次手术后6个月，在一条通道中的靶标上方3cm处观察到4mm的增强区域；包括动脉自旋标记磁共振灌注成像和磁共振波谱的CT和MRI示出了与术后神经胶质增生一致的变化。
临床评估
在第一次(左)植入后24个月和第二次(右)植入后18个月，患者报告没有不良事件或功能下降。在第一次植入前，停止多巴胺替代疗法(“关闭”)过夜后，未测量MDS-UPDRS部分III(帕金森氏病运动体征评估)的得分，因为患者由于症状恶化拒绝停止用药。在第一次植入后4周，关闭期的得分为43，在随后的随访时间为33至41，并且在24个月时为33。多巴胺替代疗法(“开启”)峰值剂量下的MDS-UPDRS部分III得分在植入时为38，在随访期间为19至35，并且在24个月时为29。PDQ-39得分(评估帕金森氏病相关的生活质量，得分越低指示质量越好)在植入时为62，在随访期间为2至34，并且在24个月时为2(图25A至B和表5)。
表5.临床评估
Figure BDA0003482534650000711
B/L＝基线植入前；MDS-UPDRS：运动障碍学会会统一帕金森氏病评定量表(Goetz等人，Mov Disord 2008；23:2129-70)；MoCA：Montreal认知评估(Nasreddine等人，J AmGeriatr Soc 2005；53:695-9)；BAI：Beck焦虑问卷(Beck等人，J Consult Clin Psychol1988；56:893-7)；BDI：Beck抑郁量表(Beck AT,Steer RA,Brown GK.BDI-II,Beckdepression inventory:manual.San Antonio,Tex.；Boston:Psychological Corp.；Harcourt Brace；1996)；QUIP-RS：帕金森氏病评定量表中的冲动性强迫性障碍问卷(Weintraub等人，Mov Disord 2012；27:242-7.)；NMS：非运动症状量表(Chaudhuri等人，Mov Disord 2007；22:1901-11)；PDQ-39：帕金森氏病问卷–39(Peto等人，Qual Life Res1995；4:241-8)。
在24个月时，患者的帕金森氏病药物为缓释卡比多巴-左旋多巴(在胶囊中分别含有23.75mg和95mg，每天四次，剂量分别为三粒、三粒、两粒和三粒)、罗替戈汀(每天4mg)、雷沙吉兰(每天1mg)和屈昔多巴(每天100mg)(每天总剂量，847mg左旋多巴等效剂量)；与植入前相比，这表示左旋多巴等效剂量减少了6％。患者报告每天的“关闭”时间少于1小时。患者没有报告运动障碍，或在临床检查期间未观察到运动障碍，这与其术前没有运动障碍类似。
除运动评分和运动ADL的改善之外，受试者还报告了睡眠质量得到改善，其包括REM睡眠行为障碍症状减少、流涎和吞咽困难减少以及焦虑和抑郁减少。主观认知功能没有下降，并且MoCA得分保持在27-30之间。
本研究报告了帕金森氏病患者体内iPSC衍生的自体多巴胺能祖细胞的产生和植入，以及临床和成像结果，从而提供了治疗益处的证据。
参考文献
1.de Lau,L.M.,and Breteler,M.M.2006.Epidemiology of Parkinson'sdisease.Lancet Neurol 5:525-535.
2.Kang,U.J.,and Fahn,S.1988.Management of tardive dyskinesia.RationDrug Ther 22:1-7.
3.Bjorklund,A.,and Kordower,J.H.2013.Cell therapy for Parkinson'sdisease:what next？Mov Disord 28:110-115.
4.Kefalopoulou,Z.,Politis,M.,Piccini,P.,Mencacci,N.,Bhatia,K.,Jahanshahi,M.,Widner,H.,Rehncrona,S.,Brundin,P.,Bjorklund,A.,et al.2014.Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease:twocase reports.JAMA Neurol 71:83-87.
