JP7391308B2 - 脊髄損傷の治療のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
この出願は、2018年1月22日に提出された米国仮特許出願番号62/620,269の優先権の利益を主張する。
参照による組み込みのみを許可する管轄区域の目的のために、本明細書で引用されるすべての文書の本文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に引用または言及されている製品の製造元の指示またはカタログは、参照により組み込まれる。この本文に参照により組み込まれた文書、またはその中の教示は、本発明の実施において使用することができる。「アデノウイルスE4ORF1を発現する内皮細胞およびその使用方法」と題する米国特許第8,465,732号の教示の多くは、本発明と組み合わせて使用することができ、または本発明での使用に適合させることができる。したがって、米国特許第8,465,732号の内容全体は、参照により本出願に明示的に組み込まれる。
脊髄損傷（「SCI」）は、衰弱性で生命を脅かす可能性のある広範囲の障害をもたらす。例えば、頸部（首）レベルのSCIは、生命を脅かす呼吸障害を頻繁に引き起こし、この呼吸障害は、大部分は、横隔膜（一次呼吸筋）を制御する横隔膜運動回路の直接的な障害に起因し得る。SCIの他の壊滅的な影響には、対麻痺と四肢麻痺が含まれる。毎年世界中で250,000件を超えるSCIの出来事が発生しているため、罹患した個人の生存、機能、および生活の質を改善できる治療法を開発することが急務となっている。
細胞療法は、探索されている最も有望な治療戦略の一部であり、SCIからの機能的回復を達成することが最終的な目標である。いくつかの研究では、損傷した脊髄に神経前駆細胞（「NPC」）を移植することの安全性と有効性が調査されている。NPCは、増殖能力を保持する、移植可能な、系統が限定された（神経およびグリア）前駆体の広範囲に調査された供給源を表す。しかしながら、これまでに、NPCを使用して脊髄損傷を治療する前臨床試験では、さまざまな結果が得られている（1）。血管新生は、組織修復の必須要素であると考えられている。しかしながら、SCIの文脈で血管新生/脈管形成を強化するために、驚くほど殆ど努力がなされていない。いくつかの研究では、ウイルスのベクターを使用して血管成長因子（VEGFやFGFなど）を供給することを検討しており、一部の修復の可能性に関連しているものの（34）、これらのアプローチの重要な限界は、非生物学的であるため、栄養因子送達の用量や時間経過は制御できないままであることである。最近の研究では、ナイーブ内皮細胞（EC）を含む分解性ポリマーインプラントを脊髄病変の部位にNPCとともに移植すると、ラット脊髄病変の部位で安定した機能的な血管の形成を促進できることが報告されている（Rauchら、2009）。しかしながら、ニューロフィラメント陽性細胞の発芽が見られたものの、病変にまたがるニューロンおよび/または軸索の成長/伸長の証拠は報告されておらず、神経機能の回復は報告されていなかった（Rauchら、2009）。現在の細胞治療努力の成功の欠如を考えると、機能的な脊髄修復を達成することができる強力で効果的な細胞治療が当技術分野で依然として必要とされている。本発明は、この必要性に取り組む。
本発明は、一部には、この特許明細書の実施例のセクションでより詳細に説明されているいくつかの驚くべき発見に由来している。特に、脊髄病変の部位にアデノウイルスE4ORF1配列（「E4ORF1+ECs」）を発現する操作された内皮細胞と一緒に神経細胞を移植すると、脊髄病変での軸索の成長/伸長、および重要なことに、SCI関連の機能障害（横隔膜機能および呼吸の障害）からの回復を特徴とする、劇的で予期しないレベルの神経修復が起こることが見出された。これらの知見、およびこの特許明細書の実施例のセクションに記載されている他の知見に基づいて、本発明は、脊髄損傷の修復に使用するための様々な新規かつ改善された組成物および方法を提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における脊髄損傷（SCI）を治療する方法を提供し、この方法は、以下を含む：（a）E4ORF1+内皮細胞（EC）、および（b）神経細胞を、例えば、SCIの部位での局所投与によりSCIを有する対象に投与し、それにより対象におけるSCIを治療する。同様に、他の実施形態では、本発明は、（a）E4ORF1+内皮細胞（EC）、および（b）神経細胞を含む組成物を提供する。そのような組成物は、それを必要とする対象におけるSCIの治療に有用であり得る。
本明細書に記載される方法および組成物の1つの重要な特徴は、意味のある解剖学的および機能的な神経修復を生成するそれらの能力である。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、神経修復を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変でのニューロンおよび／または軸索の成長および／または伸長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変での運動ニューロンおよび／または軸索の成長および／または伸長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変での感覚ニューロンおよび／または軸索の成長および／または伸長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変でのセロトニン作動性ニューロンおよび／または軸索の成長および／または伸長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変での横隔膜ニューロンおよび／または軸索の成長および／または伸長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、ニューロンおよび/または軸索の成長および／または伸長を含み、その際、ニューロンおよび/または軸索は、対象の中枢神経系にシナプス的に統合されるようになる。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変にわたる電気信号の伝達の増加を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変の結果として損なわれまたは失われた運動機能の改善を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、脊髄病変の結果として損なわれまたは失われた感覚機能の改善を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して達成される「治療」は、横隔膜機能および／または呼吸の改善を含む。
そのような方法および組成物のそれぞれにおいて、様々な異なるタイプのECを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ECは血管ECである。いくつかの実施形態ではECは初代ECであるが、他の実施形態ではECは、EC細胞株からの培養されたEC細胞である。いくつかの実施形態では、ECは哺乳動物ECである。いくつかの実施形態では、ECは霊長類ECである。いくつかの実施形態では、ECはヒトECである。いくつかの実施形態では、ECは、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコまたはイヌECなどの他の哺乳動物ECである。いくつかの実施形態では、ECは臍帯静脈EC（UVEC）である。いくつかの実施形態では、ECはヒト臍帯静脈EC（HUVEC）である。いくつかの実施形態では、ECは中枢神経系ECである。いくつかの実施形態では、ECは脳ECである。いくつかの実施形態では、ECは脊髄ECである。いくつかの実施形態では、ECは嗅球ECである。いくつかの実施形態では、ECは末梢神経系ECである。いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与されることになっている対象に関して同種である。いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与されることになっている対象に関して自家である。いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与されることになっている対象と同じMHC/HLAタイプを有する。いくつかの実施形態では、ECは有糸分裂的に不活性である。いくつかの実施形態では、ECは分化したECである。いくつかの実施形態では、ECは成人ECである。いくつかの実施形態では、ECは人工多能性幹細胞（iPSC）から分化される。いくつかの実施形態では、ECは、皮膚、線維芽細胞、肝細胞、リンパ芽球、星状細胞、末梢血単核細胞を含むがこれらに限定されない細胞から誘導されたiPSCから分化される。いくつかの実施形態では、ECは、分化した非内皮細胞型からの分化転換により産生される。いくつかの実施形態では、ECは以前に3Dマトリックスで培養されている。いくつかの実施形態では、ECは以前に3Dマトリックスで培養されていない。
同様に、そのような方法および組成物のそれぞれにおいて、様々な異なるタイプの神経細胞を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、神経細胞は初代神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、神経細胞株または初代供給源から培養される。いくつかの実施形態では、神経細胞は哺乳動物神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は霊長類神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はヒト神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコまたはイヌの神経細胞などの他の哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はニューロン（neuronal cells）である。いくつかの実施形態では、神経細胞はグリア細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は神経幹細胞（NSC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、脊髄に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、嗅球に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、脊髄または嗅球に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、発達中の脊髄に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、発達中の嗅球に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、発達中の脊髄または発達中の嗅球に由来する神経前駆細胞（NPC）である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、系統限定神経前駆細胞またはグリア前駆細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植/投与されることになっている対象に関して同種である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植／投与されることになっている対象に関して自家である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植／投与されることになっている対象と同じMHC/HLAタイプを有する。いくつかの実施形態では、神経細胞は有糸分裂的に不活性である。いくつかの実施形態では、神経細胞は分化した神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は成人神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）から分化される。いくつかの実施形態では、神経細胞は、皮膚、線維芽細胞、肝細胞、リンパ芽球、星状細胞、末梢血単核細胞を含むがこれらに限定されない細胞から誘導されたiPSCから分化される。いくつかの実施形態では、神経細胞は、分化した非神経細胞型からの分化転換により産生される。いくつかの実施形態では、神経細胞は以前に3Dマトリックスで培養されている。いくつかの実施形態では、神経細胞は以前に3Dマトリックスで培養されていない。
本発明の方法および組成物で治療することができる対象には、脊髄損傷（SCI）を有するあらゆる対象が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は霊長類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコまたはイヌである。
本発明の方法および組成物のそれぞれは、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドを含む内皮細胞、すなわち「E4ORF1+EC」を含む。このようないくつかの実施形態では、E4ORF1+ECは、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、該核酸分子はベクター中に存在する。いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、マロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）ベクターである。いくつかの実施形態では、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする該核酸は、ECのゲノムDNAに組み込まれている。
本発明の治療方法の実施に際し、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、脊髄損傷の部位への細胞または薬剤の局所送達のための当技術分野で公知の任意の適切な手段を使用して投与することができる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、局所注射によって投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、局所注入によって投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、局所外科的移植方法によって投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、生体適合性マトリックス材料（例えば、固体3Dインプラントまたは液体マトリックスなどの生体適合性および／または生分解性マトリックス）で投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、生体適合性マトリックス材料で投与されない。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、固体3D生体適合性マトリックスで投与されない。同様に、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、当技術分野で知られている任意の適切な担体組成物で投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、生理食塩水を含む組成物で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、生体適合性マトリックス材料（例えば、投与プロセス中に液体のままであるもの、または投与プロセス中に固体3Dインプラントであるもの）で投与されてよい。E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、一緒にまたは別々に投与できる。E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、同時にまたは異なる時間に投与することもできる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は対象に1回だけ投与されるが、他の実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は対象に複数回投与されてよい。投与される神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率は変えることができる。いくつかの実施形態では、神経細胞に対するE4ORF1+ECの1:1の比率が使用される。しかしながら、神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率は、約1:10、または約1:9、または約1:8、または約1:7、または約1:6、または約1:5、または約1:4、または約1:3、または約1:2、または約2:1、または約3:1、または約4:1、または約5:1、または約6:1、または約7:1、または約8:1、または約9:1、または約10:1も使用できる。同様に、投与されるE4ORF1+ECおよび神経細胞の数も変えることができる。投与されるE4ORF1+ECの数は、本明細書で定義される「有効量」であるべきである。同様に、投与される神経細胞の数は、本明細書で定義される「有効量」であるべきである。いくつかの実施形態では、投与される細胞の総数は、約500,000細胞～約10,000,000（1000万）細胞の範囲である。細胞がげっ歯類などの小動物に投与されるようないくつかの実施形態では、投与される細胞の総数は、約500,000細胞～約2,000,000（200万）細胞の範囲である。細胞が霊長類（ヒトを含む）などのより大きな動物に投与されるようないくつかの実施形態では、投与される細胞の総数は、約5,000,000（500万）細胞～約10,000,000（1000万）細胞の範囲である。E4ORF1+ECおよび神経細胞が投与された後、さまざまな異なる方法を使用して、治療の進行状況をさまざまな時点でモニターできる（例えば、即時評価から始めて、最初の週は毎日、その後は無期限に週2回、または事前に設定された実験時点の完了まで）。このような方法の例としては、これらに限られないが、解剖学的修復を視覚化できる方法（例えば、医療用画像技術、または必要に応じて組織学的評価を用いる）、および機能改善を観察できる方法（例えば、SCIの影響を受ける1つまたはそれ以上の感覚または運動機能測定による）などがありる。
本発明の治療方法を実施する際、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞の対象への投与のタイミングは、損傷の発生後の任意の適切な時間であり得る。ヒト対象の場合、医師は通常、投与のタイミングについて決定を下すであろう。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の急性期内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の亜急性期内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の中間期内で対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の慢性期内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約1週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約2週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約3週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約4週間以内に対象に投与される。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、この特許開示の他のセクションでさらに説明される。さらに、当業者には明らかなように、本明細書に記載されている様々な実施形態の特定の修正および組み合わせは、本発明の範囲内にある。
この特許開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」、および「請求の範囲」のセクションは、本発明の主要な実施形態を記載している。この「詳細な説明」のセクションは、本発明の組成物および方法に関する特定の追加の記載を提供し、この特許開示の他のすべてのセクションと併せて読まれることが意図されている。さらに、当業者には明らかであるように、この特許開示全体を通して記載される異なる実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、また、組み合わせることが意図されている。本明細書に記載される特定の実施形態のそのような組み合わせは、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
定義および略語：
特定の定義および略語を以下に示す。その他は、この特許開示の他の場所で定義される。さらに、他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語および略語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、The Dictionary of Cell and Molecular Biology（第5版、J.M. Lackie編、2013)、the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology（第2版、R. Cammackら編、2008)、およびThe Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology（第2版、P-S. Juo, 2002)は、本明細書で使用されているいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供する。
特定の定義および略語を以下に示す。その他は、この特許開示の他の場所で定義される。さらに、他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語および略語は、本発明が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、The Dictionary of Cell and Molecular Biology（第5版、J.M. Lackie編、2013)、the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology（第2版、R. Cammackら編、2008)、およびThe Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology（第2版、P-S. Juo, 2002)は、本明細書で使用されているいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「an」）という用語、ならびに「1またはそれ以上の」および「少なくとも1の」という用語は、互換的に使用することができる。
さらに、「および／または」は、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの、他方の有無にかかわらず、特定の開示として解釈されるべきである。したがって、「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、およびＢ（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）を含むことが意図されている。
単位、接頭辞、および記号は、ＳｙｓｔｅｍｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含み、本明細書で提供される任意の個々の値は、本明細書で提供される他の個々の値を含む範囲の終点として機能することができる。例えば、1、2、3、8、9、および10などの値のセットも、1～10の範囲の数値の開示である。
実施形態が「含む」という言葉で記載されている場合は常に、「からなる」および／または「本質的にからなる」に関して記載されている他の類似の実施形態が含まれる。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、数値に関して使用される場合、述べられた値の±10％以内を意味する。
本明細書で使用する場合、「同種」という用語は、同じ種に由来する、同じ種の起源である、または同じ種の成員であることを意味し、成員は遺伝的に関連しているか、または遺伝的に無関係であるが遺伝的に類似している。「同種移植」は、ドナー対象からレシピエント対象への細胞の移入を指し、その際、レシピエント対象はドナー対象と同じ種である。一部の同種移植方法では、ドナー対象とレシピエント対象は同じMHC/HLAタイプを持っている、すなわち、ドナー対象とレシピエント対象はMHC適合またはHLA適合である。一部の同種移植の実施形態では、細胞は、（a）第1／ドナー対象から得、（b）任意選択でエキソビボにて維持および／または培養および／または拡張および／または改変され、ついで（c）その後に第1/ドナー対象と同じ種の第2／レシピエント対象に移植される。例えば、一部の同種移植の実施形態では、内皮細胞は第1/ドナー対象から得、エクスビボで遺伝子改変してE4ORF1+とし、ついで第1/ドナー対象と同じ種の第2/レシピエント対象に移植される。
