JP2011522520A - 細胞の脱分化を行う方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許商標庁に2008年5月6日付で出願され、シリアル番号第61/050,726号が与えられた「細胞の分化状態を調節する方法(Methods For Modulating The Differentiation Status Of A Cell)」の出願を引用し、これの優先権の利益を主張するものである。PCT規則4.18条に従い、本明細書に含まれていないPCT規則20.5(a)条に規定する明細書、請求の範囲または図面のいずれの要素または部分を組み入れることを含め、2008年5月6日付で出願された前記出願の内容は、引用によりあらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
本発明は、細胞の脱分化を行って、あまり分化していない細胞にする方法、たとえば多能性細胞にする方法に関する。したがって、この方法はとりわけ分化した体細胞から誘導多能性幹細胞を形成することを可能にする。この方法は、未分化細胞の多分化能を維持することも可能にする。
この目的は、Errタンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることによって解決される。
第三の態様において、本発明は、少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができる候補化合物を同定する方法あるいは未分化細胞の多分化能および/または自己複製特性を維持する方法を提供する。この方法は、Errタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に化合物を導入することを含む。この方法は、Errタンパク質の発現を測定することをさらに含む。Errタンパク質の増大した発現は、化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化の実施あるいは未分化細胞の多分化能および/または自己複製特性の維持が可能であることの現れである。
前記の化合物を含む製剤を経口的に使用することができ、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、並びにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールなどの可塑剤で作製されたソフト密封カプセルを包含する。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び/又はタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および場合によって安定剤との混合物で活性成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解もしくは懸濁させることができる。加えて、安定剤を添加することができる。経口投与用の全ての処方は、かかる投与に好適な用量である。口腔投与のために、組成物は、通常の方法で処方された錠剤もしくはロゼンジの形態を取ることができる。
(実施例)
細胞培養およびトランスフェクション
マウスES細胞を、ゼラチンでコーティングした皿上、15%の熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS、GIBCO)、0.055mMのβ−メルカプトエタノール(GIBCO)、2mMのL−グルタミン、0.1mMのMEM非必須アミノ酸、5,000単位/mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよび1,000単位/mlのLIF(Chemicon)を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM、GIBCO)中で培養し、2〜3日ごとに継代した。再プログラミングされた細胞、V6.4およびR1マウスES細胞を同じES細胞培地中マイトマイシンC処理マウス胚線維芽細胞(MEF)フィーダ上で培養し、2〜3日ごとに継代した。MEFを13.5d.p.c胚から、0.05%トリプシンで37℃にて10分間解離させることにより単離し、200μg/mlゲンタマイシンを含む15%FBS/DMEM中で培養した。この研究において、本発明者らは、MEFを5継代以内で使用して、複製老化を回避した。CD1、B6、129/B6、アクチン−GFP、アクチン−GFP/CD1、Pou5f1−GFP/B6マウス由来のMEFを、この研究においてiPS誘導のために使用した。shRNAおよび過剰発現プラスミドのトランスフェクションを、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を製造業者の指示にしたがって使用して実施した。簡単に言うと、1.5μgのプラスミドをRNAおよびタンパク質抽出のために60mmのプレート上ES細胞中にトランスフェクトした。ES細胞の非分化状態の指標であるアルカリ性ホスファターゼの検出を、Chemiconから市販のES Cell Characterization Kitを用いて実施した。プロマイシン(Sigma)選択をトランスフェクションの1日後、0.8μg/mlの濃度で導入し、収集前2〜6日間維持した。
全RNAを、TRIzol Reagent(Invitrogen)を用いて抽出し、RNAeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて精製した。SuperScript II Kit(Invitrogen)を用いて逆転写を実施した。DNA汚染をDNase(Ambion)処理によって除去し、RNAをRNAeasyカラム(Qiagen)によってさらに精製した。定量的PCR分析を、ABI PRISM7900 Sequence Detection SystemおよびSYBR Green Master Mixを記載されているようにして使用して、リアルタイムで実施した。使用した全てのプライマについて、それぞれが正しい大きさの一つの生成物を生成した。逆転写酵素がない四つの対照全てにおいて、シグナルは検出されなかった。それぞれのRNAi実験を、ES細胞の異なるバッチを用いて少なくとも3回繰り返した。Esrrb shRNAによって標的とされる配列は、Lohら(2006、上記)によって記載されている通りである。