5.Barker,R.A.,Drouin-Ouellet,J.,and Parmar,M.2015.Cell-basedtherapies for Parkinson disease-past insights and future potential.Nat RevNeurol 11:492-503.
6.Lindvall,O.2016.Clinical translation of stem cell transplantationin Parkinson's disease.J Intern Med 279:30-40.
7.Sonntag,K.C.,Song,B.,Lee,N.,Jung,J.H.,Cha,Y.,Leblanc,P.,Neff,C.,Kong,S.W.,Carter,B.S.,Schweitzer,J.,et al.2018.Pluripotent stem cell-basedtherapy for Parkinson's disease:Current status and future prospects.ProgNeurobiol 168:1-20.
8.Takahashi,K.,and Yamanaka,S.2006.Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors.Cell 126:663-676.
9.Takahashi,K.,Tanabe,K.,Ohnuki,M.,Narita,M.,Ichisaka,T.,Tomoda,K.,and Yamanaka,S.2007.Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 131:861-872.
10.Yu,J.,Vodyanik,M.A.,Smuga-Otto,K.,Antosiewicz-Bourget,J.,Frane,J.L.,Tian,S.,Nie,J.,Jonsdottir,G.A.,Ruotti,V.,Stewart,R.,et al.2007.Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 318:1917-1920.
11.Park,I.H.,Zhao,R.,West,J.A.,Yabuuchi,A.,Huo,H.,Ince,T.A.,Lerou,P.H.,Lensch,M.W.,and Daley,G.Q.2008.Reprogramming of human somatic cells topluripotency with defined factors.Nature 451:141-146.
12.Scudellari,M.2016.How iPS cells changed the world.Nature 534:310-312.
13.Takahashi,K.,and Yamanaka,S.2016.A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.Nat Rev Mol Cell Biol 17:183-193.
14.Tapia,N.,and Scholer,H.R.2016.Molecular Obstacles to ClinicalTranslation of iPSCs.Cell Stem Cell 19:298-309.
15.Miura,K.,Okada,Y.,Aoi,T.,Okada,A.,Takahashi,K.,Okita,K.,Nakagawa,M.,Koyanagi,M.,Tanabe,K.,Ohnuki,M.,et al.2009.Variation in the safety ofinduced pluripotent stem cell lines.Nat Biotechnol 27:743-745.
16.Ohnishi,K.,Semi,K.,Yamamoto,T.,Shimizu,M.,Tanaka,A.,Mitsunaga,K.,Okita,K.,Osafune,K.,Arioka,Y.,Maeda,T.,et al.2014.Premature termination ofreprogramming in vivo leads to cancer development through altered epigeneticregulation.Cell 156:663-677.
17.Mandai,M.,Kurimoto,Y.,and Takahashi,M.2017.Autologous InducedStem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.N Engl J Med 377:792-793.
18.Kirkeby,A.,Nolbrant,S.,Tiklova,K.,Heuer,A.,Kee,N.,Cardoso,T.,Ottosson,D.R.,Lelos,M.J.,Rifes,P.,Dunnett,S.B.,et al.2017.Predictive MarkersGuide Differentiation to Improve Graft Outcome in Clinical Translation ofhESC-Based Therapy for Parkinson's Disease.Cell Stem Cell 20:135-148.
19.Cha,Y.,Han,M.J.,Cha,H.J.,Zoldan,J.,Burkart,A.,Jung,J.H.,Jang,Y.,Kim,C.H.,Jeong,H.C.,Kim,B.G.,et al.2017.Metabolic control of primed humanpluripotent stem cell fate and function by the miR-200c-SIRT2 axis.Nat CellBiol 19:445-456.
20.Korpal,M.,Lee,E.S.,Hu,G.,and Kang,Y.2008.The miR-200 familyinhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration bydirect targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2.JBiol Chem 283:14910-14914.
21.Valastyan,S.,and Weinberg,R.A.2011.Roles for microRNAs in theregulation of cell adhesion molecules.J Cell Sci 124:999-1006.
