CN105164249A - 用于诱导细胞至较不成熟状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了用于通过使细胞与增加MUC1*活性的生物物质或化学物质接触从而在细胞中诱导或保持多能性的方法。在一个方面，本发明涉及一种用于由起始细胞生成较不成熟细胞的方法，包括诱导所述起始细胞回复至较不成熟状态，包括使所述起始细胞与以下的生物试剂或化学试剂接触：(i)增加所述细胞中MUC1或NME蛋白质的量；(ii)增加所述细胞中MUC1或NME蛋白质的表达；或(iii)增加MUC1或NME蛋白质的活性。
Description
技术领域
本申请涉及在细胞中诱导多能性的领域。
背景技术
已经证实在小鼠和人类中，体细胞可以通过转录因子的异位表达被重编程(Lowry等人，2008；Maherali等人，2007；Nakagawa等人，2008；Okita等人，2007；Park等人，2008；Takahashi等人，2006；Takahashi和Yamanaka，2006；Wernig等人，2007；Yu等人，2006)而变得具有多能性。诱导型多能干(iPS)细胞的生成对于真正的个性化再生医学的实现具有很大希望(Yamanaka，2007；Jaenish和Young，2008)，这是因为源自患者自身皮肤细胞的干细胞可被用于生成细胞和组织以修复由疾病或老化引起的损伤。已经示出转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc或Oct4、Sox2组合的强制表达引起成熟细胞回复至多能状态。
在早期研究中，使用多种病毒载体表达转录因子(Takahashi和Yamanaka，2006；Okita等人，2007；Maherali等人，2007；Wernig等人，2007；Takahashi等人，2006；Yu等人，2006；Park等人，2008)。由于多重整合事件导致致癌的风险升高，多种载体的使用呈现出问题(Takahashi和Yamanaka，2006；Aoi等人，2008)。研究人员已经试图通过使用单个载体系统(Sommer等人，2009)、可切割载体(Kaji等人，2009；Soldner等人，2009；Woltjen等人，2009)、非整合载体(Stadtfeld等人，2009；Yu等人，2009)和瞬时转染(Okita等人，2009)克服该问题。然而，这些方法在实现表观遗传重编程(epigeneticreprogramming)上非常低效。
用于诱导多能性的方法包括转染致癌基因c-Myc，由于它可能引发癌症而是不令人希望的。iPS细胞可以在不转染c-Myc的情况下生成(Nakagawa等人，2008；Wernig等人，2008)。然而，重编程的效率大大降低。类似地，Klf4可以诱发发育不良(Foster等人，2005)。
由于与多种细菌载体整合相关的问题和诱导多能性的一些基因的不希望副作用，所以存在用调控它们的表达或表达由诱导多能性的基团调控的蛋白质基因产物和蛋白质或者调控诱导多能性的基因表达或蛋白质的小分子代替使用一些或所有诱导多能性的基因的需要。为此，已经报告了基因产物而不是基因的引入也诱导多能性(Zhou等人，2009)。用聚精氨酸标记重组Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc以促进进入细胞，其重编程小鼠体细胞。其他人已经使用小分子代替对于核心组(coreset)中的某种基因的需要。上调Nanog的小分子消除了对于也上调Nanog的Klf4基因的需要(Lyssiotis等人，2009)。在另一个研究中，小分子HDAC抑制剂除去了对于Klf4和c-Myc两者的需求(Huangfu等人，2008，a&b)。这些研究示出：1)蛋白质基因产物可以代替对于基因的需要；2)上调基因的小分子可以代替对于基因的需要；以及3)相同调节途径中的基因(或基因产物)可以相互取代。
尽管实现了这些，但是留下的主要问题是这些方法遭受低效率的重编程。目前在体细胞中诱导多能性的速率如此低，以至于它们使iPS细胞的治疗用途不切实际。因此，需要的是确定单独的、或除了那些已经被确定的之外的在细胞中诱导多能性或改善诱导多能性的效率的蛋白质和小分子。
发明内容
一方面，本发明涉及用于由起始细胞(startingcells)生成较不成熟细胞(lessmaturecells)的方法，包括诱导起始细胞回复至较不成熟状态，包括使起始细胞与以下的生物试剂或化学试剂接触：
(i)增加细胞中MUC1或NME蛋白质的量；
(ii)增加细胞中MUC1或NME蛋白质的表达；
(iii)增加MUC1或NME蛋白质的活性。
该方法可以包括用直接或间接引起MUC1或NME蛋白质的量、表达或活性升高的核酸转染起始细胞。NME蛋白质可以是NME7或它的NME7变体(variant)。或者，NME蛋白质可以是NME1或它的NME1变体。MUC1可以是MUC1*。
另一方面，以上方法可以包括用直接或间接引起MUC1裂解酶的量、表达或活性升高的核酸转染起始细胞。裂解酶可以是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。
另一方面，以上方法可以进一步包括用直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的核酸转染起始细胞。
以上方法可以进一步包括使起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的肽或蛋白质接触。
生物物质可以是肽或蛋白质。可以用增强它进入细胞的能力的部分或序列修饰肽或蛋白质。肽或蛋白质可以是NME蛋白质或它的变体。NME蛋白质可以是NME7或NME1。肽或蛋白质也可以是MUC1或MUC1的一部分。并且以上方法可以进一步包括使起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的肽或蛋白质接触。以上方法还可以包括用直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的核酸转染起始细胞。
在上述的方法中，化学物质可以直接或间接引起NME7、NME1、MUC1、MUC1*、MMP16、MMP14或ADAM17的量、表达或活性升高。并且该方法可以进一步包括使起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的化学物质接触。较不成熟状态可以由OCT4、SOX2、KLF4、KLF2、NANOG、LIN28、MUC1、NME1或NME7中至少一种的表达升高来表征。较不成熟状态可以是多能状态。
在以上方法中，蛋白质可以是MUC1*配体。配体可以使MUC1*二聚化。配体可以是NME家族成员，如NME1、NME6或NME7。NME1和NME6可以是二聚体形式，以及NME7可以是单体形式(monomericform)。
另一方面，配体可以是识别MUC1*的PSMGFR序列的抗体。
在以上方法中，化学试剂可以是增强MUC1的转录、MUC1裂解酶的转录、或NME家族成员的转录的小分子。裂解酶可以是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。小分子可以增强MUC1的裂解，如佛波酯(phorbolester)。
在以上描述的方法中，使用的核酸可以编码MUC1，如MUC1*。或者，核酸可以编码MUC1*的配体，以及配体可以是MUC1*抗体或NME蛋白质。
在以上描述的方法中，该方法可以进一步包括使起始细胞与增加诱导多能性的基因产物的表达的分子接触。这种基因产物可以包括OCT4、SOX2、NANOG、KLF4或LIN28。具体地，是OCT4和SOX2。
本发明中的细胞可以是哺乳动物细胞，包括人类细胞。
在又一方面，本发明涉及由起始细胞生成较不成熟细胞的方法，包括诱导起始细胞回复至较不成熟状态，包括使起始细胞与增加细胞中MUC1或NME的量的生物试剂或化学试剂接触，以及进一步使起始细胞与增加OCT4、SOX2、NANOG、KLF4或LIN28中的一种或多种的量的生物物质或化学物质接触。增加MUC1或NME的量的生物物质可以是编码MUC1、MUC1*、NME1或NME7或它们的变体的核酸。
起始细胞可以是多能干细胞、专能干细胞(multipotentstemcells)或终末分化细胞(terminallydifferentiatedcells)。多能干细胞可以处于始发态(primedstate)。专能干细胞可以是造血细胞、骨髓细胞或神经元细胞。终末分化细胞可以是成纤维细胞、成皮细胞(dermablast)、血细胞、或神经元细胞。
然后可以在体外或体内使生成的细胞分化。
本发明涉及给予(administer)生成的细胞的方法，其包括使生成的细胞分化，以及给予分化的细胞至需要其的患者。本发明涉及给予生成的细胞，以及给予生成的细胞至需要其的患者的方法。生成的细胞可以来自患者或供体(供者，donor)。
在又一方面，发明涉及使干细胞分化的方法，包括：
(i)诱导起始细胞回复至较不成熟状态或将其保持在较不成熟状态，包括实施以上描述的方法；和
(ii)引起较不成熟细胞分化。
细胞可以分化成外胚层细胞、中胚层细胞或内胚层细胞。
在再一方面，本发明涉及治愈(heal)通过在损伤部位诱导或维持干细胞而治愈的疾病或伤口的方法，包括给予需要其的个体(个人，person)有效量的多能性诱导试剂。多能性诱导试剂可以是MUC1*激活剂。试剂可以是NME。可以通过注射、移植或局部施用(topicalapplication)将生成的细胞给予至受试者。
在又一方面，本发明涉及救治(恢复，rescue)退化的干细胞的方法，包括使细胞与NME接触。
在再一方面，本发明涉及提高诱导细胞多能性的效率的方法，包括使细胞与NME接触。
另一方面，本发明涉及增加MUC1或MUC1*在细胞中的表达的方法，包括使细胞与NME接触。该细胞可以是干细胞。
另一方面，本发明涉及生成较不成熟细胞(包括诱导型多能细胞)的方法，包括在不存在bFGF下使起始细胞与NME接触。
通过本发明的以下描述、所附参考附图和所附权利要求可以更全面地理解本发明的这些和其他目的。
附图说明
将通过在下文给出的详细描述和仅通过例示方式给出因而不限制本发明的附图而更全面地理解本发明，在附图中：
图1A-1F示出MUC1*使生长率(生长速率，growthrate)增加。A.克隆测定(clonogenicassay)示出用MUC1*转染大鼠成纤维细胞(3Y1)使生长率增加，但MUC1(全长)则不能；B.MUC1*活性增加存活率。具有获得性抗性的乳腺癌细胞通过增加MUC1*表达确实是这样。用抗-MUC1*Fab处理逆转了对诱导细胞死亡的获得性抗性(acquiredresistance)；C.MUC1*胞外结构域的配体诱导的二聚化刺激生长。添加二价抗-MUC1*抗体刺激MUC1*阳性细胞的生长。用抗-MUC1*(mv)Fab阻断抑制了细胞生长。钟型生长曲线是受体二聚化的特征。对照MUC1-阴性HEK293细胞的生长不受影响；D.使用特异性siRNA抑制MUC1*消除了添加MUC1*二聚配体的生长刺激作用；E.NM23是天然的MUC1*激活配体。NM23刺激MUC1*阳性癌细胞的生长并且产生表示受体二聚的钟形曲线。作用被MUC1的siRNA抑制抵消；F.通过SPR检测NM23与MUC1*肽的直接结合。15nMNM23结合至MUC1*胞外结构域肽，但不结合至无关的肽(不相关的肽)。使用SPR(表面等离子体共振)和NTA-Ni-SAM涂覆的Au膜(Auchip)进行测量。
图2A-2F示出MUC1在未分化的hESC上裂解，但是不在分化的hESC上裂解。免疫细胞化学示出未分化的(多能)干细胞表达MUC1*，但不表达全长的蛋白质；OCT4是用于多能性的黄金标准标记物(goldstandardmarker)。所有多能干细胞是MUC1*阳性的。然而，一旦分化开始(OCT4表达缺失)，裂解停止并且仅检测出全长的MUC1(MUC1-FL)。画面A-C是被以下染色的相同未分化干细胞集落(colony)的照片：A.识别PSMGFR肽的抗-MUC1*抗体；B.抗-OCT4；C.抗-MUC1全长VU4H5。画面D-F是被以下染色的相同新分化干细胞集落的照片：D.识别PSMGFR肽的抗-MUC1*抗体；E.抗-OCT4；F.抗-MUC1全长VU4H5。
图3A-3F示出在未分化的hESC上而不是分化的细胞上，NM23(MUC1*配体)与MUC1*和OCT4共定位。免疫细胞化学示出未分化的(多能)干细胞表达MUC1*和它的激活配体NM23。然而，当干细胞开始分化(OCT4表达缺失)时，那么MUC1表达为全长蛋白质，并且不再分泌NM23。虚线表示未分化部分和新分化部分之间的边界。画面A-C是被以下染色的相同未分化干细胞集落的照片：A.识别NM23的抗体；B.识别PSMGFR肽的抗-MUC1*抗体；C.(A)、(B)和用DAPI染色以染色细胞核的相同细胞的覆层(overlay)。画面D-F是被以下染色的相同未分化干细胞集落的照片：D.识别NM23的抗体；E.识别OCT4的抗体；F.(D)、(E)和用DAPI染色以染色细胞核的相同细胞的覆层。
图4A-4H示出通过配体诱导的二聚化刺激MUC1*促进生长并且在不存在bFGF和条件介质(条件培养基，conditionedmedia)下抑制hESC的分化。使用二价抗-MUC1*抗体，在不添加bFGF的基本培养基或在条件培养基的情况下，生长5周后配体诱导的MUC1*胞外结构域的二聚产生基本100％的多能集落。集落在基质胶上生长。当使用NM23或NM23S120G突变体激活MUC1*时，得到相同的结果。画面A-D是其中用来自成纤维细胞饲养细胞加抗-MUC1*或bFGF的条件培养基补充细胞生长培养基的孔的照片。画面E-H是其中在基本培养基加抗-MUC1*或bFGF中培养干细胞的孔的照片。图像是用以下染色的细胞的图像：A.识别OCT4的抗体；B.(A)的细胞的DAPI染色；C.识别OCT4的抗体；D.(C)的细胞的DAPI染色；E.识别OCT4的抗体；F.(E)的细胞的DAPI染色；G.识别OCT4的抗体；H.(G)的细胞的DAPI染色。
图5示出表示多能干细胞生长需要MUC1*活性的柱状图。用抗-MUC1*Fab阻断MUC1*，甚至在bFGF和条件培养基(CM)存在下，引起总的干细胞在8-12小时内死亡。二价抗-MUC1*刺激生长。培养细胞25hr；在钙黄绿素荧光测定中测量活细胞。
图6A-6B示出证明MUC1*转移(移位)至细胞的细胞核的照片。荧光标记(红)MUC1*Fab，然后用MUC1*阳性细胞温育。照片示出MUC1*开始时不均匀分布在细胞表面。然而，在40分钟后，MUC1*集中在细胞核中。为了比较，也用荧光标记的识别EEA1的抗体(绿)染色细胞，该抗体在整个实验中保持不均匀分布在细胞质中。A.在时间0时拍摄的照片；B.在添加抗-MUC1*的Fab40分钟后拍摄的照片。
图7A-D是实验第4天的放大照片，其中，没有用任何多能性基因转染成纤维细胞，但是将其培养在NM23介质(A，B)中或包含成纤维细胞介质的血清中(C，D)。
图8A-C是实验第4天的放大照片，其中，用OSKM转染细胞并将其培养在NM23介质中(A，B)或成纤维细胞介质中(C)。
图9A-D示出实验第11天的放大照片，其中，没有用任何多能性基因转染成纤维细胞但将其培养在NM23介质中，并且在第5天将细胞转移至不同表面：塑料(A)，MEF(B)，抗-MUC1*抗体、C3(C)，或抗-MUC1*抗体、C3加Rho激酶抑制剂(ROCi)(D)。
图10A、10B示出实验第11天的放大照片，其中，将未转染的细胞培养在成纤维细胞介质中直到第7天，然后将其培养在标准FGF介质中。在第5天将细胞转移至MEF。
图11A-D示出用OSKM(OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc)转染并一直培养在NM23介质中(A，B)或培养在成纤维细胞介质中直到第5天，然后用NM23介质更换(C，D)的成纤维细胞的实验第11天的放大照片。
图12A-B示出用OSKM(OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc)转染并且培养在人饲养细胞表面(A)或小鼠饲养细胞表面(B)上的FGF培养基中的成纤维细胞的实验第11天的放大照片。
图13A-D示出实验第14天未转染细胞的放大照片，该细胞已经被培养在抗-MUC1*抗体(A，B)或成纤维细胞饲养细胞(C，D)上的NM23-MM-A(一直)中。
图14A-C示出被培养在标准FM中直到第5天，然后被培养在饲养细胞上的FGF介质中的未转染细胞在实验第14天的放大照片，并且没有示出诱导多能性的迹象。
图15A-C示出实验第14天用OSKM转染的成纤维细胞的放大照片，该成纤维细胞一直被培养在抗-MUC1*抗体表面上(A)、塑料上(B)或MEF上(C)的NM23介质中。
图16A-D示出用OSKM转染并且第7天后被培养在NM23中(A，B)或被培养在FGF培养基中(C，D)的成纤维细胞在实验第14天的放大照片，其中，细胞被接种(涂板，plate)至小鼠饲养细胞(A，C)或人饲养细胞(B，D)上。
图17A-D示出实验第19天对照未转染细胞的放大照片，该细胞已经被培养在NM23-MM-A(一直)中或NM23-MM-R(更换的)中。在不存在转染的基因下，NM23-MM诱导多能细胞形态。
图18A-B示出实验第19天对照未转染细胞的放大照片，该细胞已经被培养在FM中，然后被培养在FGF-MM中。看不到多能性的诱导。
图19A-D示出实验第19天用OSKM转染的成纤维细胞的放大照片，该细胞已经被培养在NM23-MM-A中(A，B)或NM23-MM-R中(C，D)。图像示出NM23-MM一直增强多能性的诱导。
图20A-B示出用OSKM转染的成纤维细胞在第19天的放大照片，其中，细胞已经被培养在FM中7天，然后被培养在FGF-MM中。
图21A-B示出在转染三种或更多种多能性基因后，然后测定多能性基因存在的第4天(A)或第20天(B)的RT-PCR实验的图表。
图22A-B示出在转染3种或4种多能性基因后第4天(A)和第20天(B)测定Oct4的表达的RT-PCR实验的图表。
图23A-C是免疫细胞化学实验的照片，其中，在转染后第10天测定转染的成纤维细胞中多能性标记Tra1-60的存在。
图24A-E示出成纤维细胞转染后第10天的照片，该成纤维细胞被荧光染色用于多能性标记Tra1-60的存在，其中，细胞已经被培养在NM23介质中。
图25A-C示出成纤维细胞转染后第10天的照片，该成纤维细胞被荧光染色用于多能性标记Tra1-60的存在，其中，细胞已经被培养在FGF介质中。
图26A-C示出一直被培养在NM23中(A)、在第7天NM23更换成纤维细胞介质(B)或FGF介质(C)的未转染成纤维细胞在实验第15天的照片。
图27A-C示出用OSKM(A)、OSK(B)、或OSM(C)转染成纤维细胞后第15天的照片，其中，在实验持续时间中所有都被培养在NM23介质中。
图28A-C示出用OSKM(A)、OSK(B)、或OSM(C)转染成纤维细胞后第15天的照片，其中，从第7天起所有都被培养在NM23介质中。
图29A-C示出用OSKM(A)、OSK(B)、或OSM(C)转染成纤维细胞后第15天的照片，其中，从第7天起所有都被培养在FGF介质中。
图30A-C示出用OSKM转染成纤维细胞并且一直被培养在NM23介质中(A)、从第7天起被培养在NM23中(B)、或第7天起被培养在FGF介质中(C)的第15天的照片。
图31A-C示出用OSK转染成纤维细胞并且一直被培养在NM23介质中(A)、从第7天起被培养在NM23中(B)、或第7天起被培养在FGF介质中(C)的第15天的照片。
图32A-C示出用OSM转染成纤维细胞后并且一直被培养在NM23介质中(A)、从第7天起被培养在NM23中(B)、或第7天起被培养在FGF介质中(C)的第15天的照片。
图33示出FACS实验的图表，其中，在被培养在标准小鼠LIF介质或NM23介质中后，测定小鼠胚胎干细胞中多能性标记SSEA4的存在。
图34示出FACS实验的图表，其中，在被培养在标准小鼠LIF介质或NM23介质中后，使用MUC1*的特异性抗体的组(panel)测定小鼠胚胎干细胞中MUC1*的存在。