野生型CD1マウス、B6マウス、アクチン−EGFPトランスジェニックマウスおよびPou5f1−EGFPトランスジェニックマウス(Jackson’s Lab,それぞれストック番号003516および004654)をMEF単離のために使用した。B6マウスを顕微注入のために使用した。
Esrrbおよび他の因子のCDSをPCRによってマウスES細胞から増幅させ、MMLV系pMXsレトロウイルスベクター中にクローンした。レトロウイルスは、TakahashiおよびYamanaka(2006、上記)によって記載されているようにして生成させた。iPS細胞を誘導するために、異なる因子をコードする等しい量のウイルスを、MEF上に、6ng/mlのポリブレンを含む15%FBS/DMEM中、50〜70%コンフルエンスで塗布した。24時間後、培地を新鮮なものと替え、翌日(2dpi)に、細胞をMEFフィーダ上で1:6〜1:20に分割した。培養物を次いでマウスES細胞培地中に11〜24日間維持した。
ガラス底皿中またはゼラチン化スライドカバー上MEFフィーダ上で培養したES細胞または再プログラミングされた細胞を、4%PFA/PBSで固定した。1%トリトン−X100/PBS中で30分間透過化後に、Nanogを1:20抗Nanog(RCAB0002PF,CosmoBio)で染色した後、1:300Alexa Flour568接合抗ウサギ(Invitrogen)で染色した。SSEA1を、1:200モノクローナル抗SSEA1(MAB4301,Chemicon)で直接染色し、続いて1:2000Alexa Flour546接合抗マウスIgMで染色した。DAPIもしくはHoechst(Invitrogen)を対比染色に使用した。免疫化学分析のために、E9.5胚を4%PFA中4℃で一夜固定し、パラフィン中に埋め込んだ。セクショニング後、GFPを、1:200抗GFP(sc−9996,Santa Cruz)、続いてHRP接合抗マウス(VECTASTAIN ABC kit,Vector)を用いて染色し、次いでDAB(3,3’−ジアミノベンジジン)を用いて発生させた。ヘマトキシリンを用いて核を対比染色した。
細胞を有糸分裂停止のためにコルセミドで処理し、標準的低張処理およびメタノール:酢酸(3:1)固定によって集めた。標準的空気乾燥法によってスライドを調製し、Gバンド染色体分析を実施した。
iPS細胞をM2培地(SAFC Biosciencesから入手可能(カタログ番号5170C)であり、M16胚培地の修飾物である)中に再懸濁させ、8細胞期B6マウス胚中に注入した。胚を次いで発生させて、iPS細胞が動物中に組み込まれる能力について試験した。
ChIP分析はすでに記載されているようにして実施した。簡単に言うと、細胞を1%ホルムアルデヒドで10分間室温にて架橋させ、ホルムアルデヒドを次いで125mMのグリシンの添加によって不活性化した。平均サイズが500bpのDNAフラグメントを含むクロマチン抽出物を、抗H3K4me3(Abcam)または抗H3K27me3(Upstate Biotech)抗体を用いて免疫沈降させた。全ChIP実験について、定量的PCR分析を、ABI PRISM 7900配列検出システムおよびSYBRグリーンマスターミックスを用いてすでに記載されているようにしてリアルタイムで実施した。見かけの免疫沈降効率(免疫沈降したDNAの量の、投入試料の量に対する比)を測定することによって相対的占有率値を計算し、観察されたレベルに対して標準化した。
Imprint(商標)DNA Modification Kit(Sigma)を製造業者の指示にしたがって用いて、DNAの重亜硫酸塩処理を実施した。ゲル濾過カラムを使用することによって増幅産物を精製し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)中にクローンし、M13順方向および逆方向プライマを用いて配列決定した。Nanogプロモータを増幅するために使用したプライマは、配列:5’−GATTTTGTAGGTGGGATTAATTGTGAATTT(配列番号8)および5’−ACCAAAAAAACCCACACTCATATCAATATA(配列番号9)を有していた。Oct4プロモータを増幅するために使用したプライマは、配列:5’−ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA(配列番号10)および5’−CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC(配列番号11)を有していた。
各反応について、MEF、ES細胞、iPS細胞または胚卵黄嚢から抽出したゲノムRNA500ngを用いてPCR増幅を実施した。増幅に使用したセンスプライマは以下の配列を有していた:5’−GACGGCATCGCAGCTTGGATACAC(配列番号1)。
Esrrb:5’−TGTGGTGGCTGAGGGCATCA(配列番号2)
Esrra:5’−TGTAGAGAGGCTCGATGCCCACCAC(配列番号3)
Esrrg:5’−GGCAAAGTTCTACCGAATCC(配列番号4)
Oct4:5’−CCAATACCTCTGAGCCTGGTCCGAT(配列番号5)
Sox2:5’−GCTTCAGCTCCGTCTCCATCATGTT(配列番号6)
cMyc:5’−TCGTCGCAGATGAAATAGGGCTG(配列番号7)
マイクロアレイ分析
細胞由来のmRNAを逆転写し、標識し、Illuminaマイクロアレイプラットフォーム(Sentrix Mouse−6 Expression BeadChip vl.l)を用いて分析した。アレイを製造業者の指示にしたがって処理した。マイクロアレイデータをSAMによって分析した。
すでに記載されている遺伝的に未修飾の線維芽細胞の直接再プログラミングを使用して(Blelloch,R.ら、Cell Stem Cell(2007)1,245−247、Meissner,A.ら、Nat Biotechnol(2007)25,1177−81)、Oct4、Sox2、c−MycおよびEsrrbを、マウス胚線維芽細胞(MEF)中で共発現させた。得られたES細胞様細胞を、アルカリ性ホスファターゼ、SSEA1およびNanogについて陽性に染色した(図2a〜図2g)。以下で、これらのOct4、Sox2、c−MycおよびEsrrb再プログラミング細胞は、OSCE再プログラミング細胞とも称する。先のレポートと一致して、Oct4、Sox2およびc−Mycは、安定したクローンの形成を誘導できない(データ不掲載、Blelloch,2007、上記、Nakagawa,2008、上記)。先のレポートは、再プログラミング細胞単離のためのストリンジェントな選択法としての内因性Pou5flレポータの活性化の使用を示している(Wernigら、2007、上記)。したがって、本発明者らは、MEFをPou5fl−GFPレポータとともに使用して(Szabo,P.E.ら、Mech Dev(2002)115,157−160)、Oct4、Sox2およびcMycを用いたES細胞様コロニーの誘導におけるEsrrbの潜在性をさらに検証した。ES細胞様コロニーは、9〜11dpi付近で出現した。本発明者らは、14dpiでGFP陽性コロニーの数を定量化した(図2h、図2i)。Esrrb再プログラミング細胞の生成効率は、Klf4、Oct4、Sox2およびc−Mycの導入によって得られるものの約50%であった(図2j)。この結果から、EsrrbはMEFの再プログラミングにおいてKlf4と置き換わることができることがわかった。