22.Banyard,J.,Chung,I.,Wilson,A.M.,Vetter,G.,Le Bechec,A.,Bielenberg,D.R.,and Zetter,B.R.2013.Regulation of epithelial plasticity by miR-424 andmiR-200 in a new prostate cancer metastasis model.Sci Rep 3:3151.
23.Pieters,T.,and van Roy,F.2014.Role of cell-cell adhesion complexesin embryonic stem cell biology.J Cell Sci 127:2603-2613.
24.Chan,E.M.,Ratanasirintrawoot,S.,Park,I.H.,Manos,P.D.,Loh,Y.H.,Huo,H.,Miller,J.D.,Hartung,O.,Rho,J.,Ince,T.A.,et al.2009.Live cell imagingdistinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.NatBiotechnol 27:1033-1037.
25.Tanabe,K.,Nakamura,M.,Narita,M.,Takahashi,K.,and Yamanaka,S.2013.Maturation,not initiation,is the major roadblock during reprogrammingtoward pluripotency from human fibroblasts.Proc Natl Acad Sci U S A 110:12172-12179.
26.Nakagawa,M.,Takizawa,N.,Narita,M.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.2010.Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.ProcNatl Acad Sci U S A 107:14152-14157.
27.Kandoth,C.,McLellan,M.D.,Vandin,F.,Ye,K.,Niu,B.,Lu,C.,Xie,M.,Zhang,Q.,McMichael,J.F.,Wyczalkowski,M.A.,et al.2013.Mutational landscape andsignificance across 12 major cancer types.Nature 502:333-339.
28.Merkle,F.T.,Ghosh,S.,Kamitaki,N.,Mitchell,J.,Avior,Y.,Mello,C.,Kashin,S.,Mekhoubad,S.,Ilic,D.,Charlton,M.,et al.2017.Human pluripotent stemcells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations.Nature545:229-233.
29.Kilpinen,H.,Goncalves,A.,Leha,A.,Afzal,V.,Alasoo,K.,Ashford,S.,Bala,S.,Bensaddek,D.,Casale,F.P.,Culley,O.J.,et al.2017.Common geneticvariation drives molecular heterogeneity in human iPSCs.Nature 546:370-375.
30.Martincorena,I.,and Campbell,P.J.2015.Somatic mutation in cancerand normal cells.Science 349:1483-1489.
31.Chung,S.,Leung,A.,Han,B.S.,Chang,M.Y.,Moon,J.I.,Kim,C.H.,Hong,S.,Pruszak,J.,Isacson,O.,and Kim,K.S.2009.Wnt1-lmx1a forms a novelautoregulatory loop and controls midbrain dopaminergic differentiationsynergistically with the SHH-FoxA2 pathway.Cell Stem Cell 5:646-658.
32.Joksimovic,M.,Anderegg,A.,Roy,A.,Campochiaro,L.,Yun,B.,Kittappa,R.,McKay,R.,and Awatramani,R.2009.Spatiotemporally separable Shh domains inthe midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.Proc Natl Acad SciU S A 106:19185-19190.
33.Joksimovic,M.,Yun,B.A.,Kittappa,R.,Anderegg,A.M.,Chang,W.W.,Taketo,M.M.,McKay,R.D.,and Awatramani,R.B.2009.Wnt antagonism of Shhfacilitates midbrain floor plate neurogenesis.Nat Neurosci 12:125-131.
34.Arenas,E.,Denham,M.,and Villaescusa,J.C.2015.How to make amidbrain dopaminergic neuron.Development 142:1918-1936.
35.Tao,Y.,and Zhang,S.C.2016.Neural Subtype Specification from HumanPluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell 19:573-586.
36.Chambers,S.M.,Fasano,C.A.,Papapetrou,E.P.,Tomishima,M.,Sadelain,M.,and Studer,L.2009.Highly efficient neural conversion of human ES and iPScells by dual inhibition of SMAD signaling.Nat Biotechnol 27:275-280.
