KR20070058453A - 줄기세포의 분화 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 특이한 세포 유형을 확인하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

만능 줄기세포, 배아 줄기세포, 배양체, 분화된 세포, 전사 조절 요소, 마커, 동종 재조합.

Description

줄기세포의 분화{DIFFERENTIATION OF STEM CELLS}

본 발명은 줄기세포의 분화에 관한 것이다.

인간 만능 줄기세포와 같은 만능 줄기세포는 현대 의학을 규정하는 많은 만성 질병을 이해하고 치료할 수 있는 능력을 극적으로 변경하고 확장할 수 있게 해준다. 약물의 발견으로부터 단클론성 항체의 생성, 세포 치료법의 제공에 이르기까지, 인간 세포 생물학의 대부분은 특정 세포 유형, 예컨대 인간 세포 유형을 마음대로 생성할 수 있는 능력에 의해 변형될 것으로 기대되고 있다. 만능 줄기세포를 의학적 및 산업적으로 적용하기 위해서는 대다수의 단일 세포 유형을 시험관 내에서 생성할 수 있는 능력이 필요하다. 공지의 모르포겐, 호르몬 또는 다른 화학물질을 사용한 처리를 통하여 세포 분화를 특정하는 현재의 방법은 일정한 경우에는 성공적이었지만, 실험실 밖에서의 실제 적용에 필요한 정도의 질과 부피로 세포를 생성할 수 있었던 경우는 없었다. 따라서 시험관 내에서 세포 유형을 생성할 필요가 매우 크다. 시험관 내 면역 시스템을 통한 단클론성 항체의 생성, 당뇨병 치료를 위한 샘(islets)의 생성, 및 신경 관련 기능장애를 위한 신경 전구체의 생성은 바로 그러한 특이한 세포 유형의 지속적이고 신뢰성 있는 생성을 필요로 하는 인간 질병 분야 중 일부이다. 이 연구계획의 경제적 중요성은 매우 크다. 단클론성 항체 응용은 그 자체만으로도 수십억 달러 규모의 사업이다. 미국 국립보건원(NIH)은 미국에서 당뇨병에 소요되는 연간 비용이 1조 3200억 달러라고 추정하고 있다. (http://diabetes.niddk.nih.gov/dm/pubs/statistics/index.htm#14). 신경퇴행성 질병에 드는 연간 국가 비용은 1조 달러가 넘는 것으로 추산하고 있다. (http://www.alzheimers.org/pubs/prog00.htm#The%20Impact%20of%20Alzheimer%92s%20Disease).

배아줄기세포 생물학을 실제로 적용하기 위해서는 대다수의 균질한 세포 유형의 생성이 필요하다. 특정 분화가 수반되는 미분화 줄기세포의 대규모 배양은 일련의 도전을 초래하는데, 그것은 대체 용액에 대한 필요성을 시사한다. ES와 EG 라인은 세포 배양 배지에 그것들의 성장과 미분화 상태의 유지를 지속시키기 위해 값비싼 재조합 호르몬, 예컨대 섬유아세포 성장 인자 및 백혈병 억제 인자의 첨가를 필요로 한다. 일반적으로 ES와 EG 라인은 여전히 공급기 층 위에서 배양된다. 그것들은 느리게 성장하고, 동결되며 적게 회수되고 계대되는 것이 어렵다. ES 및 EG 세포 배양을 더 용이하게 하는 연구가 진행 중이나, 그러한 과정은 언제나 실질적인 공급원 및 식견이 넓고 헌신적인 스태프들을 필요로 한다.

특정된 분화는 추가적인 문제점들을 나타낸다. 분화는 호르몬 환경을 변화시키거나, 배양체를 형성함으로써 또는 이 두 가지의 조합 중 어느 하나에 의해 개시될 수 있다. 배양체 형성이 현재 가장 광범위하게 사용되는 일반적인 과정이다. 이 방법은 배양체 내에 나란히 존재하는 다양한 조직 유형으로부터 광범위한 세포를 생성하는 것으로 나타난다. 이 방법의 문제점은 균일한 형성이라는 것을 생각하게 한다. 정지 상태 배양에서, 다양한 크기 및 형상의 배양체들을 형성하고, 이는 가변적인 분화 과정을 초래한다. 다시 말하면, 실험실 규모의 방법, 예컨대 행잉 드롭(hanging drop)은 이런 문제를 극복할 수 있는 한편으로, 대규모로 형성되는 경우에는 문제의 소지가 있다. 분화를 특정하기 위해, 배양체의 형성보다 호르몬과 화학물질을 사용하는 것이 오히려 더 매력적인 접근법으로 보이나, 기관 생성에 필요한 복잡한 상호작용에 관한 우리의 이해는 초보적인 것에 불과하다. 이러한 이해의 차이를 메우기 위해서 실험적으로 쉽게 접근할 수 없는 발생학적 과정에 대한 힘들고 까다로운 분석이 필요할 것이다.

본 발명에서는 실제로 어떠한 세포 유형이든지 시험관 내에서 생성할 수 있는 방법, 및 그 방법에 사용되는 조성물 또는 그 방법으로부터 유래 조성물이 개시된다. 생성된 이들 셀 라인은 정상적인 핵형의 장점을 유지하면서도 필요한 양으로 복제되고, 특징 지워지며, 냉동되고 사용될 수 있다. 이들 세포의 활용성은 현재 인간 줄기세포에 대해 계획하고 있는 많은 잠재적 적용의 실현을 가능하게 할 것이다.

본 명세서에 삽입되어 그것의 일부를 구성하는 첨부 도면은 여러 실시예들을 설명하는 것으로, 상세한 설명과 함께 개시된 조성물 및 방법을 설명한다.

도 1은 형질전환 유전자의 활성화된, 우성 네거티브 쌍의 순차적인 발현을 이용한 가역성 형질전환을 위한 카세트의 예를 개략적으로 나타낸 것이다. 개략도 아래에는 만능 줄기세포로부터 분화된 세포로 진행 과정 중 카세트의 일부가 활성 화되는 일시적인 진행 과정이 도시된다.

도 2A 내지 도 2C는 생식선 유래 만능 줄기세포인 ACTEG1으로부터 간세포 유래 셀 라인의 분리를 위해 사용될 수 있는 플라스미드의 예를 도시한다.

도 3은 절제 가능한 활성화된 발암유전자를 사용하는 가역적 형질전환을 위한 카세트의 예를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 4는 도 3에 도시한 바와 같은 카세트의 제조에 사용될 수 있는 플라스미드의 예인, ploxHBV-aRas의 구조를 나타낸 것이다.

도 5는 온도 민감성 형질전환 유전자를 사용하는 가역성 형질전환을 위한 카세트의 예를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 6은 스트라타진(Stratagene)에 의해 표시된 바와 같은 pEGSH 플라스미드를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 7은 개시된 조직 특이적 가역성 형질전환 (TSRT) 방법의 한 형태의 다이아그램을 나타낸 것이다.

도 8은 우성 네거티브 ras의 테트라사이클린 조절된 CMV 프로모터 유래 발현과 a-ras의 조직 특이적 프로모터 유래 발현을 이용한 가역적 형질전환을 위한 카세트의 예를 개략적으로 나타낸 것이다.

본 발명에서는 세포 및 셀 라인의 생성과 관련된 방법 및 조성물이 개시된다.

본 발명의 화합물, 조성물, 제품, 장치, 및/또는 방법을 개시하고 설명하기 전에, 그것들은 특별한 다른 언급이 없는 한 특정 합성 방법 또는 특정 재조합 생명공학 방법에, 또는 특별한 다른 언급이 없는 한 그 자체로서 달라질 수 있는 특정 시약에 한정되지 않는다는 것이 인지되어야 할 것이다. 또한 본원에 사용되는 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적이며 제한하려는 의도는 아니라는 것이 인지되어야 할 것이다.

많은 저자들이 인간 만능 줄기세포의 가능한 적용에 관해 썼다 (Gearhart, J (1998) Science 282, 1061-1062; Pera, MF, et al., (2000) J. Cell Sci. 113, 5-10; Trounson, A (2001) Reprod Fertil Dev. 2001;13(7-8):523-32; Sussman, NL, Kelly, JH. (1994) 미국 특허 제 5,368,555호). 이것들은 약물 발견에서 표적 평가 및 독성 시험으로부터, 췌장에 새로운 베타 세포를 이식함으로써 제 I형 당뇨병을 치료하기 위한 시도에 이르기까지 다양하다. 이들 출원은 각각 제어되고 재생가능한 공급원으로부터 다량의 분화된 세포를 필요로 한다. 선행 기술들이 이런 요구조건을 만족하지 못한 반면, 본원에 개시된 것은 제어되고 재생가능한 방법으로 시험관 내에서 원하는 세포 유형을 다량 생성할 수 있는 조성물과 방법이다.

인간 만능 줄기세포는 현대 의학을 규정하는 많은 만성 질병을 치료하는 능력을 극적으로 변경하고 확장할 수 있는 가능성을 제시한다. 신경퇴행성 질병, 신경근육 질병, 당뇨병, 자가면역 질병, 백혈병, 및 심장 질환은 모두 손상된 조직을 대체하고 재생할 목적으로 세포를 근간으로 하는 치료법의 표적이 되는 예들이다.

이러한 비전은 일차적으로 그러한 만능 줄기세포를 사용하여 유전자도입 마우스를 성공적으로 생성한 것을 토대로 한다 (Zambrowicz, BP, Sands, AT (2003) Nat. Rev. Drug Disc. 2, 38-51). 줄기세포를 시험관 내에서 변경하고 표적 돌연변이를 가진 마우스를 생성할 수 있는 능력은 유전자 조절 및 기능뿐만 아니라 포유류의 발달을 이해하는 데에 급격한 진보를 이끌어냈다. 이것은 계속해서 마우스 모델에서 인간 질병을 모방하는 능력을 유래하였고, 이는 약물 개발 과정을 촉진시켰다. 마우스에서 만능 줄기세포를 사용한 작업은 만능 줄기세포가 유기체의 어떠한 조직에든지 기여할 수 있으며, 관심 유전자는 본질적으로 마음대로 변경될 수 있고, 특정 실험의 필요에 따라 개별적인 조직에서 기능이 정지되거나, 결실되거나, 활성화되거나, 또는 발현될 수 있다는 것을 보여주었다.

이들 결과는 인간 만능 줄기세포 작업에 대한 열광을 적절하게 부추긴 한편, 이런 작업을 마우스로부터 인간에게로 일반화시키는데 있어 핵심적인 문제를 형성하기도 한다. 유전자도입 마우스의 모델로서의 성공 및 유기체형 분화를 유래하는 조직의 복잡한 상호작용을 복제하는 능력 때문에 시험관 내에서 분화를 재생하는 조건을 규정하는 데에는 실질적으로 적은 관심이 기울여졌다. 그러나 아직 세포-기초 치료라는 비전을 현실화하기 위해서는 실제로 응용할 수 있는 양의 특정 세포 유형 또는 세포 유형 세트가 시험관 내에서 생성될 필요가 있다. 절대적으로 균일한 집단을 포함하는 분화된 줄기세포, 즉 클론이거나 반-정제된 것들은 그것들이 정상적인 환경 이외의 곳에 이식될 때 종양을 형성하는 만능 줄기세포의 잘 입증된 성향을 피하기 위하여 유용할 것이다 (Andrew, PW (2002) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 405-417). 따라서 본원에 개시되는 것은 균일한 분화 줄기세포, 클론성 분화 줄기세포, 반-정제된 분화 줄기세포, 및 혼합 분화 줄기세포이다. 또한 본원에는 클론성일 수 있지만 반드시 클론은 아닌, 동일할 수 있지만 반드시 동일한 필요는 없는 세포 유형, 및 생성될 수 있는 세포 유형의 하위 세트일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 세포 집단이 개시된다. 이들 집단은 예를 들면 치료, 생체 내 독성 분석 또는 약물 스크리닝과 같은 다른 유형의 시험관 내 분석에 사용될 수 있다. 또한 반-정제된 세트의 세포 유형은 최소한 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 또는 25%의 특정 세포 유형, 예컨대 본원에 개시된 어떠한 세포의 어떠한 조합, 본원에 개시된 어떠한 세포, 또는 간세포를 포함한다.

본원에 개시되는 것은 분화된 줄기세포 및/또는 하나 또는 그 이상의 유형의 세포를 생성하는 방법이다. 또한 본원에는 개시된 방법에 의하여 생성된 세포 및/또는 세포 유형이 개시된다. 그 방법은 일반적으로 줄기세포를, 분화를 촉진하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계와, 하나 또는 그 이상의 세포 및/또는 세포 유형을 선택 또는 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다. 사용된 줄기세포는 마커(marker)를 코드화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함하는 핵산 절편을 포함할 수 있다. 선택 또는 스크리닝은 마커를 토대로 할 수 있다. 마커가 발현되는 세포 및/또는 세포 유형이 선택 또는 스크린될 수 있으며, 또는 마커가 발현되지 않는 세포 및/또는 세포 유형이 선택되거나 스크린될 수 있다. 이런 방법으로 특정 세포 및/또는 세포 유형이 줄기세포로부터 얻어질 수 있다.

전사 조절 요소는 조직-, 세포-, 세포 유형- 및/또는 세포 계통-특이적 전사 조절 요소일 수 있으며, 그것은 전사 조절 요소가 특정 조직, 세포, 세포 유형 및/또는 세포 계통에서 각각 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하거나 촉진한다는 것을 의미한다. 그러므로 본 발명의 개시된 방법에서, 마커는 전사 조절 요소가 특이적인 조직, 세포, 세포 유형 및/또는 세포 계통에서 발현될 수 있다. 이런 방식으로 특정 세포, 특정 조직의 세포, 특정 세포 유형 및/또는 특정 세포 계통의 세포들이 줄기세포로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에 개시된 방법은 그것에 의하여 관심의 분화된 세포가 줄기세포 및 관심의 대상이 아닌 분화된 세포로부터 선택 또는 스크린될 수 있는 특징 또는 특성 (마커의 발현 또는 비-발현)을 제공하는 장점을 갖는다. 개시된 방법의 개념은 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결된 마커가 단지 또는 주로 출발 줄기세포가 원하는 유형의 세포 또는 조직 (그것에 대해 전사 조절 요소가 특이적인 유형의 조직 또는 세포)으로 분화될 때에만 발현될 것 (또는 발현되지 않을 것)이라는 것이다. 어떠한 관심 세포, 세포 유형, 세포 계통 및/또는 조직도 관심 세포, 세포 유형, 세포 계통, 및/또는 조직에 관련된 전사 조절 요소를 선택함으로써 표적화될 수 있다.

유용한 유형의 마커는 형질전환 제제, 예컨대 발암 유전자이다. 이 경우 형질전환 제제의 발현은 세포의 형질전환을 유발할 수 있다. 그 결과는 형질전환 유전자를 발현하는 세포의 성장 및/또는 우선적인 성장일 수 있다. 분화된 줄기세포의 관점에서 형질전환, 및 관련된 성장은 대부분의 다른 분화된 줄기세포가 서서히 성장할 것이기 때문에 형질전환 제제를 발현하는 세포의 선택 및/또는 우선적인 성장을 가능하게 할 수 있다. 마커를 발현하는 (또는 발현하지 않는) 세포는 마커와 관련된 선택적인 압력을 적용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들어 많은 유전자와 단백질이 선택적인 장점 또는 단점을 세포에 부여하기 위해 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 마커를 발현하는 (또는 발현하지 않는) 세포는 마커를 발현하는 (또는 발현하지 않는) 세포를 확인함으로써 스크린될 수 있다. 예를 들어 많은 효소와 단백질은 검출될 수 있는 신호를 구성 및/또는 생성할 수 있다고 알려져 있다. 그러한 신호는 세포 확인의 기초가 될 수 있다.

상기 방법 또한 가역적인 마커 발현을 포함할 수 있다. 그것은, 예를 들면, 핵산 절편의 전부 또는 일부를, 예컨대 핵산 절편의 전부 또는 일부의 절제; 핵산 절편, 전사 조절 요소, 및/또는 마커의 비활성화; 핵산 절편, 전사 조절 요소, 및/또는 마커의 억제; 및/또는 역전 제제의 도입 및/또는 발현에 의해 제거함으로써 이루어질 수 있다. 핵산 절편의 절제는 많은 방법으로 이루어질 수 있다. 예를 들어 핵산 절편은 재조합 효소를 사용하는 부위-특정 재조합에 의해 절제될 수 있다. 역전 제제는 마커의 효과를 변경 및/또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어 마커가 Ras와 같은 형질전환 제제인 경우 세포의 형질전환 (Ras의 영향)은 우성 네거티브 Ras의 발현에 의해 역전될 수 있다. 형질전환 제제의 사용 및 형질전환의 후속적인 역전을 포함하는 개시된 방법은 조직 특이적 가역성 형질전환 (TSRT)으로 언급될 수 있다. 비록 TSRT가 조직 특이적 가역성 형질전환을 말하는 것이지만, 이것은 단순히 편리를 위한 것이며 TSRT는 형질전환 제제의 조직-, 세포-, 세포 유형- 및/또는 세포 계통-특이적 발현을 말하는 것으로 의도된다.

표시된 바와 같이, 역전 조작의 조합은 역전을 이루기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 핵산 절편의 절제과 역전 제제의 발현은 개시된 방법에서 함께 사용될 수 있다. 핵산 절편의 제거는 세포가 최소한의 유전적 변이 (예컨대 동일 유형의 천연 세포와 비교하여)을 가지도록 요구될 때 유용한 역전 조작이다. 이것은 예를 들면 세포가 치료적으로 사용되어야 할 경우 바람직하다.

본원에는 출발 물질로서 줄기세포를 사용하여 어떠한 특정 세포 유형의 분화된 셀 라인을 세우기 위한 조직-특이적 가역성 형질전환을 포함하는 방법이 개시된다. 또한 특정 세포 유형을 확인하고 배양하기 위해 사용될 수 있는 형질전환 유전자의 조직 특이적 발현을 이용하는 방법이 개시된다. 이러한 형질전환은 어떤 형태의 방법에서는 많은 가능한 과정 중 하나를 이용하여 역전될 수 있고, 그 결과 본원에서 논의되는 바와 같이, 상이한 또는 반-정제된 세포의 집단, 또는 세포의 클론성 집단을 포함하여 비-형질전환, 분화된 세포의 클론성 또는 반-정제된 집단이 생성된다.

본원에는 변형된 줄기세포, 예컨대 만능 줄기세포를 포함하는 조성물 및 방법이 개시되는데, 이때 만능 줄기세포는 예를 들어 그것의 발현이 전사 조절 요소, 에컨대 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터, 세포 특이적 프로모터, 및/또는 세포 계통 특이적 프로모터에 의해 조절되는 마커를 포함한다. 그런 다음 변형된 만능 줄기세포는 본원에서 논의되는 바와 같은 세포 증식 또는 배양체(EB) 및 분화된 세포 형성을 가능하게 하는 조건하에서 성장할 수 있다. 줄기세포가 EB를 형성하는 것을 가능하게 할 때 EB는 자발적 분화를 통해 상이한 많은 세포 유형을 생성한다. 개시된 일부 형태의 방법에서는 EB를 원하는 시간 동안 형성되도록 한 후, 예컨대 세포를 마커에 대하여 동족의 선택 배지에서 성장시킴으로써 선택적 압력이 적용될 수 있다. 이 시점에서 상이한 많은 세포 유형이 존재하는 반면 (유형의 수는 시간의 길이에 좌우되고, EB는 선택적 압력 없이 발생하도록 허용된다), 선택적 압력은 발현된 마커를 가지는 세포가 선택적으로 증폭되거나 가시화되는 것을 유발한다. 선택적 마커를 가지는 세포는 원하는 분화된 세포 유형 또는 유형들인데, 이는 마커가 조직 특이적 프로모터로부터 원하는 세포 유형 또는 유형들에서 우선적으로 또는 선택적으로 발현될 수 있도록 디자인될 수 있기 때문이다. 또한 특정 시스템에서는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터에 의해 작동되는 마커가 존재할 수 있는 것으로 인지된다. 상이한 프로모터에 의해 작동되는 다중 마커가 있다면, 조직 특이적 프로모터가 단일 조직에서 집중적으로 발현되지 않는 세포 유형에 대해서는 선택의 엄격성이 증가할 수 있다. 또한 원하는 세포가 확인되는 선택 단계 또는 단계들 후에 추가의 확인 단계가 존재할 수 있다는 것이 인지된다. 이들 확인된 세포는 다음에 추가로 분리되어 배양될 수 있다.

일정 시간이 지난 후 선택 조건 (예컨대, 선택적 압력)은 제거되어 세포 증식을 증가시킬 수 있고, 그런 다음 선택적 압력이 다시 적용될 수도 있다. 그러므로 선택의 반복 과정이 일어날 수 있고, 그것은 선택의 엄격성을 증가시킨다. 선택의 반복적인 일련의 과정은 또한 하나 이상의 마커 유형이 동일한 조직 특이적 프로모터로부터 발현되는 시스템에서 일어날 수 있다. 어떤 형태의 방법에서는 이들 선택의 반복적인 일련의 과정이, 예를 들면, 첫 번째 마커가 활용된 후에 두 번째 마커가 활용되고, 그 후에 첫 번째 마커가 활용되고 다시 두 번째 마커가 활용되는 식으로 일어날 수 있다. 선택적 압력의 적용이 완료된 후에는 원하는 분화된 세포가 비-선택적 조건하에서 성장할 수 있고, 그때에 마커 및 관련된 DNA는 필요에 따라 제거될 수 있다. 이것을 이루는 방법은 많이 있는데, 예를 들면 재조합 효소 기법, 예컨대 Cre-lox 기법 또는 온도 특이적 돌연변이 마커를 사용하는 것을 포함한다. 또한 마커는 만능 줄기세포 염색체에 통합되거나 염색체 외재성 카세트, 예컨대 포유류 인공 염색체상에 은닉될 수 있다는 것이 인지된다.

본원에는 출발 물질로서 줄기세포를 사용하는 어떠한 특정한 세포 유형의 분화된 셀 라인을 수립하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 이 메커니즘은 마커, 예컨대 특정 세포 유형을 확인하고 배양하기 위해 사용된 형질전환 유전자의 조직 특이적 발현을 사용할 수 있다. 이 형질전환 사건은 가능한 많은 과정 중에서 하나를 사용하여 역전될 수 있으며, 그 결과 형질전환되지 않고, 분화된 세포의 클론성 또는 반-정제된 집단이 생성된다.

예를 들어 본원에는 B형 간염 바이러스 코어 항원으로부터 RAS 유전자의 상이한 변이를 유래하는 인간의 간 특이적 프로모터/인핸서에 관련된 조성물 및 방법이 개시된다. 어떤 형태의 방법에서, 역전 제제로서 엑디손 유래성 우성 네거티브 RAS에 결합된 활성화된 RAS가 사용될 수 있다. 어떤 형태의 방법에서는 HBV/RAS 구성물의 양 옆에 CRE 재조합 효소로 절제될 수 있는 loxP 부위가 있을 수 있다. 일부 다른 형태의 방법은 온도 민감성 (ts), 활성화된 RAS의 생성을 사용할 수 있다.

전형적으로 마커 구성물은 줄기 셀 라인, 예컨대 인간 배아종(embryonal germ)(EG) 셀 라인 안에서 형질전환될 수 있다. 그 결과로 생긴 셀 라인의 분화는 예를 들면 배양체의 형성에 의해 개시될 수 있다. 이런 방법으로 천연 생물학적 과정이 적절한 세포 유형의 발생을 초래한다. 세포가 원하는 세포 유형이 될 때, 예컨대 간세포, 조직 또는 세포 특이적 프로모터, 예컨대 간 특이적 구성물은 활성화될 것이고, 마커가 발현될 것이다. 세포는 예컨대 형질전환되거나 마커의 발현에 의해 추적된다. 선택적 배지, 예를 들면 소프트 한천 배지(soft agar)가 형질전환된 세포를 위해 사용될 수 있으며, 선택 배지에 놓이게 될 때 EB의 형질전환된 세포 중에서 단지 적절하게 분화된 세포만이 생존하거나 선택적 장점을 갖게 된다. 형질전환된 세포는 우선적으로 또는 선택적으로 성장하여 콜로니를 형성할 것이다. 콜로니는 선택되어 클로닝을 위해 다시 평판 배양된다. 용도에 따라 세포는 표준 방법에 의해 원하는 양과 형태로까지 성장될 수 있다. 적절한 시간에 역전 신호, 예컨대 유전자 전환을 위해서는 엑디손, lox 구성물을 위해서는 CRE 재조합효소 또는 ts 구성물을 위해서는 온도 이동이 적용될 수 있고, 그 결과 기능적으로 일차 배양물과 동등한 세포의 집단이 생성된다.

예를 들어 본원에는 구조물 P-I를 포함하는 핵산 절편을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 이때 P는 전사 조절 요소이고, I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환 제제를 포함할 수 있다.

본원에는 마커가 이종성 핵산으로부터 발현되고, 핵산은 또한 자살 유전자를 포함하며, P는 조직 특이적 전사 조절 요소이고, P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 유발하며, 불멸화제가 온도 허용 제제이고, I는 SV40 라지 T 항원을 포함하며, 핵산 절편의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있고, I의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있으며, P의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있고, 및/또는 P-I의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열 X가 있어서 X-P-I-X를 형성하는 것이 특징인 세포가 개시된다.

또한 본원에는 본원에 개시된 줄기세포로부터 핵산 절편을 절제함으로써 생성된 세포가 개시된다.

본원에는 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편이 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제를 사용하여 절제되고, 및/또는 구조 P-I를 포함하는 핵산 분자의 절제가 비-절제된 핵산 분자의 재조합을 초래하게 되는 세포가 개시된다.

본원에는 줄기세포로부터 조건성 불멸 세포 유형의 집단을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환하는 단계, 줄기세포를 요소 P의 전사 조절이 활성화되도록 하는 환경에서 배양함으로써, I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 하는 단계, 그리고 I를 발현하는 세포 유형을 선택하는 단계로 이루어진다.

본원에는 추가로 I를 발현하는 세포 집단의 순도를 증가시키는 단계를 포함하고, 또한 핵산을 절제하는 단계를 포함하며, 추가로 선택된 세포 유형을 냉동시키는 단계를 포함하고, 및/또는 추가로 세포 집단에 관심의 유전자를 첨가하는 단계를 포함하는 방법이 개시되는데, 상기 순도를 증가시키는 단계는 세포의 클론성 또는 반-정제된 집단을 생성하는 것을 포함한다.

본원에는 조건성 불멸 세포 유형을 유도하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환하는단계, 조절 요소 P를 활성화시켜 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 단계, I를 발현하는 세포 유형을 선택하고 P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 절제하는 단계, 선택된 세포 유형을 환경과 접촉시켜서 이미 P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 포함하는 핵산의 말단들을 재결합하는 단계; 그리고 선택된 세포 유형을 냉동하는 단계로 이루어진다.

본원에는 줄기세포 배양물이 자발적으로 배양체로 분화되는 것이 허용되는 방법이 개시된다.

또한 본원에는 세포 배양물을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환하는 단계, 줄기세포를 환경과 접촉시켜서 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 단계, I를 발현하는 세포를 배양하는 단계로 이루어진다.

본원에는 추가로 I를 발현하는 배양된 세포를 클로닝하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 세포를 예컨대 본원에 개시된 세포 이식에 의해 투여하는 것으로 이루어지는, 환자의 치료 방법이 개시된다.

본원에는 조성물을 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포와 함께 인큐베이션하는 것으로 이루어지는, 독성에 대하여 조성물을 분석하는 방법이 개시된다.

본원에는 구조 P-I를 포함하는 핵산 분자 구성물을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 이때 P는 조직 특이적 전사 조절 요소이고, P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현될 수 있도록 I를 유발하고, I는 온도 허용성 불멸화 제제이다.

본원에는 구조물 X-P-I-X를 포함하는 핵산 분자 구성물을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 이때 P는 조직 특이적 전사 조절 요소이고, P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현될 수 있도록 I를 유발하고, I는 온도 허용성 불멸화 제제이며, X는 부위-특이적 절제 서열이다.

본원에는 P-I가 절제되거나, P-I가 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제에 의해 X에서 절제되거나, 및/또는 P-I의 절제로 이미 P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 포함하는 핵산의 재조합이 가능해지는 세포가 개시된다.

본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 구조물 P-I를 포함하는 구성물로 형질전환하는단계, 줄기세포를 환경과 접촉시켜서 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 하는 단계, I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계, 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어진다.

본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 구조물 X-P-I-X를 포함하는 구성물로 형질전환하는단계, 줄기세포를 환경과 접촉시켜서 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 하는 단계, I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계, 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어진다.

본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 본원에 개시된 핵산 분자 구조물 X-P-I-X를 포함하는 구성물로 형질전환하는단계, 줄기세포를 환경과 접촉시켜서 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 하는 단계, I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계, P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 절제하는 단계, 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어진다.

본원에는 P와 I가 동일한 벡터에 포함되어 있거나 또는 P와 I가 상이한 벡터에 포함되어 있는 세포가 개시된다.

본원에는 줄기세포로부터 분화된 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 특히 유용한 형태의 방법은 부위 특이적 재조합과 조직 특이적, 가역성 형질전환 (TSRT) 과정을 포함한다. 방법은 예를 들면 flp/frt 중재된 재조합과, 예를 들어, ras 형질전환을 활성화하고 적절한 세포를 확인하기 위하여 조직 특이적 프로모터를 사용할 수 있다. 그런 다음 형질전환이 예컨대 우성 네거티브 ras의 테트라사이클린 조절된 발현을 사용하여 역전될 수 있다. 이들 기법을 단계적으로 적용함으로써 원하는 세포 유형의 세포가 생성되고, 그것들은 그것들의 발생 프로그램에 대한 광범위한 지식이 없어도 복제되고, 저장되고 배양될 수 있다. 형질전환의 역전으로는 분화된 세포의 입증가능하게 균일한 집단이 생성된다. 상기 과정은, 도 7에서 예로서, 도 8에 도시된 핵산 절편을 사용하여 개략적으로 도시된다. 어떠한 세포 유형이든지 핵산 절편에서 조직 특이적 프로모터 (TS 프로모터)를 중단(switch out)시킴으로써 선택될 수 있다. 이 예에서는 α-MHC 프로모터가 사용된다. 도 8의 조직 특이적 선택제는 우성 네거티브 ras를 유래하는 테트라사이클린 조절된 CNV 프로모터와 a-ras를 유래하는 조직 특이적 프로모터로 구성된다. 관심 조직 유형의 형성은 프로모터를 활성화하고 세포를 형질전환한다. 필요하다면 형질전환은 테트라사이클린을 첨가함으로써 역전된다.

개시된 방법은 규정된 공급기 유리 조건하에서 배양될 수 있는 줄기세포, 예컨대 인간 배아종(EG) 셀 라인을 사용할 수 있다. 어떤 형태의 방법에서, 이들 세포에 사용될 수 있는 TSRT 과정은 배양체가 분화되는 중에 형성된 세포 유형을 확인하고 배양하기 위해 사용될 수 있으며, 조직 특이적 프로모터로부터 발현된 ras와 같은 형질전환 유전자의 세포 성장을 유래하는 능력이라는 장점을 갖는다. 그런 다음 이들 세포는 복제되고, 특징 지워져, 필요에 따라 Master Cell Bank에 냉동된다. 세포가 사용될 때, 예컨대 약물 스크리닝 또는 세포 치료법으로 사용될 때, 형질전환 과정은 상응하는 우성 네거티브 ras의 발현을 통해 역전될 수 있다. 이런 방법으로, 어떠한 필요한 세포 유형이든지 확인되고, 어떠한 원하는 양으로 배양될 수 있으며, 형질전환되지 않은 표현형으로 양적으로 전환될 수 있다.

개시된 방법은 예를 들면 방법을 위해 개조된 변형된 줄기세포의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어 frt 재조합 부위는 줄기 셀 라인, 예컨대 EG 셀 라인에 삽입되어, 조직 특이적 선택제가 각각의 선택을 위해 동일한 공지 부위에 삽입되는 것을 가능하게 할 수 있다. 선택제는 예를 들면 발현-조절된 형질전환 제제를 포함하는 핵산 절편일 수 있다. 최적의 통합 부위를 가지는 줄기 셀 라인을 확인하기 위해 독립적인 분리물이 확인될 수 있다. 그 결과의 줄기 셀 라인은 frt 삽입 (FI) 라인으로서 언급될 수 있다. frt 삽입 라인은 테트라사이클린 조절된 삽입 부위를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그 결과 생성된 테트라사이클린 오퍼레이터 frt 삽입 (TOFI) 라인은 형질전환을 역전시키기 위해 우성 네거티브 형질전환 제제의 조절된 발현을 가능하게 한다.

Flp는 람다 통합효소 패밀리의 구성원으로, 효모에서 DNA 절편을 들어올리는 능력 때문에 붙여진 이름이다 (Branda and Dymecki, (2004) Talking about a revolution: the impact of site specific recombinases on genetic analyses in mice. Developmental Cell 6, 7-28). 그것은 특이한 인지 서열, frt(flp 재조합효소 표적)를 통하여 재조합을 중재한다. frt 서열의 삽입은 두 번째 frt 서열을 포함하는 플라스미드의 부위 특이적 통합을 가능하게 하는 것으로 증명되었다. Flp/frt는 배아 줄기세포에서 효율적으로 작용하는 것으로 증명되었다 (Dymecki, (1996) Flp recombinase promotes site specific DNA recombination in embryonic stem cells and transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 6191-6196).

frt 부위 (또는 부위 특이적 재조합 또는 삽입 부위)를 줄기 셀 라인에 삽입함으로써, 선택제 구성물인, ras에 부착된 조직 특이적 프로모터가 모든 선택을 위해 동일 부위에 대해 표적화될 수 있다. 이것은 DNA가 게놈 절편에 통합되어 분화과정으로서 계속되거나 계속되지 않거나 또는 기능화 유전자에 통합되는 경우 DNA의 특정되지 않은 삽입으로 발생하는 문제를 제거한다. 비록 종래의 DNA 삽입 시스템의 해결하기 어려운 문제는 아니라 하더라도 (그런 문제는 일반적으로 선택 배지에서의 연속 성장에 의해 극복될 수 있다), 개시된 방법은 명쾌한 해결책을 제공한다. 개시된 방법은 선택제의 무작위 삽입을 사용할 수 있지만, 이것은 각각의 삽입물이 삽입 효과에 대해 평가될 필요가 반드시 있기 때문에 더 많은 작업을 필요로 한다. 재조합 부위를 사용하는 것은 적절한 세포를 한 번 생성하는 것을 가능하게 한다. 이 세포는 그런 다음 되풀이해서 사용될 수 있으며, 동일한 부위에 반복적으로 재조합되어 추가적인 세포 유형을 선택할 수 있다. 절제 부위에 재조합됨으로써 모든 형질전환체들은 동일해 질 것이며, 따라서 전체 접시는 클로닝을 반복하는 문제 없이 수집될 수 있다. flp/frt 시스템의 사용은 또한 형질전환의 효율을 최대화한다.

개시된 방법은 예를 들어 원하는 세포 유형에서 활성인 전사 조절 요소의 사용을 토대로 하여 어떠한 원하는 세포 유형이든지 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 심근세포는 개시된 방법으로, 예컨대 알파 미오신 중쇄 (αMHC) 프로모터를 유래하는 ras를 사용함으로써 제조될 수 있다. 삽입된 테트라사이클린 조절된, 우성 네거티브 ras는 그런 다음 심근세포의 형질전환을 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 온도 민감성 형질전환체 또는 선택제 (발현-조절된 형질전환 제제를 포함하는 핵산 절편)의 절제는 flp 재조합효소의 조절된 발현을 통한다.

A. 조성물

1. 줄기세포

줄기세포 (Gilbert, (1994) DEVELOPMENTAL BIOLOGY, 4th Ed. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA., p. 354)는 "더 분화된 세포 원조뿐만 아니라 더 많은 줄기세포 (자체-재생)를 만들어내는, 광범위한 증식을 할 수 있는" 세포로서 규정된다. 이 특성은 줄기세포 능력으로서 언급될 수 있다. 만능 줄기세포, 성체 줄기세포, 낭포-유래 줄기세포, 생식선-유래 줄기세포, 기형종-유래 줄기세포, 분화 전능 줄기세포, 다기능 줄기세포, 배아 줄기세포 (ES), 배아종 세포 (EG), 및 배아 암종 세포 (EC)가 모두 줄기세포의 예이다.

줄기세포는 다양한 상이한 특성 및 이들 특성의 범주를 가질 수 있다. 예를 들어 어떤 형태의 줄기세포는 미분화 상태에서 최소한 10, 15, 20, 30, 또는 더 많은 계대 동안 증식할 수 있다. 어떤 형태의 줄기세포는 1년 이상 분화 없이 증식할 수 있다. 줄기세포는 또한 증식 및/또는 분화하는 한편으로 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 줄기세포는 또한 생식 세포, 난자 및 정자를 포함하여, 중배엽, 내배엽, 및 외배엽 조직으로 분화할 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 일부 줄기세포는 또한 미분화 상태에서 시험관 내에서 무한 증식할 수 있는 세포일 수 있다. 어떤 줄기세포는 또한 연장된 배양을 통해 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 어떤 줄기세포는 연장된 배양 후에도 세 가지의 모든 배아 생식층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 유도체로 분화할 수 있는 가능성을 유지할 수 있다. 어떤 줄기세포는 유기체에서 어떠한 세포 유형이든지 형성할 수 있다. 어떤 줄기세포는 특정 조건하에서, 예컨대 미분화된 성장을 유지하지 못하는 배지 상에서 성장될 때 배양체를 형성할 수 있다. 어떤 줄기세포는 예컨대 낭포와의 융합을 통하여 키메라를 형성할 수 있다.

어떤 줄기세포는 다양한 마커에 의해 규정될 수 있다. 예를 들어 어떤 줄기세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 어떤 줄기세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-81을 발현한다. 어떤 줄기세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-81을 발현하지 못한다. 어떤 줄기세포는 Oct4와 Nanog를 발현한다 (Rodda et al., J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005); Chambers et al., Cell 113, 643-655 (2003)). 어떤 줄기세포는 이것들을 mRNA 수준에서 발현할 것이고, 다른 줄기세포는 그것들을 단백질 수준에서, 예를 들면 세포 표면상에 또는 세포 내에서 발현할 것임이 인지된다.

줄기세포는 본원에서 논의되는 어떠한 줄기세포 특성 또는 범주 또는 범주들 및 특성들의 모든 조합을 가질 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어 어떤 줄기세포는 알칼리성 포스파타제를 발현하고, SSEA-1을 발현하지 않으며, 최소한 20 계대 동안 증식하고, 어떠한 세포 유형으로든지 분화할 수 있다. 다른 세트의 줄기세포는 예를 들면 SSEA-1을 세포 표면에 발현할 수 있고, 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 조직을 형성할 수 있으며, 분화 없이 1년 이상 배양될 수 있다. 또 다른 세트의 줄기세포는 예를 들면 SSEA-1을 발현하는 만능 줄기세포일 수 있다. 또 다른 세트의 줄기세포는 예를 들면 알칼리성 포스파타제를 발현하는 낭포-유래 줄기세포일 수 있다.

줄기세포는 줄기세포의 원하는 유형의 특성을 촉진하는 모든 배양 수단을 사용하여 배양될 수 있다. 예를 들어 줄기세포는 만능 배아 줄기세포를 생성할 염기성 섬유아세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 막 결합 강(steel) 인자, 및 가용성 강 인자의 존재하에 배양될 수 있다 (미국 특허 제 5,690,926호, 5,670,372호, 및 5,453,357호 참조; 최소한 배양중의 만능 배아 줄기세포를 유래하고 유지하는 것에 관련된 물질에 대한 참조). 줄기세포는 또한 배아 섬유아세포 상에서 배양될 수 있고, 분리된 세포는 배아 공급기 세포에서 다시 평면 배양될 수 있다 (미국 특허 제 6,200,806호 및 5,843,780호 참조; 최소한 줄기세포를 유래하고 유지하는 것에 관련된 물질에 대한 참조).

줄기세포의 한 범주는 만능 배아 줄기세포이다. 만능 배아 줄기세포는 본원에서 생식 세포 (정자와 난자)를 포함하여, 배 또는 성체에서 분화된 많은 세포 유형으로 발생시킬 수 있는 세포를 의미한다. 만능 배아 줄기세포는 또한 자체-재생될 수 있다. 그러므로 이들 세포는 생식선을 차지하고 성체의 특수화된 기관을 포함하는 다수의 최종적으로 분화된 세포로 발생할 뿐만 아니라 자체 재생가능하다.

줄기세포의 한 범주는 자체 재생할 수 있고 중배엽, 외배엽, 및 내배엽의 세포 유형으로 분화할 수 있지만, 생식 세포, 즉 정자 또는 난자로 발생하지는 않는 세포이다.

줄기세포의 다른 범주는 자체 재생할 수 있고, 중배엽, 외배엽, 및 내배엽의 세포 유형으로 분화할 수 있지만, 태반 세포로 발생하지는 않는 세포이다.

줄기세포의 또 다른 범주는 배 또는 태아로부터 유래되지 않는 모든 유형의 줄기세포인 성체 줄기세포이다. 전형적으로 이들 줄기세포는 비록 성체 줄기세포가 이미 설명된 세 가지의 모든 세포 유형을 생성할 수 있다 하여도 새로운 세포 유형을 생성할 수 있는 제한된 능력을 가지며 특정 계통에 관련된다 (예를 들면 미국 특허 출원 공보 번호 20040107453호 (Furcht, et al. published June 3, 2004)와 PCT/US02/04652, 최소한 성체 줄기세포에 관련된 물질과 성체 줄기세포를 배양하는 것에 관련된 참조). 성체 줄기세포의 한 예는 다기능 조혈 줄기세포로, 그것은 적혈구, 대식세포, T 및 B 세포와 같은 혈액의 모든 세포를 형성한다. 이들과 같은 세포는 조혈 계통 내에 있는 그것의 만능성 때문에 "만능 조혈 줄기세포"로 언급된다. 만능 성체 줄기세포는 만능 능력을 지니는 성체 줄기세포이다 (미국 특허 공보 번호 20040107453, 미국 특허 출원 No. 10/46796).

또 다른 범주의 줄기세포는 낭포-유래 줄기세포로, 그것은 예를 들면 64, 100 또는 150 세포 단계 전에 낭포로부터 얻어진 세포로부터 유래 만능 줄기세포이다. 낭포-유래 줄기세포는 낭포의 내부 세포 덩어리로부터 유래될 수 있으며, 통상 유전자도입 마우스 작업에 사용되는 세포이다 (Evans and Kaufman, (1981) Nature 292:154-156; Martin, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78:7634-7638). 배양된 낭포로부터 분리된 낭포-유래 줄기세포는 그것들의 미분화 특성을 무한하게 보유하는 영구적인 셀 라인으로 발생할 수 있다. 낭포-유래 줄기세포는 현대 분자 생물학 기법 중 어느 하나를 사용하여 조작된 후, 새로운 낭포에 재-이식될 수 있다. 이 낭포는 낭포-유래 줄기세포의 유전적 구성을 은닉하는 완전한 최종 동물로 발생할 수 있다 (Misra and Duncan, (2002) Endocrine 19:229-238). 그러한 특성 및 조작은 일반적으로 낭포-유래 줄기세포에 적용할 수 있다. 낭포-유래 줄기세포는 이식 전 또는 후의 배로부터 얻을 수 있고, 전-이식 낭포-유래 줄기세포와 후-이식 낭포-유래 줄기세포로 각각 언급될 수 있는 것으로 인지된다.

또 다른 범주의 줄기세포는 생식선-유래 줄기세포로, 예컨대 배란 후 발생 단계 또는 6, 7, 8, 9 또는 10주 경과 후의 인간 배 또는 태아로부터 얻어진 세포로부터 유래 만능 줄기세포이다. 알칼리성 포스파타제 염색은 5-6주 단계에서 일어난다. 생식선-유래 줄기세포는 예컨대 생식선 세포로부터 6-10주 지난 인간 배 또는 태아의 생식선으로부터 유래될 수 있다.

다른 범주의 줄기세포는 배 유래 줄기세포로, 150개 세포로 구성된 배 또는 잉태 후 6주까지의 더 많은 세포로 구성된 배로부터 유래한다. 전형적으로 배 유래 줄기세포는 낭포의 내부 세포 덩어리 세포 또는 내부 세포 덩어리 세포, 예컨대 발생중에 생식선으로 이동하는 세포로부터 발생할, 생식선 세포가 될 세포로부터 발생한 세포로부터 유래한 것이다.

다른 세트의 줄기세포로는 배아 줄기세포 (ES 세포), 배아종 세포 (EG 세포), 및 배아 암종세포 (EC 세포)가 있다.

또한 본원에는 기형종-유래 줄기세포로 언급되는 다른 범주의 줄기세포가 개시되는데, 그것은 기형암종으로부터 유래한 줄기세포이고 정상적인 핵형의 결핍을 특징으로 한다. 기형암종은 대부분의 종양과는 달리 흔하지 않은 종양으로, 광범위한 상이한 조직 유형으로 구성된다. 기형암종에 대한 연구는 그것이 통상적인 조절 메카니즘을 벗어난 원시적인 생식 조직으로부터 발생하였음을 시사한다. 그런 특성 및 조작은 일반적으로 기형종-유래 줄기세포에 적용할 수 있다.

줄기세포는 또한 그것의 발생 가능성에 의해 분류될 수 있다. 한 범주의 줄기세포는 완전한 유기체로 성장할 수 있는 줄기세포이다. 다른 범주의 줄기세포는 전체 유기체로 성장할 수는 없지만, 신체의 어떤 다른 형태도 될 수 있는 (상기에서 규정된 바와 같은 전능 능력을 가지는) 줄기세포이다. 또 다른 범주의 줄기세포는 특정 유형의 세포, 예컨대 혈구, 또는 뼈 세포로만 될 수 있는 줄기세포이다. 다른 범주의 줄기세포는 분화 전능성, 전능, 및 다기능 줄기세포를 포함한다.

본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 일반적으로 "줄기세포" 또는 "전능 줄기세포"와 관련하여 참조로 설명된다. 그러나 개시된 방법은 줄기세포와 전능 줄기세포의 사용에 한정되지는 않는다. 개시된 방법 및 조성물은 모든 유형 또는 범주의 줄기세포, 예컨대 성체 줄기세포, 낭포-유래 줄기세포, 생식선-유래 줄기세포, 기형종-유래 줄기세포, 분화 전능 줄기세포, 및 다기능 줄기세포, 또는 본원에서 설명되는 어떠한 특성이든지 가지는 줄기세포를 사용 또는 포함할 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 어떠한 유형 또는 범주의 줄기세포를 단독으로 및 어떠한 조합으로든 개시된 방법 및 조성물에서 또는 그것들과 함께 사용하는 것이 구체적으로 고려되고 설명된다.

2. 시험관 내에서 줄기세포의 분화

최근에 이르기까지, 만능 줄기세포 작업은 거의 전적으로 마우스에 한정되었었다. 비록 여러 다른 종들로부터 라인들이 유래되었지만, 마우스의 실험적 장점 때문에 대부분의 작업이 마우스에 집약되었다. 실험 모델로서의 마우스의 이차적인 중요성은 시험관 내 분화를 용이하게 하기 위한 조건을 수립하는 작업을 상대적으로 덜 강조한 것이었다. 유전자도입 마우스를 생성하는 데 있어 상대적인 간편성은 기관과 유사한 분화를 유래하는 극히 복잡한 세포의 상호작용을 모방하는 세포 배양 조건을 규정하는 불확실하고 우연을 기대하는 작업을 낙담시켰다. 인간 전능 줄기세포의 발표와 함께, 시험관 내 분화를 조절하는 능력은 새롭게 부각되었다.

전능 줄기세포는 예를 들면 공급기 층에서 유지되었고, 적절한 배양 배지가 있을 때에 미분화된 상태로 무한정 유지된다. 공급기 층의 제거 및 현탁액 중에서의 배양으로 응집체가 형성되고 다른 분화된 세포가 형성된다 (Kyba, M, (2003) Meth. Enzymol. 365, 114-129). 이들 응집체는 조직화하기 시작하고 낭포의 특성 중 일부를 나타내기 시작한다. 이들 전낭포는 배양체 (EB)로 언급된다. EB 내에서, 증식과 분화의 진행적인 반복이 일어남으로써 대충 발생 패턴을 따른다. 광범위한 조직 유형이 EB에서 확인될 수 있는 반면, 외부에서의 지시가 없으면 분화는 혼란스러워지고 어떠한 하나의 세포 유형이라도 유의할만한 양으로 형성되는 것을 유도하지 못한다 (Fairchild, PJ, (2003) Meth. Enzymol. 365, 169-186). 더 큰 비율의 세포가 어떠한 특정 발생 경로로 향하도록 수많은 방법들이 고안되었다 (Wassarman, PM, Keller, GM. (2003) METHODS IN ENZYMOLOGY, Differentiation of Embryonic Stem Cells, vol. 365, Elsevier Academic Press, New York, NY, 51 Op.). 그것들은 공지의 모르포겐을 사용한 처리, 호르몬 환경의 변경, 특정 기질 상에서의 세포의 배양, 및 시험관 내 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 화학물질의 순차적 적용 형태를 취하였다. 이들 방법들은 모두 특정 적용에는 성공적이었지만, 균일하게 하나의 세포 유형인 세포를 생성할 수 있었던 경우는 없었다.

균일성의 문제 외에, 당업자가 이차 적용시 특정 세포 유형을 실제로 사용할 수 있는 가능성을 고려할 때 다른 문제가 발생한다. 예를 들어 독성 시험에 사용하기 위한 정상인 간세포는 약물 개발에 매우 유용할 수 있다. 인간 간으로부터 직접 유래 세포인 인간 일차 간세포는 매우 짧은 시간 동안에만 공급이 가능하다. 줄기세포 라인으로부터 유래한 간세포는 이런 문제를 해결할 수 있지만, 활용하기 위해서는 상당한 수가 필요할 것이다. 본원에 개시된 것은 이런 문제를 해결할 수 있는 조성물과 방법이다.

줄기세포 유래 생성물이 실제 적용에 적용될 수 있기 위해서는, 다량의 동일 세포가 생성될 필요가 있다. 이상적으로는 이것은 각 세포 유형에 대해 장황한 실험을 필요로 하기보다는 광범위하게 적용될 수 있는 일반적인 과정일 수 있다.

3. 세포 특이적 생성

조직 특이적 가역성 선택, 예컨대 형질전환은 분화된 줄기세포를 생성하기 위해 유용한 과정을 제공한다. 개시된 방법은 어떠한 특이적 유형의 세포의 영구적 라인이 확인되고 배양된 후, 전체 집단이 정상 표현형으로 복귀되거나 전체 집단으로부터 제거되는 것을 가능하게 한다.

본원에는 어떠한 원하는 세포 유형의 셀 라인으로 발달될, 줄기 셀 라인의 조직 특이적, 가역성 형질전환을 사용하는 조성물 및 방법이 개시된다. 개시된 방법은 형질전환 제제의 조직 특이적 발현을 사용한다. 또한 본원에는, 예컨대, 원하는 세포 생성물의 관계에 따라 형질전환 유전자의 우성 네거티브 버전의 발현과 같은, 어떠한 수의 방법들을 통해, 형질전환이 역전되는 방법이 개시된다. 개시된 조성물 및 방법은 줄기세포의 대규모 배양을 피하는데, 이는 줄기세포는 그 자체가 원하는 세포 유형을 분리하기 위해 실험실 규모상으로만 성장할 필요가 있기 때문이며; 그것들은 복제될 수 있고 현재 대규모 세포배양 적용에서 행해지고 있는 것처럼 특징 지워질 수 있고 냉동될 수 있는 개별적 셀 라인을 발생시키며; 조성물 및 방법은 이들 복잡한 과정을 대규모로 복제하기 위한 시도를 하기보다는 생물학 자체의 힘을 활용하기 때문에 그것들은 현재 잘 알지 못하는 생물학의 일부를 우회하고; 셀 라인이 일차적 배양조건으로 배양중에 가장 잘 형질전환된 것처럼 행동할 것이기 때문이다. 즉, 상기 배양조건으로는 인슐린, 트란스페린, 셀레늄, 통상 세포 배양 배지가 대부분의 상기 라인에 대해 적절할 것이다. 본원에서 논의되는 바와 같이 비-형질전환 방법도 사용될 수 있으며, 형질전환 방법과 상호교환가능하다.

4. 변형 줄기세포

본원에는 변형 줄기세포가 개시된다. 변형 줄기세포는 세포의 원래 배경과는 상이한 유전적 배경을 가지는 줄기세포이다. 예를 들어, 변형 줄기세포는 외래 염색체 핵산 또는 통합된 핵산 중 어느 하나로부터 마커를 발현하는 줄기세포일 수 있다. 줄기세포는 마커의 발현을 통한 것을 포함하여 많은 방법으로 변형될 수 있다. 마커는 줄기세포 또는 줄기세포로부터 유래한 세포의 선택 또는 스크리닝을 허용하는 모든 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 비-형질전환 세포는 성장할 수 없는 조건에서 성장할 수 있는 세포를 제공하는 형질전환 유전자, 예컨대 Ras일 수 있다.

세포는 마커와 관련된 어떤 방식으로 세포 집단을 변경하도록 디자인된 조건하에서 세포가 성장하거나 놓이는 것을 의미하는 선택적 압력하에 놓일 수 있다. 예를 들어, 마커가 마커를 발현하는 세포에 항생물질 내성을 부여한다면, 세포 집단은 항생물질이 존재하는 조건 하에 놓일 수 있다. 항생물질 내성을 전달하는 유전자를 발현하는 세포만이 항생물질 내성 유전자를 발현하지 않는 세포와 비교하여 생존할 수 있거나 생존하는 장점을 가질 수 있다. 마커 유전자를 발현하고 선택적 장점을 가지는 세포는 어떤 형태의 방법에서는 마커를 갖지 않는 다른 세포와 비교하여 선택적으로 증폭되는데, 그것은 그러한 세포가 마커를 갖지 않는 세포보다 더 큰 속도로 성장하거나 생존할 것임을 의미한다. 어떤 형태의 방법에서는 마커를 가지는 세포의 선택이 특정한 선택적 엄격성을 갖는다. 선택적 엄격성이란 마커가 마커를 갖지 않는 세포로부터 마커를 가지는 세포를 확인하는 효율성이다. 예를 들어 선택적 엄격성은 마커가 마커를 발현하지 않는 세포보다 최소한 2, 4, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 400, 500, 800, 1000, 2000, 4000, 10,000, 25000, 50,000배 성장하는 장점을 가지는 세포를 생성하는 것일 수 있다. 어떤 형태의 방법에서 선택적 엄격성은 동일한 시간 기간에 걸쳐서 생존하는 마커를 발현하지 않는 세포의 백분율을 능가하는, 예를 들면, 계대되는 시간 기간에 걸쳐 생존하는 마커를 발현하는 세포의 백분율의 선택적 비율로서 표시될 수 있다. 예를 들어, 본원에는 최소한 1, 1.5, 2, 4, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 400, 500, 800, 100O, 2000, 4000, 10,000, 25000, 50,000, 또는 100,000의 선택적 비율을 부여할 수 있는 마커가 개시되어 있다. 마커는 마커를 발현하는 세포가 선택적으로 성장 또는 가시화되는 것을 허용하는데, 그것은 마커를 발현하는 세포가 마커를 발현하지 않는 세포보다 우선적으로 또는 선택적으로 성장하거나 확인될 수 있다는 것을 의미한다.

a) 마커

마커 또는 마커 생성물은 마커 또는 어떤 다른 핵산이 세포에 전달되고, 일단 전달되면 발현되는지의 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 마커는 마커 유전자 또는 리포터 유전자의 발현 생성물일 수 있다. 유용한 마커 유전자의 예로는 대장균 lacZ 유전자를 포함하며, 그것은 β-갈락토시다제, 아데노신 포스포리보실 트란스페라제 (APRT), 및 히포크산틴 포스포리보실 트란스페라제 (HPRT)를 코드화한다. 형광 단백질 또한 마커 및 마커 생성물로서 사용될 수 있다. 형광 단백질의 예로는 형광 단백질 (GFP), 그린 리프 산호색 형광 단백질 (G-RCFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 적색 형광 단백질 (REP 또는 dsRed2) 및 황색 형광 단백질 (YFP)이 있다.

(1) 네거티브 선택 마커

마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유류 세포에 적당한 선택가능한 마커의 예는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나아제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히드로마이신, 및 퓨로마이신이다. 그런 선택가능한 마커가 성공적으로 포유류 숙주 세포에 전달될 때, 형질전환된 포유류 숙주 세포는 선택적 압력하에 놓이게 된다면 생존할 수 있다. 선택적 상황에는 두 가지의 분명한 범주가 폭넓게 사용된다. 첫 번째 범주는 세포의 대사과정과, 보충된 배지와 무관하게 성장할 수 있는 능력이 결핍된 돌연변이 셀 라인의 사용을 토대로 한다. 두 가지 예는 CHO DHFR- 세포와 마우스 LTK-세포이다. 이들 세포는 티미딘 또는 히포크산틴과 같은 영양분의 첨가 없이 성장할 수 있는 능력이 결핍되어 있다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 특정 유전자가 부족하기 때문에, 그것들은 누락된 뉴클레오티드가 보충 배지에 제공되지 않는 한 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것에 대한 대안은 무상 DHFR 또는 TK 유전자를 각각의 유전자가 결핍된 세포에 도입함으로써, 그 세포의 성장 요구조건을 변경시키는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 각각의 세포들은 비-보충 배지에서 생존할 수 없을 것이다.

(2) 우성 선택 마커

두 번째 범주는 모든 세포 유형에서 사용된 선택 계획을 말하는 것으로 돌연변이 셀 라인의 사용을 필요로 하지 않는 우성 선택이다. 이들 계획은 통상 숙주 세포의 성장을 억제하기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 가지는 이들 세포는 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고 선택에도 생존할 것이다. 그러한 우성 선택의 예로 약물 네오마이신 (Southern P. and Berg, P., J. Molec, Appl. Genet. 1:327 (1982)), 미코페놀산 (Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209:1422 (1980)) 또는 하이그로마이신 (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985))을 사용한다. 세 가지 예는 내성을 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (미코페놀산) 또는 하이그로마이신에 각각 전달하기 위해 진핵생물 제어 하에 있는 박테리아 유전자를 사용한다. 다른 예는 네오마이신 유사체 G418과 퓨로마이신이다.

(3) 형질전환하는 유전자

형질전환하는 유전자는 마커로서 사용될 수 있다. 형질전환하는 유전자는 세포가 암세포의 최소한 하나의 특성, 예컨대 소프트 한천 배지(soft agar)에서 성장할 수 있는 능력을 가지도록 유발하는 단백질 또는 RNA를 코드화하는 어떠한 서열이다. 다른 특성으로는 접촉 억제의 소실 및 성장 인자와의 무관성을 들 수 있다. 또한 형질전환된 세포에서 형태의 변화가 일어날 수 있는데, 예컨대 세포가 덜 둥글어진다. 형질전환하는 유전자는 또한 형질전환 유전자로 언급될 수 있다. 형질전환하는 유전자, 형질전환 유전자, 및 그것들의 생성물은 형질전환하는 제제 또는 형질전환 제제로 언급될 수 있다. 형질전환 제제는 또한 불멸화 제제로 언급될 수 있다.

발암유전자는 형질전환하는 유전자일 수 있고, 전형적으로 형질전환하는 유전자는 발암유전자일 것이다. 발암유전자는 전형적으로 신호 변환 캐스케이드의 성분을 코드화한다. 전형적으로 발암유전자의 정상 유전자 생성물은 세포 성장을 조절하고, 이 활성을 없애거나 증가시키는 단백질 또는 발현의 돌연변이가 발생한다. 발암유전자는 전형적으로 신호 변환 경로, 예컨대 MAPK 경로 또는 Ras 경로의 분자들을 코드하고, 예컨대 성장 인자, 성장 인자 수용체, 전사 인자 (erbA: 갑상선 호르몬 수용체 (스테로이드 수용체)를 코드한다, rel: 전사를 조절하는 한 쌍처럼 행동하는 조합을 형성한다 (NF-kB), v-rel: 유인원 세망내피염증, jun & fos), 단백질 키나아제, 신호 변환, 세린/트레오닌 키나아제, 핵 단백질, 성장 인자 수용체 키나아제, 또는 세포질 티로신 키나아제일 수 있다. 개시된 발암유전자 및 형질전환하는 유전자의 모든 세트의 조합이 구체적으로 고려된다. 어떤 발암유전자, 예컨대 Ras는 스스로 형질전환한다.

막결합 변환 분자도 때로는 발암유전자일 수 있다. 막결합 변환 분자, 예컨대 Ras는 다른 분자가 인접한 수용체에 결합함으로써 간접적으로 활성화된다. 인접한 수용체의 활성화는 발암유전자가 활성이 되어 정상 세포 행동에 변화를 가져올 신호화 캐스케이드를 시작하도록 한다. 수용체 티로신 키나아제가 또한 발암유전자일 수 있다. 수용체 티로신 키나아제는 분자를 표적화하기 위해 포스페이트(phosphate)기를 전달할 수 있는 효소이다. 표적 분자, 예컨대 성장 인자가 키나아제의 세포외 부분에 결합할 때 신호는 세포막을 통해 전달되어서 신호 변환 캐스케이드가 야기된다. 이런 유형의 발암유전자의 예는 HER2 단백질이다. 수용체-결합 키나아제가 또한 막결합 효소이지만 그것들은 다른 인접한 수용체와 결합함으로써 활성화된다. 이 결합은 키나아제가 표적 단백질을 인산화하는 것을 유발함으로써 핵에 신호 변환을 야기한다. Src도 이런 유형의 발암유전자의 예이다. 전사 인자는 DNA 나선을 따라 특이한 서열에 결합함으로써 결합된 유전자가 핵에서 발현되도록 야기하는 단백질이다. 이런 유형의 발암유전자의 예는 myc이다. 일부 전사 인자는 Rb와 같은 억제제이다. 텔로메라제는 염색체의 말단을 유지하는 단백질-RNA 복합체이다. 텔로메라제가 존재하지 않거나 소량 존재하는 경우, 심각한 손상이 일어날 때까지 각각의 세포 분할로 염색체는 짧아진다. 텔로메라제는 대부분의 정상 세포에서 발현되지 않거나 존재하거나 또는 느리게 발현되거나 존재하지만, 대부분의 형질전환된 세포에서는 동족의 비형질전환 세포에서보다 더 높은 농도로 존재한다. 아폽토시스 조절 단백질은 예정 세포사를 조절하는 작용을 하는 단백질이다. DNA가 손상되거나 다른 손상이 발생했을 때, 아폽토시스가 발생할 수 있다. 정상 상태에 있는 많은 발암유전자들, 예컨대, Bcl-2가 세포 죽음을 차단하기 위해 작용한다.

발암유전자를 제한하지 않으면서 열거하면 다음과 같다: ab1 (티로신 키나아제 활성); ab1/bcr (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); Af4/hrx (융합은 hrx의 전사 인자 생성물에 영향을 준다); akt-2 (단백질-세린/트레오닌 키나아제 난소암 1을 코드화한다); alk (수용체 티로신 키나아제를 코드화한다); ALK/NPM (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); aml1 (전사 인자를 코드화한다); aml1/mtg8 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); axl (수용체 티로신 키나아제를 코드화한다); bcl-2,3,6 (아폽토시스 (예정 세포사)를 차단한다); bcr/ab1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); c-myc (세포 증식 및 DNA 합성); db1 (구아닌 뉴클레오티드 교환 인자); dek/can (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); E2A/pbx1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); egfr (티로신 키나아제); en1/hrx (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); erg/c16 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); erbB (티로신 키나아제); erbB-2 (원래 neu)(티로신 키나아제 유방암); ets-1 (어떤 프로모터를 위한 전사 인자); ews/fli-1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); fms (티로신 키나아제); fos (API에 대한 전사 인자); fps (티로신 키나아제); gip (막결합 G 단백질); gli (전사 인자); gsp (막결합 G 단백질); HER2/neu (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); hox11 (DNA 결합 단백질의 과잉 발현); hrx/en1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); hrx/af4 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); hst (섬유아세포 성장 인자를 코드화한다); IL-3 (단백질의 과잉 발현); int-2 (섬유아세포 성장 인자를 코드화한다); jun (전사 인자); kit (티로신 키나아제); KS3 (성장 인자); K-sam (성장 인자 수용체를 코드화한다); Lbc (구아닌 뉴클레오티드 교환 인자); lck (T-세포 수용체 유전자에 대한 티로신 키나아제의 재배치); lmo-1 (T-세포 수용체 유전자 가까이에 있는 전사 인자의 재배치); L-myc (세포 증식 및 DNA 합성); lyl-1 (DNA 결합 단백질의 과잉 발현); lyt-10 (IgH 유전자 가까이에 있는 전사 인자의 재배치); lt-10/C 알파1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); mas (안지오텐신 수용체); mdm-2 (p53 억제제를 코드화한다) 육종 1; MLH1 (DNA의 부적당한 짝 수복); mll (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); MLM (세포 주기를 정지시키는 p16 네거티브 성장 조절제를 코드화한다); mos (세린/트레오닌 키나아제); MSH2 (DNA의 부적당한 짝 수복); mtg8/aml1 (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); myb (DNA 결합 도메인이 포함된 전사 인자를 코드화한다); MYH11/CBFB (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); neu (새로운 erb-2)(티로신 키나아제); N-myc (세포 증식 및 DNA 합성); NPM/ALK (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); nrg/rel (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); ost (구아닌 뉴클레오티드 교환 인자); pax-5 (IgH 유전자에 대한 전사 인자의 재배치); pbx1/E2A (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); pim-1 (세린/트레오닌 키나아제): PML/RAR (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); PMS1,2 (DNA의 부적당한 짝 수복); PRAD-1 (세포 주기의 G1에 중요한 사이클린 D1을 코드화한다); raf (세린/트레오닌 키나아제); RAP/PML (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); rasH (세포의 신호 변환에 관여한다); rasK (세포의 신호 변환에 포함된다); rasN (세포의 신호 변환에 관여한다); rhom-1,2 (DNA 결합 단백질의 과잉 발현); ros (티로신 키나아제); ski (전사 인자); sis (성장 인자); set/can (융합에 의해 생성된 새로운 단백질); Src (티로신 키나아제); tal-1,2 (전사 인자의 과잉 발현); tan-1 (단백질의 과잉 발현); Tiam-1 (구아닌 뉴클레오티드 교환 인자); TSC2 (GTPase 활성화제); trk (재조합 융합 단백질).

형질전환하는 유전자의 예는 Ras 유전자로, 그것의 예는 SEQ ID NO:2에 도시된다. 발암유전자의 ras 패밀리는 3개의 중심 구성원: K-ras, H-ras 및 N-ras를 포함한다. 세 가지 모든 발암유전자는 다양한 암에 포함된다. K-ras 발암유전자는 염색체 12p12에서 발견되는데, 21-kD 단백질 (p21ras)을 코드화한다. P21은 G-단백질 신호 변환 경로에 포함된다. K-ras 발암유전자의 돌연변이는 G-단백질 신호 변환 경로의 구성 활성화를 초래하고 그 결과 비정상적인 증식 및 분화가 나타난다.

활성화하는 K-ras 돌연변이는 결장 선종 및 암종의 50% 이상에서 나타나며, 가장 크게는 발암유전자의 코돈 12에서 일어난다. K-ras 돌연변이는 췌장과 담즙 암종에서 가장 흔한 유전적 이상(異狀) 중 하나이다 (75% 이상). K-ras 돌연변이는 또한 폐의 선암종에서도 빈번하다.

마찬가지로, 개시된 형질전환하는 유전자는 특정 실험에서 원하는 특성을 가지는 다른 유전자 또는 형질전환하는 유전자 세트와 쌍을 이룰 수 있다. 상이한 형질전환 방법이 상이한 경우에 유용할 것이다. 예를 들어, 활성화된/우성 네거티브 쌍으로 형질전환된 세포는 다중 주기의 역전을 가능하게 한다. 이들 세포는 그런다음 두 가지 일차 세포 및 셀 라인의 장점들을 갖게 된다. 세포는 확장되고, 정지되며, 조작된 후, 다시 확장된다. Cre/lox를 사용하여 역전된 세포는 일차 세포의 유사체가 되고, 게놈에 남아있는 lox 부위는 단지 34bp뿐이다. 이들 세포는 세포 치료법 설정에서 유용할 것이다.

b) 발현 시스템

세포에 전달된 핵산은 전형적으로 발현 조절 시스템을 포함하고, 때로 이들 발현 조절 시스템은 조직 특이적이다. 세포는 조직 특이적인 발현 조절 시스템을 v포함하고 아마도 다른 것은 반드시 조직 특이적일 필요가 없다. 발현 조절 시스템은 표적 핵산의 발현을 유발하는 시스템이다. 예를 들어 바이러스 및 레트로바이러스 시스템에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 인핸서를 포함하여 원하는 유전자 생성물의 발현의 조절을 돕는다. 프로모터는 일반적으로 전사 출발 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 작용하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소를 포함하며, 상류 요소와 반응 요소를 포함할 수 있다. 전사에 영향을 미치는 서열들은 전사 조절 요소로서 언급될 수 있다.

분화는 세포가 그 세포 유형의 특징적인 유전자 패밀리를 전사하는 특정 세트의 전사 인자를 발현하도록 지시받는 과정이다. 이들 전사 인자들은 다음 단계에서 특징적인 유전자의 프로모터에서 조합적으로 작용하여 동족의 mRNA 및 단백질의 발현을 야기한다. 이런 방법으로, 제한된 수의 전사 인자 유전자가 훨씬 더 큰 세트의 표적 유전자들을 특이하게 조절할 수 있다 (Alberts, B, Bray, D, Lewis, J, Raff, M, Roberts, K, Watson, JD. (1994) MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 3rd Ed., Garland Publishing, New York, NY, 1294p).

조직 특이적 프로모터는 대부분이 특별한 생물학적 환경에서만 효과적으로 작용한다 (Kelly, JH, Darlington, GJ. (1985) Ann. Rev. Gen. 19, 273-296). 예를 들어 알부민은 성인 간세포의 주요 단백질 생성물이고, 그 세포 유형에서만 상당량이 발현된다. 이것은 인간 알부민 유전자의 발현을 통해 이루어지는데, 그것은 간세포에서만 알부민 유전자의 발현을 구동하는 프로모터와 인핸서를 가진다. 유전자도입 마우스에서 수행한 수많은 실험 결과 알부민 프로모터/인핸서의 조절하에 있는 이종성 유전자는 간세포에서 거의 배타적으로 발현된다는 것을 입증하였다 (Pinkert, CA, et al., (1987) Genes Dev. 3, 268-76). 세포 유형이 특정 유전자 및 단백질의 발현에 의해 규정되기 때문에 모든 특이한 유형은 그 세포 유형에서 배타적으로, 또는 거의 배타적으로 발현되는 특정 유전자를 갖는다. 로돕신은 망막 세포에서만 발현되고, 강심제 미오신은 심근세포에서만 발현되며, 인슐린은 췌장의 베타세포에서만 발현된다. 이들 각각의 유전자는 그 세포 유형에서만 작용하는 프로모터에 의해 구동된다.

(a) 세포 특이적 유전자는 세포 특이적 프로모터를 갖는다

하기 표 3에는 유전자의 예가 열거되어 있는데, 조직의 특이적 유형에서 전체적으로 또는 부분적으로 발현되는 유전자가 표시된다. 이들 유전자는 각각 특이적 발현 패턴을 가능하게 하는 조절 요소를 포함하는 5' 상류 영역을 가지고 있음이 인지된다. 예를 들면, 본원에 개시된 형질전환 유전자에 작동가능하게 연결된 이들 유전자의 각각의 5' 상류 영역의 100, 350, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 또는 5000 염기를 포함하는 핵산이 개시되어 있다. 또한 이들 유전자의 5' 상류 영역을 제조하고 사용하는 방법이 개시되는데, 그 방법에는 본원에 개시된 특별한 특성을 가진 이들 영역에 포함된 특이한 요소를 확인하고 분리하는 방법이 포함된다. 그 방법은 잘 알려져 있으며, 조절 요소의 확인을 가능하게 한다.

개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 세포 특이적 프로모터는 많이 있다. 프로모터는 또한 세포 유형에 특이적이거나 세포 유형의 하위세트에서 발생하는 유전자의 전사물과 결합된 조절 영역을 확인함으로써 확인될 수 있다.

예를 들어 프로모터와 인핸서를 포함하는 지방세포 조절 서열에 대하여, 예컨대, -908에서 +14까지의 인간 아디포넥틴 유전자 서열로부터의 서열이 지방세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다 (SEQ ID NO:9)(Iwaki, M., et al. Diabetes 52, 1655 - 1663, 2003, Genbank nos. Q15848 and NM_004797, 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 아디포넥틴 유전자 및 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또 다른 예는 프로모터와 인핸서를 포함하는 간세포 세포 조절 서열, 예컨대 1610부터 1810까지의 인간 B형 간염 바이러스 서열 (SEQ ID NO:22), -137부터 -37까지의 인간 알파-1-항트립신 프로모터 서열 (SEQ ID NO:10), 및 -434부터 +12까지의 인간 알부민 유전자 서열 (SEQ ID NO:11)이다 (Gabriela Kramer, M., et al. Molecular Therapy 7, 375-385 (2003), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 간세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 프로모터와 인핸서를 포함하는 심장 세포 조절 서열이 개시된다. 예를 들어 -357부터 +40까지의 인간 미오신 경쇄 유전자 VLC1 서열 (SEQ ID NO:12)은 심장 세포에 특이한 방식으로 작용한다 (Kurabayashi, el al., J. Biol. Chem. 265, 19271-19278, (1990), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 심장 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 프로모터와 인핸서와 같은 망막 조절 서열, 예컨대 인간 로돕신 유전자에 대한 조절 서열, 예컨대 -176부터 +70과 -2140부터 -1894까지의 246bp 서열 (SEQ ID NO:13)이 개시된다 (Nie el al., J. Biol. Chem. 271, 2667 - 2675, (1996), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 망막 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본원에는 프로모터와 인핸서 서열과 같은 B 세포 조절 서열, 예컨대 인간 면역글로불린 중쇄 프로모터 및 인핸서 요소를 조절하는 서열이 개시된다 (Maxwell, IH, et al. Cancer Res. 51, 4299-4304, (1991), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 B 세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 프로모터와 인핸서 서열과 같은 내피 세포 조절 서열, 예컨대 인간 E 선택 유전자에 대한 조절 서열, 예컨대 -547부터 +33까지의 서열 (SEQ ID NO:14)이 개시된다 (Maxwell, IH, et al. Angiogenesis 6, 31-38, (2003), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 내피 세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 T 세포 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서 서열, 예컨대 인간 T 세포 수용체에 대한 서열, 예컨대 -279부터 +5까지의 서열 (SEQ ID NO:15)이 개시되며, 그 서열은 상류 인핸서 요소를 포함할 수 있다 (Reizis and Leder, Exp. Med., 194, 979-990, (2001), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 T 세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 대식세포 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서 서열, 예컨대 -308부터 +2까지의 인간 HCgp-39 유전자에 대한 서열 (SEQ ID NO:16)이 개시된다 (Rehli, M., et al. J. Biol. Chem. 278, 44058-44067, (2003), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 대식세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 신장세포에 대한 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서 서열, 예컨대 인간 우로모둘린 유전자에 대한 조절서열, 예컨대 유전자의 -3.7kb로부터의 프로모터 서열 (SEQ ID NO:17)이 개시된다 (Zbikowska, HM, et al. Biochem. J. 365, 7-11, (2002), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 신장세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본원에는 프로모터와 인핸서 서열과 같은 뇌 조절 서열, 예컨대 인간 글루타메이트 수용체 2 유전자 (GluR2), 예컨대 -302부터 +320까지의 서열 (SEQ ID NO:18)이 개시된다 (Myers, SJ, et al. J. Neuroscience 18, 6723-6739, (1998), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 뇌 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 프로모터와 인핸서 서열과 같은 폐 조절 서열, 예컨대 인간 계면활성제 단백질 A2 (SP-A2), 예컨대 -296부터 +13까지의 서열 (SEQ ID NO:19)이 개시된다 (Young, PP, CR Mendelson Am. J. Physiol. 271, L287-289, (1996), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 폐 세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본 발명에는 췌장세포 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서 서열, 예컨대 인간 인슐린 유전자에 대한 조절 서열, 예컨대 유전자의 -279로부터의 서열 (SEQ ID NO:20)이 개시된다 (Boam, DS, et al. J. Biol. Chem. 265, 8285-8296, (1990), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 췌장세포 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본원에는 골격근 조절 서열, 예컨대 프로모터와 인핸서 서열, 예컨대 인간 빠른 골격근 트로포닌 C 유전자에 대한 조절 서열, 예컨대 -978부터 +1까지의 서열 (SEQ ID NO:21)이 개시된다 (Gahlmann, R, L. Kedes J. Biol. Chem. 265, 12520-12528, (1990), 서열 및 그것을 얻는 방법을 포함하여 골격근 조절 서열과 관련된 물질에 대한 참조).

또한 본원에는 자살 유전자를 포함하는 핵산, 예컨대 본원에 개시된 것들이 개시되는데, 이때 자살 유전자는 예컨대 그것이 작동을 시작하면 세포를 죽일 것이고, 이들 유전자는 그것의 발현으로 조절될 수 있다. 예를 들어 자살 유전자는 또한 cre-lox 재조합 부위에 포함될 수 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 형질전환 후에, 그리고 세포 또는 세포 세트가 선택적으로 형질전환 배지에서 성장한 후에, 형질전환 유전자가 재조합효소, 예컨대 Cre에 의해 절제될 것이고, 자살 유전자 또한 절제될 것이다. 그런 다음 전환에 적절한 조건을 포함하는 비-형질전환 배지에서 자살 유전자는 진행되어 단지 재조합 사건이 일어난 세포들만 생존할 수 있을 것이다. 이 결과의 변형 및 본원에 개시된 마커와 조성물 및 방법과의 조합이 많이 있다.

(2) 바이러스 프로모터 및 인핸서

포유류 숙주 세포에서 벡터로부터 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들면 폴리오마 바이러스, 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스로부터, 또는 이종성 포유류 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터로부터 얻을 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기원을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻을 수 있다 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 인접한 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다 (Greenway, PJ. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론 숙주 세포 또는 관련 종으로부터 얻어지는 프로모터는 또한 본원에서도 유용하다.

인핸서는 일반적으로 전사 출발 부위로부터 정해지지 않은 거리에서 기능하는 DNA 서열을 말하는 것으로, 전사 유닛에 대해 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 78: 993 (1981)) 또는 3' (Luskv, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983))일 수 있다. 나한천 배지 인핸서는 인트론 내 (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983))뿐 아니라 코딩 서열 자체 내에 있을 수 있다 (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4:1293 (1984)). 그것들은 통상 길이가 10과 300bp 사이이며, cis로 작용한다. 인핸서는 인접한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 작용을 한다. 인핸서는 또한 전사의 조절을 중재하는 반응 요소를 포함하기도 한다. 프로모터는 또한 전사 조절을 중재하는 반응 요소를 포함할 수 있다. 인핸서는 때로 유전자 발현의 조절을 결정한다. 현재 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자로부터 공지되어 있지만 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린), 전형적으로는 일반적 발현을 위해서는 진핵 세포 바이러스로부터 얻어지는 인핸서를 사용할 것이다. 바람직한 예는 복제 기원의 뒷부분에 있는 (bp100-270) SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 뒷부분에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.

프로모터 및/또는 인핸서는 빛에 의해 또는 그것들의 기능을 야기하는 특수한 화학적 사건에 의해 특이하게 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린과 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 또한 조사(irradiation), 예컨대 감마선 조사에 대한 노출, 또는 알킬화 화학요법 약물에 의해 바이러스 벡터 유전자 발현을 증대시키는 방법도 있다.

프로모터 및/또는 인핸서 영역은 전사될 전사 유닛의 영역의 발현을 최대화하기 위하여 구성 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 어떤 구성물에서 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 그것이 단지 특정 시간에 특정 유형의 세포에서만 발현되는 것이더라도, 모든 진핵세포 유형에서 활성이 된다. 이런 유형의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터 (650염기)이다. 바람직한 다른 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (전체 길이의 프로모터), 및 레트로바이러스 LTF이다.

특이적인 모든 조절 요소가 흑색종 세포와 같은 특정 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 제조하기 위해 클론될 수 있고 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 신경교 섬유성 아세트성 단백질 (GFAP) 프로모터는 신경교 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키기 위해 사용되었다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 핵화 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이들 영역은 mRNA 코드화 조직 인자 단백질의 미번역 부분에 있는 폴리아데닐화 절편으로서 전사된다. 3' 미번역 영역은 또한 전사 종결 부위를 포함한다. 전사 유닛은 또한 폴리아데닐화 영역을 포함할 수 있는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 가지 유익한 점은 그것이 전사된 유닛이 mRNA처럼 프로세스되고 운반될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 구성물에서 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 잘 수립되어 있다. 동종성 폴리아데닐화 신호는 유전자도입 구성물에서 사용되는 것이 바람직하다. 어떤 전사 유닛에서 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되고, 약 400개의 염기로 구성된다. 또한 전사된 유닛은 다른 가닥 서열을 단독으로 또는 구성물로부터의 발현, 또는 구성물의 안정성을 개선하는 상기 서열과 조합하여 포함하는 것이 바람직하다.

c) 가역성 형질전환

형질전환은 그것으로 인해 세포가 그것의 성장을 정상적으로 조절할 신호에 반응하는 능력을 잃게 되는 과정이다. 이것은 기능 돌연변이의 형태를 취하게 되는데, 예컨대 PTEN과 같은 세포 성장의 억제제를 손실하게 되는 결과를 낳거나, 또는 많은 RAS 돌연변이에서 일어나는 것과 같이 유전자가 영구적으로 활성화되는 기능 돌연변이가 발생하는 것이다. 많은 실험자들은 이들 형질전환하는 유전자를 정상 세포에 하나 또는 그 이상 삽입하는 것이 통상적인 구성물에서 그것의 성장을 자유롭게 할 수 있고 증식하는 것을 가능하게 할 수 있음을 발견하였다 (Downward, J. (2002) Nat. Rev. Cancer 3, 11-22). 가역적인 형질전환은 형질전환하는 유전자를 한 상황에서 활성화한 다음에는 다른 상황에서는 중지시키는 것이다. 이런 역전을 이루기 위한 수단은 많다.

조직 특이적 프로모터/인핸서와 가역성 형질전환하는 유전자의 조합으로 분화하는 줄기세포로부터 어떠한 특이한 세포 유형의 분화 및 배양이 가능해진다. 이 시스템은 그것이 일반적이고 특이한 세포 유형을 다량으로 생성하기 위해 사용될 수 있다는 점에서 상기에 언급된 이중 장점을 제공한다. 실제로 이 시스템은 특성이 확인되고 냉동될 수 있는 영구적이고, 클론성의 또는 반-정제된, 분화된 셀 라인의 수립을 가능하게 한다. 전환될 때에는 전체 집단이 전환되므로, 특징 지워져 분화된 정상 세포의 무한한 공급원을 제공할 수 있다.

(1) 우성 네거티브 역전

많은 형질전환하는 유전자, 예컨대 RAS는 우성 네거티브인 공지된 다른 돌연변이체를 갖는다. 예를 들어 우성 네거티브 RAS는 RAS 신호의 증식에 필요한 다른 단백질인 RAF를 고립시켜서 RAS 신호화를 중단시킨다 (Fiordalisi, (2002) J Biol Chem.. 29, 10813-23). 그러한 유전자의 활성화/우성 네거티브 쌍을 사용하면 가역성 시스템을 제공할 수 있다. 그런 쌍은 예를 들면 RAS, SRC 및 p53에 대하여 공지되어 있다 (Barone and Courtneidge, (1995) Nature. 1995 Nov 30;378(6556):509-12; Willis A, et al, Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2330-8).

(2) 온도 민감성 돌연변이체 역전

가역적인 형질전환을 이루기 위한 또 다른 메커니즘은 온도 민감성 돌연변이체를 사용하는 것이다 (Jat, PS, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096 - 5100). 온도 민감성 (ts) 단백질은 허용되는 온도에서는 안정하지만 제한적인 온도에서는 불안정하다. SV40 바이러스의 널리 공지된 형질전환하는 유전자인 T 항원 (TAg)은 여러 개의 ts 돌연변이체를 가지고 있다. tsTAg가 정상 세포에 삽입되면, 세포는 형질전환되고 32℃에서는 증식하지만, 39℃에서는 정지되고 정상으로 역전된다. 그런 여러 개의 온도 민감성 돌연변이체가 예컨대 SV40 T 항원 및 아데노바이러스 E1A에 대하여 알려져 있다 (Fahnestock, ML, Lewis, JB. (1989) J. Virol. 63, 2348-2351).

(3) 재조합효소 역전

가역성 형질전환을 위한 세 번째 메커니즘은 실제로 형질전환하는 유전자를 가역적으로 삽입하는 것이다. Cre/lox 및 flp/frt가 가역 삽입을 위한 두 가지의 그런 메커니즘이다 (Sauer. B. (2002) Endocrine 19, 221-228; Schaft, J, et al., (2001) Genesis 31, 6-10). 만약 유전자가 lox 재조합 부위에 의해 각 말단이 캡핑되어 있는 표적 세포에 형질전환된다면, 그 세포를 CRE 재조합효소로 처리함으로써 삽입된 서열이 절제되어 단일한 lox 서열만이 남게 될 것이다. 마찬가지로 만약 유전자가 frt에 의해 각 간부가 캡핑되어 있는 표적 세포에 형질전환된다면, flp로 처리함으로써 삽입된 서열이 절제되어 flp 서열만이 남게 될 것이다.

본 발명에는 예컨대 본원에 개시된 하나 또는 그 이상의 핵산을 이미 포함하는 세포의 재조합 사건 후에 잔류하는, 본원에 개시된 하나 또는 그 이상의 서열을 포함하는 세포, 예컨대 인슐린 프로모터에 의해 구동되는 형질전환 서열을 포함하는 세포, 예컨대 재조합 효소 서열, 예컨대 lox 또는 flp 서열을 포함하는 세포의 정제된 또는 반-정제된 또는 클론성 집단을 포함하는 조성물이 개시된다.

5. 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 세포

성인의 신체는 상이한 많은 세포 유형을 생성한다. 인간 세포 유형에 대한 정보를 알 수 있는 사이트를 참조한다 (http://encyclopedia.thefreedictionary.com/List%20ofyo20distinct%20cell%20types%20in%20the %20adult%20human%20body). 이들 상이한 세포 유형으로는, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 다음과 같은 것들이 있다: 케라틴화 상피세포, 습식 층을 이루는 장벽 상피세포, 외분비 상피세포, 호르몬 분비세포, 상피성 흡수세포 (소화관, 외분비선 및 비뇨생식관), 대사 및 저장 세포, 장벽기능세포 (폐, 소화관, 외분비선 및 비뇨생식관), 상피세포 라이닝 폐쇄 내부 체강, 추진기능이 있는 솜털 달린 세포, 세포외재성 매트릭스 분비세포, 수축성 세포, 혈액 및 면역 시스템 세포, 감각 변환기 세포, 자동신경세포, 감각기관 및 말초신경 지지세포, 중추신경계 뉴론 및 신경교 세포, 렌즈세포, 색소세포, 생식세포, 및 신경세포. 또한 어떠한 줄기세포와 본원에 개시된 세포들의 전구 세포뿐만 아니라 그것들이 유래하는 세포도 포함된다. 개시된 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 유형은 그런 세포의 하나 또는 그 이상의 특성을 참조로 확인될 수 있다. 그런 특성은 많이 공지되어 있으며, 그 중의 일부가 본원에서 설명된다.

세포 유형

조직학적 연구를 바탕으로 한 통상적인 평가는 성인 신체에는 다른 구조와 기능을 나타내는 뚜렷한 세포 종류가 약 200개 있음을 나타낸다 (David S. Goodsell, The Machinery of Life, Springer-Verlag, New York, 1993; Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, James D. Watson, The Molecular Biology of the Cell, Second Edition, Garland Publishing, Inc., New York, 1989; Arthur J. Vander, James H. Sherman, Dorothy S. Luciano, Human Physiology: The Mechanisms of Body Function, Fifth Edition, McGraw-Hill Publishing Company, New York, 1990). 이것들은 형태학적 연속체를 따라 임의로 나누는 것이 아니라, 현저히 다른 특성을 가진 별개의 세포 유형을 나타낸다. 전통적인 분류방식은 현미경으로 살펴본 형상과 구조, 그리고 미정제 화학적 성질 (예컨대 다양한 스트레인에 대한 친화력)을 토대로 하지만, 보다 새로운 면역학적 기법에 의해 예를 들면 림프구에도 10개 이상의 구별되는 유형이 있는 것으로 드러났다. 약리학적 및 생리학적 시험으로 상이하면서도 다양한 많은 평활근 세포가 드러났는데, 예를 들면 자궁벽 평활근 세포는 에스트로겐 (임신 후반기에) 및 옥시토신에 매우 민감한 반면, 소화관벽 평활근 세포는 그렇지 않다.

인간 신체의 세포는 다음과 같다: 케라틴화 상피세포, 표피 각질생성세포 (상피세포를 분화한다), 표피 기저세포 (줄기세포), 손톱 및 발톱의 각질생성세포, 발톱상 기저세포 (줄기세포), 수질 모 샤프트세포, 피질 모 샤프트 세포, 각피 모 샤프트 세포, 각피 모근 전단세포, 헉슬리층의 모근 전단세포, 헨레층의 모근 전단세포, 외부 모근 전단세포, 모 매트릭스 세포 (줄기세포), 습식 층을 이루는 장벽 상피세포, 망막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 말단 요도 및 질의 층을 이루는 비늘모양 상피의 표면 상피세포, 망막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 말단 요도 및 질의 상피의 기저세포 (줄기세포), 비뇨기 상피세포 (방광 및 비뇨관을 라이닝함), 외분비 상피세포, 침샘 점액세포 (다당-풍부 분비물), 침샘 장액세포 (당단백질 효소-풍부 분비물), 혀의 폰 에브너샘 세포 (미각 돌기를 씻는다), 유선 세포 (젖 분비), 눈물분비샘 세포 (눈물 분비), 귀의 귀지선 세포 (귀지 분비), 외분비 땀샘 흑색세포 (당단백질 분비), 외분비 땀샘 투명세포 (작은 분자 분비), 아포크린 땀샘 세포 (냄새 분비, 성호르몬 민감성), 눈꺼풀의 몰(Moll) 세포샘 (특수한 땀샘), 피지샘 세포 (지질-풍부 피지 분비), 코의 바우만샘 세포 (후각 상피를 씻는다), 십이지장의 브루너샘 세포 (효소 및 알칼리성 점액), 정액성 소포 세포 (헤엄치는 정자를 위한 프룩토스를 포함하여 정액 유체 성분을 분비한다), 전립선 세포 (정액 유체 성분을 분비한다), 불보요도선 (Bulbourethral gland) 세포 (점액 분비), 바르톨린선 세포 (질 윤활제 분비), 리터샘 세포 (점액 분비), 자궁 내막 세포 (탄수화물 분비), 호흡기 및 소화기 관의 분리된 고블렛(goblet) 세포 (점액 분비), 위 라이닝 점액세포 (점액 분비), 위샘 효소원 세포 (펩시노겐 분비), 소화샘 옥신트 세포 (oxyntic cell)(HCl 분비), 췌장 소핵 세포 (중탄산염 및 소화효소 분비), 소장의 파네쓰(paneth) 세포 (라이소자임 분비), 폐의 타입 II 폐세포 (계면활성제 분비), 폐의 클라라 세포, 호르몬 분비세포, 성장호르몬을 분비하는 뇌뇌하수체 전엽 세포, 난포 자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 황체형성호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 프로락틴을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 부신피질 자극호르몬을 분비하는 뇌하수체전엽 세포, 갑상선 자극호르몬을 분비하는 뇌하수체 전엽 세포, 멜라노사이트-자극 호르몬을 분비하는 뇌하수체 중엽 세포, 옥시토신을 분비하는 뇌하수체 후엽 세포, 바소프레신을 분비하는 뇌하수체 후엽 세포, 세로토닌을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 엔도르핀을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 소마토스타틴을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 가스트린을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 세크리틴을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 콜레시스토키닌을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 인슐린을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 글루카곤을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 봄베신을 분비하는 소화관 및 호흡기 세포, 갑상선 호르몬을 분비하는 갑상선 세포, 칼시토닌을 분비하는 갑상선 세포, 부갑상선 호르몬을 분비하는 부갑상선 세포, 부갑상선 옥시필 세포, 에피네프린을 분비하는 부신 선 세포, 노르에피네프린을 분비하는 부신 선 세포, 스테로이드 호르몬을 분비하는 부신 선 세포 (무기코르티코이드 및 글루코코르티코이드), 테스토스테론을 분비하는 고환의 레이디그 세포 (Leydig cell), 에스트로겐을 분비하는 난소 난포의 태막 내부 세포, 프로게스테론을 분비하는 깨진 난소 난포의 코르푸스 황체 세포, 신장 사구체 인접 기관 세포 (레닌 분비), 신장의 검은색 반점 세포, 신장의 양극성 세포, 신장의 메상기얼(mesangial)세포, 상피 흡수 세포 (소화관, 외분비선 및 비뇨생식기 관), 장의 브러쉬 경계 세포 (미세융모 포함), 외분비선 층을 이루는 소화관 세포, 골 방광(Gall bladder) 상피 세포, 신장 기부 세관 브러쉬 경계 세포, 신장 말단 세관 세포, 소도관 에페렌 조정 세포, 부고환 기초세포, 부고환 기저세포, 대사 및 저장 세포, 간세포 (간 세포), 백색 지방세포, 갈색 지방세포, 간 지방세포, 장벽 기능 세포 (폐, 소화관, 내분비선 및 비뇨생식관), 타입 I 폐세포 (폐의 공기 영역을 라이닝), 췌장관 세포 (중심소핵 세포), 비-횡문 소화관 세포 (땀샘, 타액샘, 젖샘 등의), 신사구체 체벽 세포, 신사구체 포도사이트(podocyte), 헨레 루프 얇은 절편 세포 (신장), 신장 수집 소화관 세포, 소화관 세포 (정액 소포, 전립선 등의), 폐쇄된 내부 체강을 라이닝하는 상피세포, 혈관 및 림프관 내피의 작은 구멍이 있는 세포, 혈관 및 림프관 내피의 연속세포, 혈관 및 림프관 내피의 비장 세포, 활액 세포 (관절 강을 라이닝, 히알루론산 분비), 융모막 세포 (복막, 늑막, 및 심막 강을 라이닝), 비늘모양 세포 (귀의 말초 림프액 분비 공간을 라이닝), 비늘모양 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 미세융모가 있는 내부 림프 분비 색의 원주형 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 미세융모가 없는 내부 림프 분비 색의 원주형 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 흑색 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 전실 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 가는 홈이 있는 도관 기저세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 가는 홈이 있는 도관 주변 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 클라우디우스 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 보체르 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 맥락막 망상 세포 (뇌척수액 분비), 피아-아라크노이드(Pia-arachnoid) 바늘모양 세포, 색소 침착된 눈의 모양체 상피세포, 색소 침착되지 않은 눈의 모양체 상피세포, 각막 상피세포, 추진 기능이 있는 섬모세포, 호흡기의 섬모세포, 수란관 섬모세포 (여성에서), 자궁 내막 섬모세포 (여성에서), 망상 고환 섬모세포 (남성에서), 소도관 에페렌스 섬모세포 (남성에서), 중추신경계의 섬모 에펜다이멀(ependymal) 세포 (뇌 강을 라이닝), 세포외재성 매트릭스 분비 세포, 에나멜 모세포 상피세포 (치아 에나멜 분비), 귀의 전실 기관의 플라늄 세미루테늄 (Planum semilutenum) 상피세포 (프로테오글리칸 분비), 코르티 기관 치간 상피세포 (모세포를 덮는 텍토리움 막 분비), 느슨한 연결조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포, 힘줄 섬유아세포, 골수 망상 조직 섬유아세포, 다른 (비상피성) 섬유아세포, 혈액 모세혈관 말초세포, 척추 내 디스크의 핵 풀포수스(pulposus) 세포, 세멘토블라스트(cementoblast)/세멘토사이트(cementocyte) (뼈와 같은 치근 백악질 분비), 치아모세포/치아세포 (치아 상아질 분비), 히알린 연골조직 연골세포, 섬유연골조직 연골세포, 탄성 연골조직 연골세포, 골아세포/골세포, 원조 뼈세포 (골아세포의 줄기세포), 눈의 유리체의 히알로사이트(hyalocyte), 귀의 말초 림프액 분비 공간의 방사상 세포, 수축성 세포, 적색 골격근 세포 (느린), 백색 골격근 세포 (빠른), 중간 골격근 세포, 근육 방추 -핵 가방 세포, 근육 방추 - 핵 사슬 세포, 방사상 세포 (줄기세포), 정상적인 심근 세포, 결절 심근세포, 퍼킨지(Purkinje) 섬유세포, 평활근 세포 (다양한 유형), 홍채의 근상피 세포, 외분비선의 근상피 세포, 혈액 및 면역 시스템 세포, 적혈구, 메가카리오사이트(megakaryocyte), 단핵 세포, 연결조직 대식세포 (다양한 유형), 표피 랑게르한스 세포, 파골세포 (뼈에서), 수지상 세포 (림프양 조직에서), 미소신경교 세포 (중추신경계에서), 호중성, 호산성 세포, 호염기성 세포, 비만 세포, 헬퍼 T 림프구, 억제제 T 림프구, 킬러 T 림프구, IgM B 림프구, IgG B 림프구, IgA B 림프구, IgE B 림프구, 킬러 세포, 줄기세포 및 혈액 및 면역 시스템에 사용되는 원조 (다양한 유형), 감각 변환 세포, 눈의 광 수용체 막대 세포, 눈의 광 수용체 푸른색-민감 원추 세포, 눈의 광 수용체 녹색-민감성 원추 세포, 눈의 광 수용체 적색-민감성 원추 세포, 코르티 기관의 청각 내부 모세포, 코르티 기관의 청각 외부 모세포, 귀의 전실 기관의 타입 I 모세포 (가속 및 중력), 귀의 전실 기관의 타입 II 모세포 (가속 및 중력), 타입 I 미각 돌기 세포, 후각 뉴런, 후각 상피의 기저 세포 (후각 뉴런에 대한 줄기세포), 타입 I 경동맥 체세포 (혈액 pH 센서), 타입 II 경동맥 체세포 (혈액 pH 센서), 표피의 마르켈 세포 (접촉 센서), 접촉-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 저온-민감성 일차 감각 뉴런, 열-민감성 일차 감각 뉴런, 통증-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 자기 수용성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 자동 뉴런 세포, 콜린성 신경세포 (다양한 유형), 아드레날린성 신경세포 (다양한 유형), 펩티드성 신경세포 (다양한 유형), 감각 기관 및 말초 뉴런 지지세포, 코르티 기관의 내부 기둥 세포, 코르티 기관의 외부 기둥 세포, 코르티 기관의 내부 지골 세포, 코르티 기관의 외부 지골 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 헨센 세포, 전실 기관 지지세포, 타입 I 미각 돌기 지지세포, 후각 상피 지지세포, 슈반 세포, 방사상 세포 (말초 신경세포체를 캡슐화함), 장 신경교 세포, 중추신경계 뉴런 및 신경교 세포, 뉴런 세포 (대다수의 유형, 여전히 분류는 빈약하다), 성상 신경교 세포 (다양한 유형), 올리고덴드로사이트 신경교 세포, 렌즈 세포, 전방 렌즈 상피 세포, 결정-포함 렌즈 섬유 세포, 색소 세포, 멜라노사이트, 망막의 색소 침착된 상피 세포, 생식 세포, 난원세포/난모세포, 정모세포, 정원세포 (정모세포에 대한 줄기세포), 영양 세포, 난소의 난포 세포, 세르톨리(sertoli) 세포 (고환에서), 흉선 상피 세포.

세포의 이 목록은 세포 기능에 의해 정리하였고, 평활근 세포, CNS의 뉴런 부류, 다양한 관련 연결 조직 및 섬유아세포 유형, 및 케라틴 생성 세포와 같은 성숙 세포의 중간 단계의 분할은 생략하였다 (단지 줄기세포와 분화된 세포 유형만 제시하였다). 그렇지 않으면, 카탈로그는 성인 표현형에서 발견된 대략 219 세포의 다양성의 포괄적인 목록을 나타낸다 (복잡성 이론과 계통 발생적 비교는 세포 유형의 최대수 N_세포~N_유전자 ^{1 /2} = 인간에 대해 370 세포 유형이고, N_유전자는 대략 10⁵ 유전자임을 시사한다)(S.A. Kauffman, "Metabolic Stability and Epigenesis in Randomly Constructed Genetic Nets," J. Theoret. Biol. 22(1969):437-467; Stuart A. Kauffman, The Origins of Order: Self-Organization and Selection in Evolution, Oxford University Press, New York, 1993).

세포 마커

세포를 구별하고 확인할 수 있는 특성을 확인하는 방법은 여러 가지가 있다. 상이한 세포 유형은 크기, 모양, 밀도가 독특하고, 세포내, 세포-표면, 및 분비된 단백질의 발현 프로필이 뚜렷하다. 본원에는 본원에 제공된 분화된 세포를 확인하고 규정하기 위해 사용될 수 있는 마커가 설명된다. 이들 마커는 항체, 프로브, 프라이머, 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 그런 표적화 수단을 사용하여 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 분화된 세포 유형을 확인하고 구별하기 위해 기본적으로 사용되는 마커의 예는 하기 표 4에 제시한다.

표 4. 분화된 세포 유형을 확인하고 특징 지우기 위해 통상 사용되는 마커

마커 명칭	세포 유형	중요성
혈관
태아 간 키나아제-1 (Flk1)	내피	내피세포 원조를 확인하는 세포-표면 수용체 단백질; 세포-세포 접촉의 마커
평활근세포-특이한 미오신 중쇄	평활근	혈관의 벽에 있는 평활근 세포를 확인한다
혈관 내피세포	카데린(cadherin)	평활근은 혈관 벽에 있는 평활근 세포를 확인한다.
뼈
뼈-특이적 알칼리성 포스파타제(BAP)	골아세포	골아세포에서 발현된 효소; 활성은 뼈 형성을 나타낸다.
히드록시아파타이트	골아세포	구조적 통합성을 제공하는 무기화된 뼈 매트릭스; 뼈 형성의 마커
오스테오칼신(OC)	골아세포	골아세포에 의해 독특하게 합성된 미네랄-결합 단백질; 뼈 형성의 마커
골수 및 혈액
뼈 형태유전학적 단백질 수용체(BMPR)	메센카이멀 줄기 및 전구 세포	메센카이멀 줄기 및 전구 세포로부터 명확한 메센카이멀 세포 유형의 분화에 중요하다; BMPR은 초기 메센카이멀 계통 (줄기 및 전구 세포)을 확인한다
CD4 및 CD8	백혈구 (WBC)	성숙한 T 림프구에 특이적인 세포-표면 단백질 마커 (WBC 하위타입)
CD34	조혈 줄기세포(HSC), 방사상, 내피 원조	HSC 및 내피 원조를 가리키는, 골수세포 상의 세포-표면 단백질; CD34는 또한 근육 방사상, 근육 줄기세포를 확인한다.
CD34+Sca1+Lin- 프로필	메센카이멀 줄기세포 (MSC)	지방세포, 골세포, 연골세포, 및 근세포로 분화할 수 있는 MSC를 확인한다.
CD38	HSC에 부재 WBC 계통에 존재	WBC 계통을 확인하는 세포-표면 분자. CD34+/CD38- 세포의 선택으로 HSC 집단의 정제가 가능해진다.
CD44	메센카이멀	메센카이멀 세포의 특이한 유형을 확인하기 위해 사용된 세포-부착 분자의 유형
c-키트	HSC, MSC	HSC 및 MSC를 확인하는 BM 세포 유형상의 세포-표면 수용체; 우태아혈청(FCS)에 의한 결합으로 ES 세포, HSC, MSC, 및 조혈 전구 세포의 증식이 증대된다.
콜로니-형성 유닛(CFU)	HSC, MSC 원조	CFU 분석은 단일 줄기세포 또는 원조세포가 하나 또는 그 이상의 세포 계통, 예컨대 적혈구 (RBC) 및/또는 백혈구 (WBC) 계통으로 발생할 수 있는 능력을 검출한다.
섬유아세포 콜로니-형성 유닛 (CFU-F)	골수 섬유아세포	다기능 섬유아세포의 콜로니로 발생된 개별적인 골수세포; 그렇게 확인된 세포는 분화된 메센카이멀 계통의 전구체이다.
획스트 염료	HSC에 부재	DNA에 결합하는 형광 염료; HSC는 염료를 밀어내고 다른 세포 유형과 비교할 때 약간 얼룩진다.
백혈구 공통 항원 (CD45)	WBC	WBC 전구세포 상의 세포-표면 단백질
계통 표면 항원 (Lin)	HSC, MSC 분화된 RBC 및 WBC 계통	성숙한 혈구 계통의 마커인 13 내지 14개의 상이한 세포-표면 단백질; Lin-네거티브 세포의 검출은 HSC 및 조혈 전구 집단의 정제를 돕는다
Mac-1	WBC	성숙한 과립구 및 대식세포 (WBC 하위타입)에 특이한 세포-표면 단백질
Muc-18 (CD146)	골수 섬유아세포, 내피	골수 섬유아세포에서 발견된 세포-표면 단백질 (면역글로불린 슈퍼패밀리), 조혈에 중요하다; Muc-18+ 세포의 하위집단은 메센카이멀 전구체이다.
줄기세포 항원 (Sca-1)	HSC, MSC	HSC 및 MSC 골수 및 혈액 농도를 가리키는, 골수 (BM) 세포상의 세포-표면 단백질
Stro-1 항원	간질 (메센카이멀) 전구 세포, 조혈 세포	골수 간질 (메센카이멀) 세포의 하위세트상의 세포-표면 당단백질; Stro-1+세포의 선택은 지방세포, 골세포, 평활근세포, 섬유아세포, 연골세포, 및 혈구로 발생할 수 있는 다기능 세포인 메센카이멀 전구 세포를 분리하는 것을 돕는다
Thy-1	HSC, MSC	세포-표면 단벡질; 네거티브 또는 낮은 검출은 HSC를 시사한다.
연골 조직
콜라겐 타입 II 및 IV	연골세포	연골세포에 의해 특이하게 생성된 구조적 단백질
케라틴	케라틴 생성세포	피부의 기본적인 단백질; 분화된 케라틴생성세포를 확인한다
황화 프로테오글리칸	연골세포	연결 조직에서 발견된 분자; 연골세포에 의해 합성된다
지방
지방세포 지질-결합 단백질 (ALBP)	지방세포	지방세포에 특이하게 위치한 지질-결합 단백질
지방산 수송체 (FAT)	지방세포	지방세포에 특이하게 위치한 수송 분자
지방세포 지질-결합 단백질 (ALBP)	지방세포	지방세포에 특이하게 위치한 지질-결합 단백질
간
알부민	간세포	간에 의해 생성된 기본 단백질; 성숙하는 기능과 완전히 분화된 간세포를 나타낸다
B-1 인티그린	간세포	세포-세포 상호작용에 중요한 세포-부착 분자; 간의 발생 중에 발현된 마커
신경계
CD133	신경 줄기세포, HSC	뉴런과 신경교세포로 발생하는 신경 줄기세포를 확인하는 세포-표면 단백질,
신경교 원섬유성 산성 단백질(GFAP)	성상세포	성상세포에 의해 특이하게 생성된 단백질
미소관-결합 단백질-2 (MAP-2)	뉴런	수지상 돌기-특이적 MAP; 뉴런의 수지상 돌기 가지뻗기에서 특이하게 발견된 단백질
미엘린 염기성 단백질 (MPB)	올리고덴드로사이트	성숙한 올리고덴드로사이트에 의해 생성된 단백질; 뉴런 구조를 둘러싸고 있는 미엘린 뚜껑에 위치함
네스틴	신경 원조세포	원시 신경 조직에서 발현된 중간 필라멘트 구조적 단백질
신경성 튜뷸린	뉴런	뉴런에 중요한 구조적 단백질; 분화된 뉴런을 확인한다.
뉴로필라멘트(NF)	뉴런	뉴런에 중요한 구조적 단백질; 분화된 뉴런을 확인한다.
노긴(Noggin)	뉴런	뉴런의 발생 중에 발현된 뉴런-특이적 유전자
O4	올리고덴드로사이트	올리고덴드로사이트를 발생하는, 미성숙체 상의 세포-표면 마커
O1	올리고덴드로사이트	성숙한 올리고덴드로사이트를 확인하는 세포-표면 마커
시냅톱신	뉴런	시냅스에 위치한 뉴런 단백질; 뉴런 간의 연결을 나타낸다.
Tau	뉴런	MAP의 유형; 액손 구조를 유지하는 것을 돕는다
췌장
사이토케라틴 19 (CK19)	췌장 상피	CK19는 샘세포와 소화관 세포에 대한 원조세포인 특이한 췌장 상피세포를 확인한다
글루카곤	췌장샘	췌장의 알파-샘세포에 의해 발현됨
인슐린	췌장샘	췌장의 베타-샘세포에 의해 발현됨
췌장 인슐린-촉진 인자-1 (PDX-1)	췌장샘	췌장의 베타-샘세포에 의해 발현된 전사 인자
네스틴	췌장 원조세포	췌장을 포함한 원조 셀라인을 나타내는 구조적 필라멘트 단백질
췌장 폴리펩티드	췌장샘	췌장의 감마-샘세포에 의해 발현됨
소마토스타틴	췌장샘	췌장 만능 줄기세포의 델타-샘세포에 의해 발현
알파-페토단백질 (AFP)	내배엽	원시 내배엽 발생 중에 발현된 단백질; 내피 분화를 반영한다
전능 줄기세포
뼈 형태유전학적 단백질-4	중배엽	초기 중배엽 형성 및 분화 중에 발현된 성장 및 분화 인자
브라키우리(brachyury)	중배엽	중배엽 형성 및 분화의 초기 단계에 중요한 전사 인자; 중배엽 형성의 초기 지시체로서 사용
GATA-4 유전자	내배엽	ES가 내배엽으로 분화함에 따라 발현은 증가함
간세포 핵 인자-4 (HNF-4)	내배엽	내배엽 형성시 초기에 발현된 전사 인자
네스틴	외배엽, 신경 및 췌장 원조세포	세포 내 중간 필라멘트; 원시 신경외배엽 형성의 특징
뉴런 세포-부착 분자 (N-CAM)	외배엽	세포-세포 상호작용을 촉진하는 세포-표면 분자; 원시 신경외배엽 형성을 나타낸다
Pax6	외배엽	ES 세포가 신경상피로 분화함에 따라 발현된 전사 인자
비멘틴	외배엽, 신경 및 췌장 원조세포	세포내에 있는 중간 필라멘트; 원시 신경외배엽 형성의 특징
골격근/심장/평활근
MyoD 및 Pax7	근아세포, 근세포	근아세포의 성숙한 근세포로의 분화를 지시하는 전사 인자
미오게닌 및 MR4	골격 근세포	근육 줄기세포로부터 근아세포의 분화에 필요한 이차 전사 인자
미오신 중쇄	심근세포	심근세포에서 발견되는 구조적 및 수축성 단백질의 성분
미오신 경쇄	골격 근세포	골격근세포에서 발견되는 구조적 및 수축성 단백질의 성분

세포 표면 항원은 기본적으로 세포를 확인하고 구별하기 위한 마커로서 사용된다. 항원 특이성은 종 (유전자형), 기관, 조직, 또는 거의 모든 세포에 대한 세포 유형에 대해 존재한다 - 아마도 대략 10⁴의 구별되는 항원이 있을 것이다. 세포 유형을 구별하기 위해 사용될 수 있는 세포 표면 항원의 예를 하기 표 5에 제시한다.

표 5. 인간 세포 표면 항원

B 세포	CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, NT5E
활성화된 B 세포	VD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7
성숙한 B 세포	CD19, CD22, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1
T 세포	CD160, CD28, CD37, CD3D, CD3G, CD3Z, CD5, CD6, CD7, FAS, KLRB1, KLRD1, NT5E, ST6GAL1
세포독성 T 세포	CD8A, CD8B1
헬퍼 T 세포	CD4
활성화된 T 세포	ALCAM, CD2, CD38, CD40LG, CD69, CD83, CD96, CTLA4, DPP4, HLA-DRA, IL12RB1, IL2RA, ITGA1, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFSF7
천연 킬러 (NK) 세포	CD2, CD244, CD3Z, CD7, CD96, CHST10, FCGR3B, IL12RB1, KLRB1, KLRC1, KLRD1, LAG3, NCAM1
단핵세포/대식세포	ADAM8, C5R1, CD14, CD163, CD33, CD40, CD63, CD68, CD74, CD86, CHIT1, CHST10, CSF1R, DPP4, FABP4, FCGR1A, HLA-DRA, ICAM2, IL1R2, ITGA1, ITGA2, S100A8, TNFRSF8, TNFSF7
활성화된 대식세포	CD69, ENG, FCER2, IL2RA
내피세포	ACE, CD14, CD34, CD31, CDH5, ENG, ICAM2, MCAM, NOS3, PECAM1, PROCR, SELE, SELP, TEK, THBD, VCAM1, VWF
평활근 세포	ACTA2, MYH10, MYH11, MYH9, MYOCD
수지상 돌기 세포	CD1A, CD209. CD40, CD83, CD86, CR2, FCER2, FSCN1
비만 세포	C5R1, CMA1, FCER1A, FCER2, TPSAB1
섬유아세포(간질)	ALCAM, CD34, COL1A1, COL1A2, COL3A1, PH-4
상피세포	CD1D, K61RS2, KRT10, KRT13, KRT17, KRT18, KRT19, KRT5, KRT8, MUC1, TACSTD1
지방세포	ADIPOQ, FABP4, RETN

적혈구의 경우, Rh, Kell, Duffy, 및 Kidd 혈액 그룹 시스템의 항원은 적혈구의 혈장막에서 배타적으로 발견되고 혈소판, 림프구, 과립구, 혈장, 또는 다른 신체 분비액, 예컨대 침, 젖, 또는 양막 액에서는 검출되지 않았다 (P. L. Mollison, C.P. Engelfriet, M. Contreras, Blood Transfusions in Clinical Medicine, Ninth Edition, Blackwell Scientific, Oxford, 1993). 그러므로 이 4가지의 항원 세트의 어떠한 구성원이든지 검출하는 것은 적혈구 확인에 대한 독특한 마커를 수립하는 것이 된다. MNS와 루테란 항원은 또한 적혈구에 한정되지만 두 가지 예외가 있다: GPA 당단백질 (MN 활성)은 또한 신장의 모세관 내피에서 발견되고 (P. Hawkins, S. E. Anderson, J.L. McKenzie, K. McLoughlin, M.E.J. Beard, D.N.J. Hart, "Localization of MN Blood Group Antigens in Kidney," Transplant. Proc. 17(1985):1697~1700), Lu^b-유사 당단백질은 신장의 내피세포와 간의 간세포에서 나타난다 (D.J. Anstee, G. Mallinson, J.E. Yendle, et al., "Evidence for the occurrence of Lu^b-active glycoproteins in human erythrocytes, kidney, and liver," International Congress ISBT-BBTS Book of Abstracts, 1988, p. 263). 이와는 대조적으로 ABH 항원은 많은 비-RBC 조직 세포, 예컨대 신장과 침샘에서 발견된다 (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Immunology, Gower Medical Publishing, New York, 1989). 어린 배에서 ABH는 모든 내피 및 상피세포에서 발견될 수 있지만, 단, 중추신경계에서는 예외이다 (Aron E. Szulman, "The ABH antigens in human tissues and secretions during embryonal development," J. Histochem. Cytochem. 13(1965):752-754). ABH, 루이스, I 및 P 혈액그룹 항원은 최소한 부분적으로는 혈장으로부터 세포막으로의 흡수 때문에 혈소판과 림프구에서 발견된다. 과립구는 I 항원을 가지지만 ABH는 갖지 않는다 (P.L. Mollison, C.P. Engelfriet, M. Contreras, Blood Transfusions in Clinical Medicine, Ninth Edition, Blackwell Scientific, Oxford, 1993).

혈소판은 또한 그것들이 이미 체조직 세포를 공유하는 HLA 항원 외에, 혈소판-특이적 동종항원을 그것들의 혈장막에서 발현한다. 현재 분자 수준에서 규정된 인간 혈소판 동종항원 (HPA) 시스템은 5가지가 인지되어 있다. 주어진 표현형 빈도는 백인 집단에 대한 것이고; 아프리카와 아시아인 집단에서의 빈도는 실질적으로 달라질 것이다. 예를 들어 HPA-1b는 백인의 28%의 혈소판에서 발현되지만, 일본인에게서는 단지 4%에게서만 발현된다 (Thomas J. Kunicki, Peter J. Newman, "The molecular immunology of human platelet proteins," Blood 80(1992):1386-1404).

특별한 기능적 활성을 가지는 림프구는 그것들의 세포 표면에 표시된 다양한 분화 마커에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어 모든 성숙한 T 세포는 CD3 복합체로 불리는 한 세트의 폴리펩티드 사슬을 발현한다. 헬퍼 T 세포 또한 CD4 당단백질을 발현하는 한편, 세포독성 및 억제제 T 세포는 CD8로 불리는 마커를 발현한다 (Wayne M. Becker, David W. Deamer, The World of the Cell, Second Edition, Benjamin/Cummings Publishing Company, Redwood City CA, 1991). 그러므로 표현형 CD3⁺CD4⁺CD8^-는 헬퍼 T 세포를 포지티브로 확인하는 반면, CD3⁺CD4^-CD8⁺의 검출은 세포독성 또는 억제제 T 세포를 독특하게 확인한다. 모든 b 림프구는 면역글로불린 (그것들의 항원 수용체, 또는 Ig)을 표면에 발현하고, 그것을 기초로, 예컨대 Ig⁺ MHC 부류 II⁺로서 T 세포와 구별될 수 있다.

림프구 표면은 또한 세포 분화의 특징적 단계에서만 발현되는 특이한 유전자 생성물을 나타내는 뚜렷한 마커를 나타낸다. 예를 들어, 단계 I 원조 B 세포는 CD34⁺PhiL^-CD19^-를 나타내고; 단계 II는 CD34₊PhiL⁺CD19^-를; 단계 III은 CD34⁺PhiL⁺CD19⁺를; 그리고 마지막으로 전구체 B 단계에서 CD34^-PhiL⁺CD19⁺를 나타낸다 (Una Chen, "Chapter 33. Lymphocyte Engineering, Its Status of Art and Its Future," in Robert P. Lanza, Robert Langer, William L. Chick, eds., Principles of Tissue Engineering, R.G. Landes Company, Georgetown TX, 1997, pp. 527-561).

호중성 백혈구-특이적 항원과 백혈구에 대한 다양한 수용체-특이적 면역글로불린 결합 특이성이 존재한다. 예를 들어, 단핵세포 FcRI 수용체는 측정된 결합 특이성 IgG1⁺⁺⁺IgG2^-IgG3⁺⁺⁺IgG4⁺를 나타내고, 단핵세포 FcRIII 수용체는 IgG1⁺⁺⁺IgG2^-IgG3⁺⁺IgG4^-를 가지며, 호중성 및 호산성 백혈구 상의 FcRII 수용체는 IgG1⁺⁺⁺IgG2⁺IgG3⁺⁺⁺IgG4⁺를 나타낸다. 호중성 백혈구는 또한 그 표면상에 β-글루칸 수용체를 갖는다 (Vicki Glaser, "Carbohydrate-Based Drugs Move CLoser to Market," Genetic Engineering News, 15 April 1998, pp. 1, 12, 32, 34).

조직 세포 또한 그 표면상에 구별되는 특이한 마커 세트를 나타낸다. 갑상선 마이크로솜-미세융모 항원은 갑상선에 독특한 것이다 (Ivan M. Roitt, Jonathan Brostoff, David K. Male, Immunology, Gower Medical Publishing, New York, 1989). 신경교 원섬유성 산성 단백질 (GFAP)은 성상 세포의 면역세포화학적 마커이고 (Carlos Lois, Jose-Manuel Garcia-Verdugo, Arturo Alvarez-Buylla, "Chain Migration of Neuronal Precursors," Science 271(16 February 1996):978-981), 신탁신 1A와 1B는 신경 세포의 혈장막에서만 발견되는 인단백질이다 (Nicole Calakos, Mark K. Bennett, Karen E. Peterson, Richard H. Scheller, "Protein-Protein Interactions Contributing to the Specificity of Intracellular Vesicular Trafficking," Science 263(25 February 1994):1146- 1149). 알파-포드린은 침샘 세포의 기관-특이적 자가항원 마커이다 (Norio Haneji, Takanori Nakamura, Koji Takio, et al., "Identification of alpha-Fodrin as a Candidate Autoantigen in Primary Sjogren's Syndrome," Science 276(25 April 1997):604-607). ADAM 패밀리의 한 구성원인 페르틸린(Fertilin)은 포유류 정자 세포의 혈장막에서 발견된다 (Tomas Martin, Ulrike Obst, Julius Rebek Jr., "Molecular Assembly and Encapsulation Directed by Hydrogen-Bonding Preferences and the Filling of Space," Science 281(18 September 1998):1842-1845). 간세포는 코넥신 32, 트란스페린, 및 주요 방광 단백질 (MUP)과 함께 표현형 마커 ALB⁺⁺⁺GGT^-CK19^-를 나타내는 한편, 담즙 세포는 마커 AFP^-GGT⁺⁺⁺CK19⁺⁺⁺와 BD.1 항원, 알칼리성 포스파타제, 및 DPP4를 나타낸다 (Lola M. Reid, "Chapter 31. Stem Cell/Lineage Biology and Lineage-Dependent Extracellular Matrix Chemistry: Keys to Tissue Engineering of Quiescent Tissues such as Liver," in Robert P. Lanza, Robert Langer, William L. Chick, eds., Principles of Tissue Engineering, R. G. Landes Company, Georgetown TX, 1997, pp. 481-514). 클라트린-코팅된 소포 수송에 관련된 100-킬로달톤 혈장막 구아노신 트리포스페이트의 패밀리로는 다이나민 I (뉴런에서 배타적으로 발현된다), 다이나민 II (모든 조직에서 발견된다), 및 다이나민 III (고환, 뇌, 및 폐에 한정된다)이 있고, 이들 각각은 최소한 4개의 구별되는 이소(iso)형태가 있으며; 다이나민 II는 또한 트란스(trans)-골지 네트워크에서 세포 내 배치를 나타낸다 (Martin Schnorf, Ingo Potrykus, Gunther Neuhaus, "Microinjection Technique: Routine System for Characterization of Microcapillaries by Bubble Pressure Measurement," Experimental Cell Research 210(1994):260-267). 하기 표 6은 간 생성 (예컨대 간 원세포) 및 조혈 (예컨대 적혈구 전구세포) 세포의 수많은 독특한 항원 마커의 목록이다.

표 6. 간 생성 및 조혈 인간 세포의 독특한 항원 마커

간 생성 세포 (예컨대 간 원세포)	α-페토단백질, 알부민, 줄기세포 인자, 간 헤파린 황산염-PGs(신데칸/퍼레칸), IGF I, IGF II, TGF-α, TGF-α 수용체, α1 항원, α5 인티그린, 코넥신 26, 및 코넥신 32
조혈 세포 (예컨대 적혈구 전구세포)	OX43 (MCA 276), OX44 (MCA 371, CD37), OX42 (MCA 275, CD118), c-키트, 줄기세포 인자 수용체, 조혈 헤파린 황산염-PG (세르글리신), GM-CSF, CSF, α4 인티그린, 및 적혈구 항원

최소한 4개의 주요 패밀리의 세포-특이적 세포 부착 분자가 1998년에 확인되었다 - 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 (N-CAM 및 ICAM-1 포함), 인티그린 슈퍼패밀리, 카데린 패밀리 및 셀렉틴 패밀리 (하기 참조).

인티그린은 광범위한 세포 상에서 발현되는 약 200 킬로달톤의 세포 표면 부착 수용체이며, 대부분의 세포가 여러 개의 인티그린을 발현한다. 대부분의 인티그린은 세포외재성 매트릭스에 대한 세포 연결을 중재하고, 세포골격 하층에의 부착에 포함된다. 세포-유형-특이적 예로는 혈소판-특이적 인티그린 (α_IIbβ₃), 백혈구-특이적 β₂ 인티그린, 후기-활성화 (α_Lβ₂) 림프구 항원, 망막 강글리온 액손 인티그린 (α₆β₁) 및 케라틴 생성세포 인티그린 (α₅β₁)이 있다 (Richard O. Hynes, "Integrins: Versatility, Modulation, and Signaling in Cell Adhesion," Cell 69(3 April 1992):ll-25). 최소한 20개의 상이한 이종 이량체 인티그린 수용체가 1998년에 공지되었다.

723-748-잔기의 경막 단백질의 카데린 분자 패밀리는 세포-특이적인 세포-세포 부착의 또 다른 방법을 제공한다 (Masatoshi Takeichi, "Cadherins: A molecular family important in selective cell-cell adhesion," Ann. Rev. Biochem. 59(1990):237-252). 카데린은 세포골격에 연결된다. 고전적인 카데린은 E-(상피), N-(신경 또는 A-CAM), 및 P-(태반) 카데린을 포함하지만, 1998년에 이 패밀리의 최소한 12개의 상이한 구성원이 알려졌다 (Elizabeth J. Luna, Anne L. Hitt, "Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions," Science 258 (1992):955-964). 그것들은 세포 표면에서 세포-세포 접합점에 집약되고 (그곳에서만 배타적으로 발견되는 것은 아니지만 ), 다세포 구조를 유지하는데 결정적인 것으로 여겨진다. 세포는 우선적으로 동일한 카데린 유형을 발현하는 다른 세포에 부착한다. 간의 간세포는 단지 E-만을 발현하고; 메센카이멀 폐 세포, 눈의 액손 및 신경상피세포는 N-만을 발현하며; 상피 폐 세포는 E-와 P-카데린을 모두 발현한다. 카데린 패밀리의 구성원들은 또한 배에서 상이한 시공간적 패턴으로 분포되며, 세포가 분화됨에 따라 카데린 유형의 발현은 역동적으로 변화된다 (Masatoshi Takeichi, "Cadherins: A molecular family important in selective cell-cell adhesion," Ann. Rev. Biochem. 59(1990):237-252).

탄수화물은 세포 인식에 중요하다. 모든 세포는 당단백질과 당지질로 구성되는 얇은 당 코팅 (글리코칼릭스)을 가지는데, 그것의 약 3000개의 상이한 모티프가 1998년에 확인되었다. 탄수화물 세포 표면 구조의 레퍼토리는 세포가 발달하거나, 분화하거나, 또는 약해짐에 따라 특징적으로 변화한다. 예를 들어 독특한 3당 (SSEA-1 또는 Le^x)은 배가 느슨한 세포 그룹으로부터 매끄러운 볼로 압축될 때 정확히 8- 내지 16-세포 단계에서 발생하는 배의 세포 표면에 나타난다.

탄수화물 모티프는 이론적으로는 뉴클레오티드 또는 단백질-기저 구조보다 더 조합적으로 다양하다. 뉴클레오티드와 아미노산이 한 가지 방식으로만 상호연결될 수 있는 반면, 올리고당과 다당에 있는 단당 유닛은 여러 지점에서 부착할 수 있다. 그러므로 두 개의 아미노산은 단지 두 개의 구별되는 디펩티드를 만들 수 있지만, 두 개의 동일한 단당류는 결합하여 11개의 상이한 이당류를 형성할 수 있다. 왜냐하면 각 단당류는 6개의 탄소를 가지고 있어서, 각각의 유닛이 6개의 상이한 부착 지점을 제공하고 총 6+5=11개의 가능한 조합을 만들기 때문이다. 네 개의 상이한 뉴클레오티드는 단지 24개의 구별되는 테트라뉴클레오티드를 만들 수 있지만, 4개의 상이한 단당류는 35,560개의 독특한 4당류를 만들 수 있고, 그 중 많은 것들이 가지를 뻗은 구조를 갖는다 (Nathan Sharon, Halina Lis, "Carbohydrates in Cell Recognition," Scientific American 268(January 1993):82-89). 단일한 6당류는 ~10¹²개의 구별되는 구조를 만들며, 헥사펩티드의 경우 6.4×10⁷개의 구조를 만들고; 9-량체 탄수화물은 한 몰의 이성질체를 가진다 (Roger A. Laine. Glycobiology 4(1994):l-9).

경막 당단백질의 CD44 패밀리는 ECM 결합, 세포 이동 및 림프구 회귀(homing)를 중재하는 80-95 킬로달톤 세포 부착 수용체이다. CD44 항원은 광범위한 세포-특이적 및 조직-특이적 글리코실화 패턴을 나타내며, 각각의 세포 유형은 CD44 코어 단백질을 그 자신만의 독특한 탄수화물 구조 배열로 장식한다 (Jayne Lesley, Robert Hyman, Paul W. Kincade, "CD44 and Its Interaction with Extracellular Matrix," Advances in Immunology 54(1993):271-335; Tod A. Brown, Todd Bouchard, Tom St. John, Elizabeth Wayner, William G. Carter, "Human Keratinocytes Express a New CD44 Core Protein (CD44E) as a Heparin-Sulfate Intrinsic Membrane Proteoglycan with Additional Exons," J. Cell Biology 113(April 1991):207-221). 명료한 CD44 세포 표면 분자들은 림프구, 대식세포, 섬유아세포, 상피세포, 및 케라틴 생성세포에서 발견되었다. 신경계에서의 CD44 발현은 건강한 젊은이들의 백질 (성상세포 및 신경교세포를 포함)에 제한되지만, 노화 또는 질병에 수반하는 회색질에서도 나타난다 (Jayne Lesley, Robert Hyman, Paul W. Kincade, "CD44 and Its Interaction with Extracellular Matrix," Advances in Immunology 54(1993):27l-335). 소수의 조직, 예컨대 간의 간세포, 신장 세뇨관 상피, 심근, 고환 및 피부의 일부는 CD44 네거티브이다.

약 50킬로달톤의 세포 부착 수용체 당단백질 분자인 셀렉틴 패밀리 (Ajit Varki, "Selectin ligands," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(August 1994):7390- 7397; Masatoshi Takeichi, "Cadherins: A molecular family important in selective cell-cell adhesion," Ann. Rev. Biochem. 59(1990):237-252)는 다양한 세포-표면 항원 탄수화물을 인지할 수 있고, 백혈구가 염증 영역에 자리잡는 것(백혈구 전매(trafficking))을 돕는다. 셀렉틴은 세포골격에 부착되지 않는다 (Elizabeth J. Luna, Anne L. Hitt, "Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions," Science 258(6 November 1992):955-964). 백혈구는 L-셀렉틴, 혈소판은 P-셀렉틴, 내피 세포는 E-셀렉틴 (L과 P까지도) 수용체를 나타낸다. 셀렉틴에 의해 인지되는 세포-특이적 분자는 종양 뮤신 올리고당 (L, P, 및 E에 의해 인지됨), 뇌 당지질 (P와 L), 호중성 당단백질 (E와 P), 백혈구 시알로당단백질 (E와 P), 및 내피 프로테오글리칸 (P와 L)이다 (Ajit Varki, (1994)). 관련된 MEL-14 당단백질 회귀 수용체 패밀리는 장의 페이어 조각, 장간막 림프 결절, 폐-관련 림프 결절, 활액 세포 및 젖을 분비하는 유방 내피에 있는 세포 상에서 발견된 세포-특이적 표면 항원인 "혈관 어드레신"으로 코드된 특이한 림프액 분비 조직에 림프구가 회귀하는 것을 가능하게 한다. 회귀 수용체는 또한 일부 림프구가 결장과 공장을 구별하는 것을 가능하게 한다 (Ted A. Yednock, Steven D. Rosen, "Lymphocyte Homing", Advances in Immunology 44(1989):313-378; Lloyd M. Stoolman, "Adhesion Molecules Controlling Lymphocyte Migration," Cell 56(24 March 1989):907-910). 셀렉틴-관련 상호작용은 화학적 유인제 수용체 및 인티그린-Ig와 함께 백혈구의 분출을 연속적으로 조절하여, 신체 내의 세포 정위에 대한 세 자리의 "영역 코드"를 수립한다 (Timothy A. Springer, "Traffic Signals on Endothelium for Lymphocyte Recirculation and Leukocyte Emigration," Annu. Rev. Physiol. 57(1995):827-872).

마지막으로, 세포는 그것의 고유한 경막 세포골격-관련 단백질에 따라 분류될 수 있다. 예를 들어 적혈구 막은 당단백질 C (~25 킬로달톤, ~3000 분자/미크론²)와 밴드 3 이온 교환기 (90-100 킬로달톤, ~10,000 분자/미크론²)을 포함하고 (Elizabeth J. Luna, Anne L. Hitt, "Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions," Science 258(6 November 1992):955-964; MJ. Tanner, "The major integral proteins of the human red cell," Baillieres Clin. Haematol. 6(June 1993):333-356); 혈소판 막은 GP Ib-IX 당단백질 복합체 (186 킬로달톤)를 통합하며; 호중성에서 세포막 연장은 경막 단백질 폰티큘린 (17 킬로달톤)을 필요로 하고; 가는 홈이 있는 근육 세포막은 경막 디스트로핀-당단백질 복합체의 가장 바깥 부분에서 특이한 라미닌-결합 당단백질 (156 킬로달톤)을 포함한다 (Elizabeth J. Luna, Anne L. Hitt, "Cytoskeleton-Plasma Membrane Interactions," Science 258(6 November 1992):955-964). 또한 세포 표면에는 빈번하게 나타나는 다양한 탄수화물-결합 단백질 (렉틴)이 있으며, 상이한 단당류와 올리고당류를 구분할 수 있다 (Nathan Sharon, Halina Lis, "Carbohydrates in Cell Recognition," Scientific American 268(January 1993):82-89). 세포-특이적 렉틴으로는 간세포의 갈락토스(아시알로당단백질)-결합 및 프룩토스-결합 렉틴, 섬유아세포의 만노실-6-포스페이트 (M6P) 렉틴, 치조골막 대식세포의 만노실-N-아세틸글루코사민-결합 렉틴, 신경상피세포의 갈라비오스-결합 렉틴, 및 심장, 뇌 및 폐의 여러 갈락토스-결합 렉틴이 있다 (Nathan Sharon, (1993); Mark J. Poznansky, Rudolph L. Juliano, "Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs: A Critical Review," Pharmacological Reviews 36(1984):277-336; Karl-Anders Karlsson, "Glycobiology: A Growing Field for Drug Design," Trends in Pharmacological Sciences 12(My 1991):265-272; N. Sharon, H. Lis, "Lectins - proteins with a sweet tooth: functions in cell recognition," Essays Biochem. 30(1995):59-75).

개시된 방법으로 제조될 수 있는 세포 유형에 대한 추가의 설명은 아래와 본원의 다른 곳에 제시한다.

a) 케라틴화 상피세포

케라틴화 상피세포는 상피의 케라틴 생성세포 (분화하는 상피세포)를 포함한다. 케라틴 생성세포는 상피의 대략 90%의 세포를 만든다. 상피는 케라틴 생성세포 형태를 토대로 4개의 층으로 나누어진다: 기저층 (진피와 만나는 곳), 과립층(stratum granulosum), 스폰지층(stratum spinosum), 및 각질층. 케라틴 생성세포는 그것의 발달을 케라틴 생성세포 줄기세포 분화를 통하여 기저층에서 시작한다. 그것은 표피층을 통하여 상승되어 각질층에 도달할 때까지 점진적인 분화를 진행하는데, 각질층에서 그것들은 스퀘임즈(squames)로 불리는 죽은 세포, 평평해진 세포, 고도로 케라틴화된 세포 층을 형성한다. 이 층은 외래 물질 및 감염성 병원체가 신체 안으로 들어가서 습기 손실을 최소화하는 것에 대한 효과적인 장벽을 형성한다. 케라틴화 상피세포는 또한 상피줄기세포인 상피 기저 세포를 포함한다. 케라틴화 상피세포는 또한 손톱과 발톱의 케라틴 생성세포, 발톱 상 기저세포 (줄기세포), 수질 모 샤프트 세포, 피질 모 샤프트 세포, 각피 층의 모 샤프트 세포, 각피 층의 모근 덮개 세포, 헉슬리 층의 모근 덮개 세포, 헨레 층의 모근 덮개 세포, 외부 모근 덮개 세포, 및 헤어 매트릭스 세포 (줄기세포)를 포함한다. 또한 본원에 개시되는 어떠한 줄기세포와 세포의 전구 세포들, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

b) 습식 층을 이룬 장벽 상피 세포

인간 습식 층을 이룬 장벽 상피 세포는 각막, 혀, 구강, 식도, 항문, 말초 요도, 및 질의 층을 이룬 비늘 모양 상피의 표면 상피세포뿐만 아니라, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문, 말초 요도 및 질의 상피의 기저세포 (줄기세포), 및 비뇨기 상피세포 (방광 및 요도관 라이닝)를 포함한다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포

동물해부학에서, 상피는 상피세포로 구성된 조직이다. 그런 조직은 전형적으로, 세포막이 세포를 덮는 것처럼 신체의 부분들을 덮는다. 또한 그것은 선(샘, gland)을 형성하기 위해 사용된다. 인간 피부의 최외각층과 마우스 및 신체의 구멍마다의 점막은 죽은 비늘 모양의 상피세포로 구성되었다. 상피세포는 또한 폐, 위장관, 재생 및 요도관의 내부를 라이닝하고, 외분비선 및 내분비선을 구성한다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

c) 외분비 상피세포

외분비 상피세포는 침샘 점막 세포 (다당-풍부 분비물), 침샘 장액 세포 (당단백질-효소 풍부 분비물), 혀의 폰 에브너샘 세포 (미각 돌기를 씻음), 유선세포 (젖 분비), 눈물분비샘 세포 (눈물 분비), 귀의 귀지선 세포 (귀지 분비), 외분비 땀샘 흑색세포 (당단백질 분비), 외분비 땀샘 투명세포 (작은 분자 분비), 아포크린 땀샘 세포 (냄새 분비, 성호르몬 민감성), 눈꺼풀의 몰 세포샘 (특수한 땀샘), 피지샘 세포 (지질-풍부 피지 분비), 코의 바우만샘 세포, 십이지장의 브루너샘 세포 (효소 및 알칼리성 점액), 정액성 소포 세포 (정액 유체 성분을 분비한다), 전립선 세포 (정액 유체 성분을 분비한다), 불보요도선 세포 (점액 분비), 바르톨린선 세포 (질 윤활제 분비), 리터샘 세포 (점액 분비), 자궁 내막 세포 (탄수화물 분비), 호흡기 및 소화기 관의 분리된 고블렛 세포 (점액 분비), 위 라이닝 점액세포 (점액 분비), 위샘 효소원 세포 (펩시노겐 분비), 소화샘 옥신트 세포 (HCl 분비), 췌장 소핵 세포 (중탄산염 및 소화효소 분비), 소장의 파네쓰 세포 (라이소자임 분비), 폐의 타입 II 폐세포 (계면활성제 분비), 및 폐의 클라라 세포를 포함한다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

d) 호르몬 분비 세포

호르몬 분비 세포는 뇌뇌하수체 전엽 세포, 소마토트로프, 락토트로프, 티로트로프, 고나도트로프, 코르티코트로프, 흑색세포-자극 호르몬을 분비하는 뇌뇌하수체 중엽 세포, 옥시토신, 바소프레신을 분비하는 마그노세포 신경 분비 세포, 소화관 및 호흡기 세포, 세로토닌, 엔도르핀, 소마토스타틴, 가스트린, 세크리틴, 콜레시스토키닌, 인슐린, 글루카곤, 봄베신 분비, 갑상선 세포, 갑상선 상피세포, 부난포 세포, 부갑상선 세포, 부갑상선 치프 세포, 옥시필 세포, 부신 선 세포, 크로마핀 세포, 스테로이드 호르몬 (미테랄코르티코이드 및 글루코코르티코이드) 분비, 테스토스테론을 분비하는 고환의 레이디그 세포, 에스트로겐을 분비하는 난소 난포의 포막 내막 세포, 프로게스테론을 분비하는 깨진 난소 난포의 신황체 세포, 신장 신사구체 인접 기관 세포 (레닌 분비), 신장의 매큘라 덴사 세포, 신장의 말초 극성 세포, 및 신장의 메상기얼(mesangial) 세포를 포함한다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

e) 상피 흡수 세포 (소화관, 외분비선 및 비뇨생식기 관)

상피 흡수 세포로는 장의 브러쉬 경계 세포 (미세융모 포함), 외분비선 층을 이루는 소화관 세포, 골 방광 상피 세포, 신장 기부 세관 브러쉬 경계 세포, 신장 말단 세관 세포, 소도관 에페렌 조정 세포, 부고환 기초세포, 부고환 기저세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

f) 대사 및 저장 세포

대사 및 저장 세포로는 간세포 (간 세포), 백색 지방 세포, 갈색 지방 세포, 및 간 지방세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

g) 장벽 기능 세포 (폐, 소화관, 외분비선 및 비뇨생식기 관)

장벽 기능 세포로는 타입 I 폐세포 (폐의 공기 영역을 라이닝함), 췌장관 세포 (중심소핵 세포), 비-횡문 소화관 세포 (땀샘, 타액샘, 젖샘 등의), 신사구체 체벽 세포, 신사구체 포도사이트(podocyte), 헨레 루프 얇은 절편 세포 (신장), 신장 수집 소화관 세포, 소화관 세포 (정액 소포, 전립선 등의)가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

h) 폐쇄된 내부 체강을 라이닝하는 상피 세포

폐쇄된 내부 체강을 라이닝하는 상피세포로는 혈관 및 림프관 내피의 작은 구멍이 있는 세포, 혈관 및 림프관 내피의 연속세포, 혈관 및 림프관 내피의 비장 세포, 활액 세포 (관절 강을 라이닝, 히알루론산 분비), 융모막 세포 (복막, 늑막, 및 심막 강을 라이닝), 비늘 모양 세포 (귀의 말초 림프액 분비 공간을 라이닝), 비늘모양 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 미세융모가 있는 내부 림프 분비 색의 원주형 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 미세융모가 없는 내부 림프 분비 색의 원주형 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 흑색 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 전실 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 가는 홈이 있는 도관 기저세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 가는 홈이 있는 도관 주변 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 클라우디우스 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 보체르 세포 (귀의 내부 림프액 분비 공간을 라이닝), 맥락막 망상 세포 (뇌척수액 분비), 피아-아라크노이드(Pia-arachnoid) 바늘모양 세포, 색소 침착된 눈의 모양체 상피세포, 색소 침착되지 않은 눈의 모양체 상피세포, 및 각막 상피세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

i) 추진 기능이 있는 섬모세포

추진 기능이 있는 섬모세포로는 호흡기의 섬모세포, 수란관 섬모세포 (여성에서), 자궁 내막 섬모세포 (여성에서), 망상 고환 섬모세포 (남성에서), 소도관 에페렌스 섬모세포 (남성에서), 및 중추신경계의 섬모 에펜다이멀(ependymal) 세포 (뇌 강을 라이닝)가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

j) 세포외재성 매트릭스 분비 세포

세포외재성 매트릭스 분비 세포로는 에나멜 모세포 상피세포 (치아 에나멜 분비), 귀의 전실 기관의 플라늄 세미루테늄 (Planum semilutenum) 상피세포 (프로테오글리칸 분비), 코르티 기관 치간 상피세포 (모세포를 덮는 텍토리움 막 분비), 느슨한 연결조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포, 힘줄 섬유아세포, 골수 망상 조직 섬유아세포, 다른 (비상피성) 섬유아세포, 혈액 모세혈관 말초세포, 척추내 디스크의 핵 풀포수스(pulposus) 세포, 세멘토블라스트(cementoblast)/세멘토사이트(cementocyte) (뼈와 같은 치근 백악질 분비), 치아모세포/치아세포 (치아 상아질 분비), 히알린 연골조직 연골세포, 섬유연골조직 연골세포, 탄성 연골조직 연골세포, 골아세포/골세포, 원조 뼈세포 (골아세포의 줄기세포), 눈의 유리체의 히알로사이트(hyalocyte), 및 귀의 말초 림프액 분비 공간의 방사상 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

k) 수축성 세포

수축성 세포로는 적색 골격근 세포 (느린), 백색 골격근 세포 (빠른), 중간 골격근 세포, 근육 방추 -핵 가방 세포, 근육 방추 - 핵 사슬 세포, 방사상 세포 (줄기세포), 정상적인 심근 세포, 결절 심근세포, 퍼킨지(Purkinje) 섬유세포, 평활근 세포 (다양한 유형), 홍채의 근상피 세포, 및 외분비선의 근상피 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

l) 혈액 및 면역 시스템 세포

혈액 및 면역 시스템 세포로는 적혈구, 메가카리오사이트(megakaryocyte), 단핵 세포, 연결조직 대식세포 (다양한 유형), 표피 랑게르한스 세포, 파골세포 (뼈에서), 수지상 세포 (림프양 조직에서), 미소신경교 세포 (중추신경계에서), 호중성, 호산성 세포, 호염기성 세포, 비만 세포, 헬퍼 T 림프구, 억제제 T 림프구, 킬러 T 림프구, IgM B 림프구, IgG B 림프구, IgA B 림프구, IgE B 림프구, 킬러 세포, 줄기세포 및 혈액 및 면역 시스템에 사용되는 원조세포 (다양한 유형)가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

m) 감각 변환 세포

감각 변환 세포로는 눈의 광수용체 막대 세포, 눈의 광수용체 푸른색-민감 원추 세포, 눈의 광수용체 녹색-민감성 원추 세포, 눈의 광수용체 적색-민감성 원추 세포, 코르티 기관의 청각 내부 모세포, 코르티 기관의 청각 외부 모세포, 귀의 전실 기관의 타입 I 모세포 (가속 및 중력), 귀의 전실 기관의 타입 II 모세포 (가속 및 중력), 타입 I 미각 돌기 세포, 후각 뉴런, 후각 상피의 기저 세포 (후각 뉴런에 대한 줄기세포), 타입 I 경동맥 체세포 (혈액 pH 센서), 타입 II 경동맥 체세포 (혈액 pH 센서), 표피의 마르켈 세포 (접촉 센서), 접촉-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 저온-민감성 일차 감각 뉴런, 열-민감성 일차 감각 뉴런, 통증-민감성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형), 및 자기 수용성 일차 감각 뉴런 (다양한 유형)이 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

n) 자동 뉴런 세포

자동 뉴런 세포로는 콜린성 신경세포 (다양한 유형), 아드레날린성 신경세포 (다양한 유형), 및 펩티드성 신경세포 (다양한 유형)가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

o) 감각 기관 및 말초 신경 지지 세포

감각 기관 및 말초 신경 지지세포로는 코르티 기관의 내부 기둥 세포, 코르티 기관의 외부 기둥 세포, 코르티 기관의 내부 지골 세포, 코르티 기관의 외부 지골 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 헨센 세포, 전실 기관 지지세포, 타입 I 미각 돌기 지지세포, 후각 상피 지지세포, 슈반 세포, 방사상 세포 (말초 신경세포체를 캡슐화함), 및 장의 신경교세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

p) 중추신경계 뉴런 및 신경교 세포

중추신경계 뉴런 및 신경교 세포로는 뉴런 세포 (대다수의 유형, 여전히 분류는 빈약하다), 성상 신경교 세포 (다양한 유형), 및 올리고덴드로사이트 신경교 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

q) 렌즈 세포

렌즈 세포로는 전방 렌즈 상피 세포, 및 결정-포함 렌즈 섬유 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

r) 색소 세포

색소 세포로는 멜라노사이트와 망막의 색소 침착된 상피 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

s) 생식 세포

생식 세포로는 난원세포/난모세포, 정모세포, 및 정원세포 (정모세포에 대한 줄기세포)가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

t) 영양 세포

영양 세포로는 난소의 난포 세포, 세르톨리(sertoli) 세포 (고환에서), 및 흉선 상피 세포가 있다. 또한 본원에 개시된 어떠한 줄기세포와 세포들의 전구 세포, 및 그것들이 유래하는 세포들도 포함된다.

6. 조성물 및 방법에 대한 특성확인 및 기법

a) 서열 유사성

본원에서는 용어 상동성과 동일성이 유사성과 동일하게 사용되는 것으로 논의되는 것이 인지된다. 그러므로 예를 들어 상동성이라는 단어가 2개의 비-천연 서열에 대해 사용된다면, 그것은 본질적으로는 이 2개의 서열 사이에 진화적으로 관계가 있음을 나타내는 것은 아니지만, 그것들의 핵산 서열 사이의 유사성 또는 관계성을 보는 것이다. 2개의 진화적으로 관련된 분자 사이의 상동성을 결정하기 위한 많은 방법들이, 그것들이 진화적으로 관련되어 있거나 그렇지 않거나 간에 서열 유사성을 측정할 목적으로 어떠한 둘 또는 그 이상의 핵산에 관례적으로 적용된다.

일반적으로 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 어떠한 공지된 변이체와 그것들이 발생할 수 있는 유도체 또는 변이체를 규정하기 위한 한 가지 방법은, 특정한 공지 서열에 대해 상동성의 관점에서 변이체 및 유도체를 규정하는 것이다. 본원에 개시된 이런 특정 서열의 정체 또한 본원에 다른 곳에서도 논의된다. 일반적으로 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 변이체는 전형적으로 표준 서열 또는 천연 서열에 대하여 최소한 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 상동성을 갖는다. 당업자는 2개의 단백질 또는 핵산, 예컨대 유전자의 상동성을 측정하는 방법을 쉽게 알게 된다. 예를 들어 상동성은 두 개의 서열을 배열한 후 상동성을 가장 높은 수준에서 계산할 수 있다.

상동성을 계산하는 또 하나의 방법은 공개된 연산법에 의해 수행될 수 있다. 비교하기 위한 서열의 최적 배열은 스미스와 워터맨의 국소 상동성 연산법에 의해 (Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), 니들만과 분쉬의 상동성 배열 연산법에 의해 (Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)), 피어슨과 리프만의 유사성 탐구방법에 의해 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)), 이들 연산법의 전산화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 정밀 조사에 의해 수행될 수 있다.

핵산에 대한 동일 유형의 상동성은 예를 들면 문헌에 소개된 연산법에 의해 얻어질 수 있다 (Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol . 183:281-306, 1989). 어떤 방법이든지 전형적으로 사용될 수 있고, 어떤 경우에는 이들 다양한 방법의 결과가 다를 수 있지만, 숙련된 당업자는 이들 방법 중 최소한 하나에서 동일성이 발견된다면 그 서열은 진술된 동일성을 가진다고 말할 수 있고, 따라서 본원에 개시된다는 것을 이해할 것이다.

예를 들어 본원에서 사용되는 바와 같이, 다른 서열에 대해 특정 %의 상동성을 가지는 것으로 인용된 서열은 상기에서 설명된 계산 방법 중 어떠한 하나 또는 그 이상의 방법에 의해 계산되는 바, 인용된 상동성을 가지는 서열이라고 언급된다. 예를 들어 만약 주커 계산 방법을 사용하여 두 번째 서열에 대해 80%의 상동성을 가지는 것으로 계산되었다면, 첫 번째 서열이 다른 계산 방법들 중 어떤 것에 의해 계산된 대로라면 두 번째 서열에 대해 80%의 상동성을 갖지 않는다 하더라도, 첫 번째 서열은 본원에서 규정되는 대로 두 번째 서열에 대해 80%의 상동성을 가진다. 다른 예로서, 첫 번째 서열이 주커 계산 방법과 피어슨 및 리프만 계산 방법 두 가지를 사용하여 두 번째 서열에 대해 80%의 상동성ㅇㄹ 가지는 것으로 계산된다면, 첫 번째 서열이 스미스와 워터만 방법, 니들만과 분쉬의 계산 방법, 재거 계산 방법, 또는 다른 방법들 중 어떠한 것에 의해 계산된 바에 따르면 80%의 상동성을 갖지 않는다 하더라도, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대해 본원에 규정되는 바와 같이 80%의 상동성을 갖는다. 또 다른 예로서, 첫 번째 서열이 계산 방법 각각을 사용하여 두 번째 서열에 대해 80%의 상동성을 갖는다면 (실제로 상이한 계산 방법에서 상이한 상동성 백분율이 계산되기도 하겠지만) 두 번째 서열에 대하여 본원에 규정된 바와 같이 80%의 상동성을 갖는다.

b) 혼성화 /선택적 혼성화

혼성화라는 용어는 전형적으로 적어도 2개의 핵산 분자, 예컨대 프라이머 또는 프로브(probe) 및 유전자 사이에 서열 구동 상호작용을 의미한다. 서열 구동 상호작용은 2개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체 사이에서 뉴클레오티드 특이적 방식으로 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들어 C와 G가 상호작용하거나 또는 T와 A가 상호작용하는 것은 서열 구동 상호작용이다. 전형적으로 서열 구동 상호작용은 뉴클레오티드의 왓슨-크릭 면에서 또는 후그스틴 면에서 일어난다. 2개의 핵산의 혼성화는 당업자에 공지되어 있는 많은 조건 및 변수에 영향을 받는다. 예를 들어 염 농도, pH, 및 반응 온도는 모두 2개의 핵산 분자가 혼성화할 것인지의 여부에 영향을 미친다.

2개의 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화에 대한 변수는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 선택적 혼성화 조선은 엄격한 혼성화 조건으로서 규정될 수 있다. 예컨대 혼성화의 엄격성은 혼성화 및 세척 단계 중 어느 하나 또는 둘 다의 온도 및 염 농도에 의해 조절된다. 예를 들어 선택적 혼성화를 이루기 위한 혼성화의 조건은 Tm보다 약 12-25℃ 낮은 고온에서 높은 이온 강도 용액 (6X SSC 또는 6X SSPE)중에서의 혼성화와, 이어서 Tm보다 약 5℃ 내지 20℃ 낮은 세척 온도가 되도록 온도와 선택된 염 농도를 조합하여 세척하는 것을 포함할 수 있다. 온도 및 염농도는 필터 상에 고정된 참조 DNA의 샘플이 관심의 표지된 핵산에 혼성화된 후 엄격성이 상이한 조건하에서 세척되는 예비실험에서 실험적으로 쉽게 측정된다. 혼성화 온도는 전형적으로 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화의 경우 더 높다. 엄격성을 이루기 위해 사용될 수 있는 조건은 상기에서 설명된 것과 같거나 당업계에 공지되어 있는 것과 같다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Kunkel et al. Method Enzymol. 1987:154:367, 1987). DNA:DNA 혼성화에 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 6X SSC 또는 6X SSPE에서 약 68℃ (수용액에서)와, 이어서 68℃에서의 세척일 수 있다. 필요하다면 혼성화 및 세척의 엄격성은 원하는 상보성 정도가 감소됨에 따라, 그리고 가변성이 요구되는 경우에는 어떠한 영역의 G-C 또는 A-T 풍부성에 따라 감소될 수 있다. 마찬가지로 혼성화 및 세척의 엄격성은 필요하다면 원하는 상동성이 증가함에 따라, 그리고 고도의 상동성이 요구되는 경우 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 어떠한 영역이든지 G-C 또는 A-T 풍부함에 따라 증가할 수 있다.

선택적 혼성화를 규정하는 또 다른 방법은 다른 핵산에 결합된 한 핵산의 양 (백분율)을 살펴보는 것이다. 예를 들어 제한 핵산의 최소한 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%가 비-제한 핵산에 결합될 때 선택적 혼성화 상태일 수 있다. 전형적으로 비-제한 프라이머의 양은 예컨대 10 또는 100 또는 1000배 과잉이다. 이 유형의 분석법은 제한 및 비-제한 프라이머가 예컨대 그것들의 k_d보다 10배 또는 100배 또는 1000배 이하이거나 또는 핵산 분자 중 하나만이 10배 또는 100배 또는 1000배이거나 또는 하나 또는 둘 다의 핵산 분자가 그것들이 k_d보다 위의 값일 때 수행될 수 있다.

선택적인 혼성화를 규정하기 위한 다른 방법은 원하는 효소적 조작을 촉진하기 위해 혼성화가 필요한 조건하에서 효소적으로 조작되는 프라이머의 백분율을 살펴보는 것이다. 예를 들어 선택적 혼성화 조건은 프라이머의 최소한 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%가 효소적 조작을 촉진하는 조건하에서 효소적으로 조작될 때, 예를 들어 효소적 조작이 DNA 연장이라면 선택적 혼성화 조건은 최소한 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 프라이머 분자가 연장될 때일 수 있다.

상동성과 같이, 두 개의 핵산 분자 사이의 혼성화 조건을 측정하기 위해 본원에는 다양한 방법이 개시된다는 것이 인지된다. 이들 방법 및 조건은 두 핵산 분자 사이에 상이한 백분율의 혼성화를 제공할 수 있지만, 다른 언급이 없는 한 어떤 방법이든지 변수를 충분히 만족시킬 수 있을 것이다. 예를 들어 80% 혼성화가 필요하고 이들 방법 중 어느 것에서든지 요구되는 변수 내에서 혼성화가 일어나는 한, 그 방법은 본원에 포함되는 것으로 간주된다.

당업자는 조성물 또는 방법이 혼성화를 측정하기 위한 이들 기준 중 어느 것이든지 포괄적으로 또는 단독으로 충족한다면 그것은 본원에 개시된 조성물 또는 방법이라는 것을 인지할 것이다.

c) 핵산

예컨대 Ras, 및 그 안에 개시된 어떠한 다른 단백질뿐만 아니라 다양한 기능성 핵산을 코드화하는 핵산을 포함한, 핵산 기초의 다양한 분자가 본원에서 개시된다. 개시된 핵산은 예를 들면 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체로 구성된다. 이들 및 다른 분자의 비-제한 예는 본원에서 논의된다. 예를 들어 벡터가 세포에서 발현될 때 그 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G, 및 U로 구성될 것임이 자명하다. 마찬가지로, 만약에 예를 들어 안티센스 분자가 예컨대 외인성 전달을 통해 세포 또는 세포 환경에 도입된다면 안티센스 분자가 세포 환경에서의 안티센스 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오티드 유사체로 구성되는 것이 유익하다는 것이 자명하다.

(1) 뉴클레오티드 및 관련 분자

뉴클레오티드는 염기성 부분, 당 부분 및 포스페이트 부분을 포함하는 분자이다. 뉴클레오티드는 뉴크레오티드간 결합을 주도하는 당 부분과 포스페이트 부분을 통해 함께 결합될 수 있다. 뉴클레오티드의 염기 부분은 아데닌-9-일(A), 시토신-1-일(C), 구아닌-9-일(G), 우라실-1-일(U), 및 티민-1-일(T)이다. 뉴클레오티드의 당 부분은 리보스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오티드의 포스페이트 부분은 5가의 포스페이트이다. 뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 3'-AMP (3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP(5'-구아노신 모노포스페이트)이다.

뉴클레오티드 유사체는 염기, 당, 또는 포스페이트 부분 중 어느 것에 특정 유형의 변형이 일어난 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드에 대한 변형은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 및 2-아미노아데닌 및 당 또는 포스페이트 부분에서의 변형을 예로 들 수 있다.

뉴클레오티드 치환체는 뉴클레오티드와 유사한 기능적 특성을 갖지만, 포스페이트 부분을 포함하지 않는 분자, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA)이다. 뉴클레오티드 치환체는 왓슨-크릭 또는 후그스틴 방식으로 핵산을 인지하지만 포스페이트 부분 이외의 부분을 통하여 함께 결합된 분자이다. 뉴클레오티드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선형 구조를 이룰 수 있다.

또한 다른 유형의 분자 (콘쥬게이트)가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합되어 예컨대 세포 흡수를 증대시킬 수 있다. 콘쥬게이트는 화학적으로 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합될 수 있다. 그런 콘쥬게이트는 콜레스테롤 부분과 같은 지질 부분을 포함하며, 그것에 한정되지는 않는다 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553-6556).

왓슨-크릭 상호작용은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 면과의 최소한 하나의 상호작용이다. 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 면은 퓨린 염기 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N1, 및 C6 위치와, 피리미딘 염기 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N3, 및 C4 위치를 포함한다.

후그스틴 상호작용은 이중 DNA의 주요 홈에 노출된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 후그스틴 면에서 일어나는 상호작용이다. 후그스틴 면은 N7 위치를 포함하고 퓨린 뉴클레오티드의 C6 위치에 있는 반응기 (NH2 또는 O)를 포함한다.

(2) 서열

예컨대 Ras와, 유전자은행 (Genebank)에 개시되어 있고 본원에 개시되어 있는 어떠한 다른 단백질에 관련된 서열은 다양하고, 이들 서열 및 다른 서열들은 전체 서열뿐만 아니라 개별적인 서열이 참조로 포함된다.

다양한 서열이 본원에 제공되고, 이들 및 다른 서열들은 유전자은행 (www.pubmed.gov.)에서 찾아볼 수 있다. 당업자는 서열 불일치 및 차이를 해석하는 방법과 특정 서열에 대한 조성물과 방법을 다른 관련 서열에 대해 조정하는 방법을 알고 있다. 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 개시된 정보에 제시되고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 서열에 대해서도 디자인될 수 있다.

(3) 프라이머 및 프로브

본원에는 본원에 개시된 유전자와 상호작용할 수 있는 프라이머와 프로브를 포함하는 조성물이 개시된다. 프라이머는 DNA 증폭 반응을 지지하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 프라이머는 서열 특이적 방식으로 연장될 수 있을 것이다. 서열 특이적 방식으로 프라이머가 연장되는 것은 프라이머가 혼성화하거나 그렇지 않으면 결합하는 핵산 분자의 서열 및/또는 조성은 프라이머의 연장에 의해 생성된 생성물의 서열 또는 조성을 지시하거나 영향을 미친다. 그러므로 서열 특이적 방식으로 프라이머의 연장은, 그것에 한정되는 것은 아니지만 PCR, DNA 서열화, DNA 연장, DNA 중합반응, RNA 전사, 또는 역전사를 포함한다. 프라이머를 서열 특이적 방식으로 증폭하는 기법 및 조건이 바람직하다. 프라이머는 DNA 증폭반응, 예컨대 PCR 또는 직접 서열화에 대해 사용될 수 있다. 프라이머는 또한 예를 들면 프라이머를 연장하기 위해 사용된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 서열 특이적인 방식으로 프라이머를 연장하기 위해 화학적으로 반응할 수 있도록 변형되는 비-효소적 기법을 사용하여 연장될 수 있다. 전형적으로 개시된 프라이머는 핵산 또는 핵산의 영역과 혼성화하거나 핵산 상보물 또는 핵산 영역의 상보물과 혼성화한다.

(4) 기능성 핵산

기능성 핵산은 특이한 기능을 가지는, 예컨대 표적 분자와 결합하거나 특이한 반응을 촉매하는 핵산 분자이다. 기능성 핵산 분자는 다음 범주로 나누어질 수 있는데, 그것들에 제한되는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어 기능성 핵산으로는 안티센스 분자, 압타머(aptamer), 리보자임, 삼중나선 형성 분자, RNAi, 및 외부 안내 서열이 있다. 기능성 핵산 분자는 어펙터(affector), 억제제, 조절제, 및 표적 분자가 소유한 특이한 활성의 자극제로서 작용할 수 있고, 또는 기능성 핵산 분자는 다른 어떠한 분자와 무관하게 생체 내 활성을 가질 수 있다.

기능성 핵산 분자는 어떠한 거대분자, 예컨대 DNA, RNA, 폴리펩티드, 또는 탄수화물 사슬과 상호작용할 수 있다. 그러므로 기능성 핵산은 Ras의 mRNA 또는 Ras의 게놈 DNA와 상호작용할 수 있거나 또는 폴리펩티드 Ras와 상호작용할 수 있다. 때로 기능성 핵산이 표적 분자와 기능성 핵산 분자 사이의 서열 상동성을 토대로 다른 핵산과 상호작용하도록 디자인된다. 다른 상황에서, 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특이한 인식은 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성을 토대로 하지 않으며, 오히려 특이한 인식이 일어나는 것을 가능하게 하는 삼차 구조의 형성을 토대로 한다.

안티센스 분자는 규범적이거나 비-규범적인 염기 짝짓기를 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 디자인된다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은 예를 들면 RNAesH 중재된 RNA-DNA 혼성체 분해를 통하여 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 디자인된다. 또는 달리 안티센스 분자는 정상적으로는 표적 분자 상에서 발생할 프로세싱 기능, 예컨대 전사 또는 복제를 방해하도록 디자인될 수 있다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열을 토대로 디자인될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근이 쉬운 영역을 찾음으로써 안티센스 효능을 최적화하기 위한 수많은 방법들이 존재한다. 예시적인 방법은 시험관 내 선택 실험과 DMS와 DEPC를 사용하는 DNA 변형 연구일 것이다. 안티센스 분자는 10^-6, 10^-8, ,10^-10 또는 10^-12보다 작거나 같은 해리 상수 (k_d)로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 안티센스 분자의 디자인 및 사용에 도움이 되는 방법 및 기법의 대표적 예는 다음의 비-제한적인 미국 특허 목록에서 찾아볼 수 있다: 5,135,917호, 5,294,533호, 5,627,158호, 5,641,754호, 5,691,317호, 5,780,607호, 5,786,138호, 5,849,903호, 5,856,103호, 5,919,772호, 5,955,590호, 5,990,088호, 5,994,320호, 5,998,602호, 6,005,095호, 6,007,995호, 6,013,522호, 6,017,898호, 6,018,042호, 6,025,198호, 6,033,910호, 6,040,296호, 6,046,004호, 6,046,319호, 및 6,057,437호.

압타머(aptamer)는 표적 분자와, 바람직하게는 특이한 방식으로 상호작용하는 분자이다. 전형적으로 압타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 줄기-고리 또는 G-4분체로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산이다. 압타머는 작은 분자, 예컨대 ATP (미국 특허 5,631,146호) 및 테오필린 (미국 특허 5,580,737호)뿐만 아니라, 큰 분자, 예컨대 역전사효소 (미국 XRGJ 5,786,462호) 및 트롬빈 (미국 특허 5,543,293호)과 결합할 수 있다. 압타머는 10^-12M보다 적은 표적 분자로부터의 k_d로 매우 빈틈없이 결합할 수 있다. 압타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12보다 적은 k_d로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 압타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 예를 들어 표적 분자와 분자 상의 단지 한 위치에서만 상이한 다른 분자 사이의 결합 친화력이 10000배 더 큰 압타머가 분리되었다 (미국 특허 제 5,543,293호). 압타머는 바탕 결합 분자와의 kd보다 최소한 10, 100, 1000, 10,000, 또는 100,000배 더 낮은 표적 분자와의 kd를 가지는 것이 바람직하다. 예를 들어 폴리펩티드에 대해 비교할 때 바탕 분자가 상이한 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 예를 들어, Ras 압타머의 특이성을 측정할 때 바탕 단백질은 혈청 알부민일 수 있다. 다양한 상이한 표적 분자와 결합하기 위해 압타머를 제조하고 사용하는 방법에 대한 대표적인 예는 다음의 비-제한적인 미국 특허 목록에서 찾아볼 수 있다: 5,476,766호, 5,503,978호, 5,631,146호, 5,731,424호, 5,780,228호, 5,792,613호, 5,795,721호, 5,846,713호, 5,858,660호, 5,861,254호, 5,864,026호, 5,869,641호, 5,958,691호, 6,001,988호, 6,011,020호, 6,013,443호, 6,020,130호, 6,028,186호, 6,030,776호, 및 6,051,698호.

리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 그러므로 리보자임은 촉매성 핵산이다. 리보자임은 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한, 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형이 많이 있다. 예를 들면 햄머헤드 리보자임 (예컨대 그것에 한정되지는 않지만, 다음의 미국 특허: 5,334,711호, 5,436,330호, 5,616,466호, 5,633,133호, 5,646,020호, 5,652,094호, 5,712,384호, 5,770,715호, 5,856,463호, 5,861,288호, 5,891,683호, 5,891,684호, 5,985,621호, 5,989,908호, 5,998,193호, 5,998,203호, Ludwig and Sproat의 WO 9858058, WO 9858057, 및 WO 9718312), 헤어핀 리보자임 (예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만, 미국 특허 5,631,115호, 5,646,031호, 5,683,902호, 5,712,384호, 5,856,188호, 5,866,701호, 5,869,339호, 및 6,022,962호), 및 테트라히메나 리보자임 (예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만 미국 특허 5,595,873호 및 5,652,107호)이 있다. 또한 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임이 많다 (예를 들어 그것에 한정되는 것은 아니지만 미국 특허 5,580,967호, 5,688,670호, 5,807,718호 및 5,910,408호). 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하며, 더 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단한다. 이 인식은 때로 대부분이 규범적인 또는 비-규범적인 염기쌍 상호작용을 토대로 한다. 이런 특성은 리보자임이 특히 핵산의 표적 특이적 절단에 대한 좋은 후보가 되게 하는데, 왜냐하면 표적 기질의 인식은 표적 기질 서열을 토대로 하기 때문이다. 다양한 상이한 반응을 촉매하기 위해 리보자임을 제조하고 사용하는 방법에 대한 대표적인 예는, 그것들에 한정되지 않지만 미국 특허 5,646,042호, 5,693,535호, 5,731,295호, 5,811,300호, 5,837,855호, 5,869,253호, 5,877,021호, 5,877,022호, 5,972,699호, 5,972,704호, 5,989,906호, 및 6,017,756호에서 찾아볼 수 있다.

삼중 나선 형성 기능성 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가작 핵산 중 어느것과도 상호작용할 수 있는 분자이다. 삼중나선 분자가 표적 영역과 반응할때, 삼중나선으로 불리는 구조가 형성되며, 이때에 왓슨-크릭 및 후그스틴 염기-쌍에 따라 좌우되는 복합체를 형성하는 세 가닥의 DNA가 존재한다. 삼중나선 분자는 그것들이 표적 영역과 높은 친화력 및 특이성으로 결합할 수 있기 때문에 바람직하다. 삼중나선 형성 분자는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12보다 작은 k_d값으로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 다양한 상이한 표적 분자에 결합하기 위해 삼중나선 형성 분자를 제조하고 사용하는 방법에 대한 대표적인 예는, 그것들에 한정되지 않지만 미국 특허 5,176,996호, 5,645,985호, 5,650,316호, 5,683,874호, 5,693,773호, 5,834,185호, 5,869,246호, 5,874,566호, 및 5,962,426호에서 찾아볼 수 있다.

외부 가이드 서열 (EGS)은 표적 핵산 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 분자로, 이 복합체는 표적 분자를 절단하는 RNase P에 의해 인지된다. EGS는 선택된 RNA 분자를 특이적으로 표적화하기 위해 디자인될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 트랜스퍼 RNA (tRNA)를 프로세싱하는 것을 보조한다. 박테리아의 RNAse P는 표적 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하는 것을 유발하는 EGS를 사용함으로써 실제로 어떤 RNA 서열이든지 절단하도록 보완될 수 있다 (WO 92/03566 by Yale, and Forster and Altaian, Science 238:407-409 (1990)).

