KR101663811B1 - 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4종의 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 생체 내 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 4종의 리프로그래밍 인자는 뇌 조직에서 발현되어 신생혈관생성 및 성상교세포와 신경전구세포의 증식을 유도함으로써, 손상된 뇌기능을 회복시킨다.

Description

뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing or treating brain diseases}
본 발명은 4종의 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 인 비보(in vivo) 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
손상된 조직의 복원 또는 재생은 손상이나 질병에서 기능 회복에 중요하다. 포유동물의 뇌는 다른 기관 및 조직에 비해 재생능력이 현저히 떨어진다. 그러므로, 뇌 조직 손상은 종종 반영구적인 기능 장애로 이어진다.
뇌 재생에 필요한 세포 유형이 내재된 세포 소스(endogenous cell sources)에 의해 충분히 제공되지 않기 때문에, 다른 종류의 세포의 보충이 회복에 도움이 된다. 예를 들어, 골수 단핵세포(bone marrow mononudlear cells)1, 골수 기질세포(bone marrow stromal cells)2 및 신경줄기세포(neural stem cells)3와 같은 외인성 세포(exogenous cells)의 이식을 통하여 뇌 조직 재생을 향상시킬 수 있음이 보고된바 있다. 그러나, 이식된 세포의 생착이 제한적이고4, 이식된 세포에서 신경계통(neural lineage) 세포의 생성이 기능적 회복을 유도하기에는 충분하지 않은 문제점이 있었다5. 또한, 뇌로의 동종 또는 이종 세포의 이식은 세포주입 이후에 면역 시스템에 의해 거부되거나, 종양 생성6을 유도할 수 있는 역효과를 가져올 수 있다.
포유동물의 뇌는 손상이나 질병에 의해 동원되는 내인성 신경줄기세포(endogenous neural stem cells) 및 전구 세포(progenitor cells)를 가지고 있다7. 이러한 세포의 동원 및 활성화를 표피성장인자(EGF)와 뇌유래 신경영양인자(BDNF)와 같은 외생 전달 체액성 인자(exogenously delivered humoral factors)를 이용하여 증대시킬 수 있다8-10. 아데노바이러스 벡터 또는 삼투압 펌프에 의한 BDNF, noggin 또는 EGF의 뇌실 내로의 전달(intraventricular delivery)은 만성 저산소성 허혈성 뇌손상10과 헌팅턴병(Huntington's disease)8, 9을 가진 마우스 모델에서 선조체 재생 및 기능적 향상을 이끄는 뇌실하 부위(subventricular zone)에 있는 내인성 신경줄기/전구세포를 활성화하는 것으로 보고된바 있다. 그러나, 이러한 체액성 인자에 의해 직접 영향을 받을 수 있는 내인성 세포는 체액성 인자에 대한 수용체를 가진 세포로 제한되고, 이는 뇌기능 회복을 제한하는 요인으로 작용한다. 따라서, 손상된 뇌기능을 회복시킬 수 있는 보다 효과적인 치료법이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Iihoshi S, Honmou O, Houkin K, Hashi K, Kocsis JD. A therapeutic window for intravenous administration of autologous bone marrow after cerebral ischemia in adult rats. Brain Res. 2004;1007:1-9. Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. J Neurol Sci. 2001;189:49-57. Park KI, Teng YD, Snyder EY. The injured brain interacts reciprocally with neural stem cells supported by scaffolds to reconstitute lost tissue. Nat Biotechnol. 2002;20:1111-7. Delcroix GJ, Schiller PC, Benoit JP, Montero-Menei CN. Adult cell therapy for brain neuronal damages and the role of tissue engineering. Biomaterials. 2010;31:2105-20. Roitberg B. Transplantation for stroke. Neurol Res. 2004;26:256-64. Fong SP, Tsang KS, Chan AB, et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J Neurosci Res. 2007;85:1851-62. Goldman SA. Disease targets and strategies for the therapeutic modulation of endogenous neural stem and progenitor cells. Clin Pharmacol Ther. 2007;82:453-60. Cho SR, Benraiss A, Chmielnicki E, Samdani A, Economides A, Goldman SA. Induction of neostriatal neurogenesis slows disease progression in a transgenic murine model of Huntington disease. J Clin Invest. 2007;117:2889-902. Benraiss A, Toner MJ, Xu Q, et al. Sustained mobilization of endogenous neural progenitors delays disease progression in a transgenic model of Huntington's disease. Cell Stem Cell. 2013;12:787-99. Im SH, Yu JH, Park ES, et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 2010;169:259-68.