37.Kriks,S.,Shim,J.W.,Piao,J.,Ganat,Y.M.,Wakeman,D.R.,Xie,Z.,Carrillo-Reid,L.,Auyeung,G.,Antonacci,C.,Buch,A.,et al.2011.Dopamine neuronsderived from human ES cells efficiently engraft in animal models ofParkinson's disease.Nature 480:547-551.
38.Porter,A.G.,and Janicke,R.U.1999.Emerging roles of caspase-3 inapoptosis.Cell Death Differ 6:99-104.
39.Cummings,B.S.,and Schnellmann,R.G.2004.Measurement of cell deathin mammalian cells.Curr Protoc Pharmacol Chapter 12:Unit 12 18.
40.Lee,M.O.,Moon,S.H.,Jeong,H.C.,Yi,J.Y.,Lee,T.H.,Shim,S.H.,Rhee,Y.H.,Lee,S.H.,Oh,S.J.,Lee,M.Y.,et al.2013.Inhibition of pluripotent stemcell-derived teratoma formation by small molecules.Proc Natl Acad Sci U S A110:E3281-3290.
41.Pennartz,S.,Belvindrah,R.,Tomiuk,S.,Zimmer,C.,Hofmann,K.,Conradt,M.,Bosio,A.,and Cremer,H.2004.Purification of neuronal precursors from theadult mouse brain:comprehensive gene expression analysis provides newinsights into the control of cell migration,differentiation,andhomeostasis.Mol Cell Neurosci 25:692-706.
42.Jiang,Y.,de Bruin,A.,Caldas,H.,Fangusaro,J.,Hayes,J.,Conway,E.M.,Robinson,M.L.,and Altura,R.A.2005.Essential role for survivin in early braindevelopment.J Neurosci 25:6962-6970.
43.Darband,S.G.,Kaviani,M.,Yousefi,B.,Sadighparvar,S.,Pakdel,F.G.,Attari,J.A.,Mohebbi,I.,Naderi,S.,and Majidinia,M.2018.Quercetin:A functionaldietary flavonoid with potential chemo-preventive properties in colorectalcancer.J Cell Physiol 233:6544-6560.
44.Doi,D.,Samata,B.,Katsukawa,M.,Kikuchi,T.,Morizane,A.,Ono,Y.,Sekiguchi,K.,Nakagawa,M.,Parmar,M.,and Takahashi,J.2014.Isolation of humaninduced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cellsorting for successful transplantation.Stem Cell Reports 2:337-350.
45.Samata,B.,Doi,D.,Nishimura,K.,Kikuchi,T.,Watanabe,A.,Sakamoto,Y.,Kakuta,J.,Ono,Y.,and Takahashi,J.2016.Purification of functional human ES andiPSC-derived midbrain dopaminergic progenitors using LRTM1.Nat Commun 7:13097.
46.Guzman,J.N.,Sanchez-Padilla,J.,Chan,C.S.,and Surmeier,D.J.2009.Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.JNeurosci 29:11011-11019.
47.Ungerstedt,U.,and Arbuthnott,G.W.1970.Quantitative recording ofrotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of thenigrostriatal dopamine system.Brain Res 24:485-493.
48.Tieu,K.2011.A guide to neurotoxic animal models of Parkinson'sdisease.Cold Spring Harb Perspect Med 1:a009316.
49.Blandini,F.,and Armentero,M.T.2012.Animal models of Parkinson'sdisease.FEBS J 279:1156-1166.
50.Dowd,E.,Monville,C.,Torres,E.M.,and Dunnett,S.B.2005.The CorridorTask:a simple test of lateralised response selection sensitive to unilateraldopamine deafferentation and graft-derived dopamine replacement in thestriatum.Brain Res Bull 68:24-30.