유사하게, 진핵세포의 EGS/RNAse P-특정된 RNA 절단은 진핵 세포 내에 있는 원하는 표적을 절단하기 위해 활용될 수 있다 (Yuan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1992); WO 93/22434 by Yale; WO 95/24489 by Yale; Yuan and Altman, EMBO J 14:159-168 (1995), and Carrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)). 다양하고 상이한 표적 분자의 절단을 용이하게 하기 위해 EGS 분자를 제조하고 사용하는 방법에 대한 대표적인 예는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 미국 특허 5,168,053호, 5,624,824호, 5,683,873호, 5,728,521호, 5,869,248호, 및 5,877,162호에서 찾아볼 수 있다.

또한 개시된 핵산은 RNAi 또는 RNA 간섭에 대해 사용될 수 있다는 것이 자명하다. RNAi는 RNA 간섭(RNAi)에 대해 2-단계 메커니즘, 즉 개시 단계와 이펙터 단계를 포함하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 첫 번째 단계에서, 유입되는 이중 가닥 (ds) RNA (siRNA)는 작은 단편, 예컨대 21-23-뉴클레오티드 '가이드 서열'로 프로세싱된다. RNA 증폭은 전체 동물에서 발생할 수 있는 것으로 여겨진다. 전형적으로 그렇다면 가이드 RNA는 RNA를 분해할 수 있는 단백질 RNA 복합체, RNA-유래 침묵 복합체 (RISC)로 불리는 뉴클레아제 복합체에 통합될 수 있다. 이 RISC 복합체는 두 번째 이펙터 단계에서 염기-쌍 상호작용을 통하여 가이드 RNA에 의해 인지되는 mRNA를 파괴하는 작용을 한다. RNAi는 표적 RNA의 분해를 유발하는 사건을 야기하는 세포에 이중 가닥 RNA를 어떠한 수단에 의해서든 도입하는 것을 포함한다. RNAi는 후-전사 유전자 침묵의 형태이다. 개시된 것은 RNAi에서 작용할 수 있는 RNA 헤어핀이다. RNAi 분자를 제조하고 사용하는 것에 대한 설명은 문헌을 참조한다 ( Hammond et al., Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001); Sharp, Genes Dev 15: 485-490 (2001), Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23): 13959-13964 (1998)).

RNAi는 포유류 세포를 포함하여 많은 세포에서 작용하는 것으로 나타났다. 포유류 세포에서의 작용을 위해서는 RISC 복합체 내에서 표적화 서열로서 사용될 RNA 분자는 더 짧은 것이 바람직하다. 예를 들어 50 또는 40 또는 30 또는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10 뉴클레오티드 길이보다 작거나 같다. 이들 RNA 분자는 또한 절단될 표적 RNA와 관련하여 3' 또는 5' 말단에 돌출부를 가질 수 있다. 이들 돌출부는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 뉴클레오티드 길이 또는 그것보다 짧을 수 있다. RNAiSMS 포유류 줄기세포, 예컨대 마우스 ES 세포에서 작용한다.

d) 세포에 대한 조성물의 전달

핵산을 시험관내에서 또는 생체내에서 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법은 많다. 이들 방법 및 조성물은 크게 바이러스 기초 전달 시스템과 비-바이러스 기초 전달 시스템의 두 부류로 나눌 수 있다. 예를 들어 핵산은 많은 직접적인 전달 시스템, 예컨대 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 칼슘 포스페이트 침전, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드를 통하여, 또는 세포 또는 담체, 예컨대 양이온성 리포좀에서 유전자 물질의 전달을 경유하여 전달될 수 있다. 바이러스 벡터, 화학적 형질전환제, 또는 일렉트로포레이션 및 DNA의 직접적인 확산과 같은 물리-기계적 방법을 포함한 트랜스펙션에 적절한 수단이 문헌에 소개되어 있다 (Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465- 1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)). 그런 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 쉽게 사용할 수 있다. 어떤 경우에 방법은 큰 DNA 분자를 사용하여 특이하게 기능하도록 변형될 것이다. 또한 이들 방법은 담체의 표적화 특징을 사용함으로써 특정 질병 및 TVH 집단을 표적화하는 데 사용될 수 있다.

(1) 핵산 기초 전달 시스템

전달 벡터는 유전자를 세포 (예컨대 플라스미드)에 전달하기 위해 사용된, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 방법의 일부로서, 예컨대 재조합 레트로바이러스 또는 아데오바이러스의 일부로서 사용된 어떠한 뉴클레오티드 구성물일 수 있다 (Ram eT al., Cancer Res. 53:83-88, (1993)).

본원에서 사용되는 바와 같이 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 개시된 핵산, 예컨대 Ras를 발현하는 핵산을 분해 없이 세포에 운반하고, 그것이 전달되는 세포에서 유전자의 발현을 초래하는 프로모터를 포함하는 제제이다. 벡터는 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 뉴로날 트로픽(neuronal trophic) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 및 HIV 골격을 가지는 이들 바이러스를 포함하여 다른 RNA 바이러스이다. 또한 벡터로서 사용하기에 적당하도록 만드는 이들 바이러스의 특성을 공유하는 어떠한 바이러스 패밀리도 바람직하다. 레트로바이러스는 쥐의 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스들이다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 유전자 물질, 즉 유전자도입 또는 마커 유전자를 운반할 수 있고, 이런 이유 때문에 흔히 사용되는 벡터이다. 그러나 그것들은 증식하지 않는 세포에서는 사용할 수 없다. 아데노바이러스 벡터는 상대적으로 안정하고 고역가로 작용하기 쉬우며, 에어로솔 형태로 전달될 수 있고, 분할하지 않는 세포를 형질전환할 수 있다. 수두 바이러스 벡터는 크고 유전자를 삽입할 수 있는 부위가 여러 개이며, 열적 안정성이 있고 실온에서 저장될 수 있다. 바이러스 항원에 의해 유래, 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하기 위하여 공학적으로 처리되는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이런 유형의 바람직한 벡터는 인터루킨 8 또는 10에 대한 코딩 영역을 포함할 것이다.

바이러스 벡터는 유전자를 세포 안에 도입하기 위한 화학적 또는 물리적 방법보다 더 높은 처리 능력 (유전자 도입 능력)을 가질 수 있다. 전형적으로 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사물, 복제 및 캡시드화에 필요한 전환된 말단 반복물, 및 바이러스 게놈의 전사와 복제를 제어하기 위한 프로모터를 포함한다. 벡터로서 공학조작될 때, 바이러스는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 초기 유전자가 제거되고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신 바이러스 게놈 안에 삽입된다. 이런 유형의 구성물은 약 8kb의 외래 유전자 물질을 포함할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필요한 기능은 전형적으로 초기 유전자의 트랜스 유전자 생성물을 발현하도록 공학제조된 셀 라인에 의해 공급된다.

(a) 레트로바이러스 벡터

레트로바이러스는 어떠한 타입, 아과, 속, 또는 향성(向性)을 포함하여 레트로바이러스의 바이러스과에 속하는 동물 바이러스이다. 레트로바이러스에 관한 일반적인 설명은 문헌을 참조한다 (Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer, In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp.229-232, Washington, (1985)). 유전자 치료법에 대하여 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법에 대한 예는 미국 특허 4,868,116호와 4,980,286호; PCT 출원 WO 90/02806 및 WO 89/07136; 및 문헌 (Mulligan, Science 260:926-932 (1993))에 기재되어 있다.

레트로바이러스는 본질적으로 그것을 핵산 카르고(cargo) 안으로 패킹하는 패키지이다. 핵산 카르고는 그것을 패키징 신호와 함께 운반하는데, 그것은 복제된 딸 분자가 패키지 코트 내에서 효과적으로 패킹되는 것을 보장한다. 패키지 신호 외에 복제를 위해서는 시스로 (in cis), 그리고 복제된 바이러스의 패키징에 필요한 많은 분자가 있다. 전형적으로 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트의 제조에 포함되는 gag, pol, 및 env 유전자를 포함한다. 표적 세포에 전달될 외래 DNA에 의해 전형적으로 대체되는 것은 바로 gag, pol 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 패키징 코트 안에 통합되기 위한 패키징 신호, gag 전사 유닛의 출발을 신호하는 서열, 역전사의 tRNA 프라이머에 결합하기 위한 프라이머 결합 부위를 포함하여 역전사에 필요한 요소, DNA가 합성되는 동안 RNA 가닥의 전환을 안내하는 말단 반복 서열, DNA 합성의 두 번째 가닥을 합성하기 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 퓨린 풍부 서열 5'에서 3'LTR, 및 숙주 게놈에 레트로바이러스의 DNA 상태의 삽입물이 삽입되는 것을 가능하게 하는 LTR의 말단 가까이에 있는 특이한 서열을 포함한다. gag, pol, 및 env 유전자의 제거는 약 8kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 안으로 삽입되고, 역전사되어, 복제시 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지되는 것을 가능하게 한다. 이 양의 핵산이면 각 전사물의 크기에 따라 하나부터 다수의 유전자의 전달에 충분하다. 삽입물 안에 있는 다른 유전자와 함께 포지티브 또는 네거티브 선택가능한 마커를 포함하는 것이 바람직하다.

대부분의 레트로바이러스 벡터에서는 복제 기구 및 패키징 단백질이 제거되었기 때문에 (gag, pol, 및 env), 벡터는 전형적으로 그것을 패키징 셀라인 안에 놓음으로써 생성된다. 패키징 셀 라인은 복제 및 패키징 기구를 포함하지만 어떠한 패키징 신호는 결핍되어 있는 레트로바이러스로 형질전환된 셀 라인이다. 관심의 DNA를 은닉하고 있는 벡터가 이들 셀 라인에 형질전환되면, 헬퍼(helper) 세포에 의해 시스로 제공된 기구에 의해, 관심의 유전자를 포함하고 있는 벡터가 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지된다. 기구용 게놈은 필요한 신호가 없기 때문에 패키지되지 않는다.

(b) 아데노바이러스 벡터

복제-결함 아데노바이러스의 제조는 문헌에 설명되어 있다 (Berkner et al, J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)). 이들 바이러스를 벡터로서 사용하는 것의 장점은 그것들이 다른 세포 유형으로 확산될 수 있는 정도로만 제한된다는 것인데, 왜냐하면 그것들은 초기 감염된 세포 내에서는 복제할 수 있지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수는 없기 때문이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 내 상피, 간세포, 혈관 상피, CNS 연조직 및 많은 다른 조직 부위로의 직접적인 생체내 전달 후에 고도로 효과적으로 유전자를 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 특수한 세포 표면 수용체에 결합함으로써 유전자 전환을 이루고, 그런 후에 바이러스는 수용체-중재 세포 이물흡수(endocytosis)에 의해, 야생형 또는 복제-결함 아데노바이러스와 동일한 방식으로 내부화된다 (Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., MoI. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).

바이러스 벡터는 E1유전자가 제거되어 있는 아데노바이러스를 토대로 한 것일 수 있고, 이들 비리온은 인간 293 셀 라인과 같은 셀 라인에서 생성된다. E1과 E3는 모드 아데노바이러스 게놈으로부터 제거될 수 있다.

(c) 아데노 -관련 바이러스 벡터

다른 유형의 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 토대로 한다. 이 결함성 파보바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고 인간에게서는 발병시키기 않기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5kb를 운반할 수 있고 야생형 AAV는 염색체 19 안으로 안정하게 삽입되는 것으로 알려져 있다. 이 부위 특이적 통합 특성을 포함하는 벡터가 바람직하다. 이 유형의 벡터의 유용한 형태는 Avigen, San Francisco(CA)에서 제조된 P4.1 C 벡터인데, 그것은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자, HSV-tk, 및/또는 마커 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질 GFP를 코드화하는 유전자를 포함할 수 있다.

다른 유형의 AAV바이러스에서, AAV는 양 옆에 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된 세포-특이적 발현을 지시하는 프로모터를 포함하는 최소한 하나의 카세트가 붙어있는 한 쌍의 전환된 말단 반복 (ITR)을 포함한다. 이 개념에서 이종성은 AAV 또는 B19 파보바이러스에 천연적이지 않은 어떠한 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 말한다.

전형적으로 AAV및 B19 코딩 영역은 결실되어서 그 결과 안전하고 비-세포독성인 벡터가 생성된다. AAV ITR, 또는 그것의 변형은 전염성 및 부위-특이적 통합을 부여하지만 세포독성은 부여하지 않으며, 프로모터는 세포-특이적 발현을 지시한다. (미국 특허 6,261,834호 참조).

그러므로 개시된 벡터는 실질적인 독성 없이 포유류 염색체에 통합할 수 있는 DNA 분자를 제공한다.

바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 인핸서를 포함하여 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 돕는다. 프로모터는 일반적으로 전사 출발 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소의 기본적 상호작용에 필요한 코어 요소 및 전사 인자를 포함하고, 상류 요소 및 반응 요소를 포함할 수 있다.

(d) 고부하 바이러스 벡터

큰 인간 포진 바이러스를 사용한 분자 유전학 실험은 커다란 이종성 DNA 단편을 포진 바이러스로 감염될 수 있는 세포에서 클론하고, 증식하며, 수립하는 방법을 제공하였다 (Sun et al., Nature genetics 8:33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin MoI Ther 5:633-644, 1999). 이들 커다란 DNA 바이러스 (단순 포진 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바르 바이러스 (EBV))는 150kb보다 큰 인간 이종성 DNA 단편을 특정 세포에 전달할 수 있는 가능성이 있다. EBV 재조합체는 감염된 B-세포에서 큰 조각의 DNA를 에피솜성 DNA로서 유지할 수 있다. 개별적인 클론은 유전적으로 안정한 330kb 까지의 인간 게놈 삽입물을 운반한다. 이들 에피솜의 유지는 EBV로 감염되는 중에 구성적으로 발현된 특이한 EBV 핵단백질, EBNA1을 필요로 한다. 또한 이들 벡터는 형질전환에 사용될 수 있는데, 그때 다량의 단백질이 시험관 내에서 일시적으로 생성될 수 있다. 포진 바이러스 암플리콘 시스템은 또한 220kb보다 큰 DNA 조각을 패키지하고 DNA를 에피솜으로서 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 있다.

다른 유용한 시스템으로는 예를 들면 복제 및 숙주-제한 비-복제 백시니아 바이러스 벡터가 있다.

(2) 비-핵산 기초 시스템

개시된 조성물은 다양한 방법으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어 조성물은 일렉트로포레이션을 통해, 또는 리포펙션을 통해, 또는 칼슘 포스페이트 침전을 통해 전달될 수 있다. 선택된 전달 메커니즘은 부분적으로는 표적화된 세포의 유형과 예컨대 전달이 생체 내에서 또는 시험관 내에서 일어나는지의 여부에 좌우될 것이다.

그러므로 조성물은 개시된 벡터 외에 예를 들면 지질, 예컨대 리포솜, 예컨대 양이온성 리포솜 (예컨대 DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온성 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜은 필요에 따라 추가로 특정 세포를 표적화하는 것을 촉진하는 단백질을 포함할 수 있다. 화합물 및 양이온성 리포솜을 포함하는 조성물의 투여는 표적 기관에 대하여 구심성 혈관에 투여되거나 또는 호흡기관의 표적 세포에 대하여 호흡기관에 흡입될 수 있다. 리포솜에 대해서는 문헌을 참조할 수 있다 ( Brigham et al. Am . J. Resp . Cell . Mol . Biol . 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc . Natl . Acad . Sci USA 84:7413-7417 (1987), 미국 특허 4,897,355호). 나한천 배지 화합물은 특이한 세포 유형을 표적으로 할 수 있는 마이크로캡슐의 성분, 예컨대 대식세포로서 투여될 수 있고, 또는 마이크로캡슐로부터 화합물의 확산 또는 화합물의 전달 여부는 구체적인 속도 또는 용량에 대해 디자인된다.

외인성 DNA의 관심의 세포 안으로의 투여 및 흡수를 포함하는 상기 설명된 방법에서 (즉 유전자도입 또는 형질전환에서), 화합물의 세포로의 전달은 다양한 메커니즘을 통하여 이루어질 수 있다. 한 예로서, 전달은 시판중인 것을 활용할 수 있는 리포솜 제제, 예컨대 LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (QIAGEN, Inc.Hilden, Germany) 및 TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), 및 당업계의 표준 과정을 따라 개발된 다른 리포솜을 사용하여 리포솜을 경유할 수 있다. 또한 개시된 핵산 또는 벡터는 Genetronics, Inc. (San Diego, CA)로부터 활용할 수 있는 기법인 일렉트로포레이션에 의해, 및 SONOPORATION 기기 (ImaPx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)에 의해 생체 내로 전달될 수 있다.

물질은 용액, 현탁액 중에 존재할 수 있다 (예컨대 미소입자, 리포솜, 또는 세포에 통합되어). 이것들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통하여 특정 세포 유형에 대해 표적이 될 수 있다. 종양 조직에 대하여 특정 단백질을 표적화하기 위하여 이런 기법을 사용하는 것에 대한 실레는 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); and Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). 이들 기법은 다양한 다른 특이한 세포 유형에 대해서도 사용될 수 있다. 예를 들면 "스텔스(stealth)"와 같은 소포 및 다른 항체 결합된 리포솜 (콜로니 암종에 대한 지질 중재 약물 표적화를 포함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 중재된 표적화, 림프구 특정 종양 표적화, 및 쥐의 신경교 세포의 고도로 특이한 생체 내 치료용 레트로바이러스 표적화. 이런 기법을 종양 조직에 특이적인 단백질을 표적화하기 위하여 사용하는 것에 대한 예는 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로 수용체는 세포 이물 흡수 경로에 구성적으로 포함되거나 리간드 유래다. 이들 수용체는 클라트린-코팅 피트에 모이게 되고, 클라트린-코팅 소포를 경유하여 세포에 유입되며, 수용체가 분류되는 곳인 산성화된 엔도솜을 통과한 후, 세포 표면으로 재순환하여 세포내에 저장되거나 라이소자임에서 분해된다. 내부화 경로는 다양한 기능, 예컨대 영양 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 정화, 면역체계가 약해졌을 때 바이러스와 독소의 유입, 리간드의 분리 및 분해, 및 수용체-수준 조절을 수행한다. 많은 수용체가 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 값(valency), 및 리간드 농도에 따라 하나 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-중재 세포 이물 흡수의 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 이미 검토되었다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

숙주 세포 게놈에 통합될 세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 통합 서열을 포함한다. 이들 서열은 때로, 특히 바이러스 기초 시스템이 사용될 때 바이러스 관련 서열이다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 비-핵산 기초 전달 시스템, 예컨대 리포솜을 사용하여 전달될 핵산에 통합됨으로써 전달 시스템에 포함된 랙산이 숙주 게놈에 통합될 수 있다.

숙주 게놈에 통합하기 위한 다른 기법으로는 예를 들면 숙주 게놈과의 동종 재조합을 촉진하기 위해 디자인된 시스템을 들 수 있다. 이들 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이의 재조합이 일어나 숙주 게놈 안으로 전달된 핵산이 통합되는 것을 유발하는 숙주세포 게놈 내의 표적 서열과 충분한 상동성을 가지는, 발현될 핵산이 양 옆에 있는 서열에 의존한다. 이들 시스템 및 동종 재조합을 촉진하기 위해 필요한 방법은 당업자들에게 알려져 있다.

(3) 생체 내/생체 외

본원에서 설명되는 바와 같이, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 담겨 투여될 수 있고, 표적 세포에 생체 내에서 및/또는 생체 외적으로 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘에 의해 전달될 수 있다 (예컨대 DNA 자체의 흡수, 리포솜 융합, 유전자 총을 경유한 DNA의 근육내 주사, 세포 이물 흡수 등).

만약 생체 외 방법이 사용된다면, 세포 또는 조직은 제거되고 당업계에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜을 따라 체 외에 유지된다. 조성물은 어떠한 유전자 전달 메커니즘, 예컨대 칼슘 포스페이트 중재 유전자 전달, 일렉트로포레이션, 미소주사 또는 프로테오리포솜을 경유하여 세포에 도입된다. 그런 다음 형질도입된 세포는 주입되거나 (예컨대 약제학적으로 허용되는 담체 중에) 또는 세포 또는 조직 유형에 대하여 표준 방법대로 피시험체 안에 다시 동위적으로 이식된다. 다양한 세포를 피험체 안에 이식 또는 주입하는 표준 방법들이 알려져 있다.

e) 펩티드

(1) 단백질 변이체

공지되어 있고 본원에서 고려되는 개시된 단백질의 변이체들이 많이 있다. 또한 공지된 기능성 스트레인 변이체 외에 개시된 방법 및 조성물에서 기능하는 단백질의 변이체들이 있다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자들에게 자명하며, 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 아미노산 서열 변형은 전형적으로 다음 세 가지 부류 중 하나 또는 그 이상에 속한다: 치환, 삽입 또는 결실 변이체. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합과 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상 아미노 또는 카르복실 말단 융합보다 작은 삽입, 예컨대 하나에서 4개의 잔기 정도일 것이다. 면역원성 항원 단백질 유도체, 예컨대 하기 실시예에서 설명되는 것들은 충분히 큰 폴리펩티드를, 시험관내에서의 교차 결합에 의해 또는 융합을 코드화하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해 면역원성을 부여하기 위하여 표적 서열에 융합시킴으로써 제조된다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 전형적으로 약 2 내지 6잔기 이하가 단백질 분자 내의 한 부위에서 결실된다. 이들 변이체는 통상 단백질을 코드화하는 DNA에서 뉴클레오티드의 부위 특이적 돌여변이생성이 일어나고, 그로써 변이체를 코드화하는 DNA를 생성한 후 재조합 세포 배양중에 DNA를 발현함으로써 제조된다. 공지 서열을 가지는 DNA의 예정된 부위에서 하위치환 돌연변이를 제조하는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이생성과 PCR 돌연변이생성이 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기로 일어나지만, 한꺼번에 상이한 많은 위치에서 일어날 수 있고; 삽입은 통상 약 1 내지 10 아미노산 잔기 수준에서 일어날 것이며; 결실은 약 1 내지 30 잔기의 범위일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍에서 일어나는데, 즉 2개의 잔기가 결실된다거나 2개의 잔기가 삽입된다. 치환, 결실, 삽입 또는 이것들의 어떠한 조합이든지 최종 구성물에 도달하기 위해서 조합될 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임 밖에 서열을 놓지 않아야 하며, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보 영역을 생성하지 않는 것이 좋다. 치환 변이체는 최소한 하나의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입되는 것이다. 그런 치환은 일반적으로 하기 표 1과 2를 따라 제조되며, 보존 치환으로 언급된다.

표 1: 아미노산 약어

아미노산	약어
알라닌	AlaA
알로소로이신	AIle
아르기닌	ArgR
아스파라긴	AsnN
아스파르트산	AspD
시스테인	CysC
글루탐산	GluE
글루타민	GlnK
글리신	GlyG
히스티딘	HisH
이소로이신	IleI
로이신	LeuL
라이신	LysK
페닐알라닌	PheF
프롤린	ProP
피로글루탐산	Glu
세린	SerS
트레오닌	ThrT
티로신	TyrY
트립토판	TrpW
발린	ValV

표 2: 아미노산 치환

보존 치환을 예시하는 원래의 잔기, 다른 치환은 당업계에 공지이다.
Ala	ser
Arg	lys, gln
Asn	gln, his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn, lys
Glu	asp
Gly	pro
His	asn, gln
Ile	leu, val
Leu	ile, val
Lys	arg, gln
Met	Leu, ile
Phe	met, leu, tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp, phe
Val	ile, leu

기능 및 면역학적 정체의 실질적인 변화는 표 2에 제시된 것들보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 예컨대 쉬트 또는 나선 형태로서 치환 영역의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 데 미치는 효과에서 더 유의할만하게 상이한 잔기를 선택함으로써 이루어진다. 일반적으로 단백질 특성에서 가장 큰 변화를 나타낼 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예컨대 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예컨대 로이실, 이소로이실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로 (또는 에 의해) 치환되는 것; (b) 시스테인 또는 프롤린이 어떠한 다른 잔기로 (또는 에 의해) 치환되는 것; (c) 양전기성 측쇄를 가지는 잔기, 예컨대 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전기성 잔기, 예컨대 글루타밀 또는 아스파르틸로 (또는 에 의해) 치환되는 것; 또는 (d) 부피가 큰 측쇄를 가지는 잔기, 예컨대 페닐알라닌이 측쇄를 가지지 않은 잔기, 예컨대 이 경우에는 글리신으로 (또는 에 의해) 치환되는 것, (e) 술페이션(sulfation) 및/또는 글리코실화에 대한 부위의 수를 증가시킨 치환일 것이다.

예를 들어 한 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 다른 것으로 치환하는 것은 당업자들에게 보존 치환으로 알려져 있다. 예를 들어 보존 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 바꾸는 것이다. 치환은 조합, 예컨대 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr을 포함한다. 뚜렷하게 개시된 각각의 서열의 그런 보존적으로 치환된 변이는 본원에 제공된 모자이크 폴리펩티드 내에 포함된다.

치환 또는 결실 돌연변이생성은 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)에 대한 부위를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 가변성 잔기의 결실도 바람직할 수 있다. 잠재적인 단백질 가수분해 부위, 예컨대 Arg의 결실 또는 치환은 예를 들면 염기성 잔기 중 하나를 결실하거나 글루타밀 또는 히스티딜 잔기에 의해 하나를 치환함으로써 이루어진다.

어떤 후-번역 유도체는 발현된 폴리펩티드에 대해 미치는 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 자주 번역 후에 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 탈아민화된다. 또는 달리 이들 잔기는 중간 정도의 산성 조건하에서 탈아민화될 수 있다. 다른 후-번역 변형으로는 프롤린과 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 어떤 경우에는 C-말단 카르복실의 아미드화가 있다.

본원에 개시된 단백질의 변이체 및 유도체를 규정하는 한 가지 방법은 특정 공지 서열에 대한 상동성/동일성의 관점에서 변이체 및 유도체를 규정하는 것을 통해서라는 것이 자명하다. 표시된 서열에 대하여 최소한 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95%의 상동성을 가지는 본원에 개시된 이들 및 다른 단백질의 변이체가 구체적으로 개시된다. 당업자들은 두 단백질의 상동성을 측정하는 방법을 쉽게 인지하고 있다. 예를 들어 상동성은 두 개의 서열을 상동성이 최고의 수준에 있도록 배열한 후 계산될 수 있다.

상동성을 계산하는 다른 방법은 공개된 연산법에 의해 수행될 수 있다. 비교하기 위한 서열의 최적 배열은 스미스와 워터맨의 국소 상동성 연산법에 의해 (Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), 니들만과 분쉬의 상동성 배열 연산법에 의해 (Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)), 피어슨과 리프만의 유사성 탐구방법에 의해 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)), 이들 연산법의 전산화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 정밀 조사에 의해 수행될 수 있다.

핵산에 대한 동일 유형의 상동성은 예를 들면 문헌에 소개된 연산법에 의해 얻어질 수 있다 (Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol . 183:281-306, 1989).

보존 돌연변이와 상동성의 설명은 어떠한 조합으로든 함께 조합될 수 있음이, 예컨대 변이체가 보존 돌연변이인 특정 서열에 대해 최소한 70% 상동성을 가지는 실시예가 인지된다.

본 명세서가 다양한 단백질 및 단백질 서열을 논의함에 따라 그런 단백질 서열을 코드화할 수 있는 핵산이 또한 개시된다는 것이 인지된다. 이것은 특이한 단백질 서열에 관련된 모든 축퇴성 서열, 즉 축퇴성 핵산을 포함하여, 단백질 서열의 개시된 변이체 및 유도체를 코드화하는 모든 핵산뿐만 아니라 하나의 특정 단백질 서열을 코드화하는 서열을 가지는 모든 핵산을 포함할 것이다. 그러므로 각 특정 핵산 서열이 본원에 기재될 수는 없지만, 각각의 및 모든 서열은 실제로 본원에 개시되며 개시된 단백질 서열을 통해 설명된다는 것이 자명하다. 또한 어떤 아미노산도 특정 DNA 서열이 유기체 내에 있는 단백질을 코드화하는 것을 나타내지는 않는 반면에, 개시된 단백질의 특정 변이체가 본원에 개시되는 경우, 단백질이 그것으로부터 발생하는 특정 세포에서 그 단백질을 코드화하는 공지된 핵산 서열이 또한 공지이고 본원에서 개시되며 설명된다는 것이 인지된다.

개시된 조성물에 통합될 수 있는 아미노산 및 펩티드 유사체가 많이 있다는 것이 인지된다. 예를 들어 표 1 및 2의 아미노산 외에도 수많은 D 아미노산 또는 상이한 기능성 치환체를 가지는 아미노산이 존재한다. 천연 발생 펩티드의 반대쪽 입체 이성질체뿐만 아니라 펩티드 유사체의 입체 이성질체가 개시된다. 이들 아미노산은 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 채우고, 예컨대 부위 특정 방식으로 펩티드 사슬에 유사 아미노산을 삽입시키기 위하여 앰버 코돈을 활용하는 유전자 구성물을 공학처리함으로써 폴리펩티드 사슬에 쉽게 통합될 수 있다 (Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)).

펩티드를 닮았지만 천연 펩티드 결합을 통하여 연결되지 않은 분자가 제조될 수 있다. 예를 들어 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 결합은 CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂--CH₂--, --CH=CH-- (시스 및 트란스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 및 --CHH₂SO--를 포함한다 (이들 및 다른 것들은 문헌에서 찾아볼 수 있다: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., lnt J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H₂-S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis and trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (-COCH₂-); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (-COCH₂-); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)CH₂-); and Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (-CH₂-S-)). 특히 바람직한 비-펩티드 결합은 --CH₂NH--이다. 펩티드 유사체는 결합 원자 사이에 하나 이상의 원자, 예컨대 b-알라닌, g-아미노부티르산 등을 가질 수 있다.

아미노산 유사체 및 유사체 및 펩티드 유사체는 때로 증강된 또는 바람직한 특성, 예컨대 더 경제적인 생성, 더 큰 화학적 안정성, 증강된 약리학적 특성 (반감기, 흡수, 효능, 효율 등), 변경된 특이성 (예컨대 광범위한 생물학적 활성), 감소된 항원성 등을 가진다.

D-아미노산은 더 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는데, 왜냐하명 D 아미노산이 펩티드 등에 의해 인지되지 않기 때문이다. 연속 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 동일 유형의 D-아미노산 (예컨대 L-라이신 대신에 D-라이신으로 체계적으로 치환하는 것은 더 안정한 펩티드를 셍성하는 데 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 둘 또는 그 이상의 펩티드를 함께 고리화하거나 부착하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 펩티드를 특정 형태로 억제하는 것이 유익할 수 있다 (Rizo and Gierasch, Arm. Rev. Biochem. 61:387 (1992)).

f) 약제학적 담체 /약제학적 생성물의 전달

위에서 설명한 바와 같이, 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체에 넣어 생체 내로 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 그렇지 않으면 바람직한 물질, 즉 어떠한 바람직하지 못한 생물학적 결과를 유발하거나 그것이 포함되어 있는 약제학적 조성물의 다른 성분들 중 어떠한 것과도 유해한 방식으로 상호작용하는 일 없이 대상에게 핵산 또는 벡터와 함께 투여될 수 있는 물질을 의미한다. 담체는 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 자연적으로 활성 성분의 모든 분해를 최소화하고 대상의 어떠한 부작용이든지 최소화하기 위해 선택될 수 있다.

조성물은 경구로, 비경구로 (예컨대 정맥내로), 근육내 주사에 의해, 복강내 주사에 의해, 경피적으로, 체외로, 국소적 비내 투여 또는 흡입에 의한 투여를 포함하여 국소적으로, 및 그 밖의 경로로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 "국소적 비내 투여"는 조성물이 한쪽 또는 양쪽 콧구멍을 통하여 코 안으로 들어가 코를 통과하는 것을 의미하고 분무 메커니즘 또는 적하(droplet) 메커니즘에 의해 또는 핵산 또는 벡터의 에어로솔화를 통해 전달되는 것을 포함한다. 흡입에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 적하 메커니즘에 의한 전달을 경유하여 코 또는 입을 통과하는 것이다. 전달은 또한 삽관법을 통해 호흡계의 어떠한 영역 (예컨대 폐)에 직접 이루어질 수 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 대상마다 종, 연령, 체중 및 일반적인 대상의 상태, 치료되어야 할 알레르기 장애의 심각성, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 그것의 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 그러므로 모든 조성물에 대해 정확한 양을 구체화하는 것은 불가능하다. 그러나 적절한 양은 당업자에 의해 본원에서 제시되는 기본적인 실험만을 사용하여 측정될 수 있다.

조성물의 비경구 투여는 사용되는 경우 일반적으로 주사에 의해 투여되는 것이 특징이다. 주사 가능한 물질은 종래 형태로, 액체 용액이나 현탁액, 주사하기 전 액체 중의 현탁액에 적당한 고체 형태로서, 또는 에멀션으로서 제조될 수 있다. 보다 최근에 개정된 비경구 투여에 대한 접근법은 일정한 단위용량이 지속되도록 하는 서방성 또는 지속성 방출 시스템의 사용을 포함한다 (미국 특허 3,610,795호 참조).

물질은 용액으로, 현탁액으로 (예컨대 미소입자, 리포솜, 또는 셀에 통합되어) 존재할 수 있다. 이것들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통하여 특정 세포 유형에 대해 표적이 될 수 있다. 특정 단백질을 종양 조직에 대해 표적화하기 위해 이런 기법을 사용하는 것의 예를 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); and Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). "스텔스"와 같은 소포 및 다른 항체 결합된 리포솜 (콜로니 암종에 대한 지질 중재 약물 표적화를 포함하여), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 중재 표적화, 림프구 특정된 종양 표적화, 및 쥐의 신경교 세포의 고도로 특이한 치료용 생체내 레트로바이러스 표적화. 이런 기법을 종양 조직에 대해 특이한 단백질을 표적화하기 위해 사용하는 예는 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). 일반적으로 수용체는 세포 이물 흡수에, 구성적으로 포함되거나 또는 리간드 유래다. 이들 수용체는 클라트린-코팅 피트에 모이게 되고, 클라트린-코팅 소포를 경유하여 세포에 유입되며, 수용체가 분류되는 곳인 산성화된 엔도솜을 통과한 후, 세포 표면으로 재순환하여 세포내에 저장되거나 라이소자임에서 분해된다. 내부화 경로는 다양한 기능, 예컨대 영양 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 정화, 면역체계가 약해졌을 때 바이러스와 독소의 유입, 리간드의 분리 및 분해, 및 수용체-수준 조절을 수행한다. 많은 수용체가 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 값, 및 리간드 농도에 따라 하나 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-중재 세포 이물 흡수의 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 이미 검토되었다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).