Esrrb再プログラミング細胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは発現プロファイリングを実施して、二つのES細胞系、三つの再プログラミング細胞系(Esrrb再プログラミング細胞系について二つ、およびKlf4再プログラミング細胞系について一つ)ならびに二つのマウス系統由来のMEFのトランスクリプトームを捕捉した。クラスター分析によって、再プログラミング細胞系がMEFよりもES細胞に類似していることがわかった(図3a)。本発明者らのマイクロアレイ分析によって、再プログラミングされた細胞におけるES細胞関連遺伝子の上方調節およびMEF関連遺伝子の下方調節も明らかになった(図3b)。
ES細胞特異的遺伝子、たとえばNanogおよびPou5flはES細胞において高度に発現され、これらのプロモータ領域はDNAメチル化が不足している。MEFにおいて、これらの遺伝子を抑制し、これらのプロモータはDNAメチル化を獲得する。従来の研究から、再プログラミングがメチル化の除去につながることがわかっている(Wernigら、2007、上記、Maherali,N.ら、Cell Stem Cell(2007)1,55−71、Okita,K.ら、Nature(2007)448,313−7)。本発明者らは、ES細胞、MEFおよび二つの再プログラミング細胞系の重亜硫酸塩シークエンシングによって、NanogおよびPou5flプロモータでのDNAメチル化の状態を分析した。結果から、DNAメチル化が本発明者らの再プログラミング細胞系では失われたことがわかった(図4a)。
得られた再プログラミングされた細胞が多能性であるかどうかを評価するために、これらの細胞を細胞期C57/BL6胚中に顕微注入した。OSCE再プログラミング細胞はアクチン−GFPレポータを用いてMEFから誘導されるので、これらはGFP陽性である。これらの細胞を胚盤胞中に導入する前に、本発明者らまず、OSCE番号8およびOSCE番号13細胞系が正常な核型を有することを立証した(図9a、図9bを参照)。胚盤胞中に注射した後、OSCE番号8およびOSCE番号13細胞系は、9.5d.p.c.胚がGFP標識細胞のモザイク組み込みを示したので、マウス胚に貢献した(図6a〜図6f)。キメラ胚の卵黄嚢組織中に四つのレトロウイルスが存在することが、PCR検出分析によってさらに確認された(図9cを参照)。胚の免疫染色も、GFP陽性細胞が全組織に貢献することを示した(図6g〜図6i)。したがって、OSCE再プログラミング細胞は多能性であり、インビボで三つの系統に分化することができる。
Claims (41)
- 少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持する方法であって、前記細胞におけるエストロゲン関連受容体(Err)タンパク質、またはその機能的フラグメントの量または活性を増大させることを含む、方法。
- 前記Errタンパク質が、Esrrbタンパク質、Esrrdタンパク質およびEsrrgタンパク質のうちの一つである、請求項1に記載の方法。
- Oct4およびSox2のうちの一つの量または活性を増大させることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも部分的に分化した細胞が、最終分化した体細胞、前駆細胞(precursor cell)、系統限定(lineage−restricted)幹細胞、体性幹細胞および前駆細胞(progenitor cell)のうちの一つである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記未分化細胞が、幹細胞、生殖細胞、卵母細胞、割球、および内細胞塊細胞のうちの一つである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞における前記Errタンパク質の量を増加させることが、前記Errタンパク質の発現を増大させることを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Errタンパク質の前記発現を、核酸分子によって増大させる、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸分子が異種核酸分子である、請求項7に記載の方法。
- 前記核酸分子がRNA又はDNAである、請求項7または8に記載の方法。
- 前記核酸分子が、Errタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする配列を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞における前記Errタンパク質の活性を増大させることが、前記Errタンパク質の核酸標的配列との相互作用を調節することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸標的配列がエストロゲン応答エレメントまたは回帰性甲状腺ホルモン応答エレメントを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞における前記Errタンパク質の活性を増大させることが、(i)前記Errタンパク質とタンパク質、(ii)前記Errタンパク質と化合物、および(iii)前記Errタンパク質とタンパク質と化合物のうちの一つとの間で複合体を形成することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、ペプチド、ペプトイド、無機分子および低分子量有機分子からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記Errタンパク質がEsrrbタンパク質であり、前記低分子量有機分子が、4−ヒドロキシ安息香酸アリールヒドラジド、フラボンフィトエストロゲンおよびイソフラボンフィトエストロゲンである、請求項14に記載の方法。