51.Olsson,M.,Nikkhah,G.,Bentlage,C.,and Bjorklund,A.1995.Forelimbakinesia in the rat Parkinson model:differential effects of dopamine agonistsand nigral transplants as assessed by a new stepping test.J Neurosci 15:3863-3875.
52.Lundblad,M.,Andersson,M.,Winkler,C.,Kirik,D.,Wierup,N.,and Cenci,M.A.2002.Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia anddyskinesia in a rat model of Parkinson's disease.Eur J Neurosci 15:120-132.
53.Grealish,S.,Diguet,E.,Kirkeby,A.,Mattsson,B.,Heuer,A.,Bramoulle,Y.,Van Camp,N.,Perrier,A.L.,Hantraye,P.,Bjorklund,A.,et al.2014.Human ESC-derived dopamine neurons show similar preclinical efficacy and potency tofetal neurons when grafted in a rat model of Parkinson's disease.Cell StemCell 15:653-665.
54.Barker,R.A.,Parmar,M.,Studer,L.,and Takahashi,J.2017.Human Trialsof Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease:Dawn of a NewEra.Cell Stem Cell 21:569-573.
55.Ostrom,Q.T.,Bauchet,L.,Davis,F.G.,Deltour,I.,Fisher,J.L.,Langer,C.E.,Pekmezci,M.,Schwartzbaum,J.A.,Turner,M.C.,Walsh,K.M.,et al.2014.Theepidemiology of glioma in adults:a"state of the science"review.Neuro Oncol16:896-913.
56.Katsukawa,M.,Nakajima,Y.,Fukumoto,A.,Doi,D.,and Takahashi,J.2016.Fail-Safe Therapy by Gamma-Ray Irradiation Against Tumor Formation byHuman-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Progenitors.Stem Cells Dev25:815-825.
57.Hargus,G.,Cooper,O.,Deleidi,M.,Levy,A.,Lee,K.,Marlow,E.,Yow,A.,Soldner,F.,Hockemeyer,D.,Hallett,P.J.,et al.2010.Differentiated Parkinsonpatient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brainand reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats.Proc Natl Acad Sci U S A 107:15921-15926.
58.Rhee,Y.H.,Ko,J.Y.,Chang,M.Y.,Yi,S.H.,Kim,D.,Kim,C.H.,Shim,J.W.,Jo,A.Y.,Kim,B.W.,Lee,H.,et al.2011.Protein-based human iPS cells efficientlygenerate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinsondisease.J Clin Invest 121:2326-2335.
59.Effenberg,A.,Stanslowsky,N.,Klein,A.,Wesemann,M.,Haase,A.,Martin,U.,Dengler,R.,Grothe,C.,Ratzka,A.,and Wegner,F.2015.Striatal Transplantationof Human Dopaminergic Neurons Differentiated From Induced Pluripotent StemCells Derived From Umbilical Cord Blood Using Lentiviral Reprogramming.CellTransplant 24:2099-2112.
60.Samata,B.,Kikuchi,T.,Miyawaki,Y.,Morizane,A.,Mashimo,T.,Nakagawa,M.,Okita,K.,and Takahashi,J.2015.X-linked severe combined immunodeficiency(X-SCID)rats for xeno-transplantation and behavioral evaluation.J NeurosciMethods 243:68-77.
61.Kikuchi,T.,Morizane,A.,Doi,D.,Okita,K.,Nakagawa,M.,Yamakado,H.,Inoue,H.,Takahashi,R.,and Takahashi,J.2017.Idiopathic Parkinson's diseasepatient-derived induced pluripotent stem cells function as midbraindopaminergic neurons in rodent brains.J Neurosci Res 95:1829-1837.
62.Lehnen,D.,Barral,S.,Cardoso,T.,Grealish,S.,Heuer,A.,Smiyakin,A.,Kirkeby,A.,Kollet,J.,Cremer,H.,Parmar,M.,et al.2017.IAP-Based Cell SortingResults in Homogeneous Transplantable Dopaminergic Precursor Cells Derivedfrom Human Pluripotent Stem Cells.Stem Cell Reports 9:1207-1220.