(1) 약제학적으로 허용되는 담체

항체를 포함하여, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다.

적당함 담체 및 그것들의 제형은 문헌에 설명되어 있다 (Remington : The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로 적절한 향의 약제학적으로 허용되는 염이 제형을 등장성으로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이며, 이것들에 한정되지는 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 담체는 추가로 방출 지속 제제, 예컨대 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하는데, 그 매트릭스는 형상을 갖춘 제품, 예컨대 필름, 리포솜 또는 미소입자의 형태이다. 당업자들에게는 예컨대 투여 경로와 투여될 조성물의 농도에 따라 어떤 담체들이 더 바람직하다는 것이 명백할 것이다.

약제학적 담체는 당업자들에게 알려져 있다. 이것들은 가장 전형적으로 멸균수, 식염수, 및 생리적 pH의 완충용액과 같은 용액을 포함하여 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체이다. 조성물은 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용된 표준 과정에 따라 투여될 것이다.

약제학적 조성물은 선택된 분자 외에 담체, 농축제, 희석제, 완충제, 보존제, 게면활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항-미생물제, 항염증제, 마취제 등과 같은 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 국부 치료 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라, 그리고 치료될 면적에 따라 많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국부적으로 (눈에, 질로, 직장으로, 코 안으로를 포함하여), 경구로, 흡입에 의하여, 또는 비경구로, 예컨대 정맥 내 점적, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사에 의하여 이루어질 수 있다. 개시된 항체는 정맥 내로, 복강 내로, 근육 내로, 피하로, 코 안으로, 또는 경피적으로 투여될 수 있다.

비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 올레산 에틸이 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 이를테면 식염수 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 부형제는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 락트산 첨가 링거액 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥 내 부형제는 유체 및 영양 보충제, 전해진 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스를 토대로 하는 것들), 등을 포함한다. 또한 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 비활성 가스 등이 포함될 수 있다.

국부 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약제학적 담체, 수성 분말 또는 유성 베이스, 농축제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.

경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 현탁액 또는 물 또는 비-수성 배지 중의 용액, 캡슐, 향낭 또는 정제를 포함한다. 농축제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

어떤 조성물은 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산 및 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과의 반응에 의해, 또는 무기 염기, 예컨대 수산화 나트륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼륨, 및 유기 염기, 예컨대 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민과 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된, 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가염으로서 투여될 수 있다.

(2) 치료적 용도

조성물을 투여하기에 효과적인 1회 용량 및 계획표는 실험적으로 결정될 수 있으며, 그러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술에 속한다. 조성물의 투여에 대한 1회 용량 범위는 질병 증상이 영향을 받는 원하는 효과를 나타내기에 충분히 많은 양이다. 1회 용량은 해로운 부작용, 예를 들면 원하지 않는 교차 반응, 과민반응, 등을 유발할 만큼 많아서는 안 된다. 일반적으로 1회 용량은 연령, 상태, 성별 및 환자의 질병 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 그 치료법에 포함되었는지의 여부에 따라 달라질 것이고, 당업자에 의해 측정될 수 있다. 1회 용량은 어떠한 반대 징후의 상황에서 개별적인 의사에 의해 조정될 수 있다. 1회 용량은 다를 수 있으며, 하루 또는 여러 날 동안 매일, 하나 또는 그 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 그것에 대한 지침은 주어진 부류의 약제학적 생성물에 대한 적절한 1회 용량에 대한 문헌에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어 항체에 대한 적절한 용량을 선택하는데 지침은 항체의 치료적 용도에 관한 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389). 단독으로 사용된 항체의 매일의 전형적인 1회 용량은 상기에서 언급된 인자들에 따라 약 1μg/kg 내지 거의 100mg/kg 체중/1일 또는 그 이상의 범위이다.

g) 칩 및 미세배열

본원에는 최소한 하나의 어드레스가 본원에 개시된 핵산 서열, 펩티드, 또는 세포중 어느 하나에 설명된 서열 또는 서열의 일부인 칩이 개시된다. 또한 본원에는 최소한 하나의 어드레스가 본원에 개시된 펩티드 서열 중 어느 하나에 설명된 서열 또는 서열의 일부인 칩이 개시된다. 예를 들어 상이한 96-웰 플레이트를 가질 수 있는데, 예를 들어 그 중 하나는 간 세포, 하나는 폐 세포, 그리고 하나는 심장 세포를 넣고, 이것들을 시약과 배지를 포함하는 키트(kit)로서 간주할 수 있다. 그런 다음에 마지막 사용자가 시험할 것을 예컨대 웰에 첨가한다. 다른 예는 필름 위에 고밀도로 배열된 화학물질을 사용하고, 나중에 조성물, 예컨대 세포 또는 다른 것들을 포함하는 다양한 용액으로 세척하는 스크리닝을 포함하며, 세포 또는 다른 것들은 칩 상에 있는 어떤 것과 상호작용한다면 표시를 제공한다.

또한 본원에는 최소한 하나의 어드레스가 본원에 개시된 핵산 서열, 펩티드, 또는 세포 중 어느 하나에 설명된 서열 또는 서열의 일부의 변이체인 칩이 개시된다. 또한 최소한 하나의 어드레스가 본원에 개시된 펩티드 서열 중 어느 하나에 설명된 서열 또는 서열의 일부의 변이체인 칩이 개시된다.

h) 컴퓨터 판독성 미디어

개시된 핵산 및 단백질은 아미노산의 뉴클레오티드로 구성되는 서열로서 표시될 수 있다는 것이 자명하다. 이들 서열을 표시하는 방법은 다양한데, 예컨대 뉴클레오티드 구아노신은 G 또는 g로 표시될 수 있다. 마찬가지로 아미노산 발린은 Val 또는 V로 표시될 수 있다. 당업자는 어떠한 핵산 또는 단백질 서열이든지 각각에 대하여 본원에서 개시되고 고려되는 기존의 다양한 방법 중 어느 한 가지로 표시 및 나타낼 수 있는 방법을 알고 있다. 구체적으로 본원에서 고려하는 것은 컴퓨터 판독성 미디어, 예컨대 시판중이 플로피 디스크, 테이프, 칩, 하드 드라이브, 컴팩트 디스크, 및 비디오 디스크, 또는 다른 컴퓨터 판독성 미디어 상에서 이들 서열을 표시하는 것이다. 또한 본원에는 개시된 서열의 2진법 코드 표시가 개시된다. 당업자는 컴퓨터 판독성 미디어가 무엇인지를 알고 있다. 그러므로 컴퓨터 판독성 미디어 위에 핵산 또는 단백질 서열이 기록, 저장 또는 보관되어 있다.

본원에서 설명된 서열에 관한 서열 및 정보를 포함하는 컴퓨터 판독성 미디어가 개시된다.

i) 키트

본원에는 본원에 개시된 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 시약을 끌어올 수 있는 키트가 개시된다. 키트는 본원에서 논의된 또는 개시된 방법을 실시하는 데 필요하거나 유익한 것으로 이해되는 어떠한 시약 또는 시약들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어 키트는 특정 형태의 방법에서 논의된 원하는 분자 또는 변형된 ES를 코드화하는 핵산뿐만 아니라 완충제 및 그것을 사용하기 위해 필요한 효소를 포함한다. 키트의 다른 예는 독성 스크리닝에 유용한 본원에서 설명된 방법에 의해 유래 세포를 포함한다. 이들 세포는 스크린될 약물의 관련 프로필을 제공하는 다양한 말단 분화 세포를 나타낼 수 있다. 세포는 예를 들면 여전히 마커를 포함하거나 절제된 마커를 가질 수 있다. 방법이 만능 세포를 출발 세포로서 사용하는 것을 가능하게 하기 때문에 통상적인 만능 세포로부터 유래 다중 세포 유형과 그로써 공통되는 유전형을 공유하는 세포 유형이 생성될 수 있다. 키트는 예를 들면 본원에 개시된 조성물로 코팅될 수 있는 플레이트, 예컨대 96-웰 플레이트를 포함할 수 있다.

B. 방법

1. 변형된 줄기세포를 사용하는 방법

변형된 줄기세포는 원하는 세포 유형 및 원하는 세포 유형의 배양물을 확인하고 선택하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 변형된 줄기세포는 모든 세포를 자랄 수 있게 하는 조건하에서 배양될 수 있다. 그런 다음 변형된 줄기세포는 선택적인 압력, 예컨대 소프트 한천 배지로 이동되어 거기에서 형질전환하는 유전자의 존재에 대해 선택될 것이다. 선택 유전자, 예컨대 형질전환하는 유전자를 발현하는 세포들은 계속해서 성장되거나 확인될 수 있다. 변형된 줄기세포가 선택 유전자가 단지 단일 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트에서 발현되도록 공학적으로 처리되었기 때문에, 이들 세포만이 계속해서 증식하거나 확인가능한 상태를 유지할 것이다. 다음의 또는 대체 확인 단계, 예컨대 특별한 세포 유형 마커에 대한 세포 분류 또는 가시화 및 계속해서 하위-배양 및 클로닝 단계로 단일 세포 유형이고, 만약 클론된다면, 단일 시조 세포로부터 발생하는 세포 집단이 생성될 수 있다. 변형된 줄기세포가 적절한 조건하에서 배양체를 형성할 수 있는 세포라면, 배양체가 어떠한 세포 유형으로든지 자발적으로 발생할 수 있기 때문에, 어떠한 바람직한 세포 유형이든지 변형된 줄기세포가 자발적인 배양체 형성을 통해 진행하는 것을 가능하게 함으로써 얻어질 수 있고, 선택, 예컨대 본원에서 논의된 바와 같은 형질전환하는 유전자에 대한 선택이 이어진다. 이들 방법 및 본원에서 개시되는 방법들은 개시된 조성물과 함께 어떠한 원하는 세포 유형, 예컨대 본원에 개시된 것들을 생성할 수 있다. 배양체 형성을 개시하기 위하여, 전형적으로 미분화된 줄기세포가 트립신 또는 어떤 다른 분리 방법을 사용하여 공급기 층의 부재시에 미처리된 플라스틱 접시로 옮겨진다. 특수한 처리 없이 세포는 통상 플라스틱에 쉽게 부착하지 않는다. 이런 상황에서 줄기세포는 분할하여 가운데가 텅 빈 개별적인 세포의 볼을 형성할 것이다.

2. 분화된 세포를 사용하는 방법

본원에 개시된 바와 같은 변형된 줄기세포을 제조하는 방법은 생체 내 방법 및/또는 생체 외 방법 및/또는 시험관 내 방법에 적당한 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어 활성화된/우성 네거티브 형질전환하는 유전자 방법은 예를 들면 시험관내 적용에는 가장 적합하지만, 마커, 예컨대 형질전환하는 유전자가 세포 내에 남아있을 것이기 때문에 세포 치료법에는 바람직하지 않을 것이다. 다른 한편으로 CRE/lox는 마커, 예컨대 형질전환하는 유전자가 최종 세포로부터 절제되기 때문에 세포 치료법에 적당하다. 게다가 생체 내 메커니즘에서는 마커가 염색체 외재성 카세트, 예컨대 포유류 인공 염색체에 놓일 수 있기 때문에 그것들은 나중에 다양한 메커니즘을 사용하여 최종 세포로부터 완전히 제거될 수 있다.

a) 분화 조건의 확인 방법

본원에는 줄기세포를 분화하기 위한 조건을 확인하고 최적화하기 위한 방법에서 개시된 세포를 사용하는 방법이 개시된다. 분화 과정은 단계식으로 진행되고 세포는 한 전구체 세포로부터 최종 세포 유형 전의 다음 세포로 진행한다. 한 예를 조혈시스템에서 찾아볼 수 있는데, 거기에서 원시 줄기세포가 다양한 전구체로 발생하고, 그것은 다시 최종 B 세포 또는 T 세포가 나타나기 전에 추가의 전구체를 생성한다. 전구체로부터 최종 생성물로의 이런 진행, 또는 다른 것을 규정하기 위해 사용될 수 있고, 개시된 가역성 형질전환 시스템을 포함하는 방법 및 조성물이 개시된다.

그것의 기능이 잘 알려져 있지 않은 대부분의 유전자는 최종 조직에서 발현되는 유전자들이다. 이들 유전자는 그것의 프로모터가, 그것들이 말단 세포 유형 프로모터이기 때문에 개시된 방법 및 조성물에서 유용할 유전자들이다. 말단 세포 유형은 더 이상 분화하지 않는 세포 유형이다. 알부민은 말단 세포 유형에서 발현된 유전자의 좋은 예이다. 알부민은 간세포에서만 발현된다. 그것의 프로모터는 일련의 공지된 전사 인자, 예컨대 CAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP) 및 포크 머리모양의 단백질 패밀리이다 (Schrem, H., et al. Pharmacol. Rev. 54, 129-158, 2002.) 개시된 방법 및 조성물, 예컨대 조직 특이적 가역성 형질전환 과정을 사용하여 당업자는 배양체로부터 유래 다른 세포의 혼합물 내에서 간세포로 되는 세포를 확인할 수 있다. 당업자는 알부민-조절 전사 인자 중 하나로부터의 프로모터를 조직 특이적 선택제로서 사용할 수 있고, 간세포 직전의 세포를 확인할 수 있다. 이 세포는 그런 다음 분리되고 표준 게놈 기법을 사용하여 그 세포에서 발현된 유전자가 확인될 수 있으며, 세포에서 독특하게 발현되는 유전자인 추가의 선택제가 확인될 수 있다. 이 과정을 각각의 추가 선택제를 사용하여 반복하면, 기원으로 계통을 추적하여 기원으로 되돌아갈 수 있다.

이것의 변형을 진행 중의 각 간계에 대하여 세포 배양 조건을 규정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어 형질전환하는 유전자, 예컨대 활성화된 Ras 유전자를 마커로서 사용하면, 다양한 배양 조건 하에서 소프트 한천 배지에 나타나는 콜로니가 얼마나 많은 지를 정량할 수 있다. 또한 녹색 형광 단백질 또는 락테이트 데히드로게나제를 사용하여서도 정량할 수 있다. 선택제, 세포 또는 계통 특이적 프로모터와 함께 배양 조건을 달리하면 각 단계에서 특별한 경로를 타르는 세포의 수를 최대화하거나 또는 어떠한 다른 원하는 특성을 확인할 수 있다. 각 단계에서 수율을 최대화하는 것은 예를 들면 선택제를 사용하지 않고 원하는 세포 유형으로 유래한 분화 프로토콜을 디자인할 수 있다.

b)재구성된 면역 시스템

본원에는 원하는 인간 세포 유형을 생성하고 변형할 수 있는 방법 및 조성물이 개시된다. 예를 들어 인간 면역 시스템의 시험관 내 재구성이 개시된다. 현재 단클론성 항체는 마우스에서 삼-단계 과정으로 제조된다. 마우스는 먼저 원하는 항원으로 접종된다. 수일 후에 마우스의 비장이 제거되고, 비장에 있는 면역 세포가 마우스 B 세포 림프종 라인과 융합된다. 이것은 B 세포를 비장에 불멸화시키는 작용을 한다. 그런 다음 이것들을 배양하고 적절한 항체를 생성하는 융합물을 선택한다.

마우스 단클론성 항체는 인간에게 치료하기에는 빈약한데, 왜냐하면 그것은 외래 물질로서 인식되어 파괴되기 때문이다. 현재 치료에 사용되고 있는 단클론성 항체, 예컨대 유방암에 대한 Herceptin^®은 이 문제를 최소화하기 위해 인간화되거나 키메라 형성되었지만, 그 문제점이 완전히 제거되지 못하였다. 완전한 인간 단클론성 항체가 해결책이다. 그러나 불행하게도 이것은 항원으로 인간을 접종하는 것을 의미한다. 이것은 비대중적이며 성공적이지 못하였고, 시도한 경우도 드물었다. 본원에서 논의된 바와 같이 조직 특이적이고, 가역적인 줄기세포 형질전환이 인간 면역 세포: B, T 및 대식세포 라인의 짝을 이룬 세트의 선택을 가능하게 할 것이다. 이것은 오직 줄기세포로부터 이루어질 수 있는데, B, T 및 대식세포가 정확하게 융합하기 위해서는 동일한 유전적 배경으로부터 발생해야만 하기 때문이다. 적절한 세포가 수립될 때 그것들은 함께 배양되어 시험관내 면역 시스템이 생성된다. 시스템에서 인큐베이션된 항원은 프로세스될 수 있고 정확하게 B 세포로 제공되어 동족 세포로 확장된다. 배양 시간에 따라 이들 세포는 더 큰 백분율의 총 B세포 집단을 포함하면서, 우선적으로 또는 선택적으로 증식할 수 있다. 이들 세포는 그런 다음 클론되고 적절한 항체를 생성하는 세포가 선택될 수 있다. 그것들이 형질전환되기 때문에 특성확인되고, 냉동된 후 독립적으로 팽창되어 완전한 인간 단클론성 항체가 생성된다. 이 시스템은 치료용 단클론성 항체의 적용성을 극적으로 확대시킬 수 있다.

c) 독물학 시험

약제학 산업의 요망사항인 신약물 발견과 개발에 드는 충격적인 비용을 끌어내리기 위해 약물 후보를 실패하게 만드는 인자들의 조사에 박차를 가하게 되었다. 효능 문제 다음에, 실패의 가장 공통적인 원인은 독성이다 (van de Waterbeemd, H, Gifford, E. (2003) Nat. Rev. Drug Disc. 2, 192 - 204). 시판에 들어간 화합물이 더욱 문제가 되는 것은 인식되지 못한 독성 때문에 철회해야 할 때이다. 트로글리타존(triglitazone)과 트로바플록사신(trovafloxacin)이 쇠퇴했거나 그것의 사용이 간 독성 때문에 심각하게 단축된 화합물의 널리 알려져 있는 보기이고, 그레파플록사신(grepafloxacin)은 간 독성의 문제가 있으며, 테르페나딘(terfenadine)과 아스테미졸(astemizole)은 심장 독성 때문에 쇠퇴하였다 (Suchard, J. (2001) Int. J. Med. Toxicol. 4, 15 - 20).

이상적으로는 신규 화합물의 독성 성질은 개발 당시 인지될 수 있고 초기에 피할 수 있는 것이다. 인간 간 셀라인을 기초로 한 ACTIVTox는 구조 독성 관계의 개발에 대해 대사적으로 활성 플랫폼인 고도의 처리량을 제공하기 위해 디자인된 것이다. 화합물은 화학자에 의해 다음 회전의 합성을 지시하기 위해 사용될 수 있는 구조적 등급을 개발하기 위해 다중 농도에서 한 벌의 시험 장치를 통하여 스크린된다. 이 방법으로 화합물의 독성 특성이 최소화되는 한편 치료적 특성은 최대화될 수 있다.

관련된 셀라인의 패널을 개발함으로써 ACTIVTox의 이념은 일반화될 수 있었다. 신규 화합물은 고처리량 시스템에서 매치된 비-형질전환된 셀라인의 패널에 대하여 시험될 수 있고, 임상적 시도에서 성공할 수 있는 가능성을 높였다. 본원에 개시된 방법을 사용하여 패널을 많은 조직을 나타내고 가능한 밀접하게 매치된 셀라인들로 구성될 수 있다. 이것은 동일한 어버이 줄기 셀 라인, 예컨대 EG 라인으로부터 분석에 사용된 세포의 유래에 의해 이루어질 수 있었고, 동일한 메커니즘에 의해 가역적으로 형질전환되었다. 이들 세포는 유전적 배경에 차이는 있지만 문제점을 최소화하면서, 단일한 개체로부터 한 세트의 조직 샘플을 구성할 것이다.

개시된 방법을 사용하여 예견된 독물학은 또한 더 큰 세포 집단을 사용하여 수행될 수 있다. 심장, 뉴런, 소장, 신장, 간, 근육, 도는 페 라인에 대한 독물학 시험 방법이 개시된다. 이들 라인은 간에 대하여 사용된 것과 동일한 조성물을 사용하여 동일한 독성 분석으로 제조되고 스크린될 수 있다.

예는 박동하는 심장 세포 배양물이다. 제약 회사들 중에서도 주요 관심은 QT 연장으로서 알려져 있는 현상인데, 그것은 심장 불규칙과 아마도 죽음을 유래할 수 있다 (Belardinelli, L., et al. Trends in Pharmocol. Sci. 24, 619 - 625, 2003). 여러 화합물, 예컨대 테르페나딘은 이런 심각한 부작용으로 인해 시장에서 퇴출되었다. 현재, 동물 또는 인간을 제외하고는 QT 연장에 대해 시험하는 것이 어려운데, 그것이 전기적 현상이기 때문이다. 박동하는 심장 세포 배양물은 이 문제에 대한 직접적인 시험을 가능하게 한다.

많은 상이한 세포 유형을 사용하여 동일한 분석법으로 동일한 화합물을 시험함으로써, 신규 화합물의 독성 가능성에 대한 선명한 사진이 인간에게서 시험하기 전에 특정될 수 있다. 이것은 임상 시험이 대단히 가장 비싼 단계이기 때문에 신규 약물 개발의 비용 및 속도에 극적인 영향을 줄 것이다.

d) 발견 적용에 특이한 표적 세포

(1) 도파민 특이적 뉴런

조직 특이적 가역성 형질전환은 또한 약물 개발 적용을 위한 특이한 세포 유형의 개발을 가능하게 한다. 현재 신규 약물이 천연 표적-포함 세포가 활용될 수 없기 때문에 관심의 표적을 포함하도록 유전적으로 조작된 세포 상에서 빈번하게 시험된다. 예는 도파민으로 활성화되는 뉴런이다. 많은 신경 작용성 약물, 예컨대 3고리형 항우울제 또는 약물 표적 중독에 대한 도파민 재흡수 억제제가 도파민 수용체에 대해 특정되었다. 관심의 특정 세포 유형, 예컨대 어떠한 다른 세포 유형에 의해서 오염되지 않은 도파민으로 활성화되는 뉴런의 제한되지 않고 재생가능한 공급의 활용성이 본원에 개시된다.

e) 표적 인증에 대한 녹아웃

개시된 방법 및 조성물, 예컨대 조직 특이적 가역성 형질전환을 유전자 표적화된 동종 재조합과 조합하여 사용함으로써 특정 유전자가 결실되었거나 변형된 세포를 개발할 수 있다. 약물 개발에서 중심적인 문제는 치료 표적의 인증이다. 이것은 특별한 단백질이 약물에 의해 차단되거나 활성화될 때 실제로 원하는 치료 효과를 전달할 것인지의 여부를 측정하는 것이다. 마우스에서의 녹아웃(knockout) 또는 녹(knock)은 본 출원에서 자주 사용된다 (Zambrowicz, BP, et al. Nat. Rev. Drug Disc. 2, 38-51, 2003). 본원에 개시된 바와 같이 제조된 개시된 세포 및 셀라인은 시험관내에서 유사한 인증 기회를 제공할 것이다. 특이한 샘플은 인간 저밀도 리포단백질 수용체의 녹아웃이다. LDL 수용체는 인간 B형 간염 바이러스를 포함하여 많은 인간 바이러스에 대한 입구의 통로로서 사용된다. 본원에 개시된 세포, 예컨대 줄기세포에서 동종 재조합의 기법을 사용하면, LDL 수용체 유전자는 손상되너 LDL 수용체 단백질이 합성되지 않는 결과가 초래된다. 조직 특이적 가역성 형질전환을 이들 세포에서 사용하면, LDL 수용체가 없는 인간 간세포가 생성될 수 있다. 이들 세포는 HBV 감염에서 LDL 수용체의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있다. 만약 예를 들어 이들 세포가 HBV로 감염될 수 없다면, LDL 수용체는 항 HBV 치료법에 대해 인증된 표적이라고 단언할 수 있을 것이다. 다른 목적에 대해 기능 돌연변이의 기능을 얻거나 잃어버리기 위해 유사한 방법이 고안될 수 있다. 상기와 동일한 실시예를 사용하면 LDL 수용체는 정상적으로 이 단백질을 발현하지 않는 세포에서 활성화될 수 있을 것이다.

f) 생체 외 세포 치료법

(1) 간 보조 장치

본원에 개시된 간 셀라인을 토대로 한 간 보조 장치가 개시된다. 미국에서는 연간 약 5,000건의 간 이식이 수행되고 있다. 현재 약 17,000명이 대기자 목록에 올라와 있고, 매년 목록에 있는 약 1500명이 죽는다.

현재 말기 단계의 간 질환, 예컨대 신장 환자의 경우 혈액 투석을 하는 환자를 지지하기 위한 수단은 많이 있다. 간의 재생 능력 때문에 이 짧고 중대한 기간을 지지하는 것은 환자가 적당한 기관을 활용할 수 있을 때까지, 또는 가장 좋은 상황으로는 자기 자신의 간으로 살 수 있게 할 수 있다.

미국과 영국에서 동물 및 52명의 환자에게서 간 보조 장치가 개발되었고 시험되었다 (Sussman, NL, et al., (1992) Hepatology 16, 60-65; Sussman, NL, et al., (1994) Artificial Organs 18, 390-396; Millis, JM, et al., (2002) Transplantation 74, 1735-1746). 이 장치에서, 신장 투석에 사용된 것과 같은 중공 섬유 카트리지가 간기능을 수행하는 인간 간 셀 라인으로 채워진다. 세포는 환자의 면역 시스템으로부터 셀룰로스 아세테이트 섬유에 의해 분리된다. 혈액은 섬유의 루멘을 통해 펌프되고, 작은 분자들이 섬유를 통해 세포로 확산되어, 거기서 적절하게 대사된다. 장치는 안전하고, 그것의 효능을 증명하기 위해 충분한 힘을 가하는 시도는 수행되지 않았지만, 일화거리가 많은 증거는 그것이 간을 구할 수 있음을 시사한다. 동물 간세포를 사용하는 다른 유사한 장치 또한 효과적인 것으로 나타난다 (Hui, T, et al., (2001) J. Hepatobiliary Pancreat Surg. 8, 1-15).

그러나 장치를 채우기 위한 간세포의 공급원에 실제적인 문제가 발생한다. 장치가 효과적이 되기 위해서는, 각 장치는 총 간 질량의 15 내지 20%인 약 200g의 세포를 필요로 한다. 간세포는 그것의 생체 내에서의 재생 능력에도 불구하고, 그것에 대해 수십 년 동안 연구해왔음에도 배양중에 어떠한 정도로 분할하지 않는다. 더구나 상기에서 진술한 통계는 장치를 지지하기 위한 세포를 공급하기 위해 인간 간을 사용하는 것을 고무시키지 않았다. 이식은 전적으로 기관 한정된다. 동물 간의 사용은 충분한 세포를 공급할 수는 있지만, 새로운 기관의 꾸준한 수득을 필요로 하고, 재생성 및 품질 조절의 문제를 나타낸다. 이 문제는 불멸화되고 세포 은행에서 냉동될 수 있는 인간 간 셀 라인을 사용함으로써 이루어졌다 (Sussman, NL & Kelly, JH. (1995) Scientific American: Science and Medicine 2, 68-77). 이들 세포는 끊임없이 새롭고, 재생가능하며 무한히 공급되는 장치를 공급할 수 있다.

그러나 불행하게도 이들 세포의 종양-유래 공급원은 그것을 인간 치료에 사용하기 위해서는 수용과 조절의 문제를 나타냈다. 본원에 개시된 조성물 및 방법으로부터 생성된 개시된 간세포는 그것들이 역전 후에는 더 이상 셀 라인이 아니기 때문에 이런 장애를 극복할 수 있다.

g) 유전적으로 매치된 셀 라인

유전적으로 매치된 셀 라인은 유전자 소음 수준이 극적으로 감소할 수 있기 때문에 유전자 발현 연구 및 프로테오믹(proteomic) 연구에 사용될 수 있다.

개시된 세포에 앞서, 배양 중의 세포를 유전자 발현 연구에 사용할 때의 주요 단점은 세포가 동일한 유전자 배경을 가지고 있지 않다는 것이다. 상이한 세트의 유전자가 상이한 수준으로 상이한 개체에서 발현된다. 이것은 유전자 및 환경적 성분 두 가지를 가진다. 더욱이 배양 중의 대부분의 세포는 종양으로부터 유래되는데, 종양을 정의하자면 유전적으로 비정상이고 통상 다수의 역전, 복제 및 완전히 복제된 염색체를 포함하거나 또는 염색체를 잃어버린 것이다.

동일한 줄기세포로부터 분리된 세포의 세트는 개체로부터의 조직 샘플을 가지는 것과 동일할 것이다. 예를 들어 간과 장으로부터의 세포의 유전자 배경은 동일할 것이다. 이것은 개별적인 다양성이 제거되기 때문에 유전자 및 단백질의 보다 더 명백한 조직 특이적 발현의 측정을 가능하게 한다. 개시된 방법 및 조성물은 어떠한 공급원으로부터든지, 예컨대 어떠한 독특한 개체로부터 본원에 개시된 어떠한 세포, 예컨대 줄기세포로부터의 특정 세포 유형의 유전적으로 매치된 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다.

h) 발생 경로의 확인 및 조절

앞에서 설명된 바와 같이, 전사 인자는 조직 특이적 유전자 발현을 이루기 위하여 조합적으로 작용한다. 개시된 조성물 및 방법은 주어진 세포 유형에 특이한 특정 유전자를 활성화시키는 세포 단계를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 간세포를 예로 들어보면, 알부민은 주로 성인 간세포의 생성물이다. 여러 전사 인자가 그것의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그런 한 가지 인자는 C/EBP로서, 중간 단계의 대사에 포함된 많은 유전자의 조절에 관여하는 인자이다 (Darlington, GJ, (1998) J. Biol. Chem. 273, 30057-30060). 예를 들어 EG 시스템에서 C/EBP에 대한 프로모터를 사용함으로써 이 유전자를 활성화하는 세포를 확인할 수 있다. 그러한 것들 중 하나가 간세포에 대한 전구체인 간 원세포(hepatoblast)이다. 그런 다음 그것의 발현이 C/EBP를 조절하는 유전자를 선택함으로써 기원으로 거슬러올라가는 발생 경로를 단계식으로 추적할 수 있다.

C. 정의

본 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같이 단일 형태의 "하나"(원문으로 "a, an, the")는 문맥상 명백하게 다른 것을 가리키는 것이 아닌 한 복수의 지시대상을 포함한다. 그러므로 예를 들면 "약제학적 담체"라는 표현은 둘 또는 그 이상의 그런 담체의 혼합물을 포함하는 식이다.

본원에는 개시된 조성물을 제조하기 위해 사용될 성분들뿐 아니라 본원에 개시된 방법에 사용될 조성물 그 자체가 개시된다. 이들 및 다른 물질은 본원에 개시되며, 조합될 때 이들 물질의 하위세트, 상호작용, 기 등이 개시되며, 각각의 다양한 개별적이고 포괄적인 조합 및 이들 화합물의 순열의 특정한 참조가 뚜렷하게 개시되지 않더라도, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 설명되는 것이 인지된다. 예를 들어 만약 특정한 변형 ES 세포가 개시 및 논의되고 변형된 ES 세포를 포함하여 많은 분자에 대해 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의된다면, 변형된 ES의 각각의 및 모든 조합 및 순열과, 특별히 반대로 표시되지 않는 한 가능한 변형이 구체적으로 고려된다. 그러므로 분자 A, B, 및 C의 부류가 개시될 뿐 아니라 분자 D, E, 및 F의 부류와 조합 분자 A-D의 예가 개시된다면, 각각이 개별적으로 인용되지 않고 각각이 개별적으로 및 포괄적으로 조합의 의미를 나타내는 것으로 고려된다 할지라도, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F가 개시되는 것으로 간주된다. 그러므로 예를 들어 A-E, B-F, 및 C-E의 하위그룹이 개시되는 것으로 간주된다. 이런 개념은 그것에 한정되는 것은 아니지만 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 단계들을 포함하여, 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 그러므로 만약 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있다면, 이들 추가 단계의 각각은 개시된 방법의 어떠한 특정 실시예 또는 실시예의 조합으로 수행될 수 있음이 자명하다.

본원에 개시된 많은 상이한 조성물 및 방법 단계가 있으며, 본원에 개시된 바와 같은 각각의 조성물 및 방법에 대한 각각의 및 모든 조합 및 순열은 고려되고 개시된다는 것이 인지된다. 예를 들어 형질전환 유전자, 프로모터, 세포 유형, 재조합효소 조합, 변형된 줄기세포, 마커, 세포 특이적 유전자, 및 이것들 각각의 독특한 또는 총체적인 각 조합의 목록이 개시되며, 그것은 수천 가지 구체적인 실시예 및 실시예 세트를 제공한다. 일단 목록 및 그 부분이 개시되면 그것들의 조합 또한 각 조합을 구체적으로 인용하지 않아도 개시된다.

나한천 배지 특별히 반대로 언급되지 않는 한, 또는 당업자에게 반대로 이해되지 않는 한, 특정한 한 실시예가 논의되면, 예컨대 Ras 형질전환 유전자가 논의되면 다른 모든 형질전환 유전자 또한 그 설명 또는 실시예에 대해 개시되며, 본원에 개시된 각 조성물 및 방법의 각 단계에 대해서도 마찬가지라는 것이 인지된다.

범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값으로 표시될 수 있다. 그런 범위가 표시될 때 다른 실시예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값을 포함한다. 마찬가지로 값이 앞서 설명된 "약"을 사용하여 대략으로 표시되면 특정 값은 다른 실시예를 형성한다는 것이 인지될 것이다. 나한천 배지 각 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여, 또한 다른 종점과 무관하게 중요하다는 것이 인지된다. 또한 본원에 개시된 값은 많으며, 각 값은 또한 본원에서 값 자체 외에 "약" 그 특정 값으로서 표시된다는 것이 인지된다. 예를 들어 만약 값 "10"이 표시된다면 "약 10"이 또한 표시된다. 또한 "보다 적거나 동일한" 값이 표시될 때, 당업자에게 적절하게 인지되는 바와 같이 "보다 크거나 동일한 값"과 그 사이의 가능한 범위가 또한 표시된다. 예를 들어 값 "10"이 "10보다 작거나 같은" 뿐만 아니라 "10보다 크거나 같은"이 또한 표시된다. 또한 본 명세서 전체를 통하여, 데이터는 많은 상이한 포맷으로 제공되며, 이 데이터는 종점 및 출발점을 나타내고, 데이터 점의 어떠한 조합에 대한 범위를 나타낸다는 것이 인지된다. 예를 들어 특정 데이터 점 "10"과 특정 데이터 점 15가 표시되면, 10 및 15보다 큰, 보다 크거나 같은, 보다 적은, 보다 적거나 같은, 및 같은 값뿐만 아니라 10과 15사이의 값도 표시된다. 또한 두 개의 특정 유닛 사이의 각 유닛이 또한 표시되는 것으로 인지된다. 예를 들어 10과 15가 표시되면 11, 12, 13, 및 14가 또한 표시된다.

