JP2008511321A - 幹細胞/前駆細胞の多分化能の維持方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(0019)本発明は、POU特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子、ならびにHMGドメインを含む転写因子が、in vitroおよびin vivoのいずれにおいてもnanogのプロモータと複合体を形成し、さらに、この複合体の形成がタンパク質Nanogの発現を調節するという驚くべき発見に基づいている。さらに驚くべきことに、このような結合領域の少なくとも1つが累積して2億五千万年以上もの進化の間、不変のままであることが判った。
第2号、p.127〜132)。Sox2とOct4のいずれも、他の細胞タイプを決定する際に独立した役割を果たし(ニワ、エイチ.(Niwa,H.)ら、2000年、Nat Genet 第24巻、p.372〜37;非特許文献6)、多分化性細胞におけるそれらの機能の少なくとも一部は、標的遺伝子の転写を駆動するために2者の間の相乗作用を介する。
ドメインを含む転写因子から選択される。多くの実施形態において、ホメオドメインはPOU−ホメオドメインである。POU特異的ドメインは一般には75〜82アミノ酸長であり、POU−ホメオドメインは約60アミノ酸長である。天然の転写因子において、これらの2つのドメインは典型的には一緒になっていわゆるPOUドメインを構成し、この場合、POU特異的ドメインはN末端領域を形成し、POU−ホメオドメインはC末端領域を形成する。POU特異的ドメインおよびPOUホメオドメインのいずれも本発明において必要ではあるが、nanog遺伝子のプロモータとの複合体形成が起こりさえすれば、該ドメインを任意の配置構成で選択することができる。多くの実施形態において、該ドメインは適切な長さのリンカー領域によって連結される。当業者であれば、POUドメイン外の非保存配列が標的配列のトランス活性化に参加するとの報告を認識しているであろう。したがって、人工的に作成した転写因子、またはその機能的断片の、本発明の方法への適合性は、該転写因子または断片のnanogへの結合に関して調べる必要がある(下記およびたとえば、実施例2または3、図2または図3を参照)。適切な転写因子の例としては、限定はされないが、Pit−1,Oct−1,Oct−2、Oct−4、Oct−6、Oct−11、Brn−3、Brn−3A、BおよびC、肝細胞核因子lαおよびβ、網膜由来POUドメイン因子−1、精子1POU−ドメイン転写因子、ラットタンパク質Rov−1、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の転写因子POUl、POU2、GBX−2およびOct−1.5、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の転写因子Cfla、カタユウレイボヤ(Ciona intestinalis)の因子(NCBIアクセス番号BAE06650)、線虫(C.elegans)遺伝子unc−86によってコードされるタンパク質、線虫の因子ceh−6、ショウジョウバエ(Drosophila)タンパク質dPOU−19/pdm−1およびdPOU−19/pdm−2、およびゼブラフィッシュの因子pou5fl/pou2が挙げられる。説明的な例としては、転写因子Oct−1、Oct−4およびOct−6が、nanogプロモータ上の領域に結合することが示されている(ウー、ディー.(Wu,D)、ヤオ、ズィー.(Yao,Z)、2005年、Cell Research 第15巻、第5号、p.317〜324)。
Sox11,Sox−13,Sox14,Sox15,Sox18,Sox20,Sox21,Sox30,Sox32またはアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の因子Sox−11−D、またはこれらの機能的断片が挙げられる。
ことをさらに含む。
の転写因子について任意の数の結合領域を有していてもよい。たとえば、2つの部分からなる結合部位であってもよい。そのような結合要素は、たとえば、2つの転写因子Sox2およびOct4に対して存在することが知られている。8量体とsox結合部位を含み、Sox2およびOct4の標的となる複合要素を含む遺伝子は、Fgf4,Utfl,Fbx15およびSox2、ならびにPou5fl(Oct4をコードする遺伝子)自体である(ユアン、エイチ.(Yuan,H.)ら、前掲;ニシモト、エム.(Nishimoto,M.)ら、前掲;トクザワ、ワイ.(Tokuzawa,Y.)ら、前掲;トミオカ、エム.(Tomioka,M.)ら、前掲;チュー、ジェイ.エル.(Chew,J.−L.)ら、2005年、Mol.Cell.Biol.第25巻、第14号、p.6031〜6046;オクムラ‐ナカニシ、エス.(Okumura−Nakanishi,S.)ら、2005年、J.Biol.Chem.第280巻、p.5307〜5317)である。本願発明者は、nanogプロモータ内の各複合要素を同定した(たとえば、図5Aを参照)。いくつかの実施形態において、複合結合要素はoct4/Sox2結合部位である。oct4/Sox2結合部位内では、oct4およびSox2に対する結合領域は、Sox2およびoct4の両者が同時に該複合結合部位に結合できさえすれば、任意の配向、かつ任意の相対位置に配置されていてよい。2つの領域は、たとえば、互いに直接隣接していてもよい(図5Aを参照)。