63.Wakeman,D.R.,Hiller,B.M.,Marmion,D.J.,McMahon,C.W.,Corbett,G.T.,Mangan,K.P.,Ma,J.,Little,L.E.,Xie,Z.,Perez-Rosello,T.,etal.2017.Cryopreservation Maintains Functionality of Human iPSC DopamineNeurons and Rescues Parkinsonian Phenotypes In Vivo.Stem Cell Reports 9:149-161.
64.Swistowski,A.,Peng,J.,Liu,Q.,Mali,P.,Rao,M.S.,Cheng,L.,and Zeng,X.2010.Efficient generation of functional dopaminergic neurons from humaninduced pluripotent stem cells under defined conditions.Stem Cells 28:1893-1904.
65.Kikuchi,T.,Morizane,A.,Doi,D.,Magotani,H.,Onoe,H.,Hayashi,T.,Mizuma,H.,Takara,S.,Takahashi,R.,Inoue,H.,et al.2017.Human iPS cell-deriveddopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.Nature548:592-596.
其它实施方案
应当理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (29)

1.生成中脑多巴胺能祖细胞(mDAP)群体的方法，所述方法包括：
提供诱导多能干细胞(iPSC)群体，优选人iPSC；
在生物基质水凝胶支持物中以每个区域约5,000-20,000个细胞，优选约10,000个细胞的密度将所述细胞群体铺板于离散的、单独的区域中，所述区域之间有足够的距离以保持所述区域之间的分离；以及
将所述细胞保持在足以将所述iPSC分化成mDAP的条件下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物基质水凝胶支持物是基底膜提取物或合成基质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在铺板之前将所述细胞悬浮在所述凝胶中。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述区域的直径为约2-10mm。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述区域之间的所述距离为1-3cm。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述iPSC表达碱性磷酸酶(AP)和TRA-1-60。
7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述mDAP表达一种、两种或更多种标志物，其包含FOXA2、OTX2、LMX1A和/或EN1，优选至少FOXA2和LMX1A；任选地，其中所述mDAPS是共表达FOXA2、LMX1A和NURR1的TH+细胞。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法生成，所述方法包括：
从受试者获得原代细胞群体，优选地，其中所述原代细胞是成纤维细胞、毛发角质形成细胞、血细胞或骨髓间充质干细胞(MSC)；
诱导所述细胞中OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的表达；以及
将所述细胞保持在足以将所述原代细胞变成iPSC的条件下。
9.根据权利要求8所述的方法，其中诱导OCT4、KLF4、SOX2和L-MYC的表达包括用多顺反子附件体载体转染所述原代细胞，所述多顺反子附件体载体包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列。
10.根据权利要求1至9所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法来生成，所述方法包括：在所述细胞中表达一种或多种选自下组的外源性微小RNA(miRNA)，所述组由以下各项组成：miR-106a、-106b、-136s、-200c、-302s、-369s和-371/373。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述miRNA包含miR-302s和miR-200c中的一种或两种。
12.根据权利要求11所述的方法，其包括将包含编码miR-302s和miR-200c的序列的附件体载体引入到所述细胞中。
13.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述iPSC通过以下方法来生成，所述方法包括：在所述原代细胞中表达OCT4、KLF4、SOX2、miR-302s和miR-200c中的全部。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括对所述细胞引入：(i)载体，优选病毒载体或多顺反子附件体载体，其包含与口蹄病病毒2A序列连接的人Oct4(OCT4-F2A)、KLF4、与猪捷申病毒2A序列连接的SOX2(SOX2-P2A)和L-MYC编码序列，或Oct4、KLF4、SOX2和L-MYC的成熟RNA，或相应的蛋白质；以及(ii)载体，优选病毒载体或附件体载体，其包含编码miR-302s和miR-200c或成熟miR-302s和miR-200c的序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
16.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括减少未分化的iPSC，优选地通过抑制BIRC5基因进行。
17.包含mDAP的细胞群体，其通过权利要求1至16的方法制备。
18.组合物，其包含根据权利要求17所述的细胞群体。
19.治疗患有或有风险形成帕金森氏病(PD)的受试者的方法，所述方法包括：
获得原代体细胞，优选地从所述患有或有风险形成PD的受试者获得，并且从所述原代细胞生成iPSC；
优选地，所述iPSC用槲皮素处理足够的时间以减少SOX1阳性、KI67阳性、SOX1/KI67双阳性、SOX1/PAX6双阳性和SOX1/PAX6/KI67三阳性细胞的数目；
通过权利要求1至16的方法生成包含mDAP的细胞群体；以及
将所述细胞群体施用于所述受试者。
20.根据权利要求19所述的方法，其中通过直接植入所述受试者脑的受影响区域中或在该受影响区域附近植入来施用所述细胞，优选地双侧植入尾状核、壳核和黑质中的一个或多个中，任选地使用磁共振成像引导的立体定向手术。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞经由注射来施用，优选地使用创建跨越壳核矢状范围的柱的装置，优选地具有三条轨道，优选地具有单个高的旁矢状面皮质进入点。