- 前記タンパク質が、GRIP1、SRC−1a、ACTRおよびPPARガンマコアクチベータのうちの一つである、請求項13または14に記載の方法。
- 前記PPARガンマコアクチベータが、PGC−1αおよびPGC−1βのうちの一つである、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞における前記Errタンパク質の活性を増大させることが、前記Errタンパク質の翻訳後修飾の変更を起こさせることを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記翻訳後修飾が、リン酸化、SUMO化およびこれらの組み合わせのうちの一つである、請求項18に記載の方法。
- (i)前記Errタンパク質、又はその機能的フラグメントの前記細胞における前記量または活性、および
(ii)前記細胞中の分化状態のマーカーの存在
のうちの一つを評価することをさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞の前記分化状態の前記マーカーが、
(i)Nanog、Oct4、Sox2、Sall4、Tc11、Tbx3、Eras、Klf2、Klf4、Klf5、Baf250a、BC031441、Eno3、Etv5、Gm1739、Gtf2h3、Hes6、Jub、Mtf2、Myod1、Nmyc1、Notch4、Nr5a2、Nrg2、Otx2、Rab2b、Rbpsuh、Rest、Stat3、Utf1、Tcfap2cおよびZfp553のうちの一つの発現、または
(ii)Nanog、Oct4、Sox2、Sall4、Tc11、Tbx3、Eras、Klf2、Klf4、Klf5、Baf250a、BC031441、Eno3、Etv5、Gm1739、Gtf2h3、Hes6、Jub、Mtf2、Myod1、Nmyc1、Notch4、Nr5a2、Nrg2、Otx2、Rab2b、Rbpsuh,Rest、Stat3、Utf1、Tcfap2cおよびZfp553のうちの一つのプロモータのメチル化状態
である、請求項20に記載の方法。 - 前記Errタンパク質の前記量及び活性の少なくともいずれか一方を評価することが、前記量および活性の少なくともいずれか一方をある期間にわたって評価することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記Errタンパク質の前記細胞における量の評価を、前記細胞における前記Errタンパク質の遺伝子発現を測定することによって行う、請求項20に記載の方法。
- Err遺伝子発現の測定結果を対照測定の結果と比較することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記対照測定が、Err遺伝子発現を少なくとも本質的に調節しない条件の使用を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞における分化状態のマーカーの存在の評価が、前記マーカーの発現および活性の少なくともいずれか一方をある期間にわたって測定することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞が、宿主生命体から得られるか、または宿主生命体中に含まれる、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主生命体が、微生物、魚、両生類、鳥および哺乳動物のうちの一つである、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血細胞、マクロファージ、単球、および単核細胞からなる群から選択される哺乳動物体細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記細胞が培養される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- Errタンパク質の発現および活性の少なくともいずれか一方を調節する化合物を投与することを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法によって得られる脱分化した細胞。
- 請求項32に記載の脱分化した細胞の集団。
- 少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持することができる候補化合物を同定する方法であって、Errタンパク質、またはその機能的フラグメントを発現できる細胞中に前記化合物を導入する工程と、前記Errタンパク質の発現を測定する工程とを含み、前記Errタンパク質の増大した発現が、前記化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持できることを示す方法。
- 前記Errタンパク質が、Esrrbタンパク質又はEsrrgタンパク質である、請求項34に記載の方法。
- 少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持できる化合物を同定するインビトロ法であって、前記化合物、Errタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにNanogおよびOct4の少なくともいずれか一方を接触させる工程を含み、前記Errタンパク質とNanogおよびOct4の少なくともいずれか一方との間の複合体形成の促進が、前記化合物が少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うことができるか、または未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくとも一つを維持できることを示す方法。
- (a)Errタンパク質、またはその機能的フラグメント、ならびにNanogおよびOct4の少なくともいずれか一方の複合体形成を調節可能であると予測される化合物を試験管に添加する工程と、
(b)前記Errタンパク質、またはその機能的フラグメントを前記試験管に添加する工程と、
(c)NanogおよびOct4の少なくともいずれか一方を前記試験管に添加する工程と、
(d)前記複合体形成を検出する工程と