本明細書で使用する場合、「自家」という用語は、同じ対象に由来する、または同じ対象の起源であることを意味する。「自家移植」とは、対象自身の細胞を対象に投与することを指する、すなわち、自家移植の場合、移植された細胞の「ドナー」と「レシピエント」は同じ個体である。一部の自家移植の実施形態では、細胞は、（a）対象から得、（b）任意選択でエクスビボにて維持および／または培養および／または拡張および／または改変され、ついで（c）続いて同じ対象に移植して戻される。例えば、いくつかの自家移植の実施形態において、内皮細胞は対象から得、エクスビボで遺伝子改変してE4ORF1+とし、ついで同じ対象に移植して戻される。
本明細書で使用される場合、略語「EC」は、内皮細胞を指す。
本明細書で使用される場合、略語「E4ORF1」は、アデノウイルスゲノムの初期4領域のオープンリーディングフレーム1を指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、本明細書に記載するように、本明細書に記載の所定の目的を達成するのに十分な、特定の薬剤または細胞集団（例えば、E4ORF1ポリペプチド、E4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子、またはE4ORF1+操作された内皮細胞の集団または神経細胞の集団）の量を指す。例えば、内皮細胞におけるE4ORF1の発現の場合、（例えばベクター中で）内皮細胞に導入/送達される核酸分子の有効量は、内皮細胞においてE4ORF1タンパク質の検出可能な発現をもたらすものであってよい。E4ORF1+内皮細胞および/または神経細胞を対象に投与することを含む方法の場合、そのような細胞または細胞の組み合わせの有効量は、SCI病変を介したまたはその周りの軸索の成長、および1またはそれ以上の感覚または運動系における感覚または運動機能の回復を含むがこれらに限られない、SCI修復の1またはそれ以上の指標の検出可能な程度または検出可能な改善をもたらすものであり得る。個々の場合における適切な「有効量」は、例えば、用量または細胞数漸増研究などの当技術分野で既知の標準的な技法を使用して経験的に決定でき、計画された使用、計画された送達/投与モード、送達/投与の所望の頻度、1、2、またはそれ以上の細胞型が送達/投与されるかどうかなどの要因を考慮して決定できる。さらに、「有効量」は、この特許開示の実施例のセクションに記載されているようなアッセイを使用して決定し、SCI修復への影響を評価することができる。そのようなアッセイは、SCI修復の解剖学的指標の研究に基づくもの、およびSCI修復の機能的指標の研究に基づくものを含むが、これらに限定されない。
本明細書において細胞に関して使用される場合、用語「操作された」は、特定の表現型（例えば、E4ORF1+）をもたらすか、または特定の核酸分子またはポリペプチドを発現するようにヒトにより操作された細胞を指す。「操作された細胞」という用語は、天然に存在する細胞を包含することを意図せず、代わりに、例えば、組換え核酸分子を含む細胞、または他の方法で人工的に（例えば、遺伝子改変により）変更された細胞、例えば、そうでなければ発現しないであろうポリペプチドを発現するように、または非操作内皮細胞で観察されるものより実質的に高いレベルでポリペプチドを発現するように変更された細胞を包含することを意図する。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、天然にあるか人工的に作られたものであるかにかかわらず、自然に存在する状態で関連している少なくとも1つの他の生成物、化合物、組成物または細胞集団から分離された生成物、化合物、組成物または細胞集団（1つの細胞型または複数の特定の細胞型の集団を含む）を指す。
本明細書で使用される場合、略語「NPC」は、神経前駆細胞を指す。本明細書で使用される場合、略語「NSC」は、神経幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、分子生物学および遺伝子工学（分子クローニングなど）の方法を使用してヒト（機械によるものを含む）によって生成され、他の方法では天然に存在しないヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。したがって、組換え核酸分子は、天然に－例えば、生物のゲノムに存在する核酸分子とは区別される。したがって、対応するゲノムDNA配列に見られるような介在するイントロン配列なしで、mRNA配列の相補的DNAすなわち「cDNA」コピーを含む核酸分子は、組換え核酸分子と見なされる。例として、組換えE4ORF1核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されたE4ORF1コード配列および／または該コード配列が天然に存在するアデノウイルスゲノムにおいて通常関連しない他の遺伝子要素を含み得る。
「対象」という用語は、示された場合を除いて、本明細書に記載の組成物または方法を使用して治療される、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタその他の哺乳動物種などの哺乳動物を指す。
細胞集団に関して本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75～80％、より好ましくは少なくとも約85～90％、最も好ましくは少なくとも約95％が、指定されたタイプの（例えば、1つまたはそれ以上の指定された細胞マーカー、形態学的特徴、または機能的特徴の発現によって決定されるような）細胞である集団、または2つまたはそれ以上の異なるタイプの細胞が一緒に使用される実施形態においては指定されたタイプ（複数）の細胞である集団を指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」とは、約50％未満、好ましくは約20～25％未満、より好ましくは約10～15％未満、最も好ましくは約5％未満の指定されたタイプではない細胞を含む細胞の集団を指す。
「治療する（treating）」または「治療（treatment）」または「治療する（to treat）」などの用語は、対象において、特定の状態または障害（SCIなど）の症状を検出可能な程度に治癒、回復、減速、軽減し、症状を改善し、および/または進行の停止および/またはその結果として、解剖学的レベル、機能レベル、またはその両方での損傷（SCIなど）の検出可能な改善となる手段をいう。特定の実施形態において、対象が、例えば、全体的または部分的に、および／または永続的または一時的に、（SCIなどの）傷害または傷害の症状の軽減または排除を示す場合、対象は、本明細書に提供される方法に従って首尾よく「治療」される。したがって、本発明の方法を使用した「治療」の成功には、脊髄病変の周囲または全体にわたる軸索突起の増加、および／または脊髄病変にわたる電気信号の伝達の増加、および/または脊髄病変の結果として以前に損なわれまたは失われた機能（運動機能または感覚機能など）の改善（ここで、このような増加または改善は、部分的、全体的、一時的、または永続的である）が含まれるが、これらに限定されない。
E4ORF1核酸分子およびポリペプチド：
本発明は、E4ORF1+ECを含む。E4ORF1+ECは、典型的にはE4ORF1核酸分子によってコードされるアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドを含む内皮細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、E4ORF1ポリペプチドおよび／またはアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
本発明は、E4ORF1+ECを含む。E4ORF1+ECは、典型的にはE4ORF1核酸分子によってコードされるアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドを含む内皮細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、E4ORF1ポリペプチドおよび／またはアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
アデノウイルス初期4（E4）領域には、少なくとも6つのオープンリーディングフレーム（E4ORF）が含まれる。E4領域全体は、以前に内皮細胞の生存を促進することが示されている（Zhangら(2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66を参照）。E4領域全体の中で、内皮細胞におけるこれらの生物学的効果の原因となっているのはE4ORF1配列であることも以前に示されている。米国特許第8,465,732号を参照。Seandelら(2008), “Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene,” PNAS, 105(49):19288-93をも参照。
本発明のE4ORF1ポリペプチドおよび本発明のE4ORF1核酸分子は、本明細書に特定されているかまたは当技術分野で知られているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有していてよく、またはそのようなアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の改変体、誘導体、変異体、または断片であってよいが、EC機能やSCI修復に関連するものを含むがこれらに限定されない、米国特許第8,465,732号に記載されているかまたは本明細書に記載されているE4ORF1の機能特性の1つまたはそれ以上を有するポリペプチドを有するかまたはコードすることを条件とする。
E4ORF1ポリペプチドを含むこれらの実施形態では、使用されるポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス2、3、5、7、9、11、12、14、34、35、46、50、または52型などの任意の適切なアデノウイルス型または株に由来し得る。いくつかの実施形態では、使用されるポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス5型由来である。そのようなアデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野で周知であり、Genbankデータベースなどの周知の公的に入手可能なデータベースで入手可能である。例えば、適切な配列には以下が含まれる：ヒトアデノウイルス9（Genbankアクセッション番号CAI05991）、ヒトアデノウイルス7（Genbankアクセッション番号AAR89977）、ヒトアデノウイルス46（Genbankアクセッション番号AAX70946）、ヒトアデノウイルス52（Genbankアクセッション番号ABK35065）、ヒトアデノウイルス34（Genbank Accession番号AAW33508）、ヒトアデノウイルス14（Genbank Accession番号AAW33146）、ヒトアデノウイルス50（Genbank Accession番号AAW33554）、ヒトアデノウイルス2（Genbank Accession番号AP.sub.--000196）、ヒトアデノウイルス12（Genbankアクセッション番号AP.sub.--000141）、ヒトアデノウイルス35（Genbankアクセッション番号AP.sub.--000607）、ヒトアデノウイルス7（Genbankアクセッション番号AP.sub.--000570）、ヒトアデノウイルス1（Genbank Accession番号AP.sub.--000533）、ヒトアデノウイルス11（Genbank Accession番号AP,sub.--000474）、ヒトアデノウイルス3（Genbank Accession番号ABB17792）、ヒトアデノウイルス5型（Genbankアクセッション番号D12587）。
いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるE4ORF1ポリペプチドおよび／またはE4ORF1核酸分子は、本明細書で具体的に列挙されるか、または当技術分野で知られている（例えば、 Genbankデータベース）ものと同じアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、使用されるE4ORF1ポリペプチドおよびE4ORF1核酸分子は、そのような配列の改変体、誘導体、変異体、または断片、例えば、そのような配列と85％を超える配列同一性を有する改変体、誘導体、変異体、または断片であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、改変体、誘導体、変異体、または断片は、既知の配列に対して約85％の同一性、または既知の配列に対して約88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、長さが既知のE4ORF1ヌクレオチド配列に対して約50ヌクレオチド、または約45ヌクレオチド、または約40ヌクレオチド、または約35ヌクレオチド、または約30ヌクレオチド、または約28ヌクレオチド、26ヌクレオチド、24ヌクレオチド、22ヌクレオチド、20ヌクレオチド、18ヌクレオチド、16ヌクレオチド、14ヌクレオチド、12ヌクレオチド、10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、または1ヌクレオチド異なる、既知のE4ORF1ヌクレオチド配列の改変体、誘導体、変異体、または断片が使用される。いくつかの実施形態では、長さが既知のE4ORF1アミノ酸配列に対して約50アミノ酸、または約45アミノ酸、または約40アミノ酸、または約35アミノ酸、または約30アミノ酸、または約28アミノ酸、26アミノ酸、24アミノ酸、22アミノ酸、20アミノ酸、18アミノ酸、16アミノ酸、14アミノ酸、12アミノ酸、10アミノ酸、9アミノ酸、8アミノ酸、7アミノ酸、6アミノ酸、5アミノ酸、4アミノ酸、3アミノ酸、2アミノ酸、または1アミノ酸異なる、既知のE4ORF1アミノ配列の改変体、誘導体、変異体、または断片が使用される。
E4ORF1をコードする核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、E4ORF1をコードする核酸分子は、細胞内で安定であり、タンパク質発現／産生を細胞内で直接指示するために使用できる合成修飾RNAなどのRNAを含むことができる。他の実施形態では、E4ORF1をコードする核酸分子は、DNAを含み得る。
いくつかの実施形態では、E4ORF1配列は、アデノウイルスE4領域からの他の配列なしで使用され、例えば、E4領域全体のヌクレオチド配列との関連ではなく、またはE4領域によってコードされる他のポリペプチドと一緒ではなく使用される。しかしながら、いくつかの他の実施形態では、E4ORF1配列は、E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5またはE4ORF6配列、またはそれらの改変体、変異体または断片などのアデノウイルスE4領域からの1つまたはそれ以上の他の核酸またはアミノ酸配列と組み合わせて使用され得る。例えば、E4ORF1配列は、他の配列、遺伝子、またはコード領域（プロモーター、マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子など）を含む構築物（ウイルスベクターなど）で使用できるが、特定の実施形態では、E4ORF1配列は、アデノウイルスE4領域全体を含まない、またはE4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、E4ORF5、および/またはE4ORF6などのアデノウイルスE4領域からの他のORFを含まない構築物で使用される。
E4ORF1をコードする核酸配列は、通常ベクターで提供される。同様に、E4ORF1+ECは通常、ベクター、すなわちE4ORF1をコードする核酸配列を含むベクターを含む。「ベクター」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、例えば、（E4ORF1をコードする核酸分子などの）核酸分子の内皮細胞などの細胞への導入に使用できるツールを含む。本明細書で使用される「ベクター」という用語には、細胞内で核酸分子を維持する働きをするベクター、細胞内で複製できるベクター、細胞内で複製できないベクター、細胞のゲノムに組み込むことができるベクター（組み込みベクター）、細胞のゲノムに組み込まれないベクター（非組み込みベクター）、およびベクター内の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするベクター（すなわち、発現ベクター）を含む。本明細書で使用される「ベクター」という用語はまた、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を含む。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターの例には、レンチウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEVまたはビスナレンチウイルス）、マウス白血病ウイルス（MLV）、ヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV）、マウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、藤波肉腫ウイルス（FuSV）、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLVまたはMoMLV）、FBRマウス骨肉腫ウイルス（FBR MSV）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Mo-MSV）、アベルソンマウス白血病ウイルス（A-MLV）、トリ骨髄球腫ウイルス29（MC29）またはトリ赤芽球症ウイルス（AEV）に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。さらに、レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら(1997)(“Retroviruses”, Cold Spring Harbour Laboratory Press編:JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp758-763)に記載があり、レトロウイルスベクターはそのような他のレトロウイルスに由来し得る。ほとんどのレトロウイルスと異なり、レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る（Lewisら(1992)EMBO J 11(8):3053-3058およびLewisおよびEmerman(1994)J Virol 68 (1):510-516）。これは、分裂/有糸分裂細胞に感染する他のほとんどのレトロウイルスとは対照的である。
本発明によれば、E4ORF1をコードする核酸配列は、上記のものからの任意の適切なベクターなどの任意の適切なベクターで提供されてよい。同様に、本発明によれば、E4ORF1+ECは、そのような適切なベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターまたはMMLVベクターなどのレトロウイルスベクターが使用される。しかしながら、当業者は他の適切なベクターを選択することができるであろう。典型的には、ベクターは、内皮細胞のトランスフェクション/形質導入に適しており、内皮細胞におけるE4ORF1の発現に適した発現ベクターであろう。そのような発現ベクターにおいて、E4ORF1をコードする核酸配列は、発現を可能にするために1つまたはそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される。所望の内皮細胞型におけるE4ORF1核酸配列の発現を駆動するのに適した任意のプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例には、CMV、SV40、RSV、HIV-Ltr、およびMMLプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、アデノウイルスゲノム由来のプロモーター、またはその改変体であり得る。例えば、プロモーターは、アデノウイルスゲノムにおけるE4ORF1発現を駆動するプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、誘導性／調節可能プロモーターを使用することができ、その結果、発現を必要に応じてオンまたはオフにすることができる。例えば、テトラサイクリン誘導性発現系、またはホルモン誘導性発現系など、任意の適切な誘導性または調節可能な発現系を使用することができる。E4ORF1をコードする核酸配列を含むことに加えて、使用されるベクターは、目的の用途に応じて、他のさまざまな核酸配列、遺伝子、またはコード領域、例えば、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子または発現タグ（例えば、GFPをコードするヌクレオチド配列）、または望ましい任意の他のヌクレオチド配列もしくは遺伝子も含んでいてよい。E4ORF1ポリペプチドは、単独で、または融合タンパク質の一部として発現させることができる。
E4ORF1をコードする核酸分子、およびそのような核酸分子を含むベクターは、トランスフェクション技術およびウイルス媒介形質導入技術を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の適切なシステムを使用して内皮細胞に導入できる。本発明に従って使用することができるトランスフェクション法には、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子衝撃が含まれるが、これらに限定されない。使用可能なウイルス媒介形質導入法には、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入、ワクシニアウイルス媒介形質導入、およびヘルペスウイルス媒介形質導入が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、E4ORF1ペプチド模倣物を使用することができる。ペプチド模倣物は、ポリペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様の鎖である。そのような分子は、E4ORF1ポリペプチドを模倣するように設計され得る。ペプチド模倣物を作製するためにペプチドを修飾する、または他の仕方でペプチド模倣物を設計する様々な異なる方法が当技術分野で知られており、本発明の方法で使用するE4ORF1ペプチド模倣物を作製するために使用できる。
E4ORF1ポリペプチドおよび／またはE4ORF1核酸分子の取り扱い、操作、および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来の技術を使用して行われ得る。そのような技術は当技術分野でよく知られている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis編、“Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989)；the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)、またはヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列の取り扱い、操作、および発現に使用する適切な技術のガイダンスとしてのその他の標準テキストの教示を参照することができる。E4ORF1のアミノ酸およびヌクレオチド配列の取り扱いまたは発現に関連するさらなる側面は、米国特許第8,465,732号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
内皮細胞：
本発明は、E4ORF1+EC、E4ORF1+ECを含む組成物、ならびにそのようなE4ORF1+ECおよび組成物の使用方法を含む。
本発明は、E4ORF1+EC、E4ORF1+ECを含む組成物、ならびにそのようなE4ORF1+ECおよび組成物の使用方法を含む。
ECは、当技術分野で公知の任意のタイプの内皮細胞であり得るか、またはそれに由来し得る。典型的には、ECは血管内皮細胞である。いくつかの実施形態では、ECは初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、ECは、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞などの哺乳動物EC、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、または他の哺乳動物ECである。いくつかの実施形態では、ECは初代ヒト内皮細胞である。ECはさまざまな異なる組織から取得できる。いくつかの実施形態では、ECは、ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）などの臍帯静脈EC（UVEC）である。いくつかの実施形態では、ECは神経系ECである。いくつかの実施形態では、ECは脳ECである。いくつかの実施形態では、ECは脊髄ECである。いくつかの実施形態では、ECは嗅球ECである。使用することができる他の適切なECには、米国特許第8,465,732号においてE4ORF1発現に適切であるとして以前に記載されたものが含まれ、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与される対象に関して自家である。いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与される対象に関して同種である。いくつかの実施形態では、ECは、それらが移植/投与される対象と同じMHC/HLAタイプを有する。