본 발명자들은 뇌손상으로 인한 뇌기능 저하를 치료할 수 있는 새로운 치료법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 허혈성 뇌손상 동물모델에서 4종의 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)의 뇌 조직에서의 일시적 인 시투(in situ) 발현이 뇌손상으로 인한 기능 저하를 회복시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Oct-4(Octamer-binding transcription factor 4), Sox2(SRY-box containing gene 2), c-Myc(c-myelocytomatosis oncogene) 및 Klf4(Kruppel-like factor 4)인 4종의 리프로그래밍 인자를 암호화하는 단일의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 생체 내(in vivo) 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4인 4종의 리프로그래밍 인자를 별도로 암호화하는 복수개의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 생체 내(in vivo) 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 뇌손상으로 인한 뇌기능 저하를 치료할 수 있는 새로운 치료법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 허혈성 뇌손상 동물모델에서 4종의 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)의 뇌 조직에서의 일시적 인 시투(in situ) 발현이 뇌손상으로 인한 기능 저하를 회복시킬 수 있음을 규명하였다.
유전자 치료는 유전자 전달 방법에 따라 생체 밖(ex-vivo) 유전자 치료와 생체 내(in-vivo) 유전자 치료로 구분되며, 생체 밖 유전자 치료는 몸 밖에서 배양한 세포를 다시 주입하여 치료하는 방법이고, 생체 내 유전자 치료는 환자로부터 세포를 추출할 필요 없이 직접 환자에게 유전자를 주입하는 방법이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 뇌신경 질환에 대한 생체 내 유전자 치료제로서, 본 발명을 이용한 유전자 치료에는 상기 4종의 리프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자가 이용된다. 상기 핵산 분자는 4종의 리프로그래밍 인자를 함께 암호화하는 단일의 폴리뉴클레오타이드이거나, 또는 4종의 리프로그래밍 인자를 별도로 암호화하는 복수개의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 4종의 리프로그래밍 인자를 별도로 암호화하는 복수개의 폴리뉴클레오타이드는, (ⅰ) 각각의 리프로그래밍 인자를 암호화하는 4종의 폴리뉴클레오타이드이거나, 또는 (ⅱ) 4종의 리프로그래밍 인자 중 1종의 리프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 2 내지 3종의 리프로그래밍 인자를 함께 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 조합일 수 있다.
본 발명의 리프로그래밍 인자의 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) 웹사이트 등에 공개되어 있으므로, 통상의 기술자는 이와 같이 공지된 염기서열을 토대로 본 발명의 핵산 분자를 용이하게 제작할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 뇌신경 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 뇌신경 질환의 발전의 억제, 뇌신경 질환의 증상 완화, 또는 손상된 뇌기능의 회복을 의미한다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 뇌신경 질환의 증상인 인지기능 저하를 회복시킴으로써 뇌신경 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 뇌신경 질환의 다른 증상인 운동기능 저하를 회복시킴으로써 뇌신경 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 뇌 조직에서 신생혈관생성(angiogenesis)을 유도하거나, 또는 성상교세포 또는 신경전구세포의 증식을 유도함으로써 뇌신경 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 다양한 뇌신경 질환의 예방 및 치료에 적용될 수 있다. 본 발명이 적용 가능한 뇌신경 질환의 예로는, 뇌졸중, 뇌성마비, 허혈성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 섬망 및 퇴행성 뇌신경 질환 등이 있다.
본 발명이 적용 가능한 상기 퇴행성 뇌신경 질환의 예로는, 치매, 파킨슨병 및 헌팅턴병 등이 있다. 상기 치매에는 노인성 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 파킨슨병 치매, 헌팅턴병 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 두부 외상으로 인한 치매 및 물질로 유발된 치매가 포함되나, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 전달체에 포함되어 있거나, 또는 네이키드 DNA(naked DNA)이다. 리프로그래밍 인자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 이용하는 경우, 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자는 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "유전자 전달"은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포 내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다.
상기 발현 컨스트럭트에서, 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 용어, "작동적으로 연결된"은 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자에 결합된 프로모터는, 동물세포(예컨대, 포유동물 세포)에서 작동하여 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함할 수 있다(예컨대, 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자는 "프로모터 - 리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자 - 폴리 아데닐화 서열"의 구조를 갖는다.
본 발명의 핵산 분자는 다양한 형태로 제작할 수 있으며, 예를 들어 (i) 플라스미드를 전달체로 이용한 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 바이러스 벡터, (ⅲ) 리포좀 또는 니오좀, (ⅳ) 지질-유전자 결합체(Lipid-DNA complex) 또는 (ⅴ) 폴리머-유전자 결합체(Polymer-DNA complex) 등의 형태로 제작할 수 있다.