沈降アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴などの結合要素の同定に適した例も挙げられる。
梢血から得られる内皮前駆細胞などの前駆細胞は、NanogやOct−4の高い発現レベルを示すことが発見されている(ロマグナニ、ピー.(Romagnani,P.)ら、2005年、Circ.Res.第97巻、p.314)。網膜前駆細胞などのCNS前駆細胞は、Sox2を高レベルで発現することが報告されている(グラハム、ブイ.(Graham,V.)ら、2003年、Neuron 第39巻、第5号、p.749〜765;クラッセン、エイチ.(Klassen,H.)ら、2004年、J.Neurosci.Res.第77巻、第3号、p.334〜343)。
Kawataba,K)ら、前掲)。nanogプロモータ(内在性または外来性のいずれの起源であっても)の活性化を容易にするために、nanogプロモータを含むベクターを細胞内に導入することが有益であるかもしれない。さらに、たとえばタンパク質を得るために、nanogプロモータを用いて外来性遺伝子を発現することが望ましい場合がある。この場合、典型的には、nanogプロモータ制御下に所望の外来性遺伝子を含むベクターが選ばれる。この目的のために、任意の所望の遺伝子の配列を各ベクターに含めることができる。当業者であれば、それぞれ転写されたタンパク質が本発明の方法において用いられる細胞内で翻訳後修飾を受けることが望ましい場合には、さらに酵素を同時発現することが必要なこともあることに気づくであろう。
つの転写因子またはその機能的断片と、nanogプロモータの各結合要素との複合体形成の阻害によるものかもしれない(上記参照)。
たは、POUドメインおよびホメオドメインを含む転写因子および/またはHMGドメインを含む転写因子のプロモータのメチル化状態を調節する化合物である。説明的な例として、脱メチル化分子5−アザシチジンが、Sox2およびOct4の発現を増加させることが発見されている(ツジ‐タカヤマ(Tsuji−Takayama)ら、2004年、Biochem.Biophys.Res.Commun.第323巻、p.86〜90)。
子の発現の損失をもたらす(簡単な概説として、ザモア、ピーディー(Zamore,PD)、ハーレイ、ビー(Haley,B)、2005年、Science 第309巻、p.1519〜1524を参照されたい)。この技術は、たとえば、米国特許出願第2005/0191618号明細書に開示されるように、寄生DNA配列のサイレンシング、たとえばHIV RNAの開裂に応用されてきた。
(0073)すべての配列は、www.ncbi.nlm.nih.govおよび/またはwww.ensembl.org.にある公的に利用可能なデータベースから得た。ウシ(Bos taurus)およびアフィリカゾウ(Loxodonta africana)のNanogプロモータ領域は、NCBIにおいて入手可能なトレースファイル配列から構築した。ウェブ上(www-gsd.lbl.gov/vista )のVistaゲノム配列アラインメントツール(メイヤー(Mayor)ら、2000年)を用いて、マウスとヒトのNanogゲノム配列を比較した。マウスnanogおよびヒトNanogおよびNanogGP1に対するプロモータ領域を適当な生物種のゲノムDNAから増幅した。増幅のためのプライマーは、クローニング用の制限酵素切断部位(小文字で示す)を備えた下記の
nanog順方向 5’−CGCgtcgacTAAAGTGAAATGAGGTAAAGCC−3’(配列番号1)、
nanog逆方向 5’−CGCggatccGGAAAGATCATAGAAAGAAGAG−3’(配列番号2)、
Nanog順方向 5’−CGGctcgagTTGCTCGGTTTTCTAGTTC
C−3’(配列番号3)、
Nanog逆方向 5’−CGGctcgagCAAGAAATTGGGATAAAGTGAG−3’(配列番号4)、
NanogGP1順方向 5’−CGGctcgagTTGCTCGGTTTTCTAGTTCC−3’(配列番号5)、
NanogGP1逆方向 5’−CGGctcgagCAAGAAGTTGTGATGAAGTGAG−3’(配列番号6)
とした。マウスnanogプロモータ断片を、pGL3−Basicベクター(プロメガ(Promega))およびpEGFP1ベクター(クロンテック(Clontech))の両方にクローニングし、ヒトプロモータはpGL3−Basicだけにクローニングした。すべての構築物について配列確認を行った。
(0074)E14マウスESCを、ダルベッコ改変イーグル培地、20%ウシ胎仔血清、1×非必須アミノ酸、0.1mMの2−メルカプトエタノール、および組換えLIF調整培地のアリコート中で培養した。標準的なプロトコールを用いてNanogEGFP構築物でESCを安定的にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性マウス胚線維芽細胞上で培養した細胞を用いて300μg/mLのG418で10日間選択した後に、個々のコロニーを採取した。ESCを、LIF調整培地の回収、胚様体への自発的分化、またはレチノイン酸の添加により分化させた。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、FACSCalibur(商標)(ビーディーバイオサイエンシズ(BD Biosciences))で行った。内在性Nanogおよび強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)レポータの発現の定量は、ABI PRISM(登録商標)7900配列検出システム(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))を用いてリアルタイムの逆転写PCR分析によって行った。この分析のためにProligo(登録商標)により合成されたプライマーとプローブのセットは以下の
Nanog順方向、5’−GGTTGAAGACTAGCAATGGTCTGA−3’(配列番号7)
Nanog逆方向、5’−TGCAATGGATGCTGGGATACTC−3’(配列番号8)
Nanogプローブ、5’−TTCAGAAGGGCTCAGCACCA−3’(配列番号9)
EGFP順方向、5’−CGACAACCACTACCTGAGCAC−3’(配列番号10)
EGFP逆方向、5’−TCGTCCATGCCGAGAGTGAT−3’(配列番号11)
EGFPプローブ、5’−CGGCGGCGGTCACGAACTCCAGC−3’(配列番号12)
である。発現はa−アクチン対照(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))に対して正規化した。ヒトESC株HUES−6(ハーバード大学のダグ・メルトン氏(Doug Melton)より入手)は、カウアン(Cowan)ら(2004年、N.Engl.J.Med.第350巻、p.1353〜1356)に従って継代した。
(a)RNAi分析
(0075)本実施例では、nanog遺伝子活性のダウンレギュレートによる細胞効果をどのようにして分析するかについて説明する。実施例6(下記参照)に示すのと同様の方法から、NanogのダウンレギュレーションがESCの分化に繋がることが判った。
GFP RNAi(対照)用として、
5’−GATCCCCGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAGAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTTTTA−3’(配列番号13)および
5’−AGCTTAAAAAGAACGGCATCAAGGTGAACTCTCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCGGG−3’(配列番号14)
Nanog RNAi用として、
5’−GATCCCCGAACTATTCTTGCTTACAATTCAAGAGATTGTAAGCAGAATAGTTCTTTTTA−3’(配列番号15)および
5’−AGCTTAAAAAGAACTATTCTTGCTTACAATCTCTTGAATTGTAAGCAAGAATAGTTCGGG−3’(配列番号16)
とした。E14ES細胞を、50%コンフルエントの状態でshRNAプラスミドおよびGFPプラスミドで同時にトランスフェクションした。
(0077)NanogRNAiが、Sox2またはOct4などの他の転写因子に影響を与えることなくNanog発現を特異的にダウンレギュレートするかどうかを調べるために、SDS−PAGEおよび続くウェスタンブロットによってタンパク質レベルを分析した。この2つの方法は当業者に周知である。Nanog発現ベクターを、対照、Nanog、Oct4またはSox2のsiRNAを発現する構築物とともに、293T細胞に同時トランスフェクトした。細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、抗Nanog抗体または抗βアクチン抗体を用いて行い、βアクチンを装荷量の対照とした。
RNAi(実施例6参照)は、Nanogの発現に影響を及ぼさなかった。このNanog siRNAは、同時発現させたSox2またはOct4のレベルに影響を及ぼさなかった(図1B、Cを参照)。これらのデータから、Nanog siRNAがNanogに対して特異的であり、POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子ならびにHMGドメイン含有転写因子に対するモデルタンパク質として選ばれた他の2つの転写因子には影響を及ぼさないことがわかった。