22.根据权利要求21所述的方法，其中施用约100万、200万、300万、400万、500万、600万、700万或800万个细胞的剂量，优选地，其中将所述细胞平均分配在所述三条轨道中。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中对两个半球进行治疗，并且在第一次治疗中将所述细胞施用于第一半球，并且在第二次治疗中将所述细胞施用于另一半球。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一次和第二次治疗之间的时间为约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、48个月、54个月或60个月。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中在术前、围手术期和/或术后施用至少一种抗生素。
26.用于培养细胞的培养皿，其中所述皿的下侧刻有具有线间间距为1.5-2.5cm的网格，优选2x2 cm网格。
27.根据权利要求26所述的培养皿，其中所述网格以所述皿的一部分形成，打印或蚀刻在所述下侧上。
28.根据权利要求26所述的培养皿，其包含聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚乙烯基热塑性树脂。
29.根据权利要求26所述的培养皿，其包含布置于其中的生物基质水凝胶支持物层，优选地基底膜提取物或合成基质。
CN202080052998.3A 2019-05-23 2020-05-21 用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法 Pending CN114174498A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962852008P 2019-05-23 2019-05-23
US62/852,008 2019-05-23
US201962949906P 2019-12-18 2019-12-18
US62/949,906 2019-12-18
PCT/US2020/034098 WO2020237104A1 (en) 2019-05-23 2020-05-21 Autologous cell replacement therapy for parkinson's disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114174498A true CN114174498A (zh) 2022-03-11

Family

ID=73458688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080052998.3A Pending CN114174498A (zh) 2019-05-23 2020-05-21 用于帕金森氏病的自体细胞替代疗法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220243174A1 (zh)
EP (1) EP3972617A4 (zh)
JP (1) JP2022534693A (zh)
KR (1) KR20220024104A (zh)
CN (1) CN114174498A (zh)
CA (1) CA3141716A1 (zh)
WO (1) WO2020237104A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522425B (zh) * 2020-12-25 2023-11-28 武汉睿健医药科技有限公司 Dpc细胞鉴定分类用标记物基因、筛选方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120064596A1 (en) * 2010-09-13 2012-03-15 Marquette Michele L High-density spot seeding for tissue model formation
US20180051248A1 (en) * 2016-08-16 2018-02-22 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for differentiating pluripotent cells
CN107988261A (zh) * 2008-08-12 2018-05-04 细胞动力国际有限公司 产生ips细胞的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2710124B1 (en) * 2011-05-20 2016-02-24 The McLean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses
US9694036B2 (en) * 2014-03-21 2017-07-04 Cellular Dynamics International, Inc. Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
PL3303564T3 (pl) * 2015-06-01 2022-05-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Metody in vitro różnicowania neuronów dopaminowych śródmózgowia (mda)
WO2017005927A1 (en) * 2015-07-08 2017-01-12 Paris Sciences Et Lettres - Quartier Latin Cell culture device

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107988261A (zh) * 2008-08-12 2018-05-04 细胞动力国际有限公司 产生ips细胞的方法
US20120064596A1 (en) * 2010-09-13 2012-03-15 Marquette Michele L High-density spot seeding for tissue model formation
US20180051248A1 (en) * 2016-08-16 2018-02-22 Cellular Dynamics International, Inc. Methods for differentiating pluripotent cells