图35A-C示出诱导变得多能的细胞的第19天FACS扫描，其中，染色该细胞用于分化的成纤维细胞的标记物CD13和多能性的表面标记物Tra1-60。A)示出用根据标准方法的Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc(OSKM)转染，并且在第7天将成纤维细胞介质切换为FGF介质的细胞的FACS扫描，而B)示出也用OSKM转染，但是其中细胞从开始被培养在NM23二聚体介质中并且没有经受血清或FGF的细胞的FACS扫描。结果列于C)中。
图36是图35的FACS结果的图表。
图37示出用OSKM、OSK或OSM转染并且被培养在FGF介质中、一直或仅在第7天后(此时由纤维细胞介质切换)被培养在NM23介质中的细胞的第18天FACS扫描。染色细胞中的分化的成纤维细胞的标记物CD13、多能性的表面标记物SSEA4和多能性的表面标记物Tra1-60。
图38示出测量CD13和Tra1-60的第18天FACS扫描的列表结果。
图39示出测量CD13和SSEA4的第18天FACS扫描的列表结果。
图40A-F是被培养在MEF层上的FGF介质中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NME7-AB介质中，和通过免疫细胞化学测定MUC1*的存在(A，D)和多能性标记物Rex-1(B，E)和Tra1-60(C，F)的存在的人诱导型多能干(iPS)细胞系的照片。
图41A-F示出被培养在MEF层上的FGF介质中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NME7-AB介质中，和通过免疫细胞化学测定MUC1*(A，D)的存在和多能性标记物Rex-1(B，E)和Tra1-60(C，F)的存在的人胚胎干(ES)细胞系的照片。
图42A-F示出被培养在MEF层上的FGF介质中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体介质中(D-F)，和通过免疫细胞化学测定MUC1*(A，D)、核染色DAPI(B，E)的存在的人iPS细胞系的照片和合并的图像(mergedimages)(C，F)。
图43A-L示出被培养在MEF层上的FGF介质中(A-F)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体介质中(G-L)，和通过免疫细胞化学测定MUC1*(A，G)、多能性标记物Tra1-60(D，J)、核染色DAPI(B，E，H，K)的存在的人iPS细胞系的照片和合并的图像(C，F，I，L)。
图44A-C示出被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体介质中和通过免疫细胞化学测定NME7(A，B，C)和核染色DAPI(C)的存在的人类iPS细胞系的照片。
表2示出在多种条件下在诱导人成纤维细胞的多能性第19天产生多少干细胞样集落，并且计算了诱导效率(其是生成单个集落所需的细胞数)和诱导速率(其是该数值的相反数(倒数、逆数，inverse))。
具体实施方式
在本申请中，“一个”和“一种”用于指一个或多个对象。
如本文所使用的，“增加MUC1*活性”是指直接或间接增加MUC1*信号，并且包括但不限于MUC1*受体的二聚以及通过MUC1受体裂解MUC1*产量增加。MUC1*活性也可以通过MUC1*受体的较高转录表达增加，该MUC1*受体进一步裂解和二聚。因此，一方面，MUC1*活性可以随使MUC1*二聚的效应分子的较高活性或裂解MUC1从而形成MUC1*的裂解分子的较高活性、或MUC1的表达升高而升高。因此，能够增加MUC1*二聚配体的活性的任何化学物质或生物物质、形成MUC1*的MUC1裂解酶、或增强MUC1的表达的任何转录激活剂(激活子)被包含为“增加MUC1*活性”的物质。
如本文所使用的，“MUC1生长因子受体”(MGFR)是功能性定义，指与激活配体(如生长因子或修饰酶，如裂解酶)相互作用的MUC1受体部分。MUC1的MGFR区域是最接近细胞表面的细胞外部分，并且被定义为以下所定义的PSMGFR的大部分或全部。MGFR包括未修饰的肽和已经经受酶修饰(如例如，磷酸化、糖基化等)的肽。
如本文所使用的，“MUC1生长因子受体的一级序列”(PSMGFR，PrimarySequenceoftheMUC1GrowthFactorReceptor)是指在某些情况下定义MGFR的大部分或全部的肽序列、和该肽序列的功能性变体和片段。PSMGFR被定义为SEQIDNO:6，并且其所有功能性变体和片段具有至多20个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)氨基酸置换(替换)的整数值和/或在它的N端和/或C端至多20个氨基酸添加或缺失的任何整数值。上文中的“功能性变体或片段”是指具有特异性结合至配体或以其他方式与配体特异性相互作用的能力的这种变体或片段，该配体特异性结合至SEQIDNO:6的肽或以其他方式与SEQIDNO:6的肽特异性相互作用，同时不强力结合至与它们本身相同的其他肽分子的相同区域，使得肽分子具有与其他相同肽分子聚集(即，自聚集)的能力。作为SEQNO:6的PSMGFR肽的功能性变体的PSMGFR的一个实例是SEQIDNO:8，其通过包含代替-SRY-的-SPY-序列而与SEQIDNO:6相区别。
如本文所使用的，“MUC1*”是指N端被截短从而胞外结构域基本由PSMGFR组成的MUC1蛋白质(SEQIDNO:5)。
如本文所使用的，“MUC1*相关因子”是指修饰、激活、调节MUC1*的活性或调节MUC1*的表达的试剂。MUC1*相关因子包括不限于影响MUC1*受体的二聚、增加MUC1*的产量、诱导MUC1受体的裂解的试剂，通过MUC1受体(其进一步被裂解和二聚)的较高转录表达增加MUC1*活性的试剂。
如本文所使用的，“有效量”是足以影响有益的或期望的临床结果或生物化学结果的量。可以一次或多次给予有效量。对于本发明的目的，抑制剂化合物的有效量是足以诱导或保持细胞的多能性或激活MUC1*的量。
如本文所使用的，“片段”或“功能衍生物”是指本发明的天然配体(nativeligand)或受体的生物活性的氨基酸序列变体和片段、以及共价修饰物，包括通过与有机衍生剂反应得到的衍生物、翻译后修饰物、与非蛋白质性质的聚合物的衍生物、和免疫粘附素(immunoadhesins)。
如本文所使用的，“未成熟”细胞是指可以经历至少一步或多步分化以及表达已知能够经历至少一步或多步分化的特定细胞类型的标记物的细胞。
如本文所使用的，“具有比起始细胞较不成熟状态的细胞”是指已经去分化，从而具有比起始细胞升高的分化为不同细胞类型的能力或具有比起始细胞升高的分化为更多细胞类型的能力的细胞。可以通过测量多能性标记物的表达增加、通过确定多能性标记物的表达水平与多能干细胞的表达水平相近或通过测量比起始细胞较不成熟状态的标记物，可以识别较不成熟状态的细胞。例如，可以分化为任何血细胞类型的造血干细胞由CD34的表达和不存在CD38表征。当这些细胞分化时，它们从CD34+/CD38-至CD34+/CD38-，然后至CD34-/CD38+。如果某人诱导CD34-/CD38+细胞回复至较不成熟状态，那么细胞将再次表达CD34。转分化技术涉及使起始细胞回复至较不成熟状态，其中，甚至当起始细胞与得到的细胞在相同的相对分化水平时，细胞变得不稳定并且可以被引导分化为相比起始细胞的分化细胞类型(Iede等人，2010；Efe等人，2011)。例如，心脏成纤维细胞已经通过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的短暂异位表达(briefectopicexpression)回复至较不成熟状态，然后由该不稳定状态分化为心肌细胞。
如本文所使用的，“配体”是指特异性共价或瞬时结合至分子(如多肽)的任何分子或试剂、或化合物。当在某些情况下使用时，配体可以包括抗体。在其他情况下，“配体”是指旨在被另一种分子以高亲和力结合的分子，如但不限于用于MUC1*的天然或非天然配体或结合至MUC1或MUC1*的裂解酶或用于MUC1*的二聚配体。
如本文所使用的，“原始态干细胞(stemcell)”是类似于胚泡(blastocyst)的内细胞团(innermass)细胞并且具有胚泡的内细胞团细胞的可量化特征的那些。与始发态干细胞(primedstemcells)相比，原始态干细胞具有某些基因表达上的可量化区别，其类似于胚泡的外胚层部分的细胞并且具有胚泡的外胚层部分的细胞的性状和特征。值得注意地是，雌性来源的原始态干细胞具有两个活性X染色体，称为XaXa，而后者雌性来源的始发态干细胞具有X染色体中的灭活的一个。
如本文所使用的，“NME”家族蛋白质是十(10)种蛋白质的家族，其中的一些近年来已经被发现，其中，可以通过它们与核苷二磷酸激酶(NDPK)结构域的共享序列同源性分类它们，尽管许多NME家族成员没有激酶活性。NME蛋白质直到被发现以前被称为NM23-H1和NM23-H2，然后是NM23-H3，到NM23-10。不同的NME蛋白质功能不同。在本文中，NME1和NME6结合至MUC1*受体以及当它们为二聚体形式时使MUC1*受体(其中，它的胞外结构域基本由PSMGFR序列组成)二聚；NME7具有两(2)个用于MUC1*受体细胞外结构域的结合位点并且也使受体二聚。NME1二聚体、NME6二聚体和NME7二聚体是用作MUC1*配体诱导或将细胞保持在比起始细胞较不成熟的状态的优选的NME家族成员。能够结合至MUC1*受体并且使MUC1*受体二聚的其他NME家族成员也被考虑用作MUC1*配体来诱导或将细胞保持在比起始细胞较不成熟的状态。
如本文所使用的，“多能性标记物”是那些当细胞回复至比起始细胞较不成熟的状态时表达增加的基因和蛋白质。多能性标记物包括OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF2、Tra1-60、Tra1-81、SSEA4、和REX-1以及之前描述的其他的和目前发现的那些。例如，成纤维细胞表达不可检出的或低水平的这些多能性标记物，但是表达成纤维细胞分化标记物，称为CD13。为了确定细胞是否变得比起始细胞较不成熟，可以测量起始细胞和得到的细胞之间的多能性标记物的表达水平的区别。
如本文所使用的，“始发态干细胞”是类似于胚泡的外胚层部分的细胞并且具有胚泡的外胚层部分的细胞的性状和特征的细胞。
如本文所使用的，术语“特异性结合”是指两种分子之间的非随机结合反应，例如，抗体分子与抗原之间的免疫反应，或非抗体配体与另一种多肽(如与MUC1*特异性结合的NM23或结合至MUC1*的抗体或结合至MUC1或MUC1*的裂解酶)反应。
如本文所使用的，“多能”干细胞是指可以分化为所有三个种系，内胚层、外胚层和中胚层以分化为体内任何细胞类型，但不能产生完整的有机体的干细胞。全能干细胞(totipotentstemcell)是可以分化或成熟为完整的有机体(如人体)的一种(细胞)。关于胚胎多能干细胞，它们是源自胚泡的内细胞团的细胞。多能性的典型标记物是OCT4、KLF4、NANOG、Tra1-60、Tra1-81和SSEA4。
如本文所使用的，“专能(multipotent)”干细胞是指可以分化为其他细胞类型(其中不同细胞类型的数目受限制)的干细胞。
如本文所使用的，“半多能”或“预-iPS状态(pre-iPSstate)”是指具有多能干细胞的一些或所有形态特征，但是它的多能性标记物的表达水平或它分化为所有三个种系的能力低于多能干细胞的水平或能力的细胞。
如本文所使用的，“干细胞样”形态是指类似于干细胞的形态、多能性基因的一种或多种的表达水平、或分化为多种细胞类型的能力的形态。干细胞样形态是当细胞具有圆形时的形态，并且与它们的细胞核的大小相比非常小，其往往具有大的细胞核与细胞质比值，该比值是多能干细胞的特征。相比之下，成纤维细胞形态是当细胞具有长的、细长形状(纺锤形)并且不具有大的细胞核与细胞质比时的形态。此外，多能干细胞是非粘附的，而其他细胞类型(如成纤维细胞)是粘附的。
如本文所使用的，“载体”、“多核苷酸载体”、“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于RNA、DNA、包封在逆转录病毒外壳(coat)中的RNA、包封在腺病毒外壳中的DNA、包装在另一种病毒或病毒样形式(如单纯疱疹、和腺相关病毒(AAV))中的DNA、包封在脂质体中的DNA、与聚赖氨酸络合、与合成聚阳离子分子络合、与化合物(如聚乙二醇(PEG))络合以免疫“标记”分子和/或增加半衰期、或结合至非病毒蛋白质的DNA。优选地，多核苷酸是DNA。如本文所使用的，“DNA”不仅包括碱基A、T、C、和G，而且包括它们的任何类似物或这些碱基的修饰形式，如甲基化的核苷酸、内核苷酸修饰物如不带电荷的键和硫醇盐、糖类似物的使用、以及修饰的和/或可替代的骨架结构如聚酰胺。
序列表自由文本
至于除了a、g、c、t之外的核苷酸符号的使用，它们遵循在WIPOStandardST.25，附录2表1中列出的惯例，其中，k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t以及y表示c或t。
LSYTNPAVAAASANL(SEQIDNO:1)描述了全长MUC1受体(粘蛋白1前体，Genbank登录号：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQIDNO:2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTA(SEQIDNO:3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTG(SEQIDNO:4)
SEQIDNO:2、3和4描述了用于引导MUC1受体和截短的同种型(isoform)至细胞膜表面的N端MUC-1信号序列。如通过SEQIDNO:2、3和4中的变体所示出的，在C末端可缺乏至多3个氨基酸残基。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQIDNO:5)描述了在其N端具有nat-PSMGFR并且包括全长MUC1受体的跨膜和细胞质序列的截短的MUC1受体同种型。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:6)描述了MUC1生长因子受体的原始一级序列(primarysequence)(nat-PSMGFR-“PSMGFR”的实例)：
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:7)描述了MUC1生长因子受体的原始一级序列(nat-PSMGFR-“PSMGFR”的实例)，在SEQIDNO:6的N端具有一个氨基酸缺失。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:8)描述了具有增强的稳定性的MUC1生长因子受体的原始一级序列的“SPY”功能变体(var-PSMGFR-“PSMGFR”的实例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:9)描述了具有增强的稳定性的MUC1生长因子受体的原始一级序列的“SPY”功能变体，在SEQIDNO:8的N端具有一个氨基酸缺失(var-PSMGFR–“PSMGFR”的实例)。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQIDNO:10)描述了MUC1细胞质结构域的核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQIDNO:11)描述了MUC1细胞质结构域的氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQIDNO:12)描述了NME7核苷酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQIDNO:13)描述了NME7氨基酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQIDNO:14)描述了NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQIDNO:15)NM23-H1描述了氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQIDNO:16)描述了NM23-H1S120G突变体的核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQIDNO:17)描述了NM23-H1S120G突变体的氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
atgtacaacatgatggagacggagctgaagccgccgggcccgcagcaaacttcggggggcggcggcggcaactccaccgcggcggcggccggcggcaaccagaaaaacagcccggaccgcgtcaagcggcccatgaatgccttcatggtgtggtcccgcgggcagcggcgcaagatggcccaggagaaccccaagatgcacaactcggagatcagcaagcgcctgggcgccgagtggaaacttttgtcggagacggagaagcggccgttcatcgacgaggctaagcggctgcgagcgctgcacatgaaggagcacccggattataaataccggccccggcggaaaaccaagacgctcatgaagaaggataagtacacgctgcccggcgggctgctggcccccggcggcaatagcatggcgagcggggtcggggtgggcgccggcctgggcgcgggcgtgaaccagcgcatggacagttacgcgcacatgaacggctggagcaacggcagctacagcatgatgcaggaccagctgggctacccgcagcacccgggcctcaatgcgcacggcgcagcgcagatgcagcccatgcaccgctacgacgtgagcgccctgcagtacaactccatgaccagctcgcagacctacatgaacggctcgcccacctacagcatgtcctactcgcagcagggcacccctggcatggctcttggctccatgggttcggtggtcaagtccgaggccagctccagcccccctgtggttacctcttcctcccactccagggcgccctgccaggccggggacctccgggacatgatcagcatgtatctccccggcgccgaggtgccggaacccgccgcccccagcagacttcacatgtcccagcactaccagagcggcccggtgcccggcacggccattaacggcacactgcccctctcacacatgtga(SEQIDNO:18)描述了人SOX2核苷酸序列(SOX2：GENBANK登录号NM_003106)。
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM(SEQIDNO:19)描述了人SOX2氨基酸序列(SOX2：GENBANK登录号NM_003106)。
atggcgggacacctggcttcagattttgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggccaggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcctggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattcccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctctgcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggatatacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaacgaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcccttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaaagcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgagaggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagccacatcgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcgccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgggtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtaccccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgagggggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactga(SEQIDNO:20)描述了人OCT4核苷酸序列。
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKWVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVWFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQIDNO:21)描述了人OCT4氨基酸序列。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQIDNO:22)描述了NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：GENBANK登录号AK313448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQIDNO:23)描述了NM23-H2氨基酸序列(NM23-H2：GENBANK登录号AK313448)。
atggctgtcagcgacgcgctgctcccatctttctccacgttcgcgtctggcccggcgggaagggagaagacactgcgtcaagcaggtgccccgaataaccgctggcgggaggagctctcccacatgaagcgacttcccccagtgcttcccgccggcccctatgacctggcggcggcgaccgtggccacagacctggagagcgccggagccggtgcggcttgcggcggtagcaacctggcgcccctacctcggagagagaccgaggagttcaacgatctcctggacctggactttattctctccaattcgctgacccatcctccggagtcagtggccgccaccgtgtcctcgtcagcgtcagcctcctcttcgtcgtcgccgtcgagcagcggccctgccagcgcgccctccacctgcagcttcacctatccgatccgggccgggaacgacccgggcgtggcgccgggcggcacgggcggaggcctcctctatggcagggagtccgctccccctccgacggctcccttcaacctggcggacatcaacgacgtgagcccctcgggcggcttcgtggccgagctcctgcggccagaattggacccggtgtacattccgccgcagcagccgcagccgccaggtggcgggctgatgggcaagttcgtgctgaaggcgtcgctgagcgcccctggcagcgagtacggcagcccgtcggtcatcagcgtcacgaaaggcagccctgacggcagccacccggtggtggtggcgccctacaacggcgggccgccgcgcacgtgccccaagatcaagcaggaggcggtctcttcgtgcacccacttgggcgctggaccccctctcagcaatggccaccggccggctgcacacgacttccccctggggcggcagctccccagcaggactaccccgaccctgggtcttgaggaagtgctgagcagcagggactgtcaccctgccctgccgcttcctcccggcttccatccccacccggggcccaattacccatccttcctgcccgatcagatgcagccgcaagtcccgccgctccattaccaagagctcatgccacccggttcctgcatgccagaggagcccaagccaaagaggggaagacgatcgtggccccggaaaaggaccgccacccacacttgtgattacgcgggctgcggcaaaacctacacaaagagttcccatctcaaggcacacctgcgaacccacacaggtgagaaaccttaccactgtgactgggacggctgtggatggaaattcgcccgctcagatgaactgaccaggcactaccgtaaacacacggggcaccgcccgttccagtgccaaaaatgcgaccgagcattttccaggtcggaccacctcgccttacacatgaagaggcatttt(SEQIDNO:24)描述了KLF4核苷酸序列(KLF4：GENBANK登录号AF022184)。
MAVSDALLPSFSTFASGPAGREKTLRQAGAPNNRWREELSHMKRLPPVLPAGPYDLAAATVATDLESAGAGAACGGSNLAPLPRRETEEFNDLLDLDFILSNSLTHPPESVAATVSSSASASSSSSPSSSGPASAPSTCSFTYPIRAGNDPGVAPGGTGGGLLYGRESAPPPTAPFNLADINDVSPSGGFVAELLRPELDPVYIPPQQPQPPGGGLMGKFVLKASLSAPGSEYGSPSVISVTKGSPDGSHPVVVAPYNGGPPRTCPKIKQEAVSSCTHLGAGPPLSNGHRPAAHDFPLGRQLPSRTTPTLGLEEVLSSRDCHPALPLPPGFHPHPGPNYPSFLPDQMQPQVPPLHYQELMPPGSCMPEEPKPKRGRRSWPRKRTATHTCDYAGCGKTYTKSSHLKAHLRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGHRPFQCQKCDRAFSRSDHLALHMKRHF(SEQIDNO:25)描述了KLF4氨基酸序列(KLF4：GENBANK登录号AF022184)。
atggatttttttcgggtagtggaaaaccagcagcctcccgcgacgatgcccctcaacgttagcttcaccaacaggaactatgacctcgactacgactcggtgcagccgtatttctactgcgacgaggaggagaacttctaccagcagcagcagcagagcgagctgcagcccccggcgcccagcgaggatatctggaagaaattcgagctgctgcccaccccgcccctgtcccctagccgccgctccgggctctgctcgccctcctacgttgcggtcacacccttctcccttcggggagacaacgacggcggtggcgggagcttctccacggccgaccagctggagatggtgaccgagctgctgggaggagacatggtgaaccagagtttcatctgcgacccggacgacgagaccttcatcaaaaacatcatcatccaggactgtatgtggagcggcttctcggccgccgccaagctcgtctcagagaagctggcctcctaccaggctgcgcgcaaagacagcggcagcccgaaccccgcccgcggccacagcgtctgctccacctccagcttgtacctgcaggatctgagcgccgccgcctcagagtgcatcgacccctcggtggtcttcccctaccctctcaacgacagcagctcgcccaagtcctgcgcctcgcaagactccagcgccttctctccgtcctcggattctctgctctcctcgacggagtcctccccgcagggcagccccgagcccctggtgctccatgaggagacaccgcccaccaccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgaggaagaaatcgatgttgtttctgtggaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatcaccttctgctggaggccacagcaaacctcctcacagcccactggtcctcaagaggtgccacgtctccacacatcagcacaactacgcagcgcctccctccactcggaaggactatcctgctgccaagagggtcaagttggacagtgtcagagtcctgagacagatcagcaacaaccgaaaatgcaccagccccaggtcctcggacaccgaggagaatgtcaagaggcgaacacacaacgtcttggagcgccagaggaggaacgagctaaaacggagcttttttgccctgcgtgaccagatcccggagttggaaaacaatgaaaaggcccccaaggtagttatccttaaaaaagccacagcatacatcctgtccgtccaagcagaggagcaaaagctcatttctgaagaggacttgttgcggaaacgacgagaacagttgaaacacaaacttgaacagctacggaactcttgtgcg(SEQIDNO:26)描述了c-Myc核苷酸序列(c-Myc：GENBANK登录号BC000917)。
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQIDNO:27)描述了c-Myc氨基酸序列(c-Myc：GENBANK登录号BC000917)。
atgggctccgtgtccaaccagcagtttgcaggtggctgcgccaaggcggcagaagaggcgcccgaggaggcgccggaggacgcggcccgggcggcggacgagcctcagctgctgcacggtgcgggcatctgtaagtggttcaacgtgcgcatggggttcggcttcctgtccatgaccgcccgcgccggggtcgcgctcgaccccccagtggatgtctttgtgcaccagagtaagctgcacatggaagggttccggagcttgaaggagggtgaggcagtggagttcacctttaagaagtcagccaagggtctggaatccatccgtgtcaccggacctggtggagtattctgtattgggagtgagaggcggccaaaaggaaagagcatgcagaagcgcagatcaaaaggagacaggtgctacaactgtggaggtctagatcatcatgccaaggaatgcaagctgccaccccagcccaagaagtgccacttctgccagagcatcagccatatggtagcctcatgtccgctgaaggcccagcagggccctagtgcacagggaaagccaacctactttcgagaggaagaagaagaaatccacagccctaccctgctcccggaggcacagaat(SEQIDNO:28)描述了LIN28核苷酸序列(LIN28：GENBANK登录号AF521099)。
MGSVSNQQFAGGCAKAAEEAPEEAPEDAARAADEPQLLHGAGICKWFNVRMGFGFLSMTARAGVALDPPVDVFVHQSKLHMEGFRSLKEGEAVEFTFKKSAKGLESIRVTGPGGVFCIGSERRPKGKSMQKRRSKGDRCYNCGGLDHHAKECKLPPQPKKCHFCQSISHMVASCPLKAQQGPSAQGKPTYFREEEEEIHSPTLLPEAQN(SEQIDNO:29)描述了LIN28氨基酸(LIN28：GENBANK登录号AF521099)。
atgtctcccgccccaagaccctcccgttgtctcctgctccccctgctcacgctcggcaccgcgctcgcctccctcggctcggcccaaagcagcagcttcagccccgaagcctggctacagcaatatggctacctgcctcccggggacctacgtacccacacacagcgctcaccccagtcactctcagcggccatcgctgccatgcagaagttttacggcttgcaagtaacaggcaaagctgatgcagacaccatgaaggccatgaggcgcccccgatgtggtgttccagacaagtttggggctgagatcaaggccaatgttcgaaggaagcgctacgccatccagggtctcaaatggcaacataatgaaatcactttctgcatccagaattacacccccaaggtgggcgagtatgccacatacgaggccattcgcaaggcgttccgcgtgtgggagagtgccacaccactgcgcttccgcgaggtgccctatgcctacatccgtgagggccatgagaagcaggccgacatcatgatcttctttgccgagggcttccatggcgacagcacgcccttcgatggtgagggcggcttcctggcccatgcctacttcccaggccccaacattggaggagacacccactttgactctgccgagccttggactgtcaggaatgaggatctgaatggaaatgacatcttcctggtggctgtgcacgagctgggccatgccctggggctcgagcattccagtgacccctcggccatcatggcacccttttaccagtggatggacacggagaattttgtgctgcccgatgatgaccgccggggcatccagcaactttatgggggtgagtcagggttccccaccaagatgccccctcaacccaggactacctcccggccttctgttcctgataaacccaaaaaccccacctatgggcccaacatctgtgacgggaactttgacaccgtggccatgctccgaggggagatgtttgtcttcaaggagcgctggttctggcgggtgaggaataaccaagtgatggatggatacccaatgcccattggccagttctggcggggcctgcctgcgtccatcaacactgcctacgagaggaaggatggcaaattcgtcttcttcaaaggagacaagcattgggtgtttgatgaggcgtccctggaacctggctaccccaagcacattaaggagctgggccgagggctgcctaccgacaagattgatgctgctctcttctggatgcccaatggaaagacctacttcttccgtggaaacaagtactaccgtttcaacgaagagctcagggcagtggatagcgagtaccccaagaacatcaaagtctgggaagggatccctgagtctcccagagggtcattcatgggcagcgatgaagtcttcacttacttctacaaggggaacaaatactggaaattcaacaaccagaagctgaaggtagaaccgggctaccccaagtcagccctgagggactggatgggctgcccatcgggaggccggccggatgaggggactgaggaggagacggaggtgatcatcattgaggtggacgaggagggcggcggggcggtgagcgcggctgccgtggtgctgcccgtgctgctgctgctcctggtgctggcggtgggccttgcagtcttcttcttcagacgccatgggacccccaggcgactgctctactgccagcgttccctgctggacaaggtc(SEQIDNO:30)描述了MMP14核苷酸序列(MMP14：GENBANK登录号BC064803)。
MSPAPRPSRCLLLPLLTLGTALASLGSAQSSSFSPEAWLQQYGYLPPGDLRTHTQRSPQSLSAAIAAMQKFYGLQVTGKADADTMKAMRRPRCGVPDKFGAEIKANVRRKRYAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLAHAYFPGPNIGGDTHFDSAEPWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIMAPFYQWMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGGESGFPTKMPPQPRTTSRPSVPDKPKNPTYGPNICDGNFDTVAMLRGEMFVFKERWFWRVRNNQVMDGYPMPIGQFWRGLPASINTAYERKDGKFVFFKGDKHWVFDEASLEPGYPKHIKELGRGLPTDKIDAALFWMPNGKTYFFRGNKYYRFNEELRAVDSEYPKNIKVWEGIPESPRGSFMGSDEVFTYFYKGNKYWKFNNQKLKVEPGYPKSALRDWMGCPSGGRPDEGTEEETEVIIIEVDEEGGGAVSAAAVVLPVLLLLLVLAVGLAVFFFRRHGTPRRLLYCQRSLLDKV(SEQIDNO:31)描述了MMP14氨基酸序列(MMP14：GENBANK登录号BC064803)。
atgatcttactcacattcagcactggaagacggttggatttcgtgcatcattcgggggtgtttttcttgcaaaccttgctttggattttatgtgctacagtctgcggaacggagcagtatttcaatgtggaggtttggttacaaaagtacggctaccttccaccgactgaccccagaatgtcagtgctgcgctctgcagagaccatgcagtctgccctagctgccatgcagcagttctatggcattaacatgacaggaaaagtggacagaaacacaattgactggatgaagaagccccgatgcggtgtacctgaccagacaagaggtagctccaaatttcatattcgtcgaaagcgatatgcattgacaggacagaaatggcagcacaagcacatcacttacagtataaagaacgtaactccaaaagtaggagaccctgagactcgtaaagctattcgccgtgcctttgatgtgtggcagaatgtaactcctctgacatttgaagaagttccctacagtgaattagaaaatggcaaacgtgatgtggatataaccattatttttgcatctggtttccatggggacagctctccctttgatggagagggaggatttttggcacatgcctacttccctggaccaggaattggaggagatacccattttgactcagatgagccatggacactaggaaatcctaatcatgatggaaatgacttatttcttgtagcagtccatgaactgggacatgctctgggattggagcattccaatgaccccactgccatcatggctccattttaccagtacatggaaacagacaacttcaaactacctaatgatgatttacagggcatccagaaaatatatggtccacctgacaagattcctccacctacaagacctctaccgacagtgcccccacaccgctctattcctccggctgacccaaggaaaaatgacaggccaaaacctcctcggcctccaaccggcagaccctcctatcccggagccaaacccaacatctgtgatgggaactttaacactctagctattcttcgtcgtgagatgtttgttttcaaggaccagtggttttggcgagtgagaaacaacagggtgatggatggatacccaatgcaaattacttacttctggcggggcttgcctcctagtatcgatgcagtttatgaaaatagcgacgggaattttgtgttctttaaaggtaacaaatattgggtgttcaaggatacaactcttcaacctggttaccctcatgacttgataacccttggaagtggaattccccctcatggtattgattcagccatttggtgggaggacgtcgggaaaacctatttcttcaagggagacagatattggagatatagtgaagaaatgaaaacaatggaccctggctatcccaagccaatcacagtctggaaagggatccctgaatctcctcagggagcatttgtacacaaagaaaatggctttacgtatttctacaaaggaaaggagtattggaaattcaacaaccagatactcaaggtagaacctggacatccaagatccatcctcaaggattttatgggctgtgatggaccaacagacagagttaaagaaggacacagcccaccagatgatgtagacattgtcatcaaactggacaacacagccagcactgtgaaagccatagctattgtcattccctgcatcttggccttatgcctccttgtattggtttacactgtgttccagttcaagaggaaaggaacaccccgccacatactgtactgtaaacgctctatgcaagagtgggtg(SEQIDNO:32)描述了MMP16核苷酸序列(MMP16：GENBANK登录号AB009303)。
MILLTFSTGRRLDFVHHSGVFFLQTLLWILCATVCGTEQYFNVEVWLQKYGYLPPTDPRMSVLRSAETMQSALAAMQQFYGINMTGKVDRNTIDWMKKPRCGVPDQTRGSSKFHIRRKRYALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENGKRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFLAHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQYMETDNFKLPNDDLQGIQKIYGPPDKIPPPTRPLPTVPPHRSIPPADPRKNDRPKPPRPPTGRPSYPGAKPNICDGNFNTLAILRREMFVFKDQWFWRVRNNRVMDGYPMQITYFWRGLPPSIDAVYENSDGNFVFFKGNKYWVFKDTTLQPGYPHDLITLGSGIPPHGIDSAIWWEDVGKTYFFKGDRYWRYSEEMKTMDPGYPKPITVWKGIPESPQGAFVHKENGFTYFYKGKEYWKFNNQILKVEPGHPRSILKDFMGCDGPTDRVKEGHSPPDDVDIVIKLDNTASTVKAIAIVIPCILALCLLVLVYTVFQFKRKGTPRHILYCKRSMQEWV(SEQIDNO:33)描述了MMP16氨基酸序列(MMP16：GENBANK登录号AB009303)。
用于大肠杆菌(E.coli)表达的优化的人NME7-AB序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQIDNO:34)描述了NME7-AB核苷酸序列。
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:35)描述了NME7-AB氨基酸序列。
GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAC(SEQIDNO:36)描述了人MUC1受体的近膜部分(membraneproximalportion)。
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:37)描述了“N-10“，其在PSMGFR的N端缺失10个氨基酸。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQIDNO:38)描述了包含SEQIDNO:37的氨基酸序列的N端邻近部分的氨基酸序列。
GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQIDNO:39)描述了MUC1的自聚集区域。
HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS(SEQIDNO:40)描述了一种不相关的肽。
诱导细胞至较不成熟状态
近年来发现体细胞可以被重编程而回复至多能状态。编码转录因子OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、c-MYC和LIN28或蛋白质本身的基因可以被引入至体细胞中并且引起回复至多能状态。以前认为这些多能性因子中的许多是癌基因(致癌基因)。C-Myc是熟知的癌基因，并且类似地，已经示出Klf4诱导发育不良(Foster等人，2005)。曾经认为OCT4是确定多能干细胞的黄金标准。认为在细胞核中存在OCT4表示细胞是多能的，并且它的不存在表示细胞已经进入分化过程并且不能再分化为任何细胞类型。近年来，得知OCT4也存在于许多癌细胞的细胞核中，但不存在于正常的成熟细胞中。本发明人近年来发现MUC1跨膜蛋白质(SEQIDNO:1)的裂解形式MUC1*是功能强大的生长因子受体，其在估计75％实体瘤癌症中表达(Raina等人，2009)，并且也以这种“肿瘤发生”形式在所有多能干细胞(包括胚胎干(ES)细胞以及诱导型多能干(iPS)细胞)中表达(Hikita等人2008；Smagghe等人，2013)。本发明涉及MUC1*和MUC1*相关因子以及使用它们用于诱导或保持多能性或增强诱导多能性的效率的方法。
MUC1*是介导干细胞和癌细胞的生长和多能性的原始生长因子受体(primalgrowthfactorreceptor)。引入MUC1*相关因子诱导细胞回复至比起始细胞的状态较不成熟的状态。二价或二聚体形式的NM23是MUC1*生长因子受体的配体。中断NM23-MUC1*的相互作用诱导微RNA-145(miR-145)的表达，微RNA-145是向多能干细胞发信号使其失去多能性并且开始成熟过程的微RNA。
在多能性基因存在或不存在下，用属于蛋白质的NME家族的蛋白质，如二聚体NM23、二价NM23、或NME7处理体细胞引起成熟细胞回复至比细胞的起始状态较不成熟的状态。用多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的两种或更多种转染的成纤维细胞在它们被培养在包含二聚体NM23的培养基中时，以更快的速率和增强的诱导效率被诱导变为多能干细胞。没有用任何多能性基因转染但被培养在二聚体NM23中的细胞表达Oct4并在数天内回复至干细胞样形态。此外，用识别MUC1*的PSMGFR部分的二价抗体处理的体细胞也回复至比起始细胞较少分化的状态。因此，二价MUC1*配体，如二聚体NME家族蛋白质，具体地具有用于MUC1*的两个结合位点从而使MUC1*二聚的NME7，以二聚体形式的NME家族成员或针对PSMGFR区域的抗体促进未分化的干细胞的生长，以及诱导细胞回复至较不成熟状态，其中，可以回复至较不成熟状态的细胞选自包含全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞以及分化的细胞的组。
除了使成熟细胞回复至较不成熟状态或进一步回复至多能状态，我们也已经证实用MUC1配体(如NM23二聚体或NME7)处理干细胞引起干细胞回复至较不成熟状态，即，更多能的状态。
干细胞救治(恢复、挽回，rescue)
由它们不能适当分化所证实，干细胞系往往“变得糟糕”。例如，研究者可以使用可被引导分化为心肌细胞的干细胞系几个月，然后分化效率开始下降并且最终细胞系停止工作。当测定细胞系中典型的多能性标记物的存在时，方便的表面标记物像Tra1-60、SSEA4或Rex-1的表达降低是轻微的。然而，如果然后测定这些细胞中MUC1*的存在，我们发现存在MUC1*的最小表达。用NM23二聚体或NME7处理这些“多能”干细胞(iPS或ES)引起MUC1*的表达急剧增加，其与多能性标记物的表达增加相一致。在实施例14、图40-44中详细说明了研究本发明的该方面的一些实验。一旦用NM23二聚体或NME7处理细胞，这些细胞以比起始细胞显著更高的效率分化。
由于干细胞阶段性分化为成熟的成体细胞，所以在使它们分化为成熟细胞之前，没有必要使所有细胞回复至多能干细胞状态。可以使细胞从过渡状态(中间状态，interimstate)分化为期望的细胞类型。因此，可以仅诱导细胞回复至较不成熟状态，由此它们能够分化为期望的细胞类型或组织类型。一些是指过渡状态，作为预iPS状态的较不成熟状态。该技术被称为“转分化”以及有时被称为“直接分化”。例如，体细胞或成熟细胞(如成纤维细胞或成皮细胞)可以被诱导变得有些多能，然后被引导分化或允许分化为一些期望的细胞类型(Iede等人2010；Efe等人，2011)。例如，可以使心肌成纤维细胞变为较不成熟状态，然后使其分化为跳动的(beating)心肌细胞。在其他情况下，从与期望的最终细胞类型同系的细胞开始是有利的。这样，细胞仅回复至早于一些决策点(临界点，decisionpoint)的较不成熟状态，然后被引导分化为期望的细胞类型。
用于引导分化为心肌细胞、神经元细胞、胰岛细胞等的方法是本领域技术人员已知的。需要克服的障碍包括引导分化(directeddifferentiation)的效率非常低以及引入诱导多能性的试剂的质粒和病毒载体的使用。诱导细胞回复至较不成熟状态的蛋白质试剂增加诱导效率和/或增加引导分化的效率，这将解决迄今为止防止干细胞疗法的临床应用的这些问题。可以将NM23和/或其他MUC1*相关因子引入至细胞中以诱导它们变得不太成熟或更加像干细胞。可以单独或与其他因子结合使用NM23来诱导细胞变得更像干细胞。在一个实施方式中，提供了二聚体形式或二价形式的NM23至细胞以诱导细胞变得较不成熟。在其他实施方式中，与诱导细胞变得更像干细胞的其他基因、蛋白质、或小分子一起添加NM23(H1或H6二聚体或NME7)。由该干细胞样或半多能状态，仅通过将细胞放置在期望的细胞类型的细胞环境中或将影响诱导的细胞分化为期望的细胞类型或组织类型的因子环境中，可以允许诱导的细胞分化为期望的细胞类型。
在一个实施方式中，被诱导变得较不成熟的细胞是存在于宿主动物或人类中的细胞。在一些情况中，在全身(系统地)添加诱导细胞变得较不成熟的因子。在其他情况下，局部添加诱导细胞变得较不成熟的因子。为了有助于局部引入这些因子，可以将诱导因子浸渍或附着至，例如加快伤口愈合的敷料(dressing)。可替代地，可以局部、单独、或在载体材料中注射它们，该载体材料可以是水凝胶或其他材料。也可以将诱导因子附着至可以被局部施用、手术植入或咽下(吞咽、吸收，ingest)的生物相容材料。通过将诱导细胞变得较不成熟的因子引入至关节可以有助于软骨修复。通过诱导自身脑细胞(局部脑细胞)回复至由此它们能够分化为功能性脑细胞的较不成熟状态，可以治疗遭受神经退行性疾病如Alzheimer’s或Parkinson’s疾病的人。
本发明还包括使诱导细胞变得较不成熟的因子附着至执行无关功能的基底，如用于血管修复的支架、将两片物质支撑在一起同时促进间隙内细胞再生的带状材料、在结构上或结构内成形组织的形成的支架，被图案化(例如，用于神经和其他生物结构形成)的基底。本发明进一步包括使诱导半多能状态的因子附着至用于生成结构化细胞和组织(如构成眼睛的那些)的基底。
在一些情况中，可以同时或在稍后时间添加引导预iPS细胞分化的因子至被诱导变得较不成熟的细胞部位。在其他情况中，没有添加引导分化的因子。相反，依靠局部(local)环境分泌的因子引导诱导细胞分化为期望的细胞类型或组织类型。
在一个优选的实施方式中，诱导细胞变得较不成熟的因子是MUC1*相关因子，包括但不限于二价的抗-MUC1*抗体和抗体样蛋白质、增加MUC1裂解的酶或试剂、以及引入的增加MUC1或NM23(H1或H6二聚体或NME7)的表达的基因。本发明包括引入编码MUC1裂解产物的核酸，该MUC1裂解产物的胞外结构域基本上由PSMGFR序列组成，该PSMGFR序列是膜近端的大约45个氨基酸。在一个特别优选的实施方式中，除了使用NME7时(因为它是具有两个MUC1*结合位点并且能够使其二聚的天然“二聚体”)，MUC1*相关因子是以二价形式或二聚体形式的NM23。可以单独或与其他多能性诱导因子(包括但不限于OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、c-MYC和/或LIN28)一起添加诱导细胞变得较不成熟的MUC1*相关因子。
哺乳动物中MUC1的序列同源性
MUC1近膜部分在哺乳动物中是高度保守的。人MUC1的近膜部分是：N-GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAA SRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAC(SEQIDNO:36)。
我们之前示出了MUC1*激活配体NM23结合至包含序列QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQIDNO:37)的MUC1*的一部分，在我们之前的专利申请中也作为“N-10”被提到，其在PSMGFR的N端缺失10个氨基酸。该MUC1的部分在具有58％同一性的人和小鼠之间是72％同源性。包含序列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQIDNO:38)的N端邻近部分在具有47％序列同一性的人和小鼠之间是71％同源性。我们之前示出的MUC1的部分是自聚集区域GGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQIDNO:39)，在具有69％同一性的人和小鼠之间是85％同源性。
由于良好的序列保守性，识别人MUC1*受体的配体也识别小鼠MUC1*受体。例如，以二聚体形式或二价形式的人NM23结合至小鼠胚胎干细胞上的MUC1并且能够生长，同时保持以及诱导多能性。在基本干细胞介质(NM)中添加人NM23二聚体完全消除了对于LIF的需要。此外，小鼠ES细胞在LIF中的生长增加了表达多能性标记物的细胞的百分比，并且还增加了本身是多能性因子的MUC1的表达。因此，在不存在任何其他的生长因子下，以二聚体形式或二价形式的人或小鼠NM23促进小鼠胚胎干细胞或造血干细胞的生长和多能性。此外，人或小鼠NM23在小鼠体细胞中诱导多能性。除了天然配体NM23，识别MUC1的近膜部分的二价抗体在小鼠细胞中促进和保持以及诱导多能性。由于MUC1的近膜区域的良好的序列保守性，本发明包括使用识别大约50个近膜氨基酸的NM23以及二价抗体，用于在哺乳动物细胞中和一般的哺乳动物中生长、保持和诱导多能性。
本发明还包括使用MUC1*相关因子，其包括蛋白质因子、编码它们的基因、或影响它们的表达的小分子，以诱导或改善生成iPS细胞的效率。我们已经示出MUC1跨膜蛋白质的裂解形式-MUC1*-是介导癌症和多能干细胞的生长的原始生长因子受体。MUC1*胞外结构域和它的激活配体NM23之间的相互作用的完全中断对多能干细胞是致死的(Hikita等人，2008)，而用较低浓度的这些抑制剂处理诱导了分化。通过用抗-MUC1*Fab处理阻断NM23诱导的MUC1*受体的二聚或通过添加具有与MUC1*胞外结构域相同序列的合成肽从而竞争性地抑制NM23和它的靶MUC1*胞外结构域之间的相互作用，特异地中断了MUC1*和NM23之间的相互作用。这些发现表明MUC1-NM23途径是多能性的关键。NM23是激活MUC1*的配体(Mahanta等人，2008，Hikita等人，2008；Smagghe等人，2013)(SEQIDNO:12-17、22-23、和34-35)。除了在抑制分化的同时刺激多能干细胞生长的能力，已经报告了NM23诱导已知的多能性因子c-Myc的转录(Dexheimer等人，2009)。此外，通过NM23或二价抗-MUC1*抗体对MUC1*的刺激激活MAP激酶扩散(proliferation)途径，其增加细胞存活率(Mahanta等人，2008)。NANOG表达诱导多能性；肿瘤抑制剂p53抑制Nanog的表达(Lin等人，2007)。因此，通过抑制p53降低或消除了对于诱导多能性的NANOG的需要。已经示出MUC1细胞质尾(MUC1-CT)异位表达的72氨基酸片段存在于癌细胞的细胞核中，其中，它结合至p53启动子(Wei等人，2007)。可以与其他多能性诱导因子组合使用MUC1-CD(如SEQIDNO:11中所示的)的大约72个氨基酸片段来诱导或增强iPS细胞生成。然而，该肽不对应于天然生成的MUC1物质，因此可能产生不期望的效应。本发明人公开了MUC1*转移至细胞核(实施例1和9，和图6)，因此单独或与其他多能性诱导因子组合使用来诱导或增强iPS细胞生成。为了支持这个方法，已经报告了调节MUC1、它的裂解酶和/或它的激活配体NM23转录的核心组多能性基因中的几种基因(Boyer等人，2005)。OCT4和SOX2结合至MUC1启动子并且也结合至它的裂解酶MMP-14的启动子。SOX2和NANOG结合至NM23启动子。假设MUC1*是保持hESC的关键，并且是关键多能性基因的靶向物，我们公开了可以使用引入的MUC1*或增加MUC1裂解成MUC1*形式的试剂与它的激活配体NM23取代一些或所有之前确定的多能性诱导因子来诱导或增强iPS细胞的生成。
本发明公开了新的试剂和方法，包括MUC1*和它的配体，用于诱导细胞回复至较不成熟状态以及甚至回复至多能状态。这些试剂和方法用于在体细胞或成熟细胞中诱导多能性。可替代地，它们可以被用于诱导细胞至较不成熟状态，其中，起始细胞是成熟细胞、祖细胞或部分分化的细胞。在本发明的另一方面，它们被用于增加在成熟细胞中诱导多能性的效率。在本发明的又一方面，它们被用于将未成熟细胞保持在未成熟状态。在本发明的另一方面，它们被用于抑制分化。在本发明的另一方面，这些试剂和方法用于将干细胞保持在多能状态。
本发明涉及通过向成熟细胞或稍微分化的细胞中引入影响MUC1*和它的相关因子的表达的基因或基因产物来逆分化或保持干细胞样特征。MUC1*是跨膜蛋白质MUC1的裂解形式。MUC1*相关因子包括但不限于裂解MUC1的酶、MUC1*激活配体还有影响MUC1或MUC1*的表达的转录因子。本发明还涉及引入用于MUC1*或MUC1*相关因子的基因或基因产物至成熟细胞或稍微分化的细胞，其将在那些细胞或它们的后代中诱导多能性或干细胞性(stem-ness)。本申请描述了它们在干细胞中保持多能性的用途。可以与已知诱导多能性的一种或多种基因或基因产物(包括OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、c-MYC和LIN28)组合、或者取代它们，添加影响MUC1*或MUC1*相关因子(如NM23-H1二聚体或NM23-H7单体)的表达的试剂。
已经示出转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc或Oct4、Sox2、Nanog和Lin28组合的强制表达引起成熟细胞回复至多能状态(Takahashi和Yamanaka，2006)。诱导多能性的转录因子中的每种调节大约十几种(adozen)基因的转录。其中一些是发明人已经确定为MUC1相关因子的几种。OCT4和SOX2结合至MUC1启动子本身。SOX2和NANOG结合至NM23(NME7)启动子。NM23(也称为NME)之前被本发明人确定为MUC1*的激活配体(Mahanta等人，2008)。NM23-H1(也称为NME1)结合至MUC1*胞外结构域，并且如果NM23-H1以二聚体形式；浓度较高或没有使NM23优选形成二聚体的突变时，诱导MUC1*的二聚，NM23野生型是不结合至MUC1*或使其二聚的六聚体。因此，仅二聚体形式的NM23-H1在细胞中诱导多能性。NM23-H6，也称为NME6，也可以是二聚体并且如此结合至诱导多能性的MUC1*生长因子受体并使其二聚。NME7也是MUC1*的激活配体。然而，单体NME7具有用于MUC1*胞外结构域和使MUC1*二聚的两个结合位点，因此诱导和保持多能性。OCT4和SOX2都结合至用于MMP16的启动子，本文中公开的MMP16是MUC1的裂解酶。OCT4、SOX2或NANOG也结合至用于裂解酶MMP2、MMP9、MMP10、ADAMTSL-1、ADAMTS-4、ADAM-17(一种MUC1裂解酶)、ADAM-TS16、ADAM-19和ADAM-28的启动子位点。可以上调这些裂解酶中的一些或所有以增强MUC1裂解至MUC1*形式，而诱导多能性或保持多能性(Boyer等人，2005)。
我们之前关于仅表达MUC1的裂解形式MUC1*的胚胎干细胞的工作示出它的胞外结构域的二聚化刺激生长并且抑制分化(Hikita等人，2008)。通过使用二价抗-MUC1*抗体、重组的NM23、或优先形成二聚体的突变体NM23(S120G)使MUC1*胞外结构域二聚实现了这些效应(Kim等人，2003)。使用单价抗-MUC1*Fab抑制MUC1*胞外结构域在几小时内是致死的。这些发现表明MUC1*是保持干细胞或引起细胞回复至较不成熟状态的显著因子。此外，OCT4和SOX2结合至MUC1基因启动子并且也结合至它的裂解酶的启动子。SOX2和NANOG结合至NM23(NME7)启动子。由于阻断MUC1*的胞外结构域对hESC是致死的，从而伴随的是多能性基因OCT4、SOX2、和NANOG都诱导MUC1、它的裂解酶和它的激活配体的表达。对于单独的MUC1*或此外还有它的裂解酶和/或激活配体NME7、NME1、NME2、NME6或使MUC1或MUC1*的PSMGFR表位二聚的抗体，通过转染基因或引入基因产物可以取代已经示出诱导多能性的基因或基因产物中的一种或多种。
本领域的技术人员熟悉的是，可以用增强它们进入细胞的能力的部分或序列修饰编码多能性基因的核酸或蛋白质或肽本身。类似地，信号序列可以引导转染的基因或基因产物的定位。作为SEQIDNO:2-4给出信号序列的实例。本发明考虑使用基因和蛋白质修饰至以上描述的任何多能性基因以增强编码蛋白质的核酸或蛋白质本身进入细胞，其中，蛋白质包括MUC1、MUC1*、NME7、NME1、NME6和它们的变体。MUC1*一般被描述为跨膜受体MUC1的截短形式，其中，大多数的胞外结构域不存在以及剩余的胞外结构域包含大多数或所有的PSMGFR序列。然而，根据组织类型或细胞类型，MUC1可以被不同的酶裂解。例如，在干细胞中，MUC1被MMP14、MMP16和ADAM17裂解为MUC1*，而在乳腺癌T47D细胞中，MUC1裂解以MMP16为主，以及在DU145前列腺癌细胞中，其被MMP14裂解。因此，MUC1*胞外结构域基本上由PSMGFR序列组成，但是可以在N端进一步延伸以包含另外的氨基酸。本发明考虑MUC1*的N端区域可以被截短或延伸至多九(9)个氨基酸，而基本不改变它的活性。示例为SEQIDNO:5的MUC1*和胞外结构域基本由SEQIDNO:6、7、8和9给出的序列组成的变体是优选的。
MUC1、MUC1*、或相关因子，包括以上列出的那些，可以构成一种或多种诱导多能性的基因或基因产物，并且可以被用于诱导多能性或至较不成熟状态的过渡或保持该状态。
本发明考虑使用任何成熟细胞，包括但不限于体细胞，其包括但不限于成纤维细胞、成皮细胞、血细胞、造血祖细胞、神经细胞(nervecell)和它们的前体和实际上比多能干细胞分化更多的任何种类的细胞。在一种情况中，用编码MUC1蛋白质的基因转染体细胞，如成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、血细胞或神经细胞，其辅助诱导干细胞样特征以及在一些情况中诱导后代变为多能干细胞。在本发明的另一方面，将MUC1*的基因转染细胞以诱导回复至较不成熟状态或干细胞样状态，以及在一些情况中诱导实际的多能干细胞的生成。可以单独或与其他基因(其辅助诱导多能性或干细胞样特征)组合将MUC1或MUC1*基因中的每种引入至细胞。例如，将编码MUC1或优先编码MUC1*的DNA与编码OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4、和/或c-MYC的基因中的一种或多种一起引入至细胞中。将编码截短形式的MUC1、优选编码MUC1*的DNA与编码OCT4、SOX2、NANOG、和LIN28的基因中的一种或多种一起转染至成纤维细胞(Yu等人，2007)。在另一个实施方式中，将编码截短形式的MUC1、优选编码MUC1*的DNA与编码OCT4、SOX2、KLF4、和c-Myc的基因一起转染至体细胞、成纤维细胞、或其他细胞中(Takahashi等人，2007)。类似地，将编码MUC1*和/或它的激活配体NM23的DNA转染至细胞中以诱导回复至较不成熟状态。在一个优选的实施方式中，NM23家族成员是优选形成二聚体的NME1或NME1的S120G突变体、二聚体形式的NME6、或NME7。在一个优选的实施方式中，将NME家族成员添加至细胞培养基中。在一个更优选的实施方式中，NME家族成员是可以可选地由亚基(subunit)A和B组成、缺乏“M”前导序列的NME7：NME7-AB(SEQIDNO:34-35)。可以与其他基因如OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4、和/或c-MYC一起引入MUC1*和/或NM23至细胞中以诱导多能性或干细胞样特征。也可以单独或与其他基因一起将编码识别MUC1*或MUC1的抗体的DNA转染至细胞中，以在细胞或它们的后代中诱导干细胞特征。如果分泌，那么抗-MUC1*抗体将二聚并因此激活MUC1*受体，其将作用于促进或保持干细胞样特征。可替代地，外源添加抗-MUC1*抗体至经受诱导至较不成熟状态的细胞。在一个优选的实施方式中，将MUC1*抗体附着至细胞所附着的表面。
类似地，将因子如核酸、蛋白质、修饰的蛋白质或影响MUC1、MUC1*或它们的相关因子的表达的小分子引入至细胞，以诱导干细胞特征或诱导返回至多能性。例如，将用于MUC1裂解酶MMP14、MMP16、MMP2、MMP9、MMP10、ADAMTSL-1、ADAMTS-4ADAM-17(一种MUC1裂解酶)、ADAM-TS16、ADAM-19和ADAM-28的基因或基因产物引入至细胞，以诱导多能性或类似的特征。
在另一个实施方式中，添加非蛋白质试剂至细胞中，以诱导或增强多能性的诱导。例如，佛波酯佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(phorbol12-myristate13-acetate)是增加MUC1裂解至MUC1*的小分子(Thathiah等人，2003)。在本发明的一个方面，添加佛波酯至经受转化至多能性的细胞中，以诱导或增加iPS生成的效率。
在另一个实施例中，单独或与其他诱导或保持干细胞样特征或多能性的基因一起添加与MUC1或MUC1*相互作用的配体至体细胞、皮肤成纤维细胞(dermalfibroblast)、成纤维细胞或稍微分化的细胞以诱导多能性。例如，将编码OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4、和/或c-MYC的一种或多种基因转染至成纤维细胞或其他细胞，然后在激活MUC1或MUC1*的配体存在下培养。MUC1*的二聚、蛋白质配体是优选的。在一个优选的实施方式中，添加二价抗-MUC1*抗体至已经用影响细胞或它们的后代变为多能干细胞的基因转染的细胞中。
在一个优选的实施方式中，作为编码它的基因、作为蛋白质本身或作为带有前导序列(主导序列，leadersequence)如聚精氨酸束(poly-argininetract)的蛋白质，将NM23(NM23-H1、NM23-H2、NME6、或能够使MUC1*胞外结构域二聚的它们的变体、NME7或NME7-AB)引入至细胞，以有助于进入细胞，以帮助诱导或保持多能性。本发明人近年来示出当NM23由多能干细胞(和癌细胞)分泌时，它是MUC1的裂解形式MUC1*的激活配体-并且触发MAP激酶的扩散途径。示出MUC1*的NM23刺激促进多能hESC的生长并且抑制它们的分化(Hikita等人，2008)。NM23还诱导c-Myc的转录(Dexheimer等人，2009)并且取代对于c-MYC的需要。要么以它的自然状态外源添加NM23以激活MUC1*生长因子受体，要么与聚精氨酸束外源添加NM23以有助于其进入细胞和细胞核，在那里它诱导c-MYC的表达。可以作为编码核酸或作为具有或不具有修饰的有助于进入细胞的表达蛋白质添加NM23(NME)。可以以它们的自然状态或以有利于二聚状态的突变体形式(如S120G突变)使用NME-H1或NME-H6。作为单体蛋白质，可选地作为由编码A和B区域的构建体表达但缺乏M前导序列的人重组蛋白质(我们称为NME7-AB(SEQIDNO:34-35))使用NME7。
在本发明的另一方面，添加结合至MUC1*胞外结构域(PSMGFR)的二价抗体或二聚MUC1*配体(如NM23)、或编码它们的基因至表达MUC1*的细胞以诱导多能性，增加诱导多能性的效率，保持多能性或抑制分化。向其中添加这些MUC1或MUC1*相互作用蛋白质的细胞可以是天然存在的细胞或已经添加诱导干细胞样特征的基因或已经进入分化过程或可以是干细胞的那些细胞。
可以将用于诱导多能性的基因引入到相同或不同的质粒上，其可以是慢性病毒(lentiviral)载体驱动或腺病毒载体或任何整合或非整合型病毒或非病毒载体、或有助于引入这些基因至期望细胞的任何其他系统。
在许多情况下，优选通过引入蛋白质本身而不是编码它们的核酸或基因实现蛋白质诱导多能性的作用。本发明包括用于诱导干细胞样特征或多能性的可以由以它们的自然状态或被前导序列(如聚精氨酸束)修饰的基因产物、蛋白质取代的基因，以允许进入细胞。引入这些基因的产物，即，与转染基因的一种或多种产物相互作用的蛋白质或其他蛋白质，至细胞以诱导或保持多能性或其他干细胞样特征。
在其他情况中，引入合成试剂(如小分子)在成熟或分化细胞中诱导干细胞性是有益的(Lyssiotis等人，2009)。在本发明的一方面，添加小分子至直接或间接诱导基因(诱导多能性)的转录的细胞中。在其他情况中，添加直接或间接增加MUC1*的产生的小分子。在一个实例中，这些小分子增加MUC1裂解至MUC1*形式，其是干细胞的特征。例如，佛波酯是增加MUC1至MUC1*的裂解的小分子，所以当被添加至细胞中时，它通过生成MUC1*促进多能状态的诱导或保持。
P53抑制剂的使用
P53，也称为肿瘤抑制剂，促进细胞凋亡。因此，当培养干细胞或在体细胞或其他细胞中诱导多能性时，抑制p53是有利的。本发明预期使用p53抑制剂(suppressor)与其他试剂和本发明的方法来保持干细胞性或诱导干细胞样或多能特征。可以通过多种方法抑制P53。小分子，如Pifithrin-μ，抑制p53的促凋亡效应(Strom等人，2006Sep；Komarov等人，1999)，因此可被可选地添加至细胞以增加多能性的诱导效率或保持干细胞性。在一个优选的实施方式中，与上调MUC1或MUC1*的基因或基因产物一起使用p53抑制剂，包括但不限于MUC1或MUC1*基因或基因产物、它们的激活配体和它们的裂解酶。
用于抑制p53活性以增加诱导多能性的效率或保持干细胞性的另一种方法是引入MUC1*蛋白质至细胞培养基(细胞培养物，cellculture)中。可以通过添加聚精氨酸束修饰MUC1*蛋白质或其部分，如仅胞质结构域，以有助于进入细胞。已经报告了MUC1的单独的细胞质尾(MUC1-CD)的过表达导致它向细胞核的转移，发现在细胞核中它结合至p53启动子。这些研究不能确定MUC1-CD是否下调或上调p53。本发明还涉及通过MUC1*的异位表达阻遏p53，以增加诱导多能性或其他干细胞样特征的效率。可以通过将基因插入细胞，通过外源添加蛋白质本身或通过添加可选地被聚精氨酸束修饰的MUC1*蛋白质引入MUC1*。
在本发明的一个方面，将MUC1*配体添加至细胞培养基中；细胞，可以是体细胞、分化的或稍微(somewhat)分化的细胞，与介质接触几天至几周的过程，直到细胞已经恢复至期望的状态，即比起始细胞较不成熟的状态。在一个优选的实施方式中，MUC1*配体是以二聚体形式的NME1。在一个更优选的实施方式中，MUC1*配体是可以缺乏“M”前导序列的单体NME7(NME7-AB)。使细胞仅与MUC1*配体接触足以使细胞回复至较不成熟状态。在一个优选的实施方式中，待回复至较不成熟状态的细胞与两种不同类型的MUC1*配体接触：一种能够使细胞附着至表面，如抗MUC1*抗体，以及另一种是溶液或介质中不含的配体，如二聚体NM23-H1或NME7。可选地，也可以将rho激酶抑制剂添加至细胞培养基中。在图7A、B、图9、图13、图15、图17和图26中可以看到通过使细胞与MUC1*配体接触使细胞回复至较不成熟状态的证据。
NME引起MUC1和MUC1*的表达
在NM23-H1二聚体或NME7中的培养细胞引起MUC1和具体地MUC1*的表达增加。MUC1或MUC1*的表达或活性增加使细胞回复至较不成熟状态，其可以是多能状态。通过检测多能干细胞状态的标记物(如OCT4、SSEA4、Tra1-60、REX-1、NANOG、KLF4和其他本领域技术人员已知的)的伴随增加记录了这些证据。RT-PCR测量示出培养在NM23介质中的细胞具有增加的MUC1表达；因为PCR测量RNA转录，它不能判断蛋白质是否被翻译后修饰，如裂解产生MUC1*。然而，免疫细胞化学实验清楚地示出了用NM23-H1二聚体或用NME7培养细胞或与细胞接触引起MUC1*表达量的急剧增加。例如，当用三(3)种或四(4)种多能性诱导基因(也称为“Yamanaka诱导因子”)(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)转染以及通过标准方法在FGF介质或在NM23介质(NM23-H1的二聚体形式)中培养，然后通过RT-PCR测定人成纤维细胞以量化多能性标记物以及MUC1和MUC1*配体NME7的表达水平时，观察到随着细胞增加多能性标记物的表达，存在MUC1和MUC1*配体NME7的表达的相关增加。在图21中可以看出并且在实施例11中详细说明了示出该作用的几个RT-PCR实验的代表图。此外，进行免疫细胞化学实验用于测定MUC1*以及多能性标记物的存在。实验示出细胞与MUC1*配体(如NM23-H1二聚体或NME7)接触引起MUC1*表达的增加，伴随着一些多能性标记物表达的增加，如Tra1-60。代表性实验数据示于图40-图44中。
在本发明的另一个方面，通过细胞与MUC1*配体如NM23-H1二聚体、NME7、NME7-AB和/或抗MUC1*抗体接触，同时还与其他诱导多能性的生物或化学试剂接触，细胞回复至较不成熟状态以及进一步至多能状态。在一个优选的实施方式中，诱导多能性的试剂是选自包含OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28的组中的蛋白质本身、或编码它们的基因或核酸。已知选自以上组中的两种或多种多能性基因的异位表达将引起细胞回复至多能状态。在更成熟的细胞中诱导多能性的本领域的技术是使细胞表达一种或多种多能性基因，同时培养在包含bFGF并且有时包含bFGF和TGF-β的培养基中。诱导多能性(形成诱导型多能干(iPS)细胞)的效率非常低。
我们证实用NM23介质取代bFGF介质大大地改善了诱导多能性的效率。此外，使用饲养细胞可以取代细胞外基质蛋白质或它的片段的层或MUC1*配体的层。在一个优选的实施方式中，将经历诱导至较不成熟状态的细胞放置在识别干细胞上的MUC1*的抗-MUC1*抗体层上。表2(参见附图部分)示出用bFGF取代介质中的NM23导致多达iPS生成效率的100倍增加，其中通过生成的具有干细胞样形态的集落数除以需要产生该集落数的细胞数目计算得效率，其也被称为诱导效率(诱导率，inductionrate)。
在本发明的又一个方面，通过使细胞与增加MUC1或MUC1*的表达的生物试剂或化学试剂接触使细胞回复至较不成熟状态或多能状态。用多能性基因OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转染并且培养在包含成纤维细胞血清的介质然后培养在FGF介质(用于形成iPS细胞的标准实践)中的细胞引起MUC1表达增加，其与多能性标记物(如OCT4、Tra1-60等)的表达的预期增加一致。当引起多能性基因表达以及细胞在介质中与MUC1*配体接触或附着至表面时，得到MUC1表达的甚至更高的增加。然而，本发明考虑在悬浮液中或其他表面(包括用细胞外基质蛋白质、ECM蛋白质的片段如纤连蛋白片段、玻连蛋白、饲养细胞、癌细胞等涂覆的表面)上培养细胞。图21示出一个这样的实例，当用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转染成纤维细胞并且将其培养在根据用于形成iPS细胞的标准方法的FGF介质中时，20天后MUC1表达增加4.3倍。这示出当细胞过渡至较不成熟状态，MUC1表达增加。在包含MUC1*配体如NM23二聚体或NME7的介质中培养相同的细胞引起20天后MUC1表达增加大约10-100倍(图21)。多能性基因表达的大幅增加是由于细胞被培养在NM23二聚体培养基中。该结果示出使细胞与MUC1*配体接触诱导细胞回复至较不成熟状态并且超过转染的多能性基因的作用。
使人成纤维细胞经受用于诱导多能性的标准方法，其中，使用了一种或多种编码Yamanaka因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的基因。然而，为了测定本发明的方法对于增加iPS生成或独自诱导多能性的它们的能力，我们使用了包含NM23二聚体或NME7的培养基代替标准的bFGF。在实验的一种条件下，没有转染基因，但是将成纤维细胞培养在不含血清、NM23-S120G以二聚体形式或NME7作为唯一的外源添加生长因子的介质中。在实验的另一方面(另一臂、另一分支，anotherarm)，转染了一些或所有多能性基因。另一个实验的变化是要么在实验开始要么在第7天引入NM23介质，当根据标准实验方案时，应当将成纤维细胞介质(FM)变换为不含血清的包含4ng/mLbFGF的介质。在这个时间点，根据标准实验方案，将细胞移至成纤维细胞饲养细胞。完成这项(步骤)，但是此外，将NM23培养的细胞移至已经用小鼠单克隆抗-MUC1*抗体(称为MN-C3)涂覆的塑料培养板，MN-C3是发明人研发的用于使干细胞附着至表面。“MN-C3”(短手(shorthand)“C3”)和“MN-C8”(短手“C8”)是发明人研发出的特异性结合至MUC1*的小鼠单克隆抗体，因为它出现在人干细胞上。当表面被这些抗体中的一种涂覆时，它使人干细胞能够粘附，而多能人干细胞是非粘附的细胞。
通过照片、多能性基因的RT-PCR量化、免疫细胞化学和FACS表征得到的细胞以评估多能性标记物的存在；在第4天和第30天之间取出的细胞上进行表征。