리프로그래밍 인자-코딩 핵산 분자는 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 아데노 바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로 바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티 바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Humana Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 바이러스 벡터로 구현될 수 있다.
상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 유효성분 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 용어, "약제학적 유효량"은 상술한 유효성분의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 뇌 조직으로 투여되고, 4종의 리프그래밍 인자는 뇌 조직에서 발현된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 4종의 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 암호화하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 생체 내 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명에 따르면, 상기 4종의 리프로그래밍 인자는 뇌 조직에서 발현되어 신생혈관생성 및 성상교세포와 신경전구세포의 증식을 유도함으로써, 손상된 뇌기능을 회복시킨다.
도 1은 본 발명의 실험 과정을 도식화하여 보여준다. A는 유전자가 이식되지 않은(non-transgenic) 마우스를 이용한 실험과정이고, B는 유전자가 이식된(transgenic) 마우스에서의 실험과정이다.
도 2는 면역조직화학염색을 이용해 센다이 바이러스에 의한 리프로그래밍을 확인한 결과이다(A-C = 200 ㎛).
도 3은 센다이 바이러스로 리프로그래밍 인자를 발현시킨 뇌 허헐 마우스에서 인 시투 리프로그래밍 인자의 발현에 의한 운동기능 회복을 보여준다.
도 4는 리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스에서 인 시투 리프로그래밍 인자의 발현에 의한 운동기능 회복을 보여준다.
도 5는 리프로그래밍 유전자 이식-뇌 허혈 마우스의 뇌실하 부위에서의 세포 증식(BrdU+ 세포) 및 신경줄기세포(Nestin+ 세포)와 성상세포(GFAP+ 세포)로의 우세한 분화를 보여주는 면역조직화학염색 결과이다.
도 6은 리프로그래밍 유전자 이식-뇌 허혈 마우스의 선조체에서의 세포 증식(BrdU+ 세포) 및 성상세포(GFAP+ 세포)로의 우세한 분화를 보여주는 면역조직화학염색 결과이다.
도 7은 성상세포와 뉴런세포에서 혈관생성인자의 발현 정도를 보여주는 면역분석 결과이다. 대조군에 비하여 리프로그래밍 된 마우스에서 혈관이 증가된 것을 수량화하여 그래프로 나타내었다(A, B = 100 ㎛).
도 8은 리프로그래밍 유전자 이식-뇌 허혈 마우스의 선조체에서 혈관생성(CD31+ 세포)이 증가하였음을 보여주는 면역조직화학염색 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
뇌 허혈 마우스 모델(2-vessel occlusion mouse model)
마우스의 양측 총경동맥(birateral common carotid artery)을 일시적으로 결찰하고, 20분 후 풀어주어 허혈성 뇌손상(ischemic brain injury)을 유도하였다.
리프로그래밍 유도 - 바이러스 벡터 이용
상술한 뇌 허혈 마우스에 허혈 뇌손상 후 즉시 양측 측뇌실(lateral ventricle)로 리프로그래밍 인자(Oct-4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 발현하는 센다이 바이러스(CytoTumeTM-IPS Sendai Reprogramming Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 주입하였다. 대조군은 초록색 형광 리포터만을 발현하는 센다이 바이러스(CytoTumeTM-EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하였다. 상기 실험 과정을 도 1의 A에 나타내었다.
리프로그래밍 유도 - 독시사이클린 삼투압 펌프 이용
독시사이클린 투여 시 이식된 리프로그래밍 유전자를 발현하도록 제조된 트랜스제닉 마우스(reprogrammable mice; Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae Col1a1tm3(tetO-Pou5리,-Sox2,-Klf4,-Myc)Jae/J)에서 허혈 뇌손상 후 즉시 오른쪽 측 뇌실(lateral ventricle)로 독시사이클린이 들어있는 삼투압 펌프를 이식하여 약 7일간 리프로그래밍 인자를 발현하도록 하였다. 대조군에는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)가 들어간 삼투압 펌프를 이식하였다. 모든 마우스는 새로 생성된 세포를 표지하기 위하여 BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine, 50 mg/kg)를 허혈 뇌손상 후 다음날부터 약 2주간 복강 내 주사해 주었다. 상기 실험 과정을 도 1의 B에 나타내었다.
운동 기능 테스트(behavioral assessment)
운동협조(motor coordination) 기능을 평가하기 위하여, 로타로드(Cat. No. 47600, UGO Basile, VA, Italy)를 이용하여 2주 간격으로 로타로드(rotarod) 시험을 진행하였다. 구체적으로, 48 rpm의 고정 속력과 4-80 rpm까지의 가속력 방법으로 5분간 시행하는 동안, 대상 동물이 로드에서 떨어지는 시간을 측정하였다. 평가를 2차례 진행하였고, 평균 지속시간(mean latency)을 분석하였다.
사다리 보행 검사로서, 다양한 거리로 철심 가로단(rung)이 놓여 있는 1 m 거리의 수평 사다리에서 대상 쥐를 4차례 보행하도록 한 후, 사다리 가로단 사이로 미끄러져 떨어지는 횟수(number of slips)를 비디오 분석을 통해 측정하였다. 실험결과는 도 3-4에 나타내었다.
면역화학염색(Immunohistochemistry; IHC)
면역화학염색을 실시하기 위하여, 일단 환경과 부유 환경에서 사육 8주 후, 대상 동물의 뇌 조직을 적출한 후 16 ㎛ 간격으로 절단하고, 마이크로 글라스 슬라이드 상에 뇌 조직 절편(section)을 부착시켰다. 리프로그래밍의 확인을 위하여, 센다이 바이러스 이식 후 3일째 되는 마우스의 뇌 조직에서 Oct4 항체를 이용하여 면역화학염색 후 공초점 현미경으로 관찰하였다. 실험결과는 도 2에 나타내었다.
인 시투(in situ) 리프로그래밍에 의한 세포 증식(BrdU 항체)과 신경줄기세포(Nestin 항체), 그리고 성상세포(GFAP 항체) 등을 표지하는 항체를 이용하여 면역화학염색 후 공초점 현미경으로 확인하였다. 실험결과는 도 5-6에 나타내었다.
인 시투 리프로그래밍에 의한 혈관 생성을 확인하기 위하여, 혈관내피세포 표지 항체인 CD31을 이용하여 면역화학염색 후 공초점 현미경으로 확인하였다. 실험결과는 도 7에 나타내었다.
세포 배양
어떤 세포에서 혈관생성인자가 발현되는지 확인하기 위하여, 마우스 성상세포 세포주(C8-D1A; Astrocyte Type 1 clone, ATCC, CRL-2541)와 신경 모세포주 (N1E-115, ATCC, CRL-2263)를 무혈청(serum free) 배양액에서 이틀간 배양한 후, 세포를 거두어 실험에 사용하였다.
면역분석
면역분석을 위하여, 얻은 세포로부터 용해 용액을 이용하여 추출한 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 분획한 다음, 영동된 분획의 위치를 그대로 여과지에 옮겼다. 여과지에 옮겨진 단백질은, 혈관생성인자들인 ANGPT1 (angiopoietin-1), VEGFA (vascular endothelial growth factor-A), FGF2 (fibroblast growth factor-2) 항체와 항존 유전자 단백질인 GAPDH 항체를 이용하여 방사선 면역검정법(radioimmunoassay)으로 검출하였다. 실험결과는 도 8에 나타내었다.
실험결과
운동 기능 테스트 결과
뇌 허혈 마우스에서 인 시투 리프로그래밍에 의한 운동 기능 변화를 확인하기 위하여, 로타로드와 사다리 보행 검사로 행동검사를 시행하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 센다이 바이러스를 투여한 뇌 허혈 마우스에서, 로타로드의 가속(4-80 rpm) 속도에서 리프로그래밍 된 마우스들이 대조군에 비해 2주 후 지속시간이 유의하게 증가하였다(오른쪽 그래프).
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 리프로그래밍 유전자가 이식된 뇌 허혈 마우스에서 독시사이클린 투여로 리프로그래밍을 유도하였을 때, 로타로드의 가고정(48 rpm) 속도에서는 대조군에 비해 2주부터 유의하게 지속시간이 증가하기 시작했고, 4주까지 이러한 양상이 유지되었다(왼쪽 상단 그래프). 로타로드의 가속(4-80 rpm) 속도에서도 2주에는 증가되는 경향만을 보였으나, 4주에서는 유의하게 지속시간이 증가하였다(오른쪽 상단 그래프). 사다리 보행 검사 결과, 대조군에 비해 리프로그래밍 시킨 마우스에서 앞다리의 미끄러짐 정도가 2주에서 4주까지 감소하는 양상을 보였다(하단 그래프).
