KR20110134939A

KR20110134939A - 유도된 다능성 줄기 세포

Info

Publication number: KR20110134939A
Application number: KR1020117026184A
Authority: KR
Inventors: 도훈 김; 준형 김; 광수 김
Original assignee: 더 맥클린 하스피털 코퍼레이션
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2011-12-15
Also published as: WO2010115052A2; US20120128655A1; EP2414510A4; EP2414510A2; WO2010115052A3

Abstract

본 발명은 세포가 다능성 줄기 세포가 되도록 세포의 후성 리프로그래밍을 유도하기 위하여 특정 리프로그래밍 인자 단백질을 세포, 예컨대 분화된 체세포 내로 전달하는 것에 관한 것이다. 리프로그래밍 인자 단백질(들)은 Sox2, Klf4, Oct3/4, c-Myc, Lin28, Nanog, 또는 리프로그래밍 (-강화) 활성이 있는 임의의 단백질일 수 있다. 이러한 단백질들은 표적 세포 내로의 이러한 단백질들의 도입을 용이하게 하는데 도움이 되는 세포 투과 펩티드에 재조합적으로 또는 화학적으로 연결될 수 있고, 바람직하게는 이들을 활성 형태로 유지하도록 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 따라서, 다능성 줄기 세포 (iPS) 형성을 유도하는 본 발명의 방법은 숙주 표적 세포에게 해롭고 암을 야기하는 것으로 공지된, 바이러스 또는 DNA-기반 발현 벡터의 사용 또는 표적 세포 내에서의 리프로그래밍 인자 유전자의 발현을 방지한다.

Description

유도된 다능성 줄기 세포{INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2009년 4월 3일 출원된 미국 가출원 번호 61/166,635를 우선권으로 청구하고, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.

정부-지원 연구의 진술

본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 과제 번호(Grant No.) MH48866 및 DC006501 하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정한 권리가 있다.

발명 분야

본 발명은 다능성(pluripotent) 세포의 생산 및 용도에 관한 것이다.

발명의 배경

다능성 줄기 세포는 3가지 상이한 유형의 배엽층 중 임의의 하나로 분화되는 잠재력이 있다: (1) 내부의 위 내층, 위장관, 및 폐를 구성하는 내배엽 세포; (2) 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식 세포를 구성하는 중배엽 세포; 및 (3) 표피 조직 및 신경계 세포를 구성하는 외배엽 세포. 이러한 성질로 인해, 다능성 줄기 세포는 다양한 세포 대체 요법에서 세포를 개조하거나 보급하는 강력한 방식을 제공한다. 따라서 다능성 줄기 세포는 건강한 세포 및 조직의 재생가능한 공급원을 수득하는독특한 방식을 제공하고, 이는 임의의 다수의 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.

다능성 줄기 세포는 수일령의 인간 배아로부터 전형적으로 단리된다. 이러한 배아로부터의 세포는 실험실에서 무한적으로 성장할 수 있는 다능성 줄기 세포주를 생성시키는데 사용될 수 있다. 중복성(multipotent) 줄기 세포주가 태아 조직 (발달 8주령 초과)으로부터 수득된 태아 조직으로부터 또한 개발되었다. 그러나, 다능성 줄기 세포가 임의의 태아 또는 성체 세포 유형을 발생시킬 수 있더라도, 다능성 줄기 세포가 배아외 조직, 예컨대 태반에 기여할 잠재력이 없기 때문에 이는 단독으로 분열되어 태아 또는 성체 동물로 발달될 수 없다.

그럼에도 불구하고, 정확한 환경 하에서, 배아로부터 단리된 다능성 줄기 세포는 신체 내의 거의 모든 세포를 생산할 수 있다. 그러나, 이러한 배아 발달 단계가 종료된 후, 줄기 세포는 모든 세포 유형으로 발달되는 무한한 잠재력을 더 이상 지니지 않는다. 따라서, 이들의 다능성이 상실되고, 이들은 최종적으로 분화된 세포인 특정 유형의 세포만 될 수 있다. 그러나, 이러한 최종적으로 분화된 세포는 미분화 다능성 상태로 다시 되돌아가도록 "리프로그래밍(reprogramming)"될 수 있다. 이러한 리프로그래밍 방법으로 "유도된 다능성 줄기 세포" (iPS)가 생산된다.

따라서, 유도된 다능성 줄기 세포는 분화된 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 이러한 분화된 세포 내에서의 특정 유전자의 발현을 강요함으로써 인공적으로 유래된 유형의 다능성 줄기 세포이고, 상기 발현은 세포의 유전자형을 다능성 상태의 유전자형으로 효과적으로 재설정한다. 따라서, 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 배가 시간, 배상체 형성, 기형종 형성, 생육성 키메라 형성, 및 효능 및 분화성과 관련하여, iPS 세포는 천연 다능성 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 세포와 공통적인 다수의 특색이 있는 것으로 여겨진다.

iPS 세포는 비-다능성 세포, 예컨대 성체 섬유모세포 내로의 특정 줄기 세포-관련 유전자 (리프로그래밍 인자; "RPF")의 형질감염에 의해 전형적으로 유래된다. 형질감염은 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스를 통해 전형적으로 달성된다. 형질감염되는 유전자는 본원에서 핵 리프로그래밍 인자로 기술되는 마스터(master) 전자 조절인자 Oct-3/4 (Pouf51) 및 Sox2를 포함한다. 약 1개월 후, 소수의 형질감염된 세포가 형태학적으로 및 생화학적으로 다능성 줄기 세포와 유사해지기 시작하고, 형태학적 선별, 배가 시간을 통해, 또는 리포터 유전자 및 항생제 선별을 통해 전형적으로 단리된다.

4가지 다능성 핵 리프로그래밍 인자가 iPS 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다: Oct-3/4, SOX2, c-Myc, 및 Klf4. iPS를 검출하는데 사용되는 바람직한 마커는 배아 줄기 세포에서 중요한 유전자이고 세포 다능성의 주요 결정인자인 "Nanog"이다. 한가지 문제점은 이러한 리프로그래밍 인자들이 발암성(oncogenic)이고/이거나 종양에 관련된다는 것이다. 또한, 숙주의 게놈 내의 무작위 위치에 이러한 유전자를 삽입하는데 사용되는 바이러스성 형질감염 시스템은 바람직하지 않은 발암성 및 종양발생성(tumorogenic) 성장에 또한 이를 수 있는데, 이는 발현 카세트의 통합이 숙주 세포의 게놈을 비정상적으로 파괴하기 때문이다.

따라서, 분화된 세포를 리프로그래밍시키기 위한 현재의 방법은 리프로그래밍에 중요한 전사 인자를 코딩하는 유전자 서열을 발현시키기 위한 바이러스 벡터의 사용을 필요로 한다. 바이러스 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것으로 공지되어 있고, 이는 세포 및 생물에게 해롭기 때문에, 바이러스 벡터의 사용은 바람직하지 않고 문제가 있다. 따라서, 본 발명은 어떠한 DNA 또는 바이러스 벡터도 사용하지 않으면서 iPS 세포를 생산하는, 위험하지 않고 발암성이 아닌 상이한 방법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명의 한 측면은 분화된 세포 (예를 들어, 체세포)를 하나 이상의 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 리프로그래밍 인자 단백질(들)이 분화된 세포가 탈분화되도록 하는 것인, 다능성 줄기 세포의 생산 방법이다.

한 실시양태에서, 리프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, 및 Lin28로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 방법은 리프로그래밍 인자에 노출된 분화된 세포를 리프로그래밍 활성 또는 리프로그래밍-강화 활성이 있는 임의의 단백질과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 분화된 세포를 p53, p16(Ink4a) 및 p19(Arf)의 억제제; ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 베타-카테닌; ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2 중 하나 이상과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 리프로그래밍 인자는 세포 투과 펩티드에 연결된다. 한 실시양태에서, 리프로그래밍 인자는 세포 투과 펩티드에 화학적으로 접합되거나, 또는 융합 단백질로서 세포 투과 펩티드에 재조합적으로 연결된다.

한 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 (a) 9개 이상의 연속적인 리신 아미노산 잔기, (b) 9개 이상의 연속적인 아르기닌 아미노산 잔기; (c) 리신 및 아르기닌 아미노산의 혼합물의 9개 이상의 잔기, 또는 (d) HIV-TAT 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 펩티드이다.

또 다른 실시양태에서, 분화된 세포는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 하나 이상의 리프로그래밍 인자와 접촉된다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 분화된 세포를 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질은 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질의 존재는 분화된 세포가 다능성 줄기 세포 (즉, 유도된 다능성 세포; "iPS")가 되도록 한다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 분화된 세포를 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질은 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질의 존재는 분화된 세포가 다능성 줄기 세포 (즉, 유도된 다능성 세포; "iPS")가 되도록 한다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 분화된 세포를 c-Myc 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 c-Myc 단백질은 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 c-Myc 리프로그래밍 인자 단백질의 존재는 분화된 세포가 다능성 줄기 세포 (즉, 유도된 다능성 세포; "iPS")가 되도록 한다.

한 실시양태에서, 방법은 상기 분화된 세포를 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질은 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질의 존재는 분화된 세포가 다능성 줄기 세포 (즉, 유도된 다능성 세포; "iPS")가 되도록 한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 상기 분화된 세포를 Oct4 접합체, Sox2 접합체, c-Myc 접합체, 및 Klf4 접합체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 각각의 상기 접합체는 세포 투과 펩티드를 포함하고, 상기 접합체는 상기 세포가 다능성 줄기 세포 (즉, 유도된 다능성 세포; "iPS")가 되도록 한다.

한 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 치환체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함한다.

한 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고머는 올리고펩티드이다.

한 실시양태에서, 올리고펩티드의 실질적으로 모든 아미노산 잔기가 양성 전하를 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 올리고펩티드는 5개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 올리고펩티드는 5개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 올리고펩티드는 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 분화된 세포는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 리프로그래밍 인자 접합체 단백질과 접촉된다.

본 발명의 또 다른 측면은 Oct4, Sox2, c-Myc, Lin28, Nanog, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택된 리프로그래밍 인자와 연결된 세포 투과 펩티드를 포함하는 리프로그래밍 인자 단백질이다. 본 발명은 이러한 특정 리프로그래밍 인자에만 한정되지 않는다; 기타 리프로그래밍 인자가 iPS 세포를 생산하기 위해 본원에 개시된 방법 및 기술에 따라 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 양이온성 접합체는 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 치환체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양이온성 접합체는 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함한다.

한 실시양태에서, 양이온성 접합체는 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머이다.

한 실시양태에서, 올리고머는 올리고펩티드이다. 한 실시양태에서, 상기 올리고펩티드의 실질적으로 모든 아미노산 잔기가 양이온성이다. 또 다른 실시양태에서, 올리고펩티드는 5개 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 올리고펩티드는 5개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 올리고펩티드는 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 방법들 중 임의의 것에 의해 생산된 유도된 다능성 줄기 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 방법들 중 임의의 것에 의해 제조된 유도된 다능성 줄기 세포로부터 생산된 분화된 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 분화된 세포는 (A) 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 제조된 유도된 다능성 줄기 세포로부터 배아체를 생산하는 단계, 및 (2) 배아체를 ITSFn 배지 상에서 인큐베이션하며, 여기서 배아체가 내배엽 배엽층 세포, 중배엽 배엽층 세포 및 외배엽 배엽층 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배엽층의 세포 형상으로 분화되는 단계에 의해 생산된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A) 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 제조된 유도된 다능성 줄기 세포로부터 배아체를 생산하는 단계, 및 (2) 배아체를 ITSFn 배지 상에서 인큐베이션하며, 여기서 배아체가 내배엽 배엽층 세포, 중배엽 배엽층 세포 및 외배엽 배엽층 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배엽층의 세포 형상으로 분화되는 단계를 포함하는, 분화된 세포의 제조 방법이다. 한 실시양태에서, 분화된 세포는 신경 세포 (예를 들어, 뉴런, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 또는 슈반 세포), 표피 세포, 가로무늬 근육 세포, 지방 세포, 상피 세포 (예를 들어, 호흡 상피 세포 또는 피부 상피 세포), 섬유모세포 (예를 들어, 피부 섬유모세포), 및 각막-유사 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 측면은 (A) 개체로부터의 분화된 세포를 Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시킴으로써 다능성 줄기 세포를 생산하며, 여기서 개체의 분화된 세포 내의 리프로그래밍 인자 단백질(들)의 존재가 다능성 줄기 세포의 발달을 유도하는 단계; (B) 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화된 배엽층 세포를 생산하는 단계; 및 (C) 분화된 배엽층 세포를 개체에게 투여하며, 여기서 분화된 배엽층 세포가 무질환성(disease-free)이고, 개체의 질환 또는 손상을 치료하는데 유용한 단계를 포함하는, 질환 또는 손상이 있는 개체를 치료하는 방법이다. 한 실시양태에서, 질환 또는 손상은 신경변성 질환, 백혈병, 림프종, 제1형 당뇨병, 외상성 뇌 및/또는 척수 손상, 퇴행성 척수 손상 및 질환, 심근에 대한 손상, 골격근에 대한 손상, 또는 피부에 대한 손상이다. 또 다른 실시양태에서, 신경변성 질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 알츠하이머병이고; 퇴행성 척수 손상 또는 질환은 근위축성 측삭 경화증이고; 심근에 대한 손상은 허혈성 손상이며; 피부에 대한 손상은 열상, 화학 화상, 및 열 화상이다.

본 발명의 또 다른 측면은 질환 또는 손상이 있는 개체에게 본원에 개시된 방법들 중 임의의 것에 의해 제조된 다능성 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 손상이 있는 개체를 치료하는 방법이다. 한 실시양태에서, 개체에 신경변성 질환, 백혈병, 림프종, 제1형 당뇨병, 외상성 뇌 및/또는 척수 손상, 퇴행성 척수 손상 및 질환, 심근에 대한 손상, 골격근에 대한 손상, 또는 피부에 대한 손상이 있다. 한 실시양태에서, 신경변성 질환은 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 알츠하이머병이고; 퇴행성 척수 손상 또는 질환은 근위축성 측삭 경화증이고; 심근에 대한 손상은 허혈성 손상이며; 피부에 대한 손상은 열상, 화학 화상, 및 열 화상이다.

본 발명의 한 측면은 본원에 개시된 방법들 중 임의의 것에 의해 제조된 다능성 줄기 세포를 포함하는 제약 조성물이다.

"다능성 줄기 세포"는 3가지 배엽층 모두의 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있고 여러 세대 동안, 가능하게는 무한한 기간 동안 시험관내 자가-복제 또는 자가-재생이 가능한 미분화 세포이며, 여기서 생성된 딸 세포는 어버이 세포의 미분화 특징을 유지한다. 다능성 세포에는 배아 줄기 세포가 포함되지만, 다능성 세포의 기타 예에는 유도된 다능성 세포 (예를 들어, 문헌 [Takahashi et al., Cell, 126: 663-676, 2006]; [Cell, 131: 861-872, 2007]; 및 [Nakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106, 2008] 참조), 핵 전달에 의해 유래된 다능성 세포가 포함된다 .

도면의 간단한 설명
도 1: 세포 투과 펩티드로서의 9개의 반복 아르기닌과 융합된 리프로그래밍 단백질의 세포 흡수: (a) 리프로그래밍 인자의 포유류 발현 벡터의 개략적인 설명. 각각의 KLF4, c-MYC, OCT4, 및 SOX2 cDNA가 C-말단에서 세포 투과 펩티드로서의 9개의 반복 아르기닌 및 myc 태그(tag) 부착 펩티드와 연결되었다; (b) 인간 신생아 섬유모세포 (HNF) 세포를 각각의 리프로그래밍 단백질을 발현하는 HEK 293 세포로부터의 세포 추출물과 함께 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하고, myc 항체를 사용하여 면역세포화학에 적용하였다. 핵이 DAPI로 대조염색되었다.
도 2: HEK293 세포에서의 리프로그래밍 인자의 안정적인 발현. HEK293 세포를 pCMV hKLF4-9xArg-myc, pCMV hOCT4-9xArg-myc, pCMV hSOX2-9xArg-myc, 및 pCMV hc-MYC-9xArg-myc 벡터로 각각 형질감염시키고, 안정적으로 형질감염된 세포를 선별하기 위해 G-418의 존재 하에 성장시켰다. 50 ㎍의 세포 용해물 단백질을 SDS-PAGE에 이어서 항-myc 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 적용하였다.
도 3: dsRED 및 dsRED-9R 단백질로 처리된 COS-7 및 HNF 세포의 형광 현미경검사 분석. a, COS-7 세포 및 b, HNF 세포가 dsRED (위쪽 패널) 및 9개의 반복 아르기닌과 융합된 dsRED (dsRED-9R; 아래쪽 패널)을 발현하는 HEK 293 세포의 추출물로 8시간 동안 처리되었고, 594 nm 형광으로 제시되었다.
도 4: 인간 신생아 섬유모세포로부터의 p-iPS 세포의 유도를 위한 다양한 프로토콜.
도 5: 레트로바이러스 인자를 사용하여 인간 신생아 섬유모세포 (HNF)로부터 유래된 rv-hiPS01 세포주의 생성 및 특성화. a, rv-hiPS01 클론의 면역형광 염색은 TRA-1-60, Oct-4, 및 SSEA-4가 포함되는 인간 ES 제조제의 발현을 나타낸다. b, rv-hiPS 01 세포의 배상체 (EB)-매개 분화. 제8일에 rv-iPS 세포의 현탁 배양에 의해 EB가 제조된다. 위상 대조 영상들은 신경 세포 (외배엽), 내피-유사 세포 (중배엽), 및 내배엽-유사 세포 (내배엽)를 포함하여, 제24일에 EB로부터 분화된 3가지 모두의 배세포를 나타낸다.
도 6: p-iPS 세포 생성에 대한 신규 프로토콜을 사용하여 인간 신생아 섬유모세포 (HNF)로부터 유래된 p-hiPS (01 및 02) 세포주의 유도 및 특성화. a, 프로토콜은 HNF (상부 패널의 첫번째 영상)로부터의 p-iPS 세포의 생성을 위한 반복된 프로세스를 나타낸다. b, 단백질로 처리된 HNF가 3회 사이클 반복으로부터 형태 면에서 변화되었고 (상부 패널의 두번째 영상), 반복된 프로세스는 6회 사이클 후 더 많은 콜로니 형성을 유도한다 (상부 패널의 세번째 영상). 이러한 콜로니들은 알칼리성 포스파타제(phosphatase) (AP)로 명확하게 염색된다 (상부 패널의 네번째 영상). AP-양성 콜로니는 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 상에서 비슷한 ES-유사 형태의 2개의 독립적인 인간 ES 세포주를 형성한다.; 형성된 iPS 세포-유사 콜로니의 AP 염색 (상부 패널의 네번째 영상), 고배율의 AP-염색 iPS 세포-유사 콜로니로부터 유래된 p-iPS 콜로니의 초기 형태 (상부 패널의 다섯번째 영상), 계대수 10의 확립된 p-iPS 세포주의 전형적인 형태 (상부 패널의 두번째 영상). p-hiPS01 클론 (두번째 패널) 및 p-hiPS02 클론 (하부 패널)의 면역형광 염색은 AP 염색, SSEA-3, SSEA-4, Oct-4, Nanog, 및 TRA-1-60이 포함되는 인간 ES 제조제의 발현을 나타낸다. 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 핵이 염색되었다 (두번째 및 세번째 행 패널에서 청색). c, iPS-유사 콜로니 형성의 효율.
도 7: 단백질-유도 인간 iPS 세포에서의 유전자 발현 및 후성(epigenetic) 상태. a, 정량적 RT-PCR을 수행하여 단백질-유도 인간 iPS, H9, 및 HNF 세포에서의 c-MYC, GDF3, KLF4, NANOG, OCT4, REX1, SOX2, 및 hTERT의 발현을 평가하였다. 배수 변화는 β-액틴 발현에 대해 표준화된 HNF 세포에서의 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 이러한 실험을 독립적으로 제조된 cDNA를 사용하여 3중으로 2회 반복하였다. b, 단백질-유도 iPS, H9, 및 HNF 세포에서의 NANOG 및 OCT4의 프로모터 영역의 비술파이트 서열확인 분석. 백색 원 및 흑색 원은 각각 비-메틸화 및 메틸화를 가리킨다. 상부의 숫자는 전사 시작 부위에 상관적인 CpG 위치를 나타낸다. CpG 메틸화 백분율 (％Me)이 각각의 패널의 오른쪽에 제시되었다.
도 8: HNF, H9, 단백질-유도 iPS (p-hiPS01 및 p-hiPS02), 및 레트로바이러스-유도 iPS (rv-hiPS01) 세포에서의 hES 마커 유전자의 발현. 전체 유전자, 내생 유전자 및 레트로바이러스에 의해 발현된 유전자의 상대적인 발현을 구별하기 위해 상이한 프라이머들을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. β-액틴이 증폭 대조군용으로 사용된다.
도 9: DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 분석. 단백질-유도 iPS, 레트로바이러스-유도 iPS, H9, 및 HNF 세포로부터 게놈 DNA를 제조하였다. 고도로 가변성인 직렬 반복물을 함유하는 프라이머 세트를 사용하여 게놈 PCR을 수행하였다 (표 3). 증폭된 PCR 생성물을 7％ 아크릴아미드 젤 전기영동에 적용하였다.
도 10: 시험관내 및 생체내 분화에서의 p-hiPS (01 및 02) 세포의 배상체 (EB)-매개 분화. a, 제8일에 2개의 p-iPS 세포주의 현탁 배양에 의해 EB가 제조된다 (상부 행 패널에서 왼쪽). 위상 대조 영상 (상부 행 패널) 및 면역염색 영상 (두번째 및 세번째 행 패널)은 신경 세포 (외배엽), 근육 (중배엽) 내피-유사 세포 (중배엽), 및 내배엽-유사 세포 (내배엽)를 포함하여, 제24일에 EB로부터 분화된 3가지 모두의 배세포를 나타낸다. b, p-hiPS 세포 (01 및 02)로부터 유래된 기형종의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 세포들이 SCID 마우스의 신장 피막 하에 이식된 후 단일 주사 부위로부터 종양이 잘 발달되었다. 생성된 기형종은 외배엽, 중배엽 및 내배엽 분화를 나타내는 하기의 특색들을 나타냈다 (네번째 행 패널 (p-hiPS01) 및 하부 행 패널 (p-hiPS02)). 외배엽: 색소침착 망막 세포 및 신경 조직; 중배엽: 근육 및 지방세포; 내배엽: 호흡 상피 및 장-유사 상피.
도 11: 개략도 1은 단백질의 C 또는 N 말단에서 양이온성 접합체와 연결된 예시적인 리프로그래밍 인자 단백질을 도해한다. 예시적인 접합된 단백질에서, 폴리펩티드는 알파 아미노산, 예를 들어 글리신, 알라닌, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘, 또는 베타 아미노산, 예를 들어 베타-알라닌을 포함한다.
도 12: 개략도 2는 링커(linker)와 함께 또는 링커 없이 단백질의 아미노산 측쇄를 통해 양이온성 접합체와 연결된 예시적인 리프로그래밍 인자 단백질을 도해한다. 예시적인 접합된 리프로그래밍 인자 단백질이 양이온성 접합체 (폴리펩티드 또는 폴리아민)와 이의 아미노산 측쇄로부터 직접적으로 또는 디술피드 또는 요소 결합을 통해 간접적으로 커플링되었다.

상세한 설명

본 발명은 생검 섬유모세포가 포함되는 체세포로부터 유래된 다능성 줄기 세포의 조성물, 및 이를 생산하는 방법을 제공한다. 다능성 줄기 세포는 규정된 특성이 있는 비교적 실질적으로 균질한 집단으로서 제공된다. 실질적으로 균질한 세포 집단은 원하는 표현형 (즉, 관심 소질(들))이 있는 세포를 과반수 (즉, >50％)로 함유하는 세포들의 집단 또는 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 실질적으로 균질한 집단은 원하는 표현형이 있는 세포를 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 또는 이를 초과하여 함유한다.

그 후, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)로 본원에서 지칭되는, 본 발명의 리프로그래밍된 다능성 세포가 적합한 배양 조건 하에 특히 바람직한 세포 유형으로 발달 및 분화되도록 배양될 수 있다. 다능성 줄기 세포의 세포 배양, 발달 및 분화를 위한 방법은 당업계의 표준 문헌을 참고로 수행될 수 있다. 적절한 기술이 문헌 [Wiles et al., Meth. Enzymol. 225:900, 1993]; 및 [Embryonic Stem Cells, Turksen ed., Humana Press, 2002]에 기술되어 있다. 설치류 및 인간 다능성 줄기 세포의 생성, 계대 및 보존을 위한 확립된 프로토콜이, 예를 들어, 문헌 [Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994]; [Matsui et al., Cell 70:841, 1992], [Thomson et al., Science 282:114, 1998]; [Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]; [Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000]; 미국 특허 5,843,780 및 6,090,622; 및 PCT 공개 번호 WO 99/27076 및 WO 00/27995에 기술되어 있다. 한 기타 형태의 배양 단계는 iPS 세포를 배양하기 위한 피더(feeder) 세포층 예컨대 섬유모세포 피더 세포층의 사용을 수반한다.

본 발명은 개체에게 본 발명의 방법에 의해 생성된 iPS 세포를 함유하는 조성물 또는 제형을 개체에게 투여하는 것에 의한 개체에서의 인간 질환, 예컨대 신경변성 질환의 치료를 위한 임상적으로 실현가능한 세포 공급원을 제조하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 치료 조성물 및 세포를 사용하는 치료를 받을 수 있는 질환 및 장애에는, 예를 들어, 신경변성 질환 (예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 알츠하이머병), 백혈병, 림프종, 제1형 당뇨병, 외상성 뇌 및/또는 척수 손상, 퇴행성 척수 손상 및 질환 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증), 심근에 대한 손상 (예를 들어, 허혈성 손상 후, 예컨대 심근경색증, 또는 외상성 손상), 골격근에 대한 손상, 및 피부에 대한 손상 (예를 들어, 열상, 화학 화상, 및 열 화상)이 포함된다.

기타 실시양태에서, 치료 조성물 내에 함유된 세포가 캡슐화된다. 본 발명의 이러한 실시양태가 더욱 상세하게 설명된 유전 질환에 대한 하기의 하위 섹션을 참조한다. 치료 조성물은 임의의 적합한 공지된 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 "iPS 세포로부터 유래된 세포"는 다능성이거나 또는 iPS 세포의 시험관내 배양 또는 생체내 이식의 결과로 최종적으로 분화된 세포를 지칭한다.

분화된 세포의 단리

iPS 세포가 되도록 본 발명에 따라 리프로그래밍될 체세포 및 분화된 세포의 유형은 특별히 제한되지 않고, 임의 종류의 체세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 성숙된 체세포, 뿐만 아니라 배아기의 체세포, 뿐만 아니라 섬유모세포, 간세포, 및 위 점막 세포가 사용될 수 있다. 실제로, (1) 내배엽 세포, 예컨대 내부의 위 내층, 위장관, 및 폐; (2) 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식 세포의 중배엽 세포; 및 (3) 표피 조직 및 신경계 세포의 외배엽 세포로부터의 임의의 세포 유형이 본 발명에 따라 조작될 수 있고, iPS 세포를 생산하기 위해 본원에 개시된 리프로그래밍 단백질에 노출될 수 있다.

분화된 세포는 임의의 포유류 세포, 예를 들어 마우스, 인간, 래트, 소, 양, 말, 햄스터, 개, 기니피그, 또는 유인원 세포일 수 있다. 예를 들어, 이같은 체세포의 직접적인 리프로그래밍은 개체- 또는 질환-특이적 다능성 줄기 세포를 생성시킬 기회를 제공한다. 마우스 iPS 세포는 형태, 증식, 유전자 발현 및 기형종 형성 면에서 사실상 ES 세포와 구별불가능하다. 또한, 주머니배 내로 이식되었을 때, 마우스 iPS 세포는 성체 키메라를 발생시킬 수 있고, 이는 생식선 전달이 가능하다 (문헌 [Maherali et al., Cell Stem Cell 1:55-70, 2007]; [Okita et al., Nature 448:313-17, 2007]; [Wemig et al., Nature 448:318-324, 2007]). 인간 iPS 세포 또한 확장가능하고, 형태 및 증식 면에서 사실상 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 구별불가능하다. 또한, 이러한 세포들은 시험관 내에서 및 기형종에서 3가지 배엽층의 세포 유형으로 분화될 수 있다.

임상 환경에서, 예컨대 조직 및 세포의 바늘 흡인 인출에 의해 또는 임의의 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플, 조직 샘플, 타액 샘플, 모발 샘플 또는 정액 샘플, 또는 임의의 체액 샘플로부터, 세포가 직접적으로 수득되는 인간 개체로부터의 명시적 사전 동의가 요구될 수 있다. 사전 동의에 관련된 논점에 대해서 문헌 [Aalto-Setala, et al., PLoS Biology, vol. 7(2), pp.:204-208 (February 2009)] 참조.

별법적으로, 인간 체세포가 생물학적 기탁소 예컨대 ATCC로부터 수득되어, 기탁물과 함께 제공된 첨부 조건에 따라 배양될 수 있다.

리프로그래밍 인자

본 발명의 세포로 및 세포 내로 직접적으로 전달될 수 있는 리프로그래밍 인자에는 Oct4 패밀리, Sox2 패밀리, Klf4 패밀리, 및 c-myc 패밀리의 유전자로부터 발현된 단백질들의 패밀리가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본원에 참고로 포함된 문헌 [Yamanaka, "Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells", Cell Stem Cell 1:39-49 (July 2007)] 참조.

간략하게, Oct4는 Oct 패밀리에 속하는 전사 인자이고, EC 세포, 초기 배아, 및 배세포에서 특이적으로 발현된다. Oct 전사 인자는 8량체 서열 ATTA/TGCAT에 결합하는, 아미노산 약 150개의 영역인 POU 도메인을 함유한다. Oct4는 세포 분화 촉진에서 중요한 역할을 하고, 마우스에서의 신경 및 심장 세포 분화에서 특히 그러하다. iPS 세포의 임상 목적을 위해, CPP 및/또는 기타 서열 예컨대 정제 목적을 위한 히스티딘 반복물과의 융합 형태로서 인간 Oct4 cDNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

Sox2는 결합 모티프 A/TA/TCAAA/TG를 인식함으로써 DNA에 결합하는 고-이동성 군 (HMG) 도메인을 함유하는 Sox (SRY-관련 HMG 박스) 단백질이다. Sox2는 ICM, 배아덩이위판(epiblast), 및 배세포에서 발현되고, 배아외 외배엽의 중복성 세포에 의해 또한 발현된다. 이는 중추 신경계의 분열 중인 미구속(uncommitted) 줄기 및 전구체 세포와 관련된다. iPS 세포의 임상 목적을 위해, CPP 및/또는 기타 서열 예컨대 정제 목적을 위한 히스티딘 반복물과의 융합 형태로서 인간 Sox2 cDNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

Klf4는 피부 및 위장관의 분화된 유사분열후 상피세포에서 고로도 발현되는 크루펠(Kruppel)-유사 인자, 아연-손가락 단백질이다. Klf4는 섬유모세포 및 미분화 마우스 ES 세포에서 또한 발현된다. Kl4는 종양 억제인자 및 종양유전자(Oncogene)로서 기능한다. iPS 세포의 임상 목적을 위해, CPP 및/또는 기타 서열 예컨대 정제 목적을 위한 히스티딘 반복물과의 융합 형태로서 인간 Klf4 cDNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

c-Myc는 자신의 N-말단을 통해 여러 단백질, 특히 히스톤 복합체 성분에 결합한다. c-Myc의 C-말단은 c-Myc를 이의 파트너 단백질 Max에 결합시키는 염기성 영역/나선-루프-나선/류신 지퍼 도메인을 함유한다. c-Myc-Max 이량체는 인간 게놈 전반에 걸쳐 존재하는 CACA/GTG 모티프가 있는 DNA 서열에 결합한다. 따라서, c-Myc-Max 이량체의 결합은 염색질 구조를 변형시킬 수 있고 유전자 발현을 조절할 수 있다. c-Myc의 문제점은 c-Myc가 종양발생을 유도하는 것으로 공지되어 있다는 것이다. iPS 세포의 임상 목적을 위해, CPP 및/또는 기타 서열 예컨대 정제 목적을 위한 히스티딘 반복물과의 융합 형태로서 인간 c-Myc cDNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

각각의 이같은 핵 리프로그래밍 단백질은 단독으로 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 핵 리프로그래밍 단백질과 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 리프로그래밍 단백질은 iPS 세포를 수득하기 위해 소형 분자, 화합물, 또는 기타 작용제와 함께 사용될 수 있다.

이러한 리프로그래밍 인자 단백질들에 더하여, Lin28, Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 베타-카테닌과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 기타 단백질이 유도된 다능성 줄기 세포 유전자형을 촉진 또는 강화하는 것을 돕기 위해 체세포 또는 분화된 세포에 공동-전달될 수 있다. Nanog가 다능성을 촉진하는데 특히 유용하다. 유사하게, 하기의 단백질들이 리프로그래밍 인자 단백질들 (예를 들어, Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, 및 c-myc 단백질) 중 하나 이상과 함께 분화된 세포에 또한 전달될 수 있다: ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2. 특히, 난모세포 및/또는 ES 세포에서 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질 인자가 유용한 리프로그래밍 인자일 수 있다. 이러한 인자들은 리프로그래밍 인자 단백질 (예를 들어, Oct4 단백질, Sox2 단백질, Klf4 단백질, 및 c-myc 단백질) 중 하나 이상과 함께 또는 이들 없이 사용될 수 있다: ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2.

이러한 경향에 따라, 따라서 본 발명의 또 다른 실시양태는 다능성 줄기 세포의 생성을 강화 또는 촉진하는 것을 돕기 위한 리프로그래밍 활성 또는 리프로그래밍-강화 활성이 있는 임의의 단백질의 용도를 포함한다. 예를 들어, 최근의 연구는 우성 음성 형태의 p53, 또는 p53의 억제제가 리프로그래밍 효율을 증가시킨다는 것을 나타냈다 (문헌 [Hong et al., 2009, Nature, 460, 1132]; [Utikal et al., 2009, Nature, 460, 1145]).

따라서, 한 실시양태는 세포, 예컨대 분화된 세포를 우성 음성 형태의 p53, 또는 p53의 억제제에 노출시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태는 본원에 개시된 리프로그래밍 인자들 중 하나를 우성 음성 형태의 p53, 또는 p53의 억제제, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA 분자와 공동-투여하는 것을 포함한다 (문헌 [Hong et al.]). 활성 Trp53 (즉, p53), p16(Ink4a), 및 p19(Arf)의 내생 수준이 낮은 1차 세포 집단이 높은 효율로 iPS 세포를 생산하는데 또한 유용할 수 있다 (문헌 [Utikal et al.])

그러므로, 본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 (1) Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28 중 하나 이상, 및 (2) 우성 음성 형태의 p53, 또는 p53의 억제제의 조합물에, 또는 본원에 기술된 바와 같이, 리프로그래밍 활성 또는 리프로그래밍-강화 활성이 있는 임의의 단백질과 함께 노출시키는 것이 고려된다.

리프로그래밍 인자의 생산

(A) 세포 추출물로부터의 단리 및 정제

본 발명의 리프로그래밍 인자 단백질은 조직 샘플 또는 세포 배양물 샘플로부터 추출, 단리 및 정제될 수 있다. 예를 들어, Klf4는 피부 및 위장관의 분화된 유사분열후 상피 세포에서 고도로 발현된다. 따라서, Klf4가 추출 및 정제될 수 있는 피부 및 위장관 조직 샘플을 수득하는 것이 합리적이다. 유사하게, Sox2는 ICM, 배아덩이위판 및 배세포, 및 배아외 외배엽의 중복성 세포에서 발현된다. 따라서, 이러한 조직 유형들은 Sox2 단백질의 공급원을 제공한다. 유사하게, Oct4 단백질을 신경 및 심장 세포로부터 단리할 수 있다. 세포, 조직, 및 세포 추출물로부터 단백질을 단리하기 위한 다양한 표준 기술이 있다.

(B) 재조합 생산

유전자 서열, 또는 이의 기능성 부분을 세포에서 발현시킴으로써, 본 발명의 리프로그래밍 인자를 재조합적으로 생산할 수 있다. 세포 발현 시스템, 예컨대 인간 세포 발현 시스템, 차이니즈 햄스터 난소 세포 발현 시스템 (CHO), 또는 예를 들어 곤충 세포 또는 박테리아 세포가 기능성 인자를 코딩하는 뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 발현된 단백질의 활성을 최대화하도록 생성된 발현된 단백질이 정확하게 또는 확실하게 폴딩(folding)되고 형성되는 것을 확실히 하기 위해, 포유류 세포 발현 시스템을 사용하여 리프로그래밍 인자 또는 또 다른 강화/촉진 단백질, 예를 들어, nanog를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.

리프로그래밍 인자 뉴클레오티드 서열이 조절 요소 예컨대 프로모터 및 종결인자에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 카세트를 생성시키는 것이 가능하고, 그 후, 발현 카세트가 리프로그래밍 인자 단백질이 생산되도록 이러한 세포 시스템들 중 하나에서 발현될 수 있다.

따라서, 본 발명의 발현 카세트는 프로모터 및 적합한 폴리아데닐화 및/또는 종결 신호 서열에 작동가능하게 연결된, Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Lin28, 및 Klf4 중 임의의 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 Oct4의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, Oct4 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 Sox2의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, Sox2 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 c-Myc의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, c-Myc 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 Nanog의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, Nanog 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 Klf3의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, Klf4 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 세포 내에서의 Lin28의 발현을 용이하게 하는 적절한 조절 요소에 작동가능하게 연결된, Lin28 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 리프로그래밍 전사 인자들 중 하나의 "기능성 부분"을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA와 또는 다른 전자 인자와 상호작용하는 것을 담당하는 단백질 서열의 부분, 예컨대 특정 DNA 결합 도메인을 인식하거나 동종- 또는 이종-이량체화를 담당하는 인자의 부분을 코딩하는 것이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog 및 Kf4 중 어느 하나의 기능성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 적합한 폴리아데닐화 및/또는 종결 신호 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 카세트의 제조를 수반한다.

본 발명은 재조합 발현 기술을 사용하는 하나를 초과하는 리프로그래밍 인자의 발현을 또한 제공한다. 따라서, 발현 벡터는 각각 상이한 리프로그래밍 인자를 발현하는 2개 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 따라서, 한 형질전환 이벤트에서 2개 이상의 상이한 리프로그래밍 전사 인자가 발현될 수 있다.

그 후, 재조합적으로 발현된 본 발명의 인자를 표준 기술에 따라 세포 발현 시스템의 추출물로부터 정제할 수 있다.

리프로그래밍 인자 융합 단백질 및 접합체의 생산

세포 내로의, 그리고 세포막을 가로지르는 리프로그래밍 인자 단백질의 전달을 용이하게 하는 것을 돕기 위해, 리프로그래밍 인자 단백질이, 조직 또는 세포 추출물로부터 정제되는지 또는 재조합적으로 제조되는지 여부와 관계 없이, 양이온성 접합체, 예컨대 양이온성 리신-풍부 또는 아르기닌-풍부 펩티드와 또는 하기 기술된 바와 같은 기타 양이온성 접합체와 화학적으로 또는 재조합적으로 융합될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 회합될 수 있다. 양이온성 접합체는 단백질에 직접적으로 또는 적합한 링커를 통해 적절한 조건 하에 연결될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 예를 들어 화학적 접합에 의한 또는 재조합적인 리프로그래밍 인자와 양이온성 접합체 간의 융합 단백질의 생성이다. 양이온성 접합체는 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함한다. 관련된 실시양태에서, 양이온성 접합체는 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 양이온성 접합체는 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민 등, 뿐만 아니라 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머이다. 올리고머는 올리고펩티드의 아미노산 잔기가 양성 전하를 형성할 수 있는 올리고펩티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 올리고펩티드는 5개 내지 25개의 아미노산, 바람직하게는 5개 내지 15개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5개 내지 10개의 아미노산을 포함할 수 있다.

(a) 양이온성 리신 또는 아르기닌 올리고펩티드와의 접합

또 다른 측면에서, 본 발명은 Oct4-폴리리신, Oct4-폴리아르기닌, Sox2-폴리리신, Sox2-폴리아르기닌, c-Myc-폴리리신, c-Myc-폴리아르기닌, Klf4-폴리리신, Klf4-폴리아르기닌, 및 Nanog-폴리리신 및 Nanog-폴리아르기닌과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 올리고펩티드의 아미노산 잔기가 양성 전하를 형성할 수 있는 올리고펩티드 (폴리펩티드)인 양이온성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 당업자는 양성 전하를 형성할 수 있는 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기, 예를 들어 히스티딘, 오르니틴, 호모아르기닌 등을 포함하는 기타 올리고펩티드 (폴리펩티드)를 용이하게 활용할 것이다. 접합 및 재조합 기술이 하기에 더욱 상세하게 기술된다.

본 발명은 리신과 아르기닌 아미노산 양쪽 모두 등으로 구성된 하이브리드(hybrid) 세포 투과 펩티드와 연결된 융합 단백질을 또한 제공한다. 따라서, 본 발명은 Oct4-폴리리신/폴리아르기닌, Sox2-폴리리신/폴리아르기닌, c-Myc-폴리리신/폴리아르기닌, Klf4-폴리리신/폴리아르기닌, 및 Nanog-폴리리신/폴리아르기닌과 같은 융합 단백질을 또한 제공한다.

따라서, 본 발명의 양이온성 올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 연속적인 일련의 리신 아미노산, 또는 아르기닌 아미노산, 또는 리신 및 아르기닌 아미노산의 혼합물 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 리프로그래밍 인자 단백질에 융합되거나, 접합되거나, 결찰되거나 또는 다른 방식으로 연결될 수 있는 동종중합체성 리신 펩티드, 동종중합체성 아르기닌 펩티드, 이종중합체성 리신/아르기닌 펩티드 등을 제공한다. 추가로, 본 발명은 리프로그래밍 인자 단백질의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서의 동일하거나 상이한 세포 투과 펩티드의 융합을 제공한다. "상이한"은 2개의 리신-풍부 펩티드가 펩티드의 아미노산 조성에 더하여 각각의 펩티드 내의 잔기의 개수로 인해 상이할 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 리프로그래밍 인자의 N-말단에서의 리신 6개의 펩티드 및 리프로그래밍 인자의 C-말단에서의 리신 9개의 펩티드의 융합을 제공한다.

따라서, 본 발명의 양이온성 리신 또는 아르기닌 펩티드의 길이는 아미노산 5개의 길이, 아미노산 6개의 길이, 아미노산 7개의 길이, 아미노산 8개의 길이, 아미노산 9개의 길이, 아미노산 10개의 길이, 아미노산 11개의 길이, 아미노산 12개의 길이, 아미노산 13개의 길이, 아미노산 14개의 길이, 아미노산 15개의 길이, 아미노산 16개의 길이, 아미노산 17개의 길이, 아미노산 18개의 길이, 아미노산 19개의 길이, 아미노산 20개의 길이, 또는 아미노산 20개를 초과하는 길이일 수 있다. 펩티드는 아미노산 5개 내지 10개의 길이일 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 투과 펩티드는 9개의 잔기, 즉, 9개의 연속적인 리신 잔기 또는 9개의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함한다.

하이브리드 헤테로(hetero)-세포 투과 펩티드의 경우에, 하나 이상의 리신 또는 아르기닌이 더 긴 아르기닌-풍부 또는 리신-풍부 펩티드 내에 각각 존재할 수 있다. 즉, 주로 리신이 풍부한 펩티드가 하나 이상의 아르기닌 잔기를 포함할 수 있다; 마찬가지로, 주로 아르기닌이 풍부한 펩티드가 하나 이상의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 헤테로-세포 투과 펩티드는 일련의 연속적인 아르기닌 잔기에 인접한 일련의 연속적인 리신 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 헤테로-세포 투과 펩티드는 9개의 아르기닌 잔기와 연결된 9개의 리신 잔기를 함유할 수 있다. 본 발명은 세포 투과 펩티드 조성의 임의의 특정 실시양태에 한정되지 않고, 자신이 부착된 단백질을 세포막을 가로질러 세포 환경 내로 전달하는 것을 용이하게 하는데 도움이 되는 다양한 순열 및 배열을 포함할 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명의 리프로그래밍 인자/리신-또는-아르기닌 세포 투과 펩티드 융합 단백질은 여러 방식으로, 예컨대 화학적 접합 및 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있다.

(i) 화학적 접합

본 발명의 리프로그래밍 인자는, 화학적으로 합성되었는지, 재조합적으로 제조되었는지, 또는 세포 추출물 또는 조직으로부터 단리되었는지 여부와 관계 없이, 본 발명의 양이온성 올리고펩티드에 화학적으로 접합될 수 있다. 하나의 펩티드를 또 다른 펩티드에 접합시키기 위한 표준 기술이 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kennerly S. Patrick, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC; 1 edition (August 12, 2005)] 참조.

본 발명은 리프로그래밍 인자의 N-말단 또는 이의 C-말단에서의 세포 투과 펩티드의 접합을 제공한다. 추가로, 본 발명은 리프로그래밍 인자의 N- 및 C-말단 양쪽에서의 동일하거나 상이한 세포 투과 펩티드의 접합을 제공한다. 화학적으로 접합된 세포 투과 펩티드와 리프로그래밍 인자의 예시적인 실시양태에 대해 도 18 및 19를 참조한다.

본원에서 사용된 용어 "아미노산"은 아미노산의 배열이 입체이성체 형태를 허용하는 경우 이같은 아미노산의 (D) 및 (L) 입체이성체를 포함한다. 본원에서의 아미노산 및 아미노산 잔기의 배열은 적합한 기호 (D), (L) 또는 (DL)에 의해 명시되고, 배열이 명시되지 않은 경우에는 아미노산 또는 잔기의 배열은 (D), (L) 또는 (DL)일 수 있다. 본 발명의 화합물 중 일부의 구조는 비대칭 탄소 원자를 포함한다는 것이 주지될 것이다. 따라서, 이같은 비대칭에서 발생하는 이성체들이 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 이같은 이성체들은 전통적인 분리 기술 및 입체적으로 제어되는 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 달리 상반되게 언급되지 않는 한, 지명된 아미노산은 (D) 및 (L) 입체이성체 양쪽 모두를 포함하는 것으로 해석될 것이다.

본원에서 사용된 용어 "양이온성으로 관능성인 모노사카라이드"는 임의의 아민-함유 모노사카라이드 예컨대 글루코사민, 갈락토사민 및 2-아미노-시알산을 포함할 수 있다. 이는 양성 전하를 형성할 수 있는 관능기, 예를 들어 아민 및 인 함유 기를 하나 이상 함유하는 임의의 천연 또는 비-천연 유도체화 모노사카라이드를 또한 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드"는 "양이온성으로 관능성인 모노사카라이드"를 하나 이상 포함하는 올리고사카라이드이다.

본원에서 사용된 용어 "양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜"은 양성 전하를 형성할 수 있는 관능기, 예를 들어 아민 및 인 함유 기를 치환체가 포함하는 임의의 치환된 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "양이온성으로 관능화된 올리고에테르"는 양성 전하를 형성할 수 있는 관능기, 예를 들어 아민 및 인 함유 기를 치환체가 포함하는 임의의 치환된 올리고에테르를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 디술피드 결합, 보호된 디술피드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 술폭시드 결합, 아민 결합, 히드라존 결합, 술폰아미드 결합, 요소 결합, 술포네이트 결합, 에스테르 결합, 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 디티오카르바메이트 결합 등, 뿐만 아니라 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 링커가 선택될 수 있다. 다양한 방식으로, 예를 들어, 리프로그래밍 인자 단백질의 C 또는 N 말단에서의 관능기 전환에 의해 (예를 들어, 아민 결합, 술폰아미드 결합, 에테르 결합, 아미드 결합), 및/또는 적합한 링커에 대한 측쇄의 결합에 의해 (예를 들어, 티오에테르 결합, 술폭시드 결합, 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 에스테르 결합), 결합이 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용된 링커는 원하는 링커 길이, 링커의 화학적 성질, 및 유도체화에 사용된 화학을 기초로 선택된다. 리프로그래밍 인자 단백질에의 부착을 위한 가능한 배향이 1가지를 초과하는 링커는 부착을 위한 모든 가능한 배향을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 에스테르 결합은 히드록시 (-OC(O)-) 또는 옥소 (-C(O)O-) 모이어티(moiety)를 통해 연결될 수 있고, 술포네이트 결합은 히드록시 (-OS(O)₂-) 또는 메르캅토 (-S(O)₂O-) 모이어티를 통해 연결될 수 있으며, 티오카르바메이트 결합은 히드록시 (-OC(S)NH-) 또는 아미노 (-NHC(S)O-) 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 각각의 양이온성 접합체의 부착을 위한 기타 적절한 링커들이 용이하게 확인될 수 있다.

( ii ) 세포 투과 펩티드

세포 투과 펩티드 ("CPP")는 다양한 분자성 화물의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩티드이다. CPP의 한 기능은 세포내이입을 통해 통상적으로 발생하는 프로세스인, 세포 내로의 화물 전달이며, 여기서 화물이 살아 있는 포유류 세포의 엔도솜으로 전달된다.

"화물"은 소형 화학 분자에서 나노-크기 입자 및 DNA 및 단백질의 대형 단편까지의 임의의 물질일 수 있다. 임의의 이같은 화물이 공유 결합에 의한 화학적 결합을 통해 또는 비-공유결합 상호작용을 통해 CPP 펩티드에 공동으로 연결될 수 있다. 또는, CPP 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 화물 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 핵산 서열 내로 조작되거나 또는 이에 인접하여 서브클로닝될 수 있다. 따라서, 전체 서열의 발현으로, 예를 들어, CPP 펩티드에 융합된 화물 단백질을 포함하는 융합 단백질이 생산될 수 있다. 추가로, 올리고뉴클레오티드 화물을 세포에 전달하기 위한 CPP의 용도가 하기에서 논의된다.

전형적으로 CPP의 아미노산 조성은 양성 전하를 띠는 아미노산 예컨대 리신 또는 아르기닌을 높은 상대적 존재도로 함유하거나, 또는 CPP에는 극성/전하를 띠는 아미노산과 비-극성, 소수성 아미노산이 교대되는 패턴을 함유하는 서열이 있다. 1988년에, 프랭클(Frankel) 및 파보(Pabo)는 인간 면역결핍 바이러스 전사 트랜스활성화제(transactivator) (HIV-TAT) 단백질이 CPP를 사용하여 세포에 전달될 수 있음을 발견하였다 (문헌 [Frankel et al., 1988a] 및 [Frankel et al., 1988b]).

본 발명의 한 측면에 따라 사용된 CPP는 3개 내지 35개의 아미노산, 바람직하게는 5개 내지 25개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개 내지 25개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 15개 내지 25개의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 펩티드 길이의 CPP를 코딩하는 코딩 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다.

또한 CPP가 화학적으로 변형될 수 있고, 예컨대 CPP의 C-말단 근처에서 프레닐화될 수 있다. 프레닐화는 펩티드 상에 탄소수 15 (파르네실) 또는 20 (제라닐제라닐)의 이소프레노이드 사슬이 부가되는 것을 초래하는 번역후 변형이다. 화학적으로 변형된 CPP는 심지어 더 짧지만 여전히 세포 투과 성질을 보유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, CPP는 2개 내지 35개의 아미노산, 바람직하게는 5개 내지 25개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개 내지 25개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 15개 내지 25개의 아미노산이 있는 화학적으로 변형된 CPP이다.

본 발명의 한 측면을 수행하는데 적절한 CPP는 하나 이상의 염기성 아미노산 예컨대 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함할 수 있다. 코딩 DNA 3문자 (코돈)과 관련하여, 아르기닌은 서열 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG에 의해 코딩될 수 있고, 리신은 서열 AAA 및 AAG에 의해 코딩될 수 있으며, 히스티딘은 서열 CAU 및 CAC에 의해 코딩될 수 있다. 따라서, 하기 기술되는 바와 같은 특정한 또는 바람직한 CPP가 생성되도록 이러한 코돈들의 조합이 디자인될 수 있다.

또 다른 측면에서, CPP가 더 많은, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 이를 초과하는 개수의 이같은 염기성 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 별법적으로 아미노산의 약 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 40％, 50％가 염기성 아미노산이다. 한 실시양태에서, CPP는 2개 이상의 연속적인 염기성 아미노산, 또는 별법적으로 3개 이상 또는 5개 이상의 연속적인 염기성 아미노산을 함유한다. 특정 측면에서, CPP는 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 연속적인 아르기닌을 포함한다. 추가적인 측면에서, CPP는 리신 또는 히스티딘보다 더 많은 아르기닌을 포함하거나, 또는 바람직하게는 리신 및 히스티딘 합계보다 더 많은 아르기닌을 포함한다.

CPP는 산성 아미노산을 포함할 수 있지만, 산성 아미노산의 개수는 염기성 아미노산의 개수보다 더 작아야 한다. 한 실시양태에서, CPP는 최대 1개의 산성 아미노산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CPP는 산성 아미노산을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 적절한 CPP는 HIV-TAT 펩티드이다.

CPP는 재조합적으로, 공유결합에 의해, 또는 비-공유결합에 의해 단백질에 연결될 수 있다. 박테리아, 예컨대 대장균, 포유류 세포 예컨대 인간 HEK293 세포, 또는 단백질 발현에 적절한 임의의 세포에서 CPP 펩티드가 있는 재조합 단백질이 제조될 수 있다. CPP/단백질 복합체를 형성하도록 공유결합 및 비-공유결합 방법이 또한 개발되었다. CPP인 Pep-1이 단백질 복합체를 형성하는 것으로 나타났고, 전달에 효과적인 것으로 입증되었다 (문헌 [Kameyama et al., 2006 Bioconjugate Chem. 17:597-602]).

CPP는 전구체 또는 줄기 세포 내로의 단백질의 전달을 용이하게 하는데 또한 사용될 수 있는 양이온성 접합체를 또한 포함한다. 양이온성 접합체는 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물을 포함하는 다수의 잔기를 포함할 수 있다. 관련된 실시양태에서, 양이온성 접합체는 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함할 수 있다. 또한 양이온성 접합체는 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민 등, 뿐만 아니라 그들의 조합물을 포함하는 올리고머일 수 있다.

올리고머는 올리고펩티드의 아미노산 잔기가 양성 전하를 형성할 수 있는 올리고펩티드일 수 있다. 올리고펩티드는 5개 내지 25개의 아미노산, 바람직하게는 5개 내지 15개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5개 내지 10개의 양이온성 아미노산 또는 기타 양이온성 서브유닛을 포함할 수 있다. CPP를 단백질에 고정(anchoring)시키는 재조합 단백질이 생성되어, 성숙된 기능성 DA 뉴런을 제조하기 위해 신경 전구체 세포 또는 줄기 세포에의 전달에 사용될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 신경 전구체 세포 또는 신경 줄기 세포를 Wnt1, Lmx1b, Lmx1b, Otx2 및 Pitx3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Wnt1-Lmx1a 신호전달 경로 단백질 및 SHH, FoxA2 및 Nurr1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 SHH-FoxA2 신호전달 경로 단백질과 이러한 단백질들이 세포를 투과하는데 적절한 조건 하에 접촉시킴으로써 신경 전구체 세포 또는 줄기 세포로부터 신경 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 각각의 단백질이 CPP에 부착된다.

일부 실시양태에서, 단백질은 FoxA2, Lmx1a 및/또는 Otx2를 포함하거나, 또는 별법적으로 Nurr1, Pitx3 및/또는 Lmx1a를 포함하거나, 또는 별법적으로 Nurr1, Pitx3, Lmx1a, FoxA2 및/또는 Otx2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신경 세포가 En1, En2 및/또는 Ngn2 중 하나 이상과 추가로 접촉될 수 있고, 이들은 임의적으로 CPP에 부착될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전구체 세포로부터 신경 세포를 생산하는데 유용한 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 CPP에 융합된, 다양한 Wnt1-Lmx1a 신호전달 경로 구성원 (예를 들어, Wnt1, Lmx1a, Lmx1b, Otx2 및 Pitx3) 및 다양한 SHH-FoxA2 신호전달 경로 구성원 (예를 들어, SHH, FoxA2 및 Nurr1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CPP는 단백질의 C-말단에 직접적으로 또는 링커 (예를 들어, 아미노산 또는 중합체 링커)를 통해 융합된다. 적절한 CPP에는, 예를 들어, HIV TAT 단백질 또는 임의의 다가양이온성 폴리펩티드 또는 중합체 (예를 들어, 5개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기)가 포함된다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 이를 초과하는 개수의 이러한 폴리펩티드가 제약 제형 내로 혼입될 수 있고, 제형 자체가 파킨슨병의 치료 또는 예방을 위해 치료적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 CPP 펩티드에 연결된, Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28로 구성된 군으로부터 선택된 리프로그래밍 인자를 세포에게 제공하는 것에 관한 것이다. 따라서, Oct4-CPP, Sox2-CPP, c-Myc-CPP, Klf4-CPP, Nanog-CPP, 및 Lin28-CPP와 같은 접합체가 본 발명에서 구현된다.

인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1)로부터의 트랜스(trans)-활성화 전사 활성화제 (TAT)는 CPP이고, 이는 상이한 세포주에서 세포막을 가로질러 세포질 내로 상이한 단백질, 예컨대 양고추냉이 과산화효소 및 RNase A를 전달할 수 있다. 문헌 [Wadia et al. (2004) Nat. Med 10:310-15]. 따라서, 한 측면에서, 단백질, 예컨대 Lmx1b가 TAT를 비히클로 사용하여 신경 전구체 세포에 전달되어, 세포 내에서의 Lmx1b의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다.