本発明のE4ORF1+ECは、様々な形態で存在してよく、または提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、ECは、ECの単離した集団などのECの集団を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、ECは、インビトロの細胞の集団を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、ECは、実質的に純粋な細胞集団を含んでいてよい。例えば、いくつかの実施形態では、全細胞集団を構成する細胞の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75～80％、より好ましくは少なくとも約85～90％、および最も好ましくは少なくとも約95％がE4ORF1+ECであろう。
いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECは、E4ORF1+ECおよび1つまたはそれ以上の追加の細胞型を含む組成物（例えば、治療用組成物）で提供されてよい。いくつかの実施形態では、そのような追加の細胞型は、NPCおよび／またはグリア細胞などの神経細胞型である。
いくつかの実施形態では、ECは、複製することができないように使用（例えば治療的使用）の前に有糸分裂的に不活性化される。これは、例えば、マイトマイシンCなどの化学物質を使用することによって、または操作された内皮細胞を照射することによって達成することができる。
ECを培養で維持する方法は当技術分野で知られており、任意の適切な細胞培養方法を使用することができる。例えば、E4ORF1+ECは、他の内皮細胞を培養で維持するのに役立つことが知られている方法、または特に米国特許第8,465,732号に記載されているように（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）E4ORF1+ECを培養するのに役立つことが知られている方法を使用して、培養で維持できる。いくつかの実施形態において、E4ORF1+ECは、血清の非存在下、または外因性成長因子の非存在下、または血清および外因性成長因子の両方の非存在下、または外因性血管新生因子の非存在下にて培養で維持される。E4ORF1+ECはまた凍結保存できる。例えば、R. Ian Freshney によるCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、第4版(2000)("Freshney")（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）などの、細胞培養および細胞凍結保存のための様々な方法が当業者に知られている。
神経細胞：
いくつかの実施形態では、本発明は、神経細胞、神経細胞を含む組成物、ならびにそのような神経細胞および組成物の使用方法を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、神経細胞、神経細胞を含む組成物、ならびにそのような神経細胞および組成物の使用方法を含む。
本明細書で使用される場合、「神経細胞」という用語は、ニューロンおよびグリア細胞を包含し、神経幹細胞（「NSC」）および神経前駆細胞（「NPC」）をも包含する。「神経幹細胞」および「神経前駆細胞」という用語は、当技術分野で認められている意味に従って使用される。幹細胞と前駆細胞の発生能は異なるが（幹細胞は一般に少なくとも多能性（pluripotent）であるが、前駆細胞は一般に発生能がさらに限られており、すなわち、せいぜい複能性（multipotent）であるにすぎない）、NSCおよびNPCはともにニューロンおよびグリア細胞の両者を生成する能力を有する。本発明のいくつかの実施形態は、ニューロン前駆細胞であるNPCおよび／またはグリア前駆細胞であるNPCを含む。ニューロン前駆細胞およびグリア前駆細胞は神経前駆細胞よりも能力が限られており、ニューロン前駆細胞はニューロン細胞を産生する能力を有し、グリア前駆細胞はグリア細胞を産生する能力を有する。
神経細胞を含む本発明の実施形態では、神経細胞は、中枢および末梢ニューロンを含む任意のタイプの神経細胞であり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、特にセロトニン作動性ニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は初代神経細胞であるか、または初代神経細胞に由来する。他の実施形態では、神経細胞は、幹細胞、前駆細胞、または非神経細胞に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、神経細胞は、神経幹細胞、または神経前駆細胞、またはニューロン前駆細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞に由来し得る。同様に、いくつかの実施形態では、神経細胞は、分化した非神経細胞などの他の分化した細胞からの分化転換によって誘導されてもよい。
グリア細胞を含む本発明の実施形態では、グリア細胞は、例えば、星状細胞、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、放射状グリア、シュワン細胞、衛星細胞、腸グリア細胞、またはミクログリア細胞であり得る。いくつかの実施形態では、グリア細胞は初代グリア細胞であるか、またはそれに由来する。他の実施形態では、グリア細胞は、幹細胞、前駆細胞、または非グリア細胞に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、グリア細胞は、神経幹細胞、または神経前駆細胞、またはグリア前駆細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞に由来し得る。同様に、いくつかの実施形態では、グリア細胞は、分化した非グリア細胞などの他の分化した細胞からの分化転換によって誘導されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、神経細胞を含む組成物、ならびにそのような神経細胞および組成物の使用方法を含む。神経細胞は、当技術分野で知られている任意のタイプの神経細胞であり得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は初代神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、または他の哺乳動物の神経細胞などの哺乳動物の神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は初代ヒト神経細胞である。神経細胞はさまざまな異なる組織から得ることができる。いくつかの実施形態では、神経細胞は脳神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は脊髄神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、嗅球神経細胞である。
いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植／投与される対象に関して自家である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植／投与される対象に関して同種である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、それらが移植／投与される対象と同じMHC/HLAタイプを有する。
本発明の組成物および方法において使用される神経細胞は、様々な形態で存在してよく、または提供されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、神経細胞は、神経細胞の単離した集団などの神経細胞の集団を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、インビトロの細胞の集団を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、実質的に純粋な細胞の集団を含んでいてよい。例えば、いくつかの実施形態では、全細胞集団を構成する細胞の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75～80％、より好ましくは少なくとも約85～90％、および最も好ましくは少なくとも約95％が神経細胞であろう。
いくつかの実施形態では、神経細胞は、神経細胞および1つまたはそれ以上の追加の細胞型を含む組成物（例えば、治療用組成物）で提供されてよい。いくつかの実施形態では、そのような追加の細胞型は、E4ORF1+ECなどのECである。
いくつかの実施形態では、神経細胞が有糸分裂的に活性である場合（NSCおよびNPCなど）、それらは複製することができないように使用（例えば治療的使用）の前に有糸分裂的に不活性化される。これは、例えば、マイトマイシンCなどの化学物質を使用することによって、神経細胞を照射することによって、または塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）などのマイトジェンを追加せずに細胞を長期培養条件にさらすことによって達成することができる。
神経細胞を培養で維持する方法は当技術分野で知られており、本発明に従って任意の適切なそのような方法を使用することができる。同様に、神経細胞を凍結保存する方法は当技術分野で知られており、本発明に従って使用することができる。例えば、Bonner J.F., Haas C.J., Fischer I.(2013)“Preparation of Neural Stem Cells and Progenitors: Neuronal Production and Grafting Applications.” In:Amini S., White M.(編)Neuronal Cell Culture. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), Vol1078. Humana Press, Totowa, NJ.を参照。
内皮細胞および/または神経細胞を含む組成物：
いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、特定の細胞および1つまたはそれ以上のさらなる成分および／またはさらなる細胞型を含む組成物の形態で提供され得る。例えば、いくつかの実施形態では、列挙された細胞を担体溶液中に一緒に含む組成物が使用される。そのような担体溶液は、例えば、生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地などからなるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、列挙された細胞を生体適合性マトリックス材料とともに含む組成物が使用されてよい。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、体温（すなわち、約37℃）で固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、体温（すなわち、約37℃）で液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、氷上にあるとき、および／または冷蔵されているときに（すなわち、約0℃から約4℃まで）固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、氷上にあるとき、および／または冷蔵されているときに（すなわち、約0℃から約4℃）液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で液体であり、本発明の方法による対象への投与のプロセス中に液体のままであるものである。
いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、特定の細胞および1つまたはそれ以上のさらなる成分および／またはさらなる細胞型を含む組成物の形態で提供され得る。例えば、いくつかの実施形態では、列挙された細胞を担体溶液中に一緒に含む組成物が使用される。そのような担体溶液は、例えば、生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地などからなるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、列挙された細胞を生体適合性マトリックス材料とともに含む組成物が使用されてよい。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、体温（すなわち、約37℃）で固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、体温（すなわち、約37℃）で液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、氷上にあるとき、および／または冷蔵されているときに（すなわち、約0℃から約4℃まで）固体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、氷上にあるとき、および／または冷蔵されているときに（すなわち、約0℃から約4℃）液体であるものである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、室温で液体であり、本発明の方法による対象への投与のプロセス中に液体のままであるものである。
特定の実施形態では、生体適合性マトリックス材料は、脱細胞化動物組織、またはコラーゲン、ラミニン、および／またはフィブリンなどの1つまたはそれ以上の細胞外マトリックス（「ECM」）成分を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のラミニンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のフィブリンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性足場はヒアルロン酸を含まない。いくつかの実施形態では、生体適合性足場は、約5％、4％、3％、2％、1％、または0.5％を超えるヒアルロン酸を含まない。いくつかの実施形態では、生体適合性足場はマトリゲルを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性足場はマトリゲルを含まない。いくつかの実施形態では、生体適合性足場材料は、例えば、その生体力学的特性または任意の他の生物学的特性に基づいて、それが埋め込まれる組織の位置に応じて選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される各組成物（例えば、担体溶液および／または生体適合性マトリックス材料からなるまたはそれらを含むもの）は、「治療用組成物」（組成物の成分がヒト対象などの対象への投与に適していることを意味する）であり得る。必要に応じて、他の治療上許容される薬剤を含めることができる。当業者は、意図される用途に応じて、治療用組成物に含まれるべき適切な薬剤を容易に選択することができる。
いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、同じ組成物中で一緒に、すなわち、細胞型の混合物として提供されてよい。そのような実施形態のいくつかでは、神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率は、約1:10、または約1：9、または約1：8、または約1：7、または約1：6、または約1：5、または約1：4、または約1：3、または約1：2、または約1：1、または約2：1、または約3：1、または約4：1、または約5：1、または約6：1、または約7：1、または約8：1、または約9：1、または約10：1であってよい。
治療方法：
いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてSCIを治療する方法を提供する。そのような方法は、E4ORF1+ECおよび神経細胞を対象のSCIの部位に移植/投与することを含む。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は同時に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、異なる時に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、両方の細胞型を含む組成物で一緒に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、2つの別個の組成物（一方はE4ORF1+ECを含み、他方は神経細胞を含む）で別々に投与される。
いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてSCIを治療する方法を提供する。そのような方法は、E4ORF1+ECおよび神経細胞を対象のSCIの部位に移植/投与することを含む。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は同時に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、異なる時に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、両方の細胞型を含む組成物で一緒に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび神経細胞は、2つの別個の組成物（一方はE4ORF1+ECを含み、他方は神経細胞を含む）で別々に投与される。
いくつかの実施形態では、対象に移植/投与される神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率は、約1:10、または約1：9、または約1：8、または約1：7、または約1：6、または約1：5、または約1：4、または約1：3、または約1：2、または約1：1、または約2：1、または約3：1、または約4：1、または約5：1、または約6：1、または約7：1、または約8：1、または約9：1、または約10：1であってよい。
いくつかの実施形態では、対象に移植/投与されるE4ORF1+ECの数は、約100,000細胞、または約250,000細胞、または約500,000細胞、または約1,000,000細胞、または約1,500,000細胞、または約2,000,000細胞、または約3,000,000細胞、または約4,000,000細胞、または約5,000,000細胞、または約6,000,000細胞、または約7,000,000細胞、または約8,000,000細胞、または約9,000,000細胞、または約10,000,000細胞である。
いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、注射、注入、外科的移植、または細胞の送達の他の適切な形態によってSCIの部位に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、細胞を含む液体組成物の注射または注入によってSCIの部位に投与される。同様に、他の実施形態では、E4ORF1+ECおよび／または神経細胞は、固体マトリックス中の細胞の外科的移植によってSCIの部位に投与される。細胞を脊髄または脊髄病変に投与するための当技術分野で既知の任意の適切な技術を使用することができる。細胞をSCIの部位に移植/投与するために使用される技術の正確な詳細は、対象の種、対象の年齢、SCIの場所を含むがこれらに限定されない特定の状況を考慮して決定することができる。典型的には、SCIの部位に細胞を移植/投与するために使用される技術の詳細は、移植/投与手順を行う外科医または他の開業医などの医師によって、および/または科学諮問委員会からのアドバイスをもとに決定されるであろう。
E4ORF1+ECおよび/または神経細胞の対象への投与のタイミングは、損傷の発生後の任意の適切な時間であり得る。ヒトの被験者の場合、医師は通常、投与のタイミングについて決定を下すであろう。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の急性期内に対象に投与される。ヒトの被験者の場合、急性期は通常、SCI損傷の発生後、約0～2日以内であると見なされる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後、亜急性期内に対象に投与される。ヒトの被験者の場合、亜急性期は通常、SCI損傷の発生後約3～14日以内であると見なされる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の中間期内で対象に投与される。ヒトの被験者の場合、中間期は通常、SCI損傷の発生後、約2週間から6か月以内であると見なされる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生後の慢性期内に対象に投与される。ヒトの被験者の場合、中間期は通常、SCI損傷の発生後6か月以上であると見なされる。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約1週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約2週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約3週間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞は、SCI損傷の発生から約4週間以内に対象に投与される。
モデル系：
治療用途に有用であることに加えて、本発明の移植方法は、他の様々な状況、例えば、薬物スクリーニング法を含む、SCIおよびSCIの可能な治療の研究に有用なモデル系の作成においても有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の治療方法を実施し、ついで1つまたはそれ以上の候補薬剤または候補細胞型のSCIまたはSCI修復に対する効果を試験することを含む、SCIまたはSCI修復に対する1つまたはそれ以上の候補薬剤または候補細胞型の効果を評価する方法を提供する。
治療用途に有用であることに加えて、本発明の移植方法は、他の様々な状況、例えば、薬物スクリーニング法を含む、SCIおよびSCIの可能な治療の研究に有用なモデル系の作成においても有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の治療方法を実施し、ついで1つまたはそれ以上の候補薬剤または候補細胞型のSCIまたはSCI修復に対する効果を試験することを含む、SCIまたはSCI修復に対する1つまたはそれ以上の候補薬剤または候補細胞型の効果を評価する方法を提供する。
キット：
本発明はまた、本明細書に記載される様々な方法を実行するためのキットを提供する。このようなキットは、E4ORF1配列（例えば、ベクター中にて）、内皮細胞、E4ORF1+内皮細胞、神経細胞（ニューロン、グリア、NSC、NPC、ニューロン前駆細胞またはグリア前駆細胞など）、E4ORF1配列またはE4ORF1ポリペプチドの検出のための手段または組成物（例えば、核酸プローブ、抗体など）、E4ORF1+神経細胞または神経細胞を維持または拡大するために有用な培地または組成物、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞を対象に投与するための手段または組成物、使用説明書、容器、培養容器など、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の成分のいずれをも含むことができる。
本発明はまた、本明細書に記載される様々な方法を実行するためのキットを提供する。このようなキットは、E4ORF1配列（例えば、ベクター中にて）、内皮細胞、E4ORF1+内皮細胞、神経細胞（ニューロン、グリア、NSC、NPC、ニューロン前駆細胞またはグリア前駆細胞など）、E4ORF1配列またはE4ORF1ポリペプチドの検出のための手段または組成物（例えば、核酸プローブ、抗体など）、E4ORF1+神経細胞または神経細胞を維持または拡大するために有用な培地または組成物、E4ORF1+ECおよび/または神経細胞を対象に投与するための手段または組成物、使用説明書、容器、培養容器など、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の成分のいずれをも含むことができる。
本発明の特定の局面は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載され得る。
実施例：
実施例１：