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALZANO F等: "MiR200 and miR302: Two Big Families Influencing Stem Cell Behavior", MOLECULES, vol. 23, no. 2, 30 January 2018 (2018-01-30), pages 5 - 7 *
LEE MO等: "Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 110, no. 35, 5 August 2013 (2013-08-05), pages 281, XP055175410, DOI: 10.1073/pnas.1303669110 *
LIU, ZHONGMIN 等: "Looking into the Future: Toward Advanced 3D Biomaterials for Stem-Cell-Based Regenerative Medicine", ADVANCED MATERIALS, vol. 30, no. 17, 30 April 2018 (2018-04-30), pages 2 *
张宝等: "诱导多能干细胞过程中重编程因子导入方法研究进展", 黑龙江畜牧兽医, no. 19, 31 October 2018 (2018-10-31), pages 36 - 40 *
张惠展: "基因工程", vol. 4, 31 January 2017, 华东理工大学出版社, pages: 392 *
陈晓光: "药理学研究的新技术与新方法", vol. 1, 31 March 2014, 中国协和医科大学出版社, pages: 302 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3972617A4 (en) 2023-06-07
US20220243174A1 (en) 2022-08-04
JP2022534693A (ja) 2022-08-03
WO2020237104A1 (en) 2020-11-26
EP3972617A1 (en) 2022-03-30
KR20220024104A (ko) 2022-03-03
CA3141716A1 (en) 2020-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Song et al. Human autologous iPSC–derived dopaminergic progenitors restore motor function in Parkinson’s disease models
US10983111B2 (en) Human trophoblast stem cells and uses thereof
JP6756786B2 (ja) 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン
Balakrishnan et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury
Panciera et al. Induction of expandable tissue-specific stem/progenitor cells through transient expression of YAP/TAZ
JP6316938B2 (ja) Ｈｍｇａ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法
KR102468360B1 (ko) 삼차원 뇌 오가노이드 유래 신경 줄기세포 및 그의 용도
US20180346875A1 (en) Differentiation of cortical neurons from human pluripotent stem cells
JP7471084B2 (ja) 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法
El Ayachi et al. Human dental stem cell derived transgene‐free iPSCs generate functional neurons via embryoid body‐mediated and direct induction methods
Lebedeva et al. The morphofunctional properties of induced pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts and differentiated to dopaminergic neurons
US20220243174A1 (en) Autologous cell replacement therapy for parkinson`s disease
Stančin et al. Human oral mucosa stem cells increase survival of neurons affected by in vitro anoxia and improve recovery of mice affected by stroke through time-limited secretion of miR-514a-3p
US10842822B2 (en) Diagnosis and treatment of parkinson&#39;s disease based on identification and amelioration of liver dysfunction
US20240150709A1 (en) Compositions and methods for making parasympathetic neurons
KR20230165846A (ko) 도파민성 전구세포 및 사용 방법
Xie Modeling SCN1A Epilepsy with Dual Isogenic Pairs of Human iPSC-derived Neurons
Grissom et al. Male-specific deficits in reinforcement learning, motivation, striatal volume, and white-matter integrity in the 16p11. 2del/+ mouse model of autism
Bucchia TRANSPLANTATION OF A SPECIFIC NEURAL STEM CELL SUBPOPULATION AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
EA041083B1 (ru) Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination