EA041083B1 - Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro - Google Patents

Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro Download PDF

Info

Publication number
EA041083B1
EA041083B1 EA201490796 EA041083B1 EA 041083 B1 EA041083 B1 EA 041083B1 EA 201490796 EA201490796 EA 201490796 EA 041083 B1 EA041083 B1 EA 041083B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
neurons
cell
midbrain
population
Prior art date
Application number
EA201490796
Other languages
English (en)
Inventor
Лоренц Студер
Чжае-Вон Шим
Соня Крикс
Original Assignee
Мемориал Слоун-Кеттеринг Кэнсэ Сентр
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мемориал Слоун-Кеттеринг Кэнсэ Сентр filed Critical Мемориал Слоун-Кеттеринг Кэнсэ Сентр
Publication of EA041083B1 publication Critical patent/EA041083B1/ru

Links

Description

Лицензионные права Государства
Настоящее изобретения было сделано при частичной государственной поддержке по гранту NS052671NIH/NINDS и гранту P50 NS047085 NIH/NINDS, полученных от Национального института здравоохранения США (NIH) и Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS). Соответственно, Правительство Соединенных штатов обладает определенными правами на настоящее изобретение.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биологии стволовых клеток, в частности, к области линиеспецифической дифференцировки плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, которые могут включать, но не ограничиваются перечисленными: эмбриональные стволовые клетки человека (hESC, ЭСКч), помимо неэмбриональных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC, иПСКч), соматические стволовые клетки, стволовые клетки от больных пациентов или любые другие клетки, способные к линиеспецифической дифференцировке. В частности, описаны способы обеспечения линиеспецифической дифференцировки ЭСКч и/или иПСКч в клеткипредшественники вентральной пластинки среднего мозга и затем далее в крупные популяции FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга с применением новых условий культивирования. FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовые (ДА) нейроны среднего мозга, полученные с применением способов согласно настоящему изобретению, далее применяют по различным назначениям, включая, но не ограничиваясь, применение в in vitro анализах для разработки лекарственных средств и в качестве терапевтического средства для обращения заболевания, повреждения или недостатка дофаминовых нейронов у пациента. Далее, предложены композиции и способы для обеспечения дифференцировки FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека для применения в моделировании заболеваний, в частности болезни Паркинсона. Кроме природные ДА нейроны содержат большое количество маркеров, таких как CD142, и нейрональные клетки типа A9.
Предпосылки создания изобретения
Популяции клеток, сохраняющие способность дифференцироваться в многочисленные специализированные типы клеток можно применять для разработки большого числа дифференцированных линиеспецифическим образом популяций клеток. Эти популяции клеток, которые сохраняют способность к дальнейшей дифференцировке в специализированные клетки, содержат плюрипотентные клетки. Плюрипотентные клетки могут происходить из эмбриональных и/или неэмбриональных стволовых клеток. Предполагается, что эти популяции линиеспецифически дифференцированных клеток найдут применения в заместительной клеточной терапии для пациентов с заболеваниями, причиной которых является потеря функции определенной популяции клеток. Помимо прямого терапевтического значения, линиеспецифически дифференцированные клетки также представляют собой ценные исследовательские инструменты для различных целей, включая скрининговые in vitro анализы для идентификации и верификации, а также тесты для исследования функций или для исследования доставки терапевтических молекул для лечения заболеваний, связанных с определенными линиями клеток.
Ранее эмбриональные и соматические стволовые клетки применяли в качестве терапевтических средств и модельных систем для нейродегенератвных заболеваний. За последние годы были осуществлены исследовательские и технологические разработки, связанные с направленной дифференцировкой эмбриональных и соматических стволовых клеток, в области заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как хорея Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз. Однако результаты этих исследований показали низкую способность этих клеток обеспечивать восстановление нейрональных функций у пациента при применении in vivo способность этих клеток, и что их применение часто приводит к росту нежелательных опухолей у пациентов.
Соответственно, существует потребность в композициях и способах для получения популяций клеток, пригодных для применения как в исследованиях, таки в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний, причиной которых является потеря клеток, обладающих определенной функцией.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к области биологии стволовых клеток, в частности линиеспецифической дифференцировки плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, которые могут включать, но не ограничиваются следующими: эмбриональные стволовые клетки человека (hESC, ЭСКч), а также неэмбриональные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC, иПСКч), соматические стволовые клетки, стволовые клетки от пациентов с заболеванием или любые другие клетки, способные к линиеспецифической дифференцировке.
В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro, охарактеризованный в следующих пп.1-32.
1) Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro, включающий осуществление контакта плюрипотентных стволовых клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), и осуществление контакта указанных клеток с активатором передачи сигнала SHH (Sonic hedgehog) и активатором передачи сигнала wingless (Wnt), причем контакт
- 1 041083 указанных клеток с активатором передачи сигнала Wnt осуществляют в промежуток времени с третьего (3) по одиннадцатый (11) день после первичного контакта клеток с ингибитором передачи сигнала
SMAD с получением популяции клеток, причем более 10% указанной популяции клеток экспрессирует как белок forkhead box A2 (FOXA2), так и LIM гомеобокс-содержащий фактор транскрипции 1 альфа (LMX1A).
2) Способ по п.1, в котором указанная передача сигнала SMAD включает передачу сигнала ТФРβ/активин-нодаль.
3) Способ по п.1 или 2, в котором указанная передача сигнала SMAD включает передачу сигнала белка морфогенеза костей (BMP).
4) Способ по любому из пп.1-3, в котором по меньшей мере 20% указанной популяции клеток экспрессирует как белок FOXA2, так и LMX1A.
5) Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что клетки приводят в контакт с активатором передачи сигнала белка SHH по меньшей мере между 24 и 36 ч от первичного контакта клеток с ингибитором SMAD.
6) Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что клетки приводят в контакт с активатором передачи сигнала wingless (Wnt) по меньшей мере между 24 и 36 ч от первичного контакта клеток с активатором передачи сигнала белка SHH.
7) Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что по меньшей мере 40% указанной популяции клеток экспрессирует белок FOXA2 и LMX1A.
8) Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанные плюрипотентные стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из неэмбриональных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, индуцированных неэмбриональных плюрипотентных стволовых клеток и модифицированных плюрипотентных стволовых клеток человека, примата, отличного от человека, или грызуна.
9) Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, экспрессирующая FOXA2 и LMX1A, дополнительно экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из тирозингидроксилазы (TH), ортодентикл гомеобокс 2 (OTX2), родственного ядерному рецептору белка 1 (NURR1), нейрон-специфичного бета-тубулина класса III (Tuj1), фактора 3 семейства трилистника (TTF3), гомеобоксного белка 3, содержащего домен, подобный спаренному 3 (PITX3), комплекса achaete-scute (ASCL), раннего фактора 1 B-клеток (EBF-1), раннего фактора 3 Bклеток (EBF-3), транстиретина (TTR), синапсина, транспортера дофамина (DAT), сопряженного с Gбелком калиевого канала внутреннего выпрямления (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 и CD99.
10) Способ по любому из пп.1-9, в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются в указанную популяцию клеток в течение 11 дней от первичного контакта указанных клеток с по меньшей мере одним ингибитором передачи сигнала SMAD.
11) Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются в дофаминовые нейроны не позднее 25 дней после первичного контакта указанных клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD.
12) Способ по п.11, отличающийся тем, что по меньшей мере 20% указанных дофаминовых нейронов экспрессирует FOXA2 и LMX1A и дополнительно экспрессирует по меньшей мере еще один маркер дофаминовых нейронов среднего мозга человека подтипа A9, выбранный из группы, состоящей из Girk2, CD142 и DCSM1.
13) Способ по п.11 или 12, дополнительно включающий отбор популяции дофаминовых нейронов, экспрессирующей CD142 или DCSM1, или оба маркера.
14) Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что указанная популяция клеток характеризуется существенно низким уровнем экспрессии по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из PAX6, EMX2 и LHX2.
15) Способ по любому из пп.1-14, дополнительно включающий осуществление контакта указанной популяции клеток с мозговым нейротрофным фактором (BDNF), аскорбиновой кислотой (AA), нейротрофным фактором глиальных клеток (GDNF), дибутирил цАМФ (dbcAMP) и трансформирующим фактором роста типа β3 (TGFe3) с получением дофаминовых нейронов.
16) Способ по любому из пп.1-15, дополнительно включающий осуществление контакта указанной популяции клеток с активатором передачи сигнала FGF.
17) Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный активатор сигнала FGF представляет собой FGF8.
18) Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала FGF осуществляют в течение до 144 ч с первичного контакта указанных клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD.
19) Способ по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что указанный ингибитор сигнала SMAD выбран из группы, состоящей из LDN-193189, SB431542, Noggin, дорсоморфина и комбинаций перечисленного выше.
20) Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что указанный ингибитор сигнала SMAD
- 2 041083 представляет собой 4-[4-(1,3-бензодиоксол-5 -ил)-5-(2-пиридинил)-1 Н-имидазол-2-ил] бензамид (SB431542).
21) Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что активатор передачи сигнала SHH выбран из группы, состоящей из SHHs, агонистов Smoothened (SAGs) и комбинаций перечисленного выше.
22) Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что активатор передачи сигнала SHH представляет собой агонисты Smoothened (SAG).
23) Способ по п.21 или 22, отличающийся тем, что указанный SAG представляет собой пурморфамин.
24) Способ по п. 21, отличающийся тем, что указанный SHH представляет собой рекомбинантный белок SHH.
25) Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок SHH по меньшей мере на 95% идентичен N-концевому фрагменту мышиного SHH.
26) Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок SHH представляет собой SHH C25II.
27) Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала wingless (Wnt) представляет собой соединение, способное снижать передачу сигнала гликогенсинтазы 3бета 3β (GSK3e).
28) Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала Wnt выбран из группы, состоящей из CHIR99021, Wnt3A, Wnt1 и комбинации перечисленного выше.
29) Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала Wnt представляет собой CHIR99021.
30) Способ по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что указанные клетки приводят в контакт с двумя ингибиторами передачи сигнала SMAD, которые представляют собой SB431542 и LDN-193189, и активатор сигнала wingless (Wnt) представляет собой CHIR99021.
31) Способ по любому из пп.1-30, дополнительно включающий трансфекцию указанных плюрипотентных стволовых клеток полисиалилтрансферазой (PST) перед приведением указанных плюрипотентных стволовых клеток в контакт с ингибитором передачи сигнала SMAD.
32) Способ по любому из пп.1-30, дополнительно включающий обработку указанной популяции клеток экзогенной PST.
В частности, описаны способы обеспечения линиеспецифической дифференцировки ЭСКч и/или иПСКч в клыетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга и затем далее в крупные популяции FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга с применением новых условий культивирования. FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовые (ДА) нейроны среднего мозга, полученные с применением способов согласно настоящему изобретению, далее применяют по различным назначениям, включая, но не ограничиваясь, применением в in vitro анализах для разработки лекарственных средств, в неврологических исследованиях и в качестве терапевтического средства для обращения заболевания, повреждения или недостатка дофаминовых нейронов у пациента. Далее, предложены композиции и способы для обеспечения дифференцировки FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека для применения в моделировании заболеваний, в частности болезни Паркинсона. Кроме того, природные ДА нейроны содержат большое количество маркеров, таких как CD142, и нейрональные клетки типа A9.
Набор, содержащий первый ингибитор передачи сигнала, второй ингибитор передачи сигнала и третий ингибитор передачи сигнала, где указанный первый ингибитор способен снижать передачу сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFe, ТФР-бета)/Нодаль-активина, указанный второй ингибитор способен снижать передачу сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), и указанный третий ингибитор способен снижать передачу сигнала киназы гликогенсинтазы 3-бета (GSK3e) для активации Wnt(wingless). В одном варианте реализации указанный первый ингибитор представляет собой LDN-193189. В других вариантах реализации указанный первый ингибитор выбран из группы, состоящей из LDN-193189, его производных и их смесей. В одном варианте реализации указанный второй ингибитор представляет собой SB431542. В других вариантах реализации указанный второй ингибитор выбран из группы, состоящей из SB431542, его производных и их смесей. В одном варианте реализации указанный третий ингибитор представляет собой CHIR99021. В других вариантах реализации указанный третий ингибитор выбран из группы, состоящей из CHIR99021, его производных и их смесей. В одном варианте реализации указанный набор дополнительно содержит активатор передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) и активатор передачи сигнала семейства рецептора фактора роста фибробластов (FGF,ФРФ) 8. В одном варианте реализации указанный набор дополнительно содержит нейротрофический фактор мозга (BDNF), аскорбиновую кислоту (АК), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ и трансформирующий фактор роста типа β3. В одном варианте реализации указанный набор дополнительно содержит антитела, выбранные из группы, состоящей из антител к тирозингидроксилазе (TH), антитела к белку forkhead box A2 (FOXA2) и антитело к LIM и гомеобокссодержащемк фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A). В одном варианте реализации указанный набор
- 3 041083 дополнительно содержит клетку, выбранную из группы, состоящей из стволовой клетки, эмбриональной стволовой клетки, индуцированной плюрипотентной стволовой клетки и модифицированной клетки. В одном варианте реализации указанный набор дополнительно содержит инструкции по обеспечению дифференцировки клеток-предшественников и FOXA2/LMX1A+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга. В одном варианте реализации указанный набор дополнительно содержит инструкции по получению клетки от пациента, больного болезнью Паркинсона (БП).
Композиция, содержащая популяцию клеток в контакте с первым ингибитором передачи сигнала и вторым ингибитором передачи сигнала, где больше 40% указанной популяции клеток положительно по белку forkhead box A2 (FOXA2), где указанная популяция клеток была ранее приведена в контакт с первым ингибитором передачи сигнала, третьим ингибитором передачи сигнала и активатором передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH), причем указанный первый ингибитор способен снижать передачу сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/Активин-нодаль, указанный второй ингибитор способен снижать передачу сигнала киназы гликогенсинтазы 3-бета (GSK3e) для активации передачи сигнала Wnt(wingless), и указанный третий ингибитор способен снижать передачу сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic). В одном варианте реализации указанный первый ингибитор представляет собой низкомолекулярное соединение, выбранное из группы, состоящей из LDN-193189, его производных и их смесей. В одном варианте реализации указанный второй ингибитор выбран из группы, состоящей из CHIR99021 и его производных. В одном варианте реализации указанный третий ингибитор выбран из группы, состоящей из SB431542, его производных и их смесей. В одном варианте реализации указанный активатор передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) выбран из группы, состоящей из Низкомолекулярного агониста рецептора Smoothened (SMO) и Sonic hedgehog (SHH) C25II, причем указанный агонист представляет собой пурморфамин. В некоторых вариантах реализации указанную популяции клеток дополнительно предварительно приводили в контакт с фактором роста фибробластов 8 (FGF8). В одном варианте реализации указанное большинство клеток, составляющих указанную популяцию являются белок forkhead box A2 (FOXA2)+, LIM+гомеобокс-содержащий фактор транскрипции 1, альфа (LMX1A)+, NGN2+ и DDC+ клетками-предшественниками вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из клеток грызуна, клеток приматов и клеток человека. В одном варианте реализации указанные клетки получены из клеток пациента с болезнью Паркинсона (БП). В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 50% положительна по белку forkhead box A2 (FOXA2). В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 60% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 70% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 80% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 90% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 95 до 100% положительна по белку forkhead box A2.
Композиция, содержащая in vitro популяцию клеток, где большинство клеток, составляющих указанную популяцию клеток, являются тирозингидроксилаза (TH)+, белок forkhead box A2 (FOXA2)+, LIM+гомеобокс-содержащий фактор транскрипции 1, альфа (LMX1A)+ дофаминовыми (ДА) нейронами вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанные более 40% указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга положительны по тирозингидроксилазе (TH+). В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 50% положительна по тирозингидроксилазе. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 60% положительна по тирозингидроксилазе. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 70% положительна по тирозингидроксилазе. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 80% положительна по тирозингидроксилазе. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 90% положительна по тирозингидроксилазе. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 95% до 100% положительна по тирозингидроксилазе. В некоторых вариантах реализации указанная популяция клеток содержит большей частью дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны среднего мозга. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга положительны по маркерам, выбранным из группы, состоящей из: ядерного рецептора NURR1 (NR4A2), нейрон-специфичного бета-тубулина класса III (Tuj1), фактора 3 семейства трилистника (TTF3), гомеобоксного белка 3, содержащего домен, подобный спаренному и гомеобок белка 3 (PITX3), комплекса achaete-scute(ASCL), раннего фактора 1 B-клеток(EBF-1), раннего факторе 3 B-клеток (EBF-3) и транстиретина (TTR). В одном варианте реализации указанная популяция FOXA2/LMX1A+ дофаминовых (ДА) рецепторов среднего мозга положительна по соединению, выбранному из группы, состоящей из ДА, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) и гомованилиновой кислоты (HVA). В одном варианте реализации указанный маркер выбран из группы, состоящей из белка и нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации указанная популяция FOXA2/LMX1A+ дофаминовых (ДА) рецепторов среднего мозга способна приживаться in vivo у пациента, выбранного из группы, состоящей из паци- 4 041083 ента с болезнью Паркинсона (БП). В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА)
FOXA2/LMX1A+ нейроны среднего мозга способны приживаться in vivo и выполнять функцию дофаминовых (ДА) нейронов.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую популяцию клеток в контакте с LDN-193189 и CHIR99021, где больше 40% указанной популяции клеток положительно по белку forkhead box A2 (FOXA2), и где указанная популяция клеток была ранее приведена в контакт с LDN-193189, SB431542, активатором передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) и CHIR99021. В одном варианте реализации указанный активатор передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) выбран из группы, состоящей из Sonic hedgehog (SHH) C25II и пурморфамина. В одном варианте реализации указанные более 10% указанной популяции клеток дважды положительны по белку forkhead box A2 (FOXA2) и кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A). В одном варианте реализации указанная большая часть указанной популяции клеток представляет собой популяцию клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанную популяцию предварительно приводят в контакт с фактором роста фибробластов 8 (FGF8). В одном варианте реализации указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из клеток грызуна, клеток примата и клеток человека. В одном варианте реализации указанные клетки человека представляют собой клетки от человека с неврологическим симптомом болезни Паркинсона (БП). В одном варианте реализации указанная популяция клеток получена из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC, иПСК). В одном варианте реализации более 10% указанной популяции клеток выбрано из группы, состоящей из дважды положительных по белку forkhead box A2 (FOXA2)/кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A) и дважды положительных по белку forkhead box A2 (FOXA2)/ортодентикл гомеобокс 2 (OTX2).
В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ индукции направленной дифференцировки клеток в популяцию клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга, включающий a) обеспечение: i) популяции клеток, причем указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из неэмбриональной стволовой клетки, эмбриональной стволовой клетки, индуцированной неэмбриональной плюрипотентной клетки и модифицированной плюрипотентной клетки; и ii) первого ингибитора передачи сигнала, второго ингибитора передачи сигнала, активатора передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) и третьего ингибитора передачи сигнала, где указанный первый ингибитор способен снижать передачу сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активиннодаль, указанный второй ингибитор способен снижать передачу сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), и указанный третий ингибитор способен снижать передачу сигнала киназы гликогенсинтазы 3-бета (GSK3β) для активации передачи сигнала Wnt(wingless); b) осуществление контакта указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором, c) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором далее приведение в контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) в условиях для дифференцировки популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга; и) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) далее приведение в контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором для дифференцировки указанной популяции клеток в популяцию клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации казанный контакт с указанным первым и указанным вторым ингбитором осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации казанный контакт с указанным первым и указанным вторым ингибитором осуществляют в течение 1 ч после посадки клеток in vitro. В одном варианте реализации казанный контакт с указанным первым указанным вторым ингибитором осуществляют в течение 48 ч после посадки клеток in vitro. В одном варианте реализации казанный контакт с указанным первым и указанным вторым ингибитором осуществляют в течение 62 ч после высевание клеток in vitro. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) осуществляют через по меньшей мере 24 и до 36 ч после осуществления контакта указанной популяции клеток с указанным первым и указанный вторым ингибитором. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) составляет до 144 ч. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга среднего мозга. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором осуществляют через по меньшей мере 24 и до 36 ч после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH). В одном
- 5 041083 варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором составляет до 192 ч. В одном варианте реализации указанная популяция клеток дифференцируется в указанные клетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга к по меньшей мере 11 дню после приведения к контакт указанных клеток с указанным первым и указанным указанный вторым ингибитором. В одном варианте реализации указанный первый ингибитор представляет собой SB431542. В одном варианте реализации указанный второй ингибитор представляет собой LDN-193189. В одном варианте реализации указанный третий ингибитор представляет собой CHIR99021. В одном варианте реализации указанный активатор передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) выбран из группы, состоящей из Sonic hedgehog (SHH) C25II и пурморфамина. В одном варианте реализации в указанном способе дополнительно обеспечивают фактор роста фибробластов 8 (FGF8) и приводят в контакт указанную популяцию клеток с указанным FGF8 в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток в указанным FGF8 осуществляют через по меньшей мере 24 ч и до 36 ч после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором. В одном варианте реализации указанный контакт указанных клеток с указанным FGF8 составляет до 144 ч. В одном варианте реализации указанная популяция клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга содержит более 40 forkhead box A2 (FOXA2)+ клеток. В одном варианте реализации указанная популяция клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга содержит более 40% клеток, положительных по forkhead box A2 (FOXA2), кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A). В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает этап e) приведения в контакт указанной популяции клетокпредшественников вентральной пластинки среднего мозга со средой для созревания нейронов, причем указанная среда содержит среду N2, нейротрофический фактор мозга (BDNF), аскорбиновую кислоту (AA), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ (dbcAMP) и трансформирующий фактор роста типа β3, для дифференцировки клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга в дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает этап e) приведения в контакт указанной популяции клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга со средой для созревания нейронов с добавкой B27 для дифференцировки клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга в дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанные клетки, приведенные в контакт с нейробазальной средой с добавкой B27, приводят в контакт с нейротрофическим фактором мозга (BDNF), аскорбиновой кислотой (AA), нейротрофическим фактором глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ (dbcAMP) и трансформирующим фактором роста типа β3 для дифференцировки клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга в дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга положительны по белку forkhead box A2 (FOXA2), кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A), родственный ядерному рецептору белку 1 (NURR1) и тирозингидроксилазе (TH). В одном варианте реализации более 40% указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга положительны по тирозингидроксилазе (TH)+. В одном варианте указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга дифференцируется к по меньшей мере 25 дню после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанный вторым ингибитором. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга положительны по маркерам, идентифицирующим молекулы. В одном варианте реализации указанные маркеры выбраны из группы, состоящей из тирозингидроксилазы (TH), белка forkhead box A2 (FOXA2), кодируемого гомеобоксным геном LIM фактора транскрипции 1, дофамина, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) и гомованилиновой кислоты (HVA), альфа, ядерного рецептора NURR1 (NR4A2), нейрон-специфичного бета-тубулина класса III (Tuj1), TTF3, гомеобоксного белка 3, содержащего домен, подобный спаренному, 3 (PITX3), комплекс achaete-scute(ASCL), ранний фактор 1 B-клеток(EBF-1), ранний фактор 3 B-клеток (EBF-3), транстиретин(TTR), синапсин, транспортер дофамина (DAT) и сопряженного с G-белком калиевого канала внутреннего выпрямления (Kir3.2/GIRK2). В одном варианте реализации указанная молекула выбрана из группы, состоящей из белка и нуклеиновой кислоты. В одном варианте реализации указанную молекулу идентифицируют с применением маркера, выбранного из группы, состоящей из антитела, ПЦР-праймера, последовательности нуклеиновой кислоты и тесте с применением фермента. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга способны приживаться in vivo у пациента с болезнью Паркинсона (БП) и обеспечивать функцию дофаминовых (ДА) нейронов. В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает, обеспечение пациента, нуждающегося в дофамин-продуцирующих нейронах, причем указанный пациент демонстрирует по меньшей мере один неврологический симптом, у этап трансплантации дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга указанному пациенту для обеспечения функции дофаминовых (ДА) нейронов. В одном
- 6 041083 варианте реализации указанные неврологические симптомы выбраны из группы, состоящей тремора, брадикинезии (сильной замедленности движений), сутулой позы, постуральной неустойчивости и ригидности. В одном варианте реализации у указанного пациента происходит снижение выраженности указанного неврологического симптома. В одном варианте реализации указанная клетка выбрана из клетки грызуна, клетки примете и клетки человека. В одном варианте реализации указанные клетки человека представляют собой клетки от человека с неврологическим симптомом болезни Паркинсона (БП). В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ обеспечения приживления in vivo для терапевтического лечения, включающий a) обеспечение: i) популяции дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга, где больше 40% указанной популяции экспрессируют тирозингидроксилазу (TH); и ii) субъекта, причем у указанного субъекта наблюдают по меньшей мере один неврологический симптом; и b) трансплантацию указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга указанному субъекту в условиях, обеспечивающих приживление in vivo для обеспечения функции дофаминовых (ДА) нейронов. В одном варианте реализации указанные неврологические симптомы выбраны из группы, состоящей из тремора, брадикинезии (сильной замедленности движений), сутулой позы, постуральной неустойчивости и ригидности. В одном варианте реализации у указанного субъекта происходит снижение выраженности указанного неврологического симптома. В одном варианте реализации указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга, обработанных в соответствии со способами согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга, обработанных в соответствии со способом, дополнительно включающим этап приведения в контакт указанной популяции клетокпредшественников вентральной пластинки среднего мозга со средой для созревания нейронов, причем указанная среда содержит среду N2, нейротрофический фактор мозга (BDNF), аскорбиновую кислоту (AA), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ и трансформирующий фактор роста типа β3 для дифференцировки клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга в дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанная популяция клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток, обработанной в соответствии со способом согласно настоящим изобретениям. В одном варианте реализации указанная популяция клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток, обработанной в соответствии со способом индукции направленной дифференцировки клеток в популяцию клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга, включающим a) обеспечение: i) популяции клеток, причем указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из неэмбриональной стволовой клетки, эмбриональной стволовой клетки, индуцированной неэмбриональной плюрипотентной клетки и модифицированной плюрипотентной клетки; и ii) первого ингибитора передачи сигнала, второго ингибитора передачи сигнала, активатора передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH), и третьего ингибитора передачи сигнала, где указанный первый ингибитор способен снижать передачу сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активинНодаль, указанный второй ингибитор способен снижать передачу сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), и указанный третий ингибитор способен снижать передачу сигнала киназы гликогенсинтазы 3-бета (GSK3e) для активации передачи сигнала Wnt(wingless); b) приведение в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором, c) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором далее приведение в контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) в условиях для дифференцировки популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга; и d) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) далее приведение в контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором для дифференцировки указанной популяции клеток в популяцию клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток, выбранной из группы, состоящей из животных, приматов и людей. В одном варианте реализации указанные клетки человека являются клетками пациента с симптомом болезни Паркинсона (БП).
В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую популяцию клеток в контакте с LDN-193189 и CHIR99021, где больше 40% указанной популяции клеток положительно по белку forkhead box A2 (FOXA2), и где указанная популяция клеток была ранее приведена в контакт с LDN-193189, SB431542, активатором передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) и CHIR99021, причем указанный активатор передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) выбран из группы, состоящей из Sonic hedgehog (SHH) C25II и пурморфамина. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 50% положительна по белку forkhead box A2 (FOXA2). В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 60% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 70% поло
- 7 041083 жительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 80% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 90% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации указанная популяция клеток по меньшей мере на 95 до 100% положительна по белку forkhead box A2. В одном варианте реализации более 10% указанной популяции клеток выбрано из группы, состоящей из клеток, дважды положительных: по белку forkhead box A2 (FOXA2)/кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A), и дважды положительных: по белку forkhead box A2 (FOXA2)/LIM гомеобокс 2 (OTX2). В одном варианте реализации указанная популяция клеток является положительной по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, по меньшей мере на 95 до 100%. В одном варианте реализации по меньшей мере 20% указанной популяции клеток положительно по маркеру, выбранному из группы, состоящей из Nurr1+, CD142, DCSM1, CD63 и CD99. В некоторых вариантах реализации указанная популяция клеток является положительной по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, по меньшей мере на 95 до 100%. В некоторых вариантах реализации указанная популяция клеток является положительной по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, по меньшей мере на 95 до 100%. В одном варианте реализации указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из клеток грызуна, клеток примата, клеток человека и клеток человека от пациента с неврологическим симптомом болезни Паркинсона (БП). В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ индукции направленной дифференцировки клеток в популяцию клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга, включающий, a) обеспечение: i) популяции клеток, причем указанная популяция клеток выбрана из группы, состоящей из неэмбриональной стволовой клетки, эмбриональной стволовой клетки, индуцированной неэмбриональной плюрипотентной клетки и модифицированной плюрипотентной клетки; и ii) первого ингибитора передачи сигнала, второго ингибитора передачи сигнала, активатора передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) и третьего ингибитора передачи сигнала, причем указанный первый ингибитор представляет собой SB431542, указанный второй ингибитор представляет собой LDN193189, указанный активатор передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) выбран из группы, состоящей из Sonic hedgehog (SHH) C25II и пурморфамина, и указанный третий ингибитор представляет собой CHIR99021; b) приведение в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанный второй ингибитор, причем казанный контакт с указанным первым и указанным вторым ингибитором осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга, таким образом, что указанный контакт с указанным первым и указанным вторым ингибитором осуществляют в течение 48 ч после посадки клеток in vitro, c) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанным вторым ингибитором далее приведение в контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) в условиях для дифференцировки популяции клетокпредшественников вентральной пластинки среднего мозга; и d) после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) далее приведение в контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором для дифференцировки указанной популяции клеток в популяцию клеток-предшественником вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки асреднего мозга, таким образом, что указанный контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH) осуществляют по меньшей мере через 24 и до 36 ч после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным первым и указанный вторым ингибитором. В одном варианте реализации контакт указанных клеток с указанным третьим ингибитором осуществляют в условиях, допускающих возможность получения указанной дифференцированной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга, таким образом, что указанный контакт указанных клеток с указанный третий ингибитор осуществляют через по меньшей мере 24 и до 36 ч после приведения в контакт указанной популяции клеток с указанным активатором передачи сигнала Sonic hedgehog (SHH). В одном варианте реализации популяция клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга содержит более 40% клеток. Положительных по белку forkhead box A2 (FOXA2), LIM+гомеобокс-содержащему фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A). В одном варианте реализации способ дополнительно включает этап e) приведения в контакт указанной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга со средой для созревания нейронов, причем указанная среда содержит среду N2, нейротрофический фактор мозга (BDNF), аскорбиновую кислоту (AA), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ и трансформирующий фактор роста типа β3 для дифференцировки клетокпредшественников вентральной пластинки среднего мозга в дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга положительны по набору маркеров, выбранных из группы, состоящей из: белка forkhead box A2 (FOXA2)/кодируемого гомеобоксным геном LIM фактора транскрипции 1 альфа (LMX1A)/тирозингидроксилазе (TH); белка forkhead box A2/ кодируемого гомеобоксным геном LIM фактора транскрипции 1 альфа/тирозингидроксилазы/CD142; белка forkhead box A2/кодируемого
- 8 041083 гомеобоксным геном LIM фактором транскрипции 1 альфа/тирозингидроксилазы/родственного ядерному рецептору белка 1 (NURR1); белка forkhead box Л2/кодируемого гомеобоксным геном LIM фактора транскрипции 1 альфа/тирозингидроксилазы/CD142/родственного ядерному рецептору белка 1 и тирозингидроксилазы/а-синуклеина. В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает этап f) сортировки указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга по экспрессии CD142 в популяцию клеток, по меньшей мере на 80% положительную по CD142. В одном варианте реализации указанные дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга положительны по маркеру, идентифицирующему молекулу, выбранную из группы, состоящей из тирозингидроксилазы (TH), белка forkhead box Л2 (FOXA2), кодируемого гомеобоксным геном LIM фактора транскрипции 1, дофамина, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) и гомованилиновой кислоты (HVA), альфа, ядерного рецептора NURR1 (NR4A2), нейрон-специфичного бета-тубулина класса III (Tuj1), TTF3, гомеобоксного белка 3, содержащего домен, подобный спаренному, 3 (PITX3), комплекса achaete-scute(ASCL), раннего фактора 1 B-клеток(EBF-1), раннего фактора 3 B-клеток (EBF-3), транстиретина (TTR), синапсина, транспортера дофамина (DAT) и сопряженного с G-белком калиевого канала внутреннего выпрямления (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 и CD99. В одном варианте реализации в способе дополнительно берут пациента, нуждающегося в дофаминпродуцирующих нейронах и дополнительно осуществляют этап e) лечения указанного пациента путем трансплантации указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга для обеспечения функции дофаминовых (ДА) нейронов. В одном варианте реализации у указанного пациента есть по меньшей мере один неврологический симптом, выбранный из группы, состоящей из тремора, брадикинезии (сильной замедленности движений), сутулой позы, постуральной неустойчивости и ригидности. В одном варианте реализации у указанного пациента наблюдают наличие по меньшей мере одного неврологического симптома, выбранного из группы, состоящей из тремора, брадикинезии (сильной замедленности движений), сутулой позы, постуральной неустойчивости и ригидности. В одном варианте реализации у указанного пациента происходит снижение выраженности по меньшей мере одного из указанных неврологических симптомов.
В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ приживления in vivo для терапевтического лечения, включающий а) обеспечение: i) популяции дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга, где больше 40% указанной популяции экспрессирует тирозингидроксилазу (TH); и ii) субъекта, причем у указанного субъекта наблюдается по меньшей мере один наврологический симптом, выбранный из группы, состоящей из тремора, брадикинезии (сильной замедленности движений), сутулой позы, постуральной неустойчивости и ригидности; и b) трансплантацию указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга указанному пациенту в условиях, подходящих для in vivo приживления для обеспечения функции дофаминовых (ДА) нейронов. В одном варианте реализации у указанного субъекта происходит снижение выраженности по меньшей мере одного симптома. В одном варианте реализации указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток с применением дополнительно этапа сортировки указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга по экспрессии CD142 в популяцию, по меньшей мере на 80% положительную по CD142. В одном варианте реализации указанную популяцию дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получают из популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга после этапа сортировки указанных дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга по экспрессии CD142 в популяцию клеток, по меньшей мере на 80% положительную по CD142. В одном варианте реализации указанную популяцию дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получают из популяции клеток, выбраннох из группы, состоящей из животных, приматов, людей и пациента с симптомами болезни Паркинсона (БП). В одном варианте реализации указанная популяция дофаминовых (ДА) нейронов вентральной пластинки среднего мозга получена из популяции клеток, выделенных из группы, состоящей из животных, приматов, людей и пациента с симптомами болезни Паркинсона (БП).
Определения.
В настоящем тексте термин моделирование заболевания относится к процессу применения экспериментального организма или культур клеток in vitro для имитации конкретных признаков или симптомов, возникающих у человека в результате заболевания. В одном варианте реализации плюрипотентные стволовые клетки, полученные из модельного животного с генетической мутацией, приводящей к неврологическому расстройству, такому как болезнь Паркинсона (БП), могут выращиваться и дифференцироваться в нервные клетки для идентификации новых характеристик нейронов, связанных с БП. В одном варианте реализации плюрипотентные клетки человека, взятые у лица с генетической мутацией, приводящей к неврологическому расстройству, такому как болезнь Паркинсона (БП), могут выращиваться и дифференцироваться в нервные клетки, имеющие дефект, аналогичный наблюдаемому в организме указанного лица.
В настоящем описании термин паркинсонизм относится к группе заболеваний, каждое их которых связано с дефицитом дофамина в базальных ганглиях, которые являются частью мозга, контроли
- 9 041083 рующей движения. Симптомы включают тремор, брадикинезию (сильную замедленность движений), сутулую позу, постуральную неустойчивость и ригидрость. Диагноз паркинсонизм ставят только в случае наличия по меньшей мере двух из этих симптомов, одним из которых должны быть тремор или брадикинезия. Наиболее распространенной формой паркинсонизма является идиопатическая, или классическая, болезнь Паркинсона (БП), но в случае значительного меньшинства диагнозов, примерно 15 процентов от общего числа, может присутствовать один из паркинсон-плюс синдромов (ППС). Эти синдромы, также известные как атипичный паркинсонизм, включают кортикобазальную дегенерацию, деменцию с тельцами Леви, мультисистемную атрофию и прогессирующий супрануклеарный паралич. В целом, болезнь Паркинсона включает нарушение функции и гибель важнейших нервных клеток в мозге, в первую очередь, в области мозга, называемой черной субстанцией - substantia nigra. Многие из этих важных нервных клеток производят дофамин, поэтому в случае гибели таких нейронов количество дофамина, зависящее от дифференцировки мозга, снижается, что приводит к неспособности нормальн управлять движениями. В кишечнике также имеются дофаминовые клетки, которые разрушаются у пациентов с болезнью Паркинсона, что может быть важным фактором симптомов со стороны ЖКТ, которые являются частью этого заболевания. Комплексы симптомов у разных больных различны. К первым двигательным признакам болезни Паркинсона относятся следующие: тремор кистей, рук, ног, челюсти и лица, брадикинезия или замедленность движений, ригидрость или снижение подвижности суставов и туловища и постуральную неустойчивость или нарушения равновесия и координации.
В настоящем тексте термин субъект относится к млекопитающему (человеку и животным, т.е. животным, не являющимся человеком), который будет реципиентом определенного лечения, включая любой тип контроля. Обычно термины субъект и пациент используются здесь взаимозаменяемо применительно к субъекту-человеку.
В настоящем тексте термин животные, отличные от человека обозначает всех животных, не являющихся человеком, включая позвоночных, таких как грызуны, приматы кроме человека, бараны, быки, жвачные, зайцеобразные, свиньи, козы, лошадиные, собачьи, кошачьи, птицы и т.д., но не ограничиваясь перечисленными.
В настоящем тексте термин дофамин (дофамин) обозначает химическое соединение, продуцируемое дофаминовыми нейронами, которое переносит сигналы в часть мозга, которая содержит нейроны, управляющие движениями и координацией.
В настоящем тексте термин LSB обозначает комбинацию двух компонентов LDN-193189 и SB431542, способную снижать или блокировать передачу сигнала, заключающуюся в передачи сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активин-Нодаль и передачи сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), в клетке.
В настоящем тексте термин SB431542 обозначает соединение, способное снижать или блокировать передачу сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активин-Нодаль, имеющее номер CAS 301836-41-9, молекулярную формулу C22H18N4O3 и название 4-[4-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-5-(2пиридинил)-1H-имидазол-2-ил]-бензамид. См., например, следующую структуру
В одном примере SB431542 представляет собой SB431542 Stemolecule™, Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, США. В настоящем тексте термин LDN-193189 обозначает низкомолекулярное соединение DM-3189, название по ИЮПАК 4-(6-(4-(пиперазин-1-ил)фенил)пиразоло[1,5-а]пиримидин-3ил)хинолин с химической формулой C25H22N6. LDN-193189 может действовать как ингибитор передачи сигнала SMAD. LDN-193189 также является высокоэффективным низкомолекулярным ингибитором ALK2, ALK3 и ALK6, протинтирозинкиназ (PTK), ингибируя передачу сигнала семейств ALK1 и ALK3 рецепторов TGFe I типа, что приводит к ингибированию передачи множества биологических сигналов, включая сигналы белков морфогенеза костей (BMP) BMP2, BMP4, BMP6, BMP7 и цитокина активина и последующему фосфорилированию белков SMAD Smad1, Smad5 Smad8 (Yu et al. (2008) Nat Med 14:1363-1369; Cuny et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18: 4388-4392, указанный источник включен в настоящий текст посредством ссылки).
- 10 041083
В одном примере реализации LDN-193189 представляет собой LDN-193189 Stemolecule™, Stemgent,
Inc. Cambridge, Массачусетс, США.
В настоящем тексте термин ингибитор киназы гликогенсинтазы 3β или ингибитор GSK3e обозначает соединение, которое ингибирует киназу гликогенсинтазы 3β, см., например, Doble, et al., J Cell Sci. 2003;116:1175-1186 (данный источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Для целей настоящего изобретения ингибитор GSK3e способен активировать каскад передачи сигнала WNT, см., например, Cadigan, et al., J Cell Sci. 2006; 119:395-402; Kikuchi, et al., Cell Signaling. 2007;19:659-671 (этот источник включен в настоящее описание посредством ссылки).
В настоящем тексте термин CHIR99021, или CHIR, или аминопиримидин, или 3-[3-(2карбоксиэтил)-4-метилпиррол-2-метилиденил]-2-индолиной соответствует названию 6-(2-(4-(2,4дихлорфенил)-5-(4-метил-1Н-имидазол-2-ил)пиримидин-2-иламино)этиламино)никотиннитрил по ИЮПАК. CHIR99021 является одним из примеров низкомолекулярных ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3β (GSK3e), который активирует каскад передачи WNT и отличается высокой селективностью, демонстрируя приблизительно тысячекартную селективность в отношении панели родственных и неродственных киназ с IC50=6,7 нМ в отношении человеческой GSK3e и наномолярные значения IC50 в отношении гомологичных GSK3e грызунов.
В одном примере реализации CHIR99021 представляет собой CHIR99021 Stemolecule™, Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, США. В настоящем тексте термин пурморфамин обозначает производное пурина, такое как производное, имеющее номер CAS: 483367-10-8. Одним из примеров является соединение, имеющее приведенную ниже структуру, которое активирует каскад Hedgehog, включая направленное воздействие на Smoothened.
В одном примере реализации пурморфамин представляет собой пурморфамин Stemolecule™, Stemgent Inc. Cambridge, Massachusetts (США).
В настоящем тексте термин сигнальный применительно к сигнальному белку относится к белкам, которые активирует или на которые каким-либо другим образом влияет связывание лиганда с мембранным рецепторным белком или какой-либо другой стимул. Примеры сигнальных белков включают SMAD, комплексный белок WNT, в другом варианте реализации, комплексный белок WNT, включая бетка-катенин, белки Sonic hedgehog (SHH), NOTCH, трансформирующий фактор роста бета (TGFe), активин, Нодаль, киназа гликогенсинтазы 3β (GSK3e) и подобные им. Для многих рецепторов клеточной поверхности или внутренних рецепторных белков лиганд-рецепторные взаимодействия не связаны напрямую с ответом клетки. Активированный лигандом рецептор должен сначала провзаимодействовать с другими белками внутри клетки для осуществления конечного физиологического воздействия лиганда на поведение клетки. Часто после активации или ингибирования рецептора происходит изменение поведения цепи из нескольких взаимодействующих клеточных белков. Полный комплекс изменений в клетки, инициируемый активацией рецептора, называется механизмом сигнальной трансдукции (передачи сигнала) или каскадом передачи сигнала.
В настоящем тексте термин LSB/S/F8/CHIR или LSB/SHH/FGF8/CHIR относится к приведению клеток в контакт с LDN-193189 и SB431542 (т.е. LSB) в дополнение к S, активатору белка Sonic Hedgehog, F8, FGF8 и CHIR в соответствии с настоящим изобретением. В отличие от LSB/S/F8, или SHH/FGF8, или SHH/FGF, которые относятся к приведению клеток в контакт с LDN-193189 и SB431542 (т.е. LSB) в дополнение к S, активатору белка Sonic Hedgehog, F8, FGF8, но в отсутствие CHIR, согласно описанным ранее способам. В близких аббревиатурах LDN/SB относится к приведению клеток в контакт с LDN, LDN-193189 и SB, SB431542.
В настоящем тексте термин ингибировать или блокировать означает снижение уровня активности определенного каскада передачи сигнала клетки после обработки соединением (т.е. ингибитором) по сравнению с активностью указанного каскада передачи сигнала в клетке, которую не обрабатывали таким соединением или подвергли контрольной обработке.
В настоящем тексте термин активировать обозначает увеличение уровня активности определен- 11 041083 ного каскада передачи сигнала клетки после обработки соединением (т.е. активатором) по сравнению с активностью указанного каскада передачи сигнала в клетке, которую не обрабатывали таким соединением или подвергли контрольной обработке. Любой уровень ингибирования или активации конкретного каскада передачи сигнала считается вариантом реализации настоящего изобретения, если такое ингибирование или активация приводят к направленной дифференцировки стволовой клетки.
В настоящем тексте термин термин SMAD (или Sma Mothers Against Decapentaplegic или Small Mothers Against Decapentaplegic) относится к сигнальной молекуле.
В настоящем тексте термин WNT или wingless применительно к лиганду обозначает группу секретируемых белков (а именно, Int1 (integration 1) у человека), которые могут взаимодействовать с рецептором WNT, таким как рецептор семейства Frizzled и LRPDerailed/RYK.
В настоящем тексте термин WNT или wingless применительно к каскаду передачи сигнала обозначает путь передачи сигнала, состоящий из лигандов семейства Wnt и рецепторов семейства Wnt, таких как рецепторы Frizzled и LRPDerailed/RYK, опосредуемый β-катенином или без него. Для описанных здесь целей предпочтительный каскад передачи сигнала WNT включает участие β-катенина, т.е. комплекса WNT /β-катенин.
В настоящем тексте канонический каскад или классическая активация применительно к WNT обозначает один из множества нижележащих сигнальных каскадов Wnt, например в каноническом каскаде основным эффектом связывания лиганда Wnt с его рецептором является стабилзация цитоплазменного комплекса деградации бета-катенина. Другие каскады Wnt являются неканоническими.
В качестве одного примера, низкомолекулярное соединение CHIR влияет на нижележащий каскад передачи сигнала Wnt.
В настоящем тексте термин Sonic hedgehog (SHH или Shh) обозначает белок, который является одним из по меньшей мере трех белков в семействе каскада сигнальной трансдукции млекопитающих, называемого hedgehog (еж), другим является DHH (DHH (пустынный еж, desert hedgehog), а третьим IHH (индийский еж, Indian hedgehog). Shh взаимодействует по меньшей мере с двумя трансмембранным белками путем взаимодействия с трансмембранными молекулами Patched (PTC) и Smoothened (SMO). Обычно Shh связывается с PCT, что обеспечивает дальнейшую активацию SMO - переносчика сигнала (сигнального трансдуктора). В отсутствие SHH PTC обычно ингибирует SMO, который, в свою очередь, активирует репрессор транскрипции, вследствие чего не происходит транскрипция некоторых генов. Если Shh присутствует и связывается с PTC, PTC не может вмешиваться в функционирование SMO. В отсутствие ингибирования SMO некоторые белки могут проникать в ядро и действовать как факторы транскрипции, что обеспечивает активацию некоторых генов (см. Gilbert, 2000 Developmental Biology (Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc., Publishers).
В настоящем тексте термин активатор или активирующий относится к малым молекулам, пептидам, белкам и соединениям для активации молекул, приводящей к направленной дифференцировке клеток в соответствии с настоящими изобретениями. Примеры активаторов включают, но не ограничиваются перечисленными: CHIR, Sonic hedgehog (SHH) C25II, низкомолекулярный агонист белка Smoothened пурморфаминфактор роста фибробластов (FGF, ФРФ) и т.д.
В настоящем тексте термин активатор передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) относится к любой молекуле или соединению, которые активируют путь передачи сигнала SHH, включая молекулы или соединения, которые связываются с PCT или агонистом Smoothened, и подобные им. Примерами таких соединений являются белок Sonic hedgehog (SHH) C25II и низкомолекулярный агонист белка Smoothened пурморфамин.
В настоящем тексте термин Sonic hedgehog (SHH) C25II обозначает рекомбинантный N-концевой фрагмент полноразмерного мышиного белка hedgehog, способный связываться с рецептором SHH и активировать SHH, см, например, номер по каталогу R&D Systems: 464-SH-025/CF.
В настоящем тексте термин сигналы относится к внутренним и внешним факторам, которые контролируют изменения в структуре и функции клетки. Они могу иметь химическую или физическую природу. В настоящем тексте термин лиганд относится к молекулам и белкам, которые связываются с рецептором (R), примеры включают, но не ограничиваются трансформирующим фактором роста-бета, активинами, белком нодаль, белками морфогенеза костей (BMP) и т.д.
В настоящем тексте термин ингибитор или ингибитор передачи сигнала относится к ингибированию сигнальной молекулы или сигнального молекулярного каскада, как например, в случае ингибитора передачи сигнала SMAD, ингибитор киназы гликогенсинтазы 3β (GSK3e) обозначает соединение или молекулу (например, малую молекулу, пептид, пептидомиметик, природное соединение, белок, миРНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту, аптамер или антитело), которое нарушает (т.е. снижает, или подавляет, или устраняет, или блокирует) сигнальную функцию молекулы или каскада. Другими словами, ингибитор представляет собой любое соединение или молекулу, которая изменяет любой вид активности названного белка (сигнальной молекулы, любой молекулы, взаимодействующей с сигнальной молекулой, названной связанной молекулы, такой как киназа гликогенсинтазы 3β (GSK3e)) (например, включая описанные здесь сигнальные молекулы, но не ограничиваясь ими), в качестве одного из примеров по- 12 041083 средством осуществления прямого контакта с передачей сигнала SMAD, осуществления контакта со SMAD мРНК, что приводит к конформационным изменениям SMAD, снижению уровней белка SMAD или нарушению взаимодействия SMAD с партнерами по передаче сигнала (например, включая партнеров, описанных здесь) и ослабление экспрессии целевых генов SMAD (например, таких генов, как описанные здесь). Ингибиторы включают также молекулы, которые опосредованно регулируют биологическую активность SMAD, перехватывая молекулы выше по каскады сигнализации. Соответственно, в одном варианте реализации ингибитор согласно настоящему изобретению индуцирует (изменяет) или меняет дифференцировку с клеточного типа в отсутствие воздействия (типичного) на другой клеточный тип (атипичный), один из способов согласно настоящему изобретению, включающий применение LDN/SB, CHIR и активатора SHH (который может ингибировать киназу гликогенсинтазы 3β) обеспечивал дифференцировку клеток-предшественников в в атипичный нейрональные клетки-предшественники. В предпочтительном варианте реализации ингигибитор согласно настоящему изобретению изменяет или снижает или блокирует исходную передачу сигнала, направляя дифференцировку клеток по пути к атипичному типу клеток, например, как описано в данном тексте для дифференцировки клетокпредшественников вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями. Соответственно, ингибитор согласно настоящему изобретению представляет собой природное соединение или малую молекулу, которая изменяет активность сигнальной молекулы, таким образом, что это способствует дифференцировке исходной популяции клеток (день 0) в клетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга. Если клетки-предшественники приводят в контакт с ингибиторами, эти малые молекулы способствуют дальнейшей дефференцировке в дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями. Ингибиторы описаны в терминах конкурентного ингибирования (связывается с активным сайтом, что приводит к исключению или снижению связывания с другим известным связывающим соединением) и аллостерического ингибирования (связывается с белком, что приводит к изменению конформации белка, что нарушает связывание соединения с активным сайтом этого белка) в дополнение к ингибирование в дополнение к ингибированию, индуцированному связыванием с и воздействием на молекулу выше по каскаду, чем названная сигнальная молекула, что, в свою очередь, вызывает ингибирование названной молекулы. В некоторых случаях ингибитор называется прямым ингибитором, что обозначает ингибирование сигнальной мишени или пути передачи сигнала, являющегося мишенью; например, прямым ингибитором гамма-секретазы является молекула DAPT, которая связывается с белком гамма-секретазой.
В настоящем тексте термин производное относится к химическому соединению с близкой основной структурой.
В настоящем тексте термин клетка-предшественник вентральной пластинки среднего мозга применительно к in vivo клетке, расположенной в среднем мозге, включая период эмбрионального развития нейронов среднего мозга, обозначает клетку, которая может дифференцироваться в дофаминпродуцирующую клетку. В некоторых вариантах реализации клетка-предшественник вентральной пластинки среднего мозга относится к клетке в культуре, которая используется для искусственного получения культуральной клетки in vitro, которая экспрессирует наборы маркеров, идентичные и пересекающиеся с наборами маркеров, экспрессируемыми клетками in vivo, т.е. экспрессирует совместно маркер вентральной пластинки FOXA2 и маркеры покрышки LMX1A, OTX2, NGN2 и DDC, как в культивируемых клетках в соответствии с настоящими изобретениями около дня 11 после инициации направленной дифференцировки, как описано здесь. В предпочтительном варианте клетка-предшественник вентральной пластинки среднего мозга является FOXA2+LMX1A+ или FOXA2/LMX1A+. В некоторых вариантах реализации небольшое число клеток в популяции дифференцированных предшественников является FOXA2/LMX1A/TH+.
В настоящем тексте термин ДА нейроны покрышки или аутентичные ДА нейроны среднего мозга или FOXA2+LMX1A+ дофаминовые (ДА) нейроны линии среднего мозга или дофаминовые (ДА) нейроны вентральной пластинки среднего мозга или приживляемые ДА нейроны среднего мозга или mДА нейроны, или FOXA2+LMX1A+TH+, или FOXA2/LMX1A/TH, или FOXA2+LMX1A+ NURR1+TH+, или FOXA2/LMX1A/NURR1/TH ОТНОСИТСЯ К популяции приживляемых ДА нейронов среднего мозга, полученных описанным здесь способом, обычно приблизительно на 25 день или к 25 дню после инициации направленной дифференцировки. В предпочтительном варианте реализации аутентичные ДА нейроны среднего мозга являются FOXA2+/LMX1A+/NURR1+/TH+. Эти нейроны обозначали как приживляемые после эксперимента по трансплантации на мышах и приматах, что указывает на способность этих нейронов обращать неврологические состояния, подобные паркинсонизму, и при этом вызывают меньше проблем, связанных с чрезмерным ростом нейронов и образованием тератом. Дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями выдерживали in vitro в течение нескольких месяцев при сохранении способности к приживлению.
Согласно настоящему раскрытию, клетки, применяемые для получения клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов среднего мозга получают из различных источников, включая эмбриональные и неэмбриональные источники, например ЭЧКч и неэмбриональные иПСКч, соматические стволовые клетки, стволовые клетки с заболеванием,
- 13 041083
т.е. изолированные плюрипотентные клетки и модифицированные производные стволовые клетки, взятые у пациентов с болезнью Паркинсона, раковые стволовые клетки, плюрипотентные клетки человека или млекопитающего и т.д.
В настоящем тексте термин стволовая клетка относится к клетке, обладающей способностью делиться в течение неопределенного периода в культуре и давать начало специализированным клеткам. Стволовая клетка может быть получена из организмы животных и пациентов, включая людей; например, человеческая стволовая клетка представляет собой стволовую клетку, которая является человеческой. Стволовая клетка может быть получена из различных источников, включая эмриональные инеэмбриональные, такие как клетки пуповинной крови, клетки детей и клетки взрослых. Для целей настоящих изобретений стволовые клетки взрослых в целом относятся к клеткам, которые не были первоначально получены из плода, другими словами, клетки младенцев, из неиспользуемых пуповин, неиспользуемой плаценты, клетки детей, клетки взрослых и т.д.
В настоящем тексте термин стволовые клетки пуповинной крови относится к стволовым клеткам, полученным из пуповины при родах, которые обладают способностью давать начало, по меньшей мере, всем клеткам крови в организме (гематопоэтические).
В настоящем тексте термин соматические стволовые клетки (стволовые клетки взрослых) относится к относительно редкой недифференцированной форме клеток, встречающейся во многих органах и дифференцированных тканях, обладающих ограниченной способностью к самообновлению (в лаборатории) и дифференцировке. Способность таких клеток к дифференцировке варьирует, но обычно ограничивается типами клеток органа, из которого они происходят.
В настоящем тексте термин соматическая клетка относится к любой клетке тела, за исключением гамет (яйцеклетки и сперматозоида), иногда они называются клетками взрослых.
В настоящем тексте термин нейрональная клеточная линия относится к клетке, которая принимает участие в развитии нервной системы (как центральной, так и периферической) или клеток нервного валика в процессе развития или во взрослом организме. Линии клеток нервного валика включают краниальные, клетки ствола, вагусные и сердечные, из которых образуются мезодерма, черепной хрящ, кости черепа, тимус, зубы, меланоциты, пигментные клетки радужной оболочки, черепные ганглии, ганглии задних корешков, симпатические/парасимпатические ганглии, эндокринные клетки, клетки кишечной нервной системы и части сердца.
В настоящем тексте термин стволовая клетка взрослого относится к соматической стволовой клетке, например гематопоэтической стволовой клетке, что обозначает стволовую клетку в организме младенцев, детей и взрослых, которая дает начало всем эритроцитам и тромбоцитам и тромбоцитам.
В настоящем тексте термин эмбриональная стволовая клетка относится к первичной (недифференцированной) клетке, которая получена из одного из нескольких источников, включая эмбрион до имплантации, искусственно созданный эмбрион, т.е. полученный в результате оплодотворения in vitro и т.д., но не ограничиваясь перечисленными, способной к делению без дифференцировки в течение длительного культивирования; известно, что эти клетки обладают способностью развиваться в клетки и/или ткани трех первичных зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму.
В настоящем тексте термин энтодерма относится к слою клеток, образованных из внутренней клеточной массы бластоцисты; он обладает способностью in vivo давать начало легким, другим дыхательным структурам и органам пищеварения, или, в общем кишке, а также разнообразным типам клеток in vitro.
В настоящем тексте термин линия эмбриональных стволовых клеток относится к популяции эмбриональных стволовых клеток, которые культивируются в условиях in vitro, которые обеспечивают пролиферацию без дифференцировки в течение дней, месяцев или лет, например, как клетки линии WA09 человеческих клеток.
В настоящем тексте термин эмбриональные стволовые клетки человека или hESC (ЭСКч) относится к типу плюрипотентных стволовых клеток, полученных из эмбрионов на ранних стадиях до стадии бластоцисты включительно, которые способны делиться без дифференцировки в течение продолжительного периода культивирования и о которых известно, что они развиваются в клетки и ткани первичных зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму.
В настоящем тексте термин индуцированная плюрипотентная стволовая клетка или iPSC (иПСК) относится к типу плюрипотентных стволовых клеток, близкому к эмбриональным стволовым клеткам, состоящему из соматических (взрослых) клеток, перепрограммированных таким образом, что они переходят в состояние, подобное эмбриональным стволовым клеткам, за счет того, что их заставляют экспрессировать факторы, важные для поддержания стволовости эмбриональных стволовых клеток (ESCs, ЭСК). Мышиные иПСК были описаны в 2006 г. (Takahashi and Yamanaka), а человеческие ИПСК были описаны в конце 2007 г. (Takahashi et al. and Yu et al). Мышиные иПСК демонстрируют важные свойства плюрипотентных стволовых клеток, включая экспрессию маркеров стволовых клеток, образование опухолей из всех трех зародышевых слоев и принимать участие в образовании многих различных тканей при инъецировании в мышиные эмбрионы на очень ранней стадии развития. Человеческие иПСКч также экспрессируют маркеры стволовых клеток и способны образовывать клетки, характерные для
- 14 041083 всех четырех зародышевых слоев. В отличие от эмбриональной стволовой клетки иПСК получают искусственно путем введения определенных эмбриональных генов (таких как трансгены OCT4, SOX2 и KLF4) (см., например, Takahashi, Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006), данный источник включен в настоящий текст посредством ссылки) в соматическую клетку, например в клеточные линии из индуцированных клеток, C14, C72 и подобных. Другим примером иПСК являются клетки кожи взрослого человека, или фибробласты, трансформированные генами (OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 и KLF4), клонированными в плазмиду, см. Yu, et al., Science DOI: 10.1126/science. 1172482 (этот источник включен в настоящее описание посредством ссылки).
В настоящем тексте термин тотипотентный относится к способности давать начало всем типам клеток организма плюс все типа клеток, которые образуют экстраэмбриональные ткани, такие как плацента.
В настоящем тексте термин мультипотентный относится к способности развиваться в больше чем один тип клеток организма.
В настоящем тексте термин плюрипотентный относится к клетке, обладающей способностью давать начало по меньшей мере двум, но часто многим различным типам клеток организма. Плюрипотентные клетки часто образуют тератому после инъецирования мышам с подавленным иммунитетом.
В настоящем тексте термин плюрипотентная стволовая клетка относится к способности этой клетки развиваться в по меньшей мере два различных типа клеток в зависимости от факторов окружающей среды, т.е. факторов роста, морфогенов, сигнальных молекул, активаторов или ингибиторов, и т.д. В некоторых вариантах реализации плюрипотентная стволовая клетка относится к способности клетки развиваться в любой из трех зародышевых листков в ходе индивидуального развития организма, в том числе эндодерму, мезодерму и эктодерму.
В настоящем тексте термин специализированная клетка относится к типу клеток, выполняющему специфическую функцию в многоклеточных организмах. Например, группы специализированных клеток, таких как нейроны, совместно функционируют с образованием системы, такой как нервная система.
В настоящем тексте термин нейроэктодерма относится к клетке или направлению дифференцировки клеток, обнаруживаемых в ранних периодах индивидуального развития или во время дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, которые могут давать начало клеткам нейронной линии.
В настоящем тексте термин маркеры пролиферации клеток относится к экспрессии молекул, ассоциированных с быстро делящимися клетками, которые, как правило, не присутствуют в зрелых медленно делящихся или неделящихся клетках, т.е. присутствуют в активно делящихся клетках, в отличие от клеток с увеличенной продолжительностью клеточного цикла или неделящихся клеток. Примеры таких маркеров включают маркер пролиферации клеток Ki67 (Gerdes, et al., Int J Cancer 31:13-20 (1983), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки) и маркеры G2/M-фаз митоза фосфогистоны H3 (Hendzel, et al., Chromosoma 106:348-360 (1997), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки).
В настоящем тексте термин пролиферация относится к увеличению числа клеток.
В настоящем тексте термин дифференцировка относится к процессу, в ходе которого неспециализированный эмбриональная клетка приобретает признаки специализированной клетки, например специфического типа нейронов, клетки головного мозга, сердца, печени или мышечной клетки. Контроль дифференцировки обеспечивает взаимодействие генов клетки с физическими и химическими условиями вокруг указанной клетки, обычно посредством сигнальных путей, задействующих белки, внедренные в поверхность клетки.
В настоящем тексте термин дифференцировка применительно к клеткам системы дифференцирующихся клеток относится к процессу, в ходе которого клетки дифференцируются из одного типа клеток (например, из мультипотентной, тотипотентной или плюрипотентной способной к дифференцировке клетки) в другой тип клеток, такой как целевая дифференцированная клетка.
В настоящем тексте термин дифференцировка клетки относится к пути, посредством которого менее специализированная клетка (т.е. стволовая клетка) развивается или созревает с приобретением более выраженной формы и функции (например, иПСК, развивающаяся в предшественник нервного гребня, в клетку нейрональной линии, в клетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга, в клетки пути среднего мозга дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны в соответствии с настоящими изобретениями).
В настоящем тексте термин недифференцированный относится к клетке, еще не развившейся в специализированный тип клеток.
В настоящем тексте термин по умолчанию или пассивный применительно к пути дифференцировки клеток относится к пути, в ходе которого менее специализированная клетка становится клеткой определенного типа дифференцированных клеток в культуре, в отсутствие обработки определенными соединениями, т.е. в нормальных условиях культивирования клеток без контакта по меньшей мере с одним морфогеном. Другими словами, заданная по умолчанию клетка образуется, когда клетку не приводят в контакт с молекулой, способной изменять тип дифференцированных клеток (т.е. с морфогеном), например культивирование с обработкой отдельно LSB, однако, не активатором SHH или активатором Wnt для получения положительной по белку Forkhead A2 (FOXA2)+ клетки в соответствии с настоящими
- 15 041083 изобретениями, приводит вместо этого к экспрессии маркеров HES5, PAX6, LHX2 и EMX2. И напротив, не заданный по умолчанию применительно к клетке относится к типу дифференцированных клеток, дающему в результате тип клеток, отличный от заданной по умолчанию клетки, т.е. не заданная по умолчанию клетка относится к типу дифференцированных клеток, образующихся в не заданных по умолчанию условиях, например представляет собой клетку в соответствии с настоящими изобретениями, в том числе положительную по белку Forkhead A2 (FOXA2)+ нейрональную клетку, клетку-предшественник вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовый (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейрон пути среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями; и т.д. Заданная по умолчанию клетка может также представлять собой заданную по умолчанию клетку, которая после контакта с морфогеном становится не заданной по умолчанию клеткой, без последующего контакта с морфогенным соединением; например, не заданную по умолчанию клетку-предшественник вентральной пластинки среднего мозга, которая затем становится заданной по умолчанию клеткой, не относящейся к дофаминовым (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронам пути среднего мозга, ввиду отсутствия контакта с морфогеном, таким как CHIR.
В настоящем тексте термин морфоген относится к соединению, которое влияет на дифференцировку клетки, т.е. определяет, по меньшей мере, частично, направление дифференцировки клеток. Морфоген также может влиять на клетку таким образом, что происходит ее дифференцировка в не заданный по умолчанию тип клеток.
В настоящем тексте термин направленная дифференцировка относится к манипуляциям с условиями культивирования стволовых клеток для индукции дифференцировки в конкретный (например, требуемый) тип клеток, например, в клетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны линии среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями. В одном варианте реализации термин направленная дифференцировка применительно к клетке относится к применению малых молекул, белков - факторов роста и других условий роста, способствующих переходу клетки из плюрипотентного состояния к более зрелому или специализированному направлению дифференцировки клеток (например, в клетку центральной нервной системы, нервную клетку, клетку-предшественник вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовый (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейрон линии среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями; и т.д.). В одном предпочтительном варианте реализации начало направленной дифференцировки происходит при приведении клетки в контакт с LDN/SB на 0 день. Прохождение клеткой направленной дифференцировки согласно описанию в настоящем документе приводит к образованию не заданного по умолчанию типа клеток клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга и дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейрон линии среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями. В настоящем тексте термин индукция дифференцировки применительно к клетке относится к изменению заданного по умолчанию типа клеток (генотипа и/или фенотипа) на не заданный по умолчанию тип клеток (генотип и/или фенотип). Соответственно, индукция дифференцировки в стволовой клетке относится к индукции образования при делении клетки дочерних клеток с характеристиками, отличающимися от указанной стволовой клетки, например характеристиками генотипа (т.е. изменение генной экспрессии по оценке с применением генетического анализа, например, с микрочипом) и/или фенотипа (т.е. изменение экспрессии белка, такого как белок Forkhead A2 (FOXA2), или набора белков, например, клетки, положительные (+) по белку Forkhead A2 (FOXA2) и кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1-альфа (LMX1A), но отрицательные (-) по PAX6).
В настоящем тексте термин направление (линия) дифференцировки применительно к клетке, например определение направления дифференцировки клеток относится в целом к клетке генетически определенной линии, потомство которой способно становиться клетками различных типов или нескольких специфических типов, в зависимости от условий in vivo или условий культивирования in vitro. Другими словами, заранее заданное направление дифференцировки клетки определяет окружающая среда, предопределяя конкретный путь дифференцировки; таким образом, клетка становится клеткой одного, а не другого типа, например потомство стволовых клеток с нейральным направлением дифференцировки становится нервными клетками, а не мышечными клетками и не клетками кожи.
В настоящем тексте термин разрастание нейритов или разрастание нейронов относится к наблюдаемым удлиненным окруженным мембраной выступам цитоплазмы из клеток.
В отличие от избыточного нейронного разрастания, которое относится к нежелательному неограниченному росту нейронов, т.е. неконтролируемому росту нейронов из трансплантированных клеток в участке приживления трансплантата. В настоящем тексте термин тератома относится к нераковой опухоли из ткани любого типа, образующейся из трансплантированных клеток.
В настоящем тексте термин образование тератомы относится к нежелательному росту ткани различных типов с образованием нераковых опухолей в результате роста трансплантированных клеток.
В настоящем тексте термин дофаминовый нейрон или дофаминергический нейрон в общем случае относится к клетке, способной экспрессировать дофамин. Дофаминовые нейроны среднего мозга, или мДА относятся к предположительно экспрессирующим дофамин клеткам в структурах переднего мозга и экспрессирующим дофамин клеткам в структурах переднего мозга.
В настоящем тексте термин нейральная стволовая клетка относится к стволовой клетке, обнару- 16 041083 живаемой в нейральной ткани во взрослом возрасте, способной давать начало нейронам и глиальным (поддерживающим) клеткам. Примеры глиальных клеток включают астроциты и олигодендроциты.
В настоящем тексте термин вентральная пластинка, или FP, или fp относится к области нервной трубки in vivo, проходящей вдоль всей вентральной средней линии, также описанной как непарная вентральная продольная зона нейральной трубки или называемая сигнальным центром нейральной трубки. Другими словами, нейральная трубка была разделена на разные области, при этом вентральные клетки, расположенные ближе всего к средней линии, составляют вентральную пластинку. В одном примере дальнейшей идентификации клеток FP среднего мозга цыпленка может быть разделена на медиальную (MFP) и латеральную (LFP) области на основании генной экспрессии, способа индукции и функции. Клетки вентральной пластинки обнаруживаются в vivo в нескольких областях развивающегося эмбриона, например клетки вентральной пластинки среднего мозга, заднего мозга и т.д. Считается, что in vivo клетки вентральной пластинки в области среднего мозга дают начало клеткам, отличным от клеток, дифференцирующих из клеток вентральной пластинки в других областях. Одним из первичных маркеров вентральной пластинки в области среднего мозга является FOXA2.
В настоящем тексте термин пластинка четверохолмия (покрышка) относится к дорсальным клеткам, расположенным ближе всего к средней линии. Один из маркеров пластинки четверохолмия представлен LMX1A. Во время эмбрионального развития клетки вентральной пластинки и пластинки четверохолмия локализованы в отдельных положениях в ЦНС (вентрально/дорсально) и отличаются диаметрально противоположными требованиями к паттернам для индукции.
В настоящем тексте термин средний мозг относится к области развивающегося головного мозга позвоночных между передним мозгом (антериально) и задним мозгом (постериально). В областях среднего мозга берут начало многие области головного мозга, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, ретикулярная формация, представляющая собой часть покрышки, область ствола головного мозга, влияющая на моторные функции, ножка мозга, которая состоит из нервных волокон, соединяющих полушария головного мозга с мозжечком, и большое пигментированное ядро, называемое черным веществом. Уникальным признаком развивающегося среднего мозга является коэкспрессия маркера вентральной пластинки FOXA2 и маркер пластинки четверохолмия LMX1A.
В настоящем тексте термин нейрон относится к нервной клетке, основной функциональной единице нервной системы. Нейрон состоит из тела клетки и отростков - аксона и один или более дендритов. Нейроны передают информацию в другие нейроны или клетки путем высвобождения нейротрансмиттеров в синапсах.
В настоящем тексте термин культура клеток (культивирование клеток) относится к росту клеток in vitro в искусственной среде, для исследований или медицинского лечения.
В настоящем тексте термин культуральная среда относится к жидкости, покрывающей клетки в культуральном сосуде, таком как чашка Петри, многолуночный планшет и т.п., и содержащей питательные вещества для питания и поддержки клеток. Культуральная среда может также включать факторы роста, которые добавляют для индукции требуемых изменений в клетках.
В настоящем тексте термин среда для нейронального созревания, или среда BAGCT относится к культуральной среде, содержащей среду N2 с добавлением нейротрофического фактора головного мозга (BDN), аскорбиновой кислоты (АК), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ и трансформирующего фактора роста типа β3 для дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов линии среднего мозга.
В настоящем тексте термин фидерный слой относится к клетке, используемой при совместном культивировании для поддержания плюрипотентных стволовых клеток. В случае культур эмбриональных стволовых клеток человека типичные фидерные слои включают эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) или эмбриональные фибробласты человека, которые прошли обработку для предотвращения деления в культуре.
В настоящем тексте термин пассаж применительно к культуре клеток относится к процессу, в ходе которого клетки разъединяют, промывают и высевают в новые культуральные сосуды после раунда роста и пролиферации клеток. Число пассажей, которому подверглись культивируемые клетки, представляет собой показатель их возраста и ожидаемой стабильности.
В настоящем тексте термин экспрессия в отношении гена или белка относится к получению мРНК или белка, которое можно наблюдать с применением анализов, таких как анализы на микрочипах, анализы с окрашиванием антител и т.п.
В настоящем тексте термин ген парного бокса 6, или PAX6 относится к маркеру отличной от заданной по умолчанию нейропрогениторной клетки.
В настоящем тексте термин TUJ1, или нейрон-специфичный бета-тубулин класса III применительно к дифференцирующей клетке в соответствии с настоящими изобретениями относится к маркеру ранней нейральной дифференцировки клеток человека, например нейральных клеток-предшественников, и его экспрессия обнаруживается в нейронах ПНС и цнс.
В настоящем тексте термин гомодимер применительно к молекуле SMAD относится к по меньшей мере двум молекулам SMAD, соединенным между собой, например, дисульфидными связями.
- 17 041083
В настоящем тексте термин приведение клеток в контакт с соединением в соответствии с настоящими изобретениями относится к размещению указанного соединения в локализации, позволяющей соприкосновение с клеткой, с получением (обеспечением) приведенных в контакт клеток. Приведение в контакт может осуществляться с применением любого подходящего способа. Например, в одном варианте реализации приведение в контакт происходит путем добавления указанного соединения в пробирку с клетками. Приведение в контакт может также быть осуществлено путем добавления указанного соединения в культуру клеток.
В настоящем тексте термин прикрепленная клетка относится к клетке, растущей in vitro, отличающейся тем, что указанная клетка прикрепляется ко дну или стенкам культурального сосуда; прикрепленная клетка может вступать в контакт с сосудом за счет молекул внеклеточного матрикса и т.п., и для отсоединения указанной клетки от культуральной емкости/контейнера требуется применение фермента, т.е. трипсина, диспазы и т.д. Прикрепленная клетка, в отличие от клетки в суспензионной культуре, не прикрепленной и не требующей применения фермента для извлечения клеток из культурального сосуда. В настоящем тексте термин маркер или клеточный маркер относится к гену или белку, указывающему на определенную клетку или тип клеток. Маркер для клетки может не ограничиваться одним маркером, маркеры могут относится к паттерну маркеров, т.е. обозначенная группа маркеров может обеспечивать идентификацию клетки или типа клеток, отличая их от других клеток или типов клеток. Например, дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны линии среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями экспрессируют один или большее число маркеров, которые отличают клеткупредшественника вентральной пластинки среднего мозга от слабее дифференцированной клеткипредшественника, т.е. положительна по белку Forkhead A2 (FOXA2) и положительна по кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1 альфа (LMX1A), в отличие от HES5+ и PAX6+ клеток, например, как видно из паттернов экспрессии, показанных на фиг. 1e и 1f. В настоящем тексте термин положительный применительно к клетке, включая сочетание положительная клетка, относится к клетке, которая экспрессирует маркер, в качестве одного из примеров, антитело окрашивает по этому маркеру при применении системы окрашивания антителами (детекции) или последовательности нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты маркера, по оценке с применением репортерной молекулы, т.е. флуоресцентной молекулы, которая присоединяется к двунитевым последовательностям нуклеиновых кислот, в детектируемом количестве для количественного и/или качественного анализа, превышающем количество для контрольной или сопоставляемой клетки. Например, под клеткой, положительной по такому маркеру, такие как белок Forkhead A2 (FOXA2) и т.д., подразумевается клетка, которая экспрессирует мРНК и/или белок FOXA2, согласно детекции в ходе анализа, например, с применением генного чипа или антитела, соответственно. Такая положительная клетка может быть названа FOXA2+. Если клетка положительна более чем по одному маркеру, например, если используется обозначение FOXA2/LMX1A+, указанная клетка или большая часть популяции указанных клеток положительна как по FOXA2, так и по LMX1A.
В настоящем тексте термин отрицательный применительно к клетке или популяции клеток, в том числе отрицательная клетка относится к клетке или популяции, в которой отсутствует детектируемый сигнал маркера, или присутствует сигнал на уровне контрольных популяций. Например, клетка, которая не окрашивается с применением способа детекции, предусматривающим приведение в контакт с антителом к белку Forkhead A2 (FOXA2), или способа с генным чипом, который включает детекцию мРНК FOXA2, и т.д., является FOXA2-, или отрицательной по FOXA2.
В настоящем тексте термины репортерный ген или репортерная конструкция относятся к генетическим конструкциям, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, который легко поддается детекции или анализу, такой как окрашенный белок, флуоресцентный белок, такой как GFP, или фермент, такой как β-галактозидаза (ген lacZ).
В настоящем тексте термин GFP относится к любой последовательности ДНК зеленого флюоресцентного белка, экспрессия которой в клетке может давать флюоресцентный белок, обычно используемый в качестве маркера экспрессии целевого гена. Примеры GFP включают последовательности GFP, выделенные из кишечнополостных, таких как тихоокеанская метдуза, Aequoria Victoria, и производные синтетические последовательности, такие как eGFP.
Термин образец(проба) используется в самом широком смысле. В другом смысле он включает образец или культуру, полученные из любого источника и включает жидкости, твердые вещества и ткани. Образцы из окружающей среды включают материалы окружающей среды, такие как поверхностные материалы, почву, воду и промышленные материалы. Эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие типы образцов, которые можно применять в настоящем изобретении.
Термины очищенный, очищать, очистка, изолированный, изолировать, изолирование и их грамматические эквиваленты в настоящем тексте относятся к снижению количества по меньшей мере одной примеси в образце. Например, целевой тип клеток очищен по меньшей мере на 10%, в предпочтительном варианте, по меньшей мере на 30%, в более предпочтительном варианте, по меньшей мере на 50%, в еще более предпочтительном варианте, по меньшей мере на 75%, и в наиболее предпочтительном варианте, по меньшей мере на 90%, с соответствующим снижением нецелевых типов клеток, например,
- 18 041083 направленная дифференцировка в соответствии с настоящими изобретениями приводила к желаемому повышению чистоты дифференцированных клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга или дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями. Другими словами, очищать и его эквиваленты относятся к удалению некоторых клеток (например, нежелательных клеток) из образца, либо механически, например путем сортировки в поточном цитометре, либо посредством направленной дифференцировки. Например, для обеспечения дифференцировки очищенной популяции положительных по белку forkhead box A2 (FOXA2) и кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A) клеток-предшественников в соответствии с настоящими изобретениями, клетки-предшественники очищают путем удаления примеси нервных клеток PAX6 путем сортировки смешанной популяции клеток с получением дважды положительных: по белку forkhead box A2 (FOXA2) и кодируемому гомеобоксным геном LIM фактору транскрипции 1, альфа (LMX1A) клеток методом поточной цитометрии; дофаминовые (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейроны среднего мозга также очищают или отбирают от недофаминовых (ДА) (типичных клеток) с применением определенного способа культивирования клеток, включающего композиции и способы в соответствии с настоящими изобретениями. Удаление или отбор клеток, отличных от FOXA2/LMX1A+ дофаминовых (ДА) нервных клеток среднего мозга, приводит повышению процентной доли целевых дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов среднего мозга в образце. Соответственно, очистка типа клеток приводит к обогащению, т.е. повышению количества целевых клеток, т.е. дофаминовых (ДА) FOXA2/LMX1A+ нейронов среднего мозга, в образце.
В настоящим тексте термин природный применительно к объекту (такому как клетка, ткань и т.д.) и/или химическому соединению (такому как белок, последовательность аминокислот, кодон и т.д.) обозначает, что указанные объект и/или соединение встречаются/встречались в природе. Например, природная клетка - это клетка, присутствующая в организме, который может быть выделен из природного источника, такая как эмбриональная клетка, причем указанная клетка не подвергалась целенаправленной модификации человеком в лаборатории.
В настоящем тексте термин in vitro относится к искусственному окружению и к процессам или реакциям, которые происходят в этом искусственном окружении. Примерами In vitro окружения являются, помимо прочего, пробирки и культуры клеток.
В настоящем тексте термин in vivo относится к природному окружению (например, животному или клетки) и к процессам или реакциям, которые происходят в природном окружении, таким как развитие эмбриональных клеток, дифференцировка клеток, формирование нервной трубки и т.д.
Термин полученный из, или образованный из, или дифференцированный из, употребляемый применительно любой описанной здесь клетке, обозначает клетку, которая получена из (например, выделена, очищена и т.д.) родительской клетки в клеточной линии, ткани (такой как разрушенный эмбрион или жидкости) с применением любых манипуляций, таких как, без ограничения, выделение единственной клетки, культивирование in vivo, обработка и/или мутагенез. Клетка может быть получена из другой клетки с применением, например, химической обработки, облучения, индукции экспрессии новых белков, например, путем инфицирования вирусом, трансфицирования последовательностями ДНК, приведение в контакт с (обработка) морфогеном и т.д., и отбор (например, путем серийного культивирования) любого типа клеток, содержаегося в культивируемых родительских клетках). Полученные клетки могут быть отобраны из смешанной популяции по ответу на фактор роста, цитокин, выбранную последовательность обработки цитокинами, способности к адгезии, отсутствию адгезивности, с применением процедур сортировки и т.п.
В настоящем тексте термин клетка относится к единственной клетке, также к популяции клеток (т.е. к клеткам в количестве больше). Популяция может представлять собой чистую популяцию, содержащую один тип клеток, такую как популяция нейронов или популяция недифференцированных эмбриональных клеток. В альтернативном варианте популяция может содержать больше одного типа клеток, например, смешанная популяция. Не предполагается ограничения числа клеток в популяции, например, в одном варианте реализации смешанная популяция клеток может содержать по меньшей мере одну дифференцированную клетку. В настоящих изобретениях отсутствует ограничение числа типов клеток, которые могут содержаться в популяции.
В настоящем тексте термин высоко обогащенная популяция относится к популяции клеток, такой как популяция клеток в культуральной чашке, экспрессирующей более высокое количество или процентную долю маркера, чем популяция сравнения, например, обработка приведенной в контакт с LSB культуры клеток в день 1 пурморфамином, а в день 3 соединением CHIR приводит к получению высоко обогащенной популяции клеток-предшественников вентральной пластинки среднего мозга относительно обработки только LSB. В других примерах обогащенная популяция представляет собой популяцию, полученную в результате сортировки или отделения клеток, экспрессирующих один или большее число маркеров, от клеток не экспрессирующих целевые маркеры, такую как CD142-обогащенную популяцию, A9-обогащенную популяцию.
Термин биология клетки или клеточная биология относится к изучению живых клеток, например, анатомии и функционирования клеток, например физиологических свойств клеток, структуры, органелл и взаимодействий с их окружением, их жизненного цикла, деления и гибели.
- 19 041083
Термин представляющая интерес нуклеотидная последовательность относится к любой нуклеотидной последовательности (например, РНК или ДНК), манипуляции с которой средний специалист может посчитать желательными по каким-либо причинам (например, для лечения болезни, обеспечения улучшенных свойств, экспрессии представляющего интерес белка в клетке-хозяине, экспрессии рибозима и т.д.). Такие нуклеотидные последовательности включают, но не ограничиваются структурными генами (например, репортерными генами, генами маркеров селекции, онкогенами, генами лекарственной устойчивости, факторами роста и т.д.) и некодирующими регуляторными последовательностями, которые не кодируют продукт - иРНК или белок (например, последовательность промотроа, пооследовательность полиаденилирования, последовательность терминации, последовательность энхансера и т.д.).
В настоящем тексте термин представляющий интерес белок относится к белку, кодируемому представляющей интерес нуклеиновой кислотой.
Термин ген относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая содержит кодирующую последовательность, необходимую для получения полипептида или предшественника (например, проинсулина). Полипептид может кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или частью кодирующей последовательности, при условии сохранения активности или функциональных свойств (например, ферментативной активности, связывания лиганда, сигнальной трансдукции и т.д.) полноразмерного соединения или фрагмента. Этот термин также охватывает кодирующий участок структурного гена, прилегающий к кодирующей области как на 5'-, так и на 3'-конце на расстоянии около 1кб или больше на любом из концов, т.е. ген соответствует длине полноразмерной мРНК. Последовательности, которые расположены в направлении 5' от кодирующей области, и которые присутствуют в мРНК, называются 5'-нетранслируемыми последовательностями. Последовательности, которые расположены в направлении 3' или ниже от кодирующей области, и которые присутствуют в мРНК, называются 3'-нетранслируемыми последовательностями. Термин ген охватывает как кДНК, так и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, внутри которой расположены некодирующие последовательности, называемые интронами или промежуточные области или промежуточные последовательности. Интроны представляют собой сегменты гена, транскрибируемые в ядерную РНК (hnRNA, чяРНК); интроны могут содержать регуляторные элементы и энхансеры. Интроны удаляются или вырезаются при сплайсинге из ядерного или первичного тренскрипта; соответственно, интроны отсутствуют в информационной РНК (иРНК-транскриптах). В процессе трансляции иРНК определяет последовательность или порядок аминокислот в образующемся полипептиде.
В настоящем тексте термин экспрессия гена относится к процессу перевода генетической информации, закодированной в гене, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК или мяРНК) посредством транскрипции гена (т.е. в результате ферментативной активности РНК-полимеразы), и, в случае генов, кодирующих белок, в белок посредством трансляции мРНК. Экспрессия генов может регулироваться на многих стадиях процесса. Повышающая регуляция или активация относится к регуляции, которая повышает продукцию продуктов экспрессии гена (т.е. РНК или белка), а понижающая регуляция или репрессия относится к регуляции, которая снижает продукция. Молекулы (например, факторы транскрипции), которые участвуют в повышающей регуляции или понижающей регуляции часто называют активаторами и репрессорами соответственно.
В настоящем тексте термины молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая, последовательность ДНК, кодирующая, ДНК, кодирующая, последовательность РНК, кодирующая и РНК, кодирующая относятся порядку или последовательности дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов вдоль нити дезоксирибонуклеиновой или рибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов определяет порядок аминокислот в цепи полипептида (белка). Таким образом, последовательность ДНК или РНК кодирует последовательность аминокислот.
Термин изолированный (выделенный) применительно к нуклеиновой кислоте, как в сочетаниях изолированный олигонуклеотид или изолированный полинуклеотид относится к последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированной и отделенной от по меньшей мере одного компонент или примеси, с которыми она обычно встречается в ее природном источнике. Изолированная нуклеиновая кислота - это нуклеиновая кислота, существующая в форме или окружении, отличающихся от тех, в которых они встречаются в природе. Неизолированные нуклеиновые кислоты, напротив, представляют собой нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, в том состоянии, в котором они встречаются в природе. Например, определенная последовательность ДНК (например, ген) существует в хромосоме клетки-хозяина вблизи соседних генов; последовательности РНК, такие как определенная последовательность мРНК, кодирующая определенный белок, присутствуют в клетке в виде смеси с многочисленными другими мРНК, которые кодируют множество белков. Однако изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая определенный белок, включает, в качестве примера, такую нуклеиновую кислоту в клетке, в норме экспрессирующей указанный белок, где положение этой нуклеиновой кислоты в хромосоме отличается от наблюдаемого в природе. Изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид могут иметь однонитиевую или двунитиевую форму. В случае, когда изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид применяют для экспрессии белка, указанный олигонуклеотид или полинуклеотид должен содержать по меньшей мере смысловую или кодирующую нить (т.е. оли- 20 041083 гонуклеотид или полинуклеотид могут быть однонитиевыми), но может содержать и смысловую и антисмысловую нити (т.е. олигонуклеотид или полинуклеотид может быть двунитиевым).
В настоящем тексте термин набор относится к любой системе доставки для доставки материалов. В контексте дифференцировки клеток набор может относиться к комбинации материалов для приведения в контакт со стволовыми клетками, такие системы доставки включают системы доставки, которые обеспечивают возможность хранения, транспортировки или доставки реакционных реагентов из одного места в другое в подходящих контейнерах (таких как пробирки и т.д.) и/или со вспомогательными материалами (например, буферами, письменными инструкциями по осуществлению дифференцировки клеток и т.д.) (например, соединениям, белками, детектирующими агентами (таких как антитела, которые связываются с тирозингидроксилазой (TH), белком forkhead box A2 (FOXA2), кодируемым гомеобоксным геном LIM фактором транскрипции 1, альфа (LMX1A), и т.д.) и т.д. Например, набор включает одну или более емкостей (например, коробок, мешков, пробирок, пробирок эппендорф, капиллярных пробирок, многолуночных планшетов и т. п.), содержащих реакционные реагенты для ингибирования каскадов передачи сигнала, например, ингибитор для снижения передачи сигнала трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)/активин-Нодаль, такой как SB431542 (или заменитель SB431542) и т.п., ингибитор для снижения передачи сигнала, SMAD, LDN-193189 (или заменитель LDN-193189) и т.п., ингибитор для снижения киназы гликогенсинтазы 3β (GSK3e), в качестве одного из примеров, для активации передачи сигнала wingless (Wnt или Wnts), известного также как активатор передачи сигнала WNT (агонист WNT), такой как CHIR99021 (или заменитель CHIR99021) и т.д.) и т.п., активатор передачи сигнала белка Sonic hedgehog (SHH) (такой как низкомолекулярный агонист рецептора (SMO)), например, молекулы Sonic hedgehog (SHH) C25II, пурморфамин и подобные, молекула, обладающая активностью фактора роста фибробластов 8 (FGF8), такая как фактор роста фибробластов 8 (FGF8) и т.д. и молекулы, связанные с созреванием нейронов, например, (BDNF), аскорбиновая кислота (AA), нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, дибутирил-цАМФ и трансформирующий фактор роста типа β3, включая молекулы, способные заменять эти компоненты и/или вспомогательные материалы. Реагенты в наборе в одном варианте реализации могут быть в форме раствора, могут быть заморожены или лиофилизированы. Реагенты в наборе в одном варианте реализации могут содержаться в отдельных контейнерах или представлены в форме определенных комбинаций, таких как комбинация LSB (LDN-193189 с SB431542), молекулы Sonic hedgehog (SHH) C25II с пурморфамином, молекулы Sonic hedgehog (SHH) C25II с пурморфамином с CHIR99021 или пурморфамина с CHIR99021, молекулами, связанными с созреванием нейронов и т.п.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 в качестве примера продемонстрирована индукция и нейрогенная конверсия предшественников вентральных пластинок среднего мозга, полученных из клеток ES человека, зависящая от добавления CHIR990221. a) Иммуноцитохимический анализ на 11 день дифференцировки для экспрессии FOXA2 (красный), NESTIN (зеленый, верхние панели), LMX1A (зеленый, средние панели) и OTX2 (зеленый, нижние панели). b, c) Обсчет данных, представленных в (a). Представлены данные трех независимых экспериментов, каждый из которых осуществлялся в трех повторах (среднее±ошибка среднего (SEM)). Уровни значимостей для индивидуальных маркеров представлены в сравнении с данными, полученными при обработке только LSB: ANOVA; критерий Даннета: ***p<0,001; **p<0,01; p<0,05). d) Схематическое изображение условий культивирования, использовавшихся для трех условий обработки. e, f) Списки отобранных дифференциально экспрессирующихся генов на 11 день в сравнении с условиями LSB/S/F8/CHIR либо с LSB (e), либо LSB/S/F8 (f). g, h) Анализ временной экспрессии генов отобранных маркеров, характерных для идентификации предшественников DA среднего мозга (g), переднего мозга и идентификации вентральных предшественников, не являющихся DA (h). Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
На фиг. 2 в качестве примера продемонстрированы иммуноцитохимический и молекулярный анализы пути развития ДА нейронов среднего мозга при обработке LSB/S/F8/CHIR в сравнении с путями LSB/S/F8 (вентральный/гипоталамический) и LSB (дорсальный передний мозг). A) Иммуноцитохимический анализ на 25 день экспрессии FOXA2 (синий) в комбинации с Tuj1 (красный)/LMX1A (зеленый) (верхние панели) и NURR1 (красный)/TH (зеленый) (нижние панели). B) Количественный анализ одновременной экспрессии в культурах, обработанных LSB/S/F8/CHIR. Представлены данные трех независимых экспериментов, каждый из которых осуществлялся в трех повторах (среднее±стандартная ошибка среднего (SEM)). C, D) Анализ общей экспрессии генов осуществляли на 25 день (образцы в трех повторах для всех трех условий). Отобранные списки наиболее дифференциально экспрессирующихся генов при сравнении данных на 13 и на 25 дни в условиях LSB/S/F8/CHIR (C) и при сравнении обработки LSB/S/F8/CHIR с LSB (D, левая панель) и LSB/S/F8 (D, правая панель). E) Анализ нормализованной дифференциальной экспрессии генов для ключевых маркеров ДА нейронов среднего мозга. Уровни значимости для индивидуальных маркеров представлены в сравнении с данными обработки только LSB: ANOVA; критерий Даннета: ***p<0,001; **p<0,01; p<0,05). Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
- 21 041083
На фиг. 3(1) и 3(2) в качестве примера продемонстрировано созревание in vitro, характеристика и функциональная оценка ДА нейронов среднего мозга, полученных из вентральных пластинок, в сравнении с ДА нейронами среднего мозга, полученными из розеткообразных структур. На фиг. 3(1): продемонстрирован типичный: a) иммуноцитохимический анализ на 50 день дифференцировки для TH (красный), в комбинации с LMX1A (зеленый, левые панели), FOXA2 (синий, левые панели) и NURR1 (зеленый, правые панели). b) Подсчет клеток TH+, FOXA2+, LMX1+ и NURR1+ среди общего количества клеток в культуре, полученной из розеткообразных структур, в сравнении с культурой, полученной из вентральных пластинок (LSB/S/F8/CHIR). c) Подсчет нейронных подтипов серотонин+ (5-НТ), и GABA+ на 50 день в культуре ДА нейронов, полученной из вентральных пластинок, и в культуре ДА нейронов, полученной из розеткообразных структур. d, e) Анализ ВЭЖХ для измерения DA и метаболитов, d) репрезентативная хроматограмма электрохимической детекции DA в образце культур, полученных из вентральных пластинок, e) сравнение уровней DA, DOPAC и HVA среди культур, полученных из вентральных пластинок и из розеткообразных структур. f) Иммуноцитохимический анализ культур, полученных из вентральных пластинок, (80 день) для TH (красный) и синапсина (зеленый). g-i) Электрофизиологические анализы культур вентральных пластинок на 80 день дифференцировки ДА нейронов. Фазовое контрастное изображение соединенного в цепь нейрона (g) и соответствующие записи показаний (h). i) Анализ энергопотребления, показывающий характеристики осцилляции мембранного потенциала, являющиеся отличительной особенностью ДА нейрона (от 2 до примерно 5 Гц). Уровни значимости для индивидуальных маркеров (панели b, c, e) представлены как сравнение культур, полученных из вентральных пластинок и из розеткообразных структур: критерий Стьюдента: ***p<0,001; **p<0,01; p<0,05). Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм в (a), 20 мкм в (f, верхняя панель), 5 мкм в (f, нижняя панель) и 20 мкм в (g) j) Созревание ДА нейронов мыши in vitro (d65). TH-положительные нейроны все еще экспрессируют FoxA2 и распространяют длинные волокна, характерные для ДА нейронов мыши, и к: измерение высвобождения DA с помощью ВЭЖХ: TH+ нейроны возраста 65 дней являются функциональными in vitro. На фиг. 3(2) продемонстрирован типичный краткий обзор клеток, полученных по описанному в настоящей заявке протоколу ДА нейронов среднего мозга на основе вентральных пластинок. a) В противоположность предшествующим стратегиям (например, Perrier, A.L. и др. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embrionic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004)), описанный в настоящей заявке новый протокол основан на получении LMX1A/FOXA2-положительных вентральных пластинок среднего мозга (левая панель) с последующей нейронной конверсией (средняя панель) и созреванием ДА нейронов (правая панель). В зрелых клетках ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, сохраняется экспрессия FOXA2/LMX1A.
На фиг. 4 в качестве примера продемонстрированы выживаемость in vivo и функционирование ДА нейронов человека, полученных из вентральных пластинок, в мозгу мышей, крыс и обезьян, использованных в качестве моделей заболевания Паркинсона. a-d) Трансплантация ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, во взрослых мышей с повреждениями, вызванными 6-OHDA (штамм NOD-SCID IL2Rgc null). a) Экспрессия TH и морфология трансплантата через 4,5 месяца после трансплантации. b) Экспрессия специфического маркера человека (hNCAM, синий), TH (зеленый), и FOXA2 (красный). c) Подсчет FOXA2+, TH+ и дважды меченых клеток в трансплантатах, полученных на основе вентральных пластинок (среднее±SEM, n=4 через 4,5 месяца после трансплантации). d) Индуцированный амфетамином анализ вращения в трансплантатах, полученных из вентральных пластинок, (синий) в сравнении с трансплантатами, полученными из розеткообразных структур (зеленый). Отрезки для определения масштаба соответствуют 500 мкм в (a), 100 мкм в (b) и 40 мкм в (4c). e-p) Трансплантация ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, во взрослых крыс с повреждениями, вызванными 6-OHDA. Иммуногистохимический анализ для одновременной экспрессии TH (зеленый) и специфических маркеров человека (красный) hNA. e) и hNCAM (4f). g) Стереологический подсчет общего количества клеток (hNA+), клеток TH+ и клеток TH+, одновременно экспрессирующих FOXA2. Средний объем трансплантата составлял 2,6+/-0,6 мм3). h-j) Изображения высокого разрешения, показывающие одновременную экспрессию TH (зеленый) со специфическими факторами транскрипции среднего мозга FOXA2, PITX3 и NURR1 (красный), k-m) Анализ поведения животных, обработанных трансплантатами ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, в сравнении с фиктивно обработанными животными. k) Асимметрия вращения, вызванная амфетамином. 1) Шаговый тест: измерение акинезии передних конечностей стороны, подвергнутой обработке, в сравнении со стороной, не подвергнутой обработке. m) Тест в цилиндре: измерение предпочтения ипсилатеральной лапы в сравнении с контралатеральной лапой при подъема не задние конечности. Животные с трансплантатами продемонстрировали существенное улучшение в по меньшей мере трех тестах (p<0,01 на 4,5-5 месяц; n=4-6 в каждом случае). n-p) Иммуногистохимический анализ для TH (зеленый) и одновременной экспрессии (красный) с DAT (n), GIRK2 (o) и кальбиндином (p). Уровни значимости (панели d, k, 1, m) следующие: **p<0,01; p<0,05). Отрезки для определения масштаба соответствуют 200 мкм в (e), 50 мкм в (f), 20 мкм в (h-j) и 40 мкм в (n-p). q-t) Трансплантация ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, во взрослую макаку-резус с повреждениями, вызванными 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP). q) Обзор репрезентативного участка трансплантата через 1 месяц после трансплантации, маркированный за счет экспрессии специ
- 22 041083 фического цитоплазматического маркера SC-121 человека (зеленый), г) Экспрессия TH трансплантате, окруженном гало TH+ волокон (стрелки), s) Исследование одновременной экспрессии SC-121 (красный) и TH (зеленый) в ядре трансплантата, t) Анализ одновременной экспрессии FOXA2 (красный) в TH+ нейронах (зеленый). Отрезки для определения масштаба соответствуют 2 мм для (q), 500 мкм для (r), 200 мкм для (s), и 50 мкм для (t). u) разрастание волокон из трансплантата (huNCAM+) в стриатум реципиента, v) Клетки, полученные из трансплантата, не дифференцируются в глиальные клетки. Однако трансплантаты содержали несколько серотонинергических волокон в дополнение к популяции TH+ клеток.
На фиг. 5 в качестве примера продемонстрирован хронометраж индукции предшественников вентральных пластинок среднего мозга FOXA2/LMX1A, опосредованный воздействием CHIR99021. A) Иммуноцитохимический анализ FOXA2 (красный)/LMX1A (зеленый) на 11 день дифференцировки с последующей обработкой отдельно LSB/S/F8 treatment или в комбинации с CHIR, начинающейся в различные отмеченные промежутки времени. B) Подсчет процентного содержания FOXA2+, LMX1A+ и дважды меченых клеток на 11 день дифференцировки с последующим началом дифференцировки под действием CHIR, как описано в (A). Уровни значимости для индивидуальных маркеров представлены в сравнении с условиями без обработки CHIR: ANOVA; критерий Даннета: ***p<0,001; **p<0,01; p<0,05). Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
На фиг. 6 в качестве примера продемонстрировано, что обработка FGF8 не играет основную роль в индукции предшественников вентральных пластинок среднего мозга FOXA2/LMX1A. Репрезентативные изображения экспрессии FOXA2 (красный)/LMX1A (зеленый), полученные методом иммуноцитохимии на 11 день дифференцировки. Клетки обрабатывали LSB/CHIR в присутствии или в отсутствие SHH (пурморфамин+SHH C25II) и FGF8. Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
На фиг. 7 в качестве примера продемонстрировано, что требуется обработка большой дозой SHH и/или мягким агонистом, представляющим собой малую молекулу, (пурморфамин) для эффективной индукции вентральных пластинок среднего мозга в присутствии CHIR99021. Репрезентативные изображения иммуноцитохимии FOXA2 (красный)/LMX1A (зеленый) на 11 день дифференцировки. Клетки обрабатывали LSB/F8/CHIR в присутствии различных концентраций SHH (SHH-C25II) и мягкого агониста пурморфамина. Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
На фиг. 8 в качестве примера продемонстрирован анализ генов, дифференциально экспрессирующихся в культурах, обработанных LSB/S/F8/CHIR в сравнении с культурами, обработанными LSB и LSB/S/F8, на 11 и 25 день дифференцировки. a) Иерархическая кластеризация данных общей экспрессии генов, полученных для трех условий в дни 0, 1, 3, 5, 7, 11 и 13 (образцы оценивали в тройных повторах для каждого условия и в каждый день). b) Анализ генного обогащения в соответствии с классами GO с применением DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov. Сравнение в 11 день выявило обогащение для сигнальных путей SHH и WNT в условиях обработки LSB/S/F8/CHIR, что согласуется с активацией канонического сигнального пути WNT при обработке CHIR99021. Альтернативные пути развития, такие как развитие переднего мозга и промежуточный мозг, а также гомеобокс, являются другими элементами GO, которые являются высоко обогащенными на 11 и 25 дни. c) Проверка данных в режиме реального времени с применением базы данных экспрессии генов человека Allen (http://human.brain-map.org) для кандидатов в маркеры, обогащенные в условиях для получения ДА нейронов среднего мозга (LSB/S/F8/CHIR). TTF3, EBF1, EBF3 и TTR экспрессировали на основании доступных данных на микрочипах, специфических для участка мозга человека. TTR, классическая транскрипционная мишень FOXA2, слабо экспрессировался только во substantia nigra взрослой особи, что позволяет предположить, что он может играть основную роль в развитии или что обработка SHH может приводить к искусственно высоким уровням экспрессии TTR в ходе дифференцировки in vitro.
На фиг. 9 в качестве примера продемонстрирован протокол дифференцировки для индукции вентральных пластинок и развития ДА нейронов среднего мозга в репрезентативных независимых линиях hESC и hiPSC. Представлены данные, полученные на линии hESC H1, a также на линиях hiPSC 2C6 (из случайного пациента с заболеванием Паркинсона) и SeV6 (на основе линии Sendai, не подвергавшейся интеграции). Использовали протокол на основе вентральных пластинок, описанный на фиг. 1d и 10, с последующим анализом экспрессии FOXA2 (красный) на 11 день и TH (зеленый)/FOXA2 (красный) на 25 день дифференцировки.
На фиг. 10 в качестве примера продемонстрировано схематичное краткое описание условий дифференцировки, использовавшихся для культур ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок и розеткообразных структур. В обоих протоколах использовали двойное ингибирование SMAD для ускорения выбора нейронного пути развития. В указанном протоколе с применением вентральных пластинок использовали LDN для ингибирования BMP, в то время как для розеткообразных структур использовали традиционную для мозга индукцию. Сокращения следующие: LDN: LDN-193189, SB: SB431542, SHH (пурморфамин+SHH C25II), FGF8: FGF8, BAGCT: BDNF+аскорбиновая кислота+GDNF+dbcAMP+TGFβ3. В качестве SHH/FGF8 в протоколе с розеткообразными структурами использовали только SHH C25I в отсутствие пурморфамина, следуя начальной рекомендации для структурирования культур ДА нейронов, полученных из розеткообразных структур. Замечание: обработка пурморфамином на стадии розеткообразных структур продемонстрировала токсичность при концентрации,
- 23 041083 подходящей для структурирования клеток вентральных пластинок. BASF: BDNF+аскорбиновая кислота+SHH/FGF8.
На фиг. 11 в качестве примера продемонстрировано созревание in vitro культур ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок. a) Иммуноцитохимический анализ TH нейронов, полученных из вентральных пластинок, (зеленый) на экспрессию DAT (красный; день 80). b) Обширные участки с Tuj1+ волокнами (красный), простирающиеся на расстояние >2 мм, наблюдали на 60 день дифференцировки. с) На 80 день дифференцировки, одновременная экспрессия GIRK2 (красный) в TH+ нейронах (зеленый). Отрезки для определения масштаба соответствуют 20 мкм в (a), 100 мкм в (b) и 20 мкм в (c).
На фиг. 12 в качестве примера продемонстрирован иммуногистохимический анализ краткосрочного (6 недель) исследования выживаемости in vivo в полосатом теле взрослых интактных (без повреждений) мышей (штамм NOD-SCID IL2Rgc null). Исследование трансплантатов, полученных из вентральных пластинок (клетки на 25 день; 150*103 клеток/животное). A) Репрезентативное изображение ядра трансплантата, демонстрирующее TH+ клетки, окруженные TH+ волокнами реципиента. В среднем 6,200 TH+ клеток (n=3) присутствовало в трансплантате через 6 недель после трансплантации. B) клетки, экспрессирующие FOXA2, (красный) были обнаружены в только трансплантате, но не в окружающем полосатом теле реципиента, демонстрируя происхождение трансплантата и отличительные черты клеток среднего мозга. Почти все TH+ нейроны (зеленый) одновременно экспрессировали FOXA2 (красный). Однако существенная часть FOXA2+ клеток одновременно не экспрессировала TH, что позволяет предположить, что эти клетки не приобрели взрослый фенотип DA или представляют другую FOXA2+ популяцию нейронов, не содержащую маркеры ДА нейронов. Отрезки для определения масштаба соответствуют 50 мкм.
На фиг. 13 в качестве примера продемонстрировано гистологическое долгосрочное (4,5 месяца) исследование мышей с трансплантатами, у которых внесены повреждения с помощью 6-OHDA (штамм NOD-SCID IL2Rgc null strain), путем сравнения поведения у мышей с трансплантатами, полученными из вентральных пластинок, трансплантатами, полученными из розеткообразных структур. Исследование трансплантатов, полученных из вентральных пластинок. a) Пример одного из самых больших трансплантатов, полученных из вентральных пластинок. Указанный трансплантат сохраняет хорошо описанную hNCAM+ (красный) цитоархитектуру. b) На периферии трансплантата наблюдалось сильное разрастание hNCAM+ волокон. с) Серотонинергическиие (5-НТ+) волокна (зеленый) в трансплантате в значительной степени являются негативными по hNCAM (красный), что позволяет предположить их происхождение из реципиента. d) GABA-ергические нейроны и волокна (зеленый) в трансплантате. Исследование трансплантатов, полученных из розеткообразных структур. е) Разрастание нейронов с компрессией ткани мозга реципиента. Большинство клеток были позитивными как в отношении NCAM (красный), так и в отношении DCX (зеленый), что позволяет предположить их нейронное происхождение. f) NCAM+/DCX+ волокна распространились в нетрансплантированную контралатеральную область мозга. g) Внутри ядра трансплантата обнаружены множественные DCX+ кластеры. h) Несколько TH+ клеток (зеленый) и волокон были обнаружены на периферии трансплантата, а практически все TH+ клетки, полученные из розеткообразных структур, in vivo были негативными в отношении FOXA2 (синий). Иммуногистохимическое исследование трансплантатов возраста 4,5 месяца, полученных из вентральных пластинок, в сравнении трансплантатами, полученными из розеткообразных структур. Представлены репрезентативные изображения экспрессии маркера пролиферации Ki67 (красный) и маркера предшественника нейронов PAX6 (зеленый) (i), экспрессии FOXA2/DCX (j), FOXG1/hNCAM (j, врезка), маркера астроцитов GFAP (зеленый) (k). Отрезки для определения масштаба соответствуют 500 мкм в (a), 50 мкм в (b-d), 500 мкм в (е), 50 мкм в (g-h), 50 мкм в (i), 40 мкм в (j) и 20 мкм в (k).
На фиг. 14 в качестве примера продемонстрировано гистологическое долгосрочное (5 месяцев) исследование мышей SD с трансплантатами, у которых внесены повреждения с помощью 6-OHDA. A) Большинство hNA+ (красный) клеток экспрессировали Tuj1 (зеленый), что указывало на характерные особенности развития по нейронному пути. B) GFAP+ волокна (зеленый) внутри трансплантата одновременно не экспрессировали hNA (красный), что позволяет предполагать их происхождение из реципиента. C) Было обнаружено несколько серотонинергических образований (5-НТ+) клеток (зеленый), хотя большинство серотонинергических волокон были получены из реципиента, также как в данных на реципиентах-мышах (на фиг. 13с). D) Дополнительный пример TH+ нейронов (зеленый) внутри трансплантата, охарактеризованного по экспрессии hNCAM (красный) для подтверждения того, что клетки в мозгу реципиента являются клетками человека. Отрезки для определения масштаба соответствуют 25 мкм в панелях.
На фиг. 15 в качестве примера продемонстрировано гистологическое исследование трансплантатов, полученных из вентральных пластинок, в мозгу приматов. Полученные из вентральных пластинок ДА нейроны, полученные из H9 hESCs и из H9-GFP hESCs, (культуры на 25 день; 1.25*106 клеток/тракт, 3 тракта/полусфера, в общем 6 трактов) трансплантировали в стриатум взрослых макак-резус, у которых были получены повреждения с помощью MPTP (=2). A) Верхние левая и правая панели: Реконструкция изображения высокого разрешения репрезентативных участков трансплантата (1 месяц после трансплантации). Цитоархитектура трансплантата проиллюстрирована иммуногистохимическим методом с приме- 24 041083 нением специфического маркера человека SC-121 (отсутствие кросс-реактивности с тканями примата, не являющегося человеком). Нижняя левая панель: SC-121+ волокна, распространяющиеся из ядра трансплантата. Нижняя правая панель: изображение более высокого разрешения SC-121+ клеток, демонстрирующее морфологии нейронных предшественников. B) Исследование экспрессии GFP в ядрах трансплантата, дополнительно подтвердило человеческую идентичность клеток, дополняя данные по SC-121. Замечание: У каждого животного в каждую полусферу трансплантировали немеченые клетки - производные H9, в то время как в другую полусферу клетки, полученные из клеток H9-GFP (экспрессия GFP под контролем промотора EF1a). C) Изображение более высокого разрешения GFP+ трансплантата с применением детекции DAB, демонстрирующее множество GFP+ клеток на периферии трансплантата, показывающие нейробластную морфологию. D) Иммуногистохимические исследования областей в ядре трансплантата, негативных в отношении GFP и SC-121. Эти области содержали большое количество микроглий реципиента, что основывается на данных об экспрессии Iba1 (красный), а также на нескольких ED1+ макрофагах (синий), что позволяет предположить длительное воспаление несмотря на иммуносупрессию циклоспорином. Отрезки для определения масштаба соответствуют 500 мкм в (A, верхняя панель), 50 мкм в (A, нижняя левая панель), 20 мкм в (A, нижняя правая панель), 2 мм в (b), 500 мкм в (C, левая панель), 50 мкм (C, верхняя правая панель), 100 мкм (C, нижняя правая панель), 100 мкм (D).
На фиг. 16 в качестве примера продемонстрировано образование TH+ клеток из hESCs на основе способа с применением предшествующих питающих клеток MS5, в котором клетки дифференцировались в клетки, подобные нейронам DA через (посредством) интермедиаты розеткообразных клеток. Верх) на стадии P0 клетки hESCs вводили в контакт с молекулами для начала индукции нейронов из Oct4+ клеток в розеткообразные клетки с применением питающих клеток MS5 (Perrier et al., 2004). На стадии P1 розеткообразные клетки развивали путем введения клеток в контакт с дополнительными молекулами для дифференцировки клеток в клетки на стадии P2 со специфическими конфигурациями экспрессии, включая Pax2+/En1+ клетки - предшественники DA в дальнейшем дифференцирующие в ТН+/Еп1+ДА нейроны. Эти клетки использовали для трансплантации в крыс, содержащих повреждения, вызванные 6OHDA, и подверженных иммуносупрессии посредством обработки циклоспорином A. Эти исследования по трансплантации продемонстрировали очень низкую выживаемость in vivo нейронов, подобных DA, включая потерю TH+ фенотипа, и выявили проблемы, касающиеся дальнейшего роста нежелательных, вероятно летальных, клеток у трансплантированных животных, например тератом, а также вырастание клеток неподходящего нейронного типа, что может приводить к дополнительным медицинским проблемам у пациентов. A) наблюдалось очень малое количество выживших TH+ нейронов после 4,5 месяцев после трансплантации (<50 TH+ клеток / животное) в трансплантатах из предшественников ДА нейронов, полученных из розеткообразных структур. Однако в противоположность TH+ клеткам, клетки, меченые GFP, (GFP находился под контролем убиквитарного промотора) выживали достаточно хорошо после трансплантации. Это позволяет предположить, что большинство выживших после трансплантации клеток были нервными клетками, не являющимися ДА нейронами (16B). C) несколько клеток, полученных трансплантата (hNA+ (зеленый) одновременно экспрессировали TH (красный), что позволяет предположить, что большинство трансплантированных клеток человека обладают фенотипом нейронов, не являющихся DA. Панели 16 D-E демонстрируют, что D-E, несмотря на очень плохую выживаемость in vivo, наблюдалось некоторое (хотя и очень ограниченное и очень изменчивое) улучшение в нескольких исследованиях поведения, таких как вращения, индуцированные амфетамином, (D), тест в цилиндре и спонтанные вращения (E).
На фиг. 17 в качестве примера продемонстрирован протокол для получения небольшого количества клеток вентральных пластинок. Модифицированный протокол с двойным ингибированием SMAD позволяет получать клетки вентральных пластинок (fp). Высокие концентрации SHH были необходимы для индукции FoxA2+ клеток вентральных пластинок, а такая добавка стимуляторов, вызывающих образование конфигурации каудализации, таких как FGF8, Wnt1 или RA не приводило к снижению экспрессии FOXA2, но вызывало изменение региональных характерных черт. A) Левая панель: клетки на 11 день дифференцировки после обработки NSB (Noggin/ SB431542); левая центральная панель: обработка NSB+SHH (Sonic C25II); центральная панель: NSB+SHH+RA; центральная правая панель: NSB+SHH+Wnt1; NSB+SHH+FGF8; замечание: только обработка NSB не приводит к индукции экспрессии FoxA2. Только FoxA2+ клетки вентральных пластинок индуцировались в присутствии высокой дозы SHH. Добавление RA, Wnt1 и FGF8 не приводит к ингибированию индукции FoxA2. B) Количественный анализ ОТ-ПЦР экспрессии генов FOXA2 и SIX6 демонстрирует сохранение уровня (или даже его увеличение) экспрессии FOXA2 после обработки RA или FGF с сопутствующим уменьшением экспрессии SIX6 с получением самых ранних предшествующих клеток, подобных вентральным пластинкам. C) Индукция экспрессии генов - маркеров предшественников среднего мозга и вентральных пластинок среднего мозга в присутствии FGF8 и Wnt1.
На фиг. 18 в качестве примера продемонстрирован протокол получения клеток вентральных пластинок, демонстрирующий высокие уровни характеристик среднего мозга в сравнении с низкими или отсутствующими уровнями в клетках, полученными в ходе процедур, использовавшихся на фиг. 16 и 17. A) Индукция вентральных пластинок среднего мозга в популяции клеток, контактировавших с высокими
- 25 041083 уровнями SHH, FGF8 и CHIR, приводящая к одновременной экспрессии FoxA2 и маркеров среднего мозга LMX1A и Otx2 на 11-1 день дифференцировки в сравнении с клетками, контактировавшими с молекулами, описанными в двух других процедурах, показанных на фиг. 16 и 17 (N/SB и SHH/FGF8, соответственно). В) Исследование общей экспрессии генов на 11 день, сравнивающее три группы клеток, контактировавших с молекулами из каждой из трех процедур, включая третью процедуру согласно настоящему изобретению (LDN/SB, SHH/FGF8, LSB/SHH/FGF8/CHIR). На графике В специфически продемонстрированы гены, которые являются общими для всех трех условий обработки в сравнении с генами, которые являются уникальными для каждых индивидуальных условий. График B является предварительным анализом, использовавшимся для результатов на микрочипах, представленных на фиг. 1. C) Уровни мРНК маркеров среднего мозга FoxA2, LMX1A являются высоко обогащенными в группе, обработанной LSB/SHH/FGF8/CHIR, в сравнении с группой, обработанной SHH/FGF.
На фиг. 19 в качестве примера продемонстрирована характеристика in vitro дофаминовых нейронов, полученных из вентральных пластинок участка среднего мозга. A) Одновременное мечение FoxA2+ нейронов маркерами ДА нейронов мыши TH, Nurr1 и LMX1A на 25 день дифференцировки. B) уровни экспрессии мРНК, определенные количественной ОТ-ПЦР, маркеров ДА нейронов мыши, а также других типов клеток среднего мозга в группах, обработанных LDN/SB+SHH/FGF8+SHH/FGF8+CHIR.
На фиг. 20 в качестве примера продемонстрирован потенциал сравнения дифференцировки по пути ДА нейронов среднего мозга в клетках PD-iPS с мутацией PINK1 и клетках дикого типа hES (или iPS). Линия БП-иПСК, мутантная по PINK1 Q456X, была дифференцирована в соответствии с новыми способами получения ДА нейронов среднего мозга на основе вентральных пластинок согласно настоящему изобретению с получением профилей дифференцировки среднего мозга, сравнимых с профилями, полученными на линии H9. A-C) Иммуноцитохимический анализ линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 11 день дифференцировки (стадия предшественников клеток среднего мозга) для FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (A), на 25 день дифференцировки (ранняя постмитотическая стадия ДА нейронов) для FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (B) и для NURR1 (красный) и TH (зеленый) (C). D-F) Некоторый набор иммуноцитохимических исследований, осуществленных с применением клеток, полученных из H9, на 11 день дифференцировки для FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (D), на 25 день дифференцировки для FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (E) и для NURR1 (красный) и TH (зеленый) (F).
На фиг. 21 в качестве примера приведена линия БП-иПСК, мутантная по PINK1, демонстрирующая фенотип, подобный фенотипу заболевания Паркинсона с агрегацией белков после продолжительной дифференцировки и созревания in vitro. На 55 день дифференцировки, линия БП-иПСК, мутантная по PINK1, продемонстрировала доказательства экспрессии α-синуклеина (основного компонента образования телец Леви в пациентах с заболеванием Паркинсона) в цитозоле TH+ ДА нейронов. Указанные клетки также продемонстрировали высокую экспрессию убиквитина (классического маркера телец Леви). В противоположность этому, ДА нейроны, полученные из контрольной линии iPS продемонстрировали экспрессию сходную с нормальной синаптической (в противоположность цитозольной) экспрессией αсинуклеина и очень низкие уровни убиквитина. A, B) Иммуноцитохимический анализ линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 55 день дифференцировки для α-синуклеина (LB509, красный), TH (зеленый) и совмещенное изображение (A) и для α-синуклеина (красный) и убиквитина (зеленый) (B). C, D) Иммуноцитохимический анализ контрольной линии iPSC на 55 день дифференцировки для α-синуклеина (красный) и TH (зеленый) (C) и α-синуклеина (красный) и убиквитина (зеленый) (D).
На фиг. 22 в качестве примера продемонстрирована экспрессия агрегированной формы αсинуклеина. В мозгу пациентов с заболеванием Паркинсона димеризованные нерастворимые формы αсинуклеина приводят к агрегации в тельца Леви. У димеризованных форм α-синуклеина показано фосфорилирование серина-129 в α-синуклеине. Клетки, полученные из линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, демонстрируют сильную экспрессию α-синуклеина, фосфорилированного по Ser129, в сравнении с контрольными клетками, полученными из iPSC, которые демонстрируют очень низкие уровни экспрессии. A, B) Иммуноцитохимический анализ α-синуклеина, фосфорилированного по Ser129, (зеленый) и DAPI (синий) в линии клеток, полученной из БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 55 день дифференцировки (A) и контрольной линии клеток, полученной из iPSC (B).
На фиг. 23 в качестве примера продемонстрированы различия в профилях экспрессии αсинуклеина, которые наблюдаются в зависимости от протокола дифференцировки. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что аутентичные ДА нейроны среднего мозга обладают уязвимостью, специфичной для заболеваний Паркинсона, и соответствующими, специфическими фенотипами in vitro. ДА нейроны, полученные с применением классического протокола дифференцировки, основанного на стромальных питающих клетках MS5, (Perrier et al., PNAS 2004, включен в настоящее описание посредством ссылки) могут приводить к большому количеству TH+ нейронов. Однако основываясь на данных согласно настоящему изобретения, указанные TH+ клетки, получающиеся в результате дифференцировки в ходе классического протокола на стромальных питающих клетках MS5, не являются аутентичными ДА нейронами среднего мозга. В культурах, дифференцированных посредством протокола MS5, было большое количество α-синуклеин положительных клеток. Однако эти клетки одновременно
- 26 041083 не экспрессировали TH. Более того, не было различий в профилях экспрессии между БП-иПСК и контрольными iPSC при использовании стратегии дифференцировки MS5. Эти данные указывают на то, что α-синуклеин также экспрессировался в других типах клеток, не являющихся клетками DA, и что такой α-синуклеин в клетках, не являющихся клетками DA, не отличается в клетках заболевания в сравнении с контрольными клетками, полученными из iPSC, в частности, при использовании стандартного протокола дифференцировка MS5. Наконец, новый протокол дифференцировки согласно настоящему изобретению на основе вентральных пластинок приводит к получению большого количества TH+ клеток, одновременно экспрессирующих α-синуклеин. Такие TH+ клетки экспрессируют α-синуклеин в виде профиля экспрессии в цитозоле. A, B) Иммуноцитохимический анализ для α-синуклеина (LB509, красный), TH (зеленый) линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 60 день дифференцировки на основе MS5 (A) и контроль PSC (B). C) Иммуноцитохимический анализ линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 55-1 день дифференцировки на основе вентральных пластинок для α-синуклеина (красный), TH (зеленый).
На фиг. 24 в качестве примера продемонстрировано, что ДА нейроны, полученные из линии БПиПСК, мутантной по PINK1, являются более уязвимыми к токсической стимуляции. TH+ ДА нейроны, полученные из БП-иПСК посредством протокола на основе вентральных пластинок согласно настоящему изобретению, были более уязвимыми к воздействию токсинов (валиномицин: митохондриальный ионофор, 5 мкМ, 48 ч), чем контрольные клетки, полученные из iPSC. В противоположность этому, TH+ нейроны, полученные посредством классического протокола на основе MS5, не продемонстрировали различную уязвимость между клетками, полученными из PD, в сравнении с контрольными клетками. AF) Репрезентативный иммуноцитохимический анализ TH на 60 день дифференцировки: нормальные условия (без обработки токсином) как для клеток, полученных при заболевании Паркинсона, так и для клеток, полученных из контрольных iPSC клеток, полученных с применением протокола на основе вентральных пластинок (A, показаны клетки, полученные из БП-иПСК), практически полная дегенерация TH+ ДА нейронов в БП-иПСК после обработки токсином (B), частично дегенерированные TH+ ДА нейроны из контрольных iPSC (C), нормальные условия как для культур, полученных при заболевании Паркинсона, так и для клеток, полученных из контрольных iPSC клеток, полученных с применением протокола на основе MS5 (D, показаны клетки, полученные из БП-иПСК), TH+ нейроны после воздействия токсина БП-иПСК (E), и культуры, полученные из контрольных iPSC (F) при использовании протокола MS5. G-H) иммуноцитохимические изображения низкого разрешения для Tuj1 (красный) и TH (зеленый) при использовании протокола на основе вентральных пластинок на 60 день дифференцировки: БП-иПСК в нормальных условиях (G) в сравнении с условиями воздействия токсина (H) и контрольные iPSC в нормальных условиях (I) в сравнении с условиями воздействия токсина (J). K-N) иммуноцитохимические изображения низкого разрешения для Tuj1 (красный) и TH (зеленый) при использовании протокола на основе MS5 на 60 день дифференцировки: БП-иПСК в нормальных условиях (K) в сравнении с условиями воздействия токсина (L) и контрольные iPSC в нормальных условиях (M) в сравнении с условиями воздействия токсина (N).
На фиг. 25 в качестве примера продемонстрирован подсчет данных исследования выживаемости клеток в зависимости от дозы при воздействии токсина. Исследование выживаемости клеток с применением красителя alamar-blue через 48 ч после обработки валиномицином продемонстрировало различную выживаемость клеток в специфическом диапазоне дозировок при воздействии токсина (5 и 10 мкМ) при сравнении БП-иПСК и контрольных iPSC (60 день дифференцировки на основе вентральных пластинок согласно настоящему изобретению). Замечание: в настоящем исследовании оценивается общая гибель клеток, хотя наиболее драматические эффекты наблюдались в особенности у ДА нейронов (см. фиг. 14). Следовательно, подсчет, основанный на данных с применением alamar blue, вероятно будет недооценивать степень различия в эффектах, наблюдавшихся в линиях ДА нейронов.
На фиг. 26 в качестве примера продемонстрировано, что трансплантированные ДА нейроны человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, обладают электрофизиологическими характеристиками, типичными для характеристик, обнаруженных в части компактов черного тела (substantia nigra pars compacta, SNpc) мышей. A) Сверху - реконструкция нейрона - создателя ритма (нейрона-ритмоводителя) в участке трансплантата. Снизу - типичная фотомикрография полученного из крысы среза мозга, в который 9-ю месяцами ранее были введены нейроны, полученные из hES; трансплантат очерчен; изображение с большим увеличением приведено внизу в виде вставки. Срез был обработан тирозингидроксилазой, которая показана белым. B). Сверху - типичная присоединенная накладка, производящая запись с предполагаемого ДА нейрона в трансплантате; снизу - типичная запись с целой клетки той же самой клетки. Записи осуществляли в присутствии антагонистов рецепторов глютамата и GABA (50 мкМ AP5, 10 мкМ CNQX и 10 мкМ GABAzine) для того, чтобы элиминировать синаптический входной сигнал. Эти записи продемонстрировали, что указанные нейроны, полученные из PS, были нейронами-ритмоводителями с нормальными интрасоматическими траекториями напряжения. Другие нейроны, записанные в образце трансплантата, имели схожие свойства. C) Для сравнения приведены записи с присоединением к клетке и записи целой клетки дофаминергических нейронов в SNpc взрослой мыши. Сокращения (CTx=кортекс, STr=стриатум, SNpc=часть компактов черного тела, ДА=дофаминергический).
- 27 041083
На фиг. 27 в качестве примера продемонстрирован кандидат в поверхностные маркеры A9 и проверка CD в hPSC. a) Диаграмма Венна данных транскриптома из ДА нейронов мыши, полученных из ESC мыши, очищенных с помощью FACS. Среди 107 генов, поделенных между PITX3 и Nurr1, большинство составляли известные маркеры ДА нейронов среднего мозга, а также было подтверждено, что новые маркеры экспрессируются в вентральном среднем мозге. b) Одним из этих маркеров был DCSM1, предполагаемый поверхностный маркер, который, как кажется на основании данных экспрессии мРНК in situ, обогащен в участке A9 (Allen Brain Atlas, Lein, E.S. et al., Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain, Nature 445: 168-176 (2007)). c-f) проверка CD: c) репрезентативный 96-луночный планшет (1 из 3x96 планшетов, использовавшихся для проверки всей панели CD). В темных лунках отмечены маркеры CD, которые сильно экспрессируются в ДА нейронах hESC на 25 день. e) Краткий обзор результатов проверки CD в нейронах, полученных из hESC. f) Был обнаружен один типичный маркер, CD142, поверхностный маркер, обогащающийся селективно в ДА нейронах на стадии Nurr1+, который затем был выделен с помощью FACS из CD142+ клеток в сравнении с CD142- клетками и проанализирован на 7 день после сортировки.
На фиг. 28 в качестве примера продемонстрирован CD142, обогащенный на стадии Nurr1+ ДА нейронов среднего мозга и истощенный для GABA- и серотонинергических нейронов. a) Проточная цитометрия продемонстрировала репрезентативную экспрессию CD142 на 25 день дифференцировки. b) CD142, обогащенный на стадии Nurr1+ у FOXA2/TH ДА нейронов среднего мозга DA в hESCs (например, WA09; на фиг. 27f) и проверенных линиях hiPSC (C29 и M3X представляют собой две линии iPSC человека на 25 день дифференцировки). с, d) CD142 истощает GABA-эргические и серотонэргические загрязнители после сортировки на 25 день и культивируется in vitro в течение 3 недель. e, f) CD142 истощает GABA-эргические и серотонэргические нейроны in vivo через 3 месяца после трансплантации. Клетки сортировали по CD142 на 25-1 день. Замечание: клетки CD142 также обогащены в отношении TH и AADC.
На фиг. 29 в качестве примера продемонстрировано предполагаемое экспериментальное использование PSA. ДА нейроны, экспрессирующие PST и экспонирующие PSTnm, полученные из hESC будут оцениваться in vitro на предмет влияния на фенотип ДА и разрастание волокон. В исследованиях in vivo в модели на крысах с повреждениями от 6OHDA будет проверяться, может ли меньшее количество ДА нейронов с усиленной экспрессией PSA приводить к восстановлению поведения, достигаемого при использовании стандартных трансплантатов, и возможно ли, чтобы усиленная экспрессия PSA в ДА нейронах, полученных из hESC, приводила выздоровлению, определяемому в исследованиях комплексной моторной функции.
На фиг. 30 в качестве примера продемонстрировано использование PST. Повышенная экспрессия (PST мыши) приводит к повышенным уровням PSA-NCAM в дифференцирующихся клетках ES мыши. A) Подсчет мРНК PST с применением количественной ПЦР в контрольных клетках (Nurr1) и в клетках с повышенной экспрессией PST (Nurr1/PST). Данные представлены в виде кратного обогащения уровней PST в клетках Nurr1/PST в сравнении с клетками Nurr1. B) Иммуноокрашивание PSA в культурах ДА нейронов на 14 день дифференцировки продемонстрировало повышенные уровни PSA в клетках Nurr1/PST (отрезок для определения масштаба: 100 мкм). C) Вестерн-блоттинг NCAM в дифференцированных клетках. Клетки Nurr1/PST (дорожка 2) продемонстрировали повышенные уровни полисиалилированной формы NCAM (пятна, скобки) в сравнении с контролем (дорожка 1). PSA удаляется с NCAM после обработки endoN (дорожка 3). D) Подсчет интенсивности пятен PSA, выраженный в произвольных единицах. E) Исследование PSA с применением FACS на 14 день дифференцировки. Обработка клеток 20 единицами endoN за 24 ч до конца дифференцировки отменяла эффект от PST. F) Репрезентативные фотомикрографии со сравнением Nurr1 и Nurr1/PST дифференцированных клеток в отношении иммунофлюоресценции GFP и маркеров DA. Клетки, отсортированные по GFP, а затем высеянные обратно, сохраняли фенотип DA (после сортировки). Отрезок для определения масштаба: 100 мкм.
На фиг. 31 в качестве примера продемонстрировано исследование ДА нейронов, полученных из ES, с применением FACS. Выделение GFP+ и SSEA-1- клеток с применением проточной цитометрии. В качестве двойного отрицательного контроля и GFP-отрицательного контроля использовали клетки ES мышей J1. Примерно от 5 до 10% клеток было отсортировано как положительные.
На фиг. 32 в качестве примера продемонстрировано, что трансплантаты Nurr1/PST были более эффективными в индукции восстановления поведения на модели с мышами с повреждениями, вызванными 6OHDA. Клетки Nurr1::GFP дифференцировали и сортировали на 14 день для получения GFP+/SSEA-1популяции. Клетки, обработанные 20 единицами endoN, выращивали в течение 12 ч перед сортировкой. 55000 клеток трансплантировали в 1 мл среды N2 с BDNF и AA. A) Животных оценивали по вращению, вызванному амфетамином, (вращения/мин в течение 20 мин) в течение 3 недель перед трансплантацией, а затем через 7 недель после трансплантации. Клетки Nurr1/PST существенно улучшили результат в сравнении с контрольными клетками Nurr1 (2-факторный тест ANOVA: р<0,01, с критерием Боферрони после исследования: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001; 6 животных в каждой группе). Удаление PSA ферментом endoN отменяло эффект от PST (р=0,26). B) В конце исследования в трансплантате PST было больше GFP+ клеток, чем в контроле (р<0,05, критерий Стьюдента). C) Соотношение иммунофлюорес- 28 041083 ценции PSA/GFP в ядре. **р<0,01. Критерий Стьюдента (п=5/тип трансплантата). D) Иммунофлюоресценция GFP, TH и PSA. Отрезок для определения масштаба: 200 мкм. E) Трансплантированные клетки экспрессируют маркеры DA. Приведены отдельные z-уровни конфокальных микрофотографий. Отрезок для определения масштаба: 20 мкм. Значения приведены в виде среднее +/-SEM.
На фиг. 33 продемонстрирована аугментация PSA, которая усиливала иннервацию полосатого тела реципиента ДА нейронами, полученными из ES. Повышенная экспрессия PSA-NCAM усиливала процесс разрастания. A) Репрезентативные фотомикрографии GFP/TH+, GFP/Girk2+ и GFP/синапсин+ процессов в контролях. Окрашивание образцов Nurr1/PST было похожим. Отрезок для определения масштаба: 20 мкм. B) Репрезентативные проекции z-стопок, демонстрирующие GFP+ процесс распространения из обоих трансплантатов, Nurr1 и Nurr1/PST. В трансплантате Nurr1/PST было больше GFP+ процессов распространения из трансплантата(Отрезок для определения масштаба: 50 мкм). Вставки демонстрируют GFP+/TH+ процессы в тех же сечениях. Стрелка: направление роста. C-E) Подсчет интенсивности GFP+ (C, E) и TH+ (D) процессов на различных расстояниях от места трансплантата, нормализованный по интенсивности вблизи от места инъекции (участки были разделены на 5 зон на расстоянии ~100 мкм в стороне. Нормализацию проводили по отношению к зоне I; двухфакторный тест ANOVA, p<0,01 для данных как GFP, так и TH, п=5/тип клеток; значения представлены в виде среднее +/-SEM). Трансплантаты Nurr1/PST прорастили в стриатум реципиента больше аксонов, при этом рост был частично подавлен (E) при обработке endoN. F) Восстановление животных коррелировало со степенью процессов прорастания. В указанном трансплантате продемонстрирована корреляция (анализ линейной регрессии) между интенсивностью прорастания GFP+ аксонов в зоне IV и восстановлением у необработанных животных и животных с трансплантатами Nurr1, обработанными endoN, и Nurr1/PST. Каждое значение представляет данные по одному животному (r2=0,65, р<0,001, n=17).
На фиг. 34 в качестве примера продемонстрировано использование PST в методах, имеющих отношение к повреждению спинного мозга и экспрессии мотонейронов. В спинном мозге, использовавшемся в качестве контроля, трансплантированные шванновские клетки с GFP (SCs) были отделены от места повреждения рубцовой тканью реципиента (A), в то время как шванновские клетки, модифицированные PST, свободно мигрировали незначительные расстояния (B). Такое конструирование с применением PSA привело к улучшению локомоторной активности, промежуточный счет BBB (показана верхняя линия в (C) в сравнении с нижней линией контроля) и двигательные возможности задней конечности (тест ходьбы по решетке; нижняя линия (D) в сравнении с верхней линией контроля). E, H) дифференцировка HB9::GFP клеток ESC мыши в мотонейроны, в которых введение PST повышает разрастание волокон и миграцию клеток (острия стрелок) in vitro (E, F). Трансплантация этих PST-клеток в седалищный нерв приводит к лучшей целевой иннервации, как это показано на множестве нейромышечных слияний (стрелки) в мышцах EDL (G, H).
На фиг. 35 в качестве примера продемонстрировано использование фермента PSTnm. A) PSA, полученный с помощью PSTnm, ингибирует адгезию шванновских в суспензии к монослою шванновских клеток даже более эффективно (красная линия - самая нижняя линия), чем PSA, полученный в результате усиленной экспрессии PST (зеленая линия - средняя линия). B) Иммуноблоттинг PSA в мотонейронах HB9, полученных из ESC, продемонстрировал, что у контрольных образцов, обработанных PSTnm, были недетектируемые уровни PSA. Выращивание с PSTnm + субстрат (CMP - сиаловая кислота) приводило к появлению большой полосы PSA, которая исчезала после обработки endoN. C, D) Подобно эффектам, полученным с геном PST, полисиалилирование этих клеток с помощью PSTnm и субстрата в ходе дифференцировки усиливало разрастание аксонов и миграцию клеток (острия стрелок). E) Иммуноокрашивание PSA ДА нейронов возрастом 30 дней, полученных из hESC. F) Это окрашивание существенно усилилось после обработки PSTnm и субстратом. G) Инъекция in vivo PSTnm отдельно не имела эффекта, в то время как его одновременное добавление с субстратом (H) приводило к сильной экспрессии PSA в полосатом теле мыши.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к области биологии стволовых клеток, в частности к области линиеспецифической дифференцировки плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, которые могут включать, но не ограничиваются перечисленными: эмбриональные стволовые клетки человек (hESC, ЭСКч), помимо неэмбриональных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC, иПСКч), соматические стволовые клетки, стволовые клетки от больных пациентов или любые другие клетки, способные к линиеспецифической дифференцировке. В частности, описаны способы обеспечения линиеспецифической дифференцировки ЭСКч и/или иПСКч в клетки-предшественники вентральной пластинки среднего мозга и затем далее в крупные популяции FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга с применением новых условий культивирования. FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовые (ДА) нейроны среднего мозга, полученные с применением способов согласно настоящему изобретению, далее применяют по различным назначениям, включая, но не ограничиваясь, применение в in vitro анализах для разработки лекарственных средств и в качестве терапевтического средства для обращения заболевания, повреждения или недостатка дофаминовых нейронов у пациента. Далее, предложены композиции и способы для обеспечения дифференцировки
- 29 041083
FOXA2+LMX1A+TH+ дофаминовых (ДА) нейронов среднего мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека для применения в моделировании заболеваний, в частности болезни Паркинсона.
Настоящее изобретение относится к характеристикам болезни Паркинсона (БП), включая выборочную дегенерацию дофаминовых нейронов среднего мозга (mDA, смДА) в мозге пациента. Поскольку основной причиной симптомов БП является селелктивная потера ДА нейронов в черной субстванции вентральной части среднего мозга, БП считается одним из заболеваний, наиболее подходящих для применения клеточно-заместительных терапевтических стратегий лечения. Соответственно, были предприняты многочисленные попытки трансплантации клеток в мозг пациента для возмещения утранченной функции дофаминовых нейронов среднего мозга (mDA). Однако эти эксперименты были нейдачиными, а степень успешности современнынх симптоматических видов лечения, применяемых для пациентов, сильно варьирует. Соответственно, существует потребность в новых видах лечения для пациентов с БП, которые обесепечили бы замедление потери функции нейронов.
Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСКч) являются источником клеток для применения в регенеративной медицине. Направленная дифференцировка ПСКч в специализированные клетки, такие как нейроны спинного мозга (Li, et al. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005), включена в настоящее описание посредством ссылки) или дофаминовые (ДА) нейроны, полученные способами, отличными от способов согласно настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, как описано выше в данном документе, нейроны, называвшиеся ранее дофаминовыми (ДА) нейронами (т.е. в работе Perrier, et al Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004), которая включена в настоящий текст посредством ссылки) или ДА-подобными нейронами (нейронами, подобными дофаминовым) среднего мозга не являются аутентичными дофаминовыми (ДА) нейронами среднего мозга (см. фиг. 3, 10, 13 и 16). Соответственно, авторы настоящего изобретения обозначали полученные из вентральной пластинки дофаминпродуцирующие нейроны, полученные описанными здесь способами, т.е. дофаминпродуцирующие нейроны в соответствии с настоящими изобретениями как аутентичные, поскольку, в отличие от дофаминпродуцирующих нейронов, полученных описанными в публикациях способами, при трансплантации аутентичных дофаминпродуцирующих нейронов в соответствии с настоящими изобретениями грызунами и приматам, они обращают состояния, подобные перкинсонизму, и вызывают меньше сложностей, связанных с избыточным ростом нейронов и образованием тератомы. Также, в отличие от более ранних способов получения дофаминпродуцирующих нейронов, аутентичные дофаминовые нейроны в соответствии с настоящими изобретениями получают в более высоком процентном отношении относительно исходной популяции, а также они сохраняют способность к приживлению в течение нескольких месяцев культивирования.
Соответственно, были созданы способы получения аутентичных ДА нейронов среднего мозга с применением описанных здесь способов дифференцировки. Однако эффективное применение ПСКч для клеточной терапии сильно отстает от успехов в культивировании клеток. Хотя была показана эффективность ДА нейронов, полученных из ПСК мышей в моделях болезни Паркинсона (БП) (Tabar, et al. Nature Med. 14, 379-381 (2008); Wernig, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 5856-5861 (2008), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки), ДА нейроны, полученные из ПСК человека обычно плохо работают in vivo (Lindvall and Kokaia, J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Помимо отсутствия компенсации потери эндогенной нейрональной функции, имеют место серьезные проблемы в отношении безопасности применения полученных из ПСКч нейронов для трансплантакии, которые связаны с тем, что они могут образовывать тератомы или приводить к избыточному росту нейронов Roy, et al. Nature Med. 12, 1259-1268 (2006); Elkabetz, et al. Genes Dev. 22, 152-165 (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки).
Другим возможным источником клеток для трансплантации являются ДА нейроны, полученные из человеческих ЭСК. Предшествующие попытки применения этих клеток в качестве исходной популяции клеток для получения дифференцированных клеток, которые считались Да-подобными нейронам среднего мозга, полученными из эмбриональных стволовых клеток человек (hESC, ЭСКч), которые трансплантировали грызуна в модели БП, характеризовались низкой in vivo выживаемость, трансплантатов после трансплантации. Эта неудача скорее всего связана с неполной дифференцировкой ДА нейронов среднего мозга in vitro, в результате который образовывались клетки, которые казались ДА нейронами среднего мозга, но не обладали способностью приживаться и восполнять потерю функции нейронов. Фактически, авторы настоящего изобретения показали, что ДА-подобные нейроны, которые ранее производились в из лабораториях и описывались в публикациях, не относились к тому же типу клеток, что и ДА нейроны вентральной пластинки среднего мозга согласно настоящим изобретениям, и не обладают сходными с ними функциями или способностью к способностью к приживлению, см., например, фиг. 16 и 17. Соответственно, авторы также обнаружили, что для обеспечения направленной дифференцировки клеток в лаборатории и получения популяций клеток, содержащих большое количество адекватно функционирующих нейронов, клетки должны пройти через конкретные стадии развития, чтобы образовать подходящую популяцию клеток для применения в заместительной терапии. Авторы также обнаружили, что, по меньшей мере, для получения приживляемых ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями,
- 30 041083 должны иметь место определенные стадии развития, такие как FOX2A/LIM1A+ промежуточная стадия дня. Авторы обнаружили, что если клетки не проходят такие стадии развития, образующиеся в результате ДА-подобные нейроны не обладают теми же функциональными способностями, что и ДА нейроны среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями, которые получают из промежуточных
FOX2A/LIM1A+kлеток 11 дня.
В отличие от того, что наблюдали ранее, в настоящем документе описаны новые методики культивирования, относящиеся к основанным на индукции клеток вентральной пластинки стратегиям получения человеческих ДА нейронов, которые эффективно приживаются in vivo. Соответственно, предполагается, что то, что раньше не удавалось получить популяции клеток, состоящие в основном из комиттированных ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями (т.е. FOXA2+ и LMXIA+ДА нейронов, способных к эффективному приживлению), является причиной неудач трансплантации ДАподобных нейронов, т.е. вследствие незавершенной специализации ДА-подобных клеток. Ранее предполагали, что причиной неудач трансплантации является особая уязвимость клеток, т.е. ДА-подобные нейроны из культуры были неспособны пережить стресс при трансплантации. Как описано здесь, FOXA2+/LMX1A+ предшественники вентральной пластинки среднего мозга получали из ПСКч через 11 дней после обработки низкомолекулярными активаторами белка sonic hedgehog (SHH) и канонической передачи сигнала WNT. Эти клетки 11 дня, являющиеся дважды положительными: по FOXA2+ и LMX1A+, приводят в контакт с дополнительными малыми молекулами для индукции дальнейшей дифференцировки в приживающиеся ДА нейроны среднего мозга, положительные по TH+, FOXA2+ и LMX1A+, к 25 дню. Эти зрелые ДА нейроны вентральной пластинки среднего мозга можно поддерживать in vitro в течение нескольких месяцев. Масштабное молекулярное in vitro исследование, биохимические и электрофизиологические данные показали развитие и подтвердили идентичность полученных из ЭСКч ДА нейронов среднего мозга. Выживание и функционирование In vivo было продемонстрировано в моделях БП на животных, в трех видах-хозяевах. Долгосрочная приживаемость у мышей и крыс с индуцированными 6-OHDA повреждениями продемонстрировала устойчивую выживаемость ДА нейронов среднего мозга, полное восстановление вызванного амфетамином поведения с вращением и улучшения в тестах на использование передних конечностей и акинезию. Наконец, масштабируемость была продемонстрирована путем трансплантации обезьянам с паркинсонизмом. Прекрасные выживаемость и функционирование нейронов и отсутствие избыточного роста нейронов в трех моделях с применением животных указывает на перспективы для разработки клеточных терапевтических средств для применения при БП на основе композиций и способов в соответствии с настоящими изобретениями.
Соответственно, основной областью применения своей разработки авторы считают обеспечение возможности получения неограниченного источника полностью функциональных ДА нейронов среднего мозга из вентральной пластинки, пригодных для доклинических и клинических терапевтических приложений. В поверхностном изложении, авторы обнаружили новый протокол для эффективной дифференцировки смДА нейронов, по меньшей мере, из популяций плюрипотентных клеток, выделенных из организма грызунов и людей (эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs, ИПСКч)). В этих исследованиях использовали мутантные линии иПС клеток PINK1, полученные из организма пациента-человека с болезнью Паркинсона (Seibler, et al., The Journal of Neuroscience, 2011, 31(16):5970-5976, цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Популяции стволовых клеток человека (ЭСКч и иПСКч) дифференцировали в клетки с фенотипом среднего мозга, которые после приведения в контакт с молекулами для созревания нейронов давали начало более аутентичным приживляемым ДА нейронам. Этот протокол использовали для демонстрации высокого выхода потомства ЭСКч к 11 дню направленной дифференцировки фенотипа ДА нейронов среднего мозга (mDA, смДА), который включал экспрессию ключевых факторов транскрипции, например, TH, FoxA2 и LMX1A, которое поелс дальнейшей дифференцировки давало дополнительные ключевые белки, например TH. Трансплантация этих полученных из ЭСКч смДА нейронов грызунам с и приматам-хозяевам с ослабленным иммунитетом, в отличие от применения полученных ранее in vitro ДА нейронов, показало хорошую in vivo выживаемость привитых клеток и функциональное восстановление нарушений поведения.
Преимущества применения способов в соответствии с настоящими изобретениями для получения ДА нейронов перед другими способами станут частично ясны из приведенной ниже информации. Применение соматических стволовых клеток и нейрональных стволовых клеток в других способах с целью получения аутентичных ДА нейронов среднего мозга, эффективно приживающихся in vivo, не было успешным (обзор можно найти в публикации Kriks & Studer, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons (под ред. Pasterkamp, et al.) (Landes Biosciences, 2008, цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Плюрипотентные стволовые клетки, такие как ЭС клетки затем применяли в качестве источников приживающихся клеток. Ранние исследования 1990х с применением ЭС клеток мышей продемонстрировали пригодность производных специфических линий из плюрипотентных клеток in vitro, включающих нейроны (Okabe, et al., Mech. Dev. 59:89-102 (1996); Bain, et al., Dev. Biol. 168v342-357 (1995), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки). Фактически ДА нейроны среднего мозга получали с применени- 31 041083 ем стратегии направленной дифференцировки (Lee, et al., Nat. Biotechnol. 18v675-679 (2000), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки) на основании информации о развитии, полученной в ранних исследованиях с трансплантатами (Ye, et al., Cell 93:755-766 (1998), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Другие стратегии направленной дифференцировки использовали для получения других типов нейронов, таких как соматические мотонейроны (Wichterle, et al., Cell 110, 385-397 (2002), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Однако эти усилия не принесли результата в случае популяций клеток, содержащих высокую долю ДА нейронов среднего мозга или клеток, способных восстанавливать функцию нейронов in vivo. Фактически, получаемая популяция содержала смесь типов клеток в дополнение к ДА нейронам среднего мозга. Далее авторы изобретения разработали другие способы получения ДА нейронов среднего мозга, частично описанные ниже, однако эти популяции клеток также представляли собой смеси типов клеток и не восстанавливали нейрональную функцию. В частности, человеческие ЭС клетки дифференцировались в ранние нейроэпителиальные клетки, называемые нервными розетками, с последующей индукцией клеток стадии розетки в клетки, экспрессирующие предшественник ДА нейронов среднего мозга и дифференцированные маркеры. Эти клетки продолжали демонстрировать функциональные свойства нейронов в электрорфизиологических исследованиях, высвобождение ДА in vitro и образование положительных по TH в иммунозолотом анализе синаптических контактов (Perrier, et al. From the Cover: Derivation of midbrain dopamine neurons from Human Embryonic Stem Cells. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Однако несмотря на многообещающие результаты in vitro, трансплантация клеток мышам с 6OHDA-индуцированными поражениями давала очень небольшое число выживших дофаминергических нейронов. Такой отрицательный результат был неожиданным, учитывая убедительные свидетельства функциональности полученных из мышиных ЭС клеток ДА нейронов in vivo (Barberi, et al., Nat. Biotechnol. 21:1200-1207 (2003); Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008); Bjorklund, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:2344-2349 (2002); Kim, et al. Nature 418:50-56 (2002), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки), устойчивые функциональные свойства in vitro ДА нейронов, полученных из ЭС клеток человека (Perrier, et al., From the Cover: Derivation of midbrain dopamine neurons Human Embryonic Stem Cells. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки) и явные свидетельства того, что фетальные ДА нейроны человека могут выживать в форме ксенографта в полосатом теле (Brundin, et al. Exp. Brain Res. 70:192-208 (1988); Bjorklund, et al., Neuronal replacement by intracerebral neural implants in animal models of neurodegenerative disease. Raven. Press., New. York. 455-492 (1988), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки). В течение почти 8 лет после первых неудачных попыток трансплантации ДА нейронов, полученных из ЭС клеток человека, в этой области почти не наблюдалось прогресса. Некоторые ограниченные улучшения наблюдали при применении источников плюрипотентных стволовых клеток приматов (Sanchez-Pernaute, et al. Long-term survival of dopamine neurons derived from parthenogenetic primate embryonic stem cells (Cynol) in rat and primate striatum. Стволовые клетки 23:914-922 (2005), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки), клетки, предварительно обработанные FGF20 или Wnt5A, или ЭС клетки человека, дифференцировались в присутствии факторов, секретируемых иммортализованными астроцитами среднего мозга (Roy, et al., Nature Med. 12:1259-1268 (2006), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Однако ни одна из предыдущих стратегий не обеспечивала получения обогащенной популяции ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями для применения в процедурах приживления для восстановления функции нейронов in vivo.
I. Способы культивирования клеток для индуцирования (линии) нейрональных клетокпредшественников: приведение в контакт плюрипотентных стволовых клеток человека с SB431542 и LDN-193189 давало линию дифференцированных нейрональных клеток.
В приведенных ниже примерах описаны примеры способов получения клеток нейрональной линии для применения в разработках в соответствии с настоящими изобретениями.
Двойное ингибирование SMAD ранее использовалось в качестве быстрого и эффективного способа индукции одного типа клеток нейрональной линии из ПСКч (Chambers, et al., Nat Biotechnol 27, (2009), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Эти нейрональные линии, индуцированные молекулами, включая Noggin, обычно (в отсутствие воздействия) дифференцируются по пути, который обеспечивает дифференцировку в клетки центральной нервной системы, что соответствует судьбе нервных клеток. В последующих исследованиях было выявлено, что применение низкомолекулярного дорсоморфина (DM) вместо Noggin, по меньшей мере, частично, близкие, но не идентичные дифференцированные клетки, причем основные различия проявлялись в культурах (Kim, et al, Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev 6, 270-281, (2010); Zhou, et al., High-Efficiency Induction of Neural Conversion in hESCs and hiPSCs with a Single Chemical Inhibitor of TGF-beta Superfamily Receptors. Stem Cells, 504, (2010), цитируемые источники включены в настоящий текст посредством ссылки). Авторы изобретения наблюдали, что клетки, полученные с применением Noggin, хотя и находятся на той же стадии развития, что и клетки, обработанные LDN, экспрессируют в основном те же маркеры и обладают близкими способностями к разви- 32 041083 тию в различные нейрональные линии, также имеют некоторые отличия, например находятся в более переднем положении на передне-задней оси (т.е. ближе к переднему мозгу, больше клеток экспрессируют
FOXG1 и т.п.) от нервных клеток, индуцированных с применением LDN Соответственно, хотя LDN использовался вместо Noggin для ингибирования BMP, среди других сигнальных путей, Noggin и LDN возможно обладают другими типами активности, помимо ингибирования BMP.
Частично из-за высокой стоимости применения Noggin авторы изобретения исследовали возможность применения ингибитора BMP вместо Noggin для дифференцировки клеток по нейрональному пути. Соответственно, использовали низкомолекулярный ингибитор BMP, LDN-193189, (Yu, et al., Nat Med 14, 1363-1369, (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки) и обнаружили, что он может заменять Noggin в ходе развития в соответствии с настоящими изобретениями в комбинации с SB431542, обеспечивая получение примитивной нейроэктодермы из ПСКч, клеток нейрональной судьбы (линии), т.е. клеток ЦНС (фиг. 2A). Такую комбинированную обработку обозначили LSB, в соответствии с комбинацией этих двух ингибиторов LDN-193189 и SB431542.
Обычно дифференцировку клеток инициировали путем обработки высоко конфлюэнтного монослоя ЭСч или иПСч путем двойного ингибирования передачи сигнала SMAD. В предпочтительных вариантах реализации процент конфлюэнтности составляет 50-100%, а наиболее предпочтительна конфлюэнтность 70-80%. Для специалиста очевидно, что исходная плотность клеток, необходимая для достижения предпочтительной конфлюэнтности согласно настоящему изобретению, будет зависеть от типа и размера клеток, эффективности посева, выживаемости, адгезии и других параметров, которые могут быть определены эмпирическим путем специалистом без слишком трудоемких экспериментов. Двойное ингибирование SMAD может быть осуществлено с использованием различных соединений, включая Noggin, SB431542, LDN-193189, дорсоморфина или других молекул, которые блокируют передачу сигнала TGFe, BMP и Activin/Нодаль. В предпочтительном варианте реализации используется композиция, содержащая SB431542 и LDN-193189 (совместно, LSB) в концентрации 0,1-250 мкМ или, более предпочтительно 1-25 мкМ, или, в наиболее предпочтительном варианте, 10 мкМ соединения SB431542 и 105000 нМ или, наиболее предпочтительно 100-500 нМ соединения LDN-193189.
II. Образование ДА нейронов из ЭСКч через промежуточные розеточные клетки и результаты исследований трансплантатов, в которых использовались эти ДА-подобные нейроны.
Ранее авторы изобретения использовали несколько других способов направленной дифференцировки, которые давали популяции клеток, содержащие ДА-подобные нейроны. Эти ДА-подобные нейроны использовали в исследованиях по тренсплантации, результаты которых вызвали сомнения в возможности последующего применения этих клеток в терапевтических приложениях. В качестве примеров, процедуры, описанные у Perrier et al., 2004 и Fasano et al., 2010, включая индукцию нейронов на основе MS5, приводили к образованию розеточных клеток и использовались для получения предшественников 11 дня, (см. фиг. 2, 16 и 17 в качестве примеров), которые далее применяли для получения ДА-подобных нейронов. Эти нейроны получались из небольшой доли клеток-предшественников в образующихся на 11 день популяциях клеток. Исследования трансплантации с использованием этих нейронов продемонстрировали низкую выживаемость после трансплантации и утрату ДА-подобного фенотипа нейронов в дополнение к наблюдавшемуся после трансплантации развитию неприемлемых типов нервных клеток и потерю контроля над ростом клеток, которая приводила к образованию тератом. См. фиг. 16 и 17.
В частности, на стадии P0 ЭСКс приводили в контакт с молекулами для начала превращения Oct4+ клеток в розеточные клетки с использованием фидерных клеток MS5 (Perrier et al., 2004). На стадии P1 розеточные клетки размножали путем приведения клеток в контакт с дополнительными соединениями для обеспечения дифференцировки клеток в клетки стадии P2 со специфическим паттерном экспрессии, включая Pax2+/En1+ клетки-предшественники ДА, которые затем дифференцировались в TH+/En1+ ДА нейроны. Эти клетки использовали для трансплантации крысам с вызванными 6OHDA повреждениями, иммуносупрессированными циклоспорином A. Описанные эксперименты по трансплантации показали плохую выживаемость in vivo, потерю фенотипа TH+, проблемы, связанные с дальнейшим разрастанием в нежелательные, возможно летальные, клетки, такие как тератомы, и перерастанием в неприемлемые типы нейронов, которые могут вызвать дополнительные медицинские проблемы у пациента.
Наблюдалось очень маленькое количество выживших TH+ нейронов через 4,5 месяца после трансплантации (<50 TH+ клеток/животное) в трансплантатах из предшественников ДА нейронов, полученных из розеток, фиг. 16A. Однако в противоположность TH+ клеткам, клетки, маркированные GFP (GFP находился под контролем убиквитарного промотора), показали довольно хорошую выживаемость после трансплантации. Это говорило о том, что клетками с наиболее хорошей выживаемостью после трансплантации были нейронные клетки, не относящиеся к ДА нейронам (16B). Несколько клеток, полученных из трансплантата (hNA+, зеленые), одновременно экспрессировали TH (красные), что также говорило о том, что большинство трансплантированных клеток человека относятся к фенотипам нейронов, не являющихся ДА нейронами, фиг. 16C. Секции фиг. 16 D-E показывают, что, несмотря на очень плохую выживаемость in vivo, наблюдалось некоторое улучшение (варьируемое в низкой и высокой степени) в нескольких поведенческих тестах, таких как тест на вращение, индуцированное амфетамином, (D), тест с цилиндром и спонтанные вращения (E).
- 33 041083
Индукцию нейронов без фидерных клеток осуществляли как описано ранее (Chambers и др., 2009), но с модификациями для получения клеток вентральных пластинок (Fasano и др., 2010, цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки).
При использовании модифицированного способа двойного ингибирования SMAD для дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки вентральной пластинки авторы настоящего исследования ранее обнаружили, что для индукции FP к 11 дню требовались высокие концентрации SHH. Например, в некоторых вариантах осуществления добавляли Sonic C25II в концентрации 200 нг/мл. В некоторых экспериментах добавляли DKK-1 (R&D; 100 нг/мл), FGF8 (R&D; 50 нг/мл), Wnt-1 (Peprotech; 50 нг/мл) и ретиноевую кислоту (R&D; 1 мМ), см. фиг. 17. При этом ни одна из популяций клеток, полученных с использованием ранее известных методов, не содержала на 11 день высокой доли предшественников клеток FOXA2+/LMX1A+ вентральных пластинок среднего мозга, получаемых с использованием способа согласно настоящему изобретению.
III. Соединения для применения в направленной дифференцировке: скрининг низкомолекулярных соединений с использование клеток нейрональных линий в соответствии с настоящими изобретениями давал соединения, которые обеспечивали дифференцировку клеток в FOX2A+ и LIMX1A+ нервные клетки к 11 дню культивирования.
В приведенных ниже примерах описано применение примеров клеток из раздела I для скрининга низкомолекулярных соединений и определения, приведет ли их применение к направленной дифференцировке популяции клеток, содержащей высокую долю нейронов вентральной пластинки среднего мозга к 11 дню после первичного контакта с двойными ингибиторами SMAD. Результаты этого скрининга вначале показали что соединение, активирующее SHH, совместно с активацией FGF8 и Wnt обеспечивало эффективное образование FOXA2+/LMX1A+ положительных клеток вентральной пластики среднего мозга к 11 дню дифференцировки. Здесь приведены результаты примеров экспериментов, в которых устанавливали, какие молекулы необходимы, и определяли оптимальное время контакта для получения делаемых FOXA2+/LMX1A+ положительных популяций клеток на 11 день.
Недавние генетические исследования на мышах продемонстрировали важную роль фактора транскрипции FOXA2 в развитии и выживании ДА нейронов среднего мозга. Уникальным свойством развивающегося среднего мозга является одновременная экспрессия маркера вентральной пластинки FOXA2 и маркера покрышки среднего мозга LMX1A. Обычно клетки вентральной пластинки и крыши расположены в различных участках ЦНС (одни - вентрально, а другие - дорсально) и требуют резко противоположных паттернов индукции. Недавно было описано получение область-специфичных предшественников вентральной пластинки из ЭСКч с использованием модифицированного протокола двойного ингибирования. Каноническая передача сигнала Wnt была важна как для функционирования покрышки, так и для развития ДА нейронов среднего мозга.
A. CHIR99021 (CHIR) индуцировал высокие уровни предшественников ДА нейронов среднего мозга к 11 дню культивирования. Как описано в настоящем документе, обработка соединением CHIR99021 (CHIR) эффективным ингибитором GSK3e, который, как известно, существенно активирует передачу сигнала WNT, индуцировала LMX1A в FOXA2+ предшественники вентральной пластинки (фиг. 1a). CHIR был более эффективен, чем рекомбинантный Wnt3A или Wnt1, в индукции экспрессии LMX1A. Эффективность индукции LMX1A зависела от времени обработки CHIR, максимальный эффект достигался на 3-11 день (фиг. 5). CHIR индуцировал совместную экспрессию FOXA2/LMX1A, а другие факторы, такие FGF8, обладали только незначительными эффектами (фиг. 6). Индукция совместной экспрессии FOXA2/LMX1A требовала значительной активации передачи сигнала SHH с использованием пурморфамина, низкомолекулярного агониста, самостоятельно или в комбинации с рекомбинантным SHH (фиг. 7).
Обработка агонистами SHH (пурморфамин+SHH) и FGF8 (S/F8) в отсутствие CHIR99021 демонстрировала гораздо более низкую экспрессию FOXA2 к 11 дню и полное отсутствие экспрессии LMX1A (фиг. 1a, b). Двойное ингибирование SMAD (обработка LDN-193189+SB431542=LSB) не приводила к образованию экспрессирующих FOXA2 клеток, но не давала подгруппы LMX1A+ клеток (фиг. 1a, b). Маркер передней области OTX2 был устойчиво индуцирован в культурах, обработанных LSB и LSB/S/F8/CHIR, но не в условиях LSB/S/F8 (фиг. 1a, c). Проводились систематические сравнения этиз трех условий культивирования (фиг. 1d) с использованием глобального временного профайлинга экспрессии генов. Иерархическое выделение кластеров дифференциально экспрессировавшихся генов позволило различать эти три набора условий обработки на 11 день дифференцировки (фиг. 8a). FOXA1, FOXA2 и несколько других мишеней SHH ниже по каскаду, включая PTCH1, были среди наиболее дифференциально регулировавшихся транскриптов в LSB/S/F8/CHIR в сравнении с наборами обработки LSB (фиг. 1e). Экспрессия LMX1A, NGN2, и DDC указывала на предопределенность пути развития в предшественника ДА нейрона среднего мозга уже на 11 день (фиг. 1e, f). В отличие от этого, культуры LSB на 11 день были обогащены маркерами предшественников дорсального заднего мозга, такими как HES5, PAX6, LHX2, и EMX2. Прямое сравнение LSB/S/F8/CHIR с обработкой LSB/S/F8 (фиг. 1f) подтвердило селективное обогащение маркеров предшественников ДА нейронов среднего мозга в группе LSB/S/F8/CHIR и указывало на идентичность предшественников гипоталамуса в культурах, обработан- 34 041083 ных LSB/S/F8, на основании дифференциальной экспрессии RAX1, SIX3, и SIX6 (см. также экспрессию POMC, OTP на фиг. 2D ниже). Полный список дифференциально экспрессировавшихся транскриптов в табл. 1, 2 и онтологический анализ генов на фиг. 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov), подтвердили обогащение канонического сигнального пути WNT при обработке CHIR Первичные данные еще недоступны на GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/accession#: [TBD]). Сравнительный временной анализ экспрессии генов маркеров предшественников ДА среднего мозга (фиг. 1g) с маркерами пути развития передних и вентральных нейронов, не являющихся ДА (фиг. 1h), привел к выявлению трех типов индукции: i) LSB: дорсальный задний мозг; ii) LSB/S/F8: вентральный/гипоталамический и iii) LSB/S/F8/CHIR: соответствующий предшественнику ДА среднего мозга.
Клетки, полученные с применением описанного здесь протокола, для обеспечения развития в соответствии с настоящими изобретениями, сравнивали с клетками, полученными предшествующими методами. На фиг. 2 и 18 показаны примеры визуального сравнения с SHH/FGF8+ клетками, обработанными CHIR, в соответствии с настоящими изобретениями. На фиг. 19A приведены примеры клеток, дважды меченых FOXA2/Tuj1, после обработки LSB/S/F8/CHIR (верхние панели) и совместного мечения FOXA2 метками TH, Nurr1 и LMX1A (нижние панели). Эти комбинации маркеров позволяют выявлять предшественники ДА нейронов на ранних стадиях. На фиг. 19B приведены данные по экспрессии генов (для сравнения с фиг. 2E) для ключевых маркеров предшественников дофаминовых нейронов.
Материалы и методы в целом описаны в настоящем документе: линии человеческих ЭСК ESC (H9, H1) и иПСК (2C6 и SeV6) обрабатывали в соответствии с модифицированным протоколом индукции вентральных пластинок (Fasano, и др., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), основанном на двойном ингибировании SMAD (Dual SMADinhibition) (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Время воздействия реагентов SHH C25II, пурморфамина, FGF8 и CHIR99021 на вентральные пластинки среднего мозга оптимизировали для получения новых популяций ДА нейронов (см. фиг. 1d). После индукции вентральных пластинок последующее созревание (11-25 дней или дольше 25 дней в культуре до по меньшей мере 100 дней в культуре) осуществляли в среде для дифференцировки на основе Neurobasal/B27 в присутствии факторов выживаемости и созревания ДА нейронов (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), таких как AA, BDNF, GDNF, TGFe3 и dbcAMP (подробности приведены в полном описании метода). Фенотип полученной популяции ДА нейронов тщательно исследовали иммуноцитохимическими методами, методом количественной ОТ-ПЦР, определения глобального профиля экспрессии генов, ВЭЖХ-анализа для определения дофамина и регистрации электрофизиологических характеристик in vitro. Исследования in vivo осуществляли на грызунах с гемипаркинсонизмом (мыши или крысы, которым токсин 6OHDA был введен в одно полушарие мозга). Указанные исследования проводили на невзрослых мышах NOD-SCID IL2Rgc (Jackson labs) и взрослых крысах Sprague Dawley из Taconic Farms, у которых вызывали повреждения 6-гидроксидопамном посредством стереотактических инъекций указанного токсина как описано ранее, а также на двух взрослых макаках-резус, получавших односторонние инъекции MPTP в сонную артерию.
ДА нейроны вводили путем стереотактической инъекции в полосатое тело животных (150x103 клеток мышам, 250x103 клеток крысам) и суммарно 7,5x106 клеток (распределенных в 6 участков; по 3 с каждой стороны мозга) макакам. Поведенческие тесты проводили ежемесячно после трансплантации, включая тест на вращение, индуцированное амфетамином, а также тест на фокальную акинезию (stepping test, шаговый тест) и тест на использование конечностей (тест в цилиндре). Крыс и мышей умерщвляли на 18-20 неделе, а приматов - через 1 месяц после трансплантации. Изучение характеристик трансплантатов осуществляли посредством стереологического анализа количества клеток и объема трансплантата, а также посредством тщательного исследования фенотипа с использованием иммуногистохимических методов.
Культура недифференцированных ЭС клеток человека. Линии клеток hESC H9 (WA-09, XX, 27-55 пассажей после 10/2009), H1 (WA-01, XY, 30-40 пассажей после 6/2010) и линии клеток iPS 2C6 (Kim, и др. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) (XY, 20-30 пассажей) и SeV6 (XY, 20-30 пассажей; получены из эмбриональных фибробластов MRC-5 с применением неинтегрирующей 4-х факторной векторной системы Sendai (Ban, и др. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (2011) 108(34):14234-14239:10,1073/pnas.1103509108, цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) поддерживали на эмбриональных фибробластах мыши при расчетных концентрациях посева в диапазоне от 0,5x103 на см2 до 100x103 на см2 на по ЭС клеткам человека, при которых клетки склонны к образованию кластеров (MEF, Global Stem, Rockville, MD) в оптимальной среде для ЭС клеток человека, содержащей 20% заменителя сыворотки Knockout serum replacement (KSR, Invitrogen, Carlsbad, California) (как описано ранее (Kim, и др. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Используемое количество заменителя сыворотки Knockout может варьировать в диапазоне от 0 до 40%.
Индукция нейронов. Для индукции дофаминовых нейронов вентральной пластинки среднего мозга
- 35 041083 использовали модифицированную версию двойного ингибирования SMAD (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) и протокол индукции вентральных пластинок (Fasano, и др. Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), основанного на воздействии в течение определенного времени реагентами LDN-193189 (100 нМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 мкМ, Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542 (10 мкМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 мкМ, Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II (100 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-2000 нг/мл, R&D, Minneapolis, MN), пурморфинамином (2 мкМ (в диапазоне концентраций 10-500 нг/мл, Stemgent), FGF8 (100 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-500 нг/мл, R&D) и CHIR99021 (CHIR; 3 мкМ (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкМ, Stemgent). Замечание: в протоколе индукции вентральных пластинок обработка SHH относится к обработке, т.е. приведение клеток в контакт с комбинацией SHH C25II 100 нг/мл+пурморфамин (2 мкМ). Клетки высевали (35-40x103 клеток/см2) и выращивали в течение 11 дней на геле matrigel или geltrex (использовались в том виде, в котором приобретены) (BD, Franklin Lakes, New Jersey, США) в среде с заменителем сыворотки Knockout (KSR), содержащей DMEM, 15% KSR, 2 мМ L-глютамин и 10 мкМ (в диапазоне концентраций 1-25 мкМ) β-меркаптоэтанол. Среду KSR последовательно замещали средой N2, начиная с 5 дня дифференцировки, смешивая их в соотношениях 75%(KSR):25%(N2) на 5-6 день, 50% (KSR):50%(N2) на 7-8 день и 25% (KSR):75% (N2) на 9-10 день, как описано ранее (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). На 11 день среду заменяли на среду Neurobasal/B27 (разведение 1:50) /L-Glut-содержащую (эффективный диапазон 0,2-2 мМ) среду (NB/B27; Invitrogen), дополненную CHIR (до 13 дня) и BDNF (полученный из мозга нейротрофный фактор, 20 нг/мл в диапазоне от 5 до 100; R&D), аскорбиновой кислотой (AA; 0,2 мМ (в диапазоне концентраций 0,01-1 мМ), Sigma, St Louis, M1), GDNF (нейтрофный фактор глиальных клеток, 20 нг/мл (в диапазоне концентраций 1-200 нг/мл); R&D), TGFe3 (трансформирующий фактор роста типа β3, 1 нг/мл (в диапазоне концентраций 0,1-25 нг/мл); R&D), дибутирил цАМФ (0,5 мМ (в диапазоне концентраций 0,05-2 мМ); Sigma), и DAPT (10 мМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 нМ); Tocris,) в течение 9 дней. На 20 день клетки подвергали диссоциации с применением Accutase® (Innovative Cell Technology, San Diego, California) и пересевали в условиях повышенной плотности клеток (например, 300-400 тыс. клеток/см2) на чашки, предварительно покрытые полиорнитином (PO); 15 мкг/мл (в диапазоне концентраций 1-50 мкг/мл)/ламинином (1 мкг/мл) (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкг/мл)/фибронектином (2 мкг/мл (в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл) в среде для дифференцировки (NB/B27+BDNF, AA, GDNF, dbcAMP (в диапазоне концентраций, указанных в настоящем описании), TGFe3 и DAPT (в диапазоне концентраций, указанных в настоящем описании) до достижения желаемой стадии созревания для конкретного эксперимента.
Для индукции ДА нейронов, основанной на розеточных структурах, частично использовали ранее описанные протоколы (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) с по меньшей мере одним исключением, когда двойное ингибирование SMAD использовали для ускорения начальной стадии индукции нейронов. Вкратце, ЭСКч индуцировали для нейронного пути развития совместным культивированием с облученными клетками MS5 в среде KSR с добавлением SB431542 и Noggin (250 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-1000 нг/мл); R&D), с 2-8 дней и SHH+FGF8 с 6-11 дней дифференцировки. После 11 дней в среде KSR нейронные розетки собирали вручную и выращивали (стадия P1) в среде N2 с добавлением SHH, FGF8, BDNF и AA как описано ранее (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). После 5-7 дней на стадии P1 розетки снова собирали вручную и измельчали в порошок с последующей инкубацией в не содержащем Ca2/Mg2 сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в течение 1 ч и пересевали на чашки, покрытые полиорнитином (PO)/ламинином/фибронектином. Составление паттерна с SHH/FGF8 продолжали в течение 7 дней на стадии P2 с последующей окончательной дифференцировкой в присутствии BDNF, AA, GDNF, TGFb3 и dbcAMP как описано выше до достижения желаемой стадии созревания для конкретного эксперимента (обычно 5-7 дней для экспериментов по трансплантации или 32 дня для функциональных экспериментов in vitro).
Анализ экспрессии генов. Тотальную РНК выделяли в ходе дифференцировки в следующие дни: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 25 для каждого эксперимента с условиями: контроль LSB, LSB/SHH/FGF8 и LSB/SHH/FGF8/CHIR с применением набора RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Для анализа на биочипах тотальную РНК обрабатывали на аппарате MSKCC Genomic core и гибридизовали на биочипах в виде бусин Illumina Human ref-12 в соответствии с инструкцией производителя. Сравнения осуществляли каждый день и для каждого набора условий с применением пакета LIMMA от Bioconductor (worldwideweb.bioconductor.org). Гены, у которых скорректированное значение P было меньше 0,05, а кратность изменения экспрессии была выше двух, считали статистически значимыми. Некоторые из описательных анализов данных на биочипах и представление выполняли с применением коммерчески доступного программного пакета (Partek Genomics Suite (версия 6.10,0915)). Для анализа количественной ОТПЦР тотальную РНК на 25 день для каждого набора условий подвергали обратной транскрипции (Quan- 36 041083 titech, Qiagen) и амплифицированный материал анализировали с применением коммерчески доступной тест-системы Taqman gene expression assays (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) с нормировкой данных по HPRT. Каждая точка представляет 9 технических повторов из 3 независимых биологических образцов. Первичные данные экспериментов на биочипах еще не доступны на GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Хирургическое вмешательство у животных. Эксперименты на грызунах и обезьянах осуществляли в соответствии с инструкциями Национального института здравоохранения (NIH), и они были одобрены местным институтским комитетом охраны и использования животных (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC), ведомственным комитетом биобезопасности (Institutional Biosafety Committee, IBC), а также научно-исследовательским комитетом по эмбриональным стволовым клеткам (Embryonic Stem Cell Research Committee, ESCRO).
Мыши. Мышей, нокаутных по NOD-SCID IL2Rgc (весом 20-35 г; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, США) подвергали анестезии кетамином (90 мг/кг; Akorn, Decatur, IL) и ксилазином (4 мг/кг; Fort Dodge, IA). 6-гидроксидофамин (10 мкг (в диапазоне концентраций 0,1- 20 мкг), 6-OHDA (Sigma-Aldrich) вводили стереотактически в полосатое тело (стриатум) со следующими координатами (в миллиметрах): AP, 0,5 (от брегмы; в качестве точки отсчета для стереотактического хирургического вмешательства использовали шов черепа); ML, -2,0; DV, -3,0 (от твердой мозговой оболочки, мембраны покрывающей мозг, использовавшейся в в качестве точки отсчета). Мыши с успешными поражениями (в среднем>6 вращений в минуту) были выбраны для трансплантации. Общее количество 150х103 клеток вводили в объеме 1,5 мкл в стриатум по следующим координатам (в мм): AP, 0,5; ML, -1,8; DV, 3,2. Мышей умерщвляли через 18 недель после трансплантации.
Крысы. Взрослых самок крыс Sprague-Dawley (Taconic, Hudson, NY, США) массой 180-230 г в ходе хирургических процедур анестезировали кетамином (90мг/кг) и ксилазином (4мг/кг). На одной стороне наносили повреждения медиального пучка переднего мозга нигростриального пути при помощи стереотакстических инъекций 6-OHDA (3,6 мг/мл в 0,2% аскорбиновой кислоте и 0,9% физрастворе, Sigma в два участка (Studer, et al. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Крыс отбирали для трансплантации, если вызванное амфетамином вращение превышало 6 поворотов в минуту через 6-8 недель после инъекции. 250 х 103 клеток трансплантировали в стриатум каждого животного (Координаты: AP +1,0 мм, ML -2,5 мм и V -4,7 мм; гребенка установлена на -2,5). Контрольные животные получали вместо этого ФБР. Хирургические процедуры описаны ранее (Studer, и др. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Ежедневные внутрибрюшинные инъекции циклоспорина 15 мг/кг (Bedford Labs, Bedford, OH) были начаты за 24 ч перед трансплантацией клеток и продолжались до умерщвления, через 20 недель после трансплантации клеток.
Приматы. Двух взрослых (17-18 лет; 10-12 кг; самки) макак-резус приводили в гемипаркинсоновское состяние посредством введения MPTP в сонную артерию с последующим еженедельным внутривенным введением MPTP для создания двустороннего паркинсоновского синдрома (Kordower, и др. Science 290:767-773 (2000), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). У обоих животных наблюдались паркинсоновские симптомы, соответствующие повреждениям от умеренной до тяжелой степеней, основанным на анализе поведения, включая сгорбленную позу, подволакивание ноги и симптомы мышечной ригидности (непластичность движений), игнорирование (моторное восприятие латерального стимула) и брадикинезию (замедленная инициация движения). Эти параметры могут быть оценены на обезьянах с применением модифицированной клинической шкалы оценки паркинсонизма (CRS). В день операции по трансплантации животным вводили транквилизатор кетамин (3,0 мг/кг внутримышечно) и дексдомитора (0,02-0,04 мг/кг внутримышечно), интубировали, чтобы поддерживать стабильную вентиляцию дыхательных путей и подвергали анестезии изофлураном. Затем их помещали в стереотактическую рамку для хирургического вмешательства. Обеих макак-резус подвергали операции однократно, с тремя внутричерепными инъекциями культур ДА, полученны из вентральных пластинок человека, основываясь на стереотаксических координатах (Paxinos, и др. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press, 2000), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Двусторонние инъекции клеток (10 мкл на инъекцию; 125000 клеток/мкл) осуществляли в три положения (1 - задний хвостовой придаток, 2-пре-комиссуральную скорлупу и вышележащее белое вещество) общим объемом 30 мкл на полушарие. Использовали инфузионный насос, присоединенный к стереотаксическому микроманипулятору, для доставки клеток при скорости 1 мкл/мин с применением шприца Hamilton объемом 50 мкл с иглой 28 G. После завершения инъекций иглу оставляли на месте на 2-5 мин, чтобы инфузат смог диффундировать из наконечника шприца, а затем медленно извлекали шприц. Немедленно после операции животные получали анальгетик (бупренекс, 0,01 мг/кг внутримышечно, два раза в день в течение 72 ч после хирургического вмешательсва; мелоксикам, 0,1 мг/кг подкожно, один раз в день в течение 72 ч после хирургического вмешательсва), а также антибиотик (цефазолин, 25 мг/кг внутримышечно, два раза в день) в течение 72 ч после хирургического вмешательства. Животные получали циклоспорин A (Neoral, Sandimmune) перорально (30 мг/кг со снижением до 15 мг/кг)
- 37 041083 ежедневно, начиная за 48 ч до хирургического вмешательства и до момента умерщвления, в течение одного месяца после трансплантации.
Поведенческие тесты. Тест с вызванным амфетаминами вращением (мыши и крысы) и тест с шаганием (крысы) проводили перед трнасплантацией и через 4, 8, 12, 18 недель после трансплантации. Вращательное поведение у мышей регистрировали через 10 мин после внутривенного введения dамфетамина (10 мг/кг, Sigma) и регистрировали в течение 30 мин. Вращательное поведение у крыс регистрировали через 40 мин после внутривенного введения d-амфетамина (5 мг/кг) автоматически оценивали с применением системы VideoMot2 (TSE, Германия). Данные представляли в форме среднего числа вращений в минуту. Использовали модифицированный шаговый тест с Blume, et al. Exp. Neurol. 219:208211 (2009) and Crawley, et al. What's Wrong With My Mouse: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice (Wiley-Liss, 2000), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, каждую крысу помещали на плоскую поверхность, задние ноги поднимали, аккуратно держа за хвост таким образом, что стола касались только передние лапы. Экспериментатор оттаскивал крысу назад на 1 метр с равномерной скоростью. Подсчитывал число компенсирающих шагов контралатеральной и ипсилатеральной лапами. Данные представляли в форме процентного отношения шагов контралатеральной лапой/количество компенсирующих шагов контралатеральной лапой+ипсилатеральной лапой. Тест с цилиндром проводили, помещая крысу с стеклянный цилиндр и подсчитывая число касаний ипсилатеральной лапой по сравнению с контралатеральной (из 20 касаний) стенки цилиндра, как описано ранее (Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки). Ниже описана обработка тканей для грызунов и приматов.
Мыши и крысы: животным (мыши и крысы) вводили повышенные дозы фенобарбитала внутрибрюшинно (50 мг/кг) для глубокой анестезии и перфузировали в 4% параформальдегиде (ПФА). Извлекали головной мозг, фиксировали в 4% ПФА, а затем погружали в 30% раствор сахарозы на 2-5 дней. Готовили срезы на криостате после фиксации в соединении O.C.T. (Sakura-Finetek, Torrance, California, США).
Приметы: животных умерщвляли под глубокой анестезией кетамином (10 мг/кг, внутримышечно (В.М.)) и фенобарбиталом (25 мг/кг, внутривенно (ВВ)) путем перфузирования сердца гепаринизированным 0,9% физраствором, а затем свежим холодным 4% фиксирующим ПФА (pH7.4). Непосредственно после первичной фиксации мозг извлекали из черепа и фиксировали в 4% ПФА, где он свободно плавал в течение 24-36 ч. Затем мозги промывали и ресуспендировали в 10% сахарозе при медленном встряхивании 4°C и оставляли вымачиваться. Затем это процесс повторяли в 20% сахарозе, а затем в 30% сахарозе. Цельные мозги нарезали по фронтальной плоскости (венечному шву) на серийные срезы толщиной 40 мкм на охлаждаемом санном микротоме и хранили плавающим в криопротективной среде при -20°C.
Иммуногистохимия: Клетки фиксировали в 4% PFA и блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) с 0,3% буфером Triton. Срезу ткани мозга промывали в холодном ФБР и обрабатывали аналогичным образом. Первичные антитела разбавляли в 1-5% БСА или нормальной сыворотке козы и инкубировали в соответствии с инструкциями производителя, подробный список антител и источников приведен в табл. 6. Соответствующие Alexa488, Alexa555 и Alexa647-конъюгированные вторичные антитела (Molecular Probes, Carlsbad, California, США) с веществом для контрастного окрашивания ядер 4',6диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Thermo Fisher, Rockford, Illinois, США). Для некоторых анализов использовали биотинилированные вторичные антитела с последующей визуализацией хромогеном DAB (3,3'-диаминобензидин).
ВЭЖХ-анализ. Обращенно-фазовую ВЭЖХ с электрохимическим детектированием для измерения уровней дофамина, гомованилиновой кислоты (HVA) и DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты) осуществляли, как описано ранее (Roy, et al. Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), все источники включены в настоящее описание посредством ссылки), образцы культур отбирали в перхлорную кислоту на 65 день дифференцировки. Для некоторых экспериментов ДА измеряли напрямую в среде с применением той же системы детектирования, но после альбуминовой экстракции дофамина и его метаболитов с применением коммерчески доступного набора, как описано ранее (Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки).
Регистрация электрофизиологических параметров: Культуры переносили в регистрирующую камеру на прямой микроскоп, оборудованный 40Х водоиммерсионным объективом (Eclipse E600FN; Nikon); культуры перфузировали физраствором, содержащим, в мМ: 125 NaCl, 2,5 KCl, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2 CaCl, 1 MgCl2 и 25 глюкозы (34°C; насыщенным 95% O2-5% CO2; pH 7,4; 298 мОсм/л). Скорость потока физраствора составляла 2-3 мл/мин при пропускании через встроенный нагреватель (SH27B с контроллером TC-324B; Warner Instruments). Нейроны визуализировали методом видеомикроскопии с охлажаемоей цифровой ПЗС-камерой (CoolSNAP ES2, Photometries, Roper Scientific, Tucson, Arizona, США). Для регистрации электрофизиологических параметров отбирали клетки, похожие по форме на нейроны, с хорошим ветвлением дендритов. Метод локальной фиксации потенциала (patchclamp) на целых соматических клетках в текущей конфигурации фиксации осуществляли с применением усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices). Сигналы фильтровли в диапазоне 1-4 кГц и оцифровы- 38 041083 вали на 5-20 к ГЦ с применением Digidata 1440A (Molecular Devices). Регистрирующие контактные электроды были выполнены из волокна из боросиликатного волокна (Sutter Instruments), вытянутого на пуллере Flaming-Brown (P-97, Sutter Instruments) имели сопротивление 4-6 МОм в ванне. Электроды заполняли внутренним раствором, содержащим в мМ: 135 K-MeSO4, 5 KCl, 5 HEPES, 0,25 EGTA, 10 фосфокреатина-ди(трис), 2 АТФ-Mg и 0,5 ГТФ-Na (pH 7,3, осмолярность доводили до 290-300 мосм/л). Мостиковый усилитель настраивали таким образом, чтобы компенсировать сопротивление электродов, и следили за ним. Емкость электродов компенсировали. Если последовательное соединение возрастало >20% в ходе фиксации потенциала данные отбрасывали, поскольку повышение сопротивление указывает на частичные технические неполадки в ходе измерения.
Подсчет клеток и стереологические анализы. Процентную долю клеток, положительных по маркеру, на вентральной пластинке (день 11), фиг. 1, предшественников дофаминовых нейронов среднего мозга (день 25), фиг. 2, и на стадии зрелых ДА нейроно (день 50 или позже), фиг. 3 и 11, определяли в образцах, полученных в по меньшей мере 3 независимых экспериментах для каждого. Изображения для подсчета выбирали случайным образом (равномерное распределение), каждое изображение оценивали сначала по числу DAPI-положительных ядер, после чего подсчитывали число клеток, экспрессирующих представляющий интерес маркер. Данные представлены как среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего). Количество человеческих клеток (идентифицируемых при помощи анти-hNA) и TH+ нейронов в трансплантате овеществляли подсчитывали на каждом десятом срезе, если удавалось определить трансплантат. Количество клеток и объем трансплантата определяли с применением оптического зонда аппарата для фракционного зондирования и оценочного устройства Cavalieri с применением программы Stereo Investigator software (MBF bioscience, Vermont, СШП) как описано у Tabar, et al. Nat. Biotechnol. 23:601-606 (2005); цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки. Данные представлены в форме оценочного общего числа клеток и общего объема трансплантата+/-стандартная ошибка среднего (SEM). Приведенные ниже составы характеризуют примеры среды для культивирования клеток для реализации настоящих изобретений.
Поддерживающая среда для ЭСКч (1 л): 800 мл DMEM/F12, 200 мл заменителя сыворотки Knockout Serum Replacement, 5 мл 200 мМ L-глютамина, 5 мл Pen/Strep, 10 мл 10 мМ раствора 15 ненезаменимых аминокислот в минимальной среде MEM, 55 мкМ 13-меркаптоэтанола, и ФРФ-бета (bFGF, конечная концентрация 4 нг/мл).
Среда KSR для дифференцировки ЭСКч (1 л): 820 мл среды Knock out DMEM, 150 мл заменителя сыворотки Knock out Serum Replacement, 10 мл 200 мМ L-глютамина, 10 мл Pen/Strep, 10 мл 10 мМ MEM и 55 мкМ 13-меркаптоэтанола.
Среда N2 для дифференцировки ЭСКч (1 л): 985 мл дистиллированной H2O с порошком DMEM/F12, 1.55 г глюкозы (Sigma, № по катологу G7021), 2.00 г бикарбоната натрия (Sigma, № по катологу S5761), путресцин (аликвота объемом 100 мкл из раствора 1.61 грамм в 100 мл дистиллированной воды; Sigma, № по каталогу P5780), прогестерон (аликвота 20 мкл раствора 0.032 грамм в 100 мл 100% этанола; Sigma, № по катологу P8783), селенит натрия (аликвоты объемом 60 0,5 мМ раствора в дистиллированной воде; Bioshop Canada, № по каталогу SEL888), и 100 мг трансферрина (Celliance/Millipore, № по катологу 4452-01), и 25 мг инсулина (Sigma, № по катологу 16634) в 10 мл 5 мМ NaOH.
Среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% ФБС для приготовления PMEF ((первичных мышиных эмбриональных фибробластов (PMEF)) - фидерных клеток) (1 л): 885 мл среды DMEM, 100 мл ФБС, 10 мл Pen/Strep и 5 мл L-глютамина.
Минимальная поддерживающая среда Alpha (MEM) с 10% ФБС для приготовления for среды для фидерных клеток MS-5 (1 л): 890 мл Alpha MEM, 100 мл ФБС, 10 мл раствора желатина с Pen/Strep (500 мл): растворяют 0,5 желатина в 500 мл теплой (50-60°C) воды Milli-Q. Охлаждают до комнатной температуры.
В целом, ниже приведен краткий обзор примеров методов мониторинга продукции зрелых ДА нейронов для использования для трансплантации (см. также условия, показанные в табл. 7. День 13 - это стадия вентральной пластинки, характеризующаяся одновременной экспрессией FOXA2/LMX1A.
В целом, ниже приведен краткий обзор примеров методов мониторинга продукции зрелых ДА нейронов для использования для трансплантации (см. также условия, показанные в табл. 7. День 13 - это стадия вентральной пластинки среднего мозга, характеризующаяся одновременной экспрессией FOXA2/LMX1A. В дополнение к экспрессии FOXA2 и LMX1A наблюдаются потеря экспрессии OCT4 и отсутствие индукции маркеров переднего мозга PAX6 и FOXG1. День 25 - это стадия предшественников ДА нейронов среднего мозга, характеризующаяся продолжающейся экспрессией FOXA2/LMX1A и экспрессией нейрональных (TUJ1) и ДА маркеров (NURR1, TH). В ходе пролиферации Ki67+ клеток наблюдают число предшественников нейронов среднего мозга PAX6 и FOXG1, где эти маркеры нежелательны. Для несмещенного и быстрого получения количественных данных иммунофлюоресценции использовали микроскоп Operetta High Content Microscope (Perkin Elmer). Для каждого маркера также осуществляли анализ методом кПЦР в реальном времени для подтверждения результатов иммунофлюоресцентного аналтиза. В некоторых вариантах реализации линии клеток (культуры), прошедшие эти предварительные in vitro тесты, используют для трансплантации, см. табл. 7. В некоторых вариантах реализа
- 39 041083 ции зрелые ДА нейроны на 25 день подвергали криоконсервации без сыворотки (в диапазоне от 20 до 25 дней) в культуральной среде+7% ДМСО (в диапазоне 3-12%) до размораживания для применения в трансплантации. В некоторых вариантах реализации образцы клеток хранят в жидком азоте. В некоторых вариантах реализации клетки хранят в холодильниках с низкой температурой. В других вариантах реализации предусмотрено применение криопротекторов, таких как миоинозитол, поливиниловые спирт, заменитель сыворотки, ингибиторы каспазы, в дополнение к ДМСО. После размораживания исследовали клетки перед трансплантацией на жизнеспособность, экспрессию маркеров и т.д. В некоторых вариантах реализации размороженные клетки исследовали на сохранение функции в продолжительных in vitro и in vivo тестах для мониторинга условий замораживания и хранения.
B. Исследования, направленные на выявление дополнительны факторов для получения функциональных ДА нейронов. Предусмотрены дополнительные эксперименты по исключению и включению для компонентов тканевой культуры для применения в получении клеток в соответствии с настоящими изобретениями. Например, было показано, что хотя применение FGF8 приводило к получению клеток в соответствии с настоящими изобретениями, он не был обязательным компонентом для получения этих клеток. Эти эксперименты будут продолжены с дополнительным реагентами, например, с теми, которые приведены в табл. 8, которые могут служить добавками к культурам клеток в дополнение к четырем основным молекулам, которые обеспечивали получение ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями, т.е. i) ингибитору Alk4/5/7 (TGFe-) (SB431542), ii) ингибитору Alk2/3 (BMP) (LDN193189), iii) агонисту Smoothened (SHH) (Пурморфамин) и iv) ингибитору GSK3e- (CHIR99021).
Как описано здесь, применение SB431542 и LDN193189 продемонстрировало эффективное превращение плюрипотентных стволовых клеток, а добавление пурморфамина и CHIR99021 к этим клеткам продемонстрировало индукцию вентральной пластинки среднего мозга. Другие химические соединения и белки использовались или могут использоваться для обеспечения долговременной трофической поддержки и/или ускоренной дифференцировки. Некоторые из этих соединений будут использоваться в дальнейших тестах для определения их роли в описанной здесь дифференцировки клеток.
Для этих экспериментов поведение других соединений будет сравниваться по типичным ограничениям для дифференцировки ДА нейронов (табл. 7) с применением 4 основных факторов (табл. 8).
Эти типы экспериментов предназначены для определения минимального числа факторов, необходимых для получения аутентичных ДА нервных клеток в соответствии с настоящими изобретениями.
С. Реализация для получения кривых доза-ответ для потенциально способных пролиферации примесей (плюрипотентных ЭСКч, розеткоподобных структур нейронов). В ходе развития в соответствии с настоящими изобретениями, образование тератом или избыточный повышенный рост в трансплантате отсутствовали в течение по меньшей мере 5 месяцев выживания in vivo. Для мониторинга безопасности в исследованиях большей продолжительности, направленных на установление предполагаемой способности трансплантата к продолжительному существованию в организме человека, изучают пороговое число клеток для определения клинически значимого предела содержания примесных проблемных типов клеток, таких как недифференцированные ЭСКч, которые могут развиться в тератомы или примитивные нейроэктодермальные предшественники, способные к значительной пролиферации. Соответственно, некоторые варианты реализации предназначены для обогащения клеток для применения в трансплантации дофаминергическими нейронами, т.е. снижения содержания примесных типов клеток перед трансплантацией, см., например, табл. 7, где приведены примеры ограничений.
Ниже приведен пример стандартизированного выбора в тестах для улучшения стратегий валидации. В случае ЭСКс, заранее определенная смесь недифференцированных (Oct4+/Nanog+) клеток с полученными из ЭСч ДА нейронами будет применяться для отслеживания клинических симптомов, указывающих на масс-эффект и/или гибель животного, в экспериментах с животными. Будут выполняться измерения ответа на дозу для одной ЭС клетки человека на 10000 полученных из ЭСКч ДА нейроны, 1/5000, 1/1000 и 1/100. Клетки будут вводить в стриатум и животных будут подвергать иммуноподавляющей обработке. За крысами будут тщательно следить и умертвят после проявления неврологических симптомов или не позднее, чем через 6 месяцев. Мозги будут исследовать на объем и состав трансплантата, как описано в настоящем текста. Соотношения клеток будут корректировать пока не будет установлен явный порог для образования тератом in vivo. Для определения мешающих уровней примитивных нейроэктодертальных предшественников будет использоваться аналогичная стратегия. Присутствие ранних нейрональных предшественников связано со значительным потенциалом для пролиферации и широким спектром дифференцировки по пути центральной нервной системы, а также по пути периферической нервной системы (ПНС). Исследование трансплантата будет заключаться ИГХ анализа клеток розеткоподобных структур (экспрессия PLZF), их потомства в ЦНС (нейрональных предшественников, экспрессирующих Nestin/Sox2 или предшественников переднего мозга, экспрессирующих FoxG1), а также объемов трансплантатов и коэффициентов пролиферации (% Ki67+ от общего числа выживших клеток).
IV. Болезнь Паркинсона.
Болезнь Паркинсона (БП) является вторым по распространенности нейродегенеративным заболеванием; согласно оценкам им страдают 4,1-4,6 миллиона пациентов в мире, и согласно предсказанием эта
- 40 041083 цифра удвоится к 2030. Это заболевание является вторым по распространенности после болезни Альцгеймера, им страдает приблизительно 1 миллион пациентов в США, и этот диагноз ставят еще 60000 пациентам каждый год. Данное заболевание несет серьезную социоэкономическую нагрузку и связано с высокой смертностью и опасностью для пациентов, объединенные прямые и непрямые затраты, связанные с БП, включая затраты на здравоохранение и потерю дохода оцениваются приблизительно в $25 миллиардов в год только в США. С настоящее время не существует средства лечения болезни Паркинсона (БП), являющейся возрастным, прогрессирующим заболеванием, приводящим к потери трудоспособности. Патогенез болезни Паркинсона характеризуется выборочной потерей ДА нейронов в черной субстанции. Соответственно, основной характеристикой БП является прогрессивная, тяжелая и необратимая потеря дофаминовых (ДА) нейронов, приводящая в итоге двигательной дисфункции, в конечном итоге ведущей к утрате трудоспособности. Несмотря на то, что были разработаны фармакологические, основанные на упражнениях и хирургические средства лечения БП, ни один из этих подходов не обеспечивает адекватное восстановление функции ДА нейронов. Долгосрочное управление двигательными симптомами у пациентов часто остается субоптимальным, и, несмотря на понимание важности прогрессирующих не реагирующих на дофамин двигательных и недвигательных симптомов, фундаментальная проблема долгосрочного управления реагирующими на дофамин симптомами по-прежнему представляет собой область настоятельной терапевтической потребности. При БП обнаруживаются многочисленные патологии, поражающие как центральную, так и периферическую нервную систему, основные признаки БП (брадикинезия, ригидность и частично тремор) глубоко связаны с потерей ДА нейрональных клеток и реагируют на дофамин. Соответственно, предусмотрено лечение БП с применением замещения нейрональных клеток ввиду достаточно селективной потери ДА нейронов среднего мозга, отвечающей за большинство двигательных симптомов указанного заболевания. В головном мозге здорового человека содержится приблизительно 1 млн ДА нейронов. Соответственно, в одном варианте реализации предусмотрено, что для замещения ДА нейронов требуется относительно незначительное число выживших клеток по сравнению с большинством других расстройств в ЦНС.
Одна из проблем при разработке клеточной терапии БП заключалась в идентификации подходящего источника клеток для применения при замещении нейронов. Указанный поиск продолжался более 30 лет, и были предложены многие потенциальные источники для замещения ДА нейронов (Kriks, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons (eds. Pasterkamp, R.J, Smidt, & Burbach) (Landes Biosciences, 2008; Fitzpatrick, et al., Antioxid. Redox. Signal. 11:2189-2208 (2009)). В прошлом некоторые из указанных источников были доведены до ранних стадий клинических испытаний, в том числе катехоламинергические клетки мозгового вещества надпочечников, Madrazo, et al., N. Engl. J. Med. 316, 831-834 (1987), трансплантаты каротидного тельца (Arjona, et al., Neurosurgery 53: 321-328 (2003)) или инкапсулированные клетки пигментного эпителия сетчатки (исследование сферамина, Bakay, et al., Front Biosci. 9, 592-602 (2004). Однако указанные испытания в большинстве своем не показывали клинической эффективности и приводили к неудовлетворительному долгосрочному выживанию и низким уровням высвобождения ДА из привитых клеток. Другой подход заключался в трансплантации ДА нейронов фетального среднего мозга, проведенной более чем у 300 пациентов в мире (Brundin, et al., Prog. Brain Res. 184, 265-294 (2010); Lindvall, & Kokaia, J. Clin. Invest 120:29-40 (2010). При терапии с применением фетальной ткани человека у указанных пациентов наблюдались признаки, свидетельствующие о выживании ДА нейронов, и высвобождение ДА in vivo в течение до 10 или 20 лет после трансплантации у некоторых пациентов. Однако у многих пациентов трансплантация фетальной ткани не обеспечивала замещении функции ДА нейронов. Кроме того, при трансплантации фетальной ткани возникает ряд проблем, в том числе малое количество и низкое качество донорной ткани, этические и практические сложности, связанные с получением ткани, и недостаточно охарактеризованная гетерогенная природа трансплантируемых клеток; указанные проблемы относятся к факторам, вносящим вклад в вариабельность клинических исходов. Примеры фетальной трансплантации описаны в источниках: Mendez, et al. Nature Med.(2008)); Kordower, et al. N. Engl. J. Med. 332:1118-1124 (1995); Piccini, et al. Nature Neuroscience 2:1137-1140 (1999). Однако к указанным клиническим результатам прибавились определенные позитивные результаты ранних открытых исследований (Lindvall, et al. Science 247:574-577 (1990); Widner, et al. N. Engl. J. Med. 327:1556-1563 (1992); Brundin, et al. Brain 123:1380-1390 (2000); Freed, et al. N. Engl. J. Med. 327:1549-1555 (1992); Freeman, et al. Bilateral fetal nigral transplantation into the postcommissural putamen in Parkinson's disease. Ann Neurol 38:379-388 (1995). Однако в ходе двух более крупных спонсированных NIH (Национальными институтами здравоохранения) плацебо-контролируемых клинических испытаний в США были получены скромные результаты (Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Olanow, et al. Ann. Neurol. 54:403-414 (2003)). Существует множество гипотез относительно ограниченной эффективности, наблюдаемой в ходе испытаний фетальной пересадки у человека, в том числе гипотеза о том, что фетальная пересадка может не обеспечивать достаточного количества клеток, находящихся на надлежащей стадии развития для оптимального благоприятного терапевтического эффекта. Кроме того, фетальная ткань довольно плохо характеризуется в отношении клеточных типов и отличается вариабельностью стадий и качества для каждого из образцов ткани Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003). Другим вносящим вклад фактором может быть вялоте- 41 041083 кущий воспалительный ответ на трансплантат у хозяина (Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003)).
И напротив, предполагается, что применение источника клеток, происходящего из стволовых клеток, или другого типа совместимых клеток для получения клеток для трансплантации позволит преодолеть многие из проблем, ассоциированных с пересадкой фетальной ткани, и обеспечить неограниченный источник ДА нейронов на оптимальной стадии для трансплантации. После почти 20 лет предпринимаемых попыток использования различных потенциальных источников стволовых клеток авторы настоящего изобретения преуспели в получении аутентичных ДА нейронов среднего мозга человека из плюрипотентных стволовых клеток, способных обращать вспять неврологическое дефекты у мышей и приматов. Указанная новая стратегия дифференцировки была высокоэффективной и приводила к устойчивому приживлению трансплантата клеток in vivo, индукции функционального восстановления при БП в моделях заболевания и отсутствию нежелательных явлений, таких как неадекватная пролиферация клеток, о чем свидетельствуют доклинические данные. Предполагается, что стратегия лечения БП на основе ЭСклеток человека может получить одобрение FDA, поскольку FDA было одобрено тестирование других производных ЭС-клеток человека при повреждении спинного мозга (Strauss, Nat. Biotechnol. 28:989-990 (2010) и макулярной дегенерации (Schwartz, et al. Lancet 379:713-720 (2012)).
Предусмотрены дополнительные варианты реализации, включающие стратегии усовершенствования для контроля чистоты клеток, содействия разрастанию аксональных волокон, а также включающие новые характеристики безопасности/регуляторные функции стратегий пересадки. Например, в некоторых вариантах реализации продемонстрирован способ очищения клеток, начиная от простого скрининга на поверхностный маркер представляющего интерес типа клеток (такой как CD142) до целенаправленной стратегии обогащения по специфическому типу нейронов. В некоторых вариантах реализации предусмотрено применение указанного способа при получении клеток для применения у человека. Кроме того, в других вариантах реализации предусмотрена сконструированная экспрессия PSA-NCAM для усиления аксонального разрастания для применения при восстановлении нервной ткани in vivo. Такое применение включает стимуляцию дистанционного аксонального роста для лечения болезни двигательных нейронов, болезни Гентингтона или других расстройств, в первую очередь, влияющих на проекционные нейроны. Предусмотрены дополнительные варианты реализации соответствующего стандартам надлежащей производственной практики (GMP) источника плюрипотентных клеток, и т.п. Поскольку для трансплантации с применением способов, описанных в настоящем документе, требуется небольшое число ДА нейронов, и они основаны на относительно простых, экономически эффективных способах с использованием малых молекул, разработанных для индукции ДА нейронов, подразумевается, что стоимость заместительной терапии ДА нейронами в пересчете на пациента будет разумной. Одно из потенциальных биологических ограничений подхода с трансплантацией при БП заключается в том факте, что дегенерация нейронов при БП распространяется на многие типы клеток помимо дофаминовых нейронов среднего мозга, в частности, на поздних стадиях указанного заболевания. Фактически, при долгосрочном исследовании на поздних стадиях БП преобладают не реагирующие на ДА симптомы, приводящие к дисфагии, падениям, деменции и другим значимым патологическим проявлениям. Однако при восстановлении дофаминергической функции предположительно могут улучшаться некоторые недвигательные симптомы. Кроме того, предполагается, что применение происходящих из чЭСК ДА нейронов на ранних стадиях указанного заболевания может предотвращать некоторые из вторичных симптомов БП, в том числе дегенерацию восприимчивых к дофамину популяций стриатума. Однако даже в отсутствие влияния не реагирующих на ДА симптомов указанного заболевания долгосрочное функциональное дофаминергическое восстановление стриатума может представлять собой значительное достижение в рамках лечения указанного, в настоящее время неизлечимого, расстройства. В случае болезни Паркинсона существует несколько альтернативных доступных вариантов терапии, в том числе стратегии на основе применения лекарственных средств и хирургические подходы, такие как глубокая стимуляция головного мозга. Предполагается, что в некоторых вариантах реализации эффективность восстановления будет сопоставима с уровнями, достигаемыми при применении альтернативных вариантов терапии, или будет выше указанных уровней. Предполагается, что в других вариантах реализации применение терапии с трансплантацией указанных зрелых ДА нейрональных клеток будет, в частности, благоприятным для конкретной подгруппы пациентов. В других вариантах реализации предполагается применение указанной терапии с трансплантацией зрелых ДА нейрональных клеток в дополнение к существующим подходам с использованием лекарственных средств и хирургии. Одно значимое преимущество применения терапии с трансплантацией зрелых ДА нейрональных клеток в соответствии с настоящими изобретениями состоит в уникальной неировосстановительнои природе посттрансплантационного периода, а именно, долгосрочном восстановлении нейрональной функции, что предполагается использовать у пациентов при постепенном снятии лекарственной терапии. Трансплантация клеток предположительно влияет на спектр связанных с ДА симптомов, отличающийся от отвечающего на лекарственные средства или другую терапию. Соответственно, в одном варианте реализации предусмотрено применение трансплантации зрелых ДА нейронов с глубокой стимуляцией головного мозга (DBS). Согласно другому варианту реализации предусмотрено применение трансплантации зрелых ДА нейронов с терапией.
- 42 041083
A) Болезнь Паркинсона и современные варианты терапии. Значительный прогресс был достигнут в идентификации редких генетических изменений, вносящих вклад в семейные формы БП. Однако в большинстве случаев БП вклад какой-либо потенциальной генетической предрасположенности остается неясным. Традиционные терапевтические стратегии при БП ограничены тем фактом, что к началу клинических симптомов 30-70% всех ДА нейронов черной субстанции необратимо деградируют. Одна из терапевтических опций заключается в фармакологическом замещение дефицита ДА нейронов с применением предшественника ДА L-ДОФА. Однако, несмотря на ярко выраженный начальный ответ на терапию L-ДОФА у некоторых БП-пациентов, долгосрочный клинический исход остается неудовлетворительным, и на поздних стадиях заболевания часто наблюдаются серьезные побочные эффекты терапии LДОФА, в том числе двигательные флуктуации и дискинезии. Пульсирующая доставка L-ДОФА играет основную роль в развитии указанных двигательных осложнений на поздних стадиях, соответственно, более плавная и более физиологическая доставка дофамина, т.е., например, из трансплантированных клеток в соответствии с настоящими изобретениями, соответственно, была бы очень желательной. Помимо фармакологических стратегий, существует несколько хирургических вариантов лечения. Указанные варианты включают абляцию или функциональную инактивацию клеток в базальных ганглиях посредством паллидотомии, или глубокой стимуляции головного мозга путем нацеленного воздействия на субталамическое ядро или внутреннюю часть бледного шара. Хотя указанные хирургические опции являются альтернативой для некоторых пациентов, они обеспечивают облегчение симптомов заболевания, но не восстанавливают нормальную ДА-функцию. Кроме того, сообщалось о побочных эффектах хирургического и нехирургического лечения, в том числе неправильное функционирование, инфекции, инсульт, кровотечение и т.п. Другие варианты лечения включают доставку факторов роста, таких как ГНТФ или нейротурин, с применением прямой внутрипаренхимной инфузии или вирусной экспрессии путем генной терапии. Хотя начальные открытые исследования при БП продемонстрировали многообещающие результаты для ГНТФ, последующие контролируемые испытания на большей группе пациентов не подтвердили какого-либо преимущества и указали на потенциальную угрозу безопасности из-за продуцирования антител против ГНТФ у подгруппы пациентов. При доставке нейротурина, молекулы, связанной с ГНТФ, на основе AAV (аденоассоциированного вируса) также не показала какого-либо значимого клинического преимущества в масштабном плацебо-контролируемом многоцентровом исследовании. Недавно появились предварительные результаты исследования фазы 2 инъекций происходящей из AAV декарбоксилазы глутаминовой кислоты (GAD) в субталамическое ядро (Lancet Neurology, апрель 2011 г.), однако, клинические преимущества в указанном исследовании были в лучшем случае умеренными. Хотя попытки использования стратегий на основе нейротрофических факторов или альтернативных нейропротекторных стратегий могут приносить пациентам временное облегчение, ни одна из указанных стратегий не способна вернуть /заместить ДА нейроны, уже утраченные в результате заболевания, что является главной целью клеточной заместительной терапии.
B. Клеточная терапия при БП. Клинические симптомы при БП становятся очевидными после потери 70-80% дофаминовых нейронов стриатума и приблизительно 50% дофаминовых нейронов черной субстанции. Однако дофаминовые нейроны среднего мозга развиваются к 8,5 неделям после зачатия, при этом убедительные данные о замещении дофаминовых нейронов на протяжении жизни отсутствуют. Соответственно, возраст дофаминовых нейронов к моменту начала заболевания составляет несколько десятилетий, и естественный механизм замещения указанных клеток отсутствует, соответственно, для замещения указанных клеток в головном мозге БП-пациентов может быть необходима трансплантация клеток. Замещение ДА нейронов при БП проводили в 1980-х годах, используя происходящие из мозгового вещества надпочечников хромаффинные клетки. Указанные гормонпродуцирующие клетки, как было показано, переключают нейротрансмиттерный фенотип с адреналина на ДА при эктопическом введении в ЦНС. Пересадка с применением указанного подхода была проведена у нескольких сотен БП-пациентов по всему миру, однако со временем выяснилось, что выживаемость пересаженных клеток была крайне неудовлетворительной, и они обеспечивали в лучшем случае временный эффект. Соответственно, от клинического применения указанного подхода в скором времени отказались. Напротив, применение пересадки фетальной ткани среднего мозга было основано на более интенсивных доклинических исследованиях в моделях на грызунах, продемонстрировавших устойчивое долгосрочное приживление трансплантатов и функциональное улучшение в панели связанных с ДА поведенческих анализов. Указанные доклинические данные послужили стимулом для продолжения проведения фетальной пересадки в нескольких центрах в конце 1980-х - начале 1990-х г. Указанные исследования ясно показали, что функциональное долгосрочное приживление трансплантата с увеличенным высвобождением ДА в области пересадки по оценке с применением ПЭТ с флюородопа и последующих гистологических исследований для некоторых пациентов, смерть которых наступила по независимым причинам. Однако при применении фетальных трансплантатов возникают две потенциальные проблемы, связанные с методами клеточной терапии. Первая неожиданная проблема при применении фетальных трансплантатов заключалась в индукции индуцированных трансплантатом дискинезий (GID) у приблизительно 15% пациентов. Хотя механизм GID остается спорным, недавно полученные данные свидетельствуют о том, что серотонинергические нейроны способны к неадекватному накоплению и высвобождению ДА. Другой потенциальный
- 43 041083 механизм, предложенный для объяснения GID, заключается в неравномерности распределения ДА нейронов, приводящей, соответственно, к образованию горячих точек высвобождения ДА. Однако при разработке настоящих изобретений были открыты способы детекции и уменьшения количества серотонинергических нейронов, которые могут обеспечить снижение частоты GID. Кроме того, инъецирование зрелых ДА нейронов может обеспечить равномерное распределение зрелых нейронов, в том числе распространение окончаний дофаминергических волокон в стриатуме хозяина. Другая проблема при лечении с применением фетальной пересадки заключалась (и заключается) в ограниченной доступности фетальной ткани среднего мозга на подходящей стадии развития. В клинике была опробована альтернативная стратегия для решения проблемы ограниченности ресурсов путем применения фетальных ДА нейронов свиньи. Однако выживание ДА нейронов в указанных ксенотрансплантатах было неудовлетворительным и от указанного подхода отказались полностью. Недавнее исследование с применением пигментного эпителия сетчатки также не показало каких-либо преимуществ. Напротив, применение ЭСклеток человека в качестве источников трансплантируемых клеток предположительно обеспечит неограниченный источник клеток для получения дофаминовых нейронов для применения при трансплантации.
V. Были открыты соединения и способы культивирования для направленной дифференцировки FOXA2+ и LMX1A+ положительных клеток-предшественников нейронов в ДА нейроны среднего мозга (нейроны мезенцефалона, мДА) в соответствии с настоящими изобретениями.
При разработке настоящих изобретений авторы обнаружили, что временные характеристики воздействия CHIR99021 определяют индукцию FOXA2/LMX1A-nредшественников вентральной пластинки среднего мозга. Соответственно, авторы настоящего изобретения проводили тестирование путем иммуноцитохимического анализа FOXA2/LMX1A на 11 день дифференцировки после LSB/S/F8 (т.е. обработки клеток LSB, S, т.е. SHH, и обработки FGF8 (F8) по отдельности или в комбинации с CHIR, с началом в различных точках времени: d0-d11 (дни 0-11), d1-d11, d3-d11, d5-d11, d7-d11 по сравнению с культурами клеток без обработки CHIR в двух повторностях. Затем проводили количественное определение процента FOXA2+, LMX1A+ и клеток с двумя метками на день 11 дифференцировки после дифференциального начала воздействия CHIR согласно описанию иммуноцитохимического анализа.
A. CHIR99021 (C) представляет собой фактор индукции FOXA2+/LMX1A+ клеток на 11 день из культивированных с LSB клеток, приведенных в контакт с активатором Hedgehog и пурморфамином. В примере ниже описано применение иллюстративных способов для тестирования эффективности каждого соединения для индукции направленной нейрональной дифференцировки мДА нейронов.
В этом примере описано обнаружение малых молекул и временных характеристик контакта для обеспечения направленной дифференцировки FOXA2+LMX1A+ ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями. Ниже представлено краткое описание некоторых из экспериментальных открытий, описанных в настоящем документе: При обработке клеток с двойным ингибированием SMAD антагонистами SHH (пурморфамин + SHH) и FGF8 (S/F8) в отсутствие CHIR99021 наблюдалась значимо более низкая экспрессия FOXA2 на 11 день и полное отсутствие экспрессии LMX1A (фиг. 1a, b). Стабильная индукция антериального маркера OTX2 происходила в обработанных LSB и LSB/S/F8/CHIR культурах, однако не в условиях с LSB/S/F8 (фиг. 1a,c). Авторы настоящего изобретения выбирали популяцию клеток, содержащую плюрипотентные клетки, в качестве стартовой популяции, и высевали на 0 день. Клетки культивировали до достижения предконфлюентности до дифференцировки (60-100% конфлюентности). Указанные клетки приводили в контакт с двойными ингибиторами SMAD (т.е. воздействовали LDN-193189+SB431542=LSB) на 0 день. Авторы настоящего изобретения продолжали наблюдение за популяцией клеток при регулярной подкормке, содержащей свежий LSB, до 11 дня, и обнаружили, что некоторые оставшиеся клетки представляли собой клетки LMX1A+, однако, не экспрессировали FOXA2 (фиг. 1a, b). Авторы настоящего изобретения высевали в двух повторностях стартовые популяции клеток, затем проводили тестирование на типы клеток (т.е. паттерны экспрессии генов/белков) после приведения в контакт со смесями, содержащими любые из следующих агонистов SHH (пурморфамин+SHH), и приведения в контакт с FGF8 (S/F8), с использованием разных схем воздействия, т.е. приведение клеток в контакт на 0 день, или 1 день, или 2 день и т.д., на протяжении определенного времени, т.е. 24 ч, 48 ч и т.д. Три протестированных варианта примеров условий первичного культивирования приведены ниже: 1) клетки приводили в контакт с LDN/SB (LSB) на 0 день, затем приводили в контакт со свежим LSB до 5 дня, на 5 день клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11 дня, 2) клетки приводили в контакт с LDN/SB (LSB) на 0 день, затем приводили в контакт со свежим LSB до дня 5, на день 5 клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11 дня, при этом в течение указанного периода клетки дополнительно приводили в контакт со свежим пурморфамином, SHH и FGF8 до 7 дня и 3) клетки приводили в контакт с LDN/SB (LSB) на 0 день, затем приводили в контакт со свежим LSB до 5 дня, на 5 день клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11 дня, при этом в течение указанного периода клетки дополнительно приводили в контакт со свежим пурморфамином, SHH и FGF8 до 7 дня, и дополнительно приводили в контакт со свежим CHIR, начиная с 3 дня культивирования и до 11 дня, с несколько варьирующими указанными первичными условиями для определения оптимального выхода типов клеток. B. Определение сравнительных характеристик in vitro FOXA2+/LMX1A+ клеток, происходящих из области вентральной пластинки среднего мозга и предшественников ДА клеток, полученных с
- 44 041083 применением других техник. Систематическое сравнение трех вариантов условий культивирования (фиг. 1d) выполняли с применением глобального временного профилирования генной экспрессии. При иерархической кластеризации дифференциально экспрессируемых генов три варианта обработки разделялись к 11 дню дифференцировки (фиг. 8a). FOXA1, FOXA2 и ряд других нижерасположенных мишеней SHH, в том числе, PTCH1 входили в число большинства дифференциально регулируемых транскриптов в наборах данных для обработки LSB/S/F8/CHIR либо LSB (фиг. 1e). Экспрессия LMX1A, NGN2 и DDC указывала на определение направления дифференцировки предшественников ДА нейронов среднего мозга уже к 11 дню (фиг. 1e, f). Напротив, культуры с LSB были обогащены маркерами предшественников дорсальной части переднего мозга, такими как HES5, PAX6, LHX2 и EMX2. Прямое сравнение обработки LSB/S/F8/CHIR с обработкой LSB/S/F8 (фиг. 1f) подтверждает селективное обогащение по маркерам предшественников ДА нейронов среднего мозга в группе LSB/S/F8/CHIR и свидетельствует о наличии гипоталамических предшественников в обработанных LSB/S/F8 культурах на основании дифференциальной экспрессии RAX1, SIX3 и SIX6 (см. также фиг. 2D, ниже: экспрессия POMC, OTP). Приведен иллюстративный перечень дифференциально экспрессируемых транскриптов, см. табл. 1, 2; онтологический анализ генов для 11 дня, фиг. 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov), подтвердил обогащение по компонентам канонической WNT-сигнализации при обработке CHIR. Исходные данные пока недоступны (GEO, worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, № доступа подлежит уточнению). Сравнительный временной анализ генной экспрессии маркеров предшественников ДА нейронов среднего мозга (фиг. 1g) и маркеров направления дифференцировки в антериальные и вентральные клетки, не являющиеся ДА нейронами (фиг. 1h), позволяет разделить три варианта условий индукции следующим образом: i) LSB: характеристики дорсальной части переднего мозга; ii) LSB/S/F8: характеристики вентральной / гипоталамической части и iii) LSB/S/F8/CHIR: характеристики предшественников ДА нейронов среднего мозга.
VI. Дальнейшая дифференцировка FOXA2+/LMX1A+ клеток 11 дня в ДА нейроны среднего мозга к 25 дню и поддержание до 65 дня.
Для дальнейшей дифференцировки FOXA2+/LMX1A+ клетки-предшественники поддерживали в среде, стимулирующей созревание нейронов (BAGCT, см. пример I). Для сравнения применяли две другие методики получения клеток-предшественников ДА нейронов. Были осуществлены следующие типы сравнений между популяциями дифференцированных клеток, полученных с использованием разработанных ранее способов и способов в соответствии с настоящими изобретениями: A) иммуногистохимический анализ на 50 день дифференцировки в TH в комбинации с LMX1A, FOXA2 и NURR1, B) Определение количества TH+, FOXA2+, LMX1+ и NURR1+ клеток от общего числа клеток для культур, полученных из розеток, в сравнении с культурами, полученными из вентральной пластинки (LSB/S/F8/CHIR). C) определение процентной доли положительных по серотонину (5-НТ+) и ГАМК+ подтипов нейронов (примеси, отличные от ДА нейронов) на 50 день в культурах ДА нейронов, полученных из розеток. И D) ВЭЖХ-анализ для измерения количества дофамина и метаболитов. Сравнение уровней ДА, DOPAC (диоксифенилуксусной кислоты) и HVA (гомованилиновой кислоты) между культурами, полученными из вентральной пластинки и розеток. К 25 дню в трех популяциях клеток-предшественников формировались Tuj1+ нейроны (фиг. 2A) и клетки, экспрессирующие TH, ограничивающий скорость фермент при синтезе ДА. Однако обработка LSB/S/F8/CHIR давала TH+ клетки, коэкспрессирующие LMX1A и FOXA2 и демонстрирующие выраженную индукцию ядерного рецептора NURR1 (NR4A2) (фиг. 2A, B). Сравнение генной экспрессии в культурах на 13 день и на 25 день подтвердило устойчивую индукцию других постмитотических маркеров ДА нейронов (фиг. 2C). Определение характеристик ДА нейронов на 25 день при сравнении обработанных LSB и LSB/S/F8 культур подтвердило обогащение известными транскриптами ДА нейронов среднего мозга и позволило идентифицировать несколько новых кандидатных маркеров (фиг. 2D, табл. 3-5, фиг. 8b). Например, в культурах LSB/S/F8/CHIR (группа ДА нейронов среднего мозга) наблюдалось наибольшее обогащение по транскрипту TTF3, гена, ранее не ассоциировавшегося с развитием ДА нейронов среднего мозга, однако, высокоэкспрессируемого в черной субстанции у человека (фиг. 8c; атлас головного мозга Allen Brain Atlas: http://human.brain-map.org).
Аналогичные данные были получены для EBF-1, EBF-3 (фиг. 8c), а также TTR, известной транскрипционной мишени FOXA2 в печени. Данные, полученные при разработке настоящих изобретений, указывают на обогащение по нескольким генам PITX в клетках-предшественниках ДА нейронов среднего мозга. PITX3, классический маркер ДА нейронов среднего мозга, также стабильно экспрессировался на 25 день дифференцировки (фиг. 2E). Наконец, индукция как вентральной пластинки среднего мозга, так и ДА нейронов может быть легко воспроизведена в независимых линиях чЭСК и чиПСК (фиг. 9). Продемонстрированные в настоящем документе данные показали, что протокол LSB/S/F8/CHIR, в отличие от других протестированных протоколов, обеспечивал получение клеток с профилем экспрессии маркеров, соответствующим направлению дифференцировки в ДА нейроны среднего мозга.
In vitro и in vivo свойства происходящих из вентральной пластинки ДА нейронов сравнивали со свойствами ДА-подобных нейронов, полученных из промежуточных клеток нейрональных розеток (фиг. 10 и 16). Формирование из нейрональных розеток представляет собой наиболее широко используемую в настоящее время стратегию получения ДА нейронов из чПСК. Оба протокола, на основе вентральных пластинок и на основе розеток, были эффективными для получения TH+ нейронов, способных к долго- 45 041083 срочному выживанию in vitro (50 день дифференцировки; фиг. 3(1)a). Однако процент TH+ клеток был значимо выше в происходящих из вентральной пластинки культурах (фиг. 3(1)b). Хотя в TH+ клетках при использовании обоих протоколов наблюдалась коэкспрессия NURR1, происходящие из вентральной пластинки ДА нейроны коэкспрессировали FOXA2 и LMX1A (фиг. 3(1)a, b и 3(2)).
Наблюдались немногочисленные ГАМК и положительные по серотонину (5-НТ) нейроны (фиг. 3(1)c). ДА и его метаболиты DOPAC и HVA, присутствовали в культурах, полученных с применением любого из протоколов, однако, уровни ДА были приблизительно в 8 раз выше в культурах из вентральной пластинки (фиг. 3(1)d, e). ДА нейроны среднего мозга демонстрировали экстенсивное разрастание волокон и устойчивую экспрессию зрелых нейрональных маркеров, в том числе синапсина, транспортера дофамина (DAT), и сопряженного с G-белком калиевого канала внутреннего выпрямления (Kir3.2, также называемый GIRK2, экспрессируется в ДА нейронах компактной части черного вещества (SNpc)) (фиг. 3(1)f, 11). ДА нейроны SNpc in vivo демонстрируют электрофизиологический фенотип, отличающий их от большинства других нейронов в головном мозге. В частности, они спонтанно генерируют спайки на низкой частоте (1-3 Гц). Кроме того, указанные медленные спайки сопровождаются медленным подпороговым осциллирующим потенциалом. Через 2-3 недели in vitro те же указанные физиологические признаки демонстрируют культивированные ДА нейроны SNpc мышей в раннем постнатальном периоде. ДА нейроны, дифференцированные из чЭСК, стабильно (4/4 тестов) демонстрировали указанный отдельный физиологический фенотип (фиг. 3(1)g-i).
При поддержании мДА нейронов in vitro на 65 день (d65) наблюдались положительные по TH нейроны, по-прежнему экспрессирующие FoxA2 и образующие длинные волокна, типичные для мДА нейронов (фиг. 3(1)j). Измерение высвобождения ДА с помощью ВЭЖХ показало, что TH+ нейроны в возрасте d65 функциональны in vitro (фиг. 3(1)k).
В целом, нейрогенная конверсия предшественников вентральной пластинки среднего мозга и разработки оптимизированного протокола дифференцировки ДА нейронов среднего мозга из вентральной пластинки описаны в настоящем документе. Происходящие из вентральной пластинки ДА нейроны получали из ЭС-клеток человека, с применением основанной на малых молекулах активации SHH и канонической WNT-сигнализации на ранних стадиях дифференцировки (фиг. 3(2)). Указанные чЭС-клетки прогрессировали от двойной позитивной по FOXA2/LMX1A стадии вентральной пластинки среднего мозга в незрелые Tuj1+ нейроны с коэкспрессией FOXA2/LMX1A, и затем в зрелые ДА нейроны (фиг. 3(2)a, b), отличающиеся устойчивым высвобождением ДА и электрофизиологическими свойствами, характерными для ДА нейронов компактной части черного вещества (SNpc; А9-тип) среднего мозга, в том числе автономной пейсмейкерной активностью (фиг. 3(2)c). Неожиданным образом, этот способ был высокоэффективным, обеспечивая приобретение профиля маркеров зрелого среднего мозга более чем половиной клеток в культуральных чашках (см. фиг. 3(2)b).
VII. Определение характеристик происходящих из вентральной пластинки дофаминовых нейронов среднего мозга in vivo в качестве привитых нейронов.
В примере ниже описано применение иллюстративных способов в соответствии с настоящими изобретениями при терапевтическом замещении клеток. Одной из главных задач в данной области техники является возможность получения происходящих из чПСК ДА нейронов среднего мозга, способных к функциональному приживлению in vivo без риска избыточного разрастания нейронов или неадекватной дифференцировки в не являющиеся нейронами среднего мозга клетки или развития тератом. На основании исследований с трансплантацией фетальной ткани авторы настоящего изобретения предположили, что время выхода из клеточного цикла, для которого характерна экспрессия NURR1, может представлять собой подходящую стадию для пересадки (приблизительно 25 день дифференцировки, фиг. 2). Начальные исследования с применением клеток 25 дня у взрослых мышей без очаговых поражений продемонстрировали устойчивое выживание происходящих из чПСК FOXA2+/TH+ нейронов через 6 недель после трансплантации (фиг. 12). Тестировали долгосрочное выживание FOXA2+/TH+ клеток у хозяев с паркинсонизмом, не приводящее к избыточному разрастанию нейронов. С этой целью получали индуцированные 6-гидроксидофамином (6-OHDA) очаговые поражения (Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки) у мышей NOD-SCID с молчащим IL2Rgc, линии, эффективно поддерживающей выживание ксенотрансплантатов, с конкретной чувствительностью к воздействию редких туморогенных клеток (Quintana, et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки). Культуры как происходящих из вентральной пластинки, так и происходящих из розеток ДА нейронов прививали (150x103 клеток/животное) без предварительного очищения для обнаружения потенциальных загрязняющих клеток с высоким пролиферативным потенциалом. Через 4,5 месяцев после трансплантации полученных из вентральной пластинки ДА нейронов наблюдалась хорошо выраженная центральная часть трансплантата, состоящая из TH+ клеток, коэкспрессирующих FOXA2 и специфический маркер человека hNCAM (фиг. 4a-c). Функциональный анализ показал полное устранение индуцированного амфетамином вращательного поведения. Напротив, в происходящих из розеток нейрональных трансплантатах наблюдались немногочисленные TH+ нейроны, они не обеспечивали значимого уменьшения вращательного поведения (фиг. 4d), а также наблюдалось массивное избыточное
- 46 041083 разрастание нейронов (объем трансплантата>20 мм3; фиг. 13). Интенсивное избыточное разрастание происходящих из розеток нейрональных клеток, использованных для пересадки, согласно описанию в настоящем документе, было сопоставимо с предыдущей работой группы изобретателей с происходящими из розеток ДА-трансплантатами (Kim, et al. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки) и др. (Hargus, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки). Указанное избыточное разрастание было предположительно обусловлено более длительными периодами выживания (4,5 месяцев против 6 недель), отсутствия очищения с применением FACS перед трансплантацией и выбором в качестве хозяев мышей NOD-SCID с молчащим IL2Rgc. Число пролиферирующих Ki67+ клеток в полученных из вентральной пластинки трансплантатах было минимальным (<1% от общего количества клеток), тогда как в происходящих из розеток трансплантатах сохранились включения пролиферирующих предшественников нейронов. Избыточное разрастание нейронов, как полагают, вызвано наличием примитивных антериальных нейроэктодермальных клеток в составе трансплантата (Elkabetz, et al. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1670716712 (2008), цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки). Указанную гипотезу подтверждает экспрессия маркера переднего мозга FOXG1 в происходящих из розеток, но не в происходящих из вентральной пластинки трансплантатах. Незначительный процент астроглиальных клеток присутствовал как в происходящих из вентральной пластинки, так и в происходящих из розеток трансплантатах, хотя большинство GFAP+ клеток были отрицательными по маркерам человека, что указывает на происхождение от хозяина (фиг. 13).
Результаты для мышей NOD-SCID с молчащим IL2Rgc, описанные в настоящем документе, продемонстрировали устойчивое долгосрочное выживание FOXA2+/TH+ нейронов, полное обращение индуцированного амфетамином вращательного поведения и отсутствие каких-либо признаков избыточного разрастания нейронов. Однако некоторые из указанных исходов могут быть объяснены специфическим использованием мышей NOD-SCID с молчащим IL2Rgc. Для тестирования указанной гипотезы культуры полученных из вентральной пластинки ДА нейронов (250x103 клеток) трансплантировали взрослым крысам с очаговыми поражениями 6-OHDA и фармакологически индуцированным циклоспорином А иммунодефицитом. Через пять месяцев после трансплантации выживание трансплантатов было устойчивым (фиг. 4e-h), в среднем более чем с 15000 TH+ клеток, коэкспрессирующих FOXA2 (фиг. 4g) и ядерный антиген человека (hNA) (фиг. 4e); волокна TH+/hNCAM+ выходили из центральной части трансплантата в окружающий стриатум хозяина (фиг. 4f). Помимо FOXA2, TH+ клетки экспрессировали маркеры ДА нейронов среднего мозга PITX3 и NURR1 (фиг. 4h-j). Поведенческие анализы показали полное устранение индуцированной амфетамином вращательной асимметрии, в отличие от подвергшихся ложной трансплантации животных, у которых не наблюдалось улучшений (фиг. 4k). У подвергшихся трансплантации животных также наблюдались улучшения в тесте с шаганием (фиг. 4l) для измерения акинезии передних конечностей, и в тесте с цилиндром (фиг. 4m) - в анализах, независимых от фармакологической стимуляции ДА-системы. Для ДА нейронов человека позднее начало восстановления (приблизительно через 3-4 месяца после трансплантации) является ожидаемым и зависит от скорости созревания in vivo, например, уровней экспрессии DAT (фиг. 4n). Присутствие TH+ клеток, экспрессирующих каналы Kir3.2 (GIRK2) или кальбиндин показывает, что в трансплантате присутствуют ДА нейроны как SNpc (A9), так и вентральной области покрышки (A10) (фиг. 4o, p). Как и у мышей (фиг. 13), среди клеток крыс серотонинергические и ГАМК-ергические клетки встречались редко (<1% от общего количества клеток), как и происходящие в основном от хозяина GFAP+ глиальные клетки (7% от общего количества клеток; (фиг. 14). При том, что в трансплантате было детектировано незначительное число положительных по серотонину нейронов, наблюдались отрицательные по hNCAM клетки, представлявшие собой, вероятно, происходящие от хозяина серотонинергические волокна (фиг. 14). При приживлении трансплантата происходящих из вентральной пластинки ДА нейронов у мышей, крыс и обезьян наблюдалось неожиданное восстановление нейрональной функции у видов грызунов и приматов. Анализы краткосрочной (6 недель) выживаемости были продлены для исследования неожиданной долгосрочной выживаемости до 5 месяцев после трансплантации в стриатум мышей-хозяев с очаговыми поражениями 6OHDA и иммунной недостаточностью. Фактически, прямое сравнение традиционного способа получения ДА нейронов на основе розеток (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004)) и нового протокола дифференцировки ДА нейронов на основе вентральных пластинок, описанного в настоящем документе, показало, что происходящие из вентральной пластинки ДА нейроны были способны обеспечивать долгосрочное приживление трансплантата ДА нейронов, в отличие от нейронов на основе розеток (фиг. 4a-c).
В частности, устойчивая индукция восстановления поведения у мышей с вращательным поведением, вызванным амфетаминами, у мышей с нанесенными соединением 6-OH повреждениями после применения полученных из вентральной пластинки нейронов (fp, синяя линия) и полученных из розеток (красная линия) ДА нейронов (фиг. 4d) показала, что происходящие из вентральной пластинки нейроны обеспечивали более высокую степень восстановления. Мыши с трансплантированными ДА нейронами,
- 47 041083 полученными из вентральной пластинки, продемонстрировали практически полное восстановление по амфетаминовой шкале. Животные с трансплантатами из полученных из розеток ДА нейронов продемонстрировали более низкое улучшение поведенческих симптомов, в некоторых случаях с течением времени восстанавливалось исходное высокое число поворотов.
В модели с использованием мышей с повреждениями, вызванными 6OHDA, также обнаруживали устойчивое функционирование трансплантата. Крысы, в отличие от мышей с БП, позволяют проводить более сложные поведенческие тесты и исследовать выживание ДА нейронов в ксенографтных моделях после фармакологической иммуносупрессии (обработка, которая более близко имитирует протоколы трансплантации у человека). Прекрасное выживание трансплантата, свидетельство разрастания ДАволокон и сохранение экспрессии специфических факторов транскрипции подтверждали долговременное выживание полученных из вентральной пластинки нейронов, экспрессирующих маркеры аутентичных ДА нейронов среднего мозга (фиг. 4e-j). Ряд функциональных анализов продемонстрировал значительное улучшение как в тестах с лекарственно индуцированным поведением (индуцированное амфетаминами вращение), так и в тестах со спонтанным поведением (тесты с цилиндром и шаганием).
Приведенные здесь результаты продемонстрировали прекрасные выживаемость трансплантата и результаты, связанные с поведением, в двух независимых моделях на мышах. Однако количество ДА нейронов, необходимых для мыши или крысы, составляет малую долю количества клеток, необходимых для трансплантации приматам и людям. Для исследования масштабируемости этого протокола провели пилотные исследования по трансплантации на двух взрослых макаках резус с повреждениями, вызванными MPTP. Кроме того, вначале не было известно, сохранят ли описанные здесь способы и клетки свою функцию у приматов; эта информация могла бы помочь реализовать применение этих способов и клеток у людей. Соответственно, проводили начальные исследования по меньшей мере на двух обезьянах для исследования краткосрочного (4-6 недель) выживания in vivo и сохранения фенотипа ДА нейронов среднего мозга в мозге приматов. Описанные здесь исследования продемонстрировали устойчивое выживание TH/FOXA2-положительных ДА нейронов и указывали на реиннервацию стриатума реципиентов (фиг. 4q-t). Трансплантация большего количества клеток, близкого к диапазону значений, необходимому для будущих исследований на людях, демонстрировали устойчивое выживание ДА нейронов среднего мозга. В дополнение к этим результатам краткосрочных исследований, был проведен ряд более долгосрочных исследований на макаках-резус, в которых оценивали выживание клеток в течение 3 месяцев и оптимизированный режим иммуносупрессии с ежедневным введением препаратов селлсепт, програф и преднизон ежедневно (использовавшихся как тройная терапия в комбинации). Неожиданно было обнаружено устойчивое выживание полученных из ЭС клеток ДА нейронов среднего мозга в мозге приматов, а также значительно сниженная воспалительная реакция реципиента на трансплантаты по сравнению с выраженной реакцией микроглии реципиента, наблюдавшейся в исходном исследовании по трансплантации (см. фиг. 15).
В частности, способы, связанные с исследованиями на обезьянах, включали партии, содержащие 50x106 трансплантируемых предшественников ДА нейронов, полученных на 25 день дифференцировки с применением протокола, основанного на использовании вентральной пластинки. Классическая доза составляла 3 мг MPTP-HCL, инъецируемых в сонную артерию (диапазон 0,5-5 мг). За этим следовала системная инъекция 0,2 мг/кг MPTP в/в. Клетки инъецировали в три участка (задний отдел хвостатого ядра и прекомиссуральную часть скорлупы) с каждой стороны головного мозга (в общей сложности в 6 трактов, 1,25x106 клеток/тракт), и иммунитет животных подавляли циклоспорином-A. С одной стороны головного мозга инъецировали ДА-предшественники из экспрессирующего GFP субслона H9, тогда как с другой стороны прививали клетки, происходящие из немеченых клеток H9. Результаты, демонстрирующие приживление трансплантата нейронов у макак-резус с продолжением экспрессии FOX2A и продуцирования TH показаны на фиг. 4q-t. Через месяц после трансплантации наблюдалось устойчивое выживание ДА нейронов среднего мозга по оценке на основании экспрессии GFP (фиг. 15) и специфического цитоплазматического маркера человека (SC-121) (фиг. 4q). Центральную часть каждого трансплантата окружал ореол TH+ волокон, выходящих на расстояние до 3 мм в организм хозяина (фиг. 4r). Центральная часть трансплантатов состояла из TH+ нейронов, коэкспрессирующих SC-121 (фиг. 4s) и FOXA2 (фиг. 4t). Отрицательные по SC-121 и GFP области в составе трансплантата содержали Iba1+ микроглию хозяина (фиг. 15), что указывает на неполное подавление иммунитета.
Таким образом, показано приживление трансплантата новой популяции ДА нейрональных клеток у приматов, т.е. у взрослых макаков-резус с очаговыми поражениями MPTP (3 мг MPTP-HCL (1-метил-4фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин; диапазон концентраций 0,5-5 мг MPTP-HCl) с серьезной, более чем 95% потерей эндогенных ДА нейронов среднего мозга. Воздействие MPTP вызывало поддающиеся наблюдению изменения и симптомы, аналогичные таковым при болезни Паркинсона у человека.
Таким образом, был обнаружен новый протокол дифференцировки чПСК на основе вентральной пластинки, обеспечивающий точное воспроизведение развития ДА нейронов среднего мозга. Доступность клеток, обладающих основными признаками ДА нейронов среднего мозга, позволит использовать их для широкого спектра вариантов биомедицинского применения, такие как базовые исследования раз- 48 041083 вития, высокоэффективный поиск новых лекарственных средств и моделирование заболеваний на основе
БП-иПСК. Важно отметить, что в указанном исследовании наконец был разработан способ получения масштабируемого источника FOXA2+/TH+ нейронов для нейрональной трансплантации - значительный шаг на пути к клеточной терапии БП.
Кроме того, при получении аутентичных ДА нейронов среднего мозга из чЭСК продемонстрирована превосходная результативность in vivo (см. фиг. 4) и получение ДА нейронов в момент пересадки (приблизительно 40% зрелых нейронов в популяции на 25-30 день дифференцировки, что было выше процентного содержания при препарировании фетальной ткани вентрального отдела среднего мозга человека (составляющего, как правило, приблизительно 10%) (Sauer, et al., Restor. Neurol. Neurosci. 2:123135 (1991)).
Ниже приведено краткое описание материалов и методов для применения при оценке двух главных параметров после приживления трансплантата: продолжительность выживания и показатели поведенческих оценок. Для краткосрочных исследований, например, с целью подтверждения выживания клеток или фенотипического состава, предусмотрены поведенческие оценки; тестирование на выживание у животных проводят приблизительно через 4-8 недель после пересадки. Долгосрочные исследования включают поведенческую оценку после пересадки и выживание животных на протяжении по меньшей мере 5 месяцев после пересадки. При анализе стратегий усовершенствования, например, модификаций PSANCAM, предусмотрено включение в поведенческую оценку более сложных параметров, например лестничного теста для оценки ловкости использования передних конечностей.
Примеры протоколов для оценки результативности in vivo содержат по меньшей мере четыре главных компонента и включают следующее: i - индукция очаговых поражений, ii - основной поведенческий анализ, iii - пересадка, и iv - анализ тканей. Хотя указанные процедуры применяли у крыс, согласно некоторым вариантам реализации указанные процедуры могут применяться у других видов.
i) Индукция очаговых поражений. Односторонние инъекции 6-гидроксидофамина (6-OHDA) в медиальный пучок переднего мозга (MFB) представляет собой один из стандартных способов индукции паркинсоноподобных симптомов у крыс. 6-OHDA представляет собой нейротоксин, посредством ретроградного транспорта через нигростриальный путь в MFB попадающий обратно в черную субстанцию, приводя к смерти нейрональных клеток в результате повреждения митохондриальных дыхательных ферментов. Целевые нейроны включают дофаминергические нейроны A9 в составе компактной части черного вещества (SNC), а также нейроны A10 в вентральной области покрышки. Указанная модель очагового поражения широко исследуется и считается превосходной доклинической моделью для исследования нейрохимических и поведенческих последствий поздних стадий БП, поскольку приводит к экстенсивному одностороннему истощению дофамина в составе комплекса хвостатое ядро/скорлупа (CPU). Поведенческие последствия также хорошо описаны и включают спонтанное и индуцированное лекарственными средствами вращение, а также нарушения функционирования конечностей (см. ниже). Двусторонние модели паркинсонизма могут лучше имитировать заболевание человека, однако, приводят к адипсии и афагии у крыс.
Процедуру выполняли у анестезированных животных (кетамин/ксилазин) посредством стереотаксической инъекции в 2 участка вдоль медиального пучка переднего мозга. Эффективность индукции полного очагового поражения в значительной степени зависит от опыта оператора и при разработке настоящих изобретений варьировала от 60 до 80%. Животным позволяли восстановиться, а затем проводили серию поведенческих тестов с началом через 2 недели после хирургических процедур.
ii) Основной поведенческий анализ. Поведенческий анализ начинают через 2 недели после хирургических процедур и продолжают после трансплантации и до умерщвления животного. Целью указанного анализа является 1) установление того, что очаговое поражение является стабильным и полным, и что у животного не наблюдалось спонтанного обращения симптомов: явление, которое наблюдалось у животных с частичными очаговыми поражениями, 2) демонстрация влияния трансплантации дофаминовых нейронов на установленные поведенческие показатели.
(a) Вращательное поведение. Крыс наблюдают для установления спонтанных вращений и индуцированных D-амфетамином (ипсилатеральных) вращений (10 мг/кг). Индикатором значимого очагового поражения является превышение порогового значения >6 вращений в минуту. Также может быть проведен анализ на индуцированные апоморфином вращения, однако считается, что положительные результаты требуют >80-90% истощения дофаминовой иннервации в области хвостатого ядра/скорлупы, и менее стабильны при очаговых поражениях MFB по сравнению с очаговыми поражениями CPU. Три набора данных получают с 2-недельными интервалами и усредняют. Крыс с показателями вращения <6 не включают с исследования.
(b) Тест с шаганием. Указанный тест предназначен для определения акинезии передних конечностей. Экспериментатор удерживает крысу одной рукой, фиксируя задние конечности (слегка приподнимая туловище), а другой рукой фиксирует переднюю конечность, мониторинг которой не проводится. Таким образом, весь вес переносится на другую переднюю лапу. Крысу медленно передвигают в боковом направлении как спереди, так и сзади. Подсчитывают число корректирующих шагов в обоих направлениях для обеих лап.
- 49 041083 (c) Тест с цилиндром. Указанный тест предназначен для определения асимметрии использования передних конечностей. Крысу помещают в прозрачный цилиндр. В течение периода, составляющего 5 минут, оценивают поведение крысы при подъеме на задние лапы. Поведение анализируют во время подъема и опускания. Определяют процент одновременного и асимметричного использования лап при указанных движениях. Это может быть осуществлено с применением компьютерной системы видеомониторинга. Известно, что отрицательные результаты в указанных тестах коррелируют с истощением по дофамину, и было показано, что результаты улучшались после восстановительной пересадки согласно описанию в настоящем документе.
iii) Пересадка. Животные получали стереотаксические инъекции дофаминовых нейронов в стриатум через 3 недели после внесения индуцирующих паркинсонизм очаговых поражений, если поведенческие тесты подтверждали адекватное очаговое поражение. Координаты для инъекций общеизвестны. После пересадки дважды в месяц проводят ту же группу поведенческих тестов на протяжении варьирующих периодов времени (в среднем для достижения стабильного поведенческого восстановления требуется 5 месяцев).
iv) Анализ тканей. Животных умерщвляют и перфузируют. Головной мозг препарируют и подготавливают для иммуногистохимического исследования и стереологического анализа. Антитела включают TH, FoxA2, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Girk2, DAT для идентификации и определения функции дофаминовых нейронов; 5-НТ для идентификации серотонинергических нейронов; NCAM человека или ядерный антиген человека для идентификации принадлежности человеку; нестин, Sox2 для определения предшественников нейронов; Ki-67 для определения пролиферации; Oct4, Nanog в качестве маркеров плюрипотентности; альфа-фетопротеин; миозин; цитокератин в качестве маркеров мультилинейности для исключения образования тератом. Количественные показатели включают объем трансплантатов (оценка по методу Кавальери), общее число клеток и число дофаминергических клеток (с применением двойного мечения нейронов TH/FoxA2); и пролиферативный индекс (% Ki67+). Перечисленные антитела коммерчески доступны и были использованы при разработке настоящих изобретений.
В некоторых вариантах реализации предусмотрено использование крыс Спрег-Доули (SD) для лучшего моделирования ситуации, характерной для человека. SD-крысы ежедневно получают внутрибрюшинные инъекции циклоспорина (15 мг/кг), начиная за день до пересадки и до умерщвления. При долгосрочном инъецировании водных форм циклоспорина (неорал, пероральный раствор, применяемый у человека) наблюдалась пренебрежимая частота осложнений.
В некоторых вариантах реализации предложены примеры способов масштабирования культур мДА нейронов, см. табл. 9. Согласно конкретным вариантам реализации, такие способы предусмотрены для применения при получении культур соответствующего требованиям GMP уровня для клинического применения.
Оценочные параметры. Предусмотрено тестирование in vivo для применения в способах краткосрочной и долгосрочной оценки эффективности трансплантатов. Результаты, полученные при разработке настоящих изобретений, показали в обоих случаях идентичные тканевые характеристики, с ожидаемым увеличением доли TH+ клеток при долгосрочной выживаемости за счет дифференцировки привитых предшественников.
В среднем при трансплантации 15000 TH+/FoxA2+ нейронов на 250000 клеток животные выживали на протяжении 5 месяцев после пересадки. При краткосрочной выживаемости выживало и было подсчитано значимо меньшее число клеток с двумя метками. Соответственно, предполагаемые результаты in vivo, приведенные в табл. 9, соответствуют консервативной оценке. Примеры показателей, используемых для оценки статуса успешности/неуспешности для состава трансплантатов приведены в табл. 10.
Для долгосрочных трансплантатов поведенческая оценка представляет собой имеющий существенное значение компонент оценки результативности продуктов чЭС-линий. Ориентировочные принципы для определения утраты функции и восстановления были полнее всего описаны для индуцированных амфетамином вращений, при этом устойчивый трансплантат должен нормализовать поведение и иногда приводить к контралатеральным движениям из-за дисбаланса ДА. Нормативы, приведенные в табл. 11, представляют собой примеры ориентиров, определенных при разработке настоящих изобретений.
В некоторых вариантах реализации источники клеток для применения в способах дифференцировки в соответствии с настоящими изобретениями включают, не ограничиваясь перечисленными, линии клеток WA09, ACT (M09), Bio-Time и Roslin. В некоторых вариантах реализации источники клеток для применения в способах дифференцировки в соответствии с настоящими изобретениями включают, не ограничиваясь перечисленными, соответствующие требованиям GMP линии. В некоторых вариантах реализации источники клеток для применения в способах дифференцировки в соответствии с настоящими изобретениями включают, не ограничиваясь перечисленными, получение зрелых ДА нейронов для применения в анализах краткосрочного выживания прижившихся трансплантатов. В некоторых вариантах реализации источники клеток для применения в способах дифференцировки в соответствии с настоящими изобретениями включают, не ограничиваясь перечисленными, получение зрелых ДА нейронов для применения в экспериментах по приживлению трансплантатов, которые включают поведенческие оценки. Контрольные группы получают WA09 категории для исследований и симулирующий солевой раствор. Для статистического анализа используют ANOVA с апостериорным тестом Даннетта.
- 50 041083
A. Комплексные поведенческие анализы для оценки степени реиннервации стриатума. В стандартных поведенческих тестах (согласно описанию в настоящем документе) продемонстрирована прямая корреляция с числом выживших дофаминовых нейронов в составе трансплантата. Крысы, получавшие лечение зрелыми ДА нейрональными клетками в соответствии с настоящими изобретениями, в поведенческих тестах демонстрируют максимальное восстановление с расчетным показателем восстановления, составляющим приблизительно 30% ДА нейронов, что необходимо для снижения уровня индуцированных амфетамином вращений. Соответственно, после достижения порога выживания ДА нейронов у хозяина (расчетный показатель: 800-1200 ДА нейронов в модели на крысах), может быть трудно отличить поведенческие различия, отражающие стратегии усовершенствования. Был описан способ с применением микротрансплантации, при котором в пределах стриатума размещают несколько трансплантатов небольшого размера, а не трансплантаты большого размера. Контролируя общее число трансплантированных ДА клеток, наблюдали различия поведенческих исходов при сравнении 2 групп: у крыс с несколькими трансплантатами небольшого размера наблюдалось более ранее и более экстенсивное поведенческое восстановление в отношении индуцированных лекарственными средствами вращений и в тестах с шаганием по сравнению с животными с одним трансплантатом большого размера, при таком же числе ДА нейронов и таком же уровне высвобождения дофамина. Неожиданным образом, имело место отчетливое различие в ловкости использования передних конечностей: у животных с широко распределенными трансплантатами небольшого размера наблюдалось улучшение, в отличие от крыс -носителей стандартных трансплантатов. Считается, что ловкость использования передних конечностей является задачей, требующей пространственного и временного контроля над высвобождением ДА, и, соответственно, надлежащей взаимосвязи между пересаженными нейронами и стриатумом хозяина. Соответственно, в некоторых вариантах реализации применение зрелых ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями для процедур трансплантации приводило к восстановлению использования передних конечностей. Соответственно, в некоторых вариантах реализации зрелые ДА нейроны в соответствии с настоящими изобретениями вводят в один участок стриатума. В других вариантах реализации зрелые ДА нейроны в соответствии с настоящими изобретениями вводят по меньшей мере в 2 или более участков в составе стриатума.
B. Тест на ловкость использования передних конечностей (или лестничный тест).
Тест на использование передних конечностей для анализа выполняемых передними конечностями движений вытягивания и захвата выполняли до и после очагового поражения, а также после трансплантации. Животным не давали пищи в течение 48 ч перед тестом, и проводили тестирование ежедневно в течение 5 дней до очагового поражения, и затем дважды после очагового поражения с 3-недельным интервалом. После пересадки тест повторяли еще 2 раза, на 3 и 5 месяц. Животных помещали в плексигласовую камеру, оснащенную двойной лестницей. Гранулы корма размещают на 5 ступеньках с двух сторон при тестировании до трансплантации, и с одной стороны (со стороны пораженной конечности, контралатерально к вращению) после пересадки. Животных тестируют на протяжении заданного временного промежутка (например, 10 мин), подсчитывают число и долю съеденных гранул (успешное извлечение) и гранул, которые были захвачены, и сравнивают с результативностью у индивидуального животного до очагового поражения. Использовали несколько вариаций указанного теста, отличающихся числом повторов и временными характеристиками теста.
VIII. Дифференцированные с применением описанных в настоящем документе способов клетки демонстрировали электрофизиологические ответы, аналогичные ответам ДА клеток in situ.
В примере ниже описано применение иллюстративных способов в соответствии с настоящими изобретениями для определения функциональной способности ДА нейронов среднего мозга, полученных в результате дифференцировки с применением способов, описанных в настоящем документе. ДА нейроны компактной части черного вещества (SNpc) in vivo проявляют электрофизиологический фенотип, отличающий их от большинства других нейронов в головном мозге. В частности, они спонтанно генерируют спайки на низкой частоте (1-3 Гц). Кроме того, указанные медленные спайки сопровождаются медленным подпороговым осциллирующим потенциалом. Через 2-3 недели in vitro, те же указанные физиологические признаки демонстрируют культивированные ДА нейроны SNpc мышей в раннем постнатальном периоде. Для определения того, демонстрируют ли мДА нейроны в соответствии с настоящими изобретениями сопоставимый электрофизиологический фенотип, тестировали уникальные характеристики электрического ответа мДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями. ДА нейроны среднего мозга в соответствии с настоящими изобретениями тестировали на 80-100 день культивирования методом регистрации отдельных клеток. Указанные дифференцировавшие из чЭСК мДА нейроны стабильно (4/4 тестов) демонстрировали указанный отдельный физиологический фенотип со специфическими автономными спайками и осциллирующими изменениями мембранного потенциала (фиг. 3g-i). Указанное поведение известно как автономная пейсмейкерная активность, представляет собой специфическое свойство ДА нейронов среднего мозга и, в частности, подтипа дофаминовых нейронов среднего мозга, наиболее релевантных при болезни Паркинсона (тип ДА нейронов черной субстанции среднего мозга).
Предусмотрено применение электрофизиологических измерений на препаратах живых срезов, т.е. биоптатов из привитых областей. В одном варианте реализации ДА нейроны A9 или A10 типа, происхо
- 51 041083 дящие из трансплантатов, идентифицируют in vivo на основании тестирования на автономную пейсмейкерную активность, специфическую для дофаминовых нейронов Л9-типа, на которые в наибольшей степени влияет БП. Другими словами, нейроны Л10-типа не обладают пейсмейкерной активностью. Задавали условия для регистрации in vivo происходящих из плюрипотентных стволовых клеток человека ДА нейронов в препаратах живых срезов, см. фиг. 26. В частности, оценивали электрофизиологические признаки трансплантированных ДА нейронов человека, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, и было обнаружено, что они обладают электрофизиологическими признаками, типичными для нейронов компактной части черного вещества мышей (SNpc); на фиг. 26Л сверху представлена реконструкция нейрона-пейсмейкера в области трансплантата. Снизу приведен пример микрофотографии среза головного мозга крысы, в который за 9 месяцев до этого были инъецированы происходящие из чЭС-клеток нейроны; трансплантат обведен; изображение с большим увеличением приведено на вставке снизу. Срез обрабатывали для выявления тирозингидроксилазы, которая окрашена белым, фиг. 26B. Кроме того, сверху представлен пример пэтч-регистрации в конфигурации присоединенная клетка с предполагаемого ДА нейрона в трансплантате; снизу представлен пример регистрации в конфигурации целая клетка с той же клетки. Регистрацию проводили в присутствии глутамата и антагонистов рецептора ГАМК (50 мкМ ЛР5, 10 мкМ CNQX и 10 мкМ габазин) для элиминации синаптического входа. Результаты указанной регистрации показали, что происходящие из ПС-клеток нейроны представляли собой автономные пейсмейкеры с нормальной внутрисоматической динамикой напряжения. Другой зарегистрированный нейрон в образце трансплантата обладал аналогичными свойствами, фиг. 26C. Для сравнения представлены способы регистрации в конфигурации присоединенная клетка и регистрации в конфигурации целая клетка с дофаминергического нейрона SNpc взрослой мыши. Сокращения (СТх=кора, STr=стриатум, SNpc=компактная часть черного вещества, ДА=дофаминергический). Указанные данные отражают функциональные исследования in vivo в стриатуме крыс после пересадки через месяцы после трансплантации. Соответственно, в некоторых вариантах реализации функциональные исследования in vivo на привитой ткани демонстрируют восстановление компактной части черного вещества (SNpc).
IX. При направленной дифференцировке мутантных генетически обусловленных БП-иПС клеток PINK1 (мутация PINK1) в ДА нейроны обнаруживались паркинсоноподобные аномалии в зрелых ДА нейронах.
В указанном примере описано открытие, заключающееся в получении больших популяций дифференцированных ДА нейронов среднего мозга с характеристиками нейронов БП-пациента при использовании линии клеток БП-пациента, т.е. мутантных клеток БП-иПСК PINK1, полученных способом, не приводящим к уничтожению эмбриона, в качестве популяции клеток для получения FOXA2/LIM1XA/TH+ ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями.
В одном варианте реализации авторы настоящего изобретения предложили выделение стартовой популяции клеток пациента для применения в способах получения аутентичных ДА нейронов in vitro, если у указанного пациента имеется симптом болезни Паркинсона (БП), обеспечивающее потенциальное преимущество при применении обработанных клеток в тестах in vitro для 1) наблюдения дифференцировки или функциональных аномалий, по сравнению с аутентичными ДА нейронами людей, у которых отсутствует неврологический симптом, и затем 2) использования наблюдаемой аномалии для разработки терапевтического лечения для обращения указанной аномалии; и 3) лечения указанного пациента с применением терапевтического лечения для уменьшения, т.е. обращения симптома болезни Паркинсона.
В одном варианте реализации авторами настоящего изобретения предложено выделение стартовой популяции клеток из организма того же пациента для получения аутентичных ДА нейронов для применения при трансплантационном лечении, при этом у указанного пациента имеется симптом болезни Паркинсона (БП), обеспечивающее потенциальное преимущество в виде уменьшения иммунологического отторжения, т.е. отторжения трансплантата. В других вариантах реализации предусмотрено уменьшение отторжения трансплантата за счет применения источника исходных клеток, выделенного из организма человека с совпадающими антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС) (т.е. близнеца) или человека с приемлемым для трансплантации уровнем совпадения тканей по МНС (например, родственника пациента или не являющегося родственником человека, у которого экспрессируются частично совпадающие молекулы МНС.
Л. Направленная дифференцировка показала, что генетически обусловленные БП-иПС клетки PINK1 обладали способностью развиваться в ДА нейроны, подобные ДА нейронам среднего мозга. См. фиг. 20-25. Дифференцировку мутантной линии БП-иПСК PINK1 Q456X в ДА нейроны среднего мозга осуществляли с применением нового протокола (способа) на основе вентральной пластинки, описанного в настоящем документе, который обеспечивал получение ДА нейронов среднего мозга, демонстрировавших профили дифференцировки, сопоставимые с профилями дифференцированных ДА нейронов, полученных с помощью нового протокола на основе вентральной пластинки среднего мозга из линии H9. (фиг. 20). В указанном примере описано открытие, заключающееся в получении больших популяций дифференцированных ДА нейронов среднего мозга с характеристиками нейронов БП-пациента при использовании линии клеток от БП-пациента, т.е. мутантных клеток БП-иПСК PINK1, полученных способом, не приводящим к уничтожению эмбриона, в качестве популяции клеток для получения
- 52 041083
FOXA2/LIM1XA/TH+ ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями.
Клетки мутантной линии БП-иПСК PINK1 Q456X дифференцировали в ДА нейроны среднего мозга с применением нового протокола (способа) на основе вентральной пластинки в соответствии с настоящими изобретениями, который обеспечивает профили дифференцировки в нейроны среднего мозга, сопоставимые с профилями для иПСК линии H9. A-C) Иммуноцитохимический анализ мутантных БПиПСК линии PINK1 на 11 день дифференцировки (стадия предшественников среднего мозга), на FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (A), 25 день дифференцировки (ранняя постмитотическая стадия ДА нейронов), на FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (B) и на NURR1 (красный) и TH (зеленый) (C). D-F) Та же группа иммуноцитохимических анализов, проведенных с применением происходящих из H9 клеток, на 11 день дифференцировки, на FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (D), на 25 день дифференцировки, на FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (E); и на NURR1 (красный) и TH (зеленый) (F).
B. Генетически обусловленные БП-иПСК проявляли БП-подобный фенотип с агрегацией белков. Фиг. 21-24. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что мутантные БП-иПСК PINK1 демонстрировали наличие экспрессии α-синуклеина (основной компонент телец Леви у БП-пациентов) в цитозоле TH+ ДА нейронов на день 55 дифференцировки с применением нового протокола индукции ДА нейронов среднего мозга на основе вентральной пластинки (фиг. 21A-B). A, B). Иммуноцитохимический анализ мутантных БП-иПСК линии PINK1 на день 55 дифференцировки на α-синуклеин (LB509, красный), TH (зеленый); и объединенное изображение (A) для α-синуклеина (красный) и убиквитина (зеленый) (B). Указанные положительные по α-синуклеину клетки также демонстрировали высокие уровни экспрессии убиквитина (классический маркер телец Леви). Напротив, ДА нейроны, происходящие из линии контрольных иПС-клеток, демонстрировали нормальную синаптическую (в противоположность цитозольной) экспрессию α-синуклеина и очень низкие уровни убиквитина (фиг. 21C-D). C, D) Иммуноцитохимический анализ линии контрольных иПСК на день 55 дифференцировки на α-синуклеин (красный) и TH (зеленый) (C); и а-синуклеин (красный) с убиквитином (зеленый) (D).
C. Экспрессия агрегированной формы α-синуклеина. В головном мозге БП-пациента димеризованная нерастворимая форма α-синуклеина приводит к агрегации в тельцах Леви. В указанной димеризованной форме α-синуклеина наблюдается фосфорилирование серина 129 на α-синуклеине. В тот же день дифференцировки мутантные происходящие из БП-иПСК клетки PINK1 демонстрировали выраженную экспрессию Ser129-фосфорилированного α-синуклеина, в отличие от происходящих из контрольных иПСК клеток, которые демонстрировали очень низкие уровни экспрессии (фиг. 22).
В мутантных происходящих из БП-иПСК клетках PINK1 наблюдалась выраженная экспрессия Ser129-фосфорилированного α-синуклеина, в отличие от происходящих из контрольных иПСК клеток, которые демонстрировали очень низкие уровни экспрессии. A, B) Иммуноцитохимический анализ на Ser129-фосфорилированный α-синуклеин (зеленый) и DAPI (синий) в мутантных происходящих из БПиПСК клетках PINK1 на день 55 дифференцировки (A) и соответствующих происходящих из контрольных иПСК клетках (B).
D. Различия в паттернах экспрессии α-синуклеина наблюдаются в зависимости от протокола дифференцировки. Авторы настоящего изобретения предположили, что происходящие из вентральной пластинки аутентичные ДА нейроны среднего мозга демонстрировали БП-специфическую уязвимость и соответствующие специфические фенотипы in vitro. ДА нейроны, полученные с применением классического протокол дифференцировки на основе стромальных клеток-фидеров MS5 (Perrier et al., PNAS 2004, цитируемый источник включен в настоящий текст путем ссылки), давали значительные количества TH+ нейронов. Однако на основании данных, полученных при разработке настоящих изобретений, авторы настоящего изобретения показали, что TH+ клетки на основе MS5 не представляли собой аутентичные происходящие из вентральной пластинки ДА нейроны среднего мозга. В культурах, дифференцированных с применением протокола MS5, присутствовало много положительных по α-синуклеину клеток. Однако указанные клетки не коэкспрессировали TH. Кроме того, отсутствовали различия в паттернах экспрессии БП-иПСК и контрольных иПСК при применении стратегии дифференцировки MS5 (фиг. 23AB). Эти данные показывают, что α-синуклеин также экспрессируется в других типах клеток, не являющихся ДА клетками, и что такой не-ДА α-синуклеин не изменяется в пораженных заболеванием клетках относительно происходящих из контрольных иПСК клеток, в частности, при применении стандартных протоколов дифференцировки с MS5. Указанные клетки представлены ДА-подобными происходящими из розеток нейронами, описанными в опубликованных источниках (например, Perrier PNAS 2004). Указанные TH+ клетки на основе MS5 (=ДА-подобные клетки) использованы для сравнения на фиг. 3, 10, 13 и 16. Эти данные показывают, что α-синуклеин также экспрессируется в других, не-ДА типах клеток, и что такой не-ДА α-синуклеин не изменяется в пораженных заболеванием клетках относительно происходящих из контрольных иПСК клеток, в частности, при применении стандартных протоколов дифференцировки MS5. Наконец, новый протокол дифференцировки на основе вентральной пластинки, описанный в настоящем документе, дает значительное число TH+ клеток, коэкспрессирующих α-синуклеин.
- 53 041083
Указанные TH+ клетки экспрессируют α-синуклеин согласно цитозольному паттерну экспрессии. Фиг.
24A, B) иммуноцитохимический анализ на α-синуклеин (LB509, красный), TH (зеленый) мутантных БПиПСК линии PINK1 на день 60 дифференцировки на основе MS5 (A) и контрольных иПСК (B); C) иммуноцитохимический анализ мутантных БП-иПСК линии PINK1 на день 55 дифференцировки на основе вентральной пластинки на α-синуклеин (красный), TH (зеленый).
E. ДА нейроны, происходящие из генетически обусловленных БП-иПС клеток, более уязвимы для токсической стимуляции. Фиг. 24-25. Происходящие из БП-иПСК TH+ ДА нейроны, полученные с помощью протокола на основе вентральной пластинки, были более уязвимы для стимуляции токсином (валиномицин: ионофор митохондрий, 5 мкМ (диапазон концентраций 1-10 мкМ), 48 ч), чем происходящие из контрольных иПСК клетки. Напротив, TH+ нейроны, полученные с применением классического протокола на основе MS5, не демонстрировали дифференциальной уязвимости происходящих из БП-иПСК и происходящих из контрольных иПСК клеток (фиг. 24). Анализ общей жизнеспособности клеток с аламаровым синим через 48 ч обработки валиномицином также продемонстрировал дифференциальное выживание клеток при стимуляции токсином в специфическом диапазоне доз (5 и 10 мкМ) при сравнении БПиПСК и контрольных иПСК (фиг. 25). Нормальные условия: происходящие из БП-иПСК и контрольных иПСК культуры, полученные с применением протокола на основе MS5 (D, показаны происходящие из БП-иПСК клетки); TH+ нейроны после стимуляции токсином в происходящих из БП-иПСК (E), и происходящих из контрольных иПСК культурах (F), полученных с применением протокола MS5. G-H) Изображения на малом увеличении при иммуноцитохимическом анализе на Tuj 1 (красный) и TH (зеленый) на день 60 дифференцировки с применением протокола на основе вентральной пластинки: БП-иПСК в нормальных условиях (G) и при стимуляции токсином (H); контрольные иПСК в нормальных условиях (I) и при стимуляции токсином (J). K-N) Изображения на малом увеличении при иммуноцитохимическом анализе на Tuj 1 (красный) и TH (зеленый) на 60 день дифференцировки с применением протокола на основе MS5: БП-иПСК в нормальных условиях (K) и при стимуляции токсином (L); и контрольные иПСК в нормальных условиях (M) и при стимуляции токсином (N).
F. Пример количественного определения жизнеспособности клеток - анализ зависимости дозаэффект при стимуляции токсином. Анализ на жизнеспособность клеток с аламаровым синим через 48 ч обработки валиномицином продемонстрировал дифференциальное выживание клеток при стимуляции токсином в специфическом диапазоне доз (5 и 10 мкМ) при сравнении БП-иПСК и контрольных иПСК (60 день дифференцировки на основе вентральной пластинки). Отметим, что указанные аналитические тесты предназначены для определения общих показателей гибели клеток, тогда как большинство резко выраженных эффектов наблюдалось конкретно в ДА нейронах (см. фиг. 14). Соответственно, при основанном на аламаровом синем количественном определении, вероятно, происходит недооценка степени дифференциального эффекта, наблюдаемого в линиях ДА нейронов.
X. Предложенное крупномасштабное культивирование с применением композиций и способов в соответствии с настоящими изобретениями для получения типовых мДА нейронов.
В приведенных в настоящем документе описаниях представлены типовые способы и применения для крупномасштабного получения нервных клеток мДА в результате дифференцировки с применением композиций и способов согласно описанию в настоящем документе. Масштабируемое получение (т.е. способы, предположительно подходящие для успешного получения мДА нервных клеток из культур, содержащих относительно небольшое количество клеток), как было показано, дает популяции клеток, способные обеспечить подходящие для трансплантирования мДА нейроны на 25 день. В частности, для иПСК PINK. См. табл. 9).
XI . Способы обогащения ДА нейронами среднего мозга.
Были разработаны и протестированы несколько способов, до и во время разработки настоящих изобретений, обогащения популяций клеток предшественниками ДА нейронов среднего мозга, за счет решения проблем, например, путем истощения контаминирующих клеточных популяций, в том числе, но не ограничиваясь указанными, контаминирующих плюрипотентных стволовых клеток. Начальные исследования проводились с применением первичных эмбриональных нейронов мыши, эмбриональных нейронов крысы и полученных из ЭСК мыши популяций. Помимо цели, заключающейся в увеличении популяций нейронов для применения при обогащении ДА нейронами, исследования на ЭСК мыши включали разработку процедур для предотвращения образования тератом, представлявшего собой проблему при предыдущих процедурах. Указанные стратегии включали негативный отбор на поверхностные клеточные маркеры, экспрессируемые на плюрипотентных клетках (таких как SSEA1) наряду с позитивным отбором клеток, экспрессирующих нейронный маркер (NCAM). Был предложен ряд генетических репортерных стратегий, задействующих клетки мыши, для применения при идентификации обогащения нервными клетками в парадигмах трансплантации ДА нейронов (например, идентифицирование клеток, экспрессирующих SOX1, Corin/Lmx1a, Ngn2, TH, Pitx или DAT). Функциональное тестирование проводили на первичных клетках от Ngn2-репортерных мышей (Thomposon et al., Exp Neurol. 198(1): 183-98 (2006) и Lmx1A-репортерных мышей, также отсортированная по Corin (Jonsson, Exp Neurol. 219(1):34154 (2009). В случае популяций, полученных из ЭСК мыши, исследования проводили с применением ре- 54 041083 портерных линий ЭСК мыши с маркерами SOX1 (Barraud et al., Eur J Neurosci. 2005 22(7):1555-69), тирозингидроксилазой TH (ТГ) (Kelly et al., Minerva Endocrinol. 1991 16(4):203-6), Pitx3 (Hedlund et al., Stem Cells. 2008 26(6):1526-36) и переносчиком дофамина DAT (Zhou et al., Stem Cells. 2009 27(12):2952-61). Кроме того, при разработке настоящих изобретений авторы изобретения провели комплексное трансплантационное исследование с непосредственным сравнением in vivo показателей трех очищенных полученных из ЭСК мыши популяций, представляющих последовательные стадии развития ДА нейронов: предшественники среднего мозга (Hes5::GFP), ранние постмитотические клетки (Nurr1::GFP), и зрелые ДА нейроны (Pitx3::YFP). Указанные исследования выявили, что Nurr1-экспрессирующие развивающиеся ДА клетки, в частности, подходят для трансплантации, и показали, что очищенные ДА нейроны способны эффективно приживаться при трансплантировании in vivo. Кроме того, указанные результаты использовали для отбора клеток на 25 день дифференцировки (начало экспрессирования Nurr1) для применения при трансплантировании чЭСК-ДА нейронов в моделях БП на мышах, крысах и макаках резус.
При разработке настоящих изобретений при получении аутентичных ДА нейронов среднего мозга из чЭСК наблюдались прекрасные показатели in vivo (см. фиг. 4); применение протоколов согласно описанию в настоящем документе приводило к выходу приблизительно 40% ДА нейронов к моменту трансплантации. Указанный процент выше процента ДА нейронов, полученных при препарировании фетальной ткани вентрального отдела среднего мозга человека (составляющего, как правило, приблизительно 10%). Соответственно, предполагается, что применение источника ДА нейронов на основе чЭСК согласно описанию в настоящем документе обеспечит дальнейшее повышение чистоты при применении стратегий очистки клеток. Кроме того, были разработаны генетические репортерные линии для применения с чЭСК, аналогичные используемым в исследованиях на мышах, включая линию клеток человека в качестве линии Nurr1::GFP. Тем не менее, применение генетических репортеров может быть проблематичным при трансляции у человека, так как GFR (ЗФБ) является для человека иммуногенным, и, соответственно, не подходит для применения у человека. Кроме того, может представлять трудности FACSсортировка для создания маточного банка ДА нейронов клинического класса (т.е. получение замороженных культур ДА нейронов человека для применения при трансплантации), учитывая продолжительность времени, необходимого для сортировки партий размером приблизительно 109 клеток, необходимых для каждого трансплантата, помимо потенциальной высокой стоимости и более низкого выхода клеток при восстановлении после хранения. Вместо использования генетических репортерных систем и выделения клеток на основе метода FACS, авторы изобретения предложили выделение ДА нейронов на основе экспрессии поверхностных маркеров с применением альтернативных стратегий с использованием техник разделения клеток, предложенных для применения у пациентов с БП. Так, сортировка с применением магнитных частиц (например, система CliniMACS®) широко применялась в одобренных FDA методах на основе клеток, и обеспечивала быстрое, экономически эффективное выделение до 1010 клеток в соответствующих правилам надлежащей медицинской практики (GMP) условиях, т.е. условиях, одобренных для выделения клеток, предназначенных для применения у человека. Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложена сортировка с применением магнитных частиц для обогащения зрелыми ДА нейронами, например с применением CD142, присоединенного к магнитным частицам для обогащения Nurr1+ нейронами, предназначенными для применения в трансплантатах.
XI I. Идентифицирование поверхностных клеточных маркеров для применения в способах получения зрелых ДА нейронов.
Данные об экспрессии маркеров клеточной поверхности, собранные при разработке настоящих изобретений, позволили идентифицировать несколько новых маркеров клеточной поверхности, экспрессируемых на ДА нейронах среднего мозга. В частности, были обнаружены маркеры для дополнительного идентифицирования клеток, таких как специфические клетки, дифференцирующие в зрелые ДА нейроны, зрелые ДА нейроны в соответствии с настоящими изобретениями и клетки A9. Для идентификации таких поверхностных маркеров применялись две главные стратегии: во-первых, несмещенный скрининг генной экспрессии в генетических репортерных линиях (фиг. 27a) показал наличие нескольких кандидатных маркеров, включая CD142 и маркер, называемый DCSM1, который избирательно экспрессировался в ДА нейронах среднего мозга и, как обнаружено, представлял собой, в частности, маркер ДА нейронов A9-типа (фиг. 27b). Вторая стратегия состояла в использовании скрининга на CD-маркеры клеточной поверхности в полученных из чЭСК ДА нейронах, которые тестировали с 242 коммерчески доступными антителами в 96-луночном формате (фиг. 27c, d). Результаты такого типового скрининга (фиг. 27e) позволили идентифицировать по меньшей мере 5 подтвержденных маркеров, которыми богаты ДА нейроны среднего мозга, включая CD142, избирательный маркер, характерный для стадии Nurr1+ ДА нейронов (фиг. 27f), помимо CD63, CD99 и DCSM1.
В частности, как видно из фиг. 27, скрининг поверхностных CD-маркеров полученных из WA09 ДА нейронов на 25 день дифференцировки, протестированных с индивидуальными антителами в количестве до 242. Указанные результаты сравнивали с дублирующим скринингом широкого спектра других полученных из WA09 типов нервных клеток (например, полученных из чЭСК HB9::GFP+ мотонейронов, полученных из чЭСК кортикальных нейронов, полученных из чЭСК Nkx2.1::GFP+ предшественников вентральной части переднего мозга, и нескольких других полученных из чЭСК типов нейронов. Получен
- 55 041083 ную базу данных экспрессионных профилей поверхностных маркеров затем использовали для отбора кандидатных CD-маркеров, избирательно обогащающих любой заданный подтип, например, ДА нейроны среднего мозга (фиг. 27). Один из выявленных маркеров, связанный с дифференцировкой ДА нейронов из чЭСК, представлял собой CD142. Отбор клеток по CD142, специфически обогащенных, в частности, полученными из чЭСК ДА нейронами на стадии Nurr1+ при истощении других подтипов нейронов. В некоторых вариантах реализации CD142 экспрессируется до Nurr1+. В некоторых вариантах реализации популяция ДА нейронов среднего мозга, отсортированная по CD142, содержит клетки Nurr1+ и Nurr1-. В некоторых вариантах реализации популяция ДА нейронов среднего мозга, отсортированная по CD142, содержит клетки Nurr1-. В некоторых вариантах реализации популяция культивируемых отсортированных по CD142+ Nurr1- ДА нейронов среднего мозга начинает экспрессировать Nurr1 (т.е. становится Nurr1+) в течение периода до двух дней после сортировки.
Помимо CD142, полученные из чЭСК ДА нейроны были обогащены маркерами CD63 и CD99. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации, ДА-культуры нервных клеток обогащают ДА нейронами путем сортировки или отбора по маркерам, включая, но не ограничиваясь перечисленными, CD142, CD63, CD99, DCSM1, Nurr1+ и т.д. Маркер CD142, как правило, присутствует у приблизительно 30% общего количества клеток в популяции на 25 день дифференцировки (фиг. 28a). Избирательность CD142 в отношении стадии Nurr1+ ДА нейронов была подтверждена для нескольких независимых линий чЭСК и чиПСК (фиг. 28b). Важно, что, помимо обогащения ДА нейронами, CD142 избирательно истощает другие подтипы нейронов, такие как GABA и серотонинергические нейроны. (фиг. 28c-f). Проводились исследования in vivo, демонстрирующие способность CD142 приводить к формированию высокочистых ДА нейронных трансплантатов без детектируемых примесей GABA и серотонинергических нейронов. Серотонинергические нейроны представляют собой тип клеток, при трансплантировании фетальных тканей человека задействованный в качестве потенциального источника трансплантатиндуцированной дискинезии. Хотя применение способов трансплантации согласно описанию в настоящем документе с применением неочищенных клеток уже приводило к немногочисленности серотонинергических нейронов, применение CD142 должно снизить указанный риск в еще большей степени.
A. Маркеры для идентификации зрелых мДА нейронов A9-типа. Было обнаружено, что полученные из A9/полученные из A10 ДА нейроны обладают, in vitro и in vivo, различными функциональными характеристиками и специфическими паттернами иннервации, соответствующими их роли для функционирования мезостриатума/мезолимбической системы. При разработке настоящих изобретений авторы обнаружили, что аутентичные мДА нейроны, полученные посредством способов в соответствии с настоящими изобретениями (фиг. 4), приводят к появлению нейронов, обладающих свойствами, характерными в большей степени для A9, чем для A10. В частности, по меньшей мере, часть аутентичных мДА нейронов, позитивных по ТГ (TH+), экспрессировала Girk2, маркер, используемый для определения ДА нейронов A9-типа. Кроме того, многие зрелые ДА нейроны демонстрировали автономную пейсмейкерную активность, представляющую собой функциональную характеристику A9-типа, но не A10-типа ДА нейронов. Тем не менее, некоторые TH+ клетки, полученные in vitro, не принадлежали типу A9. Соответственно, авторами изобретения предложены процедуры для обогащения, например, описанные в настоящем документе, для получения очищенных популяций аутентичных мДА нейронов человека A9-типа (а не A10типа). Согласно описанию в настоящем документе, авторы изобретения обнаружили по меньшей мере два маркера, уникальных для нейронов типа A9, и по меньшей мере два маркера, уникальных, по меньшей мере, для нейронов типа A10. Соответственно, в некоторых вариантах реализации нейроны типа A9 идентифицируют по маркерам (Girk2, Aldh1), отличным от маркеров A10 (кальбиндин, Otx2).
B. Определение набора маркеров, повышающий выход ДА нейронов среднего мозга подтипа A9. Для определения A9-специфических поверхностных маркеров были предложены по меньшей мере два стратегии: кандидатные маркеры получали с применением скрининга генной экспрессии, например, согласно описанию в настоящем документе, и кандидатные CD-антитела - с применением скрининга на поверхностные маркеры, согласно описанию в настоящем документе. Популяции в другом методе проводят глобальный анализ транскриптома в очищенных популяциях полученных из ЭСК мыши мДА нейронов на разных этапах дифференцировки (с применением трансгенной технологии BAC; см. фиг. 27a, b). Присутствие поверхностных маркеров обнаруживали в профиле поверхностных маркеров на ДА нейронах, полученных из RCB WA09, с помощью следующих типовых способов. Полученные из RCB WA09 ДА нейроны на 25 день дифференцировки разъединяли и повторно высевали в 96-луночные планшеты, а затем обрабатывали 242 CD-антителами и проводили анализ данных с применением сканера для многопараметрического анализа Operetta (Operetta High Content). Величину ДА-обогащения проверяли по меньшей мере для 5 дополнительных антител, связывавшихся с CD-маркерами, идентифицированными в ходе указанных скринингов (например, CD142, CD63 и CD99). Кандидатные CD-позитивные/CDнегативные клетки оценивали с применением анализа на соответствие показателям ДА (DA QC), включая экспрессию FOXA2/TH и TH/Nurr1 (см. табл. 7). В некоторых вариантах реализации предложено использование профилей глобальной генной экспрессии для сравнения не отсортированных по CD142 (CD142+) клеток. В некоторых вариантах реализации экспрессию требуемого маркера в отсортированных/разделенных клетках использовали для краткосрочных и долгосрочных in vivo исследований со
- 56 041083 гласно описанию в настоящем документе. Среди специфических для ДА нейронов маркеров, идентифицированных в ходе указанных исследований, присутствовал ген поверхностного маркера, названного DCSM1 (поверхностный маркер 1 ДА клеток). На основе данных относительно экспрессии in situ экспрессия соответствует вентральной части среднего мозга, однако, как было более неожиданно обнаружено, экспрессия по меньшей мере частично избирательна в отношении A9, и в развивающемся и взрослом головном мозге мышей (фиг. 27), и во взрослом головном мозге человека. В полученных из чЭСК ДА нейронах наблюдалось множество клеток, экспрессирующих DCSM1. In vitro анализы на принадлежность A9/A10 включали долгосрочную дифференцировку позитивных по маркеру клеток (50 день и 75 день дифференцировки) и анализ i) экспрессии маркеров A9, (Girk2, Aldh1) или же A10 (кальбиндин, Otx2) в зрелых нейронах, (ii) дифференциального аксонального наведения в ответ на Netrin-1 и Sema3, и (iii) анализ A9-обогащенных нейронов с помощью электрофизиологических тестов. ДА нейроны A9 демонстрировали специфические функциональные характеристики согласно описанию в настоящем документе в случае полученных из чЭСК A9-нейронов. Клетки, экспрессирующие DCSM1 и другие маркеры, исследовали in vivo для подтверждения i) экспрессии маркеров A9 (Girk2, Aldh1) или маркеров A10 (кальбиндин, Otx2), ii) разрастание волокон ДА-трансплантата и iii) электрофизиологических свойств A9 срезов трансплантированных клеток (см. фиг. 26).
XII I. Применение полисиаловой кислоты (ПСК) и фермента полисиалилтрансферазы (PST).
Интеграция трансплантата и степень разрастания ДА-волокон представляют собой проблемные вопросы методов трансплантации, включая исследования трансплантации фетальных тканей у пациентов с БП. Одной из проблем, возникающих в трансплантированных тканях и клетках, является ограниченное разрастание волокон из указанных трансплантатов при лечении пациентов. Указанная проблема является особенно критичной для человека, поскольку восстановление у пациента требует обширной реиннервации стриатума. В ранее существовавших методах для достижения адекватной реиннервации после трансплантации ткани требовалось неоднократное инъецирование порций клеток в разные области стриатума. Каждая из инъекций может привести к повреждению стриатума и воспалению, а также связана с другими хирургическими рисками. Такие риски включают повреждение кровеносного сосуда во время инъецирования клеток, что потенциально может спровоцировать инсульт или судороги у пациента. ПСК представляет собой природный гомополимер сиаловой кислоты (а именно, альфа-2,8-связанную сиаловую кислоту) на поверхности клеток, который, как было обнаружено, является пострансляционным модификатором (за счет действия фермента полисиалилтрансферазы (PST)) других молекул клеточной поверхности, таких как (полисиалилированная) молекула адгезии нервных клеток (NCAM), NCAM (CD56) и т.п. Обнаружено, что ПСК задействован в регуляции пластичности некоторых типов поведения клеток, требующих изменения межклеточных взаимодействий, включая миграцию клеток и разрастание аксонов. Интенсивно экспрессируясь в организме эмбриона, ПСК понижающе регулируется в тканях взрослого организма, за исключением локальных участков ЦНС, обеспечивающих поддержание структурной и физиологической пластичности (таких как гиппокамп, супрахиазмальное ядро, СВЗ). Соответственно, в некоторых вариантах реализации полисиаловая кислота (ПСК) предложена для применения для стимуляции разрастания волокон успешно трансплантированных клеток. Примеры применения ПСК в других типах клеток приведены в WO 2006/042105, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации авторы настоящего изобретения предполагают применение аутентичных ДА нейронов в комбинации с ПСК согласно описанию в настоящем документе.
A. Увеличение количества ПСК в ДА нейронах для применения у пациентов с БП. Остается множество проблем при разработке способов и получении клеток на основе полученных ранее в моделях на небольших животных результатов, включая ограниченную выживаемость трансплантируемых клеток и недостаточную иннервацию хозяйской ткани волокнами. Влияние указанных ограничений предположительно будет более серьезным в большем по размеру стриатуме человека, и, соответственно, улучшение выживаемости и иннервации необходимо для эффективного клинического применения полученных из ЭСК ДА нейронов. Улучшение разрастания волокон и интеграции трансплантата в моделях на животных, включающих применение по меньшей мере одной и до нескольких инъекции, предположительно будет снижать риски, связанные с неоднократными инъекциями или недостаточным распространением ДА нейронов in vivo.
Регуляция клеточных взаимодействий полисиаловой кислотой (ПСК) представляет собой один из факторов, способствующих распространению клеток, разрастанию аксонов и направленной иннервации при развитии позвоночных животных, см., например, Rutishauser, Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat Rev Neurosci 9, 26-35 (2008). ПСК представляла собой углеводный полимер, присоединенный к молекуле адгезии нервных клеток (NCAM), ослаблявший межклеточные взаимодействия, и таким образом способствовавший тканевой пластичности. В глиальном рубце повышенная экспрессия ПСК во взрослом ГМ способствовала миграции предшественников нейронов из субвентрикулярной зоны в кортекс и улучшению аксонального роста (El et al. Use of polysialic acid in repair of the central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 103, 16989-16994 (2006). Согласно описанию в настоящем документе, искусственное повышение экспрессии ПСК на очищенных полученных из ЭСК мыши ДА нейронов приводило к увеличению числа клеток трансплантата, обширному разраста
- 57 041083 нию волокон ДА нейронов в стриатум хозяина и, неожиданным образом, улучшению восстановления поведенческих функций у мышей с болезнью Паркинсона. Далее, применение генной инженерии для повышения уровней ПСК на поверхности полученных из ЭСК ДА нейронов одновременно повышало in vivo выживание и разрастание волокон в стриатум хозяина. Один типовой вариант реализации с применением гена PST млекопитающих, т.е. мыши или человека, представлен на фиг. 29. В других типовых вариантах реализации, проиллюстрированных фиг. 29, представлено применение бактериальной PST, т.е. PSTnm. В частности, согласно описанию в настоящем документе, увеличение количества ПСК на клетках при клеточной терапии на основе зрелых ДА нейронов предложено для применения при лечении БП.
B. Применение PST мыши для повышения экспрессирования ПСК. Результаты in vivo указывают на улучшенное распространение нейритов и значимый регресс индуцированного амфетамином вращения у мышей 6-OHDA, которым трансплантировали модифицированные PST клетки мыши, тогда как равные количества клеток, не модифицированных PST, не обеспечивали такого результата (фиг. 33). Кроме того, наблюдалась корреляция между улучшением иннервации волокнами ДА и улучшением поведенческих результатов в модели БП на мышах, например, при введении небольших (инъецирование приблизительно 50000 клеток) ПСК-позитивных клеточных трансплантатов последние обеспечивали интеграцию трансплантата и разрастание волокон, составляющие приблизительно 70% захваченных областей относительно сопоставимых трансплантатов большего размера (100000 или более клеток). Сравнение клеток полученных из ЭСК ДА нейронных трансплантатов после стимуляции ПСК и после контрольной обработки показало восстановление поведенческих функций в группе с ПСК (каждый из трансплантатов состоял из 55000 трансплантированных клеток), но не наблюдалось для контрольных клеток. При трансплантировании 100000 полученных из ЭСК ДА нейронов в головной мозг мышей наблюдалось восстановление поведенческих функций за счет полученных из ЭСК ДА нейронов, прошедших либо обработку ПСК, либо контрольную обработку, что, предположительно, означает, что объем трансплантатов, составляющий 100000 клеток, достаточен для реиннервации головного мозга мыши в отсутствие ПСКстимуляции. Соответственно, в другом варианте реализации искусственная экспрессия ПСК на поверхности аутентичных ДА нейронов предложена для применения в процедурах для лечения пациентов с БП. При индуцировании ПСК на нервных клетках в соответствии с настоящими изобретениями указанная ПСК была идентична полимеру ПСК, встречающемуся в природе в клетках головного мозга, соответственно, в отличие от применения других молекул клеточной поверхности для конструирования терапевтических типов клеток, клетки, сконструированные для экспрессирования ПСК, предположительно обладают малой антигенностью in vivo при использовании для трансплантационных процедур у человека. Кроме того, высокие уровни ПСК на успешно трансплантированных клетках, либо эндогенных нейрональных предшественников (Battista et al., J. Neurosci. 30(11):3995-4003 (2010)), шванновских клетках (Ghosh et al., Glia. 60(6):979-92(2012)), либо полученных из ЭСК ДА нейронов в соответствии с настоящими изобретениями, не вызывали детектируемых побочных эффектов при использовании в различных моделях на взрослых грызунах. При искусственном экспрессировании эффективных уровней ПСК задействован один фермент, полисиалилтрансфераза (PST), единственный продукт которого представлен указанным уникальным гликополимером. Неожиданным образом, количество экспрессируемого белка и природа продукта указанного фермента оставались в значительной степени постоянными и близкими к показателям ПСК, обнаруживаемой в естественных условиях в эмбриональных тканях.
Согласно описанию в настоящем документе предложено искусственное экспрессирование ПСК на нервных клетках для применения в процедурах трансплантации. В частности, предложено применение ПСК при подготовке клеток для терапевтического применения, для решения проблем, возникающих при использовании индуцируемой экспрессии других типов маркеров клеточной поверхности. Кроме того, применение экспрессирования ПСК обеспечивало воспроизводимость в межвидовых протоколах для позвоночных животных (например, при использовании генов PST мыши для экспрессирования в клетках человека), так как ее акцепторы также отличаются совместимой структурой у разных видов и обнаруживаются на поверхности большинства клеток. Встраивание генов PST в чЭСК для увеличения количества ПСК на ДА нейронах. Ген, кодирующий полисиалилтрансферазу человека (4PST), вводили в линию клеток чЭСК (WA01) с применением лентивирусного вектора (pLenty, Invitrogen) и согласно описанию в настоящем документе. Двадцать отобранных клонов размножали и анализировали экспрессию PST. PSTэкспрессирующие чЭСК клоны дифференцировали для подтверждения того, что ген PST в ДА нейронах не сайленсирован. Количественное определение ПСК-NCAM на разных этапах дифференцировки (дни 0, 11, 25, и 50) выполняли с применением FACS-анализа и иммунофлюоресценции (Operetta). Показатели позитивных клонов сравнивали с совокупностью качественных контрольных показателей ДА нейронов, приведенных в табл. 7. По меньшей мере 3 клона, у которых сохранялись высокие постоянные уровни ПСК-NCAM на протяжении дифференцировки, и которые демонстрировали хорошие контрольные качественные показатели (табл. 7), отбирают для оценки разрастания нейритов в сверхэкспрессирующих PST полученных из чЭСК ДА нейронах. Отсортированные контрольные и PST-сверхэкспрессирующие чЭСК клоны дифференцировали в ДА нейроны с применением стандартного протокола согласно описанию в настоящем документе, после чего фиксировали и анализировали клетки на 25 и 50 дни. Число и длину положительных по ТГ волокон в таких культурах количественно определяли с помощью микроскопа
- 58 041083
Operetta High Content. С помощью модуля для анализа нейритов программы Harmony 3.0 количественно определяли число и длину нейритов, с PST или без PST, и данные статистически анализировали с применением двустороннего анализа ANOVA. Сверхэкспрессирующие PST и контрольные клоны чЭСК, отобранные в ходе описанных выше in vitro исследований, снова дифференцировали в ДА нейроны и трансплантировали крысам в модели БП. Проводили краткосрочные трансплантационные исследования (4-6 недель) для определения выживаемости, экспрессии ПСК-NCAM и разрастания нейритов. Все клоны, прошедшие краткосрочные испытания in vivo с удовлетворительными показателями, использовали для долгосрочных трансплантационных исследований. В указанных исследованиях животным вводили половину или четверть стандартной (200x103) дозы клеток. Указанные исследования были направлены на выяснение того, приводит ли увеличение количества ПСК к повышению долгосрочной выживаемости после трансплантации (5 месяцев), и способны ли меньшие количества ДА нейронов обеспечить такие же или лучшие функциональные возможности по сравнению не содержащими PST трансплантатами, содержащими стандартные дозы клеток (фиг. 27).
Дополнительно проводили комплексные поведенческие тесты, чувствительные к степени реиннервации стриатума, для дополнительного мониторинга отличий функционального потенциала PSTтрансплантатов и контрольных ДА нейронных трансплантатов. После завершения поведенческих тестов животных умерщвляли и количественно определяли разрастание волокон с применением специфических антител человека NCAM и SC121 и антител против ТГ (см. также фиг. 29). Измеряли интенсивность и распределение в трансплантате hNCAM+, SC121+ и TH+, а также процент клеток человека, коэкспрессирующих маркеры ДА нейронов (TH, FOXA2) и ПСК. Количественно определяли плотность NCAM/TH+ ореола нейритов, распространяющихся из трансплантата, на разных расстояниях. Данные сравнивали между группами с применением двустороннего анализа ANOVA с поправкой Бонферрони. Дополнительно исследовали срезы для обнаружения качественных изменений (например, ветвления, толщины, распространения и формы трансплантата). Кроме того, получают срезы некоторых трансплантатов для электрофизиологических исследований (см. фиг. 26) в отношении принадлежности A9-фенотипу, формирования синапсов со стриатумом хозяина, а также иннервации эндогенными афферентами.
В приведенном ниже примере описана стимуляция экспрессии полисиаловой кислоты, улучшавшая функционирование трансплантатов из полученных из ЭСК дофаминовых нейронов у мышей с болезнью Паркинсона.
Клетки ЭСК, экспрессирующие ЗФБ под контролем промотора Nurr1 (Nurr1::GFP ЭСК) стабильно трансфицировали лентивирусным вектором, убиквитарно экспрессирующим полисиалилтрансферазу (PST). В трансфицированных клетках наблюдалось резкое увеличение содержания мРНК PST по сравнению с контролем (фиг. 30A). Экспрессия PST была, согласно наблюдениям, достаточной для синтеза ПСК на NCAM. Соответственно, экспрессия ПСК-NCAM значительно увеличивалась в PSTмодифицированных клетках на 14 день дифференцировки ДА нейронов (фиг. 30B-E). Как эндогенная, так и индуцированная ПСК на клеточной поверхности полученных из ЭСК ДА нейронов может быть удалена (фиг. 30E) с помощью фаговой эндонейраминидазы (endoN), расщеплявшей, в частности, уникальные альфа-2,8-связанные полимеры сиаловой кислоты в ПСК. Неожиданным образом, оказалось, что трансфекция PST, согласно наблюдениям, не влияла на экспрессию нейронных маркеров или маркеров среднего мозга в ЗФБ-очищенных ДА нейронах (фиг. 30F).
Другие исследования на гемипаркинсонических мышах с индуцированными 6OHDA повреждениями показали, что для обеспечения надежного функционального восстановления требуется трансплантация приблизительно 100000 полученных из ЭСК предшественников ДА нейронов, по оценке с применением теста со стимулированным амфетамином вращением. В ходе настоящих исследований авторы стремились трансплантировать субоптимальное число клеток, чтобы иметь возможность провести оценку улучшений за счет стимулированной экспрессии ПСК. Для трансплантирования высокообогащенных ДА нейронами популяций в истощенных по контаминирующим плюрипотентным клеткам очищенных с помощью FACS культурах на 14 день дифференцировки проводили тестирование на управляемую Nurr1 экспрессию ЗФБ и отсутствие экспрессии SSEA-1 (фиг. 31). В отсутствие свехэкспрессирования PST при снижении минимального эффективного размера трансплантата в два раза (55000 Nurr1+ДА клеток) детектируемое восстановление поведенческих функций не происходило. С другой стороны, при повышенном экспрессировании ПСК такое же количество Nurr1/PST ДА нейронов обеспечивало значимую коррекцию обусловленных БП расстройств поведения (р<0,01; двусторонний анализ ANOVA), с полным восстановлением приблизительно через 5 недель после хирургического вмешательства (фиг. 32A). Удаление ПСК до трансплантация путем инкубирования с endoN показало специфичность стимуляции ПСК, так как обработка endoN частично обращало восстановление функций за счет применения Nurr1/PST (фиг. 32A).
Для изучения характеристик трансплантированных клеток проводили иммуногистохимическое исследование животных через два месяца после трансплантации. Наблюдалось различие в количестве живых Nurr1+ нейронов; у тех животных, которым трансплантировали клетки PST-трансфицированной линии, в среднем присутствовало в два раза больше положительных по ЗФБ (GFR+) клеток, чем у животных, которым трансплантировали контрольные клетки (9300+/-1400 против 4230+/-1010 GFR+ клеток на
- 59 041083 трансплантат, для PST или контрольных образцов, соответственно; фиг. 32B, p<0,05, критерий Стьюдента). Кроме того, трансплантаты Nurr1/PST также демонстрировали более высокие уровни экспрессирования ПСК in vivo (фиг. 32С, D). При этом пропорции клеток, экспрессирующих маркеры ДА нейронов среднего мозга ТГ и FoxA2 в центре трансплантата, были сопоставимыми для Nurr1 и Nurr1/PST клеток (ТГ: 62,0%+/-8,0 против 51,3%+/-7,0; p=0,33; FoxA2: 63,2%+/-8,6 против 55,4%+/-2,0, p=0,3, соответственно; фиг. 32E).
Нейронные процессы, обусловленные клетками Nurr1 и Nurr1/PST, указывают на сопоставимые уровни ТГ, Girk2 (связанный с G-белком калиевый канал внутреннего выпрямления) и синапсина (фиг. 33A). В отличие от других исследований с трансплантацией шванновских клеток (Ghosh, et al. Glia 60, 979-992 (2012)), повышенная экспрессия ПСК оказывает незначительный эффект на миграцию ДА клеток из области трансплантирования. Тем не менее, наблюдались отчетливые изменения разрастания нейритов. Как видно на фиг. 33B, клетки Nurr1/PST обуславливали большее число ДА нейронных процессов по сравнению с контрольными клетками Nurr1+. При количественном определении интенсивности иммунофлюоресценции ЗФБ и ТГ в пяти последовательных зонах по 100 мкм на разном удалении от трансплантата, трансплантаты Nurr1/PST демонстрировали значительно более высокую относительную плотность процессов (фиг. 33C, D; p<0,01 как для ЗФБ, так и для ТГ, двусторонний анализ ANOVA). При количественном анализе указанного эффекта нормализовали относительную плотность процессов по плотности, наблюдаемой в ближайшей непосредственно к центру трансплантата зоне. Такая нормализация была необходима для компенсации большего числа жизнеспособных клеток в трансплантатах Nurr1/PST и подтверждения специфического эффекта ПСК на разрастание нейритов. Специфичность также была продемонстрирована при удалении ПСК с поверхности клеток до трансплантирования путем обработки endoN. Соответственно, предварительная обработка endoN снижала периферическое разрастание волокон до контрольных уровней (фиг. 33E).
Указанные открытия показали, что, по меньшей мере, некоторые из эффектов ПСК на функционирование трансплантата являются результатом увеличения иннервации стриатума волокнами. Соответственно, имела место высокая корреляция между функционированием трансплантата и относительным уровнем разрастания ЗФБ-позитивных волокон, например в зону IV (фиг. 33F; p<0,001, r2=0,65, n=17). Неожиданным образом, связь разрастания волокон с поведенческой функцией в экспериментальных группах (контрольной, ПСК-стимулированной и обработанной endoN) была стабильной, указывая на то, что иннервация трансплантат^хозяин представляет собой показатель восстановления поведенческой функции в модели БП на мышах. Ряд факторов механически способствовал увеличению разрастания волокон, например повышение проницаемости зоны реактивной глии, инкапсулирующей центр трансплантата, увеличение способности к спраутингу, улучшенное разрастание в окружающую ткань хозяина (например, более легкое перемещение конуса роста), и предотвращение преждевременного формирования связей с тканью хозяина в непосредственной близости от центра трансплантата. Типовые механизмы согласуются с ролью ПСК, способствующей процессу разрастания при нормальном развитии и в нервной системе взрослого организма.
Эксперименты, описанные в настоящем документе, демонстрируют применение искусственно стимулированной ПСК при трансплантировании ДА нейронов, обеспечивавшее превосходные результаты по сравнению с трансплантатами из других типов клеток. Данные ясно показывают, что стимуляция ПСК обеспечивает значимое увеличение способности трансплантированных ДА нейронов иннервировать стриатум хозяина и ослаблять функциональные расстройства при БП. Соответственно, предложен переход к клиническому применению, включающему ДА нейроны в соответствии с настоящими изобретениями, для получения клеток до трансплантации. В некоторых вариантах реализации клетки генетически модифицируют для экспрессирования ПСК. В некоторых вариантах реализации PST может доставляться непосредственно в клетки путем обработки очищенными ферментом и субстратом in vitro, до трансплантации. В некоторых вариантах реализации предложена включающая ПСК стратегия для перехода к применению у человека при БП-трансплантировании для минимизации необходимости в повторных инъекциях и, таким образом, снижения хирургических рисков, обусловленных указанными повторными инъекциями.
В других вариантах реализации указанная технология предложена для применения с другими типами и видами клеток, например, для увеличения миграции трансплантированных шванновских клеток при создании мостика (например, межклеточного сообщения) для возобновления роста аксонов на участке повреждения спинного мозга.
Ниже представлены типовые материалы и способы, используемые в этом примере.
Животные: Мышей 129S3/SvImJ в возрасте 6 недель (Jackson Laboratory) содержали в условиях контролируемой температуры и свободного доступа к пище и воде. Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с правилами Национального института здоровья (NIH) и институционального содержания и использования животных, и были одобрены локальным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) и Комитетом по институциональной биобезопасности (IBC).
Инъецирование 6OHDA и тест с индуцированным амфетамином вращением: Животных анестезировали пентобарбиталом натрия (10 мг/кг) и инъецировали в стриатум с правой стороны 2 мкл 6OHDA (4
- 60 041083 мкг/мкл в солевом растворе, 0,5% аскорбиновой кислоты). Инъецирование осуществляли с помощью шприца Hamilton в участок с координатами: 0,5 мм в постериальном и 1,8 мм в латеральном направлении от брегмы и на 2,5 мм вентральнее поверхности ГМ. Перед хирургическим вмешательством животные получали одну интраперитонеальную инъекцию дезипрамина (25 мг/кг, Sigma). Через две недели после хирургического вмешательства животных оценивали в тесте с индуцированным амфетамином вращением. Животных помещали на прозрачные пластиковые цилиндры диаметром 30 см на полчаса, после чего они получали одну интраперитонеальную инъекцию амфетамина (10 мг/кг, Sigma). Через 20 мин и на протяжении следующих 20 мин подсчитывают число ипсилатеральных/контралатеральных вращений. Животных тестировали один раз в неделю на протяжении семи недель, затем под глубокой анестезией перфузировали через сердце ФСБ и 4% параформальдегида в 0,1М фосфатном буфере (ФБ, pH 7,4). Головной мозг извлекали и дополнительно фиксировали в течение ночи при 4°C в 4% параформальдегиде, а затем получали с помощью вибратома (Pelco-101, Ted Pella) сагиттальные срезы толщиной 40 мкм. Дифференцировка и трансплантация клеток: Клетки Nurr1::GFP BAC-трансгенной репортерной линии ЭСК BAC-мышей (т.е. экспрессия ЗФБ регулируется промотором Nurr1) 5 трансфицировали лентивирусом (pLenti, Invitrogen), содержащим ген PST мыши под контролем промотора ЦМВ. ЭСК размножали на обработанных митомицином C клетках ЭФМ (StemCell Technologies) в среде DMEM (Invitrogen), 10% ФБС (HyClone) с добавлением 1400 единиц/мл ЛИФ (ESGRO; Invitrogen), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ βмеркаптоэтанола, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen). Дифференцировку ДА клеток индуцировали в соответствии с Barberi et al., NatBiotechnol 21, 1200-1207 (2003), с некоторыми модификациями. Вкратце, клетки дифференцировали на фидерных клетках MS5 на покрытых желатином чашках (10000 клеток на чашку диаметром 10 см) и культивировали в течение 4 дней на заменяющей сыворотку среде (SRM). На 4 день добавляли белки Sonic hedgehog (SHH, 200 нг/мл) и ФРФ-8 (100 нг/мл). На 7 день дифференцировки среду заменяли на N2 с добавлением SHH, ФРФ-8 и ОФРФ (10 нг/мл). На 11 день индуцировали конечную дифференцировку, удаляя SHH, ФРФ-8 и ОФРФ, и добавляя аскорбиновую кислоту (АК, 200 мкМ) и BDN (нейротрофический фактор головного мозга, 20 нг/мл).
Клетки собирали на 14-15 день с обработкой аккутазой в течение 45 мин, однократно промывали N2 и инкубировали с конъюгированным с AlexaFluor-647 антителом против SSEA-1 (BD Pharmingen) в течение 25 мин. Клетки однократно промывали N2, ресуспендировали в буфере HEPES с 0,1% БСА. Добавляли DAPI для оценки жизнеспособности. Проводили FACS-сортировку на клеточном сортере MoFlo и отбирали представляющую интерес популяцию по флуоресценции ЗФБ (Nurr1). По популяции, позитивной по AlexaFluor-647 (SSEA-1), проводили негативную сортировку. Для негативного контроля ЗФБ использовали непримированные ЭСК мышей J1 на такой же стадии дифференцировки.
Отсортированные по Nurr1::GFP клетки анализировали на жизнеспособность и ресуспендировали в N2 с BDN и АК с получением конечной концентрации 55000 клеток/мкл. 1 мкл инъецировали в поврежденный стриатум мышей с помощью 50 мкм заостренного тонкого стеклянного капилляра в участок с координатами: 0,3 мм в постериальном, 1,5 мм в латеральном направлении от брегмы, и на 2,2 мм вентральнее поверхности ГМ. Аликвоту суспензии клеток повторно высевали на покрытые матригелем 6 мм чашки для дальнейшего исследования.
Для иммунофлюоресцентного анализа клетки фиксировали параформальдегидом в течение 10 мин при 40°C, дважды промывали ФСБ, блокировали 5% БСА (0,1% Triton X-100 в ФСБ) и инкубировали с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре: антителом кролика против ЗФБ (1:1000, Invitrogen), антителом мыши IgM против ПСК (1:2000, 5A5), антителом мыши против NeuN (1:800, Chemicon), антителом мыши против TH (1:1000, Sigma), козьим против FoxA2 (1:800, Santa Cruz), козьим против Engrailed (1:800, Santa Cruz). Затем клетки инкубировали с Cy-конъюгированными вторичными антителами (1:1000, Jackson).
Обработка EndoN: Для удаления ПСК с NCAM, вечером накануне сбора клеток клетки обрабатывали 20 единицами endoN, фагового фермента, в частности, устраняющего ПСК 7-9. Затем клетки собирали и инъецировали, как описано выше, но ресуспендировали в N2 с BDN и АК и 5 единицами endoN. Ранее авторы установили, что инъекции того же количества endoN отдельно мышам с повреждениями не улучшает поведенческую функцию у животных. Анализ PST мРНК и ПСК-NCAM in vitro: Для проведения вестерн-блоттинга клетки обрабатывали буфером для вестерн-блоттинга (WB) (ФСБ с 1% NP40, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 1хингибиторов протеазы/фосфатазы, добавляемых непосредственно перед экстрагированием, при pH 7,4), обрабатывали ультразвуком дважды в течение 5 секунд, центрифугировали и ресуспендировали в буфере Лэммли (ЛБ). Аликвоты, не содержащие ЛБ, сохраняли для определения белка. Равные количества белка загружали на 6% полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия для гель-электрофореза (BioRad). Белки переносили с помощью электрофореза на поливинилиденовые мембраны (Millipore). Мембраны блокировали в течение 1-6 ч в 0,1% Triton X-100 TBS (TBS-T) с 5% обезжиренного сухого молока и инкубировали в течение ночи с антителом против NCAM (1:10000, Santa Cruz) в TBS-T с 5% молока. Блоты инкубировали с конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом (1:10000, Jackson) и проводили детекцию с применением метода усиленной хемилюминесценции (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech). Уровни белка количественно определяли с применением про
- 61 041083 граммного обеспечения ImageJ. Для анализа к ОТ-ПЦР экстрагировали тотальную РНК тризолом (Sigma), проводили обратную транскрипцию (Qiagen) и амплифицировали 10 мкл реакционной смеси 2x SYBR и прямым и обратным праймером в концентрации 0,2 мкМ до получения конечного объема 20 мкл. Для FACS-анализа ПСК-NCAM клетки собирали с обработкой аккутазой в течение 45 мин, однократно промывали и инкубировали с IgM мыши против ПСК (1:250, 5A5) в течение 25 мин на льду, однократно промывали средой N2 и инкубировали с Cy3-конъюгированным антителом против IgM мыши (1:250, Jackson) в течение еще 25 мин на льду. Клетки однократно промывали N2 и ресуспендировали в 0,1% БСА с 7AAD и проанализировали на клеточном сортере FACS Calibur. B. В контроле не добавляли первичное антитело.
Иммуногистологические и стереологические процедуры: Свободноплавающие коронарные срезы блокировали в 0,1% Triton X-100, 5% сыворотке осла в ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре и инкубировали на протяжении 48 ч при 4°C с различными антителами: кролика против ЗФБ (1:300), курицы против ЗФБ (1:200, Chemicon), мыши против TH (1:200), IgM мыши против ПСК (1:1000), мыши против NeuN (1:400), козьим против FoxA2 (1:300), кролика против Girk2 (1:300, Alomone Labs), мыши против синапсина (1:200, BD Transduction Laboratories). Затем срезы промывали и инкубировали с вторичными антителами: Cy2, Cy3 и Cy5-конъюгированными антителами осла (1:400, Jackson). Для ПСК использовали Cy5-конъюгированный анти-IgM осла (1:500 Jackson). Инкубирование проводили на протяжении 2 ч при комнатной температуре. Срезы дважды промывали в ФСБ и монтировали в Mowiol (Calbiochem). Каждый третий из коронарных срезов мозга анализировали для каждого иммунноокрашивания.
Цифровые изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 с тремя лазерами (аргоновый 488, HeNe 543 и HeNe 633) с объективом c-Apochromat 40х(водная иммерсия). Число GFR+ и TH+ клеток подсчитывали на каждом третьем из срезов, охватывающих включающих весь головной мозг, с использованием объектива 40x, и оценивали общее число клеток на трансплантат. Клетки с двойными метками анализировали в отдельных оптических плоскостях вдоль всей оси Z.
Для анализа процента клеток, меченых GFR/TH+ и GFR/FoxA2+, 100 GFR+ клеток анализировали для каждого маркера. Для анализа процесса разрастания получали конфокальные Z-сканы с интервалами 0,8 мкм по всей оси Z (20-40 мкм) с отверстием размером 1 мкм с использованием объектива 40x. Срезы сканировали от места инъекции в латеральном направлении до тех пор, пока не переставали наблюдаться какие-либо процессы. Трехмерные проекции, охватывающие всю просканированную площадь, последовательно совмещали. Для анализа интенсивности ЗФБ и ТГ всю просканированную площадь разделяли на пять последовательных 100 мкм зон на разном расстоянии от трансплантата и измеряли интенсивность с применением программного обеспечения ImageJ. Данные нормализовали по интенсивности в зоне, ближайшей к трансплантату (зона I) для контроля любых потенциальных различий размера трансплантата.
Статистический анализ: данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего (SEM). Сравнение проводили с применением теста Стьюдента или двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующей поправкой Бонферрони. Проводили линейный регрессионный анализ и количественную оценку с применением коэффициента корреляции Пирсона.
C. Сверхэкспрессия гена PST (полисиалилтрансферазы) человека. Группы имеющих повреждения животных получали одну из 3 доз: клетки дикого типа, либо клетки, экспрессирующие PST, либо клетки, предварительно обработанные ферментом PST. На них проводили поведенческие тесты согласно парадигмам, представленным в табл. 11 (индуцированное амфетамином вращение, тест с цилиндром, стептест). Выбранные дозы (например, 200 тыс., 100 тыс., 50 тыс. клеток) успешно применялись у мышей, таким образом, что полученные нейроны демонстрировали результаты согласно описанию в настоящем документе для генов PST мыши.
D. Непосредственное введение очищенного фермента PST в клетки. Другими словами, нетрансгенный способ индукции PST. Предварительная обработка клеток ферментом PST, которая приводит к полисиалилированию и повышенной экспрессии поверхностного PST. Несмотря на то, что PST млекопитающих представляют собой малораспространенные мембранные белки, функционирующие в аппарате Гольджи, очищенная а2,8-полисиалилтрансфераза Neisseria meningitides (PST-NM) функционировала во внеклеточной среде при использовании коммерчески доступного нетоксичного субстрата (а именно, ЦМФ-сиаловой кислоты) и синтезировала полимер, химически идентичный PST млекопитающих. В одном из примеров активный фрагмент указанного фермента эффективно добавлял PST в терапевтические белки in vitro, улучшая фармакокинетику in vivo. В присутствии ЦМФ-сиаловой кислоты PST синтезировался PST-NM непосредственно на поверхности клеток разнообразных типов in vitro, в том числе на ЭСК мыши и человека (фиг. 35A-E). Прямая инъекция PST-NM и субстрата in vivo запускает повышенное накопление PST на поверхности клеток в областях зрелого головного мозга, в том числе в коре головного мозга, стриатуме и спинном мозге (фиг. 35G, H). PST, синтезированный PST-NM, разлагался эндонейраминидазой (эндо-H) (фиг. 35B), удалявшей индуцированный PST, демонстрируя, что синтезируемый
- 62 041083
PST-NM PST обладал функциональными свойствами, сравнимыми с свойствами эндогенного PST (фиг. 35A, C, D). Экспрессирование PST с помощью PST-NM происходило менее чем через час, что превосходит скорость медленного трансгенного индуцирования PST. Экспрессирование продолжалось на протяжении нескольких недель in vivo, после чего уровень маркеров PST снижался, таким образом, удавалось избежать побочных эффектов продолжительной индукции трансгена PST. Соответственно, предложено применение in vitro обработки клеток PST-NM+ субстрат как простая альтернативная стратегия стимуляции повышенных уровней PST в полученных из ЭСКч ДА нейронах и других типах клеток для применения при процедурах трансплантации. Кроме того, указанный альтернативный подход при трансляции, т. е. переходу к применению для процедур трансплантации у человека, обладает преимуществами неинвазивности, т. е. исключает применение трансгенных методов; для указанных процедур используют отвечающие стандартам GMP реагенты для соответствия протоколам применения в клинической практике, и обеспечивает временную биохимически стимулированную экспрессию PST, соответствующую ожидаемым временным рамкам, для ДА-волокон, выходящих из области трансплантата и проникающих в мозг хозяина, что необходимо для недопущения некоторых опасных побочных эффектов применения клеток, сконструированных для трансплантации.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют ферментативно-инженерное получение PST на происходящих из ЭСКч ДА нейронах с применением очищенной бактериальной полисиалилтрансферазы, PSTNM, для повышения эффективности трансплантата.
Несмотря на эффективность, трансфекция геном PST требовала генетической модификации клеток ЭСКч с ограниченным контролем на протяжении полисиалилирования. В данном примере описано открытие того, что применение внешнего PST-NM в качестве альтернативы доставки генов индуцировало образование PST (см. фиг. 35). На фиг. 35A время адгезии обработанных PST шванновских клеток (ШК) (зеленая линия - средняя линия) повышено, тогда как синтезированный с помощью PST-NM PST подавлял адгезию. В частности, (A) синтезированный с помощью PST-NM PST подавляет адгезию шванновских клеток в суспензии к монослою шванновских клеток даже более эффективно (красная линии - нижняя линия), чем PST, полученный с применением принудительной экспрессии PST (зеленая линия - средняя линия). (B) Иммуноблоттинг на PST в полученных из ЭСК HB9 двигательных нейронов показывает, что контрольные образцы, обработанные только PST-NM, содержали недетектируемые уровни PST. Инкубирование с PST-NM и субстратом ЦМФ-сиаловой кислотой, дает обширную полосу PST, которая исчезает при обработке эндо-H. (C, D) Аналогично эффектам, получаемым при применении гена PST, полисиалилирование указанных клеток ферментом PST-NM и субстратом во время дифференцировки усиливает разрастание нейритов и миграцию клеток (стрелки). (E) Иммуноокрашивание на PST 30-дневных полученных из ЭСКч ДА нейронов. (F) Указанное окрашивание значительно усиливается после обработки PST-NM и субстратом. (G) In vivo инъецирование только PST-NM не оказывает эффекта, тогда как совместное введение с субстратом (H) обеспечивает значительные уровни экспрессии PST в стриатуме мышей.
Соответственно, для применения в получении клеток для трансплантации рассматриваются зрелые ДА нейроны, внешне обработанные PST-NM. Как PST млекопитающих, так и PST-NM давали химически идентичные цепи PST. Повышенные уровни PST на полученных из ЭСКч ДА нейронах (фиг. 35F) должны сохраняться в течение нескольких недель, достаточных для того, чтобы ДА-волокна вышли из области трансплантата. Так как PST-NM удаляют до трансплантации, необходимость брать в расчет иммуногенность указанного фермента, контаминирующего трансплантируемые клетки, отсутствует.
PST-NM получали из искусственного фрагмента, обладающего свойствами повышенной растворимости и активности (Willis et al., Characterization of the alpha-2,8-polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, and the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme. Glycobiology 18, 177-186 (2008)). В культурах ЭСКч индуцировали дифференцировку в ДА нейроны до обработки PST-NM, субстратом или и первым, и вторым. Культуры анализировали при обработке в различные моменты времени (от 10 мин до 6 ч) с применением количественной иммунофлюоресценции (Operetta) и вестерн-блоттинга для определения скорости и уровней полисиалилирования. Таким образом, 25-дневные дифференцировавшие полученные из ЭСКч ДА нейроны инкубируют с оптимальными концентрациями PST-NM и субстрата в условиях, описанных в настоящем документе. PST+ мДА нейроны трансплантируют в ходе краткосрочного и длительного анализа согласно приведенному здесь описанию и фиг. 29.
E. Применение при повреждении спинного мозга. В нескольких исследованиях, направленных на конечное применение у пациентов-людей, а также при использовании описанных в настоящем документе стратегий было показано, что указанные процедуры, в том числе доставка генов PST путем введения лентивирусных векторов, экспрессирующих PST непосредственно в ЦНС, для содействия регенерации аксонов и миграции эндогенных предшественников, обладают широким потенциалом. Одна из таких стратегий для применения у человека направлена на применение при повреждении спинного мозга. В одном из типов процедур для регенерации спинного мозга применяли трансплантаты шванновских клеток как часть терапии для восстановления клеточных мостиков при регенерации аксонов in vivo. Тем не менее, никакое терапевтическое вмешательство не обеспечивало восстановления двигательной функции
- 63 041083 у пациента, в том числе контроля тонких мышечных движений. В соответствии с настоящим описанием повышение экспрессирования PST на шванновских клетках, применяемых для трансплантации, приводило к усиленной миграции шванновских клеток и аксональному росту, что впоследствии приводило к сильно выраженному стимулирующему действию на двигательные функции (фиг. 30A-D). Соответственно, в некоторых вариантах реализации повышенное экспрессирование PST на шванновских клетках in vitro рассматривается для применения при процедурах трансплантации у человека с повреждением спинного мозга. Другая стратегия применения искусственной экспрессии PST за счет повышенной экспрессии генов PST в применяемых у человека процедурах включала полученные из ЭСК HB9 двигательные нейроны, при этом введение гена PST в указанные нейроны с помощью экспрессии генов на основе лентивирусного вектора приводило к резкому повышению разрастания аксонов как в культуре, так и после трансплантирования мышам для восстановления механически индуцированного повреждения седалищного нерва. Последнее приводило к улучшенному специфичному направленному действию на мышечную ткань (фиг. 30E-H). Соответственно, в другом варианте реализации искусственное экспрессирование PST на поверхности полученных из ЭСК двигательных нейронов применяется для восстановления функции седалищного нерва.
IVX. Повышенная безопасность трансплантируемых ДА нейронов.
Ниже описаны предполагаемые варианты реализации для дальнейшего снижения риска для здоровья пациентов для применения в способах получения клеток в соответствии с настоящими изобретениями.
Несмотря на то, что клетки, полученные с применением способов, описанных в настоящем документе, демонстрировали такие характеристики, как пониженный риск для пациентов при использовании для трансплантации, рассматриваются дополнительные варианты реализации для дальнейшего снижения возможного риска для здоровья пациентов, получающих клеточные трансплантаты. Одной из ряда проблем при процедурах клеточной терапии на основе ЭСКч является возможность введения примеси недифференцированных клеток, не поддавшихся дифференцировке, которые в посттрансплантационных условиях развиваются в клетки, причиняющие пациенту вред. В случае плюрипотентных клеток одним из возможных пагубных результатов является образование тератомы, что ставит под угрозу жизнь пациента. Описано образование тератомы в результате спонтанной дифференцировки клеток при применении полученных из ЭСКч клеток после использования краткосрочных протоколов нейронной дифференцировки. Тем не менее, применение авторами настоящего изобретения полученных из ЭС-клеток человека нервных клеток, в отличие от аналогов, полученных из ЭСК мыши, редко приводило к образованию тератом после применения соответствующих стратегий нейронной дифференцировки, описанных в настоящем изобретении (т.е. монослойная культура, протокол двойного ингибирования SMADсигнализации и культивирование с цитокинами, которые не способствуют пролиферации). Фактически, образования тератом не наблюдалось за последние 10 лет при анализе нескольких сотен животных с трансплантатами клеток человека на фоне применения ряда стратегий нейронной дифференцировки. Более того, тератомы не наблюдались при процедурах БП-трансплантации в соответствии с настоящими изобретениями с применением клеток человека для трансплантатов. Разница при применении клеток человека относительно применения клеток мыши для процедур трансплантации для применения у человека, предположительно, связана с разными стадиями плюрипотентности, на которых находятся ЭСК человека/мыши, поэтому свойства клеток человека, как считают, соответствуют стадии плюрипотентности, описанной как Epi-SC, в отличие от ЭСК мыши, которые могут находиться на другой стадии развития. При этом по меньшей мере одна из проблем при применении клеток в предшествующих трансплантационных исследованиях, состоящая в постоянном риске избыточного нейронального роста, существенно выраженного при протоколе Perrier et al., PNAS 2004 и аналогичных протоколах, неожиданным образом отсутствует при применении зрелых ДА нейронов и способов трансплантации в соответствии с настоящими изобретениями. Далее, другая проблема, обнаруженная при трансплантационных экспериментах в ходе предыдущих исследований, заключалась в образовании происходящих из ЭСКч нейроэпителиальных структур (т. е. нейрональных розеток), продолжающих пролиферировать in vivo. Указанная экспансия трансплантированных нейроэпителиальных клеток in vivo наблюдалась при различных парадигмах неирональнои трансплантации, в том числе в трансплантационных исследованиях с применением полученных из ЭСКч ДА нейронов в моделях на грызунах с болезнью Паркинсона и хореей Гентингтона. Указанные нейрональные розеткообразующие пролиферирующие клетки представляли собой нетрансформированные первичные клетки с высоким собственным потенциалом роста, что приводило к образованию у животных после трансплантации трансплантатов значительного размера, состоящих из эктопической, по большей части кортикально-подобной ткани. В соответствии с настоящим описанием был использован ряд стратегий для устранения примесей плюрипотентных или нейроэпителиальных клеток во время трансплантации (например, отбор по SSEA-4 (маркер плюрипотентности) или Forse-1 (нейроэпителиальный маркер). Указанные стратегии были отчасти успешными при применении стратегий дифференцировки на основе розеток, при этом избыточный нейрональный рост по-прежнему наблюдался в подгруппе трансплантатов, отобранных по Forse1, или при негативном отборе на SSEA-4. Неожиданным образом, после освоения указанной процедуры дифференцировки в ДА нейроны на основе вен- 64 041083 тральной пластинки, а не розеткообразующих клеток, проблема разрастания нейроэпителия была решена. Происходящие из трансплантата пролиферирующие клетки в функциональных полученных из ЭСКч вентральной пластинки ДА нейронных трансплантатах наблюдались редко.
Судя по нежелательным результатам других процедур трансплантации, другой связанной с безопасностью проблемой при применении для трансплантации ДА нейронов у человека являются побочные эффекты указанной терапии, такие как возникновение трансплантат-индуцированной дискинезии (GID), которая наблюдается приблизительно у 15% пациентов, получающих фетальную ткань при участии в трансплантационных исследованиях. При этом в соответствии с изложенным в настоящем документе почти полное отсутствие происходящих из трансплантата серотонинергических клеток, наряду с применением более подходящего источника клеток с возможностью последующего очищения от нежелательных клеточных типов (см. текст, относящийся к фиг. 28), и возможностью контроля распространения ДА-волокон in vivo (см. фиг. 29; а именно, предотвращение образования очагов нейрональных кластеров, секретирующих L-ДОФА и другие соединения), являются основными преимуществами применения способов в соответствии с настоящими изобретениями по сравнению с другими способами получения клеток для применения при процедурах трансплантации. Таким образом, применение указанных способов в соответствии с настоящими изобретениями предположительно будет сводить к минимуму риск для пациентов.
VX. Применение ЭСКч у человека для перехода к клиническим испытаниям на людях.
В предпочтительных вариантах реализации предложены ЭСК человека для применения в способах получения и использования клеток для процедур трансплантации у человека, иными словами, клеточной терапии для лечения БП. В частности, применение ЭСК человека обладает многочисленными преимуществами по сравнению с применением иСК человека в способах согласно настоящим изобретениям, например, в качестве примера, при получении подходящих для трансплантации ДА нейронов среднего мозга для применения в качестве клеточной терапии БП. В частности, применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иСК) в качестве источника клеток для образования ДА нейронов имеет ряд преимуществ, таких как обеспечение генетически совместимого источника клеток для каждого пациента. Тем не менее, в результате нескольких недавних исследований возникли сомнения относительно безопасности и полной генетической совместимости иСК. Перепрограммированные клетки, как было показано, являются носителями потенциально опасных генетических и эпигенетических нарушений, нежелательных при клиническом применении. Далее, в работах на иСК мыши было показано, что полученные из иСК клетки не полностью иммуносовместимы, что является главным возражением против их применения для трансплантации у человека. Далее, не существует одобренных FDA процедур с применением иСК для трансплантации. Наконец, потенциальное создание удовлетворяющих стандартам GMP с полным контролем качества (QC) банков клеток для каждого отдельного пациента было бы непрактичным и слишком затратным. Наряду с этим, генетическая стабильность иСКч по сравнению с ЭСКч интенсивно изучалась. Несмотря на то, что в культивируемых ЭСКч, согласно наблюдениям, со временем возникают мутации, время и скорость возникновения таких мутаций, как оказалось, отличаются от свойственных иСКч, при этом ЭСКч в целом признаны более генетически стабильными, чем иСК, см. примеры у Hussein, et al., Nature 471, 58-62 (2011); Mayshar, et al. Cell Stem Cell 7, 521-531 (2010); Lister, et al. Nature 471, 68-73 (2011); Laurent, et al. Cell Stem Cell 8, 106-118 (2011). Кроме того, для нескольких линий ЭСКч были разработаны стандартные операционные процедуры, удовлетворяющие требованиям безопасности при тщательной проверке, обязательной согласно FDA для продуктов, применяемых для клеточной и генной терапии. Две группы в США получили разрешение FDA на переход к клиническому применению клеточной терапии на основе ЭСКч. Так, компания Geron Corporation начала исследование фазы I полученных из ЭСКч клеток-предшественников олигодендроцитов (GRNOPC1), a Advanced Cell Technology (ACT), Inc. в настоящее время проводит два исследования фазы I/II с применением полученных из ЭСКч пигментных эпителиальных клеток сетчатки для лечения макулярной дистрофии Штаргардта (исследование NCT01345006) и прогрессирующей сухой возрастной макулярной дегенерации (исследование NCT01344993). Наконец, тот факт, что оба одобренных FDA клинических исследования с применением ЭСКч направлены на терапию расстройств нервной системы, демонстрирует преимущества применения способов на основе ЭСКч для получения материала для трансплантации для лечения заболеваний и повреждений нервной системы. Нервная система считается иммуно-привилегированной областью, так как в HC чужеродная ткань (аллотрансплантаты) вызывает слабый иммунный ответ по сравнению с таким же трансплантатом, размещенным на периферии. Так, спустя 25 лет после трансплантации фетальных клеток в мозг человека, было обнаружено, что некоторые аллогенные нейроны сохраняли жизнеспособность в мозге человека до 16 лет при транзиторной иммуносупрессии. Таким образом, как оказалось, полная антигенная совместимость источника клеток и реципиента трансплантата не является обязательной. Соответственно, в качестве универсального аллогенного источника ДА нейронов для лечения БП, помимо других заболеваний, расстройств и повреждений нервной системы предложены ЭСКч. Предполагается, что пациентам, получающим клетки в соответствии с настоящими изобретениями предложены, поставлен клинический диагноз БП. Предложены аутентичные ДА нейронные трансплантаты для применения при ранних вмешательствах и при БП от умеренной до тяжелой формы, включая пациентов, у которых
- 65 041083 наблюдается недостаточный контроль симптомов при применении доступных медикаментозных средств, таких как леводопа, вспомогательные лекарственные средства и т.д. В некоторых вариантах реализации предложено введение нейронных трансплантатов пациентам, у которых наблюдаются слабовыраженные симптомы ранней БП (например, при применении нейровизуализации для обнаружения дофаминергической недостаточности, ФДГ-ПЭТ, симптомы дискинезии и т.д. Оценку дискинезии при мониторинге пациентов до и после трансплантации предложено проводить согласно унифицированной шкале двигательных расстройств UDysRS (Unified Dyskinesia Rating scale) (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008)). Также для пациентов могут быть характерны томограммы без признаков дофаминергической недостаточности (SWEDDS), у некоторых из указанных пациентов может наблюдаться дистония или эссенциальный тремор. Необходимо проведение МРТ головного мозга для идентифицирования пациентов, у которых имеются другие (не-ДОФА) предрасполагающие факторы развития паркинсонизма. В некоторых вариантах реализации у пациентов наблюдается положительный отклик на леводопу. Определение претрансплантационных и посттрансплантационных параметров и конечных точек для мониторинга субъектов, таких как оценка моторной функции, немоторных функций, качества жизни, а также применение нейровизуализации и других биомаркеров. Моторная функция: Для оценки моторных симптомов БП широко применяют UPDRS и недавно валидированную MDS-UPDRS (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2129-2170 (2008)). Наряду с этим предложены и другие тесты, в том числе тесты с 10-минутной или 6-минутной ходьбой, TUG-тест (оценка времени до начала ходьбы, Timed Up and Go Test), оценка функциональной походки, функциональной досягаемости и др. для более пациент-ориентированного подхода к оценке результатов. Пациентов тестируют в период выключения, а также включения; должны быть включены оценочные шкалы для периодов выключения (например, согласно рекомендациям Общества двигательных расстройств (Movement Disorder Society), основанным на клиниметрических свойствах валидированных шкал для оценки истощения (Antonini, et al. Mov Disord. 26, 2169-2175 (2011)) и шкалы для оценки дискинезии (например, UdysRS (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008)). Предполагается осуществление видеозаписи стандартизированных обследований пациентов как в состоянии включения, так и в состоянии выключения. Другие функции помимо моторной: Оценивают, в первую очередь, когнитивные, психиатрические исходы и дисавтономию, помимо когнитивных способностей, депрессии, тревожности, апатии, сна, усталости, психозов и других немоторных симптомов до и после трансплантации. Качество жизни: Для мониторинга результатов у пациентов предложены БП-специфические опросники (PD-QUALIF) и/или хорошо валидированные шкалы оценки качества жизни, такие как SF-36.
Нейровизуализация и другие биомаркеры: функциональная визуализация широко использовалась в задействующих хирургические методы исследованиях БП. Хотя анализ состояния трансплантата предусматривает применения визуализации на основе дофамина (например, ФДОПА-ПЭТ), предложены для применения техники нейровизуализации с применением других лигандов, включая визуализацию на основе маркеров, например, нацеленных на воспаление, а также невизуализируемых системных маркеров, например сбор экспериментальных данных. Визуализация может быть использована для предоперационного планирования, например для определения степени и локализации ДА-истощения в базальных ганглиях, и включение данных ПЭТ при индивидуальном хирургическом планировании для каждого пациента. Локализация трансплантата и число вводимых клеток. В некоторых вариантах реализации сайтами трансплантации (введения) клеток является скорлупа (Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Lindvall, et al. Prog. Brain Res. 82, 729-734 (1990) и посткомиссуральная часть скорлупы (Olanow, et al. Ann. Neurol. 54, 403-414 (2003)). В некоторых вариантах реализации предложено несколько точек размещения с применением различных вариантов хирургического доступа. Для мониторинга трансплантированных клеток предложено использовать МРТ с системой ClearPoint, обеспечивающей построение и визуализацию траектории в реальном масштабе времени и точность нацеливания. Указанную систему размещают в месте входа электродов для глубокой стимуляции головного мозга у пациентов с БП. Число клеток и состав трансплантата. Фетальные исследования проводили с применением по существу неизвестного числа ДА нейронов, так как использовался фетальный трансплантируемый материал, содержащий множество клеточных типов. На основании данных, представленных в настоящем документе, для восстановления функции ДА нейронов предложено расчетное количество, равное 100000-200000 жизнеспособных TH+ нейронов.
Иммуносупрессия. В некоторых вариантах реализации предусмотрена иммуносупрессия пациентов с трансплантатами, по меньшей мере на протяжении 6 месяцев и до продолжения в течение всей жизни пациента. В некоторых вариантах реализации у пациентов не проводят иммуносупрессию для трансплантации тканей.
- 66 041083
Таблица 1. Результаты анализа экспрессии генов для генов, экспрессия которых значительно повышена или понижен на 11 день дифференцировки в популяции на основе вентральной пластинки, обработанной SHH/FGF8/Chir, по сравнению с популяцией, обработанной LSB
№ колонк и Ш Колонки Кратное изменени е р- значени е
7304 FOXA1 22.5512 5.03Е-16
7305 FOXA2 17.3328 5.70Е-17
31270 SPON1 16.4393 2.14Е-14
31684 SYT4 13.2693 9.61Е-12
4334 COL22A1 8.54042 2.05Е-17
6616 FBLN1 8.24162 4.97Е-18
32035 TFF3 8.01805 1.08Е-13
5324 DKK1 7.95664 1.19Е-09
3244 CAPN6 7.58928 1.77Е-08
2544 C20ORF56 7.58575 6.71Е-15
27591 PKDCC 7.42271 2.02Е-11
23584 LOC91461 5.43556 9.86Е-09
5037 DDC 5.19301 2.09Е-08
13598 LDB2 4.76303 2.92Е-09
723 АМОТ 4.58838 5.68Е-08
4978 DBX1 4.40946 2.36Е-09
31138 SOX8 4.32227 9.29Е-08
30193 SILV 4.3198 2.52Е-07
30148 SHISA2 4.31109 1.60Е-07
31509 STK39 3.65624 2.90Е-06
27661 PLCL2 3.63607 6.81Е-11
24425 MGST1 3.59223 2.48Е-11
32945 TSPAN7 3.57361 7.36Е-07
29082 RHOU 3.51768 5.89Е-06
9283 HS.19193 3.49663 6.24Е-13
5478 DOCK10 3.43476 8.18Е-07
25094 ММР11 3.40705 2.13Е-08
29975 SERPINF1 3.36169 1.97Е-10
29042 RGS4 3.33544 7.01Е-06
926 APCDD1 3.33059 3.47Е-10
№ колонк и Ш колонки кратное изменени е р- значени е
12640 IRX3 3.32454 1.65Е-05
26837 OSBPL10 3.3051 9.55Е-07
32086 THBS4 3.29135 9.77Е-07
14581 LOC100130506 3.1293 5.81Е-09
4931 DAB2 3.02851 4.80Е-09
12642 IRX5 2.95938 2.73Е-08
13774 LMX1A 2.81057 1.42Е-06
31516 STOM 2.76317 2.01Е-07
26374 ODZ4 2.75644 3.06Е-06
8210 GSC 2.75053 3.47Е-07
26170 NRCAM 2.71264 1.82Е-08
28414 РТСН1 2.63379 2.99Е-08
31578 SULF2 2.59351 1.42Е-07
7366 FREM1 2.5697 2.25Е-07
13743 LITAF 2.55681 3.65Е-08
26236 NTNG1 2.55383 1.78Е-07
25869 NEUROG2 2.55012 5.05Е-06
26132 NPY 2.54575 4.48Е-06
25967 NKX2-1 2.52195 0.00023
27101 PCDH18 2.46481 1.69Е-05
32557 TNFRSF19 2.45297 4.06Е-08
5759 EFEMP1 2.44308 7.78Е-09
31148 SP5 2.43459 5.34Е-06
28069 PQLC3 2.42685 2.59Е-05
30313 SLC20A2 2.40457 1.24Е-06
- 67 041083
30743 SNHG4 2.35277 8.69E-08
27607 PKP2 2.34734 5.34E-05
25520 MYL4 2.3327 3.93E-08
26128 NPTX2 2.29568 1.08E-05
26006 NMD3 2.29039 3.18E-05
16924 LOC391019 2.28656 1.25E-05
19975 LOC646966 2.26444 6.23E-05
29894 SEMA6A 2.25036 0.000844
6161 EYA2 2.23175 0.00024
26105 NPFFR2 2.23095 7.31E-05
4818 CXXC4 2.23047 1.66E-05
2764 C4ORF14 2.22128 5.73E-06
18269 LOC642989 2.22053 0.000735
13059 KIAA1324L 2.21906 4.75E-05
23663 LRIG3 2.21159 4.38E-07
6196 FABP5L2 2.19875 3.09E-05
29347 RPL13A 2.19362 0.000122
12446 IL1RAPL1 2.19134 1.75E-05
28455 PTN 2.18577 9.36E-05
30746 SNHG7 2.18224 4.35E-07
28788 RASL12 2.16856 1.39E-05
17150 LOC401074 2.16782 1.07E-06
30283 SLC16A3 2.16541 6.06E-05
15378 LOC100133008 2.16461 3.15E-05
32180 TLE6 2.16433 6.35E-07
12887 KCNQ1OT1 2.1641 2.97E-06
31210 SPATS2L 2.16393 0.000597
4241 CMTM8 2.16297 0.000392
30933 SNORD25 2.15953 0.000363
2803 C5ORF13 2.15734 3.94E-05
32131 TIGA1 2.15335 1.80E-05
1667 BMP7 2.14281 0.000497
20837 LOC649946 2.14098 8.39E-05
25756 NCRNA00219 2.12543 6.42E-07
8003 GPM6B 2.08967 3.45E-05
5650 DYM 2.08942 0.000179
29606 S1PR3 2.08344 0.000479
27681 PLEKHA5 2.08285 0.000217
11495 HS.570308 2.08044 1.67E-06
26232 NTN1 2.06755 2.49E-08
12635 IRS1 2.06435 0.000109
20404 LOC648343 2.05497 0.000791
29352 RPL15 2.05205 2.82E-06
33800 WNT5A 2.03874 1.08E-06
30481 SLC38A4 2.03653 1.13E-06
12059 HS.7093 2.01993 2.66E-06
22500 LOC728126 2.0183 1.16E-06
16095 LOC136143 2.01775 5.71E-05
12718 ITPR3 2.01384 1.67E-05
4004 CHN2 2.00649 7.18E-06
32162 TIP ARP 2.00538 0.000633
482 ADSS 2.00282 0.000136
2196 C17ORF45 2.00241 6.15E-05
3447 CCDC51 -2.00054 0.000177
5945 ENCI -2.0038 0.000468
27915 POU3F2 -2.00877 2.04E-07
23143 LOC729779 -2.01527 0.000972
23972 MAP1LC3A -2.01892 3.37E-06
7611 GAS6 -2.02463 9.63E-08
17062 LOC399959 -2.02793 2.39E-05
29519 RSPO3 -2.03762 1.61E-05
29038 RGS20 -2.04076 3.60E-09
19157 LOC644936 -2.04097 0.000128
30502 SLC3A2 -2.04467 5.58E-05
33508 VCAM1 -2.05421 2.51E-06
490 AFAP1L2 -2.05673 8.23E-07
23275 LOC730167 -2.06009 0.000652
29215 RNF175 -2.06406 6.81E-05
5923 EMILIN2 -2.06713 2.81E-06
34367 ZNF462 -2.07292 1.63E-05
26244 NUAK1 -2.0732 0.000172
25818 NEBL -2.07351 1.55E-06
- 68 041083
29624 SALL3 -2.0787 2.15E-06
33491 VANGL2 -2.08497 0.000402
30581 SLC7A8 -2.08722 1.40E-08
875 ANXA3 -2.08727 0.000227
34075 ZFP36L1 -2.08803 5.08E-05
15637 LOC100133760 -2.09319 8.14E-05
1227 ASNS -2.10169 8.03E-05
33804 WNT7B -2.1052 3.00E-08
24064 MARS -2.107 0.000146
33725 WDR72 -2.11201 0.000617
31295 SPRY1 -2.12339 2.43E-05
7495 GABARAPL1 -2.12367 1.70E-05
4331 COL1A2 -2.12521 1.97E-05
6821 FILIP 1 -2.1288 0.00026
24246 METRN -2.13118 1.99E-05
12056 HS.66187 -2.13789 2.97E-05
28438 PTGIS -2.14246 7.36E-06
12980 KIAA0367 -2.15304 1.92E-05
1575 BCMO1 -2.16946 7.40E-05
25473 MXRA5 -2.17542 3.63E-06
32537 TNFAIP1 -2.17984 7.66E-06
34064 ZFHX4 -2.23036 0.00046
28787 RASL11B -2.23056 0.000115
5632 DUSP6 -2.23366 0.000732
3149 CACHD1 -2.23514 5.39E-05
3221 CAMKV -2.25983 5.01E-08
7248 FLNC -2.26856 1.13E-05
28307 PRSS8 -2.28456 1.35E-05
12662 ISYNA1 -2.29255 1.40E-05
7524 GADD45A -2.2962 7.46E-07
5921 ЕМШ2 -2.29995 1.55E-05
941 APLP1 -2.31453 2.03E-07
30576 SLC7A5 -2.32091 0.000757
7474 FZD3 -2.32644 6.13E-06
5940 EMX2OS -2.3303 2.65E-07
1259 ATF3 -2.34034 2.59E-06
33806 WNT8B -2.34155 3.96E-08
31388 SST -2.34663 1.83E-06
3188 CALCB -2.34833 3.49E-06
1075 ARHGEF6 -2.35421 1.54E-08
26885 OTX1 -2.35607 0.00023
26393 OLFM3 -2.35759 2.32E-07
33087 TUBB2A -2.36013 0.000777
31747 TAGLN -2.36809 2.16E-05
5372 DMRTA1 -2.36884 5.28E-08
3614 CD200R1 -2.37345 L25E-14
17147 LOC401056 -2.37854 8.57E-10
33801 WNT5B -2.3794 3.01E-08
28590 RAB11FIP1 -2.40833 6.65E-07
23362 LOC730525 -2.41129 1.59E-06
27658 PLCHI -2.4212 3.31E-07
7000 FLJ32310 -2.42179 5.77E-06
3339 CBX4 -2.43314 1.13E-07
6073 ERRFI1 -2.44539 1.44E-05
32521 TMSB15A -2.45505 1.31E-05
13242 KLHL14 -2.51767 2.71E-11
30201 SIPA1L2 -2.52018 3.67E-06
32760 TRIBI -2.52274 1.73E-06
13641 LFNG -2.53204 5.33E-07
12285 IER3 -2.54594 1.65E-07
28506 PTPRZ1 -2.55447 1.62E-06
1608 BEX2 -2.56331 0.000109
32179 TLE4 -2.56513 0.000135
10888 HS.551307 -2.56708 0.000405
683 ALPK2 -2.57443 2.83E-06
32551 TNFRSF12A -2.59274 4.02E-06
32610 TNRC9 -2.59782 3.23E-07
777 ANKRD1 -2.61554 3.15E-05
13622 LEMD1 -2.62351 2.97E-05
26777 OR7E156P -2.64884 3.51E-07
24377 MGC39900 -2.66479 1.46E-05
12267 Ш1 -2.66562 6.68E-07
- 69 041083
27726 PLP1 -2.69279 9.13E-07
4350 COL4A6 -2.69704 1.17E-07
4320 COL11A1 -2.71039 1.79E-09
3127 CA2 -2.71276 2.35E-08
26151 NR2E1 -2.72059 4.25E-14
31267 SPOCK 1 -2.7283 3.38E-05
13744 LIX1 -2.73818 9.34E-06
32038 TFPI -2.77685 6.23E-05
32776 TRIM24 -2.79151 8.73E-08
32756 TRH -2.79963 3.98E-07
32652 TOX3 -2.81075 9.35E-06
2405 C1ORF21 -2.81457 9.49E-09
5371 DMRT3 -2.82614 4.28E-09
32381 TMEM2 -2.83489 1.83E-05
2437 C1ORF61 -2.85324 3.53E-09
2868 C6ORF141 -2.8569 6.05E-06
1178 ARX -2.87861 0.000122
26245 NUAK2 -2.95666 4.14E-08
33796 WNT2B -2.96258 1.15E-10
28507 PTRF -2.97439 2.07E-07
7662 GCNT1 -2.98108 1.49E-06
5930 EMP1 -2.9918 1.11E-06
31844 TBC1D9 -3.00324 2.53E-09
4352 COL5A2 -3.02084 1.26E-07
4699 CTNNA2 -3.04046 6.91E-09
2516 C20ORF177 -3.04277 4.86E-08
3518 CCL2 -3.04332 9.50E-11
34315 ZNF385B -3.05084 5.56E-07
12058 HS.7023 -3.0642 3.72E-08
23661 LRIG1 -3.07681 3.30E-07
7813 GLI3 -3.07936 1.22E-08
31513 STMN2 -3.09098 4.93E-06
30023 SFRP1 -3.09686 1.13E-06
1128 ARMCX2 -3.09746 2.91E-06
4689 CTGF -3.11416 4.47E-08
6365 FAM181A -3.1422 2.56E-09
31151 SP8 -8.88965 4.42E-20
30024 SFRP2 -9.73482 4.24E-14
13677 LHX2 -10.9076 6.16E-11
5939 EMX2 -11.5085 1.34E-19
21068 LOC650757 -12.1496 7.71E-20
27068 PAX6 -15.7636 2.24E-22
5554 DRD4 -17.3929 3.17E-16
4121 CLDN1 -3.15492 1.93E-06
627 ALDH1A1 -3.15745 1.18E-12
629 ALDH1A3 -3.17887 4.46E-13
33501 VAT IL -3.18253 1.21E-06
4912 CYR61 -3.18856 3.58E-07
12781 KANK4 -3.20054 7.99E-12
3067 C9ORF171 -3.24146 3.73E-11
12363 IGFBP3 -3.34999 1.02E-06
4533 CRIP1 -3.45501 6.62E-08
3740 CDH11 -3.48609 2.23E-08
816 ANKRD38 -3.48622 6.93E-12
12730 JAG1 -3.58463 3.83E-08
12271 Ш4 -3.72402 1.78E-12
810 ANKRD34B -3.76606 1.15E-11
12850 KCNJ13 -3.81092 2.16E-09
6112 ETV5 -3.81591 4.37E-10
9265 HS.181245 -3.86611 1.24E-09
633 ALDH2 -3.87108 1.97E-09
26180 NRIP3 -3.92066 6.08E-08
30413 SLC2A1 -4.11899 1.18E-05
5479 DOCK 11 -4.35251 5.67E-09
25658 NAVI -4.35259 1.02E-10
5349 DLL1 -4.47474 1.58E-07
34418 ZNF533 -4.49025 1.16E-09
327 ACTC1 -4.63509 7.37E-09
1037 ARHGAP15 -4.67561 9.89E-10
31132 SOX3 -4.72958 7.45E-09
26153 NR2F1 -4.73849 1.53E-09
3129 CA4 -4.7904 3.00E-09
33071 TTYH1 -4.79045 8.94E-14
5766 EFHD1 -4.86615 1.16E-09
867 ANXA1 -4.95401 1.41E-08
8500 HES4 -5.24189 1.63E-11
4299 CNTNAP2 -6.14001 2.94E-08
23947 MAMDC2 -6.36522 2.23E-10
7605 GAS1 -6.38074 2.63E-11
26065 NOS2A -20.0139 2.83E-16
1501 BARHL1 -20.6077 2.59E-14
26064 NOS2 -25.1751 7.45E-17
8501 HES5 -38.4549 8.90E-22
- 70 041083
№ колонк и ID набора данныз кратное изменение р-значение
31575 SYT4 14.8775 3.24Е-12
7195 FOXA1 11.8929 2.65Е-13
4225 COL22A1 8.26361 3.21Е-17
5215 DKK1 6.39507 1.32Е-08
7956 GPR177 5.98201 5.65Е-12
13508 LEF1 5.07514 2.45Е-11
2435 C20ORF56 5.02955 2.71Е-12
4928 DDC 5.0147 3.23Е-08
11952 HS.71947 4.81098 5.13Е-09
13665 LMX1A 4.7485 3.59Е-10
12427 INHBE 4.72434 3.41Е-07
32562 TPBG 4.63162 1.44Е-09
1152 ATF5 4.48583 0.000153048
5369 DOCK10 4.23427 4.29Е-08
31414 STOX1 4.20695 3.94Е-10
4869 DBX1 4.17519 5.31Е-09
31977 THBS4 4.13195 3.66Е-08
2694 C5ORF13 4.0095 7.84Е-10
31469 SULF2 3.83814 8.51Е-11
31468 SULF1 3.81974 3.96Е-07
34285 ZNF503 3.81092 2.76Е-08
Таблица 2. Результаты анализа экспрессии генов для генов, экспрессия которых значительно повышена или понижен на 11 день дифференцировки в популяции на основе вентральной пластинки, обработанной SHH/FGF8/Chir, по сравнению с популяцией, обработанной только SHH/FGF8
12531 IRX3 3.73598 3.93Е-06
4935 DDIT4 3.73152 3.78Е-05
31369 STC2 3.70632 8.48Е-08
№ колонк и ID набора данных кратное изменение р-значение
27482 PKDCC 3.69823 2.20Е-07
4257 COLEC12 3.6503 5.20Е-06
31926 TFF3 3.62059 1.12Е-08
25244 MSX1 3.60243 0.000146141
23475 LOC91461 3.58231 2.08Е-06
26777 ОТХ2 3.47814 3.97Е-09
13489 LDB2 3.44124 3.22Е-07
13657 LMO3 3.29197 2.61Е-12
817 APCDD1 3.21277 6.95Е-10
4822 DAB2 3.18324 1.84Е-09
25760 NEUROG2 3.16851 1.30Е-07
31101 SPATS2L 3.15744 2.80Е-06
1311 AXIN2 3.13274 1.80Е-06
32448 TNFRSF19 3.11104 2.48Е-10
4934 DDIT3 3.08248 4.83Е-05
26776 ОТХ1 3.05293 6.14Е-06
28360 PTPN13 3.03567 5.18Е-06
994 ARL4A 2.98803 1.45Е-07
26728 OSBPL10 2.94508 5.19Е-06
32836 TSPAN7 2.86094 1.65Е-05
- 71 041083
5665 EFNB2 2.78085 0.000222563
8101 GSC 2.75066 3.46E-07
6426 FAM84B 2.74213 7.89E-07
29866 SERPINF1 2.73192 1.26E-08
924 ARHGAP10 2.72522 3.36E-07
31039 SP5 2.68162 9.57E-07
28210 PSAT1 2.64735 9.82E-06
28933 RGS4 2.6312 0.000148375
13547 LGI1 2.61567 1.30E-06
7369 FZD7 2.61404 2.46E-06
25351 MUSTN1 2.55841 4.85E-07
25411 MYL4 2.55345 4.77E-09
28424 PVRL3 2.55083 1.04E-07
299 ADAMTS9 2.53131 2.88E-08
1555 BMP4 2.52708 9.40E-05
31161 SP0N1 2.5133 0.000145864
26265 ODZ4 2.50312 1.46E-05
33730 XBP1 2.50164 1.72E-06
28766 RBP1 2.49237 6.12E-05
12533 IRX5 2.48929 7.43E-07
1118 ASNS 2.47416 4.50E-06
2770 C6ORF160 2.40219 3.58E-05
12337 IL1RAPL1 2.40145 3.15E-06
12526 IRS1 2.3994 7.70E-06
7221 F0XJ1 2.39492 8.89E-05
28647 RARB 2.37013 9.11E-09
14472 LOC100130506 2.36331 1.36E-06
3979 CITED2 2.36201 2.92E-05
31430 STT3B 2.34069 1.29E-05
26023 NPY 2.3346 1.98E-05
6052 EYA2 2.3192 0.000136915
26991 PCDH17 2.31776 8.71E-05
26127 NTNG1 2.31615 1.30E-06
373 ADSS 2.29099 1.20E-05
6120 FAM107A 2.26256 0.000677009
28387 PTPRM 2.25934 1.41E-05
31572 SYT17 2.257 7.10E-05
7143 FLRT2 2.24042 1.35E-07
32372 TMEM88 2.2394 4.55E-05
27552 PLCL2 2.23488 1.24E-06
5681 EGLN3 2.23059 0.000841858
3837 CHAC1 2.22744 2.61E-05
26045 NR2F2 2.21836 1.71E-05
7196 FOXA2 2.21691 8.01E-05
12950 KIAA1324L 2.18683 6.09E-05
3667 CDK6 2.1717 0.00076066
9540 HS.36053 2.15618 5.44E-07
19012 LOC644860 2.15508 7.00E-06
4366 CPNE8 2.15418 9.80E-06
4936 DDIT4L 2.14147 0.000195501
29691 SDCBP 2.13721 3.10E-05
7144 FLRT3 2.11969 0.00033768
5851 ENPP2 2.10048 0.000485738
1558 BMP7 2.0876 0.000718573
23514 LPAR4 2.08062 1.96E-06
23554 LRIG3 2.07935 1.81E-06
5964 ERRFI1 2.07249 0.000220066
3623 CDCA7 2.07177 0.000280326
30635 SNHG5 2.0594 4.95E-06
32620 TRAM2 2.04784 0.000111169
12809 KCTD6 2.04602 0.000114945
28901 RGL1 2.04043 0.000167278
30628 SNHG1 2.03706 0.000252445
27947 PPPDE1 2.02017 2.69E-05
5434 DPYSL3 -2.00257 0.000139976
23863 MAP1LC3A -2.00377 4.01E-06
24226 MGC18216 -2.01184 0.000204988
4818 D4S234E -2.01244 8.77E-05
4825 DACH2 -2.01277 8.71E-07
4386 CPXM2 -2.02106 2.02E-05
32224 TMEM169 -2.02651 0.000222019
151 ACBD7 -2.03074 6.94E-05
8643 HOOK1 -2.03984 1.85E-05
4278 COPG2IT1 -2.04004 8.62E-07
32981 TUBB3 -2.04044 0.000989413
5887 EPHA1 -2.05082 1.41E-06
28929 RGS20 -2.06283 2.60E-09
28068 PRKCH -2.06869 4.13E-06
33539 WBP2 -2.0692 0.000157614
23711 LY6E -2.07026 8.93E-05
- 72 041083
29803 SEPPI -2.08034 2.48E-05
12713 KCND2 -2.08768 1.63E-08
34309 ZNF533 -2.08871 0.000231468
14009 LOC100129034 -2.09106 4.54E-07
25915 NMU -2.09244 0.000184692
24132 MEST -2.09269 2.92E-06
2715 C5ORF41 -2.09563 1.42E-05
27778 PON2 -2.09758 1.79E-05
24105 MEG3 -2.10214 5.69E-07
31812 TCF7L2 -2.10261 0.000153698
33783 YBX2 -2.1118 6.90E-06
28329 PTGIS -2.11465 9.61E-06
6694 FHDC1 -2.11553 8.86E-06
24175 MFNG -2.11579 2.95E-05
6640 FEZ1 -2.11631 2.58E-06
2407 C20ORF177 -2.12232 3.62E-05
26783 OVOL2 -2.12627 3.53E-07
28883 RFTN2 -2.13498 7.25E-08
19038 LOC644919 -2.13675 2.95E-06
30004 SH3BP4 -2.13785 0.000314453
31020 SOX2 -2.14642 0.000107169
16268 LOC284422 -2.16056 1.07E-05
4819 DAAM1 -2.16701 3.85E-05
32404 TMPRSS2 -2.1693 6.26E-07
26668 OR7E156P -2.17193 1.53E-05
12609 IIPR3 -2.18226 3.09E-06
6372 FAM65B -2.18271 1.37E-06
12635 JARID2 -2.18541 4.46E-05
25024 MOBKL2B -2.19737 5.45E-05
31567 SYT13 -2.19832 2.30E-05
25658 NDRG1 -2.20101 5.25E-07
24318 MGST3 -2.20252 3.24E-07
2147 C18ORF26 -2.2117 2.55E-06
31010 SOSTDC1 -2.21381 2.23E-08
4662 CXCL14 -2.21955 1.81E-08
33161 UCA1 -2.21966 2.19E-05
12176 IER3 -2.21992 2.75E-06
7171 FNBP1 -2.23104 1.98E-05
12199 IFITM3 -2.23167 4.22E-06
25635 NCRNA00153 -2.24173 2.01E-05
27531 PLAC9 -2.24346 9.11E-08
25743 NES -2.2469 3.16E-06
31405 STMN3 -2.25856 0.000796798
7536 GCA -2.27697 1.34E-05
12275 IGSF3 -2.28535 4.08E-06
17038 LOC 401056 -2.2854 2.45E-09
4533 CSRP2 -2.28899 0.000244001
31606 TACSTD1 -2.28933 0.000115538
29372 RRAGD -2.29258 0.000537359
5884 EPCAM -2.29475 0.00099285
28398 PTRF -2.29476 1.92E-05
12672 KANK4 -2.29735 1.73E-08
3505 CD200R1 -2.30795 3.06E-14
33264 UPK2 -2.30847 1.37E-10
24978 MMD -2.317 1.46E-05
6002 ETV4 -2.32842 6.04E-09
27655 PMP22 -2.33585 4.94E-12
5657 EFHD1 -2.33997 7.47E-05
31186 SPRY1 -2.34859 3.56E-06
3631 CDH11 -2.35006 1.77E-05
29555 SAT1 -2.35602 2.21E-05
33268 UPP1 -2.36162 5.38E-08
1968 C14ORF4 -2.36739 2.59E-06
9512 HS.34447 -2.37168 7.49E-08
16243 LOC283953 -2.38022 4.57E-07
3203 CAV2 -2.38208 1.09E-11
26223 NYNRIN -2.40311 1.90E-05
22623 LOC728715 -2.41353 0.000504831
25084 MPPED2 -2.42024 6.42E-10
13403 LAMC2 -2.42245 5.32E-10
25083 MPPED1 -2.42332 3.73E-14
13402 LAMC1 -2.43845 7.40E-05
15722 LOC 100134265 -2.44777 4.60E-06
5836 ENCI -2.45175 1.84E-05
244 ACVR2A -2.46307 1.87E-06
33616 WDR72 -2.46656 6.61E-05
28509 RAB31 -2.47199 1.57E-06
- 73 041083
3629 CDH1 -2.4799 3.05E-06
28905 RGMA -2.50113 4.45E-06
29475 S100A11 -2.50568 3.24E-06
8259 HAPLN1 -2.50809 7.14E-07
3942 CHST7 -2.51075 9.78E-08
12543 ISL1 -2.51716 2.76E-10
28305 PTCHI -2.52418 7.32E-08
32541 TOX -2.5288 5.34E-09
6067 F2RL1 -2.54309 2.36E-08
32334 TMEM54 -2.57701 2.04E-06
3436 CCND1 -2.58061 6.72E-05
707 ANKRD38 -2.58621 4.12E-09
5241 DLL3 -2.5911 8.77E-08
33424 VGF -2.59836 0.000406676
23253 LOC730525 -2.61609 3.32E-07
31368 STC1 -2.63136 1.20E-05
31910 TFAP2C -2.63773 4.72E-08
25012 MN1 -2.6469 8.33E-08
28419 PVALB -2.67012 1.23E-10
6960 FLJ37644 -2.67066 1.78E-12
7417 GADD45G -2.68804 2.14E-06
4709 CXXC4 -2.68958 5.39E-07
8050 GRHL3 -2.73097 4.15E-11
23990 MB IP -2.73995 9.29E-07
5418 DPPA4 -2.75778 5.66E-08
32212 TMEM158 -2.77503 9.30E-06
5896 EPHB1 -2.77518 2.29E-06
31404 STMN2 -2.79651 2.03E-05
12454 INSMI -2.81526 1.15E-09
13142 KLHL24 -2.81638 2.31E-07
9856 HS.475334 -2.82304 1.09E-05
33125 UBL3 -2.85607 2.77E-08
13655 LMO1 -2.90621 4.10E-06
6003 ETV5 -2.90987 5.54E-08
966 ARHGEF6 -2.92751 9.82E-11
31187 SPRY2 -2.94814 6.74E-09
28501 RAB25 -2.97139 5.77E-07
4675 CXCR7 -2.9864 6.13E-07
32652 TRIB2 -2.99455 8.47E-08
28397 PTPRZ1 -3.02099 8.00E-08
31158 SPOCK 1 -3.02198 8.12E-06
25849 NKD2 -3.02555 4.12E-11
25471 MYT1 -3.03712 6.21E-09
6856 FLJ25404 -3.03813 1.95E-08
30304 SLC2A1 -3.05478 0.000275534
12256 IGFBP5 -3.06686 2.00E-06
23779 MAF -3.07491 2.81E-08
28198 PRSS8 -3.08336 6.31E-08
9923 HS.509165 -3.09539 2.57E-07
4243 COL5A2 -3.10066 8.01E-08
3112 CAMKV -3.10668 3.37E-11
29915 SFRP2 -3.13051 3.42E-07
13092 KIT -3.13441 8.27E-12
6684 FGFR3 -3.13726 7.73E-09
8646 HOPX -3.15424 1.07E-14
29497 S1PR3 -3.15587 8.43E-07
33399 VCAM1 -3.15952 2.02E-10
5240 DLL1 -3.18075 1.28E-05
28112 PRODH -3.18595 2.33E-07
23200 LOC730278 -3.27115 1.92E-07
1202 ATP1B2 -3.29446 2.34E-08
6720 FJX1 -3.3039 6.85E-07
3609 CDC42EP4 -3.33348 2.25E-09
12198 IFITM2 -3.35237 3.41E-11
3679 CDKN1C -3.37225 1.15E-09
3202 CAV1 -3.37517 5.73E-13
31171 SPRED1 -3.42954 3.76E-08
30010 SH3GL3 -3.43813 3.73E-11
8335 HDC -3.45787 1.51E-12
8391 HES4 -3.49495 1.00E-08
33335 USP44 -3.50303 6.22E-11
1101 ASCL1 -3.54534 1.26E-11
29945 SFTA3 -3.5611 1.59E-07
13619 LIPA -3.56979 1.34E-08
27178 PDPN -3.72978 5.33E-12
7370 FZD8 -3.74383 7.14E-09
3647 CDH3 -3.80687 3.54E-09
2759 C6ORF141 -3.94476 5.10E-08
13595 LIMCH1 -3.94759 2.52E-11
13513 LEMD1 -3.98954 6.68E-08
- 74 041083
5961 ERP27 -4.02755 8.38E-13
29666 SCRG1 -4.03799 1.96E-17
7286 FRZB -4.04927 2.19E-05
12977 ΚΙΑΛΙ 598 -4.04996 4.12E-09
2380 C20ORF100 -4.16273 2.94E-12
25866 ΝΚΧ6-2 -4.17171 1.46E-10
31030 SOX9 -4.21749 9.69E-10
27805 POU3F1 -4.22404 1.53E-11
7879 GPC4 -4.23918 8.64E-08
17977 LOC642590 -4.36113 1.29E-10
19608 LOC646347 -4.53146 1.77E-08
5238 DLK1 -4.62809 8.12E-05
8401 HEY1 -4.68961 2.52E-12
30592 SMS -4.74656 5.18E-12
29914 SFRP1 -4.84227 1.53E-09
13376 L1TD1 -4.85832 6.96E-08
7984 GPR56 -4.87971 1.88E-13
7367 FZD5 -5.00247 2.43E-11
25858 NKX2-1 -5.06868 2.84E-08
7801 GNG8 -5.39693 2.22E-13
9156 HS.181245 -5.99308 1.43E-12
32962 TTYH1 -6.33607 1.00E-15
5523 DUSP6 -6.34711 8.15E-10
6091 FABP7 -6.56016 2.28E-09
5248 DLX5 -6.56829 8.74E-13
12754 KCNK12 -6.912 1.07E-12
30165 SLC15A3 -7.17663 1.60E-19
6675 FGF8 -7.58196 1.32E-18
31023 SOX3 -7.63996 1.53E-11
8395 HESX1 -8.28818 3.36E-10
28692 RAX -8.87763 6.24E-12
20959 LOC650757 -9.74543 1.18E-18
14470 LOC100130502 -10.333 1.53E-10
13568 LHX2 -14.1638 4.81E-12
30111 SIX3 -15.019 8.24E-13
12197 IFITM1 -16.4704 9.16E-16
25859 NKX2-2 -18.6642 7.93E-20
12254 IGFBP3 -19.1294 8.81E-16
8392 HES5 -33.7356 2.69E-21
30114 SIX6 -39.4411 2.59E-18
№ КОЛОНК и ID колонки кратное изменен ие р-значение
1209 ASCL1 33.085 1.60Е-09
3978 CHGA 28.1727 4.44Е-13
31604 STMN2 20.9978 1.47Е-08
32159 TH 15.2965 2.12Е-08
31606 STMN4 15.2102 3.72Е-09
7685 GAP43 12.5729 5.42Е-09
4926 D4S234E 10.7914 4.91Е-08
8593 HES6 10.6527 2.94Е-09
Таблица 3. Результаты анализа экспрессии генов для генов, экспрессия которых значительно повышена или понижен на 25 день дифференцировки по сравнению с днем 13 в популяции на основе вентральной пластинки, обработанной SHH/FGF8/Chir______
4342 COL3A1 10.0606 3.86E-06
12149 HS.7023 9.60731 3.97E-08
5691 EBF3 9.28771 5.13E-11
29820 SCG2 9.22584 1.02E-06
12655 INSM2 9.01409 3.73E-12
27988 POSTN 8.79262 1.09E-10
№ КОЛОНК и ID колонки кратное изменен ие р-значение
28590 PTPRO 8.70512 3.13Е-1О
30386 SLC17A6 8.22904 2.02Е-06
31767 SYT13 8.1735 3.63Е-07
- 75 041083
30390 SLC18A1 8.15448 6.47E-15
5689 EBF1 8.05344 2.30E-06
5029 DCX 8.00552 8.30E-08
2470 C1QL1 7.47022 8.68E-10
12609 INA 6.92121 5.72E-07
26250 NR4A2 6.75723 1.27E-13
29624 RTN1 6.6247 6.52E-07
9374 HS.19193 6.58382 1.95E-08
436 ADCYAP1 6.49154 9.75E-11
1607 BEX2 6.33986 8.93E-09
34098 ZCCHC12 6.19663 9.95E-07
7056 FLJ25404 6.19296 2.14E-06
31605 STMN3 6.17605 8.77E-07
№ колонк и ID колонки кратное изменен не р-значение
7997 GNG3 6.1196 1.26Е-06
25922 NEFM 6.11347 2.51Е-04
12359 ID2 6.07844 1.32Е-06
29017 REEP1 6.04393 2.25Е-06
30810 SNAP25 6.03677 3.62Е-06
25671 MYT1 5.86419 8.19Е-06
33297 UBE2J1 5.76887 6.22Е-08
5349 DLL3 5.76451 4.92Е-08
29133 RGS4 5.69761 1.87Е-06
28123 PPP2R2B 5.56067 2.80Е-08
27287 PCSK1N 5.43156 3.22Е-09
32126 TFF3 5.26964 3.17Е-08
27288 PCSK2 5.22877 9.14Е-10
4533 CRIP2 5.18375 8.40Е-08
12506 IL13RA2 5.1246 1.31Е-06
32417 TMEM163 5.01765 7.55Е-09
30813 SNAP91 4.92061 4.28Е-05
13260 KIF5C 4.86241 2.93Е-06
15798 LOC100133923 4.83074 3.74Е-07
32412 TMEM158 4.76646 4.81Е-06
3770 CDK5R1 4.75524 1.18E-05
5739 EEF1A2 4.75232 9.53E-05
32697 TNRC4 4.75179 1.29E-05
5455 DNER 4.71709 1.52E-05
6700 FAT3 4.68785 1.91E-06
6197 ETS2 4.67343 1.08E-10
25753 NBEA 4.65265 6.99E-07
12944 KCNJ16 4.53077 3.54E-12
3979 CHGB 4.52218 7.76E-05
25562 MXD4 4.445 7.25E-07
3941 CGNL1 4.44195 7.24E-06
26499 ONECUT2 4.37403 2.39E-07
2867 C6ORF141 4.35252 2.58E-10
12362 ID4 4.32183 6.05E-05
26011 NHLH2 4.31928 5.91E-05
2035 C14ORF132 4.31666 9.46E-07
9428 HS.204481 4.29602 1.66E-09
8288 GRM8 4.17846 1.62E-06
7617 GADD45G 4.17663 2.21E-06
4298 CNTNAP2 4.13552 4.10E-05
1408 AUTS2 4.13111 2.79E-05
23822 LRRC4C 4.11703 1.27E-09
31454 SRRM4 4.11574 8.04E-07
4003 CHN2 4.09589 3.30E-07
27665 PITX2 4.08382 1.94E-11
13296 KLC1 4.0528 4.19E-06
27773 PLEKHA6 4.0464 2.57E-07
25618 MYLIP 3.99268 2.96E-06
5036 DDC 3.96553 8.46E-05
33181 TUBB3 3.93922 1.52E-04
24522 MIAT 3.93906 9.87E-05
27411 PEG10 3.9374 3.48E-05
32343 TMEFF2 3.92112 6.49E-07
29821 SCG3 3.92108 6.47E-06
31759 SYP 3.89869 2.51E-04
9425 HS.202577 3.89053 2.85E-07
- 76 041083
33943 XKR4 3.87043 1.49E-06
33178 TUBB2A 3.86265 6.11E-05
12654 INSMI 3.84646 5.59E-05
13236 KIF1A 3.84543 3.27E-05
25721 NAPB 3.81995 3.50E-05
31765 SYT11 3.77827 1.14E-05
5877 ELAVL3 3.70028 9.69E-05
13858 LMO4 3.69359 2.09E-06
4103 CLASP2 3.64468 1.79E-05
2956 C7ORF41 3.63616 5.69E-05
33362 UCHL1 3.61003 5.64E-05
29645 RUNDC3A 3.54448 8.42E-05
24063 MAP1LC3A 3.53736 4.36E-06
5944 ENCI 3.51677 0.000141473
28730 RAB40B 3.48084 4.57E-07
25162 MLLT11 3.4633 3.13E-05
7469 FRMD4A 3.46181 7.40E-06
13070 KIAA0363 3.43032 6.39E-05
13342 KLHL24 3.41191 3.34E-05
7988 GNB3 3.38669 3.31E-09
31840 TAGLN3 3.36355 1.67E-03
12147 HS.66187 3.34592 0.000125172
4549 CRMP1 3.32015 2.42E-04
23453 LOC730525 3.31501 1.64E-03
31514 ST6GALNAC5 3.29449 1.19E-05
27054 PAFAH1B1 3.25816 1.30E-04
32432 TMEM170B 3.25165 2.44E-05
27686 PKIA 3.24255 4.29E-05
1748 BSN 3.2101 0.000169219
6213 EVL 3.17682 3.36E-05
34217 ZMIZ1 3.16249 3.29E-04
16419 LOC283514 3.15057 4.57E-06
32081 TERF2IP 3.13818 3.43E-05
4932 DACH1 3.11457 7.79E-06
5424 DNAJC19 3.09946 1.64E-09
8093 GPM6A 3.07619 1.59E-03
15034 LOC100131718 3.0686 4.01E-05
8706 HIST1H4K 3.06394 1.84E-06
28238 PRICKLE2 3.06341 1.98E-06
31429 SRGAP3 3.0575 7.84E-06
13760 LHFP 3.04812 0.000126565
3181 CADPS 3.03806 6.60E-06
3186 CALCA 3.03372 3.13E-08
1672 BMPR2 3.03171 9.26E-06
25861 NDRG4 3.00851 0.000239868
2265 C18ORF8 2.99462 9.07E-06
4698 CTNNA2 2.962 6.07E-05
1606 BEX1 2.96088 5.37E-05
32769 TPH1 2.96087 2.88E-07
31986 TCEAL7 2.95947 3.43E-05
3322 CBLN2 2.95729 1.12E-04
29639 RUFY3 2.95504 2.59E-05
3851 CELSR3 2.9545 6.27E-04
3177 CADM1 2.95335 1.81E-04
20895 LOC649841 2.94392 2.21E-05
13713 LEMD1 2.93152 9.17E-06
8184 GPR56 2.93095 3.08E-04
31935 TBC1D9 2.92862 6.60E-05
8046 GOLSYN 2.9099 2.80E-06
33004 TSHZ1 2.90158 2.76E-07
5876 ELAVL2 2.90115 0.00136166
12733 IRX5 2.88659 1.21E-04
1254 ATCAY 2.86583 7.41E-04
31763 SYT1 2.86449 1.02E-03
29193 RIMBP2 2.84834 6.29E-06
28741 RAB6B 2.84821 0.000698361
27533 PHF21B 2.8457 6.44E-05
24135 МАРТ 2.83633 5.22E-04
10116 HS.505676 2.83499 1.50E-05
8712 HIST2H2BE 2.82687 0.000157254
24061 MAP1B 2.82235 0.000357426
13054 KIAA0182 2.8162 2.66E-04
- 77 041083
34044 ZBTB20 2.81539 8.77E-08
29509 RPRM 2.81168 0.000475144
34007 YPEL5 2.81061 1.16E-04
13609 LANCL2 2.80004 8.07E-06
940 APLP1 2.77078 2.57E-05
29849 SCN3B 2.76654 7.14E-05
29201 RIMS3 2.76205 2.94E-04
27394 PDZD4 2.75594 0.000212095
1364 ATP6V1G2 2.75366 0.0012022
31778 SYT7 2.74946 4.15E-05
32351 TMEM106A 2.73965 0.000217998
7717 GATS 2.72521 3.10E-05
506 AGAP3 2.71696 2.07E-05
24141 MARCH4 2.70659 8.96E-04
5348 DLL1 2.7028 2.05E-04
6212 EVI5L 2.6886 6.79E-05
3196 CALM1 2.68129 8.50E-05
31386 SPRY1 2.67788 1.15E-03
33128 TTR 2.66999 2.76E-05
297 ACPL2 2.66551 1.52E-06
5325 DKK3 2.65119 5.63E-05
23853 LRRN3 2.64615 1.37E-03
32615 TMSL3 2.63733 4.56E-05
29822 SCG5 2.63452 1.42E-04
32000 TCF12 2.63327 1.80E-06
3497 CCDC92 2.6296 2.23E-05
5610 DUSP1 2.60841 1.78E-04
14524 LOC100130053 2.60135 4.53E-04
26279 NRSN1 2.59336 0.00111467
25711 NANOS3 2.58916 4.15E-06
5543 DPYSL4 2.58236 0.000223516
6231 EXOC7 2.58163 4.89E-06
24134 MAPRE3 2.57689 4.85E-05
9382 HS.193784 2.57602 2.18E-06
1608 BEX4 2.57251 9.83E-05
6514 FAM36A 2.56726 7.62E-05
13640 LBH 2.56551 1.34E-05
9920 HS.437111 2.55902 4.44E-05
33904 WSB2 2.55865 5.08E-04
9757 HS.369017 2.55838 4.25E-05
18920 LOC644250 2.55607 0.000475214
27311 PDCD4 2.55148 0.000139052
7562 FZD1 2.54808 2.48E-06
13191 KIAA1688 2.54643 9.31E-05
4292 CNTN2 2.53802 2.29E-04
32474 TMEM200A 2.53495 4.93E-07
6635 FAM89B 2.5341 1.64E-05
23500 LOC730990 2.53197 3.94E-05
1375 ATP9A 2.52973 1.09E-04
8126 GPR137C 2.52944 0.000217768
19248 LOC644936 2.52867 4.31E-04
4916 CYTH2 2.5213 6.31E-06
20654 LOC648921 2.51994 1.76E-03
2445 C1ORF71 2.50491 9.78E-04
21820 LOC652726 2.49851 5.58E-05
16100 LOC100134868 2.49288 0.00076351
27105 PAPSS2 2.49026 0.000148906
32246 TIMP2 2.48501 3.26E-05
27648 PIP5K2B 2.48028 0.000236563
12214 HSBP1 2.47723 1.82E-04
32754 TP53INP2 2.47324 2.42E-05
29037 REM2 2.46751 0.000170127
34742 ZNF84 2.46625 2.39E-04
3872 CENTA1 2.46106 3.74E-04
23918 LY6H 2.45793 0.000317539
29595 RSBN1 2.45785 8.01E-04
1733 BRP44L 2.45488 5.07E-04
2751 C3ORF70 2.45314 1.92E-06
12862 JUN 2.4481 4.37E-04
15357 LOC100132727 2.44481 0.00058635
13224 KIDINS220 2.43944 0.00068445
- 78 041083
33183 TUBB4Q 2.43584 0.00171503
685 ALPP 2.43222 3.60E-05
14002 LOC100128274 2.43042 1.90E-04
20699 LOC649095 2.42655 0.00040167
7123 FLJ35390 2.39837 0.00162187
16740 LOC387856 2.39594 8.21E-04
7033 FLJ22184 2.3897 4.07E-04
20602 LOC648740 2.38616 8.38E-06
10392 HS.538962 2.38583 0.000324449
31615 STOX2 2.38135 4.42E-04
23592 LOC731895 2.3779 0.000838915
32863 TRIM2 2.37536 5.63E-04
30075 SERTAD4 2.36897 0.000363024
26135 NOL4 2.36463 0.000261492
27620 PIK3R1 2.35977 1.01E-07
27073 РАКЗ 2.34949 1.62E-04
27855 PMP22 2.34705 7.89E-06
27636 PINK1 2.34687 1.17E-05
3223 CAMSAP 1 2.34021 1.96E-04
9323 HS.168950 2.33738 1.84E-04
17248 LOC401115 2.33367 0.000151535
6270 F3 2.32945 2.00E-08
2256 C18ORF32 2.32914 4.41E-04
777 ANKRD10 2.32837 2.48E-04
5372 DMRTA2 2.32784 5.27E-06
6347 FAM117B 2.32504 9.42E-04
731 AMY1A 2.3232 0.000158787
7610 GABRR1 2.31983 8.23E-08
1520 BAZ2B 2.30948 5.18E-04
7920 GLRA2 2.30858 6.83E-05
10190 HS.522924 2.30739 1.62E-03
7762 GDAP1 2.30342 6.22E-05
31325 SPHK2 2.29983 1.68E-04
31499 ST18 2.2969 9.74E-04
15124 LOC100131989 2.29335 1.57E-04
23665 LOC88523 2.29171 0.000476299
30325 SKP1 2.28675 1.76E-04
2743 C3ORF58 2.28463 0.000119256
27566 PHYHIPL 2.28388 1.72E-03
27332 PDE4D 2.28016 3.70E-05
760 ANK2 2.27803 3.84E-05
1101 ARL3 2.26792 1.O3E-O3
25218 MNX1 2.26631 4.41E-07
7255 FLJ44048 2.26493 6.84E-06
30029 SERINCI 2.26355 3.12E-04
34800 ZSWIM6 2.2634 3.19E-04
13943 LOC100128062 2.26302 0.000498795
18811 LOC644033 2.2611 5.93E-04
20075 LOC646996 2.25787 1.36E-04
7976 GNA01 2.25676 0.00121073
22799 LOC728661 2.25642 0.000599836
979 APPBP2 2.25324 6.41E-04
25716 NAP1L3 2.24879 9.43E-04
14359 LOC100129502 2.24469 1.52E-04
25580 MYCBP2 2.24333 0.000445387
27083 PAM 2.23671 0.00170991
22583 LOC728105 2.2358 0.000601193
29747 SARM1 2.2285 5.83E-07
7602 GABRB3 2.22682 4.00E-04
30261 SIAH3 2.22476 1.89E-05
27664 PITX1 2.22382 0.00102378
19467 LOC645452 2.21703 0.000168591
6533 FAM46A 2.21591 1.24E-03
26308 NT5C2 2.21285 0.00159191
1086 ARID5B 2.21184 0.000139405
494 AFF3 2.21139 1.28E-03
29124 RGS16 2.21012 2.33E-05
10056 HS.475334 2.20669 1.41E-03
3738 CDH10 2.20522 0.000389319
9819 HS.388347 2.2022 2.82E-05
34703 ZNF786 2.20193 1.65E-03
8705 HIST1H4J 2.19897 4.86E-06
- 79 041083
9740 HS.36053 2.19737 3.65E-05
651 ALG13 2.19414 4.86E-05
33588 VASH2 2.19373 0.000586609
28810 RALGPS1 2.19311 0.000999046
5774 EFNB3 2.191 0.000919096
1745 BSCL2 2.18758 8.17E-04
29151 RHBDL3 2.18758 4.86E-05
3740 CDH12 2.18674 0.000112317
24064 MAP1LC3B 2.18347 2.00E-04
32539 TMEM59 2.17758 1.77E-03
33171 TUB АЗЕ 2.17556 2.58E-04
526 AGPAT4 2.17042 1.95E-04
27832 PLXNA1 2.16997 0.000477137
34219 ZMPSTE24 2.16821 0.00130116
34669 ZNF738 2.16494 0.00145642
28749 RAB9B 2.16376 1.41E-03
3350 CCBE1 2.16311 2.69E-04
5875 ELAVL1 2.15865 6.37E-04
13154 KIAA1370 2.15727 5.07E-05
1356 ATP6V1B2 2.15309 0.000839601
6457 FAM181B 2.15303 6.91E-04
25137 MKL2 2.14461 0.000214816
27876 PNMA1 2.14384 0.000290225
23806 LRRC37B2 2.14195 4.81E-04
6851 FGD3 2.139 1.84E-04
1746 BSDC1 2.13842 0.000430355
27997 POTEF 2.13305 0.000655028
2969 C7ORF55 2.12929 5.66E-05
29923 SEC11C 2.12843 8.11E-04
31488 SSX2IP 2.12215 5.19E-06
29277 RNF128 2.12203 5.41E-06
30348 SLC12A2 2.12048 0.000343525
8277 GRK5 2.11347 0.000106085
8573 HEPACAM2 2.11332 2.39E-09
1610 BEXL1 2.10951 2.62E-04
4229 CMIP 2.10246 0.000705627
30224 SHANK2 2.10164 0.000611099
23763 LRP1B 2.09999 4.76E-05
6724 FBXL16 2.09975 8.65E-04
26092 NLRP8 2.09701 0.00161834
17496 LOC440704 2.09699 0.0015232
2543 C20ORF56 2.09698 4.79E-07
32624 TMX4 2.09279 8.41E-04
20006 LOC646821 2.0917 5.47E-05
25809 NCOA6 2.09025 1.61E-03
2811 C5ORF28 2.08938 6.33E-04
3279 CASD1 2.0821 6.10E-05
28256 PRKAR1A 2.08207 0.00119569
6208 EVI1 2.07806 4.85E-05
6920 FJX1 2.07539 1.80E-03
31199 SORBS2 2.07266 7.37E-05
3968 CHD6 2.06939 4.92E-05
34605 ZNF652 2.06441 0.00172675
4838 CYCS 2.06436 1.39E-03
34025 ZADH2 2.05857 3.02E-05
17246 LOC401098 2.05589 1.58E-03
27462 PFN2 2.05533 1.58E-03
27137 PARP6 2.05441 5.65E-04
5651 DYNC1I1 2.04874 0.000834135
7587 GABARAPL2 2.04534 0.00165234
149 AASDHPPT 2.04017 7.58E-04
1970 C12ORF51 2.038 0.000668525
31721 SVOP 2.03603 7.00E-04
1389 ATXN1 2.03408 3.27E-05
20667 LOC648980 2.03345 0.00062575
24523 MIB1 2.03159 3.22E-04
31982 TCEAL3 2.03073 0.00151379
12229 HSD17B7 2.03003 1.50E-03
27402 PDZRN4 2.02983 2.33E-05
6395 FAM13B 2.02944 3.18E-04
- 80 041083
1349 ATP6V0C 2.02572 1.08E-03
12828 JAKMIP2 2.01869 8.10E-04
34227 ZMYND11 2.01687 0.00171037
31603 STMN1 2.00603 0.000940483
29145 RHBDD2 2.00523 6.87E-04
25808 NCOA5 2.00244 0.000102715
30330 SLAIN1 2.00203 1.00E-03
2195 C17ORF45 -2.00166 0.00119767
23469 LOC730746 -2.00168 1.67E-03
30825 SND1 -2.00433 0.00128091
19456 LOC645436 -2.00559 1.69E-03
6242 EXOSC7 -2.00603 0.000798232
17727 LOC442232 -2.00726 7.96E-05
28062 PPIH -2.00996 8.70E-04
23234 LOC729779 -2.01096 4.05E-04
33239 TYK2 -2.01275 0.000787726
27020 P4HA2 -2.01467 1.3OE-O3
4563 CRTAP -2.01592 2.86E-06
29147 RHBDF1 -2.01731 9.21E-04
18367 LOC643007 -2.01867 0.000867101
2331 C1ORF106 -2.02039 2.06E-04
1332 ATP5G2 -2.02135 0.00169599
25354 MRPL45 -2.02158 0.00179523
11023 HS.552799 -2.02363 1.41E-04
17333 LOC402112 -2.02644 0.00178903
4341 COL2A1 -2.03118 0.00112645
14518 LOC100130009 -2.03222 1.54E-05
23928 LYN -2.03236 0.000609191
20489 LOC648294 -2.0327 0.0004778
32244 TIMM9 -2.03469 0.0015035
29412 RPA1 -2.03493 1.70E-03
33756 WDR12 -2.03533 5.96E-04
25781 NCAPD2 -2.03535 0.00132141
19436 LOC645385 -2.03595 0.00151373
2095 C14ORF93 -2.04138 6.93E-06
33243 TYRO3 -2.04437 4.26E-04
13396 KNTC1 -2.04704 1.95E-05
19027 LOC644464 -2.051 0.000744833
1355 ATP6V1B1 -2.0528 0.000263628
32263 TKT -2.05643 0.000380042
1039 ARHGAP19 -2.05734 6.74E-05
4923 CYYR1 -2.05748 1.68E-05
30076 SESN1 -2.05841 2.09E-04
5054 DDX10 -2.06089 0.000505
12782 ITGB3BP -2.06492 6.73E-06
17492 LOC440589 -2.06666 4.64E-04
23246 LOC729816 -2.06873 0.000791801
24128 MAPKAPK3 -2.06933 0.00146997
12221 HSD17B11 -2.07106 2.25E-05
32916 TRIM71 -2.07489 2.28E-05
16186 LOC136143 -2.07533 4.81E-04
31614 ST0X1 -2.07691 0.000191887
28717 RAB38 -2.07726 6.33E-04
21994 LOC653156 -2.07967 1.41E-03
29560 RPSA -2.08096 0.000379606
17241 LOC401074 -2.08141 6.58E-08
8588 HES1 -2.08285 0.000819562
29494 RPLP1 -2.08688 1.3OE-O3
6884 FGFR3 -2.09082 5.89E-06
4977 DBX1 -2.09957 0.000222703
29544 RPS5 -2.10042 0.00138553
29213 RIPK2 -2.10641 0.000218454
14423 LOC100129685 -2.1066 1.19E-03
27816 PLOD3 -2.10673 0.000954258
8805 HNRNPA1 -2.10967 1.74E-05
6898 FHL3 -2.1127 5.26E-05
18250 LOC642741 -2.1147 1.02E-03
32523 TMEM45A -2.1169 0.000464867
17691 LOC441876 -2.11785 1.02E-03
1488 BAIAP2L1 -2.11832 3.63E-05
4156 CLEC2D -2.11902 0.000733653
6966 FLJ10986 -2.12606 0.000420546
- 81 041083
14281 LOC100129237 -2.12997 4.96E-04
16802 LOC388556 -2.13532 6.52E-04
25385 MRPS30 -2.13565 3.28E-04
18023 LOC642250 -2.13595 0.00107704
31129 SNRPA -2.13825 6.40E-04
3730 CDCA5 -2.14343 0.0016145
26121 NOB1 -2.14482 3.43E-06
3733 CDCA8 -2.14728 0.000158263
33839 WDYHV1 -2.14889 0.000901318
15213 LOC100132299 -2.14934 3.42E-05
23294 LOC729964 -2.14942 0.000145725
23388 LOC730246 -2.15222 5.52E-04
29474 RPL36 -2.15341 1.12E-03
20693 LOC649076 -2.15494 0.000533848
14136 LOC100128771 -2.15556 6.32E-05
29459 RPL27 -2.15569 8.13E-04
20894 LOC649839 -2.15637 0.000233819
5649 DYM -2.15657 5.43E-04
6676 FANCG -2.15913 2.75E-04
26223 NPY -2.15981 4.99E-04
22700 LOC728428 -2.16464 0.00122727
27540 PHGDH -2.17929 0.000926407
23875 LSM4 -2.18409 0.00036081
15295 LOC100132528 -2.18468 8.34E-04
14997 LOC100131609 -2.187 0.000875169
29442 RPL14L -2.18734 4.55E-04
16653 LOC343184 -2.19197 6.17E-05
5697 EBPL -2.19209 2.05E-05
2763 C4ORF14 -2.19304 0.00128088
4474 CPNE8 -2.19514 2.56E-04
17500 LOC440737 -2.19615 0.000989795
22974 LOC729102 -2.1963 0.000282713
21275 LOC651149 -2.19678 1.31E-O3
17403 LOC440055 -2.19775 1.17E-03
29440 RPL13L -2.19817 2.16E-05
27368 PDK3 -2.20067 3.05E-04
31760 SYPL1 -2.20452 0.000128778
14389 LOC100129585 -2.20627 8.87E-05
29490 RPL8 -2.20725 1.35E-04
15083 LOC100131866 -2.20753 2.67E-05
2915 C6ORF48 -2.20788 0.000428494
19976 LOC646766 -2.21365 0.00033802
28801 RAI14 -2.21753 0.000675636
18557 LOC643433 -2.21779 0.000542767
16862 LOC389141 -2.21829 0.000459763
5715 ECT2 -2.21838 1.41E-03
29558 RPS8 -2.22068 0.00161471
19556 LOC645691 -2.22442 0.00107987
16693 LOC347544 -2.22526 0.000534957
23972 MAD2L1 -2.22823 0.000457464
18286 LOC642817 -2.23024 0.00054939
31588 STK24 -2.23459 3.03E-04
31024 SNORD25 -2.236 5.13E-05
1282 ATIC -2.24113 0.000182776
33110 TTK -2.24337 4.48E-04
23352 LOC730107 -2.24665 0.000445574
8727 HJURP -2.24769 2.63E-05
23237 LOC729789 -2.24864 3.21E-04
29503 RPP40 -2.25604 1.62E-04
17594 LOC441246 -2.25891 4.60E-04
17228 LOC400963 -2.26592 0.000542002
29521 RPS18 -2.26781 0.00151457
32392 TMEM144 -2.27099 5.66E-08
7652 GALK1 -2.27206 9.50E-04
27192 PCDH18 -2.27211 0.000113843
4297 CNTNAP1 -2.2794 2.43E-04
23041 LOC729279 -2.28142 5.88E-05
5840 EIF3H -2.28165 0.000193064
8828 HNRPC -2.28204 0.00128473
30493 SLC27A3 -2.29001 2.85E-04
5742 EEF1D -2.29339 0.000126152
30601 SLC44A1 -2.29419 0.000172089
- 82 041083
3866 CENPN -2.2944 0.000143689
29449 RPL22 -2.29465 0.00105741
20804 LOC649447 -2.29999 0.000262246
28036 PPAT -2.3009 0.000393145
25509 MTP18 -2.30185 3.55E-05
3538 CCNA2 -2.30784 0.000412267
33891 WNT5A -2.3104 3.36E-04
28110 PPP1R3C -2.31108 3.02E-06
1659 BMP2 -2.32278 2.31E-05
18725 LOC643863 -2.32406 1.02E-03
359 ADA -2.3269 2.14E-05
13751 LGMN -2.32715 4.54E-05
12250 HSP90AB1 -2.32781 1.49E-03
5850 EIF4B -2.32818 1.13E-O3
13724 LEPREL1 -2.32851 0.000169338
17534 LOC440991 -2.33062 1.54E-04
29559 RPS9 -2.33092 1.06E-04
3724 CDC7 -2.33576 0.000342965
27035 PABPC4 -2.33611 0.000164425
33241 TYMS -2.34068 0.00106577
30229 SHC1 -2.34608 0.00105777
21754 LOC652624 -2.34734 2.21E-04
5846 EIF3M -2.34987 0.00181367
15032 LOC100131713 -2.35114 0.000201749
29432 RPL10A -2.35345 0.00131867
24235 MCM6 -2.35636 0.00108431
19046 LOC644511 -2.36244 0.000514797
5044 DDIT4L -2.36718 0.000107365
545 AHCY -2.3677 0.000431822
18592 LOC643531 -2.37199 1.01E-03
5744 EEF1G -2.37611 0.000630065
5765 EFHD1 -2.38043 1.20E-03
32637 TNFRSF10B -2.38066 1.53E-05
26099 NME1-NME2 -2.38426 4.44E-05
22757 LOC728564 -2.38494 3.69E-04
8826 HNRPA1P4 -2.38609 3.87E-05
17458 LOC440359 -2.38691 5.63E-04
28560 PTPN13 -2.39211 0.000413752
15180 LOC 100132199 -2.39337 2.68E-05
4955 DARS -2.39728 1.56E-03
1882 C11ORF1 -2.39828 2.51E-05
23282 LOC729926 -2.39973 7.65E-04
15041 LOC 100131735 -2.40035 2.35E-05
22829 LOC728732 -2.40089 6.11E-05
3973 CHEK1 -2.40178 1.16E-06
600 AKR1A1 -2.40346 0.000695089
15586 LOC100133372 -2.40481 1.53E-04
31607 STOM -2.40533 3.40E-07
22710 LOC728453 -2.40686 0.0001068
29457 RPL26 -2.4112 0.000285349
29921 SEC11A -2.41182 0.00102718
16776 LOC388275 -2.41288 5.56E-06
29438 RPL13A -2.41592 0.000922424
3795 CDKN3 -2.41856 0.000112421
30404 SLC20A2 -2.41879 6.23E-06
32648 TNFRSF19 -2.42065 6.93E-05
31239 SP5 -2.42085 2.37E-09
23974 MAD2L2 -2.42585 0.000123115
12602 IMPA2 -2.42996 1.90E-06
17525 LOC440927 -2.43391 0.00119949
29414 RPA3 -2.43719 0.00177478
16156 LOC127295 -2.43999 5.06E-04
29565 RPUSD3 -2.44425 1.98E-07
16979 LOC390578 -2.44648 8.18E-08
15104 LOC 100131940 -2.44655 2.19E-05
26103 NME4 -2.44757 0.00114224
8825 HNRPA1L-2 -2.45235 5.46E-04
1537 BCAR3 -2.45546 0.000368573
- 83 041083
14206 LOC100129028 -2.45901 3.51E-04
16672 LOC345041 -2.46013 0.000101781
3125 САН -2.46417 0.000205741
32089 ТЕТ1 -2.46774 3.21E-05
12231 HSD17B8 -2.47022 0.000519001
4479 CPS1 -2.47967 2.21E-06
25464 MT АЗ -2.48169 8.09E-05
5758 EFEMP1 -2.48833 1.42E-05
28160 PQLC3 -2.48845 0.000585543
30245 SHMT2 -2.48964 0.00117427
23103 LOC729423 -2.50041 6.49E-06
12741 ISG20L1 -2.50404 9.70E-05
29539 RPS3 -2.50954 0.000103446
22857 LOC 728791 -2.5096 5.69E-06
23391 LOC 730255 -2.50972 1.22E-03
24097 MAP4K2 -2.51767 5.17E-06
7686 GAPDH -2.51826 0.00128279
2433 C1ORF57 -2.51861 1.49E-03
2262 C18ORF56 -2.51885 0.000156088
1792 BUB1 -2.52119 9.50E-06
5831 EIF2S3 -2.52373 3.38E-04
29039 RENBP -2.53102 4.92E-07
29481 RPL39L -2.53153 0.00013954
17141 LOC399804 -2.5389 3.38E-05
34552 ZNF581 -2.54051 9.37E-05
1156 ARRDC4 -2.54054 2.88E-05
8789 HMMR -2.54277 8.17E-05
28953 RBMX -2.5493 5.57E-05
32179 THEM2 -2.55298 5.30E-04
13239 KIF20A -2.55316 1.13E-05
1403 AURKA -2.55681 5.93E-05
27066 PAICS -2.55763 0.00111653
5836 EIF3D -2.56061 6.72E-05
13252 KIF2C -2.56757 1.70E-06
14814 LOC 100130980 -2.57639 4.33E-05
31821 TAF1D -2.57677 6.27E-06
27653 PIR -2.58392 2.26E-06
7564 FZD2 -2.58518 0.000146094
28778 RAD51AP1 -2.59104 5.06E-06
14695 LOC 100130562 -2.59563 3.41E-05
8547 HEATRI -2.59617 5.95E-07
22591 LOC728126 -2.59998 3.37E-05
29483 RPL4 -2.62451 7.56E-05
25783 NCAPG -2.62632 6.41E-05
20366 LOC647856 -2.6267 1.31E-05
29462 RPL29 -2.62809 4.36E-07
23274 LOC729903 -2.63121 4.28E-05
15975 LOC 100134393 -2.6327 2.71E-04
9745 HS.363526 -2.6341 0.000643774
561 AIF1L -2.63663 1.37E-04
8597 HEXB -2.63709 1.51E-03
5993 EPDR1 -2.63912 0.00156376
7966 GMPS -2.64155 1.99E-04
27563 PHYH -2.64322 2.14E-05
4100 CKS1B -2.64512 1.68E-04
7898 GLDC -2.64809 0.00143371
5513 DPH5 -2.6481 2.11E-05
18914 LOC644237 -2.66097 0.0011589
20185 LOC647285 -2.66563 1.82E-04
22536 LOC727984 -2.67684 0.000223687
8625 HIBADH -2.68374 0.00144114
684 ALPL -2.69266 2.39E-06
17636 LOC441506 -2.70546 6.10E-05
30602 SLC44A2 -2.70757 1.24E-03
16741 LOC387867 -2.71424 2.45E-05
23060 LOC729340 -2.7157 0.000999351
- 84 041083
27743 PLCD1 -2.72 1.14E-07
22597 LOC728139 -2.72434 4.77E-05
28530 PTGR1 -2.72675 7.39E-05
5741 EEF1B2 -2.7289 4.84E-05
18360 LOC642989 -2.73236 0.000921883
20058 LOC646942 -2.74335 5.41E-05
16737 LOC387825 -2.74954 5.93E-06
16236 LOC148430 -2.76485 2.32E-05
29441 RPL14 -2.76505 4.49E-06
31176 SNX5 -2.77426 4.41E-08
13592 LAMA1 -2.77535 2.89E-07
16814 LOC388707 -2.77694 1.99E-06
29179 RHPN2 -2.78226 0.00110049
23133 LOC729500 -2.78295 8.63E-06
2524 C20ORF199 -2.79683 8.26E-05
27370 PDLIM1 -2.79852 0.000250318
27030 PABPC1 -2.7998 0.000107149
7486 FRZB -2.81189 5.35E-04
17023 LOC391075 -2.82637 0.00139394
6705 FBL -2.8276 2.59E-05
13708 LEF1 -2.83207 1.15E-05
4101 CKS2 -2.83376 0.000537912
13438 KRT19 -2.83803 2.34E-05
28410 PSAT1 -2.8451 8.29E-07
33979 YAP1 -2.84569 0.00106156
29435 RPL12 -2.85091 4.23E-05
22553 LOC728031 -2.85482 8.14E-05
29524 RPS2 -2.85918 1.32E-05
23861 LRTM1 -2.85972 1.48E-12
26404 NUSAP1 -2.86459 9.00E-05
20473 LOC648249 -2.86802 4.01E-06
23319 LOC730029 -2.87607 3.58E-05
24516 MGST1 -2.87812 2.82E-06
349 ACVR1 -2.88477 0.000447642
30500 SLC29A1 -2.91375 2.94E-06
17086 LOC391833 -2.91531 4.06E-05
20614 LOC648771 -2.91567 7.23E-05
27493 PGM1 -2.92082 0.000287518
30836 SNHG6 -2.92725 2.13E-05
20015 LOC646849 -2.95184 3.75E-05
16783 LOC388339 -2.95309 4.55E-05
3785 CDKN1A -2.95807 0.000310093
29436 RPL12P6 -2.97114 2.40E-06
5258 DIMT1L -2.97803 1.83E-06
15940 LOC100134304 -2.98223 4.08E-08
13733 LGALS1 -2.98473 0.00160731
27902 PODXL -3.00627 2.35E-08
16630 LOC341315 -3.02065 1.10E-04
481 ADSS -3.02244 4.06E-06
29557 RPS7 -3.06985 2.69E-06
1406 AURKB -3.07612 5.67E-07
23373 LOC730187 -3.08276 4.32E-06
25214 MND1 -3.08698 3.39E-07
14412 LOC 100129657 -3.08986 0.00120608
33282 UBE2C -3.09218 4.69E-06
30114 SFRP1 -3.10477 0.000250519
17015 LOC391019 -3.10602 2.05E-05
28602 PTTG1 -3.11309 2.05E-05
17541 LOC441013 -3.11866 6.73E-07
20657 LOC648931 -3.12515 3.24E-09
31661 SUCLG2 -3.13505 5.75E-07
1559 BCL2L12 -3.13599 4.40E-07
32222 TIGA1 -3.13783 7.09E-05
7770 GDF15 -3.14204 1.42E-07
2878 C6ORF160 -3.15022 0.000111744
15382 LOC100132795 -3.21797 1.51E-05
4930 DAB2 -3.2203 2.91E-05
32933 TRIP6 -3.23132 1.32E-06
20091 LOC647030 -3.23731 4.86E-05
26048 NKD1 -3.24181 4.37E-06
6320 FAM107A -3.24905 0.000449795
- 85 041083
16552 LOC286444 -3.25137 6.05E-06 28975 RBPMS2 -3.82727 3.95E-06
26390 NUP37 -3.26236 3.70E-05 23218 LOC729742 -3.84552 7.82E-07
19783 LOC646294 -3.28211 1.06E-06 13597 LAMB1 -3.85107 1.24E-07
2210 C17ORF61 -3.28907 2.68E-05 6291 FABP7 -3.85422 0.000335025
19553 LOC645688 -3.29172 3.95E-06 12606 IMPDH2 -3.85952 4.79E-06
25847 NCRNA00219 -3.29327 7.23E-05 13834 LITAF -3.86 4.66E-05
28663 QPRT -3.29832 2.04E-05 3953 CHCHD10 -3.91295 4.20E-06
31361 SPON1 -3.32269 5.27E-06 2439 C1ORF64 -3.9544 5.48E-10
30835 SNHG5 -3.32459 0.000204237 8473 HAUS4 -3.96227 4.95E-12
4596 CSDA -3.3629 0.000363294 925 APCDD1 -3.97854 6.09E-08
455 ADM -3.40482 4.11E-05 5952 ENO3 -4.00663 6.90E-09
23228 LOC729768 -3.41997 2.20E-05 27019 P4HA1 -4.01147 0.00032695
1753 BST2 -3.42742 1.17E-07 4724 CTSL2 -4.01208 1.47E-06
20685 LOC649049 -3.46913 1.63E-06 19348 LOC645173 -4.02454 2.71E-06
17292 LOC401537 -3.50501 3.79E-07 28605 PTTG3P -4.02805 3.37E-06
6707 FBLN1 -3.53279 3.88E-06 4239 CMTM7 -4.08386 7.09E-09
28241 PRIM1 -3.53892 1.17E-06 8089 GPI -4.08821 1.18E-05
8754 HLA-E -3.54293 2.03E-07 1616 BGN -4.11601 0.000348095
643 ALDOA -3.55096 0.000184641 23196 LOC729679 -4.2525 4.55E-08
14422 LOC100129681 -3.55393 9.42E-07 3694 CDC20 -4.28351 3.38E-06
8773 HMGB2 -3.56419 9.08E-05 32729 TOP2A -4.29945 1.43E-06
32964 TRPM4 -3.5945 2.41E-06 30828 SNHG1 -4.38641 2.77E-06
12398 IFITM2 -3.59918 1.38E-03 3243 CAPN6 -4.44794 4.50E-07
32177 THBS4 -3.6116 6.59E-07 30284 SILV -4.59486 1.80E-07
3540 CCNB1IP1 -3.62989 3.35E-08 15342 LOC 100132673 -4.69254 2.18E-07
5477 DOCK10 -3.64495 7.09E-07
28387 PRSS23 -3.67253 0.000258012 29716 SALL4 -4.95909 2.66E-08
26369 NUDT7 -3.67565 7.62E-05 3541 CCNB2 -5.23718 4.33E-08
26207 NPM3 -3.69114 1.35E-06 30511 SLC2A3 -5.39887 5.64E-07
23887 LTA4H -3.69913 6.82E-05 13691 LDHA -5.76362 0.000569306
12399 IFITM3 -3.70541 0.000779898 7500 FST -5.82949 8.74E-09
8769 HMGA1 -3.72752 3.30E-08 1543 BCAT1 -6.13131 3.52E-06
323 ACTA2 -3.74071 1.75E-04 5323 DKK1 -6.17493 4.94E-08
1530 BBS9 -3.7636 3.82E-07 4343 COL4A1 -6.21986 6.18E-07
7501 FSTL1 -3.80754 0.000136961 8078 GPC3 -6.35513 0.000466041
27805 PLIN2 -3.82123 4.77E-10 4333 COL22A1 -6.371 1.87E-08
32774 TPM2 -6.8139 1.85E-08
2430 C1ORF54 -7.81915 1.70E-07
965 APOE -9.10671 6.03E-07
13804 LIN28 -26.8821 1.20E-13
- 86 041083
SPON1
31361
4.93795
4.69E-08
Таблица 4. Результаты анализа экспрессии генов для генов, экспрессия которых значительно повышена или понижен на 25 день дифференцировки в популяции на основе вентральной пластинки, обработанной SHH/FGF8/Chir, по сравнению, с контрольной колонкой, обработанной LSB
№ колонк и ID колонки кратное изменен не р-значение 13857 LMO3 4.83578 7.25Е-08
13865 LMX1A 4.63407 1.51Е-06
2543 C20ORF56 4.4431 3.63Е-13
32126 TFF3 25.0585 2.47Е-14
12733 IRX5 4.2929 1.45Е-06
1209 ASCL1 14.9328 1.97Е-07
7988 GNB3 4.13634 1.52Е-10
7395 FOXA1 12.9897 4.15Е-14
32159 TH 4.08743 0.000370318
29133 RGS4 11.0181 6.65Е-09
5346 DLK1 4.02203 1.73Е-05
27988 POSTN 8.20403 2.16Е-10
31775 SYT4 4.00669 0.000372793
7396 FOXA2 7.98132 1.60Е-14 9428 HS.204481 3.88697 6.71Е-09
4342 COL3A1 7.58625 2.49Е-05 6197 ETS2 3.70155 3.07Е-09
12731 IRX3 7.42399 1.64Е-06 5036 DDC 3.61254 0.000194062
9374 HS.19193 7.27196 7.36Е-09 26250 NR4A2 3.55879 9.29Е-10
3978 CHGA 7.14305 2.77Е-08 2867 C6ORF141 3.48146 6.97Е-09
2470 C1QL1 7.1366 1.38Е-09 26928 OSBPL10 3.27941 3.81Е-07
30390 SLC18A1 7.04751 3.52Е-14 5372 DMRTA2 3.26437 1.81Е-08
22823 LOC728715 6.5801 8.79Е-09 33930 ХВР1 3.2414 0.000921089
№ колонк и ID колонки кратное изменен ие р-значение 27664 PITX1 3.23009 1.10Е-05
9819 HS.388347 3.14523 8.26Е-08
30239 SHISA2 3.13411 4.23Е-05
12456 IGFBP5 6.15962 3.65Е-05 2743 C3ORF58 3.10109 1.50Е-06
27665 PITX2 6.10679 6.79Е-14 623 ALCAM 3.00487 0.000307411
12655 INSM2 5.18438 1.70Е-09 6533 FAM46A 2.99243 3.45Е-05
12944 KCNJ16 4.98753 8.89Е-13 28590 PTPRO 2.94164 4.45Е-05
436 ADCYAP1 4.94597 2.43Е-09 18750 LOC643911 2.93448 1.14Е-06
- 87 041083
31669 SULF2 2.92397 8.02E-05 19806 LOC646345 -2.02311 0.000183202
5348 DLL1 2.92274 8.36E-05 23846 LRRIQ1 -2.02718 0.000541683
30066 SERPINF1 2.76873 0.000156193 27746 PLCE1 -2.02761 0.000217281
5349 DLL3 2.75425 0.000173675 2727 C3ORF39 -2.03023 0.000131521
3186 CALCA 2.71125 2.10E-07 26072 NLGN3 -2.03154 2.45E-05
30590 SLC39A8 2.67444 2.25E-05 2770 C4ORF22 -2.03489 0.00113778
32000 TCF12 2.66777 1.46E-06 3491 CCDC88C -2.03515 0.00112864
3941 CGNL1 2.63848 0.00120585 25751 NAV3 -2.03716 8.63E-05
32769 TPH1 2.62647 1.95E-06 30413 SLC22A17 -2.03749 0.000703407
25941 NENF 2.55992 0.000599552 13014 KDELC2 -2.04133 0.00147391
29509 RPRM 2.53138 0.00135525 27749 PLCHI -2.0426 0.000234672
32144 TGFBR3 2.46754 8.27E-07 16489 LOC284988 -2.04353 0.000785305
13689 LDB2 2.40983 2.56E-05 9938 HS.440518 -2.04573 0.000285223
2850 C6ORF117 2.4009 0.000508473 28076 PPM1H -2.04637 0.00038276
31806 TACSTD1 2.38661 0.00154495 429 ADCY3 -2.05728 0.000712376
24375 MFNG 2.31488 5.04E-05 31199 SORBS2 -2.05812 8.31E-05
5424 DNAJC19 2.30405 4.42E-07 17624 LOC441453 -2.0676 3.05E-06
12986 KCNS3 2.28802 0.000136062 13793 LIM2 -2.07092 0.00040641
27855 PMP22 2.27371 1.36E-05 33165 TUB -2.07384 0.000187156
4003 CHN2 2.26467 0.000550787 3462 CCDC65 -2.07613 0.00151516
5691 EBF3 2.26453 0.000571924 4305 COBL -2.07819 0.000485834
3187 CALCB 2.11359 2.49E-06 6912 FILIP 1 -2.07924 9.69E-05
28325 PROXI 2.08192 0.000135872 5195 DGCR6 -2.07943 0.000935686
25218 MNX1 2.05528 3.37E-06 33905 WSCD1 -2.08212 0.00033792
6270 F3 2.01261 5.71E-07 12933 KCNIP1 -2.08721 3.72E-05
2245 C18ORF10 -2.00297 0.00129421 4933 DACH2 -2.09051 9.24E-05
28546 PTN -2.003 0.000354472 25960 NEUROG2 -2.09361 0.00111856
5920 EMID2 -2.00456 1.77E-05 25930 NEK2 -2.09683 0.00144313
24405 MGC11082 -2.00498 2.75E-05 3288 CASP3 -2.09925 0.000130992
5949 ENKUR -2.00742 0.000107398 12971 KCNMB4 -2.09934 0.00140267
26398 NUP93 -2.01111 0.00124009 3125 CA14 -2.10277 0.00147559
10837 HS.545615 -2.01378 2.65E-05 17153 LOC399959 -2.10829 0.000816932
12688 IQCC -2.01383 0.00019749 15855 LOC100134073 -2.10866 0.000366572
6196 ETS1 -2.01751 0.000848186 26322 NTM -2.10973 0.000159062
27290 PCSK5 -2.02079 0.00122771 7595 GABRA2 -2.11173 0.00169771
16112 LOC100192378 -2.0216 4.35E-05 5618 DUSP18 -2.11289 8.90E-05
- 88 041083
4289 CNTFR -2.11375 0.00132713 32380 TMEM132D -2.22662 0.000463067
3760 CDH8 -2.11381 7.41E-05 2705 C3ORF15 -2.2299 0.000615847
3196 CALM1 -2.11418 0.00157715 27781 PLEKHG1 -2.23885 1.49E-05
13615 LARGE -2.11685 2.37E-05 29607 RSPH9 -2.24091 0.000109859
32933 TRIP6 -2.11829 0.00047459 23965 MAB21L1 -2.24222 2.00E-05
2242 C17ORF97 -2.12666 0.000851745 25942 ΝΕΟΙ -2.24511 2.27E-05
5478 DOCK 11 -2.12763 0.000306132 34157 ZFP106 -2.24688 0.00129693
7377 FNDC4 -2.13338 0.000482465 33083 TTC29 -2.24927 0.000317648
29672 RYR3 -2.13573 0.000392208 3415 CCDC19 -2.25412 0.000638581
30669 SLC7A6 -2.13865 0.000299041 30209 SH3GL2 -2.2573 0.00175354
29816 SCD5 -2.14266 9.40E-05 839 ANKS1B -2.25784 6.46E-05
12212 HS6ST2 -2.14751 0.00020473 3472 CCDC74A -2.25911 3.66E-05
4213 CLSTN2 -2.15117 2.14E-05 27561 PHTF1 -2.26039 0.00113655
16924 LOC389816 -2.15626 4.60E-09 26505 OPCML -2.26062 2.34E-05
2102 C15ORF26 -2.15663 0.000242005 23859 LRRTM4 -2.26387 0.00050229
1103 ARL4C -2.16184 0.00049625 27040 PACRG -2.26701 8.08E-05
31151 SNX10 -2.16614 0.000623725 24318 MELK -2.27019 0.000423662
16382 LOC255783 -2.17123 0.000592438 10017 HS.452398 -2.27201 0.000477927
30372 SLC16A14 -2.17701 0.000382805 9237 HS.147562 -2.27279 0.000798954
13177 KIAA1598 -2.1779 0.000634174 26976 OTX1 -2.27327 0.000877908
28587 PTPRM -2.17848 0.000334455 8046 GOLSYN -2.27724 0.000100581
8661 HIST1H2AC -2.18157 0.00018782 1074 ARHGEF6 -2.27982 0.000748746
30015 SEPT6 -2.18483 0.00101243 4639 CSRNP3 -2.28361 0.000213299
6572 FAM65B -2.18593 1.46E-05 27547 PHLDA1 -2.28667 2.70E-05
4614 CSMD2 -2.18777 0.000579739 3537 CCNA1 -2.28864 6.92E-05
19737 LOC646168 -2.18864 0.000417767 26071 NLGN2 -2.29131 0.000215422
2429 C1ORF53 -2.19182 0.0017844 5325 DKK3 -2.29195 0.000372444
17855 LOC641785 -2.19315 0.000255891 6326 FAM108C1 -2.29624 0.000567659
5570 DSCR6 -2.20122 0.00137487 28721 RAB3B -2.30577 0.000211905
13835 LIX1 -2.20141 6.32E-06 2372 C1ORF158 -2.3174 0.00184147