材料および方法：
材料および方法の概要：
動物モデル：成体雌Sprague-Dawleyラット。損傷モデル：中頸部（C3-4）側性挫傷。治療：ECのみの注入、またはNPCとの併用。処理時間：損傷1週間後の単回送達。処理量：培地（HBSS）中、100,000細胞/μlでの10マイクロリットルの細胞。投与経路：病変部位への直接注射。送達方法：30ゲージの鋼針を使用した外科用シリンジ（Hamilton）を介した注射。実験の時間経過：損傷の日から7週間。解剖学的結果の測定：神経解剖学的トレーシング＆免疫組織化学（キャビテーション、血管性、および軸索成長への影響を観察）。機能的結果の測定：終末電気生理学（筋肉活動への影響を観察）。行動結果の測定：毎週のプレチスモグラフィー評価（呼吸パターン（呼吸の頻度、一回換気量、分時換気量）への影響を観察）。
実施例１：
材料および方法：
材料および方法の概要：
動物モデル：成体雌Sprague-Dawleyラット。損傷モデル：中頸部（C3-4）側性挫傷。治療：ECのみの注入、またはNPCとの併用。処理時間：損傷1週間後の単回送達。処理量：培地（HBSS）中、100,000細胞/μlでの10マイクロリットルの細胞。投与経路：病変部位への直接注射。送達方法：30ゲージの鋼針を使用した外科用シリンジ（Hamilton）を介した注射。実験の時間経過：損傷の日から7週間。解剖学的結果の測定：神経解剖学的トレーシング＆免疫組織化学（キャビテーション、血管性、および軸索成長への影響を観察）。機能的結果の測定：終末電気生理学（筋肉活動への影響を観察）。行動結果の測定：毎週のプレチスモグラフィー評価（呼吸パターン（呼吸の頻度、一回換気量、分時換気量）への影響を観察）。
材料および方法の詳細：
神経前駆細胞の分離および培養：
これらの研究で使用される詳細な神経前駆細胞（NPC）分離プロトコルは、Bonnerら(2013).(Bonner J.F., Haas C.J., Fischer I. (2013) Preparation of Neural Stem Cells and Progenitors: Neuronal Production and Grafting Applications. In: Amini S., White M.(編)Neuronal Cell Culture. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol1078. Humana Press, Totowa, NJ)に見出すことができる。NPCは、E13.5-14ラット（Fischer 344-Tg UBC-eGFP）脊髄から、またはE12.5-13マウス脊髄から分離される。切開した脊髄組織を機械的および酵素的に（トリプシン、Life Technologies＃25200-056）解離し、培養液で3日間培養した後、凍結培地（ThermoFischer＃12648010）で凍結保護し、必要になるまで液体窒素で保存する。細胞をECと組み合わせる1日前に、3x106または6x106のNPCをポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich、＃P8920）およびラミニン（ThermoFischer、＃23017015）でコーティングしたT75フラスコに播種し、培地で培養することで解凍する。培地の成分は次のとおりである：25mg/mLウシ血清アルブミン、B-27サプリメント（Life Technologies、＃17504-044）、N2サプリメント（Life Technologies、＃17502-048）、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；Peprotech、＃450-10、Rocky Hill、NJ）、および20ng/mLのニューロトロフィン-3（NT-3；Peprotech、＃450-03）を含むDMEM/F12。
神経前駆細胞の分離および培養：
これらの研究で使用される詳細な神経前駆細胞（NPC）分離プロトコルは、Bonnerら(2013).(Bonner J.F., Haas C.J., Fischer I. (2013) Preparation of Neural Stem Cells and Progenitors: Neuronal Production and Grafting Applications. In: Amini S., White M.(編)Neuronal Cell Culture. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol1078. Humana Press, Totowa, NJ)に見出すことができる。NPCは、E13.5-14ラット（Fischer 344-Tg UBC-eGFP）脊髄から、またはE12.5-13マウス脊髄から分離される。切開した脊髄組織を機械的および酵素的に（トリプシン、Life Technologies＃25200-056）解離し、培養液で3日間培養した後、凍結培地（ThermoFischer＃12648010）で凍結保護し、必要になるまで液体窒素で保存する。細胞をECと組み合わせる1日前に、3x106または6x106のNPCをポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich、＃P8920）およびラミニン（ThermoFischer、＃23017015）でコーティングしたT75フラスコに播種し、培地で培養することで解凍する。培地の成分は次のとおりである：25mg/mLウシ血清アルブミン、B-27サプリメント（Life Technologies、＃17504-044）、N2サプリメント（Life Technologies、＃17502-048）、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；Peprotech、＃450-10、Rocky Hill、NJ）、および20ng/mLのニューロトロフィン-3（NT-3；Peprotech、＃450-03）を含むDMEM/F12。
脊髄内皮細胞の分離および培養：
脊髄および嗅球を3～4週齢のSprague Dawleyラットから切開し、すぐに切開緩衝液（1XB27を補充したL15培地、L15：＃11415064、B27：＃17504044、ThermoFischer）に入れる。組織を、機械的および酵素的解離/消化法の組み合わせを使用して解離する。完全に消化した組織を遠心分離機で遠心分離し（x400g、5分）、ペレットをEC培地に再懸濁し、2日間培養する。E4ORF1をコードするレンチウイルス粒子を培地に添加する。新たなEC培地を3日ごとに培養液に添加する。凍結保存前にECを少なくとも80％の集密度に達するまで培養する。
脊髄および嗅球を3～4週齢のSprague Dawleyラットから切開し、すぐに切開緩衝液（1XB27を補充したL15培地、L15：＃11415064、B27：＃17504044、ThermoFischer）に入れる。組織を、機械的および酵素的解離/消化法の組み合わせを使用して解離する。完全に消化した組織を遠心分離機で遠心分離し（x400g、5分）、ペレットをEC培地に再懸濁し、2日間培養する。E4ORF1をコードするレンチウイルス粒子を培地に添加する。新たなEC培地を3日ごとに培養液に添加する。凍結保存前にECを少なくとも80％の集密度に達するまで培養する。
SCIモデル：
中頸部（C3-4）脊髄挫傷損傷は、Infinite Horizon空気圧インパクター（200キロダインのプリセット衝撃力、0秒の滞留時間）を使用して成体雌ラットでモデル化される。この損傷は、横隔膜運動回路を危険にさらし、横隔膜機能を損なうが、これは、終末横隔膜筋電図検査（EMG）を使用して評価される。この損傷はまた、横隔膜運動プール（横隔膜を刺激する）を構成する脊髄運動ニューロンの約50％の喪失を引き起こし、損傷の尾側の横隔膜運動ニューロンを除神経する。この解剖学的欠損は、負傷と同側の筋肉機能の減弱、および増加した呼吸ドライブ（または呼吸不全）に対する反応障害をもたらす。呼吸ドライブの増加は、動物を低酸素ガス（10％吸入O2）または高炭酸ガス（7％吸入CO2）に曝すことによって刺激される。このモデルではいくつかの自発的な機能的可塑性が発生する可能性があるが、起因する回復の程度は限られており、欠損が持続する。図Ａは、このSCIモデルの概略図である。
中頸部（C3-4）脊髄挫傷損傷は、Infinite Horizon空気圧インパクター（200キロダインのプリセット衝撃力、0秒の滞留時間）を使用して成体雌ラットでモデル化される。この損傷は、横隔膜運動回路を危険にさらし、横隔膜機能を損なうが、これは、終末横隔膜筋電図検査（EMG）を使用して評価される。この損傷はまた、横隔膜運動プール（横隔膜を刺激する）を構成する脊髄運動ニューロンの約50％の喪失を引き起こし、損傷の尾側の横隔膜運動ニューロンを除神経する。この解剖学的欠損は、負傷と同側の筋肉機能の減弱、および増加した呼吸ドライブ（または呼吸不全）に対する反応障害をもたらす。呼吸ドライブの増加は、動物を低酸素ガス（10％吸入O2）または高炭酸ガス（7％吸入CO2）に曝すことによって刺激される。このモデルではいくつかの自発的な機能的可塑性が発生する可能性があるが、起因する回復の程度は限られており、欠損が持続する。図Ａは、このSCIモデルの概略図である。
治療：
ドナー細胞を、100万細胞の用量で、損傷後1週間で病変部位（単回投与経路）に直接注入する。この遅延（亜急性）治療時間は、他の細胞療法研究で現在使用されているものに相当する。亜急性的に処置した動物において、脊髄を外科的に損傷後1週間再露出させ、小さな硬膜切開を損傷の上に直接作成させる。Hanks Balanced Salt Solution（HBSS）に懸濁した細胞を、30ゲージのカスタム（30度の角度）針を取り付けたガラス製シリンジ（World Precision Instruments）に吸い上げる。シリンジをマイクロマニピュレーターに入れ、露出した脊髄の上に配置する。針の先端を脊髄内に挿入して、病変の中心（epicenter）に到達させる。送達後、針を抜いて動物を縫合し、術後投薬を行い、綿密な監視下で清潔な環境で回復させる。
ドナー細胞を、100万細胞の用量で、損傷後1週間で病変部位（単回投与経路）に直接注入する。この遅延（亜急性）治療時間は、他の細胞療法研究で現在使用されているものに相当する。亜急性的に処置した動物において、脊髄を外科的に損傷後1週間再露出させ、小さな硬膜切開を損傷の上に直接作成させる。Hanks Balanced Salt Solution（HBSS）に懸濁した細胞を、30ゲージのカスタム（30度の角度）針を取り付けたガラス製シリンジ（World Precision Instruments）に吸い上げる。シリンジをマイクロマニピュレーターに入れ、露出した脊髄の上に配置する。針の先端を脊髄内に挿入して、病変の中心（epicenter）に到達させる。送達後、針を抜いて動物を縫合し、術後投薬を行い、綿密な監視下で清潔な環境で回復させる。
機能的結果の測定：
換気機能（一回換気量、呼吸頻度および分時換気量）を、全身プレチスモグラフィーを使用して、すべての治療グループの動物の損傷前および損傷後毎週評価する。損傷していない動物から収集された換気データは、治療グループとの比較に使用できる。終末横隔膜筋電図検査（EMG）を使用し、治療が横隔膜運動の回復を促進するかどうかを決定する。（テレメータを使用して）覚醒している動物の終末横隔膜ニューログラムまたは毎週の横隔膜筋電図も、プレチスモグラフィー評価中に使用できる。
換気機能（一回換気量、呼吸頻度および分時換気量）を、全身プレチスモグラフィーを使用して、すべての治療グループの動物の損傷前および損傷後毎週評価する。損傷していない動物から収集された換気データは、治療グループとの比較に使用できる。終末横隔膜筋電図検査（EMG）を使用し、治療が横隔膜運動の回復を促進するかどうかを決定する。（テレメータを使用して）覚醒している動物の終末横隔膜ニューログラムまたは毎週の横隔膜筋電図も、プレチスモグラフィー評価中に使用できる。
解剖学的結果の測定：
以前に行われたように14,19,23、レトログラードトレーシング法を使用して横隔膜運動回路をマッピングする。以前に記載されたように14,23、実験終了の3日前（損傷後6.5週間）に、動物は横隔膜を露出させる手術を受け、偽狂犬病ウイルス（PRV）を損傷と同側の半横隔膜に送達する。この解剖学的追跡アプローチは、横隔膜運動ニューロンとシナプス統合された介在ニューロンの数の特徴付けを可能にする。運動ニューロンおよび介在ニューロンの数を定量し、損傷していない動物から以前に得られたデータと比較する。縫線核および網様核内の細胞数を、PRVで追跡された動物から定量する。PRVで標識された損傷の吻側および尾側の介在ニューロンを、その層流分布に従って定量する。標識組織の切片を分析して、標識軸索の密度およびPRV感染ニューロンの数を決定する。