培养在任一种不含血清介质中的NM23(二聚体)中，没有被任何基因转染的成纤维细胞回复至较不成熟状态，如它们形态的急剧变化所证实，在数天内从成纤维细胞形态变化至干细胞样形态。到第20天，在模拟转染细胞和实际的多能干细胞之间没有明显的区别。对多能性标记物的测量示出表达的细胞增加多能性标记物的水平。培养在FGF介质中的模拟转染示出在多能性标记物的形态或测量上没有变化。在培养在FGF介质中的可比较细胞(对比细胞、相当细胞，comparablecells)之前，被培养在NM23-S120G二聚体中的一些或所有多能性标记物Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog转染的细胞持续表达多能性标记物，并且具有比标准FGF方法高得多的诱导多能性效率。进行了几种实验，并且在以下描述代表性数据。
图7示出在第4天拍摄的培养在不含血清的NM23(二聚体)介质中没有被任何基因转染的(A)或培养在添加试剂但没有基因的模拟转染(B)中的成纤维细胞的照片；图7的画面C和D示出培养在成纤维细胞介质中没有转染或模拟转染的对应的细胞。应当注意的是培养在NM介质中的成纤维细胞在第4天变化，从而它们看起来不像成纤维细胞并且移动至集落样集群，但是培养在包含血清而没有NM23的成纤维细胞介质中的成纤维细胞则并非如此。图8示出，当或只有当它们被培养在NM23介质中时(A和B)，而不是当它们被培养在成纤维细胞介质中时(C)(其是标准实验方案)，用所有四种Yamanaka基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)转染的成纤维细胞也是在第4天示出形态与集群(cluster)和集落样(colony-like)形态上更引人注目的变化。根据标准步骤，在第5天从塑料板移除细胞并且将其移至灭活的人或小鼠饲养细胞上，然后在两天后(第7天)将成纤维细胞培养基换为标准bFGF培养基。图9示出第11天细胞的照片，该细胞没有被任何基因转染，但是被培养在NM23不含血清的介质中并且被放置在未涂覆的塑料上(A)，被移至灭活的小鼠饲养细胞(MEF)(B)，被转移至用抗MUC1*MN-C3抗体涂覆的塑料(C)或被转移至抗体涂覆的表面并且其中添加了rho激酶抑制剂至培养基(D)。从照片可以看出，细胞的集群和集落已经浮出塑料表面，与它们已经变为干细胞样的观点一致，因为干细胞是非粘附性的而成纤维细胞非常好地粘附至塑料。已经被转移至饲养细胞的细胞失去了它们的干细胞样形态。但是没有用任何基因转染，但是培养在NM23培养基中以及移至用抗MUC1*抗体涂覆的表面(VitaTM板)的细胞(图9，C，D)保持附着在表面并且呈现干细胞样集落。这些结果与在NM23存在下培养细胞增加MUC1的裂解形式的表达，引起细胞粘附至用同源抗体涂覆的表面的观点一致。第11天，没有用基因转染但是被培养在成纤维细胞培养基中，然后被转移至灭活的饲养细胞并且切换至包含bFGF的培养基的相应细胞，无论是被转移至小鼠饲养细胞(A)还是人饲养细胞(B)，都没有示出干细胞样形态的迹象(图10)。在第11天，也拍摄已经用所有四种多能性基因OSKM转染，从实验开始培养在NM23介质中(一直标记为A)(画面A和B)或被培养在成纤维培养基中直到第7天然后切换至NM23介质(更换地标记为R)(画面C和D)的细胞的照片。附图示出对于培养在NM23中然后被转移至抗MUC1*抗体表面的OSKM转染的细胞(A)，和当细胞被转移至人饲养细胞表面(C)时，干细胞样集落形成。图12反映了对于转移至人饲养细胞上的细胞的这个相同优势。图12A示出培养在bFGF介质中并且在第5天转移至人HS27饲养细胞上的OSKM转染细胞的干细胞样形态，但是对于转移至小鼠饲养细胞的细胞没有这么多(B)。图13示出没有被转染且被培养在NM23介质中的细胞(其然后被转移至用MN-C3抗体涂覆的塑料)具有干细胞样集落，相比于低密度(B)，当以高密度(A)涂布细胞时，集落发展更多(更快)，在细胞被转移至小鼠饲养细胞(C)后，没有可见的集落，但是细胞被转移至人饲养细胞(D)后，小的干细胞样集落可见。对于培养在成纤维介质中然后在第7天切换至NM23介质，并且涂布在未涂覆的塑料上的未转染细胞(图14A)，或对于培养在bFGF介质中的未转染细胞，无论是被转移至小鼠饲养细胞(B)还是人饲养细胞(C)的未转染细胞，都没有出现干细胞样集落。图15示出被所有四种多能性基因OSKM转染，并且从开始被培养在NM23中的细胞在被涂布在用抗MUC1*抗体MN-C3涂覆的塑料(画面A)上时，形成大的干细胞样集落，但是涂布在未涂覆塑料上的相同细胞则没有(B)。然而，当第14天细胞被转移至饲养细胞时，大的干细胞样集落确实出现(图15C，图16A-D)，其中，细胞被培养在NM23介质中(A，B)或bFGF介质中(C，D)。图17示出甚至在不存在任何异位表达的基因下，NM23诱导体细胞在第19天回复至干细胞样状态。10X放大(图)示出对于连续培养在NM23中的细胞，成纤维细胞形态的完全丧失(B)，并且示出也具有大的细胞核与细胞质比值的干细胞的特征鹅卵石模式(characteristiccobblestonepattern)。对于其中细胞被培养在bFGF介质中的模拟转染，没有观察到至较不成熟状态的这种过渡(转变，transition)(图18A，B)。对于连续培养在NM23介质中或在第7天用NM23介质取代成纤维培养基的比较(图19)示出用OSKM转染的细胞在被连续培养在NM23中时回复至最佳的干细胞样状态(A，B)。到第19天，用OSKM转染但培养在bFGF介质中、第5天后培养在饲养细胞上的细胞也示出干细胞样集落的形成(图20A，20B)。
对于描绘在以上描述的附图中的细胞，也在多个时间点进行RT-PCR(实时PCR)，以量化主要的多能性基因如OCT4、NANOG、KLF4、和有时的SOX2的表达水平。用多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的三(3)种或四(4)种转染人成纤维细胞。可以看出，培养在NM23-H1二聚体(也是使MUC1*胞外结构域二聚的MUC1*配体)中的转染后4天的细胞表达增加量的多能性标记物OCT4、NANOG和KLF4，而在第4天培养在成纤维细胞培养基中的相同细胞仅示出OCT4小幅增加。因此，结论是MUC1*配体NM23诱导多能性或使细胞回复至较不成熟状态，其超过或在仅由于多能性基因转染的状态以上。同时，诱导回复至较不成熟状态的细胞还具有升高的MUC1和NME7、MUC1*配体的表达。回想一下，RT-PCR检测核酸，所以该测定不能区分MUC1和MUC1*，因为MUC1翻译后裂解产生MUC1*。第20天，经历用于诱导多能性的标准方法(其中，FGF培养基在第7天取代成纤维培养基(包含血清))的细胞示出多能性标记物OCT4、NANOG和KLF4的表达升高，以及MUC1和NME7的表达急剧升高。
这些结果示出多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导MUC1和MUC1*配体的表达。由我们之前的工作(Hikita等人)和本申请的图2，我们知道在多能干细胞中，基本上所有的MUC1裂解为MUC1*形式。因此，Yamanaka多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导MUC1*的表达。其中转染物(transfectant)被培养在NM23二聚体中的条件(情形)具有最高量的多能性标记物OCT4、NANOG、KLF4以及最高量的MUC1和NME7。此外，这些数据强有力证明MUC1和特别的MUC1*是多能性标记物。进行RT-PCR实验几次。对于每次实验，对于每种条件下三(3)个单独样品的每一个，重复测量三(3)次。GAPDH是中间对照，并且将数据绘制为倍数变化，归一化至对照，培养在成纤维细胞培养基中的未转染的人成纤维细胞。在实施例12和实施例14-15中描述以及在图21、22和图35-44中示出了示例性实验。
培养在成纤维细胞介质中的转染物在第4天示出小于2倍的Oct4、Nanog和Klf4的表达的升高，而用OSK转染并且被培养在NM23培养基中的细胞示出主要多能性基因的表达的明显升高。OCT4表达比用OSKM转染但被培养在成纤维细胞介质中的细胞升高70倍。比用所有四种多能性基因转染但被培养在成纤维细胞介质中的相同细胞，NANOG升高7倍，以及KLF4升高4.5倍。重要的是，我们注意到使细胞与MUC1*配体NM23接触引起MUC1表达的4.5倍升高。图21示出使细胞与引起OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC表达的核酸接触也使MUC1的表达升高。与在这种情况下将细胞培养在MUC1配体(二聚体NM23-H1)中的7.8倍相比，用OSKM转染并且被培养在成纤维细胞培养基中至第7天，然后切换至包含bFGF介质的细胞通过20天使MUC1升高4.3倍。当将细胞培养在NME7中时，也得到相同的结果，其中，以单体形式使用NME7。
MUC1*配体诱导多能性和MUC1*的表达。在以上描述的诱导多能性的实验中，观察到无论何时存在多能性标记物的表达的升高，存在MUC1、MUC1*和MUC1*配体NME7的表达的相关升高。图21，其示出在第4天(A)和第20天(B)进行的RT-PCR实验，示出该点。用多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的三(3)种或四(4)种转染人成纤维细胞。可以看出，培养在NM23-H1二聚体(也是使MUC1*胞外结构域二聚的MUC1*配体)中的转染后4天的细胞表达增加量的多能性标记物OCT4、NANOG和KLF4，而在第4天培养在成纤维细胞培养基中的相同细胞仅示出小幅增加。因此，结论是MUC1*配体NM23诱导多能性或使细胞回复至超过或在仅由于多能性基因转染的状态以上的较不成熟状态。同时，应注意的是诱导回复至较不成熟状态的细胞还具有升高的MUC1和NME7、MUC1*配体的表达(图21A)。回想一下，RT-PCR检测核酸，所以该测定不能区分MUC1和MUC1*，因为MUC1翻译后裂解产生MUC1*。第20天(图21B)，经历用于诱导多能性的标准方法(其中，FGF培养基在第7天取代成纤维培养基(包含血清)的细胞示出多能性标记物OCT4、NANOG和KLF4的表达升高，以及MUC1表达急剧升高和NME7表达的大约2倍升高。这些数据示出多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导MUC1和MUC1*配体的表达。由我们之前的工作(Hikita等人)和本发明的图2，我们知道在多能干细胞中，基本上所有的MUC1裂解为MUC1*形式。因此，多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导MUC1*的表达。其中转染物被培养在NM23二聚体中的条件具有最高量的多能性标记物OCT4、NANOG、KLF4以及最高量的MUC1和NME7。此外，这些数据强有力证明MUC1和具体的MUC1*是多能性标记物。进行RT-PCR实验几次。对于每次实验，对于每种条件三(3)个单独样品中的每个，重复测量3次。GAPDH是中间对照，并且将数据绘制为倍数变化，归一化至对照(培养在成纤维细胞培养基中的未转染的人成纤维细胞)。
进行免疫细胞化学实验，从而可以直接测量MUC1*。将之前培养在小鼠饲养细胞(MEF)层上的FGF中的iPS和ES细胞切换为培养在包含作为单独生长因子的NME7或NM23二聚体的不含血清的培养基中，不添加其他生长因子或细胞因子。随后的多能性标记物以及MUC1*的免疫细胞化学分析示出已经长期培养在FGF培养基(其驱使人多能干细胞从原始状态至始发态(Hanna等人，2010和Hanna等人，b，2010))的人胚胎干细胞(hES)和诱导型多能干细胞(hiPS)表现MUC1*的最小化表达，在被培养在NM23二聚体介质或NME7中后急剧升高(图40-44，实施例15)。在MUC1*配体(如二聚体NM23)中培养干细胞诱导多能人干细胞从始发态回复至较不成熟的原始状态(Smagghe等人，图6)。在MUC1*配体NME7或NM23(以二聚体形式)中培养细胞，多能干细胞导致原始状态标记物的较高表达和始发态标记物的较低表达。此外，免疫细胞化学实验示出培养在NM23二聚体中的女性干细胞回复至较不成熟状态，实际上更多能的状态，由在活性状态的两条X染色体表征。原始状态干细胞随后暴露于FGF培养基引起它们失去较不成熟的原始状态，并且进入分化更多的始发态(Smagghe等人，图7)。因此，在包含MUC1*配体(如NM23二聚体或NME7)的培养基中培养细胞引起细胞回复至较不成熟状态。
得到一致的结果，其基本上是：1)在NM23-H1二聚体或在NME7中培养细胞增加其中两种或更多种多能性基因异位表达的iPS生成的效率；2)在NM23-H1二聚体或NME7中培养细胞引起成纤维细胞回复至干细胞样状态，而无多能性基因的异位表达；3)在NM23-H1二聚体或NME7中培养细胞引起细胞表达的MUC1或MUC1*的量升高；和4)多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和/或c-Myc的强制表达引起细胞表达的MUC1或MUC1*的量升高。
在使用的多个Yamanaka多能性基因中的变型
在该组实验中，用所有四种多能性基因OSKM或三(3)种OSK或OSM转染人成纤维细胞，并且将其培养在标准培养基中或NM23-MM-A或NM23-MM-R中。为了进一步表征诱导变得多能的细胞的分子构成，在第5天将细胞从塑料转移至隔室玻片(chamberslide)，生长直到10天，然后染色用于多能性标记物Tra1-60的存在和用于使用DAPI的细胞核。
图23示出用OSKM转染并被培养在NM23-MM-A中的细胞。对于Tra1-60的绿色染色突出了已经被诱导至多能性的那些细胞。相反，图24示出当仅用OSK转染细胞并培养在NM23二聚体中时，对于多能性标记物Tra1-60，存在大量的阳性染色的细胞。在单一观点(singleview)中，没有允许检测4种或多种多能细胞的其他条件。图25示出使用标准培养基和所有四种多能性基因OSKM，仅可以定位一些细胞。
细胞和细胞源
本发明不旨在被细胞类型或细胞源限制。我们证实了使细胞与NM23-H1二聚体、诱导MUC1的二聚的NM23突变体或变体、或NME7接触诱导细胞回复至较不成熟状态，并且示出至较不成熟状态或完全多能状态的进程在一段时间内发生。除了使细胞与NME家族成员接触，我们示出使细胞与诱导一种或多种多能性基因的表达的生物试剂或化学试剂接触增加使细胞回复至较不成熟状态的效率。我们已经证实了使用胚胎干细胞和iPS细胞(其是完全的多能细胞)的这些发现。我们已经证实了使用成纤维细胞的这些发现。因此，示范细胞类型的该选择涵盖最原始的多能细胞至成熟细胞。本发明可以用于使几乎任何类型的细胞回复至较不成熟状态或完全的多能状态。起始细胞类型包括但不限于体细胞、来自脐带血的细胞、骨髓细胞、外周血细胞、动员后血细胞、造血干细胞、成皮细胞、成纤维细胞、神经元细胞、神经细胞、头发滤泡(hairfollisule)、间质干细胞和脑脊液的细胞。
在本发明的方法中使用的细胞可以源自多种来源中的任一种。可以由患者得到细胞用于自体用途，或由供体得到。
在一个优选的实施方式中，细胞是人类细胞。然而，我们已经证实我们可以在人NM23-H1二聚体或在NME7中使小鼠干细胞生长，并且它自己足以将小鼠干细胞保持在多能状态，而不用使用常规”需要“的LIF。反过来，因为物种之间高度的保守性，NM23蛋白不必是人类的。然而，人NM23-H1、NME6和NME7是优选的。有利于二聚的突变体NM23蛋白质，如在NM23-H1中的S120G突变，是优选的。
干细胞的用途
设想将本发明的方法用于多种体外、体内和离体应用。一方面，将本发明的方法用于在体外制造诱导型多能干(iPS)细胞，其然后可以被用作或分化用于多种应用，包括研究、药物测试、毒物学或治疗用途。
转分化(trans-differentiation)
另一方面，本发明的方法用于使细胞回复至较不成熟状态，然后分化，从而使它们发展为期望的细胞类型。本发明的方法因此可以被用于转分化技术中，该技术也被称为直接分化技术，其中，细胞仅部分回复至多能状态。用于转分化的当前技术涉及诱导多能性基因(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog)中的两种或多种的表达一段短于使细胞完全多能所需的时间段，然后引入引导分化至特定的细胞系或细胞类型的生物试剂或化学试剂。例如，本发明的方法可被用于诱导细胞回复至较不成熟状态，自此细胞分化为期望的状态。这可以在体外、体内、或离体进行。在本发明的一个方面，这些细胞是体内的，例如患者内的，其中，它们回复至较不成熟状态，然后被诱导分化至期望的状态。例如，大约心脏细胞的一半是成纤维细胞。因此，可以通过增加健康心肌细胞的数目缓解的心脏病症的治疗，是使用本发明的方法引起心脏成纤维细胞在原位回复至较不成熟状态，然后使它们与其他试剂接触以诱导它们分化为心肌细胞。
不需要完全在体外或体内进行本发明的技术。另一方面，可以从脑脊液或另外来源获得细胞，使用本发明的方法使其回复至较不成熟状态，然后分化至一些其他期望的细胞类型或细胞系，如神经元细胞，然后将其引入至患者，例如引入至可以通向大脑的脊髓液。可以从患者得到来源细胞，然后以分化或半分化状态重新引入。可替代地，可以从患者或供体获得细胞，其可以源自期望的细胞系并回复至较不成熟状态，然后被引入至它们被影响变为期望的细胞类型的位置。以这种方式，可以从患者或供体获得细胞，其可以回复至较不成熟状态，然后被引入至需要治疗细胞的患者的部分，其中，自身环境或外源试剂的添加将使细胞分化为期望的细胞类型。
伤口愈合
再一方面，本发明的方法可以被用于促进伤口愈合的合适设置。在该方面，本发明的试剂是在培养基中或固定在载体上，其可以是绷带、血管内支架(stent)、支架(scaffold)、用于组织再生的支架、用于脊髓再生的支架或支撑物等。在一个实施例中，用MUC1*配体(如NM23-H1二聚体或NME7)涂覆的绷带将使伤口近端的细胞回复至干细胞样状态，于是，它们将加速愈合。
本发明并不限于本文描述的具体实施方式的范围。实际上，对于本领域技术人员而言，依据以上描述和附图，可以清楚除本文描述的那些以外本发明的各种改进。这样的改进旨在落在所附权利要求的范围内。通过示出本发明的方式，而不是通过限制的方式提供以下实施例。
以下实施例示出：1)MUC1相关因子在非多能的细胞中诱导多能性；2)MUC1相关因子增加iPS生成的效率；3)MUC1相关因子取代对于一种或多种目前认为用于诱导多能性所需的基因的需要。NM23是MUC1*的配体，并且是MUC1*相关因子。
实施例
实施例1：MUC1*促进生长和细胞耐死亡性。
MUC1*促进成纤维细胞的集落生长(集落膨胀(集落扩大，colonyexpansion))。以1000个细胞/60mm皿将用全长MUC1(SEQIDNO:1)、MUC1*1110(SEQIDNO:5)或空载体中任一种转染的3Y1细胞的单一细胞集落涂布在包含10％胎牛血清、青霉素/链霉素和G148(600μg/ml)的DMEM培养基中。细胞生长9天，然后在室温下将其固定在4％多聚甲醛中15分钟。用水洗涤培养皿，然后在室温下用70％甲醇中的1％结晶紫染色20分钟。用水洗涤培养皿三次，并且允许在室温下过夜干燥以及拍照。图1A示出在MUC1*单个细胞集落#3和#44正在生长的地方吸附的结晶紫的量(细胞数目的指示剂)高得多。相反，相对于用空载体转染的细胞，用全长MUC1转染的细胞(单个细胞集落#8和#17)没有示出生长率增加。这示出裂解形式MUC1*赋予生长和/或生存优势，而全长蛋白质不能。
实施例2：通过在耐曲妥珠单抗细胞中的(肽素)(通过培养在1ug/ml中形成抗性)，抗MUC1*Fab阻断细胞死亡抗性。Fessler等人在2009年报告了抗细胞也抗阿霉素和环磷酰胺。如报告的，这些耐药物癌细胞通过过表达MUC1*实现了耐药性。以下实验示出阻断MUC1*胞外结构域的PSMGFR部分逆转了癌细胞中的获得性抗性。以10,000个细胞/孔的密度将亲代细胞(BT474)或耐性细胞(BTRes1)涂布在96孔板中，4孔/条件。接下来的一天，在存在或不存在下添加抗MUC1*Fab、对照Fab或不添加Fab至细胞(PaclitaxelSigmaT7191)。两天后，将细胞重新悬浮在50μl胰蛋白酶中，并在台盼蓝的存在下进行计数。根据台盼蓝摄取率，计算百分比细胞死亡率。在每种条件下，响应BT474细胞遭遇细胞死亡，以及BTRes1细胞仅在MUC1*抗体存在下遭遇细胞死亡(图1B)。