23979 MAF -2.20457 6.38E-05 32499 TMEM231 -2.32173 0.000378145
4734 CTXN1 -2.21039 0.0007813 5550 DRD1IP -2.3265 0.00129147
2049 C14ORF159 -2.2127 0.000171696 12785 ITGB5 -2.32837 0.00143999
30388 SLC17A8 -2.21639 0.000916084 30937 SNORA79 -2.32935 0.000394221
26228 NQO1 -2.21974 0.000753734 2538 C20ORF46 -2.34101 0.000827542
23817 LRRC46 -2.22159 0.000756129 5939 EMX2OS -2.34991 1.28E-05
- 89 041083
3153 CACNA1E -2.35127 0.000755994 4965 DBC1 -2.53221 0.000370596
28906 RBKS -2.35486 1.25E-05 32507 TMEM31 -2.53343 2.39E-06
3806 CDRT4 -2.36622 0.000173226 1927 C11ORF75 -2.53649 0.000498243
32129 TFPI -2.36876 0.000644776 6740 FBX015 -2.54184 0.00139562
5763 EFHC1 -2.36977 0.00112503 27370 PDLIM1 -2.54956 0.000681773
3746 CDH18 -2.37821 6.60E-06 728 AMPH -2.55801 6.39E-06
33006 TSHZ3 -2.38415 0.00160322 33718 VWC2 -2.56363 0.000340976
6901 FHOD3 -2.38572 0.00106294 13724 LEPREL1 -2.56798 4.43E-05
13805 LIN28B -2.38688 0.000393414 1057 ARHGDIB -2.573 5.20E-06
1806 C10ORF107 -2.39735 0.000750154 5765 EFHD1 -2.59294 0.000474204
32034 TCTEX1D1 -2.40988 0.00160003 3758 CDH6 -2.6075 0.000303268
31146 SNTN -2.42893 0.000945171 7043 FLJ23152 -2.60944 0.000143522
30057 SERPINB6 -2.43305 1.01E-05 31282 SPATA17 -2.61656 0.00020388
28580 PTPRD -2.43513 6.24E-05 7106 FLJ33590 -2.61873 0.00025779
28210 PRDM8 -2.44594 0.000113613 16264 LOC151162 -2.62005 0.000666466
2614 C22ORF15 -2.45467 0.000112958 32440 TMEM178 -2.62313 0.00011953
12892 KBTBD9 -2.45472 2.16E-06 1987 C12ORF69 -2.62861 5.06E-06
6246 EXT1 -2.4653 0.000117948 2970 C7ORF57 -2.63494 0.000118643
25946 NETO2 -2.46601 0.000568595 23830 LRRC6 -2.63632 0.000197619
493 AFF2 -2.4707 0.0012124 6173 ESMI -2.63913 0.000368518
31610 STOML3 -2.48765 0.000560404 153 ABAT -2.64114 3.81E-06
31577 STIL -2.49103 0.000199457 2793 C4ORF47 -2.64571 0.00134045
4826 CYB5D1 -2.49147 0.000128822 2301 C19ORF51 -2.64617 7.44E-05
2078 C14ORF45 -2.49501 0.000787004 34155 ZFHX4 -2.66127 5.12E-06
33501 USP13 -2.49771 6.06E-05 5762 EFHB -2.66338 0.000148296
34226 ZMYND10 -2.50015 0.000105158 6920 FJX1 -2.66433 8.09E-05
28507 PTCHD1 -2.50016 0.00120417 12872 KANK4 -2.66744 0.000457332
5322 DKFZP781N1041 -2.50483 0.000661286 26104 NME5 -2.66836 0.000118819
3253 CAPSL -2.50626 0.000844682 3148 CACHD1 -2.67846 0.000100474
14289 LOC100129268 -2.508 0.000176359 25628 MYO16 -2.67972 8.67E-05
17551 LOC441054 -2.5088 0.00166136 28838 RAPGEF2 -2.68049 7.06E-05
26395 NUP62CL -2.51081 0.000373281 5553 DRD4 -2.68408 0.000500735
1776 BTG3 -2.51582 0.00131261 4087 CITED2 -2.68818 0.00192224
33005 TSHZ2 -2.51649 3.77E-05 23790 LRRC26 -2.68889 2.44E-06
4705 CTNND2 -2.52798 0.00038507 2631 C22ORF42 -2.69089 0.00039382
29792 SCARNA11 -2.53148 3.35E-06 25564 MXRA5 -2.69302 0.00192861
- 90 041083
12836 JAZF1 -2.70808 5.58E-05 10979 HS.551307 -3.04712 1.13E-05
13346 KLHL29 -2.71506 5.11E-06 29794 SCARNA13 -3.05568 4.35E-05
25749 NAVI -2.71696 0.000248061 32378 TMEM132B -3.06408 1.54E-06
29306 RNF175 -2.71799 3.04E-05 2690 C2ORF77 -3.07752 4.19E-05
13815 LINGO2 -2.71868 2.30E-05 27660 PITPNM1 -3.09871 2.62E-05
25208 MMRN1 -2.73481 0.000116097 32963 TRPM3 -3.10437 0.000937085
3918 CFDP1 -2.73575 0.000150699 3640 CD36 -3.10624 0.000121554
31242 SP8 -2.73862 5.04E-05 26070 NLGN1 -3.1408 9.93E-05
1311 ATP1B3 -2.7498 8.64E-05 5749 EFCAB1 -3.15705 0.000423897
25939 NELLI -2.7509 0.00086776 3121 CAIO -3.15947 0.000537722
32531 TMEM51 -2.77628 6.84E-06 3215 CAMK2N1 -3.16181 0.000561888
15778 LOC100133887 -2.78135 1.17E-05 8016 GNRH1 -3.16554 1.25E-05
815 ANKRD38 -2.79552 0.000168264 13037 KHDRBS3 -3.16572 0.000269437
33758 WDR16 -2.80194 0.000532777 5681 E2F7 -3.17981 2.36E-07
12801 ITM2C -2.81062 7.32E-05 8174 GPR37 -3.18311 2.85E-05
32847 TRH -2.84178 0.00148109 29510 RPRML -3.19177 0.000271322
2881 C6ORF165 -2.84456 6.28E-05 4349 COL4A6 -3.1938 5.88E-05
15644 LOC100133542 -2.84572 9.65E-05 27887 PNOC -3.19863 4.88E-05
29811 SCARNA8 -2.84646 9.99E-06 1543 BCAT1 -3.20615 0.000858798
33964 XPR1 -2.85352 5.49E-06 28813 RALYL -3.21662 0.000509498
25940 NELL2 -2.86423 0.00024831 30531 SLC32A1 -3.24737 0.0002618
5455 DNER -2.87832 0.00127284 25216 MNS1 -3.25707 0.000109366
33807 WDR63 -2.88707 4.43E-05 3364 CCDC109B -3.26787 0.000147649
3038 C9ORF116 -2.89396 0.000215965 4004 CHODL -3.28962 0.00114785
2553 C20ORF85 -2.89405 7.84E-05 965 APOE -3.29237 0.00155578
5531 DPY19L1 -2.90287 0.000183171 5764 EFHC2 -3.29611 0.000143319
31955 TBR1 -2.90815 7.60E-06 29002 RDH10 -3.30034 0.000369857
8655 HIST1H1C -2.91043 9.46E-05 29600 RSHL3 -3.30753 6.17E-05
3401 CCDC146 -2.91057 0.000155147 12317 HTRA1 -3.31522 0.000437969
31935 TBC1D9 -2.91662 6.93E-05 2398 C1ORF194 -3.31829 1.21E-05
7421 FOXJ1 -2.94694 0.000577632 5895 ELMOD1 -3.32218 0.000142072
32783 TPPP3 -2.95648 0.000353912 3066 C9ORF171 -3.33251 4.78E-05
5337 DLG2 -2.96987 1.13E-06 33592 VAT1L -3.3402 0.000247714
27810 PLK4 -2.98102 1.71E-06 12399 IFITM3 -3.3542 0.0016376
24315 MEIS2 -3.03243 0.00109977 28319 PROM1 -3.35504 5.84E-05
31243 SPA17 -3.03709 0.000523067 29034 RELN -3.43956 1.30E-05
- 91 041083
2397 C1ORF192 -3.45738 0.000124675 31257 SPAG6 -3.86214 1.74Е-05
586 АКАРИ -3.46559 1.94Е-05 7865 GJA1 -3.88524 0.000511853
5032 DDAH1 -3.46896 1.42Е-05 3274 CASC1 -3.88963 2.00Е-05
3766 CDK2AP2 -3.4706 3.31Е-06 7696 GAS1 -3.95396 2.45Е-07
3652 CD47 -3.47334 6.18Е-05 7805 GFRA2 -4.00209 0.000116201
4283 CNR1 -3.48521 9.70Е-05 3050 C9ORF135 -4.09611 3.21Е-05
12694 IQCG -3.4934 2.59Е-05 23853 LRRN3 -4.2728 1.34Е-05
10300 HS.537002 -3.49808 0.000142247 29603 RSPH1 -4.35627 1.08Е-05
12506 IL13RA2 -3.50471 5.79Е-05 6458 FAM183A -4.40302 2.73Е-05
28709 RAB31 -3.51372 7.79Е-05 3220 CAMKV -4.47543 4.97Е-05
28536 РТН2 -3.54413 0.000188892 27284 РСР4 -4.64191 1.37Е-05
31283 SPATA18 -3.54742 5.71Е-05 29723 SAMD3 -4.7132 2.41Е-06
3071 C9ORF24 -3.55395 9.04Е-05 31223 SOX3 -4.74012 8.45Е-06
7432 FOXN4 -3.57299 5.14Е-09 29396 ROPN1L -4.86578 3.17Е-06
27171 РВХЗ -3.57487 0.000447274 29972 SEMA3C -5.03965 4.16Е-05
32270 TLE4 -3.57637 7.16Е-05 3695 CDC20B -5.17405 5.72Е-07
28981 RCAN2 -3.61105 0.000608261 4298 CNTNAP2 -5.33902 4.01Е-06
32069 ТЕКТ1 -3.61846 8.36Е-05 2006 C13ORF30 -5.4414 1.12Е-06
17491 LOC440585 -3.62588 0.000175217 33600 VCAN -5.47499 0.000917643
5660 DYNLRB2 -3.6297 6.28Е-05 1936 C11ORF88 -5.55748 2.96Е-06
5938 ЕМХ2 -3.66175 1.17Е-06 30115 SFRP2 -6.27713 3.81Е-08
24314 MEIS1 -3.68295 0.000402893 27159 РАХ6 -6.64236 3.94Е-10
13856 LMO2 -3.74164 7.37Е-06 866 ANXA1 -7.3691 4.96Е-06
6004 ЕРНВ1 -3.77917 0.000119962 3561 CCNO -9.3158 2.19Е-08
7504 FSTL5 -3.80048 0.000392914 13768 LHX2 -9.53566 3.56Е-05
1119 ARMC3 -3.82142 2.66Е-05
№ колонк и ID колонки Кратное изменен ие р-значение
Таблица 5. Результаты анализа экспрессии генов для генов, экспрессия которых значительно повышена или понижен на 25 день дифференцировки в популяции на основе вентральной пластинки, обработанной SHH/FGF8/Chir, по сравнению с популяцией, обработанной только SHH/FGF8________
32126 TFF3 24.0181 3.37Е-14
1209 ASCL1 22.1637 1.69Е-08
9374 HS.19193 14.7045 1.42Е-11
7395 FOXA1 13.8748 2.ЗОЕ-14
- 92 041083
13865 LMX1A 10.953 4.33Е-10
12456 IGFBP5 9.56964 1.58Е-06
4342 COL3A1 9.49528 5.64Е-06
12361 ID3 9.45077 З.ЗЗЕ-08
27988 POSTN 9.10453 7.82Е-11
7396 FOXA2 8.85174 5.07Е-15
3941 CGNL1 8.71553 1.37Е-08
30390 SLC18A1 8.37911 4.77Е-15
5689 EBF1 8.02385 2.37Е-06
2470 C1QL1 7.76325 5.90Е-10
22823 LOC728715 7.73246 1.77Е-09
27665 PITX2 7.32855 7.16Е-15
12655 INSM2 7.04572 4.97Е-11
26250 NR4A2 6.75415 1.28Е-13
8156 GPR177 6.28979 1.08Е-05
13857 LMO3 6.20624 4.64Е-09
33930 ХВР1 5.8436 6.74Е-06
12944 KCNJ16 5.71955 1.37Е-13
27821 PLS3 5.62251 8.45Е-07
5372 DMRTA2 5.61111 8.09Е-12
7988 GNB3 5.55425 2.56Е-12
31669 SULF2 5.51821 6.78Е-08
33128 TTR 5.48234 2.88Е-09
2543 C20ORF56 5.42131 2.00Е-14
32762 TPBG 5.30583 7.23Е-05
436 ADCYAP1 5.20834 1.29Е-09
26977 ОТХ2 5.10526 6.89Е-06
3978 CHGA 5.07311 7.78Е-07
№ колонк и ID колонки Кратное изменен и р-значение
32000 TCF12 5.05883 1.27Е-10
4003 CHN2 4.53859 9.76Е-08
2867 C6ORF141 4.43629 1.97Е-10
32417 ТМЕМ163 4.40645 3.65Е-08
26245 NR2F2 4.38488 8.32Е-05
5036 DDC 4.37185 3.55Е-05
6700 FAT3 4.28732 4.74Е-06
9428 HS.204481 4.25031 1.93Е-09
8288 GRM8 4.16549 1.67Е-06
28590 PTPRO 4.13365 8.06Е-07
32159 TH 4.10876 0.000355952
31361 SPON1 4.063 4.56Е-07
34166 ZFP36L1 4.05459 0.000219198
13689 LDB2 3.9497 1.90Е-08
32057 TEAD2 3.94608 6.68Е-06
12731 IRX3 3.93674 0.000270763
28942 RBM47 3.91109 0.000154758
30066 SERPINF1 3.84276 3.72Е-06
1666 ВМР7 3.83782 1.66Е-05
25444 MSX1 3.74709 3.45Е-05
8593 HES6 3.66092 5.43Е-05
12149 HS.7023 3.65165 0.000170814
30239 SHISA2 3.60636 8.64Е-06
9819 HS.388347 3.52316 1.46Е-08
7564 FZD2 3.48734 3.69Е-06
26928 0SBPL1O 3.44485 1.91Е-07
27664 PITX1 3.40016 5.92Е-06
2743 C3ORF58 3.31658 5.91Е-07
30590 SLC39A8 3.30002 1.28Е-06
32144 TGFBR3 3.28727 6.00Е-09
18750 LOC643911 3.2583 2.43Е-07
17491 LOC440585 3.24609 0.000469294
24375 MFNG 3.24122 3.31Е-07
5346 DLK1 3.21349 0.000161289
7562 FZD1 3.15302 8.07Е-08
3186 CALCA 3.14299 1.75Е-08
27772 PLEKHA5 3.09727 0.000150905
26335 NUAK1 3.08699 1.10Е-05
34155 ZFHX4 3.05463 6.49Е-07
27855 РМР22 3.03785 1.12Е-07
4491 CPVL 3.02972 0.000317992
- 93 041083
7421 FOXJ1 3.01784 0.000461499
2850 C6ORF117 3.00725 3.47E-05
27105 PAPSS2 2.97981 1.49E-05
12358 ID1 2.94361 0.000160308
33004 TSHZ1 2.93637 2.29E-07
5691 EBF3 2.92465 2.26E-05
1086 ARID5B 2.92012 2.33E-06
32769 TPH1 2.88914 4.24E-07
5424 DNAJC19 2.87234 6.43E-09
6208 EVI1 2.86069 2.04E-07
13858 LM04 2.85216 4.81E-05
12733 IRX5 2.84963 0.000139911
5879 ELF1 2.78573 1.43E-06
23752 LRIG1 2.77491 0.000210665
23822 LRRC4C 2.77041 5.37E-07
4780 CXCR4 2.72468 5.12E-07
27696 PKNOX2 2.7166 1.59E-05
31514 ST6GALNAC5 2.70116 0.00012729
32854 TRIL 2.66182 5.76E-06
7617 GADD45G 2.62149 0.000385727
5349 DLL3 2.62131 0.000304562
8399 GULP1 2.58556 2.34E-07
16419 LOC283514 2.55654 7.18E-05
12986 KCNS3 2.51225 3.59E-05
6270 F3 2.50649 4.09E-09
32177 THBS4 2.48547 9.17E-05
6457 FAM181B 2.48092 0.0001071
12644 INPPL1 2.47363 7.08E-06
28624 PVRL3 2.47112 3.32E-05
2885 C6ORF173 2.45642 9.25E-05
25218 MNX1 2.44999 9.15E-08
3835 CEBPD 2.44764 0.000160544
6197 ETS2 2.43482 2.74E-06
8206 GPR98 2.37781 0.000437636
30664 SLC7A2 2.36837 5.80E-11
7853 GINS2 2.3541 7.75E-05
29887 SDC2 2.34674 3.00E-05
27402 PDZRN4 2.29374 2.31E-06
16112 LOC100192378 2.2867 4.57E-06
21088 LOC650494 2.27924 4.94E-06
8583 HERC5 2.27663 2.89E-07
1775 BTG2 2.27014 6.72E-06
30719 SLK 2.24997 3.57E-05
19806 LOC646345 2.232 3.69E-05
25137 MKL2 2.22229 0.00012672
7610 GABRR1 2.21011 2.33E-07
8573 HEPACAM2 2.17226 1.17E-09
29151 RHBDL3 2.16408 5.80E-05
27016 P2RY5 2.16065 5.91E-06
30261 SIAH3 2.14795 3.46E-05
30517 SLC2A8 2.13975 8.81E-05
7457 FREM1 2.12587 7.87E-08
1102 ARL4A 2.11255 0.000248586
29277 RNE128 2.07512 8.41E-06
29124 RGS16 2.06237 7.60E-05
8211 GPRC5C 2.04839 5.12E-05
26002 NGF 2.01869 9.29E-08
33375 UCP2 2.00568 0.000336807
11039 HS.553187 -2.00024 0.000182185
7972 GNAI1 -2.00345 0.000400577
1241 ASTN1 -2.00503 0.000267753
29957 SEL1L3 -2.00817 9.40E-06
9721 HS.348844 -2.06728 9.46E-05
403 ADAMTS5 -2.09516 8.41E-07
5268 DIRAS2 -2.10442 0.000137286
1042 ARHGAP22 -2.11082 9.20E-05
24440 MGC27121 -2.11477 1.75E-08
28124 PPP2R2C -2.12982 0.000152152
2812 C5ORF30 -2.14976 2.66E-06
8046 GOLSYN -2.15553 0.000225269
7626 GAGE12C -2.16085 1.15E-07
728 AMPH -2.19127 7.33E-05
- 94 041083
28104 PPP1R1C -2.2262 3.10E-07
28251 PRKACB -2.27738 6.28E-05
26252 NR5A1 -2.3262 1.83E-08
153 ABAT -2.33538 2.64E-05
28721 RAB3B -2.33887 0.000174687
31151 SNX10 -2.35266 0.000210353
26936 0SBPL8 -2.36481 0.000356878
30232 SHC4 -2.36756 5.88E-06
28689 RAB15 -2.37701 4.57E-05
31222 S0X20T -2.37929 5.44E-06
10203 HS.525171 -2.37949 0.000112764
27287 PCSK1N -2.39396 0.000122619
30200 SH3BGRL2 -2.39696 0.000352607
23918 LY6H -2.3986 0.000426406
31543 STAMBPL1 -2.40424 0.000210764
12256 HSPA12A -2.4161 5.00E-06
12209 HS3ST5 -2.42056 1.64E-08
1764 BTBD3 -2.43171 9.02E-05
32742 TOX2 -2.47449 6.41E-06
896 AP1S2 -2.4814 0.000411095
13764 LHFPL4 -2.49494 0.000177306
12801 ITM2C -2.50635 0.000289334
1641 BLCAP -2.52288 0.000363648
30231 SHC3 -2.53075 2.70E-06
33964 XPR1 -2.55331 2.67E-05
28266 PRKCE -2.55567 1.75E-07
26521 OPTN -2.57271 0.000282119
5325 DKK3 -2.57389 8.27E-05
33325 UBL3 -2.58024 0.000136606
6859 FGF13 -2.58447 3.31E-05
32210 THY1 -2.60259 0.000107047
30015 SEPT6 -2.63038 0.000101624
30351 SLC12A5 -2.64265 0.000195945
607 AKR1C4 -2.66634 0.000217452
7635 GAGE2B -2.67196 4.87E-10
13177 KIAA1598 -2.67619 4.25E-05
1986 C12ORF68 -2.67913 0.000114615
25516 MTSS1 -2.69402 0.000290278
32535 TMEM55A -2.70095 5.71E-06
25864 NDST3 -2.72344 9.29E-06
33591 VAT1 -2.74928 0.000228555
26498 ONECUT1 -2.77372 1.86E-05
12634 INPP1 -2.79095 5.83E-05
5703 ECEL1 -2.83259 0.000107266
16740 LOC387856 -2.84534 0.000116969
5631 DUSP6 -2.85825 8.35E-05
31568 STC1 -2.8677 0.000365825
227 ABLIM2 -2.8948 2.50E-06
27415 PELI2 -2.9135 2.07E-05
2538 C20ORF46 -2.92994 6.05E-05
4639 CSRNP3 -2.9364 6.80E-06
31628 STS-1 -2.94215 9.63E-07
30210 SH3GL3 -2.94559 0.000343973
10017 HS.452398 -3.01786 1.26E-05
4705 CTNND2 -3.02031 4.91E-05
24516 MGST1 -3.02712 1.36E-06
4283 CNR1 -3.13389 0.000271812
13313 KLF6 -3.16185 3.73E-05
7613 GADI -3.18763 0.000116615
29400 RORB -3.1967 5.32E-08
27566 PHYHIPL -3.21046 3.97E-05
25628 MYO16 -3.21287 9.14E-06
25284 MPPED2 -3.23371 0.000114488
30531 SLC32A1 -3.23601 0.000270573
29034 RELN -3.32027 1.95E-05
26058 NKX2-1 -3.35392 4.84E-06
30114 SFRP1 -3.38198 0.00010787
4965 DBC1 -3.3928 1.25E-05
31763 SYT1 -3.47973 0.00017165
29624 RTN1 -3.48718 0.000208889
3121 CAIO -3.49466 0.000217475
24095 MAP4 -3.54296 0.000118613
- 95 041083
9476 HS.223856 -3.61087 5.18E-05
32343 TMEFF2 -3.6559 1.52E-06
713 AMHR2 -3.65957 2.10E-08
28417 PSD2 -3.70127 0.000123589
7106 FLJ33590 -3.74166 4.19E-06
4386 COPG2IT1 -3.9994 7.98E-05
3207 CALY -4.03219 3.21E-06
30824 SNCG -4.48956 2.76E-06
5455 DNER -4.58982 1.95E-05
5550 DRD1IP -4.64486 5.89E-07
26253 NR5A2 -4.70942 1.65E-11
12954 KCNK12 -4.77483 2.25E-06
5352 DLX1 -4.89802 0.000316228
26332 NTS -4.92922 0.000411631
33565 UTS2 -5.26698 2.91E-07
3220 CAMKV -5.35563 1.08E-05
2631 C22ORF42 -5.4488 2.15E-07
29220 RIT2 -5.49937 9.53E-12
31359 SPOCK2 -5.66406 5.68E-06
12746 ISLR2 -5.6746 0.000247482
32591 TMOD1 -5.689 7.66E-12
3215 CAMK2N1 -5.84508 2.30E-06
33592 VAT1L -6.26024 7.74E-07
27971 POMC -6.74106 6.72E-05
26219 NPTX2 -7.85511 1.15E-05
25939 NELLI -8.58778 1.80E-08
33624 VGF -8.61516 1.37E-05
31223 SOX3 -10.3701 8.71E-09
30314 SIX6 -12.5834 1.04E-12
26965 OTP -14.2469 6.08E-10
12743 ISL1 -21.0507 6.48E-05
31479 SST -21.3179 0.000281588
12746 ISLR2 -5.6746 0.000247482
32591 TMOD1 -5.689 7.66E-12
3215 CAMK2N1 -5.84508 2.30E-06
- 96 041083
Таблица 6. показан примерный список антител, применяемых в качестве маркеров, включая концентрацию (т.е. разбавление) антител, применяемых в качестве примера источника антител.
В некоторых вариантах реализации, связанные антитела идентифицировали с применением вторичных антител, конъюгированных с Alexa488, Alexa555 или Alexa647 (Molecular Probes, Carlsbad, Калифорния, США).
В некоторых вариантах реализации применяли вторичные биотинилированные антитела для идентификации связанных первичных антител, с последующей визуализацией ______с применением хромогена DAB (3,3'-диаминобензидина)______
антитело (primary) разбавление источник месторасположения
ядерный антиген человека 1:100 Millipore Billerica, MA
адгезивная молекула клеток человека 1:100 Santa Cruz Santa Cruz, CA
Т ирозингидроксилаза (TH) 1:1000/1:500 Pel-Freez/ImmunoStar Rogers, AR/Hudson,WI
β-тубулин III 1:500/1:2000 Covance Littleton, CO/ Princeton, NJ
даблкаротин 1:100 Millipore Billerica, MA
специфичный лоя человека Nestin 1:300 R&D Minneapolis, MN
Nestin #130 1:50 R. McKay NINDS, NIH
FoxA2 1:100 Santa Cruz Santa Cruz, CA
Pitx3 1:100 Millipore Billerica, MA
β-катенин 1:100 BD Franklin Lakes, NJ
коллаген 1:100 Oncogene LaJolla, CA
цитокертин 1:100 DAKO Glostrup DK
- 97 041083
Oct-4 1:200 Santa Cruz Billerica, MA
Ki-67 1:200/ 1:400 Zymed / DAKO San Francisco, CA
поликлональная GABA 1:2000 Sigma St Louis, MI
серотонин (5-НТ) 1:2000 Sigma St Louis, MI
поликлональная GF АР 1:2000 DAKO Glostrup, DK
калбидин 1:300 Abeam Cambridge, MA
VMAT2 1:200 Millipore Billerica, MA
DAT 1:1000/1:2000 Millipore Billerica, MA
GFP 1:1000 Molecular Probes Carlsbad, CA
Girk2 1:200 Abeam /Alomone Cambridge, MA / Israel
FoxGl 1:100 NeuraCell Rensselaer, NY
Рахб 1:100 Covance Princeton, NJ
Otx2 1:2000 Strategic Diagnostics Newark, DE
Lmxla 1:2000 Millipore Pittsburgh, PA
синапсии 1:1000 Sigma St Louis, MI
Iba-1 1:200 Millipore Billerica, MA
ED-1 1:200 Millipore Pittsburgh, PA
NCAM человека (Eric-1) 1:100 Santa Cruz Santa Cruz, CA
специфичный для человека цитоплазматический (SC-121) 1:1000 Stem Cells Inc. Newark, CA
Nurr-1 1:1500 Perseus Proteomics Япония
- 98 041083
Таблица 7. Примеры предусмотренной дифференцировки в ДА нейроны с ограничением по типу клеток
Тип клеток маркер описание анализа предполагаемы е пределы
FP/ DA среднего мозга FOXA2/L МХ1А ИГХ:_______со- экспрессия (а), в день 13 & день 25; > 50%
валидация количественной
ПЦР-ОТ
предшественник ДА нейронов FOXA2/T Н; TH/NURR1 ИГХ:_______со- экспрессия (а), в день > 25%
25; валидация
количественной
ПЦР-ОТ
Плюрипотентные клетки ОСТ-4; ИГХ: @ в день 25; валидация количественной <2%
ПЦР-ОТ
Пролиферирующие клетки К167 ИГХ < 25 %
предшественник (переднего мозга) FOXG1; РАХ6 ИГХ: @ в день 25; валидация количественной < 10%
ПЦР-ОТ
выход ДА нейронов TH/FOXA 2 ИГХ:_______со- экспрессия (а), в день 25 из ЭСКч, > IDA п/ЭСКч
посеянных в день 0
выживание In vivo THFOXA 2 (in vivo) Гистология in vivo (а), 4 недели после приживления > 2,000 / животное
200 тыс клеток
Таблица 8. Примеры экспериментов по определению значения некоторых факторов в получении ДА нейронов
I l)N <В Н RM CHIR ^НН BDNh GDXl· АД I)hc 1)ДР1 |||||||jj||||||j|j ^ι^^οι·ιΗβ|ΜΗ|ΗΗηΗΜΗηΗ
ИИи111Я । ! is!
i : ! J +as ί ·ί
111111111^^ ||||||||||^^ |||||||||||«^ +/- Р.Д pj'p-Hp 'р j |.\ф f-Р рВ 1ч ΡΡ'ΡΡ'ΡΒΡ'Β аа j Iр.т rrj р ‘р.jλ|.(Ρί:.Ηρ', ·Μ\:‘j рРрр;ф1р ?
' рур-,4 ·ΐ (ΡΗν Η ppp Д фр' ДчД. РД * [ др
- 99 041083
Таблица 9. Примеры способов масштабирования культуры смДА нейронов, в частности, в получении культур уровня GMP для применения в клинике
Пилотный масштаб н ром ежут очи ы й масш ι«ιό ( \ > 1) клинический масш га б
1\1ораЖС1111 :>ic iciiKoniiiiii>i 1 флакон - 1х10б на 6 см чашке 7 флаконов - 7x106 на 15 см х 1 42 флаконов 7x106 на 15 см х 6
Пасса УС 1 клаоеры 1:1 - 1:5 на 6 см чашках 1:1 - 1:5 на 15 см чашках 1:1-1:5 на 15 см чашках
Пассаж 2 клашсры 2 х 15 см чашках 6 х 15 см чашках 36 х 15 см чашках
Пассаж 3 \ccutase (нейральная 11 Н.IX кипя) 1 х 15 см чашке при высокой плотности (приблизительно 3.0x107 клеток) 3 х 15 см чашках при высокой плотности (при близительно 9.0x107 клеток) 18 х 15 см чашках при высокой плотности (приблизительно 5.4 х108 клеток)
Пассаж 4 \кк у ia ;а (день 1 5-20) 1:1 1:1 1:1
Крпоконсерв приблизительно 1.2 х приблизительно 3.6 приблизительно
ання (день 108, при приедположительно 50% потерях после криоконсервации = приблизительно 6 х 107 жизнеспособных клеток х 108, при приедположитель но 50% потерях после криоконсервации = приблизительно 1.8 х 108 жизнеспособных клеток 2.16 х 109, при приедположител ьно 50% потерях после криоконсерваци и = приблизительн о 1 х 109 жизнеспособны х клеток
- 100 041083
Таблица 10. Пример in vivo оценки продуктов лини ЭСКч - состав трансплантата
Тип клеток Маркер Описание анализа Предполагаемые пределы выход ДА нейронов TH FOXA2 ; Тереологическая > 5,000 на i (оценка общего 1200,000 привитых i числа TH/FoxA2 * клеток (ИГХ) в
S трансплантате
Коэффициент пролиферации Ki67 (MIB-1) ИГС на процент от числа клеток К167, общего <1%
Плюрипотентные клетки ОСТ-4 / Nanog ИГХ <0.5%
Серотонинергически е нейроны 5-НТ (серотонин) ИГХ < 1 %
Предшественники FOXGI; РАХ6 ИГХ < 10%
переднего мозга
Производные тератомы Myosin; cytokeratin s; afetoprotein ИГХ <1%
Таблица 11. Пример in vivo оценки продуктов лини ЭСКч - поведенческие тесты
Тест Параметр Описание анализа Предполагаемые пределы
Лефетаминов Общее число Повороты в сторону < 1 ые повороты (*) поворотов/мин повреждения после поворотов/мин {ипси-минус, интраперитонеальной :
контралатеральные) инъекции амфетамина j
Шаговый тест % компенсация контралатеральных шагов /общая компенсация Начало шагания использованием конечности контралатеральной стороне с. 40-50% на ΐ
тест цилиндром с % использование и псилатеральной конечности /общее число Спонтанное ; Мин. исследование ипси- улучшение конечностью по сравнению сравнению с состоянием контралатеральной пересадки конечностью · 20% по с ДО
(*) В некоторых вариантах реализации крысы делают >6 поворотов/мин, стабильно пересаженные трансплантаты.
Экспериментальная часть.
Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации конкретных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения, и не предназначены для ограничения его объема. В последующих описаниях экспериментов применяются следующие сокращения: N (H) (нормальный); М (молярный); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); моль (моль); ммоль (миллимоль); мкмоль (микромоль); нмоль
- 101 041083 (наномоль); пмоль (пикомоль); г (грамм); мг (миллиграмм); мкг (микрограмм); нг (нанограмм); пг (пикограмм); л (литр); мл (миллилитр); мкл (микролитр); см (сантиметр); мм (миллиметр); мкм (микрометр);
нм (нанометр); U (единица); мин (минута); с и сек (секунда); град. (градус); pen (пенициллин), strep (стрептомицин) и °C (градус Цельсия).
Пример I.
Материалы и методы.
Краткое описание методов: Линии человеческих ЭСК (ESC) (H9, H1) и иПСК (2C6 и SeV6) обрабатывали в соответствии с модифицированным протоколом индукции вентральных пластинок (Fasano, и др., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), основанном на двойном ингибировании SMAD (Dual SMAD-inhibition) (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Время воздействия реагентов SHH C25II, пурморфамина, FGF8 и CHIR99021 на вентральные пластинки среднего мозга оптимизировали для получения новых популяций ДА нейронов (см. фиг. 1d). После индукции вентральных пластинок последующее созревание (11-25 дней или дольше 25 дней в культуре до по меньшей мере 100 дней в культуре) осуществляли в среде для дифференцировки на основе Neurobasal/B27 в присутствии факторов выживаемости и созревания ДА нейронов (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), таких как AA, BDNF, GDNF, TGFe3 и dbcAMP (подробности приведены в полном описании метода). Фенотип полученной популяции ДА нейронов тщательно исследовали иммуноцитохимическими методами, методом количественной ОТ-ПЦР, определения глобального профиля экспрессии генов, ВЭЖХ-анализа для определения дофамина и регистрации электрофизиологических характеристик in vitro. Исследования in vivo осуществляли на грызунах с гемипаркинсонизмом (мыши или крысы, которым токсин 6OHDA был введен в одно полушарие мозга). Указанные исследования проводили на невзрослых мышах NOD-SCID IL2Rgc (Jackson labs) и взрослых крысах Sprague Dawley из Taconic Farms, у которых вызывали повреждения 6-гидроксидопамном посредством стереотактических инъекций указанного токсина как описано ранее, а также на двух взрослых макаках-резус, получавших односторонние инъекции MPTP в сонную артерию.
ДА нейроны вводили стереотактически в стриатум указанных животных (150x103 клеток в мышей, 250x103 клеток в крыс) и суммарно 7.5x106 клеток (распределенных в 6 участков; по 3 с каждой стороны мозга) макакам. Поведенческие тесты осуществляли ежемесячно после трансплантации, включая тест на вращение, индуцированное амфетамином, а также тест на фокальную акинезию (stepping test, шаговый тест) и тест на использование конечностей (тест в цилиндре). Крыс и мышей умерщвляли на 18-20 неделе, а приматов - через 1 месяц после трансплантации. Изучение характеристик трансплантатов осуществляли посредством стереологического анализа количества клеток и объема трансплантата, а также посредством тщательного исследования фенотипа с применением иммуногистохимических методов.
ДА нейрон. Линии ЭСКч H9 (WA-09, XX, 27-55 пассажей после 10/2009), H1 (WA-01, XY, 30-40 пассажей после 6/2010) и линии иПСК 2С6 (Kim, и др. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) (XY, 20-30 пассажей) и SeV6 (XY, 20-30 пассажей; получены из эмбриональных фибробластов MRC-5 с применением неинтегрирующей 4-х факторной векторной системы Sendai (Ban, и др. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A (2011) 108(34):1423414239:10,1073/pnas.1103509108, цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) поддерживали на эмбриональных фибробластах мыши при расчетных концентрациях посева в диапазоне от 0,5x103 на см2 до 100x103 на см2 на по ЭС клеткам человека, при которых клетки склонны к образованию кластеров (MEF, Global Stem, Rockville, MD) в оптимальной среде для ЭС клеток человека, содержащей 20% заменителя сыворотки Knockout serum replacement (KSR, Invitrogen, Carlsbad, California) (как описано ранее (Kim, и др. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Используемое количество Knockout serum replacement может варьировать в диапазоне от 0 до 40%.
Индукция нейронов. Для индукции дофаминовых нейронов вентральной пластинки среднего мозга использовали модифицированную версию двойного ингибирования SMAD (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) и протокол индукции вентральных пластинок (Fasano, и др. Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), основанного на обработке в течение определенного времени реагентами LDN-193189 (100 нМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 мкМ, Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542 (10 мкМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 мкМ, Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II (100 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-2000 нг/мл, R&D, Minneapolis, MN), пурморфинамином (2 мкМ (в диапазоне концентраций 10-500 нг/мл, Stemgent), FGF8 (100 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-500 нг/мл, R&D) и CHIR99021 (CHIR; 3 мкМ (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкМ, Stemgent). Замечание: в протоколе индукции вентральных пластинок обработка SHH относится к обработке, т.е. осуществлению контакта, клеток комбинацией SHH C25II 100 нг/мл+пурморфамин (2 мкМ). Клетки высевали (35-40x103 клеток/см2) и выращивали в течение 11 дней на геле matrigel или geltrex
- 102 041083 (использовались в том виде, в котором приобретены) (BD, Franklin Lakes, New Jersey, США) в среде с заменителем сыворотки Knockout serum replacement (KSR), содержащей DMEM, 15% KSR, 2 мМ Lглютамин и 10 мкМ (в диапазоне концентраций 1-25 мкМ) β-меркаптоэтанол. Среду KSR последовательно замещали средой N2, начиная с 5 дня дифференцировки, смешивая их в соотношениях 75%(KSR):25%(N2) на 5-6 день, 50% (KSR):50%(N2) на 7-8 день и 25% (KSR):75% (N2) на 9-10 день, как описано ранее (Chambers, и др. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). На 11 день среду заменяли на среду Neurobasal/B27 (разведение 1:50) /L-Glut-содержащую (эффективный диапазон 0,2-2 мМ) среду (NB/B27; Invitrogen), дополненную CHIR (до 13 дня) и BDNF (полученный из мозга нейротрофный фактор, 20 нг/мл в диапазоне от 5 до 100; R&D), аскорбиновой кислотой (AA; 0,2 мМ (в диапазоне концентраций 0,01-1 мМ), Sigma, St Louis, MI), GDNF (нейтрофный фактор глиальных клеток, 20 нг/мл (в диапазоне концентраций 1-200 нг/мл); R&D), TGFe3 (трансформирующий фактор роста типа β3, 1 нг/мл (в диапазоне концентраций 0,1-25 нг/мл); R&D), дибутирил цАМФ (0,5 мМ (в диапазоне концентраций 0,05-2 мМ); Sigma), и DAPT (10 мМ (в диапазоне концентраций 0,5-50 нМ); Tocris,) в течение 9 дней. На 20 день клетки подвергали диссоциации с применением Accutase® (Innovative Cell Technology, San Diego, California) и пересевали в условиях повышенной плотности клеток (например, 300-400 тыс. клеток/см2) на чашки, предварительно покрытые полиорнитином (PO); 15 мкг/мл (в диапазоне концентраций 1-50 мкг/мл)/ламинином (1 мкг/мл) (в диапазоне концентраций 0,1-10 мкг/мл)/фибронектином (2 мкг/мл (в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл) в среде для дифференцировки (NB/B27+BDNF, AA, GDNF, dbcAMP (в диапазоне концентраций, указанных в настоящем описании), TGFe3 и DAPT (в диапазоне концентраций, указанных в настоящем описании) до достижения желаемой стадии созревания для конкретного эксперимента.
Для индукции ДА нейронов на основе розеток частично использовали ранее описанные протоколы (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) с по меньшей мере одним исключением, когда двойное ингибирование SMAD использовали для ускорения начальной стадии индукции нейронов. Вкратце, ЭСКч индуцировали для нейронного пути развития совместным культивированием с облученными клетками MS5 в среде KSR с добавлением SB431542 и Noggin (250 нг/мл (в диапазоне концентраций 10-1000 нг/мл); R&D), с 28 дней и SHH+FGF8 с 6-11 дней дифференцировки. После 11 дней в среде KSR нейронные розетки собирали вручную и выращивали (стадия P1) в среде N2 с добавлением SHH, FGF8, BDNF и AA как описано ранее (Perrier, и др. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). После 5-7 дней на стадии P1 розетки снова собирали вручную и измельчали в порошок с последующей инкубацией в не содержащем Ca2/Mg2 сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в течение 1 ч и пересевали на чашки, покрытые полиорнитином (РО) / ламинином / фибронектином. Составление паттерна с SHH/FGF8 продолжали в течение 7 дней на стадии P2 с последующей окончательной дифференцировкой в присутствии BDNF, AA, GDNF, TGFb3 и dbcAMP как описано выше до достижения желаемой стадии созревания для конкретного эксперимента (обычно 5-7 дней для экспериментов по трансплантации или 32 дня для функциональных экспериментов in vitro).
Анализ экспрессии генов. Тотальную РНК выделяли в ходе дифференцировки в следующие дни: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 25 для каждого эксперимента с условиями: контроль LSB, LSB/SHH/FGF8 и LSB/SHH/FGF8/CHIR с применением набора RNeasy (Qiagen, Valencia,CA). Для анализа на биочипах тотальную РНК обрабатывали на аппарате MSKCC Genomic core и гибридизовали на биочипах в виде бусин Illumina Human ref-12 в соответствии с инструкцией производителя. Сравнения осуществляли каждый день и для каждого набора условий с применением пакета LIMMA от Bioconductor (worldwideweb.bioconductor.org). Гены, у которых скорректированное значение P было меньше 0,05, а кратность изменения экспрессии была выше двух, считали статистически значимыми. Некоторые из описательных анализов данных на биочипах и представление выполняли с применением коммерчески доступного программного пакета (Partek Genomics Suite (версия 6.10,0915)). Для анализа количественной ОТПЦР тотальную РНК на 25 день для каждого набора условий подвергали обратной транскрипции (Quantitech, Qiagen) и амплифицированный материал анализировали с применением коммерчески доступной тест-системы Taqman gene expression assays (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) с нормировкой данных по HPRT. Каждая точка представляет 9 технических повторов из 3 независимых биологических образцов. Первичные данные экспериментов на биочипах еще не доступны на GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Хирургическое вмешательство у животных. Эксперименты на грызунах и обезьянах осуществляли в соответствии с инструкциями Национального института здравоохранения (NIH), и они были одобрены местным институтским комитетом охраны и использования животных (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC), ведомственным комитетом биобезопасности (Institutional Biosafety Committee, IBC), а также научно-исследовательским комитетом по эмбриональным стволовым клеткам (the Embryonic Stem Cell Research Committee, ESCRO).
Мыши. Мышей, нокаутных по NOD-SCID IL2Rgc (весом 20-35 г; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, США) подвергали анестезии кетамином (90 мг/кг; Akorn, Decatur, IL) и ксилазином (4 мг/кг; Fort
- 103 041083
Dodge, IA). 6-Гидроксидофамин (10 мкг (в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг), 6-OHDA (Sigma-Aldrich) вводили стереотактически в стриатум со следующими координатами (в миллиметрах): AP, 0,5 (от брегмы; в качестве точки отсчета для стереотактического хирургического вмешательства использовали шов черепа); ML, -2,0; DV, -3,0 (от твердой мозговой оболочки, мембраны покрывающей мозг, использовавшейся в в качестве точки отсчета). Мыши с успешными поражениями (в среднем > 6 вращений в минуту) были выбраны для трансплантации. Общее количество 150x103 клеток вводили в объеме 1,5 мкл в стриатум по следующим координатам (в мм): AP, 0,5; ML, -1,8; DV, 3,2. Мышей умерщвляли через 18 недель после трансплантации.
Крысы. Взрослых самок крыс Sprague-Dawley (Taconic, Hudson, NY) (180-230 г) подвергали анестезии кетамином (90 мг/кг) и ксилазином (4 мг/кг) в процессе хирургических процедур. Односторонние повреждения медиального переднемозгового пучка нигростриального пути были получены стереотаксической инъекцией 6-OHDA (3,6 мг/мл в 0,2% аскорбиновой кислоте и 0,9% солевом растворе, Sigma) в двух местах (Studer, и др. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Крыс отбирали для трансплантации, если количество вращений, индуцированных амфетамином, превышало 6 вращений в минуту через 6-8 недель после инъекции. 250x103 клеток трансплантировали в стриатум каждого животного (Координаты: AP +1,0 мм, мл -2,5 мм и V-4,7 мм; гребенка установлена на -2,5). Контрольные животные получали вместо этого ФБР. Хирургические процедуры описаны ранее (Studer, и др. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Ежедневные внутрибрюшинные инъекции циклоспорина 15 мг/кг (Bedford Labs, Bedford, OH) были начаты за 24 ч перед трансплантацией клеток и продолжались до умерщвления, через 20 недель после трансплантации клеток.
Приматы. Двух взрослых (17-18 лет; 10-12 кг; самки) макак-резус приводили в состояние гемипаркинсонизма введением MPTP в сонную артерию с последующим еженедельным внутривенным введением MPTP для создания двустороннего паркинсоновского синдрома (Kordower, и др. Science 290:767-773 (2000), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). У обоих животных наблюдались паркинсоновские симптомы, согласующиеся с повреждениями от средней до сильной тяжести, основанные на анализе поведения, включая искривленную осанку, подволакивание ноги и симптомы мышечной ригидности (непластичность движений), пренебрежения (моторное восприятие латерального стимула) и брадикинезия (замедленная инициация движения). Эти параметры могут быть оценены на обезьянах с применением модифицированной паркинсоновской клинической шкалы оценки (CRS). В день операции по трансплантации животным вводили транквилизатор кетамин (3,0 мг/кг внутримышечно) и дексдомитора (0,02-0,04 мг/кг внутримышечно), интубировали, чтобы поддерживать стабильную вентиляцию дыхательных путей и подвергали анестезии изофлураном. Затем их помещали в стереотактическую рамку для хирургического вмешательства. Обеих макак-резус подвергали операции однократно с тремя внутричерепными инъекциями культур ДА, полученны из вентральных пластинок человека, основываясь на стереотаксических координатах (Paxinos, и др. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press, 2000), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Двусторонние инъекции клеток (10 мкл в инъекции; 125,000 клеток/мкл) осуществляли в три положения (1 - задний хвостовой придаток, 2-пре-комиссуральную скорлупу и вышележащее белое вещество) общим объемом 30 мкл на полушарие. Использовали инфузионный насос, присоединенный к стереотаксическому микроманипулятору, для доставки клеток на скорости 1 мкл/мин посредством шприца Hamilton объемом 50 мкл с иглой 28 G. После завершения инъекций иглу оставляли на месте на 2-5 мин, чтобы инфузат смог диффундировать из наконечника шприца, а затем медленно извлекали шприц. Немедленно после хирургического воздействия животные получали анальгетик (бупренекс, 0,01 мг/кг внутримышечно, два раза в день в течение 72 ч после хирургического вмешательсва; мелоксикам, 0,1 мг/кг подкожно, один раз в день в течение 72 ч после хирургического вмешательсва), а также антибиотик (цефазолин, 25 мг/кг внутримышечно, два раза в день) в течение 72 ч после хирургического вмешательсва. Животные получали циклоспоррин A (Neoral, Sandimmune) орально (30 мг/кг со снижением до 15 мг/кг) ежедневно, начиная за 48 ч до хирургического вмешательства и до момента умерщвеления, в течение одного месяца после трансплантации.
Поведенческие тесты. Тест на вращение, индуцированное амфетамином, (мыши и крысы) и тест на фокальную акинезию (крысы) проводили перед трансплантацией и через 4, 8, 12, 18 недель после трансплантации. Вращательное поведение у мышей регистрировали через 10 мин после внутрибрюшинной инъекции d-амфетамина (10 мг/кг, Sigma) и записывали в течение 30 мин. Вращательное поведение у крыс записывали в течение 40 мин после внутрибрюшинной инъекции d-амфетамина (5 мг/кг) и автоматически оценивали с помощью системы TSE VideoMot2 (Germany). Данные были представлены в виде среднего количества поворотов в минуту. Тест на фокальную акинезию был модифицирован по сравнению с описанием у Blume et al. Exp. Neurol. 219:208-211 (2009) и Crawley, и др. What's Wrong With My Mouse: Behavioral Phenotyping of Transgenic и Knockout Mice (Wiley-Liss, 2000), каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, каждую крысу помещали на плоскую поверхность; ее задние ноги поднимали за счет мягкого подъема хвоста так, чтобы передние лапы касались
- 104 041083 стола. Экспериментатор тянул крысу назад на расстояние 1 метр с постоянной скоростью. Подсчитывали число компенсирующих шагов как контралатеральной, так и ипсилатеральной лапами. Данные представляли как процент числа компенсирующих шагов контралатеральной лапой/количество компенсирующих шагов контралатеральной лапой + число шагов ипсилатеральной лапой. Тест в цилиндре осуществляли, помещая каждое животное в стеклянный цилиндр и считая количество касании стенки цилидндра ипсилатеральной лапой количеству касаний контралатеральной лапой (на 20 касаний), как описано ранее (Tabar, и др. Nature Med. 14:379-381 (2008), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки).
Обработка тканей.
Мыши и крысы: Животные (мыши и крысы) получали повышенную дозу пентобарбитала (50 мг/кг) внутрибрюшинно для индукции глубокой анестезии, а затем им осуществляли перфузию 4% параформальдегидом (PFA). Мозг извлекали, фиксировали в 4% ПФА, а затем вымачивали в 30% растворе сахарозы в течение 2-5 дней. Срезы получали с помощью криостата после введения O.C.T. (Sakura-Finetek, Torrance, California).
Приматы: Животных умерщвляли после глубокой анестезии кетамином (10 мг/кг, внутримышечно (IM)) и пентобарбиталом (25 мг/кг, внутривенно (IV)) последством сердечной инфузии с 0,9% салином с гепарином с последующим введением свежего холодного фиксирующего раствора 4% PFA (pH7.4). Немедленно после первичной фиксации, мозги извлекали из черепа и осуществляли последующую фиксацию погружением в 4% PFA на 24-36 ч. Затем их промывали и выдерживали в 10% сахарозе в качалке с медленным перемешиванием при 4°C, позволяя им погружаться. Затем процесс повторяли в 20% сахарозе и 30% сахарозе. Цельные мозги коронально разрезали на последовательные срезы толщиной 40 мкм на холодном санном микротоме и хранили в состоянии сводобного плавания в криоконсервирующей среде при -20°C.
Иммуногистохимия: Клетки фиксировали в 4% PFA и блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) с 0,3% Тритоном. Секции тканей мозга отмывали в холодном PBS и обрабатывали одинаковым образом. Первичные антитела разбавляли в 1-5% BSA или нормализованной козьей сыворотки и инкубировали в соответствии с рекомендациями производителя. Полный список антител и источников приведен в табл. 6. Подходящие вторичные антитела, конъюгированные с Alexa488, Alexa555 и Alexa647 (Molecular Probes, Carlsbad, California), использовали с ядерным контрастным красителем 4',6диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Thermo Fisher, Rockford, Illinois). Для некоторых анализов использовали биотинилированные антитела с последующей визуализацией с помощью хромогена DAB (3,3'диаминобензидин).
Анализ ВЭЖХ. Для измерения уровней дофамина, гомованилиновой кислоты (HVA) и DOPAC (3,4дигидроксифенилуксусной кислоты) проводили обращенно-фазовую ВЭЖХ с электрохимической детекцией как описано ранее (Roy, и др. Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer, и др. Brain Res. Bull. 41:143150 (1996), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). Образцы культур отбирали в перхлорную кислоту на 65 день дифференцировки. В некоторых экспериментах DA измеряли непосредственно в среде с применением той же системы обнаружения, но с последующей экстракцией дофамина и его метаболитов с применением коммерчески доступного набора, как описано ранее (Studer, и др. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки).
Регистрация электрофизиологических параметров: Культуры переносили в регистрирующую камеру на прямой микроском, оборудованный 40X водоиммерсионным объективом (Eclipse E600FN; Nikon); культуры перфузировали физраствором, содержащим, в мМ: 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO4, 2 CaCl, 1 MgCl2 и25 глюкозы (34°C; насыщенным 95% O2-5% CO2; pH 7.4; 298 мОсм/л). Скорость потока физраствора составляла 2-3 мл/мин при пропускании через втроенный нагреватель (SH-27B с контроллером TC-324B; Warner Instruments). Нейроны визуализировали методом видео-микроскопии с охлажаемоей цифровой ПЗС-камерой (CoolSNAP ES2, Photometries, Rona Scientific, Tucson, Arizona, США). Для регистрации электрофизиологических параметров отбирали клетки, похожие по форме на нейроны, с хорошим ветвлением дендритов. Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) на целых соматических клетках в текущей конфигурации фиксации осуществляли с применением усилителя MultiClamp 700B (Molecular Devices). Сигналы фильтровли в диапазоне 1-4 кГц и оцифровывали на 5-20 к ГЦ с применением Digidata 1440A (Molecular Devices). Регистрирующие контактные электроды были выполнены из волокна из боросиликатного волокна (Sutter Instruments), вытянутого на пуллере FlamingBrown (P-97, Sutter Instruments) иимели сопротивление 4-6 MOM в ванне. Электроды заполняли внутренним раствором, содержащим в мМ: 135 K-MeSO4, 5 KCl, 5 HEPES, 0,25 EGTA, 10 фосфокреатинади(трис), 2 АТФ-Mg и 0,5 ГТФ-Na (pH 7,3, осмолярность доводили до 290-300 мосм/л). Мостиковый усилитель настраивали таким образом, чтобы компенсировать сопротивление электродов, и следили за ним. Емкость электродов компенсировали. Если последовательное соединение возрастало >20% в ходе фиксации потенциала данные отбрасывали, поскольку повышение сопративление указывает на частичные технические неполадки в ходе измерения.
Подсчет клеток и стереологические анализы. Процентную долю клеток, положительных по марке
- 105 041083 ру, на вентральной пластинке (день 11), фиг. 1, предшественников дофаминовых нейронов среднего мозга (день 25), фиг. 2, и на стадии зрелых ДА нейроно (день 50 или позже), фиг. 3 и 11, определяли в образцах, полученных в по меньшей мере 3 незавичимых экспериментах для каждого. Изображения для подсчета выбирали случайным образом (равномерное распределение), каждое изображение оценивали сначало по числу DAPI-положительных ядер, после чего подсчитывали число клеток, экспрессирующих представляющий интерес маркер. Данные представлены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего). Количество человеческих клеток (идентифицируемых при помощи анти-hNA) и TH+ нейронов в трансплантате освеществляли подсчитывали на каждом десятом срезе, если удавлось определить трансплантат. Количество клеток и объем трансплантата определяли с применением оптического зонда аппарата для фракционного зондирования и оценочного устройства Cavalieri с применением программы Stereo Investigator software (MBF bioscience, Vermont, США) как описано у Tabar, et al. Nat. Biotechnol. 23:601-606 (2005); цитируемый источник включен в настоящий текст посредством ссылки. Данные представлены в форме оценочного общего числа клеток и общего объема трансплантата+/-стандартная ошибка среднего (SEM). Приведенные ниже составы характеризуют примеры среды для культивирования клеток для реализации настоящих изобретений.
Приведенные ниже составы характеризуют примеры среды для культивирования клеток для реализации настоящих изобретений.
Поддерживающая среда для ЭСКч (1 л): 800 мл DMEM/F12, 200 мл заменителя сыворотвки Knockout Serum Replacement, 5 мл 200 мМ L-глютамина, 5 мл Pen/Strep, 10 мл 10 мМ раствора 15 ненезаменимых аминокислот в минимальной среде MEM, 55 мкМ 13-меркаптоэтанола, и ФРФ-бета (bFGF, конечная концентрация 4 нг/мл).
Среда KSR для дифференцировки ЭСКч (1 л): 820 мл среды Knock out DMEM, 150 мл заменителя сыворотки Knock out Serum Replacement, 10 мл 200 мМ L-глютамина, 10 мл Pen/Strep, 10 мл 10 мМ MEM и 55 мкМ 13-меркаптоэтанола.
Среда N2 для дифференцировки ЭСКч (1 л): 985 мл дистиллированной H2O с порошком DMEM/F12, 1,55 г глюкозы (Sigma, № по каталогу G7021), 2,00 г бикарбоната натрия (Sigma, № по каталогу S5761), путресцин (аликвота объемом 100 мкл из раствора 1,61 грамм в 100 мл дистиллированной воды; Sigma, № по каталогу P5780), прогестерон (аликвота 20 мкл раствора 0,032 грамм в 100 мл 100% этанола; Sigma, № по каталогу P8783), селенит натрия (аликвота объемом 60 0,5 мМ раствора в дистиллированной воде; Bioshop Canada, № по каталогу SEL888), и 100 мг трансферрина (Celliance/Millipore, № по каталогу 4452-01), и 25 мг инсулина (Sigma, № по каталогу 16634) в 10 мл 5 мМ NaOH.
Среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% ФБС для приготовления PMEF ((первичных мышиных эмбриональных фибробластов (PMEF)) - фидерных клеток) (1 л): 885 мл среды DMEM, 100 мл ФБС, 10 мл Pen/Strep и 5 мл L-глютамина.
Минимальная поддерживающая среда Alpha (MEM) с 10% ФБС для приготовления среды для фидерных клеток MS-5 (1 л): 890 мл Alpha MEM, 100 мл ФБС, 10 мл раствора желатина с Pen/Strep (500 мл): Растворяют 0.5 желатина в 500 мл теплой (50-60°C) воды Milli-Q. Охлажадют до комнатной температуры.
Пример II.
В настоящем примере описано обнаружение малых молекул и установление времени обработки для обеспечения направленной дифференцировки нейронов FOXA2+LMX1A+DA согласно настоящему изобретению.
Следующее описание является кратким изложением некоторых экспериментальных находок, описанных в заявке: Обработка клеток, подвергнутых двойному ингибированию SMAD, агонистами SHH (пурморфамин+SHH) и FGF8 (S/F8) в отсутствие CHIR99021 обеспечивала значительное понижение экспрессии FOXA2 на 11 день и полное отсутствие экспрессии LMX1A (фиг. 1a, b). Предшествующий маркер OTX2 был сильно индуцирован в культурах, обработанных LSB и LSB/S/F8/CHIR, но не в условиях LSB/S/F8 (фиг. 1a, c).
Авторы настоящего изобретения ранее использовали несколько других методов направленной дифференцировки, которые приводили к получению популяции клеток, содержащих ДА-подобные нейроны. Эти ДА-подобные нейроны использовали в экспериментах по трансплантации, которые выявили проблемы при дальнейшем использовании этих клеток в терапевтических приложениях. Например, процедуры, описанные у Perrier и др., 2004 и Fasano и др., 2010, включая индукцию нейронов MS5, привели к получению розеткообразных структур клеток и были использованы для получения предшественников на 11 день, см. например, фиг. 2, 16 и 17, которые в дальнейшем были использованы для получения ДАподобных нейронов. Эти нейроны были получены из низкого процента клеток-предшественников из популяций клеток на 11 день. Эксперименты по трансплантации, в которых использовали эти нейроны, продемонстрирвали плохую выживаемость после трансплантации и потерю фенотипа ДА-подобных нейронов в дополнение к наблюдаемому после трансплантации образованию неприемлемых типов нейронов вместе с утратой контроля роста, что приводило к развитию тератом. См. фиг. 16 и 17.
В частности, ЭСКч клетки в фазе P0 приводили в контакт с молекулами для начала нейронной индукции клеток Oct4+ в клетки розеткообразных структур с применением фидерных клеток MS5 (Perrier и
- 106 041083 др., 2004). На стадии P1 клетки розеткообразных структур развивались в результате контакта клеток с дополнительными молекулами для дифференцировки клеток в клетки стадии P2 с характерным паттерном экспрессии, включая клетки-предшественники Pax2+/En1+DA, и затем дифференцировались в нейроны ТН+/Еп1+ДА. Эти клетки использовали для приживления трансплантата у крыс с вызванными 6OHDA повреждениями и иммуносупрессией, индуцированной цикоспорином A. Описанные эксперименты по трансплантации показали плохую выживаемость in vivo, потерю фенотипа TH+, проблемы, связанные с дальнейшим разрастанием в нежелательные, возможно летальные, клетки, такие как тератомы, и ростом в неприемлемые типы нейронов, которые могут вызвать дополнительные медицинские проблемы у пациента.
Наблюдалось очень маленькое количество выживших TH+ нейронов через 4,5 месяца после трансплантации (<50 TH+ клеток/животное) в трансплантатах из предшественников ДА нейронов, полученных из рощ структур, фиг. 16A. Однако в противоположность клеткам TH+, клетки, маркированные GFP (GFP находился под контролем убиквитарного промотора), показали довольно хорошую выживаемость после трансплантации. Это говорило о том, что клетками с наиболее хорошей выживаемостью были нейронные клетки, не относящиеся к ДА нейронам (16B). Несколько клеток, полученных из трансплантата (hNA+, зеленые), одновременно экспрессировали TH (красные), что также говорило о том, что большинство трансплантированных клеток человека относятся к фенотипам нейронов, не являющихся ДА нейронами, фиг. 16C. Секции фиг. 16D-E показывают, что, несмотря на очень плохую выживаемость in vivo, наблюдалось некоторое улучшение (варьируемое в низкой и высокой степени) в нескольких тестах поведения, таких как тест на вращение, индуцированное амфетамином, (D), тест в цилиндре и спонтанные вращения (E).