以前に行われたように14,19,23、レトログラードトレーシング法を使用して横隔膜運動回路をマッピングする。以前に記載されたように14,23、実験終了の3日前（損傷後6.5週間）に、動物は横隔膜を露出させる手術を受け、偽狂犬病ウイルス（PRV）を損傷と同側の半横隔膜に送達する。この解剖学的追跡アプローチは、横隔膜運動ニューロンとシナプス統合された介在ニューロンの数の特徴付けを可能にする。運動ニューロンおよび介在ニューロンの数を定量し、損傷していない動物から以前に得られたデータと比較する。縫線核および網様核内の細胞数を、PRVで追跡された動物から定量する。PRVで標識された損傷の吻側および尾側の介在ニューロンを、その層流分布に従って定量する。標識組織の切片を分析して、標識軸索の密度およびPRV感染ニューロンの数を決定する。
この手法はまた、損傷したホストの脊髄とシナプスで統合されるようになるドナーニューロンの数を明らかにすることができる。（一部のドナーNPCは成熟したニューロンに分化し、損傷した横隔膜運動回路とシナプス統合する。）
免疫組織化学を使用して、検出可能なセロトニン作動性軸索の数を特定し、グループ間の差異を評価する。例えば順行性追跡法を使用して、追加の軸索集団を評価することもできる。順行性追跡法には、イオン導入による腹側呼吸カラム内の自発的活性細胞へのビオチン化デキストランアミン（BDA）の送達、BDAまたは他の順行性トレーサーの縫線線または他の脳幹核への注入、BDAまたは他の順行性トレーサーのモーター、感覚または他の皮質への注入が含まれるが、これらに限定されない。
抗内皮細胞抗体（RECA）またはその他の一次抗体を用いた追加の免疫組織化学を使用して、病変中心の周囲および潜在的に病変中心内にある血管分布の程度を評価する。新しく形成された血管が機能しているかどうかを試験するため、（血管の内容を決定し、神経系へのタンパク質の不要な通過を試験する）血漿タンパク質の免疫組織化学を行う。
実施例２：
脊髄損傷モデルにおけるNPCおよびE4ORF1+ECの移植の効果：
図１は、説明した実験で使用した方法およびタイムラインの概略図を示す。図１Ａ：神経前駆細胞（NPC）を、発生中のラット脊髄から分離し、培養し、凍結し、移植の1日前に解凍した。図１Ｂ：E4ORF1を発現するマウス脊髄内皮細胞（EC）を解凍し、移植前にレンチGFPウイルスと培養した。図１Ｃ：NPCおよびECを1:1の比率（合計1,000,000細胞）で組み合わせ、挫傷脊髄損傷の1週間後、病変の中心に移植した。一連の解剖学的（順行性および逆行性トレーサー）および機能的（終末横隔膜筋電図、dEMG）評価を使用して、この移植パラダイムの有効性を評価した。実験のタイムラインを図１Ｄに示す。
脊髄損傷モデルにおけるNPCおよびE4ORF1+ECの移植の効果：
図１は、説明した実験で使用した方法およびタイムラインの概略図を示す。図１Ａ：神経前駆細胞（NPC）を、発生中のラット脊髄から分離し、培養し、凍結し、移植の1日前に解凍した。図１Ｂ：E4ORF1を発現するマウス脊髄内皮細胞（EC）を解凍し、移植前にレンチGFPウイルスと培養した。図１Ｃ：NPCおよびECを1:1の比率（合計1,000,000細胞）で組み合わせ、挫傷脊髄損傷の1週間後、病変の中心に移植した。一連の解剖学的（順行性および逆行性トレーサー）および機能的（終末横隔膜筋電図、dEMG）評価を使用して、この移植パラダイムの有効性を評価した。実験のタイムラインを図１Ｄに示す。
移植したNPCおよびECの表現型分析は、移植後6週間でGFAP陽性グリアへの分化を明らかにする。図２Ａに示すように、移植したGFPを発現するNPCおよびEC（図２Ａ）は、移植後6週間でGFAP陽性グリアの高発現をもたらす（図２Ｂ）。図２Ｃは、マンダーの共局在化係数を計算するために使用される散布図を示し、図２Ｃ中、象限1（Q1）は、高いGFAP強度および低いGFP強度を有するピクセルを表す；Q2はGFAPおよびGFPチャネルの両方で高輝度レベルのピクセルを表し、Q4は高GFPおよび低GFAP輝度を表す；Q3は、両方のチャネルで輝度レベルが低いピクセルを表す。この評価により、平均マンダー係数は0.96（N=3）であることが明らかになった。表１を参照。
表１：移植したNPCおよびECのマンダーの共局在化係数
表１：移植したNPCおよびECのマンダーの共局在化係数
内皮細胞（EC）とともにNPCを移植すると、病変腔を通じてセロトニン作動性の成長が促進される。移植したGFP標識NPCおよびECは、移植後6週間生存し（図３Ａ）、GFAP陽性グリアをもたらし（図３Ｂ）、ラット内皮細胞抗原（RECA）染色で示されるように（図３Ｃ）病変腔全体の血管新生を増加させる。組み合わせ移植（NPC+EC）は、病変腔を介してホストのセロトニン作動性（5HT）の増殖をもたらす（図３Ｄ）。図３Ａ～Ｄにおいて、白い矢印は成長する軸索を示す。スケールバーは示されているとおりである。
内皮細胞（EC）とともに神経前駆細胞（NPC）を移植すると、移植後6週間で適度な横隔膜の回復となる。図４：ベースライン（通常の呼吸）中および呼吸負荷（低酸素、10％O2）中の終末横隔膜筋電図検査（dEMG）を使用し、横隔膜機能を移植後6週間で評価した。変化率（すなわち、呼吸困難に反応する動物の能力）を図４に示しており、各ドットは各動物からの40秒の記録の平均である。棒グラフは、示された各グループの平均を表す。
実施例３：
脊髄損傷モデルにおいてE4ORF1+ECとともにグリア前駆細胞またはグリア細胞を移植した効果：
実施例２に上記で記載したように、NPC移植後、NPCは移植後約6週間でGFAP陽性グリアに分化することが見出された。そのため、本発明者らは、（NPCの代わりに）グリア前駆細胞またはグリアをE4ORF1+ECとともに移植すれば、上記のSCI修復も達成される可能性があると仮定した。
脊髄損傷モデルにおいてE4ORF1+ECとともにグリア前駆細胞またはグリア細胞を移植した効果：
実施例２に上記で記載したように、NPC移植後、NPCは移植後約6週間でGFAP陽性グリアに分化することが見出された。そのため、本発明者らは、（NPCの代わりに）グリア前駆細胞またはグリアをE4ORF1+ECとともに移植すれば、上記のSCI修復も達成される可能性があると仮定した。
この仮説を検証するために、以下の実験を行うが、特に明記しない限り、すべての方法は上記のとおりである。
グリア前駆細胞および/またはグリアを取得する。脊髄内皮細胞（EC）を取得し、上記のようにE4ORF1+ECを生成するように形質導入する。グリア前駆細胞とE4ORF1+ECの第一の組み合わせおよびグリアとE4ORF1+ECの第二の組み合わせを、上記のSCIモデルの病変の中心に移植する。一連の解剖学的（順行性および逆行性トレーサー）および機能的（終末横隔膜筋電図、dEMG；覚醒している動物のテレメトリック慢性的に埋め込まれた（telemetric chronically implanted）横隔膜筋電図）評価を使用して、これら移植パラダイムの有効性を評価する。
実施例４：
例示的なヒト臨床試験：
E4ORF1+ECおよびNPCを、損傷を引き起こした事象後の亜急性期中に、損傷部位に直接局所注射することにより、SCIを有するヒト対象に投与する。合計で約1,000,000個の細胞（NPCに対するE4ORF1+ECの比率が1：1）を、生理食塩水を含む組成物として投与する。手順に従い、損傷部位での解剖学的回復（例えば、適切なトレーサーおよび画像化方法を使用して）または機能回復（たとえば、電気生理学的測定および/または運動および/または感覚機能）のいずれかを示す1つまたはそれ以上のよく知られたパラメータをモニターすることにより、治療結果を評価する。治療パラメータは異なる対象で調整でき、これらの調整が治療結果に及ぼす影響を測定できる。調整可能な治療パラメータには、投与される総細胞数、NPCに対するE4ORF1+ECの比率、組成物の構成要素（例えば、緩衝液、賦形剤、成長因子、生体適合性マトリックス）、投与方法（例えば、注射vs注入）、投与場所、損傷を引き起こした事象と比較した投与タイミング（例えば、急性期vs亜急性期、または負傷後1週間未満、約1週間、約2週間以内、または2週間以上など）、E4ORF1+ECの供給源およびNPCの供給源が含まれるが、これらに限られない。
例示的なヒト臨床試験：
E4ORF1+ECおよびNPCを、損傷を引き起こした事象後の亜急性期中に、損傷部位に直接局所注射することにより、SCIを有するヒト対象に投与する。合計で約1,000,000個の細胞（NPCに対するE4ORF1+ECの比率が1：1）を、生理食塩水を含む組成物として投与する。手順に従い、損傷部位での解剖学的回復（例えば、適切なトレーサーおよび画像化方法を使用して）または機能回復（たとえば、電気生理学的測定および/または運動および/または感覚機能）のいずれかを示す1つまたはそれ以上のよく知られたパラメータをモニターすることにより、治療結果を評価する。治療パラメータは異なる対象で調整でき、これらの調整が治療結果に及ぼす影響を測定できる。調整可能な治療パラメータには、投与される総細胞数、NPCに対するE4ORF1+ECの比率、組成物の構成要素（例えば、緩衝液、賦形剤、成長因子、生体適合性マトリックス）、投与方法（例えば、注射vs注入）、投与場所、損傷を引き起こした事象と比較した投与タイミング（例えば、急性期vs亜急性期、または負傷後1週間未満、約1週間、約2週間以内、または2週間以上など）、E4ORF1+ECの供給源およびNPCの供給源が含まれるが、これらに限られない。
参考文献リスト：
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Claims (20)
- 有効量のE4ORF1を発現するCNS由来の内皮細胞（E4ORF1+EC）および有効量の神経前駆細胞（NPC）を有効成分として含む、哺乳動物対象における脊髄損傷（SCI）の治療剤であって、SCIを有する対象にSCIの部位で局所投与し、それにより対象におけるSCIを治療し、該治療の結果、（a）脊髄損傷の部位を介した機能的軸索の成長および／または伸長、および（b）SCI関連の感覚または運動障害における検出可能な改善となる、SCIの治療剤。
- NPC神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率が約1:1である、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよびNPCを生理食塩水中で対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよびNPCを一緒に対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよびNPCを別々に対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよびNPCをSCI損傷の亜急性期内に対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよびNPCをSCIの部位への直接注射により投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよび/またはNPCを生体適合性マトリックス材料中で対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよび/またはNPCを固体3D生体適合性マトリックス材料中で対象に投与する、請求項１に記載の治療剤。
- E4ORF1+ECおよび/またはNPCを生体適合性マトリックス材料中で対象に投与しない、請求項１に記載の治療剤。
- 有効量のE4ORF1を発現するCNS由来の内皮細胞（E4ORF1+EC）および有効量の神経前駆細胞（NPC）を含む、脊髄損傷の治療方法に使用するための医薬組成物。
- NPC神経細胞に対するE4ORF1+ECの比率が約1:1である、請求項１１に記載の医薬組成物。
- 生理食塩水を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
- 生体適合性マトリックス材料を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
- 生体適合性マトリックス材料を含まない、請求項１１に記載の医薬組成物。
- （a）E4ORF1を発現する内皮細胞（EC）、および（b）神経細胞を有効成分として含む、対象における脊髄損傷（SCI）の治療剤であって、SCIを有する対象にSCIの部位で局所投与し、それにより対象におけるSCIを治療する、治療剤。
- ECが哺乳動物ECである、請求項１６に記載の治療剤。
- ECがヒトECである、請求項１６に記載の治療剤。
- ECが、臍帯静脈EC（UVEC）、脳EC、脊髄EC、および嗅球ECよりなる群から選ばれる、請求項１６に記載の治療剤。
- 神経細胞が分化した神経細胞である、請求項１６に記載の治療剤。
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