を含む、請求項36に記載の方法。 - 前記検出する工程を、好適な分光法、光化学的方法、測光法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学的方法によって行う、請求項37に記載の方法。
- 前記Errタンパク質が、Esrrbタンパク質、Esrrdタンパク質およびEsrrgタンパク質のうちの一つである、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも部分的に分化した細胞の脱分化を行うか、未分化細胞の多分化能および自己複製特性の少なくともいずれか一方を維持する薬剤の製造における、Errタンパク質の細胞での絶対量を増大させる核酸分子および化合物の少なくともいずれか一方の使用。
- 前記Errタンパク質が、Esrrbタンパク質、Esrrdタンパク質およびEsrrgタンパク質のうちの一つである、請求項40に記載の方法。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014525268A (ja) * | 2011-08-30 | 2014-09-29 | ザ ジェイ. デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ | 心筋細胞を生成するための方法 |
JP2017512472A (ja) * | 2014-03-27 | 2017-05-25 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 1型および2型糖尿病ならびに関連障害を治療するための組成物および方法 |
JP2018506294A (ja) * | 2015-02-27 | 2018-03-08 | ソーク インスティチュート フォー バイオロジカル スタディーズ | リプログラミング前駆体組成物およびその使用方法 |
US11685901B2 (en) | 2016-05-25 | 2023-06-27 | Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for organoid generation and disease modeling |
US11981931B2 (en) | 2020-12-08 | 2024-05-14 | Salk Institute For Biological Studies | Reprogramming progenitor compositions and methods of use thereof |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110177042A1 (en) * | 2008-10-03 | 2011-07-21 | Meenhard Herlyn | Method for Dedifferentiating Melanocytes |
EP2483395B1 (en) * | 2009-09-30 | 2016-12-07 | Agency For Science, Technology And Research | A nuclear receptor and mutant thereof and the use of the same in the reprogramming of cells |
US9517250B2 (en) | 2010-04-28 | 2016-12-13 | The J. David Gladstone Institutes | Methods for generating cardiomyocytes |
US9234180B2 (en) | 2010-06-02 | 2016-01-12 | Agency For Science, Technology And Research | Method for inducing pluripotency in human somatic cells with PRDM14 or NFRKB |
US20120064041A1 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-15 | Arshak Alexanian | Efficient Generation of Neurally-Induced Mesenchymal Stem Cells and Applications Thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005080598A1 (ja) * | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
WO2007069666A1 (ja) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
AU5132096A (en) | 1995-01-30 | 1996-08-21 | Terrapin Technologies, Inc. | Glubodies - multiplicities of proteins capable of binding a variety of small molecules |
US6090622A (en) | 1997-03-31 | 2000-07-18 | The Johns Hopkins School Of Medicine | Human embryonic pluripotent germ cells |
DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
AU2002245978A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-10-21 | Jane E. Aubin | Estrogen receptor-related receptor alpha (err) agonist for inducing cartilage formation |
WO2003018780A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Advanced Cell Technology, Inc. | De-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies |
WO2003029462A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins |
WO2005019255A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-03 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of tear lipocalin |
AU2003264100A1 (en) | 2003-08-25 | 2005-03-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target |
US7544838B2 (en) * | 2005-01-21 | 2009-06-09 | City Of Hope | Ligands for estrogen related receptors and methods for synthesis of said ligands |
EP2059615A2 (en) | 2006-08-17 | 2009-05-20 | Ordway Research Institute, Inc. | Prognostic and diagnostic method for disease therapy |
EP2982744A1 (en) | 2007-02-23 | 2016-02-10 | Advanced Cell Technology, Inc. | Highly efficient methods for reprogramming differentiated cells and for generating animals and embryonic stem cells from reprogrammed cells |
CA2695590C (en) * | 2008-06-27 | 2018-01-09 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
-
2008
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005080598A1 (ja) * | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
WO2007069666A1 (ja) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
CELL, vol. Vol.126, Issue4, JPN6014042563, 2006, pages 663 - 676, ISSN: 0002912545 * |
J.MED.CHEM., vol. 48, JPN6013048691, 2005, pages 3107 - 3109, ISSN: 0002645447 * |
NATURE, vol. 442, JPN6013048688, 2006, pages 533 - 538, ISSN: 0002645446 * |
PNAS, vol. 104, no. 42, JPN6013048686, 2007, pages 16438 - 16443, ISSN: 0002645445 * |
最新医学, vol. 60, no. 8, JPN6013048693, August 2005 (2005-08-01), pages 1677 - 1682, ISSN: 0002645448 * |
血管, vol. 28, no. 2, JPN6013048683, 2005, pages 33 - 38, ISSN: 0002645444 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014525268A (ja) * | 2011-08-30 | 2014-09-29 | ザ ジェイ. デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ | 心筋細胞を生成するための方法 |
JP2017512472A (ja) * | 2014-03-27 | 2017-05-25 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 1型および2型糖尿病ならびに関連障害を治療するための組成物および方法 |
JP2018506294A (ja) * | 2015-02-27 | 2018-03-08 | ソーク インスティチュート フォー バイオロジカル スタディーズ | リプログラミング前駆体組成物およびその使用方法 |
JP2019107026A (ja) * | 2015-02-27 | 2019-07-04 | ソーク インスティチュート フォー バイオロジカル スタディーズ | リプログラミング前駆体組成物およびその使用方法 |
US10920199B2 (en) | 2015-02-27 | 2021-02-16 | Salk Institute For Biological Studies | Reprogramming progenitor compositions and methods of use therefore |
JP7449648B2 (ja) | 2015-02-27 | 2024-03-14 | ソーク インスティチュート フォー バイオロジカル スタディーズ | リプログラミング前駆体組成物およびその使用方法 |
US11685901B2 (en) | 2016-05-25 | 2023-06-27 | Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for organoid generation and disease modeling |
US11760977B2 (en) | 2016-05-25 | 2023-09-19 | Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for organoid generation and disease modeling |
US11981931B2 (en) | 2020-12-08 | 2024-05-14 | Salk Institute For Biological Studies | Reprogramming progenitor compositions and methods of use thereof |
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