따라서, CPP의 예는 HIV-1 TAT 서열, 예를 들어, Tat-(48-60) GRKKRRQRRRPPQ, 및 드로소필라(Drosophila) 호메오단백질(homeoprotein) 안테나파에디아(Antennapaedia)의 호메오도메인(homeodomain) (페네트라틴(penetratin) 잔기 43-58) RQIKIWFQNRRMKWKK; 및 R8 (옥토-아르기닌) RRRRRRRR을 포함한다. 본원에 참고로 포함된 문헌 [Howl et al., Biochemical Society Transactions (2007), vol. 35, part 4, pp.767-769] 참조. 호울(Howl)은 세포막을 가로지를 수 있는 다양한 키메라 CPP 펩티드들이 제조될 수 있고, 이들이 비-키메라 CPP와 비교하여 개선된 전위 성질을 제공할 수 있음을 보고하였다. 예를 들어, 키메라 CPP는 종양-귀소 펩티드, 핵 국소화 서열, 프로테아제(protease)-절단성 부위, 인테그린-결합 RGD (Arg-Gly-Asp) 서열, 당, 지질, 및 막-활성 펩티드와 회합된 펩티드를 포함할 수 있다. 이같은 키메라 CPP는 특정 세포 유형, 질환 부위 및 소기관을 더욱 양호하게 표적화하는데 유용할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 화물을 세포에 전달하는데 CPP가 또한 사용될 수 있다. [Howl et al., 상기 문헌]. CPP에 부착되는 것이 이로울 수 있는 핵산의 예로는 중성 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO), 및 이중-가닥 RNA 분자, 예컨대 RNA 간섭에서 또는 짧은 간섭 RNA로서 사용되는 헤어핀 RNA 및 듀플렉스가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 아르기닌-풍부 CPP 및 R6-페네트라틴이 PNA 및 PMO를 전달하는데 유용하다. CPP 펩티드가 RNA 분자에 비-공유결합에 의해 연결되어 siRNA 분자의 세포 흡수를 개선시킬 수 있다.

( iii ) 재조합 융합 단백질

본 발명의 융합 단백질은 재조합적으로 또한 제조될 수 있다. 리프로그래밍 인자를 발현하는 발현 카세트가, 앞서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 양이온성 리신 또는 아르기닌 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하도록 추가로 조작될 수 있다. 리신을 코딩하는 코돈에는 AAA 및 AAG가 포함된다. 아르기닌을 코딩하는 코돈에는 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG가 포함된다. 따라서, 이러한 코돈들의 순열이 특정 세포 투과 펩티드가 재조합적으로 발현되도록 폴리뉴클레오티드 서열 내로 조작될 수 있다. 리신 펩티드를 재조합적으로 생산하기 위해, 본 발명은 특정 리프로그래밍 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 카세트 내로의 일련의 AAA 코돈 또는 AAG 코돈, 또는 AAA 및 AAG 코돈 양쪽 모두의 조합물을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 통합을 제공한다. 리신 폴리뉴클레오티드 서열이 리프로그래밍 인자 서열의 5'-말단 또는 리프로그래밍 인자 서열의 3'-말단에 위치할 수 있거나, 또는 리신 폴리뉴클레오티드가 인자 서열의 양쪽 말단에 위치할 수 있다.

유사하게, 아르기닌-코딩 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG 코돈 또는 이들의 순열로 구성될 수 있고, 마찬가지로 발현 카세트 내의 리프로그래밍 인자 서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 위치할 수 있다.

하이브리드 헤테로-리신/아르기닌-코딩 폴리뉴클레오티드 서열이 각각의 잔기에 대한 상이한 코돈들을 조합하고 이러한 서열을 발현 카세트 내로 혼입함으로써 제조될 수 있다.

따라서, 발현되는 경우, 하나 이상의 세포 투과 펩티드 및 리프로그래밍 인자를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 발현 카세트가 포함할 수 있다.

발현 카세트는 리프로그래밍 인자를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 호모(homo)- 또는 헤테로-세포 투과 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 삽입물에 작동가능하게 연결된 프로모터를 예를 들어 포함할 수 있고, 이는 이러한 삽입물의 시기적절하고 적합한 발현을 용이하게 하기 위해 적합한 종결 및 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된다.

재조합 발현 카세트는 다수의 이용가능한 발현 시스템 중 임의의 것에서, 예컨대 인간 세포, 예를 들어, HEK 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 곤충 발현 시스템, 박테리아 세포 발현 시스템, 또는 효모 발현 시스템에서 발현될 수 있다.

(b) 기타 세포 투과 펩티드와의 조합

본 발명은 리프로그래밍 인자와의 리신- 또는 아르기닌-특이적 융합 단백질의 생성에 한정되지 않는다. 기타 세포 투과 펩티드가 본 발명의 리프로그래밍 인자 상에 화학적으로 접합될 수 있거나 또는 재조합적으로 조작될 수 있다. 이같은 기타 세포 투과 펩티드에는 TAT 펩티드, 페네트라틴(Penetratin), VP22, 및 부포린(Buforin) II가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

세포로의 리프로그래밍 인자 단백질의 전달

본 발명에 따라, 하나 이상의 리프로그래밍 인자 단백질이 세포에 첨가되고, 이러한 세포는 iPS 다능성 세포가 될 것이다. 리프로그래밍 인자 단백질이 세포 발현 시스템으로부터 단리 및 정제될 수 있고, 정제된 단백질이 표적 세포에 첨가될 수 있거나; 또는 리프로그래밍 인자 단백질을 발현하는 세포의 세포 추출물이 수득될 수 있다 (발현 시스템 세포를 용해시키거나 또는 다른 방식으로 파괴하여 개방시킴으로써). 본 발명의 리프로그래밍 인자는, 본원에 기술된 바와 같이, 공유결합으로, 비-공유결합으로, 또는 재조합적으로 임의의 세포 투과 펩티드 (CPP)에 결합될 수 있거나, 이와 연결될 수 있거나, 이에 융합될 수 있거나, 또는 이와 회합될 수 있다.

따라서, 정제된 단백질 또는 단백질 추출물이 표적 세포에 직접적으로 첨가될 수 있다. 이러한 기술은 주지되어 있다. 예를 들어, 하기의 실시예 3 참조. 기본적으로, 세포 단백질 추출물을 제조하기 위해, 세포가 용해 완충제에서 용해되고, 재현탁되고, 초음파처리된다. 원심분리된 초음파처리 물질은 조제(coarse) 세포 물질의 펠렛, 및 단백질 추출물 상등액으로 구성되고, 이러한 상등액을 제거하여 필요할 때까지 동결시킬 수 있다.

그 후, 표적 세포, 예를 들어, 분화된 체세포를 정제된 개별적인 또는 다중 리프로그래밍 인자 단백질, 또는 단백질 세포 추출물(들)과 함께 적절한 배지, 예컨대 본원에 기술된 ES 1 배지 (실시예 4 참조)에서 여러 주 동안 주 당 여러 시간의 제1 인큐베이션 기간 동안 인큐베이션할 수 있다. ES1 배지는 정규 MEF 배지와 유사하지만, 약간 더 높은 FBS 및 기타 성분을 함유하고, 섬유모세포-유사 세포가 성장하도록 촉진하는데 유용하다. 표적 세포가 약 5시간/주, 약 6시간/주, 약 7시간/주, 약 8시간/주, 약 9시간/주, 약 10시간/주, 약 11시간/주, 약 12시간/주, 또는 약 12시간 초과/주 동안 리프로그래밍 인자 단백질(들)과 함께 인큐베이션될 수 있고, 이러한 사이클이 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 또는 약 12주, 또는 약 12주 초과 동안 반복될 수 있다. 또한, 표적 세포가 약 0.1시간/일, 약 0.5시간/일, 약 1.0시간/일, 약 2.0시간/일, 약 3.0시간/일, 약 4.0시간/일, 약 5.0시간/일, 약 6.0시간/일, 또는 약 6.0시간 초과/일 동안 리프로그래밍 인자 단백질(들)과 함께 인큐베이션될 수 있고, 이러한 사이클이 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 16일 초과 동안 반복될 수 있다.

이러한 1차 인큐베이션 기간 후, 세포를 ES 2 배지 (섬유모세포와 iPS 사이의 중간체 세포를 배양하기 위한 ES1 배지와 ES3 배지의 혼합물) 상에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 7일 초과 동안 배양할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포가 ES 2 배지에서 1주일 동안 인큐베이션된다. 그 후, 세포를 ES 3 배지 (iPS 세포의 최종 확립용; 일반적인 ES 배지와 동일함)에서 iPS 형성이 관찰될 수 있을 때까지 일정 기간 동안 배양할 수 있다. 실시예 4 참조.

iPS 세포의 확인

분화된 세포 내로의 하나 이상의 리프로그래밍 인자 단백질의 도입에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 발달을 다수의 방식으로 확인 및 추적할 수 있다. 예를 들어, 다능성 세포에서 발현되는 특정 마커 유전자의 존재에 대해 iPS 세포를 분석할 수 있다. 실시예 5, 및 표 1에 제시된 대표적인 마커 유전자 참조. 리프로그래밍 인자 단백질(들)에 노출된 샘플 세포로부터 추출된 전체 RNA의 RT-PCR에 의해 다능성 마커 유전자를 확인할 수 있다. 실시예 5 참조. 별법적으로, 기타 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 노던 블롯(Northern blot) 및 프로브 혼성화 확인 기술을 사용하여 본 발명의 인자 처리-후 세포에서 다능성-특이적 유전자가 발현되었는지 여부를 결정할 수 있다.

본 발명의 처리된 세포를 비술파이트 게놈 서열확인을 기초로 다능성 줄기 세포 상태에 대해 또한 평가할 수 있다. 실시예 6 참조. 이러한 기술은 유전자의 조절 영역 및 프로모터 영역과 관련된 메틸화 패턴을 측정한다. 다능성 줄기 세포의 Nanog 및 Oct4 유전자에는 독특한 메틸화 패턴이 있고, 따라서 분화된 세포였던 것에서 이러한 메틸화 패턴이 확인되는 것은 분화된 세포의 다능성 세포로의 변화를 가리킨다.

또한, 예컨대 직렬 반복물 및 현미부수체(microsatellite)의 증폭, 및 표준 핑거프린팅 기술 예컨대 무작위 증폭 다형성 DNA 및 제한 단편 길이 다형성에 의해, 세포를 핑거프린팅하여 DNA 핑거프린트 프로파일을 생성시킬 수 있고, 이에 의해 본 발명의 리프로그래밍 인자 단백질(들)에의 노출 전 및 후에 세포에서 발현된 RNA로부터 제조된 cDNA를 기초로 하는 DNA 패턴이 생산된다. 실시예 7 참조.

마지막으로, 리프로그래밍 인자(들)에 노출된 세포 내의 다능성-특이적 단백질의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅 기술 (실시예 8) 및 항체-기반 면역세포화학 (실시예 9)을 사용하여 본 발명의 리프로그래밍 인자 단백질(들)로 처리된 세포의 단백질 프로파일이 생성될 수 있다.

본 발명은 iPS 세포를 확인하는 이러한 특정 방법만을 사용하는 것에 한정되지 않고, 이러한 방법들 중 하나 이상이 분화된 세포 또는 체세포의 다능성 줄기 세포의 상태로의 변화를 확인하기 위해 공동으로 사용될 수 있다.

iPS 세포의 분화

본 발명에 따라 생성된 다능성 줄기 세포가 특정 유형의 세포로 배양 및 분화될 수 있다. iPS 세포를 분리하고, bFGF가 없는 ES 배지 (세포가 증식을 멈추고 분화를 시작하게 함) 내에서 박테리아 접시 내에 iPS 세포를 플레이팅하고 나서 4일 동안 배아체 (EB)가 형성되도록 할 수 있다. 하루 동안 EB가 조직 배양 접시에 부착되도록 하였고, 그 후 1개월 동안 무혈청 ITSFn 배지에서의 인큐베이션에 의해 뉴런 전구체를 선별하였다. ITSFn 배지는 인슐린 (5 ug/㎖), 트랜스페린 (50 ug/㎖), 염화셀렌 (30 nM), 및 피브로넥틴 (5ug/㎖)이 보충된 DMEM/F12 (1:1)이다. (문헌 [Okabe et al., (1996) Mech Dev 59:89-102]). 무혈청 ITSFn 배지는 신경 전구체 세포에 대해 선택적으로 적합하다. 그 후, 다양한 분화된 세포 유형이 EB로부터 나타난다.

EB는 다양한 세포 집단을 포함하는 구형 다세포 응집물이다. 뉴런, 심근 및 조혈 세포 분화의 프로세스가 ES 시험관내 분화 시스템을 사용하여 연구되었다. 문헌 [Schmitt et al., Genes Dev. 5: 728-740, 1991]; [Keller, Cur. Open. Cell Boil. 7: 862-869, 1995]; [Sanchez-Carpintero and Narbona, Rev. Neurol. 33: 47-53, 2001]; 및 [Bain et al., Dev. Boil. 196: 342-357: 1995]를 참조하고, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.

섬유모세포 성장 인자 (FGF)-2가 보충된 배지에서 배양함으로써, 간세포 핵 인자 (HNF)-3β로 형질감염된 배아 줄기 세포가 알부민-유도 세포로부터 분화되었고, 간세포로 분화되었다. 문헌 [Ishizaka et al., FEBS J. 16: 1444-1446, 2002], 및 [Abe et al., Exp. Cell Res. 229: 27-34. 1996]; 및 [Miyashita et al., Cell Transplantation. 11: 429-434, 2002]를 참조하고, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 중복성이고, 규정된 시험관내 조건 하에 배양되는 경우 3가지 이상의 계통 (골발생성, 연골발생성, 및 지방발생성)으로 분화될 수 있다. 인간 MSC가 포함되는 성체 BM으로부터의 성숙 간세포를 분화시키려는 기존의 시도가 보고되었다. 문헌 [Camper and Tilghman, Biotechnology 16, 81-87, 1991]; [Nahon, Biochimie. 69, 445-459, 1987]; 및 [Medvinsky and Smith, Nature 422, 823-825, 2003]; 및 미국 특허 번호 7,332,336을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.

유전 질환 및 iPS 세포

본 발명의 리프로그래밍 인자 융합 단백질은 특정 유전 질환을 교정하거나 치료하기 위해 개체에게 투여하는데 유용할 수 있다. 아데노신 디아미나제(deaminase) 결핍-관련 중증 복합 면역결핍 (ADA-SCID), 스와크만-보디안-다이아몬드(Shwachman-Bodian-Diamond) 증후군 (SBDS), 제III형 고셔병 (GD), 뒤시엔느(Duchenne) 근위축증 (DMD) 및 베커(Becker) 근위축증 (BMD), 파킨슨병 (PD), 헌팅톤병 (HD), 소아 발병형 제1형 당뇨병 (JDM), 다운 증후군 (DS)/21번 세염색체증, 및 보인자 상태의 레쉬-니한(Lesch-Nyhan) 증후군과 같은 유전 질환이 돌연변이체 표현형을 발현하는 세포를 미분화 상태로 리프로그래밍함으로써 치료될 수 있다. 따라서, 생성된 질환-특이적 줄기 세포가 시험관 내에서 정상적 및 병리학적 인간 조직 형성을 수득하는데 유용한 것으로 입증될 수 있고, 이에 의해 질환 연구 및 약물 개발을 가능하게 한다. 문헌 [Park et al., Cell, 134, 877 (2008)].

환자부터의 iPS 세포에 근본적인 기능장애가 있는 경우, iPS 세포 또는 이로부터 유래된 세포가 이식 후 기능성일 수 있도록 유전자 조작 또는 기타 방법에 의해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 논문 [Jaenish, Science, 318: 1920-1923] 참조.

유사하게, 개체로부터의 iPS 세포의 생성은 이러한 개체의 질환에 걸린 세포 유형의 대규모 생산을 허용한다. 차례로 이러한 세포가 질환 모델링, 약물 발견, 및 궁극적으로는 자가 세포 대체 요법에 사용될 수 있다. 문헌 [Dimos et al., Science, 321, 1218 (2008)] 참조.

따라서, 본 발명은 바람직하고 유전적으로 "올바른" 유전형으로 재-분화될 수 있는 개체의 유전 질환 세포를 리프로그래밍시키는 것에 대한 "맞춤 의학(personalized medicine)" 접근법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 개체에게 직접적으로 투여하며, 여기서 생체 내의 세포가 리프로그래밍되는 것, 뿐만 아니라 개체로부터 세포를 추출하고 여기에 하나 이상의 본 발명의 융합 단백질을 시험관 내에서 직접 전달하여, 생성된 미분화 세포를 다시 개체 내로 돌려보내거나, 또는 시험관 내에서 추가로 처리하고 배양하여 새로운 세포 유형으로 분화시키는 것을 허용한다. 그 후, 이러한 새로운 유형의 세포를 개체 내로 재도입할 수 있다.

별법적으로, 영구 세포주가 개체의 세포로부터 제조되어 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질로 처리될 수 있고, 그 후 이러한 미분화 세포주가 특정 치료 계획을 평가하기 위해 특정 약물, 화학물질, 화합물 및 유전자 발현 연구의 효과를 결정하기 위한 스크리닝 분석법에서 사용될 수 있다. 따라서, 이같은 재생 치료, 예컨대 신경병증 및 심장병증을 위한 재생 치료에서 본 발명에 따라 생산된 iPS 세포가 특히 사용될 수 있다.

따라서, 새로운 미분화 세포의 건강하고 보충가능한 공급원이 "무질환성" 세포주로 배양되어 개체 내로 재도입될 수 있도록 본원에 개시된 리프로그래밍 인자 단백질을 체세포에 첨가함으로써 질환에서 수반되는 체세포가 iPS 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 배지에서 나타나는 유도된 다능성 줄기 세포를 선별하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 주지된 수단이 적절하게 사용될 수 있고 , 예를 들어, 약물 저항성을 지표로 사용하여 유도된 다능성 줄기 세포를 단리하기 위해 약물 저항성 유전자 등이 마커 유전자로서 사용될 수 있다.

ES 세포의 미분화 상태 및 다능성을 유지시킬 수 있는 다양한 배지 및 이같은 성질을 유지시킬 수 없는 다양한 배지가 당업계에 공지되어 있고, 유도된 다능성 줄기 세포를 적합한 배지들의 조합을 사용함으로써 효율적으로 단리할 수 있다. 단리된 유도된 다능성 줄기 세포의 분화 및 증식 능력을 ES 세포에 광범위하게 적용되는 확인 수단을 사용함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 본원에 참고로 포함된 미국 2009/0047263 참조.

약물 발견을 위한 단백질-유도 iPS 세포의 용도

임의의 본 발명의 유도된 다능성 줄기 세포를 새로운 치료 화합물 및 약물의 스크리닝 분석법에서, 그리고 본 발명의 iPS 세포에 대한 이같은 물질 및 기타 화합물의 이후의 독물학 테스트를 위해 사용하는 것이 또한 가능하다. 따라서, 분화된 세포에 대한 특정 단백질의 리프로그래밍 효과로부터 생성된 본 발명의 iPS 세포는 약물 발견 도구로서 매우 유용하다. iPS 세포는 고용량 스크리닝 (HCS) 분석법에서 사용될 수 있고, 특정 화합물 및 물질에 대한 iPS 세포의 노출로부터 초래되는 세포 이벤트 및 표현형을 연구 및 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 약물 성능의 특정 파라메터 예컨대 독성 및 특이성이 본 발명에 의해 생성된 iPS 세포의 하위집단에서 동시에 확립될 수 있다. 본 발명의 iPS 세포에 첨가되는 "화합물" 또는 약물은 화학물질, 약물, 치료 물질, 화합물, 단백질, 펩티드, 또는 핵산일 수 있다. 후자와 관련하여, iPS 세포는 DNA 또는 RNA 분자를 발현하도록 조작될 수 있고, 특정 치료제의 디자인을 위한 유용한 표적인 것으로 증명될 수 있는 유전적 상호작용을 확인하기 위해 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 특정 내생 유전자의 발현 억제의 표현형 및 분자 효과(들)을 확인하기 위해, iPS 세포가 센스 RNA, 안티센스 RNA, 또는 RNA 간섭 (RNAi) 분석법을 위한 숙주로서 유용할 수 있다. 따라서, iPS 세포 내의 유전자의 침묵화 또는 하향조절을 일으키는 실행 핵산이 유전자 기반 요법을 위한 후보일 수 있다. 따라서, 임의의 화합물, 약물 또는 치료 물질을 본 발명의 iPS 세포에 투여한 후, iPS 세포의 표현형 또는 생화학적 또는 분자적 성질에 대한 화합물, 약물 또는 물질의 임의의 특정 효과에 대해 iPS 세포를 모니터링할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 iPS로부터 제조된 분화된 세포를 마찬가지로 하나 이상의 다양한 물질로 처리하여 분화된 세포 표현형에 대한 이러한 물질의 효과를 결정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 iPS 세포는 ADME/Tox 분석법, 세포독성 분석법, 세포 증명 스크린, 세포자멸사 연구, 세포 신호전달 연구, 세포 생육성 결정, 영상화 및 면역학적 검출, 키나제(kinase) 분석법, 사이토카인 분석법, 및 프로테아제 분석법에 유용할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 방법에 의해 생성된 iPS 세포의 한 특정한 치료 용도는 항암 약물에 대한 스크리닝에서의 용도이다. 암의 한 주요 메커니즘은 키나제의 비정상적인 활성화 또는 돌연변이에 관련된다. 키나제 억제제 약물은 표적화된 치료제의 중요한 부류이고, 글리벡(Gleevec), 수텐트(Sutent), 및 스프리셀(Sprycell)이 포함되는 여러 키나제 억제제가 임상적으로 성공하였다. 따라서, 본 발명의 iPS 세포가 키나제 억제제를 확인하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 기타 부류의 단백질 및 물질이 암 및 선행 하위섹션에 언급된 바와 같은 기타 질환의 치료적 억제제로서 확인될 수 있다.

화장품 및 약용화장품

본 발명의 방법에 의해 생성된 iPS 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 추출물, 세포-컨디셔닝 배지, 단리된 분획, 또는 이러한 iPS 세포로부터의 특정 단백질 또는 단백질들의 혼합물이 생물학적, 의학적, 및 미용 목적에 유용할 수 있다. 후자와 관련하여, 줄기 세포는 미용 및 치료적 미용 용도를 개선시키는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 iPS 세포, 세포-컨디셔닝 배지 및 추출물이 주름 치료, 피부 재생 및 화이트닝, 연골 및 골 성장에 사용될 수 있고, 따라서 이를 수술, 재건 시술, 및 노화 방지 또는 주름 방지 용도와 같은 시술에서의 미용 수술 및 다양한 이식, 예컨대 가슴 이식 수술에서에서 유용한 도구이게 한다. 따라서, 본 발명의 iPS 세포는 환자로부터 피부를 재생시키는데 특히 유용하다. 따라서 한 이로운 용도는 화상 피해자에게 적용될 수 있는 피부 이식물의 생성, 피부 염증의 치료, 및 상처 치유 또는 복원을 위한 본 발명에 의해 생성된 iPS 세포의 용도이다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 7,479,279를 또한 참조한다.

소량의 개별적인 세포들을 개체로부터 제거하고 하나 이상의 본 발명의 리프로그래밍 인자로 처리하여 iPS 세포를 생산할 수 있고, 그 후 이를 특정 용태, 예컨대 미용 시술에 의해 개정되는 것을 치료하는데 직접적으로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 iPS 세포는 현재 이용가능한 특정한 기존의 미용 시술, 예컨대 통증이 심한 보톡스(Botox) 주사에 대한 유용하고 더욱 환자-친화적인 대안이다.

따라서, iPS 세포 또는 이로부터의 추출물 또는 단리물 (예를 들어, 단백질, RNA, 및 단리된 기타 세포 성분)이 이같은 치료에 사용될 수 있다. 특히, 사이토카인이 본 발명의 iPS 세포로부터 단리될 수 있다. 사이토카인은 일반적으로 자가분비, 측분비 및 내분비 기능이 있는 유용한 신호전달 물질이고, 이는 면역, 염증 및 조혈을 조절한다. 사이토카인의 가장 큰 군이 면역 세포 증식 및 분화를 자극한다. 이러한 군에는 T 세포를 활성화시키는 인터루킨 1 (IL-1); 항원-활성화 T 및 B 세포의 증식을 자극하는 IL-2; B 세포의 증식 및 분화를 자극하는 IL-4, IL-5, 및 IL-6; 포식세포를 활성화시키는 인터페론 감마 (IFNg); 및 조혈을 자극하는 IL-3, IL-7 및 과립구 단핵구 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)가 포함된다. 따라서, 본 발명의 iPS 세포의 천연-합성 사이토카인이 단리되어 크림, 로션 또는 기타 제약 및 미용 약제 및 제형으로 제형될 수 있고, 개체를 치료하는데 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 iPS 세포가 성장된 세포 배양 배지, 또는 이의 추출물 또는 여과물 ("컨디셔닝 세포 배지")을 함유하는 미용 제제 (예를 들어, 피부 크림, 로션, 및 용액)를 제공한다.

이러한 용도는 치료 및 미용 치료를 위한 iPS 세포 및 이의 세포 추출물 및 이러한 세포 추출물의 단리물의 예시적인 용도이다. 하기의 실시예 또한 예시적이고, 이는 순수하게 본 발명의 특정 실시양태 및 방법 및 시약을 예시하기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1: 세포 배양

인간 신생아 섬유모세포 (HNF)를 ATCC (CCL-117)로부터 수득하였다. 2 mM L-글루타민 (인비트로젠(Invitrogen)), 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산 (NEAA; 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 15％ 소 태아 혈청 (FBS, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트루인스), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (인비트로젠)이 보충된 둘베코 변형 최소 필수 배지 (DMEM, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)에서 HNF를 배양하였다.

배양물이 10-20％ 조밀성(confluent)일 때, 리프로그래밍 실험을 시작하였다. 배양물을 37℃, 5％ CO₂에서 유지시키고, 격일로 배지를 교환하였다. 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 단리를 위해, 임신 13.5일 CD1 마우스로부터 단리된 자궁을 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세정하였다. 단리된 배아로부터 머리 및 내장 조직을 제거하였다. 나머지 신체를 신선한 PBS에서 세정하고, 0.1 mM 트립신/1 mM EDTA 용액 내로 옮기고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, MEF 배양 배지 (15％ 규정 FBS를 함유하는 DMEM)를 첨가하고, 아래 위로 파이펫팅(pipetting)하여 세포를 해리시켰다. 계대 2의 MEF가 리프로그래밍 실험에 사용되었고, 계대 1이 피더(feeder)용으로 사용되었다.

유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포가 인간 ES 3 배지 (2 mM L-글루타민 (인비트로젠), 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산 (NEAA; 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 20％ 녹-아웃(knock-out) 혈청 대체물 (KSR, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (인비트로젠)이 보충된 DMEM (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드))에서 생성되어 유지되었다.

인간 ES 세포 및 iPS 세포를 마이토마이신 C (10 ㎍/㎖ 배지, 시그마-알드리치)-처리 MEF 세포의 피더 층 상에서 유지시켰다. 채집 및 계대를 위해, 인간 iPS 세포를 ES 배지로 1회 세정한 후, 기계적으로 정선하거나 (계대 35까지), 또는 0.1 ％ 제IV형 콜라게나제(collagenase) 용액과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 적합한 부피의 배지를 첨가하고, 내용물을 새로운 접시의 MEF 피더 세포 상으로 옮겼다. 분할 비율은 1:1이었고 (계대 3까지), 그 후에는 관례적으로 1:5였다. iPS 세포의 피더가 없는 배양을 위해, 플레이트를 젤라틴 (스템셀 테크(StemCell Tech.))로 코팅하였다.

실시예 2: 플라스미드 구축

OCT4, SOX2, KLF4, 및 c-MYC에 대한 인간 cDNA를 하기와 같은 프라이머들을 사용하여 인간 ES 폴리(A⁺)RNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭시켰다: 인간 OCT4에 대한 5'-GGA TCC GAA TTC ATG GCG GGA CAC CTG GCT TCGG-3' (서열 1) 및 5'-AAA AAA GTC GAC gcg gcg tct gcg tct gcg gcg tct gcg GTT TGA ATG CAT GGG AGA GCC-3' (서열 2), 인간 SOX2에 대한 5'-GGA TCC GAA TTC ATG TAC AAC ATG ATG GAG ACG G-3' (서열 3) 및 5'-AAA AAA CTC GAG gcg gcg tct gcg tct gcg gcg tct gcg CAT GTG CGA CAG GGG CAG TG-3' (서열 4), 인간 KLF4에 대한 5'-GGA TCC GAA TTC ATG GCT GTC AGC GAC GCG CTG C-3' (서열 5) 및 5'-AAA AAA CTC GAG gcg gcg tct gcg tct gcg gcg tct gcg AAA GTG CCT CTT CAT GTG TAA GGC-3' (서열 6), 및 인간 c-MYC에 대한 5'-GGA TCC GAA TTC ATG CCC CTC AAC GTT AGC TTC AC-3' (서열 7) 및 5'-AAA AAA CTC GAG gcg gcg tct gcg tct gcg gcg tct gcg CGC ACA AGA GTT CCG TAG CTG TTC-3' (서열 8) (밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 9× 아르기닌을 코딩하는 영역을 가리킨다).

증폭된 PCR 생성물들을 Eco RI 및 XhoI (또는 Sal I)로 소화시킨 후, pCDNA3.1/myc-His A (인비트로젠) 내로 클로닝하여, 플라스미드 pCMV cDNA-9×Arg-myc (도 1)이 생성되었다. 형질감염 실험에서 사용된 모든 플라스미드는 엔도프리 플라스미드 메디 키트(EndoFree Plasmid Medi Kit) (퀴아젠(Qiagen))에 의해 제조되었다. 레트로바이러스 벡터의 구축을 위해, 4개의 인자의 cDNA들을 레트로바이러스 발현 벡터 pCL (오르비젠(Orbigen), 미국 캘리포니아주 샌디에고) 내로 클로닝하였다. 문헌 [Ory et al., (1996) PNAS 93:11400-11406]에 기술된 바와 같이 293GPG 레트로바이러스 생산자 세포주를 사용하여 레트로바이러스를 제조하였다. 벡터 내로의 정확한 cDNA 삽입을 제한 소화 및 서열 분석에 의해 확증하였다.