Индукцию нейронов без питающих клеток осуществляли как описано ранее (Chambers и др., 2009), но с модификациями для получения клеток вентральных пластинок (Fasano и др., 2010). При использовании модифицированного способа двойного ингибирования SMAD для дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки вентральной пластинки авторы настоящего исследования ранее обнаружили, что для индукции FP на 11 день требовались высокие концентрации SHH. Например, в некоторых вариантах осуществления добавляли Sonic С25П в концентрации 200 нг/мл. В некоторых экспериментах добавляли DKK-1 (R&D; 100 нг/мл), FGF8 (R&D; 50 нг/мл), Wnt-1 (Peprotech; 50 нг/мл) и ретиноевую кислоту (R&D; 1 мМ), см. фиг. 17. При этом ни одна из популяций клеток, полученных с применением ранее известных методов, не содержала на 11 день высокий процент предшественников клеток FOXA2+/LMX1A+ вентральных пластинок среднего мозга, получаемых с применением способа согласно настоящему изобретению.
Как показано в настоящем описании, популяция клеток, содержащая плюрипотентные клетки, была выбрана авторами настоящего изобретения в качестве исходной популяции и посеяна в день 0. Перед дифференцировкой клетки выращивали до состояния, близкого к полной заселенности (между 60-100% конфлюентности). Эти клетки приводили в контакт с двойными ингибиторами SMAD (т.е. обрабатывали LDN-193189+SB431542=LSB) в день 0. Авторы настоящего изобретения поддерживали популяцию клеток с периодической подкормкой, содержащей свежий LSB до 11 дня и обнаружили, что некоторые из оставшихся клеток были LMX1A+, но не экспрессировали FOXA2 (фиг. 1a, b). Авторы посеяли дубликат исходной популяции клеток, а затем протестировали тип клеток (т.е. паттерны экспрессии генов/белков) после обработки смесями, содержащими любой из следующих агонистов SHH (пурморфамин+SHH) и FGF8 (S/F8), приводившихся в контакт с клетками в различных режимах обработки, т.е. контактировавшими с клетками в день 0, или 1 день, или 2 день, и т.д. в течение определенного периода времени, т.е. 24 ч, 48 ч и т.д. Исследовали три первичных примера условий культивирования, а именно: 1) клетки контактировали с LDN/SB (LSB) в день 0, затем контактировали со свежим LSB до 5 дня, на 5 день клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11го дня, 2) клетки контактировали с LDN/SB (LSB) в день 0, затем контактировали со свежим LSB до 5 дня, на 5 день клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11 дня, при этом в течение этого времени клетки дополнительно контактировали со свежим пурморфамином, SHH и FGF8 до 7 дня, и 3) клетки приводили в контакт с LDN/SB (LSB) в день 0, затем приводили в контакт со свежим LSB до 5 дня, на 5 день клетки приводили в контакт со свежим LDN без SB до 11 дня, при этом в течение этого времени клетки дополнительно контактировали со свежим пурморфамином, SHH и FGF8 до 7 дня, а также дополнительно контактировали со свежим CHIR, начиная с 3 дня культивирования до 11 дня с несколькими вариациями этих первичных условий. Эти эксперименты были направлены на определение оптимального выхода типов клеток. Систематические сравнения этих трех условий культивирования (фиг. 1d) осуществляли, путем определения глобального временного профиля экспрессии генов. См. примеры на фиг. 8 и табл. 1-6. Иерархическое выделение кластеров дифференциально экспрессировавшихся генов позволило различать эти три набора условий обработки на 11 день дифференцировки (фиг. 8a). FOXA1, FOXA2 и несколько других мишеней SHH ниже по каскады, включая PTCH1, были среди наиболее дифференциально регулировавшихся транскриптов в LSB/S/F8/CHIR в сравнении с наборами обработки LSB (фиг. 1e). Экспрессия LMX1A, NGN2, и DDC указывала на предопределенность пути развития в предшественника ДА нейрона среднего мозга уже на 11 день (фиг. 1e, f). В отличие от этого, культуры LSB на 11 день были обогащены
- 107 041083 маркерами предшественников дорсального заднего мозга, такими как HES5, PAX6, LHX2, и EMX2. Прямое сравнение LSB/S/F8/CHIR с обработкой LSB/S/F8 (фиг. 1f) подтвердило селективное обогащение маркеров предшественников ДА нейронов среднего мозга в группе LSB/S/F8/CHIR и указывало на идентичность предшественников гипоталамуса в культурах, обработанных LSB/S/F8, на основании дифференциальной экспрессии RAX1, SIX3, и SIX6 (см. также экспрессию POMC, OTP на фиг. 2D). Примеры списков дифференциально экспрессировавшихся транскриптов на 11 день приведены в табл. 1, 2 и на 25 день в табл. 3-5, а онтологический анализ генов - на фиг. 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov), подтверждая обогащение канонического сигнального пути WNT при обработке CHIR. Первичные данные еще недоступны на GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/accession#: [TBD]). Сравнительный временной анализ экспрессии генов маркеров предшественников ДА среднего мозга (фиг. 1g) с маркерами пути развития передних и вентральных нейронов, не являющихся ДА (фиг. 1h), привел к выявлению трех типов индукции: i) LSB: дорсальный задний мозг; ii) LSB/S/F8: вентральный/гипоталамический и iii) LSB/S/F8/CHIR: идентичный предшественнику DA среднего мозга.
Пример III.
Дифференцировка ДА нейронов. Для дальнейшей дифференцировки клетки-предшественники содержали в среде для созревания нейронов (BAGCT - см. Материалы и методы). Проводили следующие виды сравнений между популяциями дифференцировавших клеток, полученных ранее известными методами и методами согласно настоящему изобретению: A) Иммуноцитохимический анализ на 50 день дифференцировки для TH в сомбинации с LMX1A, FOXA2 и NURR1, B) Подсчет клеток TH+, FOXA2+, LMX1+, и NURR1+ среди общего количества клеток, сравнивая культуры, полученные из розеткообразных структур, с культурами, полученными из вентральных пластинок (LSB/S/F8/CHIR), C) Подсчет процентов подтипов нейронов серотонин+ (5-НТ), и GABA+ (примесь нейронов, не являющихся ДА) на 50 день в культуре, полученной из вентральных пластинок, и культуре ДА нейронов, полученных из розеткообразных структур, и D) Анализ ВЭЖХ для измерения дофамина и метаболитов: сравнение уровней ДА, DOPAC и HVA между культурой из вентральных пластинок и культурой, полученной из розеткообразных структур. К 25 дню в трех популяциях клеток образовывались Tuj1+ нейроны (фиг. 2A) и клетки, экспрессирующие TH, фермент, ограничивающий скорость синтеза ДА. Однако обработка LSB/S/F8/CHIR привела к образованию TH+ клеток, которые одновременно экспрессировали LMX1A и FOXA2, и у которых наблюдалась сильная индукция ядерного рецептора NURR1 (NR4A2) (фиг. 2A, B). Сравнение экспрессии генов в культурах на 13 день и 25 день подтвердило сильную индукцию других постмитотических маркеров ДА нейронов (фиг. 2C). Характеристика идентичности ДА нейронов на 25 день в сравнении с культурами, обработанными LSB и LSB/S/F8, подтвердило обогащение по известным транскриптам ДА нейронов среднего мозга и выявило множество новых кандидатов в маркеры (фиг. 2D, табл. 3-5, фиг. 8b). Например, наиболее обогащенным транскриптом в LSB/S/F8/CHIR (группа DA среднего мозга) был TTF3, ген, который ранее не ассоциировался с развитием ДА нейронов среднего мозга, но экспрессирующийся в высокой степени в черном веществе человека (фиг. 8c; Allen Brain Atlas: http: //human.brain-map .org).
Схожие данные были получены для EBF-1, EBF-3 (фиг. 8c), а также для TTR, известной транскрипционной мишени для FOXA2 в печени. Данные, полученные в ходе разработки настоящего изобретения, указывали на обогащение нескольких генов PITX клетках-предшественниках DA среднего мозга. PITX3, классический маркер ДА нейронов среднего мозга, также сильно экспрессировался на 25 день дифференцировки (фиг. 2E). Наконец, индукция как вентральных пластинок среднего мозга, так и ДА нейронов может быть легко воспроизведена в независимых линиях hESC и hiPSC (фиг. 9). Данные, приведенные в настоящем описании, продемонстрировали, что протокол LSB/S/F8/CHIR, в противоположность другим протестированным протоколам, позволяет получить клетки, экспрессирующие совокупность маркеров, соответствующую пути развития ДА нейронов среднего мозга.
Свойства ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, in vitro и in vivo сравнивали с ДАподобными нейронами, полученными с применением промежуточных розеткообразных нейронных структур (фиг. 10 и 16). Получение розеткообразных нейронных структур в настоящее время является наиболее широко используемой стратегией получения нейронов ДА нейроны из ПСКч. Протоколы, основанные как на вентральных пластинках, так и на розеткообразных структурах были эффективными при получении TH+ нейронов, обладающих длительной жизнеспособностью in vitro (50 дней дифференцировки; фиг. 3a). Однако процент клеток TH+ был значительно выше в культурах, полученных на основе вентральных пластинок (фиг. 3b). Хотя у клеток TH+ в обоих протоколах обнаружили одновременную экспрессию NURR1, ДА нейроны, полученные на основе вентральных пластинок одновременно экспрессировали FOXA2 и LMX1A (фиг. 3 a, b).
Было обнаружено несколько GABA- и серотонин (5-НТ)-положительных ДА нейронов (фиг. 3c), также его метаболиты DOPAC и HVA присутствовали в культурах, полученных как по одному, так и по второму протоколу, но уровни ДА были примерно в 8 раз выше в культурах вентральных пластинок (фиг. 3d, e). ДА нейроны среднего мозга демонстрировали сильное разрастание волокон и сильную экспрессию нейронных маркеров созревания, включая синапсин, транспортер дофамина (DAT), и сопряженный с G-белком калиевый канал входящего выпрямления Kir3.2, также называемый GIRK2, экспрес
- 108 041083 сирующийся в ДА нейронах компактной части черного тела (substantia nigra pars compacta, SNpc) (фиг. 3f, 11). ДА нейроны SNpc in vivo проявляют электрофизиологический фенотип, отличает их от большинства других нейронов в мозге. В частности, они с небольшой частотой генерируют спонтанные пики (1-3 Гц). Более того, такая генерировать редкие пики дополняется медленным подпороговым колебательным потенциалом. После 2-3 недель in vitro, такие же физиологические признаки демонстрировали ДА нейроны SNpc, выращенные из ранних постнатальных мышей. ДА нейроны, дифференцированные из ЭСКч клеток устойчиво (4/4) демонстрировали этот отличительный физиологический фенотип (фиг. 3g-i).
Поддержание ДА нейронов мыши in vitro до 65 дня показало, что TH-положительные нейроны продолжают экспрессировать FoxA2 и имеют протяженные волокна, типичные для ДА нейронов мыши, фиг. 3a. Измерение высвобождения ДА методом ВЭЖХ показало, что TH+ нейроны возрастом 65 дней являются функциональными in vitro, фиг. 3b.
ПримерIV.
Приживление новых популяций клеток ДА нейронов у грызунов, а именно мышей и крыс с поврежденными нейронами.
Одной из сложных задач в данной области является возможность получения из ПСКч клеток ДА нейронов среднего мозга, которые функционально приживаются in vivo без риска избыточного роста нейронов или неприемлемой дифференцировки в нейроны, не являющиеся нейронами среднего мозга, или образования тератом. На основании изучения трансплантации эмбриональных тканей авторы настоящего изобретения предположили, что время окончания клеточного цикла, маркером которого является экспрессия NURR1, может быть подходящей стадией для трансплантации (приблизительно 25 день дифференцировки, фиг. 2). Начальные эксперименты с применением клеток на 25 день на взрослых мышах без повреждений показали высокую выживаемость нейронов FOXA2+/TH+, полученных из ПСКч клеток, через 6 недель после трансплантации (фиг. 12). Проверяли долгосрочную выживаемость клеток FOXA2+/TH+ в реципиентах с паркинсонизмом без последующего разрастания нейронов. Для этой цели с помощью 6-гидроксидофамина (6-OHDA) создавали повреждения (Tabar, и др. Nature Med. 14:379-381 (2008), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) в нокаутных по NODSCID IL2Rgc мышах, линии, которая эффективно обеспечивает выживаемость ксенотрансплантата с особенной чувствительностью к воздействию редкими онкогенным клетками (Quintana, и др. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Культуры ДА нейронов, как полученных из вентральных пластинок, так и из розеткообразных структур, трансплантировали (150х103/животное) без предварительной очистки с целью выявления потенциальных загрязняющих клеток с высоким пролиферативным потенциалом. Через четыре с половиной месяца после трансплантации трансплантаты ДА нейронов, полученные из вентральных пластинок, показали хорошо сформированное ядро трансплантата, состоящее из TH+ клеток, одновременно экспрессирующих FOXA2 и специфический маркер hNCAM человека (фиг. 4a-c). Функциональный анализ показал устранение поведения с вращением, индуцированного амфетаминами. В отличие от этого, в трансплантатах ДА нейронов, полученных из розеткообразных структур, обнаружилось только несколько TH+ нейронов, и они не вызывали значительного облегчения поведения с вращением (фиг. 4d), а также было выявлено массивное разрастание нейронов (объем трансплантата >20 мм3; фиг. 13). Обширное разрастание нейронов, полученных из розеткообразных структур, использовавшихся при трансплантации, как описано в настоящей заявке, сравнивали с предыдущими работами с трансплантатами ДА, полученными из розеткообразных структур, группы авторов настоящего изобретения (Kim, и др. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки) и others (Hargus, и др. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Разрастание наблюдалось, вероятно, ввиду более продолжительных периодов выживаемости (4,5 месяца в сравнении с 6 неделями), отсутствием очистки методом FACS перед трансплантацией и выбором нокаутных по NOD-SCID IL2Rgc реципиентов. Количество пролиферирующих Ki67+ клеток было минимальным в трансплантатах, полученных из вентральных пластинок (<1% от общего количества клеток), в то время как трансплантаты, полученные из розеткообразных структур, содержали очаги пролиферирующих предшественников нейронов. Предположили, что разрастание нейронов было вызвано примитивными нейроэктодермальными клетками-прешественниками в трансплантате (Elkabetz, и др. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:16707-16712 (2008), цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки). Эта гипотеза подтверждалась экспрессией маркера FOXG1 переднего мозга в трансплантатах, полученных из розеткообразных структур, а не из вентральных пластинок. Небольшой процент астроглиальных клеток присутствовал как в трансплантатах, полученных из вентральных пластинок, так и в трансплантатах, полученных из розеткообразных структур, хотя большинство клеток GFAP+ не содержало маркеров человека, указывающих на происхождение реципиентов (фиг. 13).
Результаты, полученные на нокаутных по NOD-SCID IL2Rgc мышах, описанные в настоящей заявке, продемонстрировали высокую продолжительную выживаемость FOXA2+/TH+ нейронов, полное об
- 109 041083 ращение поведения с вращением, индуцированного амфетамином, и отсутствие каких-либо признаков разрастания нейронов. Однако некоторые из этих результатов могут быть характерны конкретно для использования нокуатных по NOD-SCID IL2Rgc мышей. Для проверки этой гипотезы культуры ДА нейронов, полученных из вентральных пластинок, (250x103 клеток) трансплантировали взрослым крысам с повреждениями, вызванными 6-OHDA, подвергнутых фармакологической иммуносупрессии с применением циклоспорина A. Через пять месяцев после трансплантации выживаемость трансплантата была высокой (фиг. 4e-h) со средним значением более 15000 TH+ клеток, одновременно экспрессирующих FOXA2 (фиг. 4g), и ядерный антиген человека (hNA) (фиг. 4e); волокна TH+/hNCAM+ распространялись из ядра трансплантата в окружающий его стриатум реципиента (фиг. 4f). В дополнение к FOXA2, TH+ клетки экспрессировали маркеры PITX3 и NURR1 ДА нейронов среднего мозга (фиг. 4h-j). Исследования поведения показали полное устранение асимметрии вращения, индуцированного амфетамином, в отличие от животных с фиктивной трансплантацией, которые не показали какого-либо улучшения (фиг. 4k). Животные, подвергнутые трансплантации, также продемонстрировали улучшения в тесте на фокальную акинезию (фиг. 4l) с измерением акинезии передних конечностей и в тесте с цилиндром (фиг. 4m), исследованиях, не зависящих от фармакологической стимуляции ДА системы. Позднее начало выздоровления (приблизительно 3-4 месяца после трансплантации) ожидается для ДА нейронов человека, в зависимости от скорости созревания in vivo, такой как уровни экспрессии DAT (фиг. 4n). Присутствие TH+ клеток, экспрессирующих каналы Kir3.2 (GIRK2) или кальбиндин, свидетельствовало о том, что в трансплантате присутствовали ДА нейроны, как SNpc (A9), так и вентральной тегментальной области (A10) (фиг. 4o, p).
Также как и у мышей (фиг. 13), в клетках крыс редко встречались серотонинэргические и GABAэргические клетки встречались (<1% от общего количества клеток), а присутствовали главным образом GFAP+ глиальные клетки, полученные от реципиента (7% от общего количества клеток (фиг. 14). Хотя в трансплантате было обнаружено несколько серотонин-положительных нейронов, были обнаружены hNCAM-отрицательные клетки, которые, вероятно, были серотонинэргическими волокнами, полученными от реципиента (фиг. 14).
Пример V.
Трансплантация популяции новых ДА нейронов приматам с поврежденными нейронами.
Результаты, приведенные в настоящем описании, продемонстрировали превосходные выживаемость трансплантата и результат влияния на поведение в двух независимых моделях на мышах. Однако количество ДА нейронов, потребовавшихся для мозга мышей или крыс, представляют малую часть большого количества клеток, необходимых для трансплантации приматам и людям. Для проверки масштабируемости указанного протокола провели пилотные исследования трансплантации на двух взрослых макаках-резус с повреждениями, вызванными MPTP.
Порции 50x106 трансплантируемых предшественников ДА нейронов были получены на 25 день дифференцировки с применением протокола, основанного на использовании вентральных пластинок. Классической дозой для индукции состояний, похожих на паркинсоновские, была доза 3 мг MPTP-HCL, введенная в сонную артерию (в диапазоне 0,5-5 мг). Затем проводили системные инъекции MPTP в концентрации 0,2 мг/кг MPTP внутривенно. Клетки вводили в три участка (задняя часть хвостатого ядра и пре-комиссуральная скорлупа) на каждой стороне мозга (в общей сложности 6 нервных пучков, 1,25x106 клеток/пучок), животных подвергали иммуносупрессии с применением циклоспорина A. На одной стороне в мозг вводил предшественники ДА из субклона H9, экспрессирующего GFP, а во вторую сторону трансплантировали клетки, полученные из немеченых клеток H9. Результаты, показывающие трансплантацию макакам-резус нейронов с продолжающейся экспрессией FOX2A и продукцией TH, приведены на фиг. 4q-t. Через один месяц после трансплантации наблюдалась высокая выживаемость ДА нейронов среднего мозга, согласно оценке по экспрессии GFP (фиг. 15) и специфического для человека цитоплазматического маркера (SC-121) (фиг. 4q). Каждое ядро трансплантата было окружено ореолом TH+ волокон, распространяющихся до 3 мм внутрь реципиента (фиг. 4r). Ядра трансплантатов состояли из TH+ нейронов, одновременно экспрессирующих SC-121 (фиг. 4s) и FOXA2 (фиг. 4t). SC-121- и GFPотрицательные области в трансплантатах содержали Iba1+микроглию реципиента (фиг. 15), что свидетельствовало о неполной иммуносупрессии.
В итоге, проведена трансплантация популяции клеток новых ДА нейронов приматам, а именно взрослым макакам-резус с повреждениями, вызванными MPTP (3 мг MPTP-HCL (1-метил-4-фенил1,2,3,6-тетрагидропиридин; в диапазоне концентраций 0,5-5 мг MPTP-HCl), и характеризующимися сильной >95% потерей эндогенных ДА нейронов среднего мозга. Обработка MPTP вызывала наблюдаемые изменения и симптомы, сходные с заболеванием Паркинсона у людей.
Пример VI.
Сравнительный потенциал дифференцировки по пути образования ДА нейронов среднего мозга у клеток БП-иПСК, мутантных по PINK1, и у ЭСКч (или иПСч) дикого типа.
В настоящем примере описано, что большие популяции ДА нейронов среднего мозга, у которых развились свойства нейронов пациентов с болезнью Паркинсона (БП), когда линия клеток таких пациентов, а именно клеток БП-иПСК, мутантных по PINK1, полученная способом, не вызывающим разруше- 110 041083 ние эмбриона, была использована в качестве популяции клеток для получения FOXA2/LIM1XA/TH+ ДА нейронов согласно настоящему изобретению.
Линию БП-иПСК Q456X, мутантную по PINK1, дифференцировали с применением нового протокола получения ДА нейронов среднего мозга на основе вентральных пластинок (способа) согласно настоящему изобретению, который приводит к профилям дифференцировки среднего мозга, сравнимым с профилями, полученных для линии иПСК H9. (фиг. 20). A-C) Иммуноцитохимический анализ линии БПиПСК, мутантной по PINK1, на 11 день дифференцировки (стадия предшественника среднего мозга) для FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (A), 25 день дифференцировки (ранняя постмитотическая стадия ДА нейронов) для FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (B), и для NURR1 (красный) и TH (зеленый) (C). D-F) Тот же набор иммуноцитохимических анализов, выполненный с применением клеток, полученных из H9 на 11 день дифференцировки для FOXA2 (красный), LMX1A (зеленый) и DAPI (синий) (D), на 25 день дифференцировки для FOXA2 (красный) и TH (зеленый) (E), и для NURR1 (красный) и TH (зеленый) (F).
У линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, был обнаружен БП-подобный фенотип агрегации белков, с последующей продолжительной дифференцировкой и созреванием in vitro. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что у БП-иПСК, мутантной по PINK1, обнаружены свидетельства экспрессии αсинуклеина (главного компонента телец Леви у пациентов с болезнью Паркинсона) в цитозоле TH+ ДА нейронов на 55 день дифференцировки при использовании нового протокола индукции ДА нейронов среднего мозга на основе вентральных пластинок, (фиг. 21A-B). A, B) Иммуноцитохимический анализ линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 55 день дифференцировки для α-синуклеина (LB509, красный), TH (зеленый) и совмещенное изображение (A) и α-синуклеина (красный) и убиквитина (зеленый) (B). Эти α-синуклеин-положительные клетки также продемонстрировали высокую экспрессию убиквитина (классического маркера телец Леви). В противоположность этому, ДА нейроны, полученные из контрольной линии iPS, продемонстрировали экспрессию нормального синаптического (в противоположность цитозольному) α-синуклеина и очень низкие уровни убиквитина (фиг. 21C-D). C, D) Иммуноцитохимический анализ контрольной линии iPSC line на 55 день дифференцировки для α-синуклеина (красный) и TH (зеленый) (C) и α-синуклеина (красный) и убиквитина (зеленый) (D).
Экспрессия агрегированной формы α-синуклеина. В мозгу пациентов с болезнью Паркинсона димеризованные нерастворимые формы α-синуклеина приводят к агрегации в виде телец Леви. У димеризованной формы α-синуклеина наблюдается фосфорилирование серина-129 в α-синуклеине.
В тот же день дифференцировки клетки, полученные из БП-иПСК, мутантных по PINK1, продемонстрировали сильную экспрессию фосфорилированного по Ser129 α-синуклеина в отличие от клеток, полученных из контрольных клеток iPSC, которые продемонстрировали очень низкие уровни экспрессии (фиг. 22). Клетки, полученные из БП-иПСК, мутантных по PINK1, продемонстрировали сильную экспрессию фосфорилированного по Ser129 α-синуклеина в отличие от клеток, полученных из контрольных клеток iPSC, которые продемонстрировали очень низкие уровни экспрессии. А, B) Иммуноцитохимический анализ фосфорилированного по Ser129 α-синуклеина (зеленый) и DAPI (синий) в клетках, полученных из БП-иПСК, мутантных по PINK1, на 55 день дифференцировки (A) и подходящих контрольных клетках, полученных из iPSC (B).
Разница в паттернах экспрессии α-синуклеина наблюдалась в зависимости от протокола дифференцировки. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что аутентичные ДА нейроны среднего мозга, полученные на основе вентральных пластинок, демонстрировали специфическую для болезни Паркинсона уязвимость и соответствующие, специфические, фенотипы in vitro. Использование ДА нейронов, полученных с применением классического протокола дифференцировки, основанного на стромальных фидерных клетках MS5 (Perrier и др., PNAS 2004, цитируемый источник включен в настоящее описание посредством ссылки), приводят к образованию большого количества TH+ нейронов. Однако основываясь на данных, полученных в ходе разработки настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения показали, что TH+ клетки, полученные на основе MS5, не были аутентичными ДА нейронам реднего мозга, полученным на основе вентральных пластинок. В культурах, дифференцировавших с применением протокола MS5, было много α-синуклеин-положительных клеток. Однако эти клетки не демонстрировали одновременной экспрессии TH. Более того, не было разницы в паттернах экспрессии между БП-иПСК и контрольными iPSC при использовании стратегии дифференцировки MS5 (фиг. 23A-B). Эти данные указывают на то, что α-синуклеин также экспрессируется в других типах клеток, не являющихся ДА, и что такой α-синуклеин из клеток, не являющихся ДА, не изменяется при болезни, при сравнении с клетками, полученными из контрольных иПСК, в частности при использовании стандартного протокола дифференцировки MS5. ДА-подобные нейроны, полученные из розеткообразных структур, описаны в публикациях (например, Perrier PNAS 2004). Такие TH+ клетки на основе MS5 (=ДА-подобные) использовали для сравнения на фиг. 3, 10, 13 и 16. Эти данные указывают на то, что α-синуклеин также экспрессируется в других типах клеток, не являющихся ДА, и что такой α-синуклеин из клеток, не являющихся ДА, не изменяется при болезни в сравнении с клетками, полученными из контрольных клеток иПСК, в частно
- 111 041083 сти при использовании стандартного протокола дифференцировки MS5. Наконец, использование нового протокола дифференцировки на основе вентральных пластинок, описанного в настоящей заявке, приводит к образованию большого количества TH+ клеток, одновременно экспрессирующих α-синуклеин. Такие TH+ клетки экспрессируют α-синуклеин в паттерне цитозольной экспрессии. Фиг. 24A, B) Иммуноцитохимический анализ α-синуклеина (LB509, красный), TH (зеленый) линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 60 день дифференцировки на основе MS5 (A) и контрольной линии иПСК (B). C) Иммуноцитохимический анализ линии БП-иПСК, мутантной по PINK1, на 55 день дифференцировки на основе вентральных пластинок в отношении α-синуклеина (красный), TH (зеленый).
Типичные ДА нейроны, полученные из клеток БП-иПСК, мутантных по PINK1, чувствительны к стимуляции токсинами. Полученные из БП-иПСК TH+ ДА нейроны, полученные с применением протокола на основе вентральных пластинок были более чувствительными к токсической обработке (валиномицин: митохондриальный ионофор, 5 мкМ (в диапазоне концентраций 1-10 мкМ), 48 ч), чем контрольные клетки, полученные на основе иПСК. В отличие от этого, TH+ нейроны, полученные с применением классического протокола MS5, не показали дифференциальной чувствительности для клеток БП в сравнении с контрольными клетками (фиг. 24). A-F) Репрезентативный иммуноцитохимический анализ TH на 60 день дифференцировки: Нормальные условия (без токсической обработки) как для клеток БП, так и для контрольных клеток, полученных из иПСК с применением протокола на основе вентральных пластинок (A, показаны клетки, полученные из БП-иПСК), практически полное вырождение TH+ ДА нейронов при последующей токсической обработке БП-иПСК (B), частично вырожденные TH+ ДА нейроны из контрольных иПСК (C). Тест на общую выживаемость клеток с красителем alamar-blue после 48 ч обработки валиномицином также показал различную выживаемость клеток в специфическом диапазоне дозирования при токсической обработке (5 и 10 мкМ) при сравнении БП-иПСК и контрольных иПСК (фиг. 25).
Нормальные условия как для культур БП, так и для культур на основе контрольных иПСК, полученных с применением протокола на основе MS5 (D, показаны клетки, полученные из БП-иПСК), TH+ нейроны после токсической обработки, полученные из культуры БП-иПСК (E) и контрольной культуры iPSC (F), полученные по протоколу MS5. G-H) изображения иммуноцитохимических исследований малой мощности для Tuj 1 (красный) и TH (зеленый) по протоколу на основе вентральных пластинок на 60 день дифференцировки: БП-иПСК при нормальных условиях (G) и условиях токсической обработки (H) и контрольная иПСК в нормальных условиях (I) и условиях токсической обработки (J). K-N) изображения иммуноцитохимических исследований малой мощности для Tuj1 (красный) и TH (зеленый) по протоколу на основе MS5 на 60 день дифференцировки: БП-иПСК при нормальных условиях (K) и условиях токсической обработки (L) и контрольная иПСК в нормальных условиях (M) и условиях токсической обработки (N).
Пример подсчета в тесте на выживаемость клеток в зависимости от дозы при токсической обработке. Тест на выживаемость клеток с alamar-blue после 48 ч обработки валиномицином показал различную выживаемость клеток в характерном диапазоне дозировок при токсической обработке (5 и 10 мкМ) при сравении БП-иПСК и контрольной iPSC (60 день дифференцировки на основе вентральных пластинок). Замечание: эти тесты изучают общую гибель клеток, хотя особенно заметные эффекты наблюдались на ДА нейронах (см. фиг. 14).
Поэтому, подсчет на основе alamar blue с большой вероятностью будет преуменьшать степень различных эффектов, наблюдаемых в линиях ДА нейронов. Документы, включенные в настоящее описание посредством ссылки:
- 112 041083
Li, и dp. Nat. Biotechnol.
23, 215-221 (2005); Perrier, и dp. Proc Natl Acad Sci U S 101, 12543-8 (2004); Perrier, и dp. Proc
Natl Acad Sci U SA 101, 12543-8 (2004); Tabar, и dp. Nature Med. 14, 379-381 (2008); Perrier, и dp. Proc Natl Acad Sci U SA 101, 12543-8 (2004); Wernig, и dp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 5856-5861 (2008); Lindvall, и dp. J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010); Roy, и dp. Nature Med. 12, 1259-1268 (2006); Elkabetz, и dp. Genes Dev. 22, 152-165 (2008); Kittappa, и dp. PLoS. Biol. 5, e325 (2007 ; Ferri, и dp. Development 134, 2761-2769 (2007); Roelink, и dp. Cell 76, 761-775 (1994); Liem, и dp. Cell 82, 969-979 (1995); Fasano, и dp. Cell Stem Cell 6, 336-347 (2010) ;
Chambers, и dp. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009) ; Muroyama, и dp. Genes Dev. 16, 548-553 (2002) ; Joksimovic и dp. Nat Neurosci 12, 125-131 (2009) ; Lyashenko, и dp. Nat. Cell Biol. 13, 753-761 (2011) ; VanDunk, и dp. J. Neurosci. 31, 6457-6467 (2011) ; Huang, и dp. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009) ; Costa, и dp. Mol. Cell Biol. 9, 1415-1425 (1989) ; Elkabetz, и dp. Genes Dev. 22, 152-165 (2008) ; Soldner, и dp. Cell 136, 964-977 (2009) ; Guzman, и dp. J. Neurosci. 29, 1101111019 (2009) ; Nedergaard, и dp. J. Physiol 466, 727-747 (1993) ; Ferrari, и bp. Eur. J. Neurosci.
24, 1885-1896 (2006) ; Olanow, и bp. Trends Neurosci. 19, 102-109 (1996) ; Zetterstrom, и bp.
Science 276, 248-250 (1997); Quintana, и bp. Nature 456, 593-598 (2008) ; Kim, и bp. diets Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8, 695-706 (2011) ;
Hargu, и bp. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 15921-15926 (2010) ; Aubry, и bp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 105, 16707-16712 (2008); Blume, и др., Exp. Neurol. 219, 208-211 (2009); Ban, и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A(2011); Studer, и др., Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998); Kordower, и др., Science 290, 767-773 (2000); Paxinos, и др., The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinate.s(Academic Press, 2000); Crawley, What's Wrong With My Mouse: Behavioral Phenotyping of Transgenic и Knockout Mice(Wiley-Liss, 2000);
Studer, и др., Brain Res. Bull. 41, 143-150 (1996); Tabar, и др., Nat. Biotechnol. 23, 601-606 (2005); и Placantonakis, и др., Stem Cells 27, 521-532 (2009).
Пример VII.
Были установлены характерные условия для записи in vivo ДА нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, в тонкослойных препаратах; см. характерные результаты на фиг. 26.
Электрофизиологические измерения рассматриваются для использования в тонкослойных препаратах, а именно из биопсии областей трансплантата. В одном варианте осуществления, ДА нейроны типа A9 в отличие от A10, полученные из трансплантата могут быть идентифицированы in vivo на основании тестирования автономной активности в создании ритма, которая является характерной для дофаминовых нейронов типа A9, которым наносится наибольший вред в случае болезни Паркинсона. Другими словами, нейроны типа A10 не обладают активностью в создании ритма.
Были установлены характерные условия для записи in vivo ДА нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, в тонкослойных препаратах; см. фиг. 26. В частности, были произведены измерения в отношении трансплантированных ДА нейронов человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, и обнаружено, что они обладают электрофизиологическими признаками, типичными для признаков, обнаруженных в части компактов черного тела (substantia nigra pars compacta, SNpc) мышей, фиг. 26A, где на виде вверху показана реконструкция нейрона - создателя ритма (нейрона-ритмоводителя) в участке трансплантата. На виде снизу показана типичная фотомикрография полученного из крысы среза мозга, в который 9-тью месяцами ранее были введены нейроны, полученные из hES; трансплантат очерчен; изображение с большим увеличением приведено внизу в виде вставки. Срез был обработан тирозингидроксилазой, которая показана белым, фиг. 26B. Далее, на виде вверху показана типичная присоединенная накладка, производящая запись с предполагаемого в трансплантате; на виде внизу типичная запись с целой клетки той же самой клетки. Запись осуществляли в присутствии антагонистов рецепторов глютамата и GABA (50 мкМ AP5, 10 мкМ CNQX и 10 мкМ GABAzine) для того, чтобы элиминировать синаптический входной сигнал. Эти записи продемонстрировали, что указанные нейроны, полученные из PS, были нейронами-ритмоводителями с нормальными интрасоматическими траекториями напряжения. Другие нейроны, записанные в образце трансплантата, имели схожие свойства, фиг. 26C. Для сравнения приведены записи с присоединением к клетке и записи целой клетки дофаминергических нейронов в SNpc взрослой мыши. Сокращения (CTx=кортекс, STr=стриатум, SNpc=часть компактов черного тела, ДА=дофаминергический). Эти данные показывают функциональные исследования in vivo в полосатом теле крысы с трансплантатом через месяц после трансплантации.
- 113 041083
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, функциональные исследования in vivo в тканях, подвергнутых трансплантации, демонстрируют восстановление части компактов черного тела (substantia nigra pars compacta, SNpc).
Пример VIII.
Методы, приведенные в качестве примера, для идентификации маркеров на поверхности клеток для использования в способах согласно настоящему изобретению. В частности, CD142 был идентифицирован с применением этих методов.
Две основные стратегии для идентификации кандидатов в поверхностные маркеры: Беспристрастная проверка экспрессии генов в линиях генетических репортеров (фиг. 27a), в ходе которой найдены несколько кандидатов в маркеры, включая маркер, названный DCSM1, который селективно экспрессировался в ДА нейронах среднего мозга и представляющийся в особенности маркеров ДА нейронов типа A9 (фиг. 27b). Вторая стратегия заключается в использование проверки поверхностных маркеров клеток CD в ДА нейронах, полученных из hESC, тестирующего 242 коммерчески доступных антитела в 96луночном формате (фиг. 27c, d). Результатом такой проверки (фиг. 27e) стала идентификация по меньшей мере 5 подтвержденных маркеров, обогащенных в ДА нейронах среднего мозга, включая CD142, маркер, селективно указывает на стадию нейронов Nurr1+ ДА (фиг. 27f). При использовании клеточной процедуры ДА нейронов, описанной в настоящей заявке, CD142 обычно маркировал приблизительно 30% общей популяции клеток на 25 день дифференцировки (фиг. 28a). Селективность CD142 к стадии нейронов Nurr1+ DA была подтверждена в множестве независимых линий hESC и hiPSC 1 (фиг. 28b). В дополнение к обогащению ДА нейронов, обогащение CD142-положительными клетками приводило к селективному истощению нежелательных подтипов нейронов, таких как GABA- и серотонинэргические нейроны. (фиг. 28c-f). Исследования in vivo подтвердили способность популяции CD142-положительных клеток давать начало трансплантатам с высокой чистотой ДА нейронов, что позволяет преодолеть проблемы контаминации GABA- и серотонинэргическими нейронами. Хотя процедура трансплантации, в которых используются неочищенные клетки, уже привела к получению незначительного количества серотонинэргических нейронов, использование селекции клеток-предшественников на основе CD142 предполагается для дальнейшего снижения риска введения серотонинэргических нейронов, типа контаминирующих клеток, которое имело следствием неудачную трансплантацию в человека тканей эмбриона как потенциальный источник нежелательных дискинезии, индуцированных трансплантацию в человека тканей эмбриона.
Пример IX.
В настоящем Примере описаны методы трансформации клеток генами PST человека для усиления экспрессии PSA на поверхности клеток. В настоящем Примере также показаны типичные методы использования клеток, имеющих повышенную экспрессию PSA на поверхности клеток.
В частности, в настоящем Примере показаны встроенные в hESCs гены PST для усиления экспрессии PSA в ДА нейронах. Ген, кодирующий полисиалилтрансферазу человека (hPST), ввели в линию hESC line (WA01) с применением лентивирусного вектора (pLenty, Invitrogen). Двадцать отобранных клонов подрастили и проанализировали на предмет экспрессии PST. Клоны hESC, экспрессирующие PST, дифференцировали для того, чтобы убедиться, что экспрессия PST не подавлена в ДА нейронах. Подсчет PSA-NCAM на различных стадия дифференцировки (дни 0, 11, 25 и 50) был произведен с применением анализа FACS и иммунофлюоресценции (Operetta). Положительным клонам было необходимо соответствовать параметрам QC ДА нейронов, приведенным в табл. 7. По меньшей мере 3 клона, которые сохраняли высокие, неизменные уровни PSA-NCAM в ходе дифференцировки и хорошо соответствовали параметрам QC (табл. 7), будут способствовать установлению разрастания аксонов в ДА нейронах, экспрессирующих PST и полученных из hESC. Подобранный контроль и экспрессирующие PST клоны hESC дифференцировали в ДА нейроны с применением стандартного протокола, описанного в настоящей заявке, с последующей фиксацией клеток и анализом на 25 и 50 дни. Количество и длину THположительных волокон в этих культурах оценивали с помощью высоко контрастного микроскопа Operetta. Модуль анализа аксонов в программном обеспечении Harmony 3.0 подсчитывал количество аксонов и длину, с PST или без него, а данные были статистически проанализированы с применением двухфакторного анализа ANOVA. Клоны, экспрессирующие PST, и контрольные клоны hESC, которые были выбраны на основании исследований in vitro, описанных выше, снова дифференцировали в ДА нейроны и трансплантировали в модельных крыс с заболеванием Паркинсона. Были сделаны краткосрочные трансплантаты (4-6 недель) для определения выживаемости, экспрессии PSA-NCAM и разрастания аксонов. Каждый клон, который удовлетворял краткосрочным параметрам in vivo, подвергали долгосрочным исследованиям в трансплантате. В этих исследованиях животные получали половину или четверть стандартной (200x103) дозировки клеток. Эти исследования были направлены на выяснение, приводит ли повышенный PSA к повышению долгосрочной выживаемости после трансплантации (5 месяцев), и способно ли меньшее количество ДА нейронов конкурировать или превосходить функциональную способность трансплантатов без PST, трансплантированных в стандартной дозировке клеток (фиг. 27).
В дополнение, комплексный тест поведения, чувствительный к стриарной реиннервации, был проведен для того, чтобы далее охарактеризовать функциональный потенциал трансплантатов ДА нейронов
- 114 041083 с PST в сравнении с контрольными. Животных умерщвляли после завершения тестов поведения, и разрастание волокон обсчитывали с применением специфических антител NCAM и SC121 человека и антител против TH (см. также фиг. 29). Интенсивность и распространение трансплантата hNCAM+, SC121+ и TH+ были измерены, также как процент клеток человека одновременно экспрессирующих маркеры ДА нейронов (TH, FOXA2) и PSA. Плотности NCAM/TH+ гало аксонов, распространяющихся из трансплантата, были посчитаны на различных расстояниях. Данные между группами сравнивали с применением двухфакторного анализа ANOVA в post-hoc тесте Бонферрони. В дополнение, изучали качественные изменения срезов (например, разветвление, толщина, распределение трансплантата и форма). В дополнение, некоторые трансплантаты подвергали электрофизиологической оценке тонкого слоя с точки зрения фенотипа A9, образования синапсов с полосатым телом реципиента, а также иннервации эндогенными афферентными нервами.
Пример X.
В следующем примере продемонстрировано усиление экспрессии полисиаловой кислоты, которое улучшает функционирование трансплантатов дофаминовых нейронов, полученных из ES, в паркинсоновских мышах.
Клетки ES, экспрессирующие GFP под контролем промотора Nurr1, (Nurr1::GFP клетки ES) стабильно трансдуцировали с применением лентивирусного вектора, убиквитарно экспрессирующего полисиалилтрансферазу (PST). Трансдуцированные клетки продемонстрировали существенное увеличение количества мРНК PST в сравнении с контролями (фиг. 30A). Было обнаружено, что экспрессия PST является существенной для синтеза PSA в NCAM. Соответственно, экспрессия PSA-NCAM была существенно усилена в PST-модифицированных клетках на 14 день дифференцировки ДА нейронов (фиг. 30BE). Как эндогенный поверхностный PSA, так и поверхностный PSA в индуцированных клетках ДА нейронов, полученных из ES, могут быть удалены (фиг. 30E) с применением фаговой эндонейраминидазы (endoN), которая специфически расщепляет уникальные для PSA альфа-2,8-связанные полимеры сиаловой кислоты. Неожиданно было обнаружено, что трансдукция PST не оказывает влияния на экспрессию нейронных маркеров или маркеров среднего мозга в ДА нейронах, очищенных от GFP (фиг. 30F).
Другие исследования гемипаркинсоновских мышей с повреждениями, вызванными 6OHDA, показали, что требуется трансплантация приблизительно 100000 предшественников ДА нейронов, полученных из ES, для получения сильного функционального восстановления, измеряемого в тесте на вращение, индуцированное амфетамином. В настоящих исследованиях, стремились трансплантировать субоптимальное количество клеток для того, чтобы достичь прироста путем усиления экспрессии PSA. Для того, чтобы трансплантировать популяции, сильно обогащенные ДА нейронами, в которых уменьшено количество контаминирующих плюрипотентных клеток, культуры, очищенные на FACS, на 14 день дифференцировки проверяли на на экспрессию GFP под контролем Nurr и на отсутствие экспрессии SSEA-1 (фиг. 31). Без суперэкспрессии PST снижение минимально эффективного размера трансплантата вполовину (55000 клеток Nurr1+ DA) не приводило к детектируемому восстановлению поведения. В противоположность этому, при усилении экспрессии PSA такое же количество Nurr1/PST ДА нейронов приводило к существенной коррекции ухудшения поведения при болезни Паркинсона (р<0,01; двухфакторный анализ ANOVA) с полным восстановлением примерно через 5 недель после хирургического вмешательства (фиг. 32A). Удаление PSA перед трансплантацией посредством индукции endoN показывало специфичность увеличения количества PSA, поскольку обработка endoN частично инвертировала функциональное восстановление, полученное с помощью Nurr1/PST (фиг. 32A).
Для проверки характеристик трансплантированных клеток животных подвергали иммуногистохимическим исследованиям через два месяца после трансплантации. Было обнаружено различие в количестве выживших Nurr1+ нейронов, поскольку животные, в которых трансплантировали PSTтрансдуцированные линии, имели в среднем вдвое больше GFP+ клеток, чем животные, в которых трансплантировали контрольные клетки (9,300+/-1,400 против 4,230+/-1010 GFP+ клеток в трансплантате в образцах PST в сравнении с контрольными образцами, соответственно; фиг. 32B, p<0,05, t-тест Стьюдента). Более того, трансплантаты Nurr1/PST g также продемонстрировали более высокие уровни экспрессии PSA in vivo (фиг. 32C, D). Однако пропорции клеток, экспрессирующих маркеры ДА нейронов среднего мозга TH и FoxA2 в ядре трансплантата, были сравнимыми для клеток Nurr1 и Nurr1/PST (TH: 62,0%+/-8.0 против 51,3%+/-7,0 p=0,33; FoxA2: 63,2%+/-8,6 vs. 55,4%+/-2,0, p=0,3, соответственно; фиг. 32E).
Нейронные процессы, которые проистекают из клеток Nurr1 и Nurr1/PST, показали сравнимые уровни TH, Girk2 (связанный с G-белком калиевый канал входящего выпрямления) и синапсина (фиг. 33A). В отличие от других исследований с трансплантированными шванновскими клетками (Ghosh, M., и др. Extensive cell migration, axon regeneration, и improved cells after spinal cord injury. Glia 60, 979-992 (2012)), усиленная экспрессия PSA имела незначительное влияние на миграцию клеток DA из места трансплантата. Однако были явные изменения в разрастании аксонов. Как показано на фиг. 33B, происходило больше нейронных процессов DA проистекающих из клеток Nurr1/PST в сравнении с Nurr1+ контролями. Когда интенсивность иммунофлуоресценци GFP и TH был посчитана в пяти последовательных зонах размером 100 мкм при удалении от трансплантата, трансплантаты Nurr1/PST продемонстриро
- 115 041083 вали гораздо более высокую плотность процессов (фиг. 33C, D; p<0,01 для GFP и TH, двухфакторный анализ ANOVA). При количественной оценке этого явления нормализовали относительную плотность процессов к плотности, наблюдаемой в зоне, наиболее приближенной, соседней с ядром трансплантата. Такая нормализация требовалась для того, чтобы компенсировать большое количество выживших клеток в трансплантатах Nurr1/PST и подтвердить специфическое влияние PSA на разрастание аксонов. Специфичность также была продемонстрирована, когда PSA был удален с поверхности клетки в ходе обработки с помощью endoN перед трансплантацией. Эта предварительная обработка с помощью endoN приводила к снижению разрастания дистальных волокон обратно к контрольным уровням (фиг. 33E).
Эти открытия продемонстрировали, что, по меньшей мере, некоторые из результатов действия PSA на функционирование трансплантата являются результатом улучшенной иннервации полосатого тела волокнами. Соответственно, наблюдалась сильная корреляция между функционированием трансплантата и относительной степенью разрастания GFP-положительных волокон, например в зоне IV (фиг. 33F; p<0,001, r2=0,65, n=17). Неожиданно оказалось, что соотношение разрастание волокон/поведение было постоянным для экспериментальных групп (контрольные, с увеличенным содержанием PSA, и обработанные с помощью endoN), указывая на то, что иннервация трансплантат-реципиент был параметром, определяющим восстановление поведения в модели с паркинсоновскими мышами. Несколько факторов вносили механический вклад в усиленное разрастание волокон, таких как улучшенная проницаемость реактивной глии, окружающей ядро трансплантата, улучшенная способность к прорастанию, усиленное разрастание в окружающие ткани реципиента (например, коническая транслокация более легкого роста), и предохранение от преждевременных связей с тканями реципиента в непосредственной близости от ядра трансплантата. Характерные механизмы соотносятся с ролью PSA в процессах содействия разрастанию в ходе нормального развития и в зрелой нервной системе.
Эксперименты, описанные в настоящей заявке, продемонстрировали использование генноинженерного PSA в трансплантации ДА нейронов прививки, которое обеспечило превосходные результаты по сравнению с трансплантатами из других типов клеток. Данные четко показали, что увеличение количества PSA обеспечило значительное увеличение способности трансплантированных ДА нейронов обеспечивать иннервацию полосатого тела трансплантата и ослаблять функциональный дефицит при болезни Паркинсона. Поэтому предполагается перевод метода в клиническое использование, включающее использование ДА нейронов согласно настоящему изобретению, для обеспечения клеток перед трансплантацией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, над клетками будут проведены генетические манипуляции для экспрессии PSA. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения PST может быть доставлен в непосредственно клетки посредством обработки очищенным ферментом и субстратом, in vitro, перед трансплантацией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предполагается использование стратегии PSA для трансплантации у человека в случае трансплантации при болезни Паркинсона для минимизации необходимости множественных инъекций и, вследствие этого, снижения рисков от хирургических вмешательств, обусловленных такими множественными инъекциями.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предполагается использование этой технологии для других типов клеток и видов, например, увеличение миграции трансплантированных шванновских клеток при создании межклеточного мостика (например, межклеточного взаимодействия) для возобновления роста аксонов в месте повреждения спинного мозга.
Далее следуют типичные материалы и методы, использованные в настоящем Примере.
Животные: Мышей 129S3/SvImJ (Jackson Laboratory) возрастом 6 недель содержали при контролируемой температуре со свободным доступом к пище и воде. Эксперименты осуществляли в соответствии с инструкциями Национального института здравоохранения (NIH) и руководством по использованию животных института, они были одобрены местным институтским комитетом охраны и использования животных (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC), комитетом биобезопасности института (the Institutional Biosafety Committee, IBC).
Инъекция 6OHDA и тест с введением амфетамина: животных подвергали анестезии пентобарбиталом натрия (10 мг/кг) и в правое стриатум вводили 2 мкл 6OHDA (4 мкг/мкл солевом растворе, 0,5% аскорбиновой кислоты). Инъекции осуществляли шприцом Hamilton в координаты: 0,5 мм сзади, 1,8 мм вбок по отношению к брегме и 2,5 мм внутрь по отношению к поверхности мозга. Перед хирургическим вмешательством животные получали одну внутрибрюшинную инъекцию дезипрамина (25 мг/кг, Sigma). Через две недели после хирургического вмешательства животных оценивали в тесте на вращение, индуцированное амфетамином. Их помещали в прозрачные пластиковые цилиндры диаметром 30 см на полчаса, после чего они получали одну внутрибрюшинную инъекцию амфетамина (10 мг/кг, Sigma). Через 20 мин подсчитывали количество ипсилатеральных/контралатеральных вращений в течение следующих 20 мин. Животных оценивали еженедельно в течение семи недель, затем подвергали глубокой анестезии и осуществляли перфузию через сердце PBS и 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB, pH 7,4). Мозги извлекали и дополнительно фиксировали в течение ночи при 4°C в 4% параформальдегиде, затем с применением вибратома (Pelco-101, Ted Pella) получали срезы толщиной 40 мкм саггитальных сечений.
- 116 041083
Дифференцировка клеток и трансплантация: линию клеток с репортером ES Nurr1::GFP BAC из трансгенных мышей BAC (а именно, экспрессия GFP осуществлялась под контролем промотора Nurr1) трансдуцировали лентивирусов (pLenti, Invitrogen), содержащим ген PST мыши под контролем промотора CMV. Клетки ES размножали на обработанных митомицином C фибробластах эмбриона мыши (MEF) (StemCell Technologies) в среде DMEM (Invitrogen), 10% FBS (HyClone) с добавлением 1,400 единиц/мл LIF (ESGRO; Invitrogen), 2 мМ L-глютамина, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen). Дифференцировку DA индуцировали в соответствии с Barberi и др., Nat Biotechnol 21, 1200-1207 (2003) с модификациями. Вкратце, клетки дифференцировали на питающих клетках MS5 в лотках, покрытых желатином (10,000 клеток/ лоток 10 см) и выращивали в течение 4-х дней в среде заменителя сыворотки (SRM). На 4 день добавляли Sonic hedgehog (SHH, 200 нг/мл) и FGF8 (100 нг/мл). На 7 день дифференцировки среду заменяли на N2 с добавлением SHH, FGF8 и bFGF (10 нг/мл). На 11 день, окончательную дифференцировку индуцировали путем удаления SHH, FGF8 и bFGF, и добавлением аскорбиновой кислоты (AA, 200 мкМ) и BDNF (20 нг/мл).
Клетки собирали на 14-15 день с обработкой Accutase® в течение 45 мин, один раз промывали средой N2 и инкубировали с антителом против SSEA-1, конъюгированным с AlexaFluor-647 (BD Pharmingen) в течение 25 мин. Клетки один раз промывали средой N2, ресуспендировали в буфере HEPES с 0,1% BSA. Для оценки выживаемости добавляли DAPI. Осуществляли FACS с применением сортировщика клеток MoFlo и интересующую популяцию сортировали по флюоресценции GFP (Nurr1). Популяции с позитивным сигналом от AlexaFluor-647 (SSEA-1) отбраковывали. В качестве контроля без GFP использовали необработанные клетки ES мышей J1 на той же стадии дифференцировки.
Клетки, отсортированные по Nurr1::GFP, исследовали на выживаемость и ресуспендировали в N2 с BDN и AA до конечной концентрации 55,000 клеток/мкл. Один мкл вводили в поврежденное стриатум мыши с применением стеклянного капилляра с заостренным наконечником объемом 50 мкм в координаты: 0,3 мм сзади, 1,5 мм вбок от брегмы и 2,2 мм внутрь от поверхности мозга. Аликвоту суспензии клеток переносили в 6 мм лотки, покрытые гелем matrigel, для дальнейшей их характеристики.
Для иммунофлуоресцентного анализа клетки фиксировали параформальдегидом в течение 10 мин при 4°C, дважды промывали PBS, блокировали с помощью 5% BSA (0,1% Triton X-100 в PBS) и инкубировали с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре: антитела кролика против GFP (1:1000, Invitrogen), IgM мыши против PSA (1:2000, 5A5), антитела мыши против NeuN (1:800, Chemicon), антитела мыши против TH (1:1000, Sigma), антитела козы против FoxA2 (1:800, Santa Cruz), антитела козы против Engrailed (1:800, Santa Cruz). Затем клетки инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с Cy3 (1:1000, Jackson).
Обработка EndoN: Для удаления PSA с NCAM, за сутки перед сбором клетки обрабатывали 20 единицами endoN, фаговым ферментом, специфически отщепляющим PSA 7-9. Затем клетки собирали и вводили как описано выше, за исключением того, что их ресуспендировали в N2 с BDNF и AA и 5 единицами endoN. Авторы настоящего изобретения определили, что инъекция такого же количества endoN в одиночку в мышей с повреждениями не улучшало поведение животных.
Анализ мРНК PST и PSA-NCAM in vitro: Для анализа вестерн-блот клетки обрабатывали буфером WB (PBS с 1% NP40, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, и 1x ингибиторы протеаз/фосфатаз, добавленные непосредственно перед экстракцией, при pH 7,4) и ультразвуком дважды в течение 5 сек, центрифугировали и ресуспендировали в буфере Лэмли (LB). Аликвоты без LB сохраняли для определения белков. Равные количества белков загружали в полиакриламидный гель для электрофореза с 6% додецилсульфатом натрия (BioRad). Белки переносили электрофорезом на мембраны из поливинилидена (Millipore). Мембраны блокировали в течение 1-6 ч в 0,1% Тритон X-100 TBS (TBS-T) с 5% обезжиренным сухим молоком и инкубировали в течение ночи с антителами против NCAM (1:10,000, Santa Cruz) в TBS-T с 5% молоком. Затем мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (1:10,000, Jackson) и детектировали с применением метода детекции ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Уровни белков подсчитывали с применением программного обеспечения ImageJ.
Для количественного анализа ОТ-ПЦР суммарную РНК экстрагировали с помощью Trizol (Sigma), проводили обратную транскрипцию (Qiagen) и амплифицировали с 10 мкл реакционной смеси 2x SYBR и 0,2 мкМ прямых и обратных праймеров с окончательным объемом 20 мкл. Для анализа PSA-NCAM с помощью FACS клетки собирали с обработкой Accutase® в течение 45 мин, один раз промывали и инкубировали с IgM мыши против PSA (1:250, 5A5) в течение 25 мин на льду, один раз промывали средой N2 и инкубировали с антителами против IgM мыши, конъюгированными с Cy3, (1:250, Jackson) в течение следующих 25 мин на льду. Клетки один раз промывали средой N2 и ресуспендировали в 0,1% BSA с 7AAD и анализировали в сортировщике клеток FACS Calibur. В качестве контроля первичные антитела не добавляли.
Иммуногистологические и стереологические процедуры: Свободно плавающие корональные срезы блокировали 0,1% Тритон X-100, 5% сывороткой осла в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре и инкубировали 48 ч при 4°C с различными антителами: антитела кролика против GFP (1:300), антитела цыплят против GFP (1:200, Chemicon), антитела мыши против TH (1:200), IgM мыши против PSA
- 117 041083 (1:1000), антитела мыши против NeuN (1:400), антитела козы против FoxA2 (1:300), антитела кролика против Girk2 (1:300, Alomone Labs), антитела мыши против синапсина (1:200, BD Transduction Laboratories). Затем срезы промывали и инкубировали с вторичными антителами: антителами осла, конъюгированными с Cy2, Cy3 и Cy5 (1:400, Jackson). Для PSA использовали антитела осла против IgM, конъюгированные с Cy5 (1:500 Jackson). Осуществляли инкубирование в течение 2 ч при комнатной температуре. Среды дважды промывали с помощью PBS и устанавливали в Mowiol (Calbiochem). Каждый из трех корональных срезов мозга анализировали для каждого окрашивания антителами.
Цифровые изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 с тремя лазерами (Argon 488, HeNe 543 и HeNe 633) с с-апохроматическим 40x объективом (водноиммерсионный). Количество клеток GFP+ и TH+ подсчитывали в каждом третьем срезе, охватив весь мозг через 40х объектив, и оценивали общее количество клеток в трансплантате. Дважды меченые клетки анализировали в одной оптической плоскости вдоль всей оси z.
Для оценки процента меченых клеток GFP/TH+ и GFP/FoxA2+ в отношении каждого маркера анализировали 100 GFP+ клеток. Для анализа процессов разрастания конфокальные скан по оси z осуществляли с интервалом 0,8 мкм вдоль всей оси z (20-40 мкм) с диафрагмой 1 мкм через 40x объектив. Срезы сканировали, начиная с места инъекции вбок до места, где процесс разрастания не наблюдался. Проекции 3-D, охватывающие всю сканированную область, были последовательно составлены. Для анализа интенсивности GFP и TH вся сканированная область была поделена на пять последовательных, отходящих от трансплантата зон размером 100 мкм и интенсивности измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ. Данные нормализовали по интенсивности в зоне, ближайшей к трансплантату (зона I) для контроля за любыми потенциальными различиями в размере трансплантата.
Статистический анализ: Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка среднего (SEM). Сравнения проводили с применением t-теста Стьюдента или двухфакторного анализа дисперсии (ANOVA) с последующим post-hoc тестом Бонферрони. Анализ линейной регрессии проводили и рассчитывали с применением корреляции Пирсона.
Пример XI.
В следующем примере продемонстрировано ферментативное конструирование PSA в ДА нейронах, полученных из hESC, с применением очищенной бактериальной полисиалилтрансферазы, PSTnm, для улучшения эффективности трансплантации.
Несмотря на эффективность, трансфекция гена PST вынуждала произвести модификации hESCs с ограниченным контролем в ходе полисиалилирования. В настоящем примере описано обнаружение того, что внешний PSTnm индуцировал PSA, вместо доставки гена, (см., фиг. 35). На фиг. 35A, шванновские клетки (SC), обработанные PST, (зеленая линия - средняя линия) обладали повышенным временем адгезии, в то время как PSA, полученный из PSTnm, ингибировал адгезию. В частности, A) PSA, полученный из PSTnm, ингибирует адгезию шванновских клеток в суспензии в монослой шванновских клеток даже более эффективно (красная линия -самая нижняя линия), чем PSA, полученный в ходе усиленной экспрессии PST ((зеленая линия - средняя линия). B) Иммуноблоттинг PSA в мотонейронах HB9, полученных из ESC, демонстрирует, что контрольные образцы, обработанные только PSTnm, имели недетектируемые уровни PSA. Инкубирование с PSTnm + субстрат CMP-сиаловая кислота приводит к получению большой полосы PSA, которая исчезает при обработке endoN. C, D) Аналогично эффектам, полученным с геном PST, полисиалилирование этих клеток посредством PSTnm и субстрата в ходе дифференцировки усиливает разрастание аксонов и миграцию клеток (острия стрелок). E) Иммуноокрашивание PSA на 30 день ДА нейронов, полученных из hESC. F) Это окрашивание существенно усиливается после обработки PSTnm и субстратом. G) Инъекция in vivo только PSTnm не имело эффекта, хотя его одновременное введение с субстратом H) приводило к большому уровню экспрессии PSA в полосатом теле мышей.
Таким образом, зрелые ДА нейроны, обработанные снаружи PSTnm, рассматриваются для использования при получениип клеток для трансплантата. Как PST, так и PSTnm млекопитающих продуцируют химически идентичные цепи PSA. Повышенный уровень PSA в ДА нейронах, полученных из hESC, (фиг. 35F) должен сохраняться в течение нескольких недель, достаточных для выхода волокон DA из ядра трансплантата. Ввиду того, что PSTnm удаляется перед трансплантацией, иммуногенность этого фермента, контаминирующего трансплантируемые клетки, не должна учитываться.
PSTnm был получен из сконструированного фрагмента с улучшенными характеристиками растворимости и активности (Willis и др., Characterization of the alpha-2,8-polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, и the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme. Glycobiology 18, 177-186 (2008)). Культуры hESC индуцировали для дифференцировки в ДА нейроны перед обработкой PSTnm, обработкой субстратом или перед обеими обработками. Культуры исследовали в различные моменты времени в ходе обработки (от 10 мин до 6 ч) методами количественной иммунофлуоресценции (Operetta) и вестерн-блоттинга для определения скорости и уровней полисиалилирования. Так, на 25 день дифференцированные ДА нейроны, полученные из hESC, будут инкубироваться с оптимальными концентрациями PSTnm и субстрата в условиях, описанных в настоящей заявке. PSA+ ДА нейроны будут трансплантироваться в ходе краткосрочных и долгосрочных анализов, как описано в настоящей заявке и на фиг. 29.
- 118 041083
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании выше, включены в настоящее описание посредством ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и систем настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники, которые не выходят за рамки настоящего изобретения и не изменяют его сущность. Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами его осуществления, следует понимать, что заявленное настоящее изобретение не следует неоправданно ограничивать этими конкретными вариантами его осуществления. Действительно, различные модификации описанных методов для осуществления настоящего изобретения, которые очевидны специалисту в области клеточной биологии, нейробиологии, биологии клеток рака, молекулярной биологии, биохимии, химии, органического синтеза, или смежных областях, входят в объем следующей формулы изобретения.

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro, включающий осуществление контакта плюрипотентных стволовых клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic), и осуществление контакта указанных клеток с активатором передачи сигнала SHH (Sonic hedgehog) и активатором передачи сигнала wingless (Wnt), причем контакт указанных клеток с активатором передачи сигнала Wnt осуществляют в промежуток времени с третьего (3) по одиннадцатый (11) день после первичного контакта клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD с получением популяции клеток, причем более 10% указанной популяции клеток экспрессирует как белок forkhead box A2 (FOXA2), так и LIM гомеобокс-содержащий фактор транскрипции 1 альфа (LMX1A).
  2. 2. Способ по п.1, в котором указанная передача сигнала SMAD включает передачу сигнала ТФРβ/активин-нодаль.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором указанная передача сигнала SMAD включает передачу сигнала белка морфогенеза костей (BMP).
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором по меньшей мере 20% указанной популяции клеток экспрессирует как белок FOXA2, так и LMX1A.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что клетки приводят в контакт с активатором передачи сигнала белка SHH по меньшей мере между 24 и 36 ч от первичного контакта клеток с ингибитором SMAD.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что клетки приводят в контакт с активатором передачи сигнала wingless (Wnt) по меньшей мере между 24 и 36 ч от первичного контакта клеток с активатором передачи сигнала белка SHH.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что по меньшей мере 40% указанной популяции клеток экспрессирует белок FOXA2 и LMX1A.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанные плюрипотентные стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из неэмбриональных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, индуцированных неэмбриональных плюрипотентных стволовых клеток и модифицированных плюрипотентных стволовых клеток человека, примата, отличного от человека, или грызуна.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, экспрессирующая FOXA2 и LMX1A, дополнительно экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из тирозингидроксилазы (TH), ортодентикл гомеобокс 2 (OTX2), родственного ядерному рецептору белка 1 (NURR1), нейрон-специфичного бета-тубулина класса III (Tuj1), фактора 3 семейства трилистника (TTF3), гомеобоксного белка 3, содержащего домен, подобный спаренному 3 (PITX3), комплекса achaete-scute (ASCL), раннего фактора 1 B-клеток (EBF-1), раннего фактора 3 Bклеток (EBF-3), транстиретина (TTR), синапсина, транспортера дофамина (DAT), сопряженного с Gбелком калиевого канала внутреннего выпрямления (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 и CD99.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанные плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются в указанную популяцию клеток в течение 11 дней от первичного контакта указанных клеток с по меньшей мере одним ингибитором передачи сигнала SMAD.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются в дофаминовые нейроны не позднее 25 дней после первичного контакта указанных клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что по меньшей мере 20% указанных дофаминовых нейронов экспрессирует FOXA2 и LMX1A и дополнительно экспрессирует по меньшей мере еще один маркер дофаминовых нейронов среднего мозга человека подтипа A9, выбранный из группы, состоящей из Girk2, CD142 и DCSM1.
  13. 13. Способ по п.11 или 12, дополнительно включающий отбор популяции дофаминовых нейронов, экспрессирующей CD142 или DCSM1, или оба маркера.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что указанная популяция клеток характеризуется существенно низким уровнем экспрессии по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из PAX6, EMX2 и LHX2.
    - 119 041083
  15. 15. Способ по любому из пп.1-14, дополнительно включающий осуществление контакта указанной популяции клеток с мозговым нейротрофным фактором (BDNF), аскорбиновой кислотой (AA), нейротрофным фактором глиальных клеток (GDNF), дибутирил цАМФ (dbcAMP) и трансформирующим фактором роста типа β3 (TGFe3) с получением дофаминовых нейронов.
  16. 16. Способ по любому из пп.1-15, дополнительно включающий осуществление контакта указанной популяции клеток с активатором передачи сигнала FGF.
  17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный активатор сигнала FGF представляет собой FGF8.
  18. 18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что контакт указанных клеток с указанным активатором передачи сигнала FGF осуществляют в течение до 144 ч с первичного контакта указанных клеток с ингибитором передачи сигнала SMAD.
  19. 19. Способ по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что указанный ингибитор сигнала SMAD выбран из группы, состоящей из LDN-193189, SB431542, Noggin, дорсоморфина и комбинаций перечисленного выше.
  20. 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что указанный ингибитор сигнала SMAD представляет собой 4-[4-(1,3-бензодиоксол-5 -ил)-5-(2-пиридинил)-1 H-имидазол-2-ил] бензамид (SB431542).
  21. 21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что активатор передачи сигнала SHH выбран из группы, состоящей из SHHs, агонистов Smoothened (SAGs) и комбинаций перечисленного выше.
  22. 22. Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что активатор передачи сигнала SHH представляет собой агонисты Smoothened (SAG).
  23. 23. Способ по п.21 или 22, отличающийся тем, что указанный SAG представляет собой пурморфамин.
  24. 24. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный SHH представляет собой рекомбинантный белок SHH.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок SHH по меньшей мере на 95% идентичен N-концевому фрагменту мышиного SHH.
  26. 26. Способ по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок SHH представляет собой SHH C25II.
  27. 27. Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала wingless (Wnt) представляет собой соединение, способное снижать передачу сигнала гликогенсинтазы 3бета 3β (GSK3e).
  28. 28. Способ по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала Wnt выбран из группы, состоящей из CHIR99021, Wnt3A, Wnt1 и комбинации перечисленного выше.
  29. 29. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что указанный активатор передачи сигнала Wnt представляет собой CHIR99021.
  30. 30. Способ по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что указанные клетки приводят в контакт с двумя ингибиторами передачи сигнала SMAD, которые представляют собой SB431542 и LDN-193189, и активатор сигнала wingless (Wnt) представляет собой CHIR99021.
  31. 31. Способ по любому из пп.1-30, дополнительно включающий трансфекцию указанных плюрипотентных стволовых клеток полисиалилтрансферазой (PST) перед приведением указанных плюрипотентных стволовых клеток в контакт с ингибитором передачи сигнала SMAD.
  32. 32. Способ по любому из пп.1-30, дополнительно включающий обработку указанной популяции клеток экзогенной PST.
EA201490796 2011-11-04 2012-11-02 Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro EA041083B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61/555,828 2011-11-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA041083B1 true EA041083B1 (ru) 2022-09-09

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11970712B2 (en) Midbrain dopamine (DA) neurons for engraftment
WO2021224496A1 (en) Methods for differentiating stem cells into dopaminergic progenitor cells
JP2020513823A (ja) 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法
EA041083B1 (ru) Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro
Joy Directed differentiation of human pluripotent stem cells to telencephalic lateral ganglionic eminence progenitors using small molecules