(0082)当該技術分野において電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)として知られるアッセイを用いて、Oct4およびSox2が、nanogプロモータ内の要素と複合体を形成することができるかを判定した。
FOS、5’−TTTAAGTATCCCATTAGCATCCAAACAAAGAGTTTTC−3’(配列番号17);
NOS、5’−CTTACAGCTTCTTTTGCATTACAATGTCCATGGTGGA−3’(配列番号18);
NmOS、5’−CTTACAGCTTCTTTCAAATTACAATGTCCATGGTGGA−3’(配列番号19);
NOmS、5’−CTTACAGCTTCTTTTGCATTAACCTGTCCATGGTGGA−3’(配列番号20);
NmOmS、5’−CTTACAGCTTCTTTCAAATTAACCTGTCCATGGTGGA−3’(配列番号21);
NNS、5’−CTGCAGGTGGGATTAACTGTGAATTCA−3’(配列番号22)
である(図4Aを参照)。DNA結合反応のためには、2μl(約16μg)の核抽出物を、50nM二本鎖標識オリゴヌクレオチドと5μgのポリdGdC(アマシャム(Amersham))とを含む反応物に添加して反応体積10μl(最終)とした。最終的な結合バッファ組成は、60%透析バッファとした。核抽出物を加える前に、所定の1μM非標識オリゴヌクレオチド競合物も含めた。結合反応は、室温(RT)で約20分間行った。所定の2μl(抗Oct4および抗JunB)または8μl(抗Sox2および抗Sox4)の抗体を最初の結合反応に続いて付加し、さらに20分間インキュベートした。サンタクルーズ(Santa Cruz)より購入した抗体は以下の通りである。ウサギ抗Oct4ポリクローナル抗体(H−134)sc−9081x;ヤギ抗Sox2ポリクローナル抗体(Y−17)sc−17320;ウサギ抗JunBポリクローナル抗体(N−17)sc−46x;ヤギ抗Sox4ポリクローナル抗体(C−20)sc−17326。結合反応物を、プレラン済みの6%非変性ポリアクリルアミドゲルで、0.5×TBE中、バイオラッド(Bio−Rad)protean(登録商標)II xi装置で300Vにて2時間かけて分離した。ゲルは、モレキュラーダイナミクス(Molecular Dynamics)のTyphoon(商標)9140型画像解析装置を用いて、赤色レーザ(633nm)ならびに、設定を600V、通常感度および焦点面+3mmとしたPMTとともにcy5エミッションフィルタを用いて、ガラス板中で直接撮影した。マウス胚線維芽細胞フィーダーのみについて行ったEMSAでは、有意な移動度シフトは生じなかったことから、それらが観察されるタンパク質DNA複合体に寄与しないことが示された。
表されている、FGF4要素に結合するF9テラトカルシノーマ細胞抽出物中のOct4およびSox2を同定した結果と矛盾するものではない。
(0091)in vivoにおけるNanogと転写因子との間の相互作用を分析する方法は、当業者には「クロマチン免役沈降アッセイ」または「ChIPアッセイ」とし
て知られている。
Biosystems))およびSYBR Greenマスターミックス(アプライドバイオシステムズ)を用いて、既述(ン、エイチ.エイチ.(Ng,H.H.)ら、2003年、Mol Cell 第11巻、p.709〜719)のようにリアルタイムで行った。相対占有率は、見かけ上の免役沈降効率(入れた試料の量に対する免役沈降したDNA量の比)を測定し、対照の領域について観察されたレベルを1.0として正規化することによって算出した。プライマー対は以下のとおり、すなわち
1、5’−GGCAAACTTTGAACTTGGGATGTGGAAATA−3’(配列番号23)、
5’−CTCAGCCGTCTAAGCAATGGAAGAAGAAAT−3’(配列番号24);
2、5’−GAGGATGCCCCCTAAGCTTTCCCTCCC−3’(配列番号25)、
5’−CCTCCTACCCTACCCACCCCCTATTCTCCC−3’(配列番号26);
3、5’−GGGTCACCTTACAGCTTCTTTTGCATTA−3’(配列番号27)、
5’−GGCTCAAGGCGATAGATTTAAAGGGTAG−3’(配列番号28);
4、5’−GGTGATACGTTGGCCTTCTAGTCTGAA−3’(配列番号29)、
5’−GGGCAAATTGCAAACTAACTGTATAACCTC−3’(配列番号30)
とした。
いずれからもアンプリコンのいずれについても有意な富化は見られなかった(データ示さず)。ここで同定された富化のレベルは、EGFPレポータ系を用いた上述の類似の分化プロトコールにおけるNanogプロモータの活性の場合とよく対応している。
(0096)本実施例では、Nanog遺伝子上の結合領域を、その配列保存性に基づいてどのようにして同定できるかを説明する。