실시예 3: 단백질 추출물 제조

HEK 293 세포를 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 10％ 소 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 유지시켰다. 2 ㎍ 플라스미드 DNA를 리포펙타민(Lipofectamine)™ (인비트로젠)에 의해 약 4×10⁵개의 세포에 형질감염시켰다. 4개의 인자를 안정적으로 발현하는 세포를 확립시키기 위해, 형질감염 48시간 후 세포의 1/1000을 시딩(seeding)하고, 500 ㎍/㎖ 네오마이신 (G418 술페이트, 클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로알토)의 존재 하에 추가로 배양하였다. 개별적인 콜로니를 네오마이신-저항성 콜로니들로부터 단리하였다. 네오마이신-저항성 콜로니들로부터의 4개의 인자의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다 (도 2).

세포 추출물을 제조하기 위해, 세포를 PBS 및 세포 용해 완충제 (100 mM HEPES, pH 8.2, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, 및 프로테아제 억제제)에서 세정하고, 400g에서 침강시키고, 1 부피의 저온 세포 용해제에 다시 현탁시키고, 30-45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 현미경검사로 판단 시 모든 세포 및 핵이 용해될 때까지, 직경 3 ㎜의 프로브가 장착된 랩소닉(Labsonic)-M 펄스 초음파처리기를 사용하여 얼음 상에서 세포를 초음파처리하였다. 용해물을 4℃에서 15분 동안 15,000g에서 침강시켜, 조제 물질을 펠렛화시켰다. 상등액을 0.2 ㎛ 막으로 여과하고, 분취하고, 드라이 아이스에서 신속하게 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다.

실시예 4: 레트로바이러스 감염, 단백질 형질도입 및 IPS 생성

바이러스 형질도입을 위해, 시험관 내에서 배양된 HEF 세포를 폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드; 1 ㎍/㎖; 시그마(Sigma))을 함유하는 바이러스 상등액과 함께 2-4시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 후, 세포를 일반적인 배양 배지 (DMEM + 15％ 규정-FBS)에서 5일 더 인큐베이션하였다. 감염 6일에, 세포를 젤라틴-코팅 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 그 후, 바이러스-감염 HEF 세포를 DMEM + 15％ 규정-FBS에서 24시간 동안 배양하였다.

단백질 형질도입을 위해, 시험관 내에서 배양된 HEF 세포를 4개의 단백질 인자 (각각 12 ㎍/㎕)와 함께 주 당 8시간 동안 6주까지 ES 1 배지 (2 mM L-글루타민, 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산, 20％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1500 U/㎖ LIF가 보충된 DMEM)에서 인큐베이션하였다. 6주 후, 세포를 해리시키고, MEF 상으로 옮겼다. 그 후, 세포를 ES 2 배지 (혼합 배지 (비율; 1 (ES1 배지):3 (ES 3 배지))에서 1주일 동안 배양하였다. 1주일 후, iPS가 형성될 때까지 세포를 ES 3 배지 (2 mM L-글루타민, 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산, 20％ KSR, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM)에서 배양하였다.

실시예 5: 마커 유전자에 대한 RT - PCR 분석

전체 RNA를 트리졸(Trizol) 시약 (인비트로젠)으로 세포로부터 단리하였다. 5 ㎍의 전체 RNA가 제조사의 설명서에 따라 수퍼스크립트(SuperScript) II (인비트로젠) 및 올리고-dT 프라이머로의 역전사 반응에 사용되었다. DNA 엔진 옵티콘(Opticon)™ (MJ 리서치(MJ Research), 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 SYBR 그린(green) I을 사용하여 3중으로 실시간 PCR 분석을 수행하여, mRNA 발현 수준을 분석하였다. mRNA를 검출하는데 사용된 프라이머 세트들이 표 1에서 제시된다. 0.5 μM의 각각의 프라이머, 0.5× SYBR 그린 I (몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 오리건주), 및 2 ㎕의 cDNA를 함유하는 25 ㎕에서 증폭을 수행하였다. 30초 동안 95℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 72℃, 및 5초 동안 79℃로 구성된 온도 프로파일로 50회의 PCR 사이클을 수행하였다. 관찰된 형광 신호가 특이적 PCR 생성물로부터만 유래되었음을 확실히 하기 위해, 각각의 PCR 생성물의 해리 곡선을 결정하였다. 각각의 PCR 사이클 후, 프라이머 이량체가 용융되도록 79℃에서 형광 신호가 검출되었다 (이러한 연구에서 사용된 모든 프라이머 이량체의 Tm은 < 76℃였다). GAPDH 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 사용하여 표준 곡선을 구축하였다 (10⁴개 내지 10⁹개의 분자). 특이적 PCR 생성물로부터의 형광 신호를 β 액틴 유전자의 것에 대해 표준화한 후, 대조군의 표준화된 값을 1로 설정함으로써 상대적인 값을 계산하였다. 3개를 초과하는 독립적인 샘플을 사용하여 모든 반응을 반복하였다.

실시예 6: 비술파이트 게놈 서열확인

세포부터의 게놈 DNA를 디엔이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit) (퀴아젠(Qiagen))로 수행하였다. 제조사의 설명서에 따라 에피텍트 키트(EpiTect Kit) (퀴아젠)를 사용하여 비술파이트 처리를 수행하였다. 기존에 공개된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 인간 NANOG 및 OCT4의 프로모터 영역을 증폭시켰다 (문헌 [Deb-Rinker et al., 2005 JBC 280:6257-6260]; [Freberg et al., 2007 MCB 18:1543-1553]; 표 2). 생성된 증폭된 PCR 생성물을 젤-정제하고, pGEM-T 이지(Easy) 벡터 (프로메가(Promega)) 내로 서브클로닝하고, 서열확인하였다.

실시예 7: 핑거프린팅 분석

iPS 클론의 기원을 확인하기 위해 고도로 가변성인 개수의 직렬 반복물 (VNTR)의 영역을 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다 (문헌 [Park et al., 2008 Nature 451:141]). 증폭된 PCR 생성물을 7％ 아크릴아미드 젤에 적용하였다. 이러한 연구에서 사용된 프라이머 서열이 표 3에 열거된다.

실시예 8: 웨스턴 블롯팅

프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche))이 보충된, 50 mM 트리스(Tris) (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1％ NP-40, 0.5％ 디옥시콜산 및 0.1％ SDS를 함유하는 RIPA 완충제로 세포를 용해시키고, 125 mM 트리스 (pH 6.8), 2％ SDS, 15％ 글리세롤, 5％ β-메르캅토에탄올, 0.05％ 브로모페놀 블루로 구성된 동일한 부피의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)-샘플 완충제와 혼합하였다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (PAGE)에 적용하고, 니트로셀룰로스 막 (하이본드(Hybond)-ECL, 아머샴(Amersham))으로 옮겼다. 차단 후, 막을 항-myc 항체 (로슈)의 1:3000 희석물과 함께 인큐베이션하고, 양고추냉이 과산화효소-접합 항-마우스 면역글로불린 G (IgG) 항체 (아머샴)의 1:300 희석물과 반응시켰다. 강화된 화학발광 기질 (아머샴)을 사용하여 검출을 달성하였다.

실시예 9: 알칼리성 포스파타제 염색 및 면역세포화학

알칼리성 포스파타제 염색 키트 II (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories), 캘리포니아주 버링게임)를 사용하여 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색을 수행하였다.

면역세포 화학을 위해, 세포를 실온에서 20분 동안 4％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. PBS로 세정한 후, 세포를 10％ 정상 염소 혈청 및 0.1％ 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 PBS로 45분 동안 실온에서 처리하였다. 1차 항체는 SSEA3 및 4 (모노클로날, 1:100, 디벨로프멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank)), Oct4 및 Tra-1-60 (폴리클로날, 1:300, 산타크루즈 바이오텍(SantaCruz Biotech).,캘리포니아주 산타크루즈), 평활근 액틴 (SMA; 모노클로날, 1:400, 다코(Dako), 덴마크 글로스트럽), 항-bIII 튜불린 (Tuj1; 모노클로날, 1:500, 코반스(Covance), 캘리포니아주 리치먼드), 데스민(Desmin) (폴리클로날, 1:500, 다코), Sox17 (모노클로날, 1:200, 산타크루즈 바이오텍), 타이로신 수산화효소 (TH; 폴리클로날, 1:1,000, 펠-프리즈(Pel-Freez), 아칸사스주 로저스), 네스틴 (모노클로날, 1:1,000, BD 사이언시스(BD Sciences), 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 포함하였다. 1차 항체의 검출을 위해, 형광-표지 (알렉사(Alexa) 플루오르 488 또는 568; 몰레큘러 프로브즈, 오리건주 유진) 2차 항체를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 벡터 랩(Vector Lab.))을 함유하는 벡타쉴드(Vectashield)를 사용하여 마운팅하고, 형광 현미경검사에 의해 분석하였다.

실시예 10: IPS 세포의 시험관내 분화

iPS 세포를 해리하고, iPS 세포를 박테리아 접시 내에 nFGF가 없는 ES 배지 내에 플레이팅하고 나서 4일 동안 EB가 형성되도록 하였다. 1일 동안 EB가 조직 배양 접시에 부착되도록 한 후, 무혈청 ITSFn 배지에서의 1개월 동안의 인큐베이션에 의해 뉴런 전구체를 선별하였다. 그 후, 다양한 분화된 세포 유형이 EB로부터 나타났다.

실시예 11: 기형종 형성

단백질-유래 인간 iPS 세포 (클론 1 및 2)를 10％ FBS를 함유하는 DMEM에 현탁시켰다. 누드(nude) 마우스를 디에틸 에테르로 마취시켰다. 세포 현탁액을 신장 피막 하에 주사하였다. 주사 4주 후, 마우스로부터 종양을 수술로 절개하였다. 샘플을 칭량하고, 4％ 포름알데히드를 함유하는 PBS에 고정시키고, 파라핀에 매립하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.

실시예 12: 인간 체세포로의 재조합 리프로그래밍 단백질의 직접적인 전달

9R-앵커링 리프로그래밍 단백질이 직접적으로 인간 체세포를 리프로그래밍할 수 있는지 여부를 다루기 위해, 인간 신생아 섬유모세포 (HNF)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (카탈로그 번호 SCRC-1041)으로부터 표적으로 선택하였다. 먼저, 9개의 아르기닌 펩티드와 융합된 적색 형광 단백질 (RFP) (RFP-9R)을 사용하여 세포 투과를 테스트하였다. 실제로, 전체 세포 추출물로 처리된 경우에도, RFP-9R이 수 시간 이내에 COS7 및 HNF 세포 양쪽 모두 내로 매우 효율적으로 전달되었다 (도 3). 다음으로, 9R 및 myc 태그와 융합된 4개의 인간 리프로그래밍 인자 (Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-myc) 각각을 발현할 수 있는 안정적인 HEK293 세포주가 생성되었다 (도 1). 안정적인 HEK 293 세포주에서의 이러한 단백질들의 현저한 발현이 웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학 분석에서 확증되었다 (도 1 및 도 3). HNF가 안정적인 HEK 293 세포주로부터의 세포 추출물로 처리되었을 때, 각각의 재조합 단백질의 효율적인 세포내 전위가 8시간 이내에 관찰되었다 (도 1). 특히, 세포질로 전위된 RFP-9R과 대조적으로, 일부는 세포질 내에 남아 있는 한편 대부분의 재조합 리프로그래밍 단백질이 핵으로 전위된 것으로 나타났다 (도 1 및 도 2).

실시예 13: 직접적인 단백질 전달에 의한 HIPS 세포주 P- HIPS01 및 P- HIPS02 의 생성

HNF 세포 (5×10⁵개)를 4개의 안정적인 HEK 293 세포주의 조합된 전체 추출물로 16시간 동안 처리하였다. 도 4의 프로토콜 1 참조. 세정 후, 세포를 ES 배지 1 (2 mM L-글루타민, 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산, 20％ FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1500 U/㎖ LIF가 보충된 DMEM)에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 마우스 배아 피더 (MEF) 상으로 옮겼다. 이러한 옮겨진 세포를 ES 배지 2 (혼합 배지 (비율; 1 (ES1 배지):3 (ES 3 배지))에서 4주까지 인큐베이션하였지만, 리프로그래밍된 콜로니가 확인되지 않았다.

그 후, 16시간 동안 동일한 전체 추출물을 처리한 후, 세정하고, 6일 동안 매일 8시간 동안 ES 배지 1과 함께 인큐베이션하였다 (도 4의 프로토콜 2). 제7일에, 대부분의 세포가 생존하지 않았고, MEF 상에서의 추가적인 인큐베이션 후 콜로니가 형성되지 않았다.

바이러스 또는 기타 DNA-기반 방법을 사용하여 리프로그래밍 인자를 발현할 때, 숙주 유전자 발현 장치는 리프로그래밍 인자를 계속해서 제공할 수 있어야 한다. 따라서, 반복된 단백질 처리 사이클을 테스트하여, 이러한 노출 제도로 hiPS 세포가 산출될지를 결정하였다; 따라서, 이러한 프로토콜은 16시간 단백질 처리에 이은 ES 배지 1에서의 6일 인큐베이션을 필요로 하였다. 처리 후, 세포를 신선한 배지로 세정하고, 매일 배지를 교체하면서 6일 동안 37℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 도 6 참조. 실제로, 3회 또는 4회 라운드 후, iPS-유사 형태의 여러 콜로니가 형성되기 시작하였다 (도 5 및 6).

이러한 "반복성" 프로토콜을 추가로 반복했을 때, iPS-유사 콜로니의 개수가 유의하게 증가되었고, 6번째 사이클부터 시작하여 이러한 콜로니들 중 대략 절반이 AP-양성이었다 (도 5 및 6). iPS-유사 형태의 이러한 AP-양성 콜로니들을 채집하고, 각각 7일 동안 ES 배지 2 및 배지 3 (2 mM L-글루타민 (인비트로젠), 1 mM β-메르캅토에탄올, 1× 비-필수 아미노산 (NEAA; 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 20％ 녹-아웃 혈청 대체물 (KSR, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (인비트로젠)이 보충된 DMEM (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드))의 존재 하에 MEF 상으로 옮겼다.