实施例3：MUC1*起生长因子受体的作用，并且使用人工(抗MUC1*抗体)或它的天然配体NM23(NME)由它的胞外结构域的二聚激活。将MUC1*阳性ZR-75-30细胞，6000/孔，或对照(MUC1阴性)HEK293细胞，4000/孔，涂布在96孔板中。接下来的一天，进行0小时细胞计数，并且每24小时或48小时向培养基中添加不同浓度的抗MUC1*抗体或Fab与少量(0.1％)血清。温育数天后，细胞重新悬浮于胰蛋白酶中并计数，并且计算百分比标准化生长。对ZR-75-30细胞的刺激示出钟形曲线，如对于配体诱导的生长刺激所证实的，但是HEK293细胞没有(图1C)。在类似的实验中，使用被siRNA靶向MUC1或对照siRNA稳定转染的MUC1*-阳性T47D乳腺癌细胞，生长刺激仅发生在对照转染的细胞，进一步证实抗体的特异性(图1D)。对于MUC1*天然配体NM23，证实了相同的结果(图1E)。
实施例4：NM23特异性结合至PSMGFR肽，其基本上由MUC1*的胞外结构域组成。通过表面等离子体共振，使用Biacore3000仪器和BIA评估软件测量结合。将组氨酸标记的MUC1*1110-ecd(SEQIDNO:5)或不相关的肽(HHHHHH-SSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS–SEQIDNO:40)固定在根据Mahanta等人在2008年中所描述的在我们的实验室中制备的在5.7％NTA-Ni++SAM涂覆的SPR条的单独的流动通道上。将纯化的牛或重组的人的NM23的35μL血管内塞(plug)注射至5uL/分钟的连续流动流中并且记录传感图(sensogram)。将由牛肝纯化的NM23(SigmaN-2635)单独稀释在PBS中。使用1:1Langmuir模型在宽范围的浓度内测量亲和力。实际的亲和力可能不同，因为一级动力学不能充分说明该系统。(图1F)
实施例5：MUC1*生长因子受体和它的配体NM23在未分化的hESC上，而不是分化的hESC上。通过免疫细胞化学(ICC)分析未分化(多能)状态或新分化状态的人胚胎干细胞。手动解剖人胚胎干细胞(hESC)并且将其涂布在已经用基质胶预涂覆的8孔隔室玻片(Nunc)上。对于未分化的细胞，涂布之后固定细胞5-7天。对于分化的细胞，在涂布之后5-7天从培养基除去bFGF，并且在固定之前允许分化14天。在4℃下用0.1M二甲胂酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛固定15分钟之前，用PBS洗涤细胞。用PBS中的1％BSA和1％驴或山羊血清阻滞细胞1小时。使用0.1％NP-40与针对细胞内抗原的抗体。整批稀释初级抗体(一抗)，并且在4℃下与细胞温育1小时。使用用于以下蛋白质的初级抗体：OCT4(SantaCruz，CloneClonesH-134和C-10，1:100稀释)、全长MUC1(VU4H5，SantaCruzBiotechnology，1:50稀释)、MUC1*(Minerva，1:250稀释)、或NM23(SantaCruz，CloneNM301，1:100稀释)。在用以下二级抗体温育30分钟之前，在PBS中3次洗涤细胞5分钟：AlexaFluor488山羊抗兔IgG、AlexaFluor555山羊抗小鼠IgG、AlexaFluor350山羊抗兔IgG(Invitrogen，1:200)；山羊抗小鼠IgM-TR(SantaCruz，1:100)。在使用抗褪色封固介质封固盖玻片之前，在PBS中3次洗涤细胞5分钟(Biomeda)。通过DAPI染色(1μg/ml)5分钟，细胞核可视。在OlympusBX-51落射荧光显微镜上可看到免疫染色的细胞。这些实验的结果示出MUC1*在未分化细胞(多能干细胞)的表面(图2A，3B，3C)，但是不在分化的hESC上(图2D)。图3示出MUC1*的配体NM23与MUC1*共定位(图3A-C)。MUC1*和它的配体NM23仅在多能干细胞(OCT4阳性细胞)上表达，但不在已经分化的那些上表达，图3C和3F(OCT4阴性细胞的DAPI染色细胞核)。
实施例6：MUC1*介导多能干细胞的生长。
进行以下实验以确定在多能干细胞上使用二价抗MUC1*刺激MUC1*的效果。结果示出添加MUC1*二聚配体刺激多能(OCT4阳性)干细胞生长并且使它们能够在饲养细胞、它们的提取物或bFGF不存在下生长。
多能(OCT4阳性)hESC的长期生长由MUC1*刺激介导。hESC被胰蛋白酶解离并且以4x104细胞/孔被接种在用基质胶预涂覆的8孔隔室玻片上。改变基质并且以用于二价抗MUC1*的最终浓度1μg/ml每隔一天添加抗体，直到离散的集落可见。培养条件包括“基本干细胞培养基”(hESC介质，没有饲养细胞条件培养基)和Hs27条件介质，有或没有bFGF补充。对于每个条件，一式四份生长细胞。用PBS洗涤细胞并且固定，以及根据以上描述的进行OCT4免疫染色。图4，画面A-D是生长在基质胶上和添加成纤维饲养细胞的条件培养基上的细胞的照片。画面E-H是生长在基质胶上的细胞的照片，其中，没有添加来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基。添加抗MUC1*抗体至细胞培养基(图4C，4D)产生比补充bFGF(图4A，4B)的生长更加多能的干细胞。添加抗MUC1*抗体至在不存在来自成纤维饲养细胞的条件培养基下培养的细胞(图4G，4H)产生大量的多能干细胞，与通过添加bFGF生长的细胞(图4E，4F)形成强烈对比，其没有产生多能细胞(不存在OCT4)。
实施例7：在定量钙黄绿素测定中直接测量刺激MUC1*增强多能干细胞生长的作用。手动解剖人胚胎干细胞(hESC)并使其生长在基质胶涂覆的孔上，其为96孔板，密度为1.9x104细胞/孔。包含hESC介质的培养基补充有30％的Hs27条件介质和4ng/ml的bFGF。添加抗体，终浓度为二价抗-MUCI*1ug/ml和单价抗-MUCI*100ug/ml。一式三份进行实验。抗体治疗41小时后，根据制造商的说明，用LIVE/DEAD存活/细胞毒性试剂盒(MolecularProbes)定量活细胞和死亡细胞。使用Victor3V读板器测量荧光(PerkinElmer)。图5的柱状图示出使用二聚配体(抗MUC1*)刺激MUC1*增强干细胞生长，同时通过抗MUC1*Fab阻断MUC1*的胞外结构域，导致总体的干细胞死亡。
实施例8：进行长期的干细胞生长实验以比较使用二价抗MUC1*抗体、NM23、NM23突变体、或bFGF刺激干细胞生长的作用。将hESC与胰蛋白酶分离并以8.2x104细胞/孔的细胞密度将其接种在用基质胶预涂覆的8孔隔室玻片上。更换介质，并且以最终浓度抗MUC1*抗体80ng/ml，野生型重组NM23或突变体(S120G)NM231nM，或重组的bFGF在“基本干细胞培养基”(hESC介质，无饲养处理的培养基)中的最终浓度4ng/ml，每隔一天添加抗体或野生型NM23蛋白质或突变的NM23蛋白质。在来自Hs27成纤维细胞的30％条件培养基和4ng/ml重组的bFGF(Peprotech#100-18B)的基本干细胞培养基中，细胞也作为对照生长。该实验的结果示出MUC1*配体在多能集落的基本介质中比在条件介质加bFGF(这些细胞在基质胶上的“标准”生长培养基)中更好地刺激生长。表1详细说明了结果。
表1.在基本介质中培养4周的hESC
实施例9：MUC1*转移到细胞的细胞核。在体外用Alexa555染料标记抗MUC1*单克隆抗体，并在4℃下将其结合至用MUC1*转染的已经在4℃的冷PBS中洗涤的HCT-116细胞(MUC1阴性)。20min后，在冷PBS中洗涤细胞两次，并且或者将细胞固定在4％多聚甲醛中，或将其温育在预温热的生长培养基中。40分钟后洗涤细胞，并且用4％多聚甲醛固定细胞5分钟，然后用PBS中的2.5％BSA、2.5％FBS和0.1％NP-40阻滞并且透化。使用抗EEA1抗体(CellSignalingTechnologies，2411S)和Alexa488(Invitrogen1:200)染色核内体(内涵体，endosome)。(图6)
在以上描述的实施例中，将细胞培养在标准成纤维细胞介质(FM)、基于bFGF的介质(FGF-MM)或基本干细胞介质中的NM23-S120G-二聚体(NM23-MM)或缺乏它的M前导序列从而仅包含它的A和B区域的NME7(在本文中称为简单的NME7或NME7-AB)中。
成纤维细胞介质，“FM”：对于500mL：435mLDMEM(ATCC#30-2002Manassas,VA)、50mL胎牛血清(FBS，#35-011-cv，Mediatech,Manassas,VA)、5mL100X原液Glutamax(#35050061，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)、5mL100X非必需氨基酸(#11140050，LifeTechnologies)、5mL100X青霉素/链霉素(#17-602E，Lonza，Allendale，NJ)。
bFGF介质“FGF-MM”：对于500mL：400mLDMEM/F12(#10565-042)、100mLKnockOut血清替代物、“KOSR”(#10828-028)、5mL100X非必需氨基酸(#11140050)、0.9mL100X原液(stock)2-巯基乙醇(#21985-023)，所有都来自于fromLifeTechnologies，和2ugbFGF(#100-18B,Peprotech，RockyHill，NJ)。
NM23介质“NM23-MM”，对于500mL：400mLDMEM/F12(#10565-042)、100mLKnockOut血清替代物、“KOSR”(#10828-028)、5mL100X非必需氨基酸(#11140050)、0.9mL100X原液2-巯基乙醇(#21985-023)，所有到来自于LifeTechnologies，和8nMNM23二聚体(Minerva，Waltham，MA)。
缩写：
OSKM：Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc是多能性基因，将其组合用于这些实验以诱导多能性。进行多次实验，所有实验结果一致。在一些情况中，使用慢性病毒系统(lentiviralsystem)来引起多能性基因的异位表达，而在其他情况中，使用核酸。在其他的情况中，使用蛋白质本身而不是编码它们的基因。
NM23-MM-R或NM23-R：代替标准方法中用基于bFGF的介质(bFGF-M)取代FM，在第7天用NM23-MM取代成纤维细胞介质(FM)。
NM23-MM-A或NM23-A：NM23-MM从实验开始一直存在。
TC-MUC1*Ab：将成纤维细胞涂布至已经用抗MUC1*抗体(此处尤其优选12.5ug/mL的mAbMN-C3和MN-C8)代替塑料涂覆的细胞培养皿(经常是处理的组织培养基，但不必须)，然后在第5天转移至成纤维饲养细胞层。
VitaTM-MUC1*Ab：将成纤维细胞涂布至已经用抗MUC1*抗体(此处尤其优选12.5ug/mL的mAbMN-C3和MN-C8)代替塑料涂覆的细胞培养皿(VitaTM：ThermoFisher)，然后在第5天转移至成纤维饲养细胞层。
HS27：人包皮成纤维饲养细胞(灭活的)
MEF：小鼠胚胎成纤维饲养细胞(灭活的)
实施例10：使用NM23或NME7对于诱导细胞回复至较不成熟状态或多能状态的作用。
进行用于iPS生成的步骤，其中，使用慢性病毒体系转染所有四种基因(OSKM)。在该实验中，用四(4)种多能性基因(refYamanaka)转染人成纤维细胞：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，在下文中称作OSKM。标准实验方案是首先将成皮细胞或成纤维细胞(人成纤维细胞“hFFn”：#PC501A-hFF，SystemBiosciences，MountainView，CA)涂布在塑料上，并且在成纤维细胞介质(FM)(每24小时更换)中培养它们。5天后，将细胞转移至用灭活的成纤维饲养细胞(其可以是小鼠的(MEF)或人的(HS27))涂覆的表面。接下来的2天，将细胞保持在FM中。在第7天，将介质更换为以上描述的bFGF-M，并且每24小时更新介质。开始涂布后～2-4周，选择具有胚胎干(ES)细胞样形态的多个集落(克隆)并将其单独涂布到用灭活的饲养细胞(小鼠MEF或HS27人成纤维细胞)涂覆的新孔中，并随后每3-4天传代。繁衍(继代，propagate)继续生长ES样细胞的孔，并且测试多能性标记物的存在。
与标准实验方案相反，在已经将细胞转移至成纤维饲养细胞层后，我们测试一直添加NM23介质(NM23-MM-A)或在第7天添加NM23介质(NM23-MM-R)取代成纤维细胞介质(FM)的作用。作为对照，添加转染试剂但省略基因，“模拟转染”，或既不添加基因也不添加转染试剂，“未转染”，或根据以上描述的标准实验方案处理细胞。
图7A-D是在实验第4天对照细胞的放大照片。A、B示出单独的NM23-MM引起成纤维细胞在4天后开始形成ES样集落。相反，其中使用标准成纤维细胞介质FM的C、D没有示出细胞形态的任何变化，它们保持成纤维细胞样。在这些对照实验中，没有将基因转染至成纤维细胞。
图8A-C示出在实验第4天用OSKM转染的细胞的放大照片。画面A、B示出培养在NM23-MM-A中培养的转染物开始形成ES样集落。其中根据标准方法细胞被培养在FM中的画面C示出成纤维细胞形态没有变化。
图9A-D是在实验第11天对照细胞的放大照片。这些图像示出当将未转染细胞培养在塑料(A)、MEF(B)、抗-MUC1*抗体、C3(C)、或抗-MUC1*抗体、C3加Rho激酶抑制剂(ROCi)上的NM23-MM-A中时，表面作用的区别。观察到在不存在任何异位表达的基因下，NM23-MM单独引起ES样集落的发展。这些得到的细胞变为非粘附的并且浮出普通的塑料表面(A)，在MEF存在下不形成，在不存在ROCi下在抗-MUC1*抗体表面(C)形成最好(比较C-D)。
图10A-B示出实验第11天对照未转染细胞的放大照片，该细胞已经被培养在标准FM中7天，然后被培养在MEF上的FGF-MM中。当培养在FGF-MM中时，典型成纤维细胞形态没有变化。
图11A-D示出在实验第11天用OSKM诱导变得多能的成纤维细胞的放大照片。该实验比较培养在NM23-MM-A(一直)中的细胞(画面A、B)与培养在成纤维细胞介质FM中7天、然后切换至NM23-MM-R(取代)中的细胞(画面C、D)。还比较的是在用抗MUC1*抗体(A)、MEF(B,D)、HS27(C)涂覆的表面上的生长。图像示出NM23-MM总是比在FM中开始成纤维细胞好，以及对于诱导ES样集落，人成纤维饲养细胞(HS27)比小鼠饲养细胞(MEF)作用得更好。
图12A-B示出培养在FGF-MM中并且用OSKM诱导变得多能的成纤维细胞在实验第11天的方法照片。该实验比较涂布在人饲养细胞上(A)和小鼠饲养细胞上(B)的细胞的形态。
图13A-D示出对照未转染细胞在实验第14天的放大照片，该细胞已经被培养在抗-MUC1*抗体(A，B)或成纤维细胞饲养细胞(C，D)上的NM23-MM-A(一直)中。画面A、C示出以高密度涂布的细胞，而B、D是以低密度涂布的。实验再次示出抗-MUC1*抗体表面和NM23-MM支持ES样集落的形成，即，在不存在用多能性基因的转染下诱导多能性，并且示出具有NM23-MM的人饲养细胞表面也支持多能性的该诱导，尽管是在较小的程度上。
图14A-C示出实验第14天对照未转染细胞的放大照片，该细胞已经被培养在标准FM中，然后被培养在FGF-MM中，并且没有示出诱导多能性的迹象。
图15A-C示出实验第14天用OSKM转染的成纤维细胞的放大照片，该成纤维细胞被培养在抗-MUC1*抗体表面上(A)、塑料上(B)或MEF上(C)的NM23-MM-A中。画面A和B示出良好形成的ES样集落。
图16A-D示出用OSKM转染的成纤维细胞在实验第14天的放大照片，该细胞已经被培养在NM23-MM-R中(直到第7天是FM，然后是NM23-MM)。画面A和C示出形成在MEF上的集落，以及B、D示出形成在HS27上的集落。
图17A-D示出对照未转染细胞在实验第19天的放大照片，该细胞已经被培养在NM23-MM-A(一直)中或NM23-MM-R(取代的)中。在不存在转染基因下，NM23-MM诱导多能细胞形态。
图18A-B示出对照未转染细胞在实验第19天的放大照片，该细胞已经被培养在FM中，然后被培养在FGF-MM中。看不到多能性的诱导。
图19A-D示出用OSKM转染的成纤维细胞在实验第19天的放大照片，该细胞已经被培养在NM23-MM-A中(A，B)或NM23-MM-R中(C，D)。图像示出NM23-MM一直增强多能性的诱导。
图20A-B示出在第19天用OSKM转染的细胞，其中，细胞已经被培养在FM中7天，然后被培养在FGF-MM中。
实验的结果和iPS诱导率示于表2中。从表2可以看出，没有用任何基因转染，但是培养在缺乏血清或其他生长因子或细胞因子的介质中的以二聚体形式的NM23-S120G中的成纤维细胞以至少两倍于用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)转染并且根据标准方法(其包括在第7天后在FGF介质中培养)培养的细胞的速率的速率产生具有干细胞样形态的集落。用多能性基因中的三(3)种或四(4)种转染并且培养在缺乏血清或其他生长因子或细胞因子的介质中的以二聚体形式的NM23-S120G中的成纤维细胞以高达使用FGF介质的标准方法的速率100倍的速率产生具有干细胞样形态的集落。因此，生成诱导型多能干细胞或比起始细胞较不成熟状态的细胞的效率远远高于由MUC1*配体接触的细胞时的效率，其中，以二聚体形式的NM23-H1或NME7是优选的。诱导率计算为具有干细胞样形态的集落数除以起始细胞数。
实施例11：NM23对iPS生成的作用，其中，使用慢性病毒体系仅转染了三(3)种多能性基因。在该实验中，我们测试省略多能性基因中的一种的影响。用四(4)种多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(“OSKM”)或三(3)种OSK或OSM转染人成纤维细胞(hFFn)。在第4天和第20天使用RT-PCR技术和免疫细胞化学测定指示多能性的某些基因的基因表达水平。应注意的是将在这些实验中使用的引物设计为使它们不会扩增正在异位表达的基因。使用RT-PCR来定量多能性的指示物Oct4、Nanog、Klf4基因的表达水平。还测量MUC1的表达。
RT-PCR实验的结果总结在图21和图22的图像中。实验示出培养在MUC1*配体(以二聚体形式的NM23-S120G)中的转染物在多能性标记物表达上具有比细胞被培养在FGF介质中的标准方法更早或更加显著的升高。此外，实验示出如果转染物被培养在NM23介质中，三(3)种多能性基因足以诱导多能性，但是如果细胞被培养在FGF介质中(图22)，三(3)种多能性基因不足以诱导多能性。也在实验第10天进行免疫细胞化学实验，其中，测量细胞中多能性标记物Tra1-60的表达。用所有四(4)种多能性基因(OSKM)转染或仅三(3)种转染并且培养在NM23介质中的细胞示出与培养在FGF介质中的相同细胞(图25)相比Tra1-60表达的大幅升高(图23和图24)。对于用OSK转染并且培养在FGF介质中的细胞，在第10天没有发现Tra1-60阳性细胞。
实施例12：使用NM23介质能够消除4种多能性基因中的至少1种。
在该组实验中，用所有四种多能性基因OSKM或三(3)种OSK或OSM转染人成纤维细胞，并且将其培养在标准培养基中或NM23-MM-A或NM23-MM-R中。为了进一步表征诱导变得多能的细胞的分子构成，在第5天将细胞从塑料转移至隔室玻片，生长直到10天，然后染色用于多能性标记物Tra1-60的存在和用于使用DAPI的细胞核。图23示出用OSKM转染并且从诱导开始(一直是：NM23-MM-A)培养在基本介质中的NM23二聚体中的细胞。用于Tra1-60的绿色染色突出了已经被诱导至多能性的那些细胞。相反，图24示出当仅用OSK转染细胞并培养在NM23-MM-A时，对于多能性标记物Tra1-60，存在大量的针对多能性的阳性染色的细胞。在单一观点中，没有允许检测4种或更多种多能细胞的其他条件。图25示出使用标准培养基和所有四种多能性基因OSKM，仅可以定位一些细胞。我们注意到在其他实验中，OSKM的转染以及培养在NM23介质中确实产生多能干细胞，其具有良好的效率。然而，通过多次实验，OSK的转染以及省略c-Myc似乎给出诱导多能性的最高效率。