(0097)本発明者らは、nanogの高度に保存された結合領域、sox−oct複合要素を同定済みである。マウスおよびヒト遺伝子配列のペアワイズなアラインメントを、エルビーエル・バークレー(LBL Berkley)のVistaオンラインツール(メイヤー、シー.(Mayor,C.)ら、2000年、Bioinformatics 第16巻、p.1046〜1047)を用いて作成し、作成にあたっては、最適なアラインメントの作成時に種特異的な反復要素を考慮した。このアラインメントに対しては、マウスnanogESTの最も5’側の10kb上流から、3’マウスnanogESTの最も3’側の10kb下流までのゲノム領域を選択した。配列類似性のピークがnanogの4つのエキソンに対応して同定されたが、ホメオドメインをコードするエキソン2および3で最も顕著であり、エキソン1で最も顕著でなかった(データ示さず)。非コーディング領域のなかでは、ESTの最も5’側のすぐ上流に、近位プロモータと定義される、有意な配列保存性を有する唯一の領域がみつかった。
(0101)広範囲の哺乳類から近位プロモータ領域のアラインメントを作成することにより、同定を強力な系統発生学的フットプリントにすることができる。このアラインメントの構築にあたって使用した5つの種の間の分岐年代は、控えめに見積もっても、マウスとラットの分岐については千2百万年前であり、マウス、ラット、ヒト、ウシおよびゾウの間では六千万年前であるが、この見積もりから、フットプリントを同定するための累積2億5千2百万年の浄化選択が提供される。最も大きい配列保存の長さは、nanog転写開始部位との相対位置−212から−119までに位置する94塩基対領域にわたり、このうち64位置が不変である(図5Aを参照)。
(0104)本実施例では、NANOGと、(POU)特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにHMGドメインを含む転写因子との複合体形成の、多分化性細胞の転写活性化に対する影響の分析について説明する。
中の保存配列のすぐ5’側から始まるこの野生型プロモータのより短いもの(−230〜+63)は、元のプロモータ活性の約130%を維持していた。このことは、この短いプロモータから除外された配列内に潜在的な負の調節要素が含まれていることを示唆するだけでなく、多分化能エンハンサ要素が−230〜+63の領域内に含まれることを示している。
(0110)本実施例では、NANOGと、(POU)特異的ドメインおよびホメオドメインを含む転写因子ならびにHMGドメインを含む転写因子とのあいだの複合体形成による、Nanogプロモータの活性調節の分析について示す。本実施例においては、Oct4およびSox2がNanogプロモータの多分化性活性に与える影響を分析した。
ウミシイタケルシフェラーゼを発現する正規化対照)をトランスフェクトした。
Sox2、5’−GAAGGAGCACCCGGATTA−3’(配列番号31);
Oct4、5’−GAAGGATGTGGTTCGAGT−3’(配列番号32)
である。
a参照文献:Fgf4:ハート(Hart)ら、前掲;
Utfl:ニシモト(Nishimoto)ら、前掲;
Sox2:トミオカ(Tomioka)ら、前掲;
Fbxl5:トクザワ(Tokuzawa)ら、前掲;
Nanog:本願発明者;
Pou5fl:本願発明者,オクムラ‐ナカニシ(Okumura−Nakanishi)ら、前掲
b転写開始部位から
cMPSS:超並列シグニチャシーケンシング(ウェイ(Wei)ら、前掲)
dtpm,マウスESCにおける100万あたりのタグ数
Claims (44)
- 幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方の、多分化能または自己再生特性のうち少なくともいずれか一方を維持する方法であって、
(a)少なくとも2つの転写因子またはその機能的断片を、nanog遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも2つの転写因子の一方はPOUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも2つの転写因子の他方はHMGドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
(b)前記少なくとも2つの転写因子がnanogプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してnanog遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。 - 前記POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、POU−ホメオドメインであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記複合体形成を検出する工程をさらに含む請求項1または2に記載の方法。