면역화학염색 결과
리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스의 뇌 조직에서의 세포 증식과 분화를 면역조직화학염색으로 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 뇌실하대에서의 세포 증식(BrdU+ 세포)을 확인하였다(패널 A). 손상된 뇌에서의 리프로그래밍은 새로운 세포의 생성을 증가시키고, 신경줄기세포로의 분화를 유도할 뿐 아니라(패널 B), 성상세포로의 분화를 증가시켰다(패널 D). 반면에 새로 생성된 세포는 신경세포로 분화 유도되지 않았다(패널 C). 패널 E, G 및 I는 대조군에서의 신경줄기세포(Nestin+ 세포), 어린신경세포(Tuj-1+ 세포) 및 성상세포(GFAP+ 세포)를 나타내고, 패널 F, H 및 J는 리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스에서의 신경줄기세포, 어린신경세포 및 성상세포를 나타낸다(E-J = 25 ㎛).
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 선조체에서 새로운 세포의 세포 증식(BrdU+ 세포)이 일어났다(패널 A). 성상세포로의 분화 역시 증가하였다(패널 C). 반면에 새로 생성된 세포는 신경세포로 분화 유도되지 않았다(패널 B). 패널 E, G 및 I는 대조군에서의 신경줄기세포(Nestin+ 세포), 어린신경세포(Tuj-1+ 세포) 및 성상세포(GFAP+ 세포)를 나타내며, 패널 D, F 및 H는 리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스에서의 어린신경세포(Tuj-1+ 세포) 및 성상세포(GFAP+ 세포)를 나타낸다. 패널 J, K 및 L은 대조군, 패널 M, N 및 O는 리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스에서 새로 생성된 세포(BrdU+ 세포)가 신경줄기세포(Nestin+ 세포), 미세아교세포(Iba-1+ 세포) 및 희돌기교세포(MBP+ 세포)로 분화되지 않았음을 보여준다(D-O = 25 ㎛).
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 리프로그래밍 유전자-이식 뇌 허혈 마우스에서 선조체에서 혈관 증식(CD31+ 세포)이 나타났다(그림 B).
면역분석 결과
어떤 세포에서 혈관생성인자가 발현되는지 확인하기 위하여, 마우스 성상세포 세포주(C8-D1A)와 신경 모세포주(N1E-115)를 무혈청 배양액에서 이틀간 배양한 후, 세포를 거두어 단백질을 추출하여 혈관생성인자들인 ANGPT1(angiopoietin-1), VEGFA(vascular endothelial growth factor-A) 및 FGF2(fibroblast growth factor-2) 항체와 항존 유전자 단백질인 GAPDH 항체로 면역분석을 실시하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 결과적으로 신경세포보다는 성상세포에서 혈관생성인자가 더 많이 발현되었음을 확인하였다. 패널 A는 ANGPT1, 패널 B는 VEGFA, 패널 C는 FGF2가 성상세포에서 증가되었음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. Oct-4(Octamer-binding transcription factor 4), Sox2(SRY-box containing gene 2), c-Myc(c-myelocytomatosis oncogene) 및 Klf4(Kruppel-like factor 4)인 4종의 리프로그래밍 인자를 암호화하는 단일의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 상기 핵산 분자는 유전자 전달체에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 내(in vivo) 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. Oct-4(Octamer-binding transcription factor 4), Sox2(SRY-box containing gene 2), c-Myc(c-myelocytomatosis oncogene) 및 Klf4(Kruppel-like factor 4)인 4종의 리프로그래밍 인자를 별도로 암호화하는 복수개의 핵산 분자를 유효성분으로 포함하고, 상기 핵산 분자는 유전자 전달체에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 내(in vivo) 유전자 치료에 이용되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 뇌신경 질환은 뇌졸중, 뇌성마비, 허혈성 뇌손상, 외상성 뇌손상, 섬망 및 퇴행성 뇌신경 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 치매, 파킨슨병 또는 헌팅턴병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경 질환의 증상인 인지기능 저하를 회복시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경 질환의 증상인 운동기능 저하를 회복시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌 조직에서 신생혈관생성(angiogenesis)을 유도하거나, 또는 성상교세포 또는 신경전구세포의 증식을 유도하는 것을 특징으로 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌 조직으로 투여되고, 4종의 리프그래밍 인자는 뇌 조직에서 발현되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 바이러스 벡터, 플라스미드, 리포좀, 니오좀, 지질-유전자 결합체(Lipid-DNA complex) 또는 폴리머-유전자 결합체(Polymer-DNA complex)인 것을 특징으로 하는 조성물.
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