在用4或3种基因转染的所有细胞群上进行FACS。进行分选(sort)以确定对多能性标记物Tra1-60和SSEA4阳性但是对成纤维细胞标记物CD13阴性的细胞。示于表3中的结果示出用OSK但没有用c-Myc转染并且培养在NM23-MM-A中的细胞具有最高的多能干细胞数。
表3
| SSEA4 | SSEA4＆TRA1-60 | TRA1-60 | |
| FGF OSKM | 16 | 281 | 21 |
| NM23-R OSKM | 124 | 402 | 26 |
| NM23-A OSKM | 254 | 243 | 12 |
| NM23-R OSK | 4 | 18 | 5 |
| NM23-A OSK | 1258 | 2539 | 400 |
图26-32示出实验第15天的细胞的明亮视野的图像。
此外，通过RT-PCR分析培养在NM23-MM或bFGF-MM中通过转染基因OSKM、OSK、或OSM诱导为多能的细胞，以定量它们在第4天表达的多能性标记物OCT4的量，然后再次定量在第20天的量。如图21和图22的图表所示，培养在NM23-MM中的细胞在早至第4天表达升高量的多能性基因OCT4。甚至在诱导多能性20天后，NM23-MM中的细胞表达较高水平的OCT4和/或具有更多OCT4阳性的细胞。产生通过OCT4表达测量的最高诱导多能性效率的条件是在转染基因OCT4、SOX2和KLF4但没有转染c-Myc后，培养在NM23-MM中。
实施例13：由于哺乳动物中MUC1近端区域的良好保守性，我们比较小鼠干细胞在LIF作为生长因子的标准介质中的生长与使用NM23作为生长因子的生长。小鼠ES细胞在NM23-MM中的生长与培养在包含作为生长因子的LIF的标准介质中的小鼠ES细胞的生长相比一样好或更好。图34示出使用SSEA4测量多能性，培养在NM23中的细胞产生比培养在LIF中的细胞更多的SSEA4阳性细胞(即多能细胞)。此外，当用针对人MUC1*序列PSMGFR的抗体染色这些细胞时，我们发现在NM23中生长增加细胞表达的MUC1*的量，见图25。这些结果一起表明可以将其他哺乳动物细胞，包括小鼠干细胞，培养在NM23中，而不是传统的小鼠ES生长因子LIF中。此外，这些细胞中的更多个识别MUC1*抗体的事实证明在NM23中培养干细胞增加MUC1*的表达。
实施例14：使以上描述的实施例10-12中得到的细胞(我们重复了四(4)次)也经受FACS分析，以确定经受多能性诱导方法表达多能性表面标记物的细胞的百分比。FACS分析应当指出被诱导回复至较不成熟状态和多能状态的人成纤维细胞。用于生成iPS细胞的标准方法消耗约3-4周来发展集落，其如通过本领域技术人员所熟悉的多能性标记物的表达所证实的是多能的。例如，这些实验中的起始细胞是成纤维细胞。CD13是成纤维细胞标记物，而已经有效开始回复至多能状态的细胞是CD13阴性的。本领域已知多能的细胞对于多能性标记物OCT4、KLF4、NANOG、REX-1和其他是阳性的。往往通过以上描述的RT-PCR检测细胞质或细胞核标记物，而其他表面标记物方便地通过荧光激活细胞分选(FACS)检测或分选活细胞。在用四种“Yamanaka”多能性基因中的一些或所有转染成纤维细胞后的第18天和第19天，通过FACS分析得到的细胞中多能性表面蛋白质SSEA4和Tra1-60的存在；也使细胞染色CD13，从而可以选择选通方式(gate)以排除对成纤维细胞标记物保持阳性的任何细胞。结果示于图33-39中。图35和图36示出用所有四种多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc(OSKM)平行转染但培养在NM23二聚体介质中而不是标准FGF介质中的细胞产生多于3倍数目的对多能性标记物Tra1-60呈阳性的细胞。图37示出使用NM23二聚体介质或标准FGF介质培养18天的用3种或4种多能性基因转染的细胞的FACS扫描。在这种情况中，染色细胞中的CD13、SSEA4和Tra1-60。图38中的表格示出仅用3种多能性基因OSK转染并培养在NM23二聚体介质中的细胞产生比用所有4种基因转染的FGF培养的细胞多～15倍的对多能性标记物Tra1-60染色阳性的细胞。当仅用OSK或OSM转染时，FGF培养的细胞不能诱导多能性。图39中的表达示出用OSK转染并培养在NM23二聚体介质中的细胞产生比用所有四(4)种基因转染并培养在FGF介质中的细胞多20-30倍的对多能性标记物Tra1-60染色阳性的细胞。
实施例15：MUC1*配体增加MUC1*的表达。用人类商业可获的人诱导型多能干(iPS)细胞以及用人胚胎干(ES)细胞进行实验，其中，我们测试MUC1*配体增加MUC1*的表达或活性的能力以及它们诱导细胞回复至较不成熟(更多能)状态的能力。在MEF上的FGF(4-8ng/mL)介质中或在用抗-MUC1*抗体MN-C3(也是MUC1*抗体-涂覆在VitaTM板上12.5ug/mL)涂覆的表面上的NME7(MUC1*配体-8-16nM)介质中培养来自SystemsBiosciencesInc.的SC101A-iPSC人iPS细胞。除了生长因子、FGF或NME7，基本介质相同并且是如以上所描述的“基本介质”。通过免疫细胞化学测定得到的细胞，以确定对多能性标记物染色呈阳性的细胞的含量。结果示出使细胞与MUC1*配体NME7接触引起MUC1*表达的升高，其与对多能性标记物染色呈阳性的细胞百分比升高一致。细胞核染色DAPI示出当细胞被培养在FGF中时，也没有被多能性标记物染色的许多细胞核。图40是人类诱导型多能干(iPS)细胞系的照片，其被培养在MEF层上的FGF培养基中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NME7培养基中、并且通过免疫细胞化学测定MUC1*的存在(A，D)和多能性标记物Rex-1(B，E)和Tra1-60(C，F)的存在。用来自BiotimeInc.的HES-3人胚胎干细胞进行相同的实验，并且得到相同的结果。图41示出人类胚胎干(ES)细胞系的照片，其被培养在MEF层上的FGF培养基中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NME7培养基中、并且通过免疫细胞化学测定MUC1*的存在(A，D)和多能性标记物Rex-1(B，E)和Tra1-60(C，F)的存在。进行类似的实验，但是代替使用NME7作为生长因子，使用突变体NM23-H1S120G(16nM)，其中通过FPLC重折叠(refold)并纯化NM23，从而使它是二聚体的纯群体。在本文中，将该NM23简单称为NM23介质、NM23二聚体介质或NM23-S120G。结果是在NM23介质中的一次传代后，存在表达的MUC1*量的大幅升高。我们注意到单克隆抗体MN-C3仅识别裂解的MUC1*，并且不能结合至全长MUC1。图42示出人类iPS细胞系的照片，其被培养在MEF层上的FGF培养基中(A-C)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体培养基中(D-F)、以及通过免疫细胞化学测定MUC1*(A，D)、核染色的DAPi(B,E)的存在和合并的图像(C，F)。另外染色细胞中的多能性标记物Tra1-60和细胞核染色DAPI。在每种情况中，培养在MUC1*配体、二聚体NM23中的细胞引起MUC1*表达升高，也引起细胞回复至较不成熟状态。当细胞失去多能性标记物的表达时，它们已经分化出多能状态。图43(C、F、I、L)的合并图像的检查示出在用MUC1*配体处理之后，每个细胞核与对多能性标记物和MUC1*的染色相关。图43示出人类iPS细胞系的照片，其被培养在MEF层上的FGF培养基中(A-F)或被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体培养基中(G-L)、以及通过免疫细胞化学测定MUC1*(A，G)、多能性标记物Tra1-60(D,J)、核染色的DAPi(B，E，H，K)的存在和合并的图像(C，F，I，L)。另外染色细胞，用于另一种MUC1配体NME7的存在。图44示出被培养在抗-MUC1*抗体层上的NM23-S120G二聚体培养基中并且通过免疫细胞化学测定NME7(A，B，C)和和染色的DAPI(C)的存在的人类iPS细胞系的照片。
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通过引用并入本文中引用的所有参考文献的全部内容。
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本领域技术人员将认识到，或利用不超过常规的实验能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方式的许多等效方式。这些等效方式旨在包括在权利要求的范围内。
Claims (69)
1.一种用于由起始细胞生成较不成熟细胞的方法，包括诱导所述起始细胞回复至较不成熟状态，包括使所述起始细胞与以下的生物试剂或化学试剂接触：
(i)增加所述细胞中MUC1或NME蛋白质的量；
(ii)增加所述细胞中MUC1或NME蛋白质的表达；
(iii)增加MUC1或NME蛋白质的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，包括用直接或间接引起所述MUC1或NME蛋白质的量、表达或活性升高的核酸转染所述起始细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述NME蛋白质是NME7或其NME7变体。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述NME蛋白质是NME1或其NME1变体。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述MUC1是MUC1*。
6.根据权利要求1所述的方法，包括用直接或间接引起MUC1裂解酶的量、表达或活性升高的核酸转染所述起始细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述裂解酶是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的核酸转染所述起始细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的肽或蛋白质接触。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物物质是肽或蛋白质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述肽或蛋白质是NME蛋白质或其变体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述NME蛋白质是NME7。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述NME蛋白质是NME1。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述肽或蛋白质是MUC1或MUC1的一部分。
15.根据权利要求11所述的方法，进一步包括使所述起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的所述肽或蛋白质接触。
16.根据权利要求11所述的方法，进一步包括用直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的核酸转染所述起始细胞。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，用增强所述肽或蛋白质进入细胞的能力的部分或序列修饰所述肽或蛋白质。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化学物质直接或间接引起NME7、NME1、MUC1、MUC1*、MMP16、MMP14或ADAM17的量、表达或活性升高。
19.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述起始细胞与直接或间接引起Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、或Nanog的量、表达或活性升高的化学物质接触。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述较不成熟状态由OCT4、SOX2、KLF4、KLF2、NANOG、LIN28、MUC1、NME1或NME7中至少一种的表达升高来表征。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述较不成熟状态是多能状态。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白质是MUC1*配体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述配体使MUC1*二聚化。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述配体是NME家族成员。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME1、NME6或NME7。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，NME1和NME6是二聚体形式且NME7是单体形式。
27.根据权利要求22所述的方法，其中，所述蛋白质是识别MUC1*的PSMGFR序列的抗体。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化学物质是小分子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述小分子增强MUC1的转录、MUC1裂解酶的转录、或NME家族成员的转录。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述裂解酶是MMP-16、MMP-14或ADAM-17。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述小分子增强MUC1的裂解。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述小分子是佛波酯。
33.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸编码MUC1。
34.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸编码MUC1*。
35.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸编码MUC1*的配体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述配体是MUC1*抗体或NME蛋白质。
37.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述起始细胞与增加诱导多能性的基因产物的表达的分子接触。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述分子增加OCT4、SOX2、NANOG、KLF4或LIN28的表达。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述分子增加OCT4和SOX2的表达。
40.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述细胞是人类细胞。
42.一种由起始细胞生成较不成熟细胞的方法，包括诱导所述起始细胞回复至较不成熟状态，包括使所述起始细胞与增加所述细胞中MUC1或NME的量的生物试剂或化学试剂接触，以及进一步使所述起始细胞与增加OCT4、SOX2、NANOG、KLF4或LIN28中的一种或多种的量的生物物质或化学物质接触。
43.根据权利要求1或42所述的方法，其中，增加MUC1或NME的量的生物物质是编码MUC1、MUC1*、NME1或NME7的核酸或其变体。
44.根据权利要求1或42所述的方法，其中，所述起始细胞是哺乳动物细胞。
45.根据权利要求1、42、43或44所述的方法，其中，所述起始细胞是人类细胞。
46.根据权利要求1或42所述的方法，其中，所述起始细胞选自包括多能干细胞、专能干细胞和终末分化细胞的组。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述多能干细胞处于始发态。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，所述专能干细胞是造血细胞、骨髓细胞或神经元细胞。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，所述终末分化细胞是成纤维细胞、成皮细胞、血细胞、或神经元细胞。
50.根据权利要求1或42所述的方法，其中，随后分化所述生成的细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，在体外分化所述生成的细胞。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，在体内分化所述生成的细胞。
53.一种给予根据权利要求1或42所述的生成的细胞的方法，包括使所述生成的细胞分化，以及给予所述分化的细胞至需要其的患者。
54.一种给予根据权利要求1或42所述的生成的细胞的方法，包括给予所述生成的细胞至需要其的患者。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述生成的细胞来自于所述患者。
56.根据权利要求54所述的方法，其中，所述生成的细胞来自于供体。
57.一种使干细胞分化的方法，包括：
(i)诱导起始细胞回复至较不成熟状态或将起始细胞保持在较不成熟状态，包括进行根据权利要求1或权利要求42所述的方法；和
(ii)引起所述较不成熟细胞分化。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述细胞分化为外胚层细胞、中胚层细胞或内胚层细胞。
59.根据权利要求1或权利要求42所述的方法，其中，在体外进行所述诱导。
60.一种注射根据权利要求1或42所述的方法制备的诱导型多能细胞至受试者的方法。
61.一种治愈通过在损伤部位诱导或维持干细胞而治愈的疾病或伤口的方法，包括给予需要其的个体有效量的多能性诱导试剂。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述多能性诱导试剂是MUC1*激活剂。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述试剂是NME。
64.根据权利要求61所述的方法，其中，通过注射、移植或局部施用将所述诱导型多能细胞给予至所述受试者。
65.一种救治退化的干细胞的方法，包括使所述细胞与NME接触。
66.一种提高诱导细胞多能性的效率的方法，包括使所述细胞与NME接触。
67.一种增加MUC1或MUC1*在细胞中的表达的方法，包括使所述细胞与NME接触。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述细胞是干细胞。
69.一种生成诱导型多能干细胞的方法，包括在不存在bFGF下使起始细胞与NME接触。
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