- (c)幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方におけるnanog遺伝子発現を測定する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- (d)工程(c)において得られた測定結果を、対照測定の結果と比較する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子は、nanogプロモータ上でヘテロ複合体を形成することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ヘテロ複合体は、2つの転写因子からなるヘテロ二量体であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子は相乗的に作用して、nanog遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はOct4であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- HMGドメイン含有転写因子はSox2であることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子は、nanogプロモータ内の複合結合要素に結合し、前記POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子は複合結合要素の一方部分に結合し、前記HMGドメイン含有転写因子は複合結合要素の他方部分に結合することを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 複合結合要素は2つの部分からなる結合部位であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 複合結合要素は、Oct4/Sox2結合部位であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- Oct4結合部位およびSox2結合部位は互いに直接隣接していることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- 幹細胞/前駆細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 胚幹細胞はヒト由来であることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 少なくとも第3の転写因子をnanog遺伝子と接触させる工程をさらに含み、前記第3の転写因子は、SMADタンパク質ファミリーのメンバー、AP1ファミリーのメンバー、hand1転写因子およびhand1関連転写因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子のそれぞれが、ヒトnanog遺伝子配列の位置−289〜+117からなるヒトnanog遺伝子の領域に対応するそれぞれのnanog遺伝子の領域内に位置する結合部位に結合することを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 3つの転写因子のそれぞれに対する結合部位が、ヒトnanog遺伝子配列の位置−212〜−119からなるヒトnanog遺伝子の領域に対応するnano遺伝子の領域内に位置することを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 細胞内の遺伝子発現を調節する方法であって、
(a)少なくとも2つの転写因子またはその機能的断片を、nanog遺伝子のプロモータ領域と接触させる工程であり、前記少なくとも2つの転写因子の一方はPOUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子から選択され、前記少なくとも2つの転写因子の他方はHMGドメイン含有転写因子から選択される接触工程と、
(b)前記少なくとも2つの転写因子がnanogプロモータ内の特異的結合要素と複合体を形成できるようにする工程であり、前記複合体は転写活性化を介してnanog遺伝子発現を調節することを特徴とする工程と
を含む方法。 - 前記POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子のホメオドメインは、POU−ホメオドメインであることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 細胞は、幹細胞または前駆細胞のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項20または21に記載の方法。
- 細胞は、胚幹細胞であることを特徴とする請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞は、がん細胞であることを特徴とする請求項20または21に記載の方法。