이러한 시점에, 약 30개의 iPS-유사 형태의 콜로니가 형성되었고, 이들 중 대략 절반이 AP-양성이었다. 이어서 5개의 iPS-유사 콜로니를 채집하였고, 이들 중 2개 (p-hiPS01 및 p-hiPS02)를 유지시키고 특성화하였다. p-hiPS01 및 p-hiPS02는 현재까지 35회를 초과하여 계대되었다 (도 6). 이러한 2개의 세포주는 대형 핵 및 빈약한 세포질을 특징으로 하는, 인간 ES 세포의 형태와 유사한 형태를 나타냈다 (도 6). 전체적으로, 바이러스-기반 유전자 발현 프로토콜 (약 0.1 내지 0.01％)과 비교하여, 이러한 iPS-유사 콜로니의 확립은 투입된 세포의 약 0.001％의 iPS 생성의 효율로 약 8주가 걸렸다; 도 5.

실시예 14: 단백질-유도 hiPS 세포주의 특성화

이러한 p-hiPS 클론이 hES 세포의 세포 성질을 지니는지 여부를 다루기 위해, 이들을 ES 마커의 발현에 대해 시험하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 양쪽 클론이 ES 마커 단백질 예컨대 AP, Oct4, Nanog, 종양-관련 항원 (Tra)1-60, 단계-특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 SSEA 4를 현저하게 발현하였다. 추가로, 정량적 역전사 PCR (qRT-PCR) 분석은 이러한 p-hiPS 클론들이 OCT4, NANOG, SOX2, REX1 (reduced expression 1), 성장 및 분화 인자 3 (GDF3), 텔로머라제(telomerase) 역전사효소 (hTERT)가 포함되는 ES 세포 마커의 mRNA를 HNF 세포보다 극적으로 더 높은 수준 (최대 100배)으로 발현하였음을 나타냈다 (도 7). p-hiPS 세포 내의 이러한 ES 마커들의 유도된 수준은 H9 hES 세포주에 필적하였다 (도 7). 대조적으로, p-hiPS 세포에서의 KLF4 및 c-MYC의 발현 수준은 HNF 세포보다 오직 약간만 더 높았다. 다양한 ES 마커들의 이러한 발현 패턴은 H9 세포와 구별할 수 없었고, 따라서 이러한 p-hiPS 세포에서 신뢰할 수 있는 후성 리프로그래밍이 발생하였음을 강력하게 시사한다. 이를 지지하여, 비술파이트 서열확인 분석은 다능성 유전자인 NANOG 및 OCT4의 프로모터 영역이 p-hiPS 세포주 및 hES H9 세포주 양쪽 모두에서는 크게 탈메틸화된 반면, 이러한 영역이 어버이 HNF 세포에서는 조밀하게 메틸화되었음을 나타냈다 (도 7).

동일한 4개의 리프로그래밍 인자를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 동일한 HNF로부터 인간 iPS 세포주가 또한 생성되었고 (문헌 [Takahashi et al., 2007 Cell 131:861]; [Yu et al., 2007 Science 318:1917]; [Park et al., 2008 Nature 451:141]), 이는 이러한 연구에 기술된 바와 같은 iPS 세포의 동일한 기준을 충족시켰다 (도 8). 이들 중 하나 (rv-hiPS01)가 대조군으로서 사용되었다 (도 9). hES H9 및 rv-hiPS01 세포주가 대조군으로서 사용되었기 때문에, p-hiPS 세포가 이러한 오염 세포로부터 유래되었을 가능성을 배제하는 것이 중요하였다. RT-PCR 분석에서, rv-hiPS01 세포에서 트랜스진의 염색체 통합이 검출되었지만, p-hiPS01 및 p-hiPS02 세포주에서는 그렇지 않았다 (도 9). 또한, p-hiPS 세포주 및 rv-hiPS01 세포 양쪽 모두의 패턴이 어버이 HNF 세포와 동일하지만 hES H9 세포로부터의 것과는 상이하다는 것을 DNA 핑거프린팅 분석이 나타냈고, 따라서 양쪽 p-hiPS 세포주가 HNF 세포 (ATCC 카탈로그 번호 SCRC1071)로부터 유래된다는 것을 확증한다. 또한, 양쪽 p-hiPS 세포주가 적어도 35회의 계대 동안 46XX의 정상적인 핵형을 나타냈다 (도 10).

그 후, 배상체 (EB) 형성을 현탁 배양에 의해 이러한 p-hiPS 세포로부터 유도하였다 (도 10). 8일 후, 잘 형성된 EB 구조물이 양쪽 p-iPS 클론으로부터 생성되었다. 이러한 EB-유사 구조물을 젤라틴-코팅 조직 배양 플레이트 상에서 ITSFn 배지에서 15일 내지 25일 동안 인큐베이션했을 때, 이들은 신경 세포, 근육 세포 및 내배엽-유사 세포가 포함되는 3가지 모두의 배엽층의 다양한 세포 형태로 분화되었다 (도 10). 면역세포화학 분석은 SRY-박스 함유 유전자 17 (SOX17, 내배엽 마커), 평활근 액틴 (SMA, 중배엽 마커), 데스민 (중배엽 마커), Tuj1 (외배엽 마커), 네스틴 (외배엽 마커), 및 타이로신 수산화효소 (TH, 외배엽 마커)에 대해 양성인 상이한 세포 유형들의 존재를 나타냈다. 또한, 이러한 p-hiPS 클론을 누드 마우스 신장 피막 내로 이식하면 6주 내지 8주 후에 기형종이 생성되었다. 이러한 기형종들은 신경 조직 (외배엽), 표피 조직 (외배엽), 가로무늬근 (중배엽), 지방 조직 (중배엽), 호흡 상피 (내배엽) 및 각막-유사 상피 (내배엽)이 포함되는 3가지 모두의 배엽층의 조직을 함유하였고 (도 10), 이는 양쪽 p-hiPS 클론이 시험관 내 및 생체 내 양쪽 모두에서 다능성을 나타낸다는 것을 보여준다.

Claims

분화된 세포를 하나 이상의 리프로그래밍(reprogramming) 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 리프로그래밍 인자 단백질(들)이 분화된 세포가 탈분화되도록 하는 것인, 다능성 줄기 세포의 생산 방법.
제1항에 있어서, 리프로그래밍 인자가 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, 및 Lin28로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 리프로그래밍 인자가 세포 투과 펩티드에 연결되며, 여기서 리프로그래밍 인자가 세포 투과 펩티드에 화학적으로 접합되거나, 또는 융합 단백질로서 세포 투과 펩티드에 재조합적으로 연결되는 방법.
제2항에 있어서, 세포 투과 펩티드가 (a) 9개 이상의 연속적인 리신 아미노산 잔기, (b) 9개 이상의 연속적인 아르기닌 아미노산 잔기; (c) 리신 및 아르기닌 아미노산의 혼합물의 9개 이상의 잔기, 또는 (d) HIV-TAT 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 펩티드인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 리프로그래밍 인자가 분화된 세포 내로 시험관 내에서 도입되는 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 리프로그래밍 인자가 분화된 세포 내로 생체 내에서 도입되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 세포를 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질이 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Oct4 리프로그래밍 인자 단백질의 존재가 분화된 세포가 다능성 줄기 세포로 되도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 세포를 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질이 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Sox2 리프로그래밍 인자 단백질의 존재가 분화된 세포가 다능성 줄기 세포로 되도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 세포를 c-Myc 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 c-Myc 단백질이 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 c-Myc 리프로그래밍 인자 단백질의 존재가 분화된 세포가 다능성 줄기 세포로 되도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 세포를 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질이 9개 이상의 연속적인 리신 잔기 또는 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기를 포함하고, 분화된 세포 내의 Klf4 리프로그래밍 인자 단백질의 존재가 분화된 세포가 다능성 줄기 세포로 되도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화된 세포를 Oct4 접합체, Sox2 접합체, c-Myc 접합체, 및 Klf4 접합체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 각각의 상기 접합체가 세포 투과 펩티드를 포함하고, 상기 접합체가 상기 분화된 세포가 다능성 줄기 세포로 되도록 하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 세포 투과 펩티드가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 치환체를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 세포 투과 펩티드가 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 세포 투과 펩티드가 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머인 방법.
제14항에 있어서, 올리고머가 올리고펩티드인 방법.
제15항에 있어서, 올리고펩티드의 실질적으로 모든 아미노산 잔기가 양성 전하를 형성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 5개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 5개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 세포가 분화된 체세포인 방법.
제11항에 있어서, 리프로그래밍 인자 접합체 단백질이 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에 전달되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 분화된 세포가 4개 이상의 리프로그래밍 인자 단백질과 접촉되는 방법.
제22항에 있어서, 상기 4개 이상의 리프로그래밍 인자 단백질이 Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4를 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4 각각이 융합 단백질로서 세포 투과 펩티드와 연결된 것인 방법.
제24항에 있어서, 각각의 세포 투과 펩티드가 독립적으로 (a) 9개 이상의 연속적인 리신 아미노산 잔기, (b) 9개 이상의 연속적인 아르기닌 아미노산 잔기, (c) 리신 및 아르기닌 아미노산의 혼합물의 9개 이상의 잔기, 또는 (d) HIV-TAT 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 펩티드인 방법.
Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택된 리프로그래밍 인자와 연결된 세포 투과 펩티드를 포함하는 리프로그래밍 인자 단백질.
제26항에 있어서, 양이온성 접합체가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제26항에 있어서, 양이온성 접합체가 알파-아미노산, 베타-아미노산, 감마-아미노산, 양이온성으로 관능화된 모노사카라이드, 양이온성으로 관능화된 에틸렌 글리콜, 에틸렌 이민, 치환된 에틸렌 이민, N-치환 스퍼민, N-치환 스퍼미딘, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 반응성 단위를 포함하는 것인 조성물.
제28항에 있어서, 상기 양이온성 접합체가 올리고펩티드, 올리고아미드, 양이온성으로 관능화된 올리고에테르, 양이온성으로 관능화된 올리고사카라이드, 올리고아민, 올리고에틸렌이민, 및 그들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고머인 조성물.
제29항에 있어서, 상기 올리고머가 올리고펩티드인 조성물.
제30항에 있어서, 상기 올리고펩티드의 실질적으로 모든 아미노산 잔기가 양이온성인 조성물.
제31항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 5개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
제32항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 5개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
제26항에 있어서, 상기 올리고펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 연속적인 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 조성물.
N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서 하나 이상의 세포 투과 펩티드와 연결된 Oct4 단백질을 포함하는 조성물.
제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 조성물.
N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서 하나 이상의 세포 투과 펩티드와 연결된 Sox2 단백질을 포함하는 조성물.
제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 조성물.
N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서 하나 이상의 세포 투과 펩티드와 연결된 c-Myc 단백질을 포함하는 조성물.
제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 조성물.
N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 양쪽 모두에서 하나 이상의 세포 투과 펩티드와 연결된 Klf4 단백질을 포함하는 조성물.
제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 아민, 구아니딘, 아미딘, N-함유 헤테로환, 또는 그들의 조합물로부터 선택된 다수의 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 투과 펩티드가 9개 이상의 연속적인 리신 잔기, 9개 이상의 아르기닌 잔기, 또는 그들의 조합물을 포함하는 것인 조성물.
제1항의 방법으로부터 생산된 유도된 다능성 줄기 세포.
제47항의 유도된 다능성 줄기 세포로부터 생산된 분화된 세포.
제48항에 있어서, (A) 제1항의 방법으로부터 제조된 유도된 다능성 줄기 세포로부터 배아체를 생산하는 단계, 및 (2) 배아체를 ITSFn 배지 상에서 인큐베이션하며, 여기서 배아체가 내배엽 배엽층 세포, 중배엽 배엽층 세포, 외배엽 배엽층 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배엽층의 세포 형상으로 분화되는 단계에 의해 생산된 분화된 세포.
(A) 제1항의 방법에 의해 제조된 유도된 다능성 줄기 세포로부터 배아체를 생산하는 단계, 및 (2) 배아체를 ITSFn 배지 상에서 인큐베이션하며, 여기서 배아체가 내배엽 배엽층 세포, 중배엽 배엽층 세포, 외배엽 배엽층 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 배엽층의 세포 형상으로 분화되는 단계를 포함하는, 분화된 세포의 제조 방법.
제50항에 있어서, 분화된 세포가 신경 세포, 표피 세포, 가로무늬 근육 세포, 지방 세포, 호흡 상피 세포, 및 각막-유사 상피 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
(A) Oct4, Sox2, c-Myc, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 리프로그래밍 인자 단백질을 개체로부터 수득된 분화된 세포에 직접적으로 제공함으로써 다능성 줄기 세포를 생산하며, 여기서 개체의 분화된 세포 내의 리프로그래밍 인자 단백질(들)의 존재가 다능성 줄기 세포의 발달을 유도하는 단계; (B) 유도된 다능성 줄기 세포로부터 분화된 배엽층 세포를 생산하는 단계; 및 (C) 분화된 배엽층 세포를 개체에게 투여하며, 여기서 분화된 배엽층 세포가 무질환성(disease-free)이고, 개체의 질환 또는 손상을 치료하는데 유용한 단계를 포함하는, 질환 또는 손상이 있는 개체를 치료하는 방법.
제52항에 있어서, 개체에 신경변성 질환, 백혈병, 림프종, 제1형 당뇨병, 외상성 뇌 및/또는 척수 손상, 퇴행성 척수 손상 및 질환, 심근에 대한 손상, 골격근에 대한 손상, 또는 피부에 대한 손상이 있는 방법.
제53항에 있어서, 신경변성 질환이 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 알츠하이머병이고; 퇴행성 척수 손상 또는 질환이 근위축성 측삭 경화증이고; 심근에 대한 손상이 허혈성 손상이며; 피부에 대한 손상이 열상, 화학 화상, 및 열 화상인 방법.
질환 또는 손상이 있는 개체에게 제47항의 다능성 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 손상이 있는 개체를 치료하는 방법.
제55항에 있어서, 개체가 신경변성 질환, 백혈병, 림프종, 제1형 당뇨병, 외상성 뇌 및/또는 척수 손상, 퇴행성 척수 손상 및 질환, 심근에 대한 손상, 골격근에 대한 손상, 또는 피부에 대한 손상을 가진 것인 방법.
제56항에 있어서, 신경변성 질환이 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 알츠하이머병이고; 퇴행성 척수 손상 또는 질환이 근위축성 측삭 경화증이고; 심근에 대한 손상이 허혈성 손상이며; 피부에 대한 손상이 열상, 화학 화상, 및 열 화상인 방법.
제47항의 세포를 포함하는 제약 조성물.
제48항의 세포를 포함하는 제약 조성물.
이전에 제47항의 세포의 성장을 지지한 컨디셔닝(conditioned) 세포 배지를 포함하는 미용 제제.
제60항에 있어서, 상기 제제가 크림인 미용 제제.
제1항에 있어서, 분화된 세포를 p53, p16(Ink4a), 및 p19(Arf)의 억제제; ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 베타-카테닌; ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2 중 하나 이상과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.