- がんは、奇形腫であることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 細胞は、nanogプロモータを含み少なくとも2つの転写因子を発現する組換え細胞であり、少なくとも2つの転写因子の一方はPOUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択され、少なくとも2つの転写因子の他方はHMGドメイン含有転写因子またはその機能的断片から選択されることを特徴とする請求項20〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 発現が調節される遺伝子は、レポータ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス遺伝子(いわゆる「細胞死」遺伝子)、または各細胞における所望の発現を有する任意の他の遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項20〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記転写因子を、前記少なくとも2つの転写因子とnanogプロモータの前記要素との複合体形成を調節する化合物と接触させる工程をさらに含む請求項20〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの転写因子またはその機能的断片と、nanogプロモータの前記要素との複合体形成が、核酸分子によって低減されることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 核酸分子はRNAまたはDNAであることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 核酸分子はアプタマー、ミクロRNA(miRNA)分子、短鎖干渉RNA(si−RNA)分子、または反復関連短鎖干渉RNA(rasiRNA)分子であることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 核酸分子は、配列番号31の配列から転写されたsi−RNA分子、または配列番号32の配列から転写されたsi−RNA分子のうち少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 方法は、前記複合体形成を調節する適切な化合物を同定するためのin vitro方法であることを特徴とする請求項27〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの転写因子またはその機能的断片と、nanogプロモータの前記要素との間の複合体形成の阻害により細胞を除去するかまたは分化させるのに有用である潜在的化合物を、in−vitroでスクリーニングするための請求項33に記載の方法であり、自動化作業ステーションを用いたマルチウェルマイクロプレート上での化合物ライブラリの同時スクリーニングを含む方法。
- 前記細胞は哺乳類に含まれており、方法はin−vivo方法であることを特徴とする請求項20〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳類は、ラット、マウス、ディンゴ、ウシ、ヤギ、ブタ、チンパンジー、マカウおよびヒトからなる群より選択されることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子と、nanogプロモータの結合領域との間の前記複合体の形成を調節する化合物を投与することを含む、請求項35または36のいずれか1項に記載の方法。
- 奇形腫の治療のための方法であるか、または奇形腫の治療の一部である請求項35〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 複合体形成を検出することをさらに含む請求項20〜38のいずれか1項に記載の方法。
- (c)細胞内でのnanog遺伝子の発現を測定する工程をさらに含む請求項20〜3
9のいずれか1項に記載の方法。 - (d)工程(c)において得られる測定結果を、対照測定の結果と比較することをさらに含む請求項40に記載の方法。
- 検出は、適切な分光学的、光化学的、光分析的、蛍光分析的、放射線学的、酵素的または熱力学的方法によって行うか、または細胞効果に基づいて行うことを特徴とする請求項3または39に記載の方法。
- 少なくとも2つの転写因子が相乗的に作用して、nanog遺伝子の転写を活性化することを特徴とする請求項20〜42のいずれか1項に記載の方法。
- POUドメインおよびホメオドメイン含有転写因子はOct4であることを特徴とする請求項20〜43のいずれか1項に記載の方法。
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