명세서 전체를 통하여 사용되는 바 "대상"은 개체를 의미한다. 그러므로 "대상"은 길들이는 동물, 예컨대 고양이, 개, 등, 가축 (예컨대 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험실 동물 (예컨대 마우스, 토끼, 쥐, 기니피그 등), 포유류, 비-인간 포유류, 영장류, 비-인간 영장류, 설치류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 어떠한 다른 동물을 포함한다. 대상은 영장류 또는 인간과 같은 포유류일 수 있다.

"처리" 또는 "치료"는 완전한 치료를 의미하는 것은 아니다. 그것은 근원적인 질병의 징후가 감소하고, 및/또는 하나 또는 그 이상의 근원적인 세포상의, 생리적인, 또는 생화학적 원인 또는 징후를 유발하는 메커니즘이 감소하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 감소는 질병상태와 비례하며, 질병의 분자 상태를 포함하고, 질병의 생리 상태를 말하는 것이 아니다.

"감소" 또는 다른 형태의 감소는 사건 또는 특징이 저하되는 것을 의미한다. 이것은 전형적으로 어떤 표준 또는 예상치와 관련되며, 다르게 표현하면 상대적이지만, 언제나 표준 또는 그것을 나타내는 관련 값일 필요는 없다는 것이 인지된다. 예를 들어 "인산화를 감소한다"는 것은 표준 또는 대조표준과 관련하여 발생하는 인산화의 양이 낮아지는 것을 의미한다.

"억제" 또는 다른 형태의 억제는 특정한 특징을 누르거나 제한하는 것을 의미한다. 이것은 전형적으로 어떤 표준 또는 예상치와 관련되며, 다르게 표현하면 상대적이지만, 언제나 표준 또는 그것을 나타내는 관련 값일 필요는 없다는 것이 인지된다. 예를 들어 "인산화를 억제한다"는 것은 표준 또는 대조표준과 관련하여 발생하는 인산화의 양을 누르거나 제한하는 것을 의미한다.

"방지한다" 또는 다른 형태의 방지는 특정 특징 또는 상태를 중지하는 것을 의미한다. 방지는 그것이 전형적으로 예컨대 감소 또는 억제보다 더 절대적이기 때문에 대조표준과 비교할 필요는 없다. 본원에 사용되는바, 어떤 것은 감소할 수는 있지만 억제되거나 방지될 수 없지만, 감소하는 어떤 것은 또한 억제되거나 방지될 수 있다. 감소, 억제 또는 방지가 사용되는 경우 특별히 다른 언급이 없는 한, 다른 두 단어의 사용도 또한 명백하게 표시된다. 그러므로 만약 인산화를 억제한다고 표시되면 인산화를 감소하고 방지하는 것도 표시된다.

용어 "치료적으로 유효한"은 사용된 조성물의 양이 질병 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 원인 도는 징후를 경감시키기에 충분한 양이라는 것을 의미한다. 그런 경감은 단지 감소 또는 변경을 말하며, 반드시 제거를 필요로 하지는 않는다. 용어 "담체"는 화합물 또는 조성물과 조합될 때 제조, 보관, 투여, 전달, 효능, 선택성, 또는 그것의 본래의 용도 또는 목적에 대한 화합물 또는 조성물의 어떠한 다른 특징을 보조하거나 촉진하는 화합물, 조성물, 물질, 또는 구조를 의미한다. 예를 들어 담체는 활성 성분의 어떠한 분해를 최소화하고, 대상의 어떠한 해로운 부작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있다.

본 명세서 및 청구범위 전체를 통하여 단어 "포함하다"와 그 단어의 변용, 예컨대 "포함하는" 및 "포함한다"는 "포함하지만 그것에 한정되는 것은 아닌"은 의미하며, 예컨대 다른 첨가제, 성분, 완전체 또는 단계를 배제하려는 의도가 아니다.

본원에 사용되는 용어 "세포"는 또한 특별히 다른 언급이 없는 한 개별적인 세포, 셀라인, 일차 배양물, 또는 그러한 세포로부터 유래 배양물을 말한다. "배양물"은 동일한 또는 상이한 유형의 분리된 세포를 포함하는 조성물을 말한다.

셀 라인은 무한하게 재생될 수 있어서 셀 라인은 "불멸"로 만드는 특정 유형의 세포의 배양물이다.

세포 배양물은 한천 배지와 같은 배지 상에서 성장하는 세포 집단이다.

일차 세포 배양물은 불멸화되지 않은 살아있는 유기체로부터 직접 취한 또는 세포로부터의 배양물이다.

용어 "선구-약물"은 생리적 조건하에서 치료적으로 활성 제제로 전환되는 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 선구 약물을 제조하기 위한 통상적인 방법은 생리적 조건 하에서 원하는 분자를 드러내도록 가수분해된 선택된 부분을 포함하는 것이다. 다른 실시예에서 선구 약물은 숙주 동물의 효소적 활성에 의하여 전환된다.

용어 "대사 산물"은 환자와 같은, 생물학적 환경에 화합물을 도입할 때 생성된 활성 유도체를 말한다.

약제학적 조성물과 관련하여 사용될 때, 용어 "안정한"은 일반적으로 당업계에서 표시된 시간 기간 동안 특수한 저장 조건하에서 특정 양보다 적은 양, 통상 10%의 활성 성분이 손실되는 것을 의미하는 것으로 인지된다. 안정한 것으로 간주되는 조성물에 필요한 시간은 각 생성물의 용도와 관련되고, 생성물 제조의 상업적인 실용성, 품질 제어 및 정밀조사를 위한 보유, 도매업자 또는 궁극적으로 사용되기 전 다시 저장 보유되는 소비자에게 직접 선적하는 것에 의해 좌우된다. 수개의 안전성 인자를 포함하여, 약품에 대한 제품의 최소 수명은 통상 일년이며, 바람직하게는 18개월 이상이다. 본원에서 사용되는바, 용어 "안정한"은 이들 시장 현실과 생성물을 쉽게 얻을 수 있는 환경적 조건, 예컨대 냉장 조건, 2℃ 내지 8℃에서 보관하고 운반하는 능력을 언급하는 것이다.

명세서 및 말미의 청구범위에서 조성물 또는 제품의 특정 요소 또는 성분의 중량부에 대한 언급은 조성물 또는 제품의 요소 또는 성분과 어떠한 다른 요소 또는 성분 사이의 중량부로 표시되는 중량 관계를 나타낸다. 그러므로 2중량부의 성분 X와 5중량부의 성분 Y를 포함하는 화합물에서, X와 Y는 2:5의 중량비로 존재하며, 추가의 성분이 화합물에 포함되었는지와 관계없이 그러한 비율로 존재한다.

성분의 중량%는 대조적인 설명이 없는 한, 성분이 포함된 제형 또는 조성물의 총 중량을 토대로 한다.

본 명세서 및 청구범위에서 규정되어야 할 많은 용어들은 다음과 같이 설명된다:

"임의의" 또는 "임의적으로"는 계속해서 설명되는 사건 또는 상황이 일어날 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며, 그 설명은 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 그렇지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.

"프라이머"는 어떤 유형의 효소적 조작을 지지할 수 있고 표적 핵산과 혼성화할 수 있어서 효소적 조작이 일어날 수 있는 하위세트의 프로브이다. 프라이머는 효소적 조작을 간섭하지 않는, 당업계에서 활용할 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 모든 조합으로부터 제조될 수 있다.

"프로브"는 표적 핵산과, 전형적으로는 서열 특이적 방식으로, 예컨대 혼성화를 통하여 상호작용할 수 있는 분자이다. 핵산의 혼성화는 당업계에 잘 알려져 있고 본원에서도 논의된다. 전형적으로 프로브는 당업계에서 활용할 수 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 또는 유사체의 모든 조합으로부터 제조될 수 있다.

개시된 방법에 사용하기 위한 핵산 절편은 또한 핵산 서열 또는 핵산 분자로서 언급될 수 있다. 다른 언급이 없는 한, 핵산 절편, 핵산 서열 및 핵산 분자에 대한 언급은 별도의 형태이거나 어떠한 다른 핵산으로 통합되거나 일부일 수 있는 특수화된 서열 및/또는 기능을 가지는 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 사슬을 말하는 것으로 의도된다.

본 명세서 전체를 통하여 다양한 공보가 언급된다. 그 공보들의 개시 내용은 전체가 본 발명이 속하는 기술 분야의 상태를 더욱 완전하게 설명하기 위하여 본 명세서에 참조로 통합되는 것이다. 표시된 참고문헌은 또한 개별적으로 및 구체적으로 참고문헌들이 의존하는 문장에서 논의되는 항목에 포함되는 물질들에 대하여 참조로서 본원에 통합된다.

D. 조성물의 제조 방법

본원에 개시된 조성물 및 개시된 방법을 수행하기 위해 필요한 조성물은 특별히 다른 언급이 없는 한 특정 시약 또는 화합물에 대하여 당업자들에게 공지되어 있는 어떠한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

1. 핵산 합성

예를 들어 프라이머로서 사용될 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드는 표준 화학 합성법을 사용하여 제조되거나 또는 효소적 방법 또는 어떠한 다른 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그런 방법은 표준 효소 소화법과 이어지는 뉴클레오티드 단편 분리 (Sambrook et ah, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6)로부터 예컨대 Milligen 또는 Beckman System 1Plus DNA 합성기 (예컨대 Model 8700 자동 합성기, Milligen-Biosearch, Burlington, MA or ABI Model 38OB)를 사용하는 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 의한 순수한 합성 방법에 이르기까지 다양하다. 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 유용한 합성법 또한 문헌에 설명되어 있다 (Ikuta et al., Ann . Rev . Biochem . 53:323-356 (1984), (포스포디에스테르 및 포스파이트-트리에스테르 방법), and Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (포스포트리에스테르 방법)). 단백질 핵산 분자는 문헌에 설명되어 있는 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Nielsen et al., Bioconjug . Chem . 5:3-7 (1994)).

2. 펩티드 합성

개시된 단백질을 제조하는 한 가지 방법은 둘 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 단백질 화학 기법에 의해 함께 연결하는 것이다. 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드는 현재 활용가능한 실험실 장비를 사용하여 Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 또는 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 화학을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자는 예를 들면 개시된 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있음을 쉽게 인지할 수 있다. 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성되고 그것의 합성 수지로부터 절단되지 않는 반면, 펩티드 또는 단백질의 다른 단편은 합성될 수 있고 계속해서 수지로부터 절단됨으로써, 기능적으로 다른 단편에 대해 차단된 말단 기를 노출시킨다. 펩티드 축합 반응에 의하여 이들 두 단편은 각각 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통하여 공유 결합하여 항체, 또는 그것의 단편을 형성한다 (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY). 또는 달리 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 설명되는 바와 같이 독립적으로 생체내에서 합성될 수 있다. 일단 분리되면 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합반응을 통해 펩티드 또는 그것의 단편을 형성하기 위해 결합될 수 있다.

예를 들어 클론된 또는 합성 펩티드 절편의 효소적 결찰은 상대적으로 짧은 펩티드 단편이 결합되어 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성하는 것을 가능하게 한다 (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 1991)). 또는 달리 합성 펩티드의 천연 화학 결찰이 활용되어 더 짧은 펩티드 단편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성에 의해 구성할 수 있다. 이 방법은 2 단계 화학 반응으로 구성된다 (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫 번째 단계는 보호되지 않은 합성 펩티드-티오에스테르를 아미노-말단 Cys 잔기를 포함하는 다른 보호되지 않은 펩티드 절편을 사용하여 화학선택적 반응하여 티오에스테르-결합 중간체를 초기 공유 생성물로서 제공하는 것이다. 반응 조건을 변화시키지 않고, 이 중간체는 자발적이고 신속한 분자내 반응을 진행시켜서 결찰 부위에서 천연 펩티드 결합을 형성한다 (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).

또는 달리 보호되지 않은 펩티드 절편은 화학적 결찰의 결과로서 펩티드 절편 사이에 형성된 결합이 비천연 (비-펩티드성) 결합인 경우 화학적으로 결합될 수 있다 (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 이 기법은 단백질 도메인의 유사체뿐 아니라 완전한 생물학적 활성을 가지고 있는 상대적으로 순수한 단백질을 다량 합성하기 위해 사용되었다 (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).

3. 조성물의 제조 방법

본원에는 조성물의 제조 방법뿐만 아니라 조성물로 유래하는 중간체의 제조방법도 개시된다. 예를 들어 개시된 방법에 의하여 제조된 세포가 개시된다. 이들 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법은 다양한데, 예를 들면 합성 화학 방법 및 표준 분자 생물학 방법이 있다. 이들 및 다른 개시된 조성물의 제조 방법이 구체적으로 설명되는 것이 자명하다.

본원에는 본원에 개시된 서열을 포함하는 핵산과 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다.

또한 본원에는 본원에 개시된 서열에 대해 80% 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산 분자와, 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다.

본원에는 엄격한 혼성화 조건하에서 개시된 서열에 혼성화하는 서열을 포함하는 핵산 분자와 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 분자와 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 펩티드에 대해 80%의 동일성을 가지는 펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 분자와 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 펩티드에 대해 80%의 동일성을 가지는 펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 분자와 핵산의 발현을 조절하는 서열을 효과적인 방식으로 결합시키는 것으로 이루어지는 방법에 의해 제조된 핵산 분자가 개시되는데, 이때 펩티드 서열로부터의 어떠한 변화든지 보존성 변화이다.

본원에는 개시된 핵산의 어떠한 것으로 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 세포가 개시된다. 비-천연 발생의 개시된 핵산 중 어떠한 것으로 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 세포가 개시된다. 본원에 설명된 방법에 의해 제조된 상이한 세포의 조합 또한 개시된다. 또한 본원에 설명된 방법에 의해 제조된 세포와 다른 세포가 혼합된 조합이 제공된다. 이들 세포는 특정한 요구 또는 적용을 토대로 다양한 순도를 가질 수 있다.

본원에는 모든 개시된 핵산을 발현시키는 과정에 의해 제조된 펩티드가 모두 개시된다. 개시된 핵산 중 어느 것이라도 발현시키는 과정에 의해 제조된 비-천연 발생의 개시된 펩티드가 모두 개시된다. 또한 개시된 비-천연 핵산 중 어느 것이라도 발현시키는 과정에 의해 제조된 개시된 펩티드가 모두 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물의 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시된다. 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물의 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 이때 동물은 포유류이다. 또한 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물의 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 이때 포유류는 마우스, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지 또는 영장류이다.

또한 본원에는 본원에 개시된 어떠한 세포를 동물에 첨가하는 과정에 의해 제조된 동물이 개시된다.

본원에는 본원에 개시된 핵산으로 세포를 형질전환시킴으로써 제조된 본원에 개시된 줄기세포 중 어느 것이든지 개시된다. 또한 본원에 개시된 방법, 예컨대 특이한 세포 유형을 선택하여 분리하고 개시된 변형 줄기세포를 사용하는 방법에 의해 제조된 세포들이 개시된다.

E. 조성물의 사용 방법

1. 연구 도구로서 조성물을 사용하는 방법

개시된 조성물은 다양한 방식으로 연구 도구로서 사용될 수 있다.

조성물은 특이한 세포 유형에 관련된 원하는 기능적 특성을 가지는 분자를 분리하기 위한 조합 방식의 화학적 프로토콜 또는 다른 스크리닝 프로토콜에서 예를 들면 표적으로서 사용될 수 있다.

개시된 조성물은 미소 배열에서 시약으로서 또는 기존의 마이크로어레이를 검증하거나 분석하기 위한 시약으로서 본원에서 논의되는 바와 같이 사용될 수 있다. 개시된 조성물은 단일 뉴클레오티드 다형태를 분리하거나 확인하기 위한 어떠한 공지의 방법으로 사용될 수 있다. 조성물은 또한 예를 들면 본원에 개시된 특정 세포 유형의 특별한 유전자의 대립형질 분석을 측정하기 위한 어떠한 방법에서 사용될 수 있다. 조성물은 또한 칩/미소 배열과 관련하여, 어떠한 공지의 스크리닝 분석 방법에 사용될 수 있다. 조성물은 또한 예컨대 개시된 조성물에 관련된 분자 모델링 분석을 수행하거나 관계성을 연구하기 위하여, 개시된 조성물의 컴퓨터 판독성 실시예를 사용하는 어떠한 공지 방법에 사용될 수 있다.

2. 유전자 변형 및 유전자 파괴 방법

개시된 조성물 및 방법은 표적화된 유전자 파괴 및 변형을 위해 이들 시건을 진행시킬 수 있는 어떠한 동물에서 사용될 수 있다. 유전자 변형 및 유전자 파괴는 동물, 예컨대 포유류의 유전자 또는 펼쳐진 염색체의 선택적 제거 또는 변경을 포유류의 생식 계통을 통하여 변형을 전달하는 방식으로 둘러싸는 방법, 기법, 및 조성물을 말한다. 일반적으로 세포는 예를 들자면 본원에 설명되어 있는 바와 같이, 세포 내에 포함된 특별한 염색체 영역과 동종 재조합하도록 디자인된 벡터로 형질전환된다. 이 동종 재조합 사건은 외인성 DNA가 예를 들면 프레임에 둘러싸는 DNA와 함께 도입된 염색체를 생성할 수 있다. 이 유형의 프로토콜은 세포 내에 포함된 게놈에 도입될 매우 특이한 돌연변이, 예컨대 점 돌연변이를 가능하게 한다. 이런 유형의 동종 재조합을 수행하는 방법이 본원에 개시된다. 마찬가지로 줄기세포, 예컨대 만능 줄기세포는 유전자도입 동물을 생성하기 위하여 유전자를 녹아웃시키는 데 사용될 수 있고, 동일한 세포가 다양한 분석에서 동물에 비교될 수 있는 셀 라인을 생성하기 위해 본원에서 설명되는 방법에 사용될 수 있다.

포유류 세포에서 동종 재조합을 수행할 때의 바람직한 한 특징은 세포가 배양될 수 있는 것이라야 한다는 것인데, 왜냐하면 원하는 재조합 사건이 낮은 빈도로 일어나기 때문이다.

일단 세포가 본원에 개시된 방법을 통하여 제조되면, 동물은 이 세포로부터 줄기세포 기술이나 클로닝 기술을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어 만약 핵산이 형질전환되어 있는 세포가 유기체에 대한 줄기세포라면, 이 세포는 형질전환 및 배양 후에 생식 셀 라인에 유전자 변형 또는 파괴가 일어날 유기체를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 그것은 다시 그것의 모든 세포에 유전자 변형 또는 파괴가 일어나는 다른 동물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 그것의 모든 세포에 유전자 변형 또는 파괴를 포함하고 있는 동물을 제조하기 위한 다른 방법에서 클로닝 기술이 사용될 수 있다. 이들 기술은 일반적으로 형질전환된 세포의 핵을 가지며, 융합 또는 대체 중 하나를 통하여 형질전환된 핵과 난모세포를 융합시키고, 난모세포는 나중에 동물을 생산하도록 조작될 수 있다. ES 기술 대신 클로닝을 사용하는 과정의 장점은 ES 세포 이외의 세포가 형질전환될 수 있다는 것이다. 예를 들어 배양하기가 매우 쉬운 섬유아세포가 형질전환되고 유전자 변형 또는 파괴 사건이 일어나는 세포로서 사용될 수 있으며, 나중에 이 세포로부터 유래 세포들이 전체 동물을 클론하는 데 사용될 수 있다.

F. 특정 실시예

본원에는 핵산 절편을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 이때 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하고, 여기서 P는 전사 조절 요소이며 I는 마커를 코드화하는 서열이고, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조된 분화된 세포가 개시되는데, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 대상에 분화된 세포를 도입시키는 것으로 이루어지는 방법이 개시되는데, 이때 분화된 세포는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조되며, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 분화된 세포와 조성물을 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계로 이루어지는, 독성에 대해 조성물을 분석하는 방법이 개시되는데, 이때 분화된 세포는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조되며, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 분화된 세포와 화합물을 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계로 이루어지는, 독성에 대해 화합물을 분석하는 방법이 개시되는데, 이때 분화된 세포는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조되며, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 분화된 세포와 조성물을 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계로 이루어지는, 세포에 미치는 관심의 효과에 대하여 조성물을 분석하는 방법이 개시되는데, 이때 분화된 세포는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조되며, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 분화된 세포와 화합물을 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계로 이루어지는, 세포에 미치는 관심의 효과에 대하여 화합물을 분석하는 방법이 개시되는데, 이때 분화된 세포는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 만능 줄기세포를 배양함으로써 제조되며, 이때 만능 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 줄기세포를 배양하는 단계와, 그에 따라 분화된 세포가 유래되는 단계로 이루어지는, 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법이 개시되는데, 이때 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함하고, I는 이종성 핵산 서열이다.

또한 본원에는 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 줄기세포를 배양하는 단계와, 그에 따라 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형이 유래되는 단계로 이루어지는, 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 이때 줄기세포는 핵산 절편을 포함하고, 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함하고, I는 이종성 핵산 서열이다.

또한 본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함하고; 줄기세포를 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형이 유래되는 단계로 이루어진다.

또한 본원에는 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함하고; 줄기세포를 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 분화된 줄기세포가 유래되는 단계로 이루어진다.

또한 본원에는 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며; 줄기세포를 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양하는 단계로 이루어지고, 이때 전사 조절 요소가 활성화되는 조건은 줄기세포가 분화됨으로써 분화된 세포가 유래되는 조건이다.

또한 본원에는 구조 P-I를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 여기서 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다. 또한 줄기세포로부터 핵산을 절제하여 제조되는 세포가 개시되는데, 이때 줄기세포는 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편을 포함하며, 여기서 P는 전사 조절 요소이고, I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 줄기세포로부터 조건성 불멸 세포 유형의 집단을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 청구범위 제 1항에서 인용되는 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 요소 P의 전사 조절이 활성화되도록 환경에서 줄기세포를 배양함으로써, I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 단계; 그리고 I를 발현하는 세포 유형을 선택하는 단계로 이루어진다.

또한 본원에는 줄기세포로부터 조건성 불멸 세포 유형의 집단을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 줄기세포를 청구범위 제 1항에서 인용되는 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 요소 P의 전사 조절이 활성화되도록 환경에서 줄기세포를 배양함으로써, I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 단계; 그리고 I를 발현하는 세포 유형을 선택하는 단계로 이루어진다.

또한 본원에는 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환시킴으로써 조절 요소 P가 활성화되어 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 단계; I를 발현하는 세포를 선택하는 단계; P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 절제하는 단계; 이전에 P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 포함하는 핵산의 말단이 재결합되도록 선택된 세포 유형을 환경과 접촉시키는 단계; 그리고 선택된 세포 유형을 냉동시키는 단계로 이루어진다.

또한 본원에는 세포 배양물을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 핵산 분자 P-I 중 하나를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 환경과 줄기세포를 접촉시키는 단계; 그리고 I를 발현하는 세포를 배양하는 단계로 이루어지며, 여기서 P는 전자 조절 요소이고, I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 구조 P-I를 포함하는 핵산 분자 구성물을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 여기서 P는 조직 특이적 전사 조절 요소이고, P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 것을 유발하며, I는 온도 수용성 불멸화제이다.

또한 본원에는 구조 X-P-I-X를 포함하는 핵산 분자 구성물을 포함하는 만능 줄기세포가 개시되는데, 여기서 P는 조직 특이적 전사 조절 요소이고, P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 것을 유발하며, I는 온도 수용성 불멸화제이고, X는 부위-특이적 절제 서열이다.

또한 본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 핵산 분자 구조 P-I를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 환경과 줄기세포를 접촉시키는 단계; I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계; 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어지며, 이때 P는 전자 조절 요소이고, I는 마커를 코드화하는 서열이며, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 핵산 분자 구조 X-P-I-X를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 환경과 줄기세포를 접촉시키는 단계; I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계; 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어지며, 이때 X는 부위-특이적 재조합 부위이고, P는 전자 조절 요소이며, I는 마커를 코드화하는 서열이고, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형을 유래하는 방법이 개시되는데, 그 방법은 만능 줄기세포를 청구항 11에서 인용된 핵산 분자 구조 X-P-I-X를 포함하는 구성물로 형질전환시키는 단계; 전사 조절 요소 P가 활성화되고 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되도록 환경과 줄기세포를 접촉시키는 단계; I를 발현하는 줄기세포 유래 세포 유형을 선택하는 단계; P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 절제하는 단계; 그리고 선택된 세포 유형을 클로닝하고 냉동하는 단계로 이루어지며, 이때 X는 부위-특이적 재조합 부위이고, P는 전자 조절 요소이며, I는 마커를 코드화하는 서열이고, 마커는 형질전환제를 포함한다.

또한 본원에는 줄기세포로부터 유래 세포 유형을 이식하는 것으로 이루어지는, 환자의 치료 방법이 개시된다. 또한 줄기세포로부터 유래 세포와 조성물을 인큐베이션하는 것으로 이루어지는, 독성에 대하여 조성물을 분석하는 방법이 개시된다.

핵산 절편은 이종성 핵산 절편일 수 있다. 핵산 절편은 외인성 핵산 절편일 수 있다. 마커는 이종성일 수 있다. I는 이종성 핵산 서열일 수 있다. P와 I는 동일 벡터에 포함될 수 있다. P와 I는 상이한 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 절편은 추가로 자살 유전자를 포함할 수 있다. P는 조직 특이적 전사 조절 요소일 수 있다. P는 세포 계통 특이적 전사 조절 요소일 수 있다. P는 세포 특이적 전사 조절 요소일 수 있다. P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 것을 유발한다.

마커는 온도 수용성 불멸화제를 포함할 수 있다. 형질전환제는 온도 수용성 제제일 수 있다. I는 SV40 큰 T 항원을 포함할 수 있다. 핵산 절편의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있을 수 있다. I의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있을 수 있다. P의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있을 수 있다. 핵산 절편은 추가로 X를 포함할 수 있고, 이때 X는 부위-특이적 절제 서열이며, X는 P-I의 양 옆에 있고, 핵산 절편은 X-P-I-X 구조를 포함한다. 핵산 절편은 X에서 절제될 수 있다. X는 loxP 부위일 수 있다.

전사 조절 요소가 활성화될 수 있는 조건은 줄기세포가 분화하는 조건일 수 있다. 줄기세포는 전사 조절 요소가 활성화되는 조건하에서 분화할 수 있다. 전사 조절 요소는 줄기세포가 자발적으로 배양체로 분화할 수 있게 함으로써 활성화될 수 있다. 핵산 절편은 분화된 세포로부터 절제될 수 있다. 핵산 절편은 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제를 사용하여 절제될 수 있다. 핵산 절편은 재조합효소를 사용하여 절제될 수 있다. 제조합효소는 Cre일 수 있다. 핵산 절편의 절제는 핵산 분자의 재조합을 초래하고, 그것으로부터 핵산 절편이 절제될 수 있다.

I의 발현 효과는 역전될 수 있다. I의 발현 효과는 분화된 세포의 형질전환일 수 있는데, I의 발현 효과의 역전이 분화된 세포의 형질전환의 역전이 될 수 있다. I의 발현 효과는 우성 네거티브 형질전환제의 발현에 의해 역전될 수 있다. I의 발현 효과는 핵산 절편의 절제에 의해 역전될 수 있다. 분화된 세포는 간세포일 수 있다. 분화된 세포는 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포일 수 있다.

분화된 세포는 분화된 세포를 대상에게 투여함으로써 도입될 수 있다. 분화된 세포는 분화된 세포를 대상에게 이식함으로써 도입될 수 있다. 전사 조절 요소가 활성화될 수 있는 조건은 줄기세포가 분화하는 조건일 수 있다. 줄기세포는 전사 조절 요소가 활성화될 수 있는 조건하에서 분화할 수 있다. 전사 조절 요소는 줄기세포가 자발적으로 배양체로 분화할 수 있게 함으로써 활성화될 수 있다.

방법은 추가로 I를 발현하는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 방법은 또한 I를 발현하는 세포의 순도를 증가시키는 단계를 포함한다. 순도를 증가시키는 것은 클론성 또는 반-정제된 세포 집단을 생성하는 것을 포함한다. 방법은 또한 핵산 절편을 절제하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 분화된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 방법은 또한 분화된 세포를 냉동하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 선택된 세포에 관심의 유전자를 첨가하는 것을 포함한다. 방법은 또한 핵산 절편을 절제하고; 선택된 세포를 냉동하는 것을 포함한다. 이미 핵산 절편을 포함하고 있는 핵산의 말단은 핵산 절편이 절제될 때 재결합한다. 방법은 추가로 I를 발현하는 세포를 배양하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 I를 발현하는 배양된 세포를 클로닝하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 분화된 세포를 대상에게 도입하는 것을 포함한다.

분화된 세포는 분화된 세포를 대상에게 투여함으로써 도입될 수 있다. 분화된 세포는 분화된 세포를 대상에게 이식함으로써 도입될 수 있다. 방법은 추가로 조성물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 방법은 분화된 세포를 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 방법은 추가로 조성물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 방법은 추가로 화합물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계를 포함한다. 방법은 추가로 마커를 선택함으로써 분화된 세포를 선택하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 마커를 발현하는 세포로 확인된 분화된 세포에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 줄기세포는 전사 조절 요소가 활성화될 수 있는 조건하에서 분화할 수 있다. 전사 조절 요소는 줄기세포가 자발적으로 배양체로 분화할 수 있게 함으로써 활성화될 수 있다.

마커는 이종성 핵산으로부터 발현될 수 있다. 핵산은 추가로 자살 유전자를 포함할 수 있다. P는 조직 특이적 전사 조절 요소일 수 있다. P는 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 것을 유발한다. 불멸화제는 온도 수용 제제일 수 있다. I는 SV40 큰 T 항원을 포함할 수 있다. 핵산 분자의 양 옆에는 부위-특이적 서열이 있을 수 있다. I의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있을 수 있다. P의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열이 있을 수 있다. P-I의 양 옆에는 부위-특이적 절제 서열, X가 있어서 X-P-I-X를 형성할 수 있다. P-I를 포함하는 핵산 분자는 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제를 사용하여 절제될 수 있다. 구조 P-I를 포함하는 핵산 분자의 절제는 절제되지 않는 핵산 분자의 재조합을 초래한다.

방법은 추가로 I를 발현하는 세포 집단의 순도를 증가시키는 방법을 포함한다. 순도를 증가시키는 것은 클론성 또는 반-정제된 세포 집단을 생성하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 핵산을 절제하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 선택된 세포 유형을 냉동시키는 것을 포함한다. 방법은 추가로 세포 집단에 관심의 유전자를 첨가하는 것을 포함한다. 조절 요소 P를 활성화하는 것은 줄기세포 배양물이 자발적으로 배양체로 분화하도록 허용하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 I를 발현하는 배양된 세포를 클론하는 것을 포함한다.

P-I는 절제될 수 있다. P-I는 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제에 의해 X에서 절제될 수 있다. P-I의 절제는 이미 P-I 핵산 분자를 포함하는 구성물을 포함하는 핵산의 재조합을 가능하게 한다. P와 I는 동일 벡터에 포함될 수 있다. P와 I는 상이한 벡터에 포함될 수 있다.

다음의 실시예는 본원에서 청구되는 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법의 제조 방법 및 평가 방법에 대한 완전한 표시 및 설명과, 본원에서 청구되는 화합물, 조성물, 제품, 장치 및/또는 방법의 제조 방법 및 평가 방법이 순수하게 예시의 목적으로 의도된 것이며 내용을 제한하려는 의도가 아니라는 것을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자와 관련하여서는 (예컨대 양, 온도 등) 정확을 기하려고 노력하였지만, 약간의 실수와 편차가 있을 것이다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량부이고, 온도는 섭씨 온도이거나 주변 온도이며, 압력은 대기압이거나 대기압에 근접한다.

실시예 1 - 활성화된/우성 네거티브 형질전환 유전자 쌍을 사용한 인간 간세포 셀 라인의 확인

인간 EG 세포로부터 출발하는 인간 간세포 셀라인을 활성화되고 우성인 네거티브 형질전환 유전자의 순차적 발현을 사용하여 확인하는 것은 다음과 같이 수행할 수 있다. 인간 EG 유전자는 활성화된 H-RAS 유전자 (SEQ ID NO:2)를 유래하는 인간 B형 간염 바이러스 코어 프로모터/인핸서 (SEQ ID NO:1) 및 또한 우성 네거티브 H-RAS 유전자 (SEQ ID NO:4)를 유래하는 엑디손 유래성 유전자 전환 프로모터 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 구성물로 형질전환한다 (Sandig et al., (1996) Gene Therapy 3, 1002-1009; Saez et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 14512-14517). 활성화된 H-RAS는 EG 세포의 분화 후에 전사된다. 형질전환된 간세포는 소프트 한천 배지에서 분리할 수 있고, 클론하고, 연장한 후, 냉동한다. 배양물을 저밀도로 플레이팅한 후 포나스테론 A로 처리하여 우성 네거티브 RAS와 역 형질전환을 유래하였다. 세포는 서브컨플루언트(subconfluent) 밀도에서 성장이 정지될 것으로 예상되었다. 세포들의 간세포로서의 정체성을 알부민, cyp1A 및 cyp3A의 생성 에 의해 확인하였다.

이 형질전환은 배양체로부터 확인될 수 있는 간세포 셀 라인을 제조하기 위하여 pHBV-aRAS 및 ACTEG1 세포를 사용하여 수행할 수 있다.

a) 방법

(1) 플라스미드

도 2에 도시된 플라스미드, pLS-RAS는 활성화된 H0Ras의 전사를 유래하는 B형 간염 바이러스로부터의 프로모터 인핸서와 우성 네거티브 H0Ras를 유래하는 엑디손 유래성 프로모터를 포함한다. Ras 포함 플라스미드는 Upstate, Inc.로부터 얻을 수 있다. 활성화된 Ras와 우성 네거티브 Ras 플라스미드는 둘 다 BglII와 BamHI으로 소화되어 CMV 프로모터 인핸서를 제거할 수 있다. 인간 B형 간염 바이러스의 뉴클레오티드 1620부터 1810까지에 상응하는 서열은 pEco63 (ATCC)로부터 PCR 증폭을 통하여 분리할 수 있다. 이 절편은 BglII/BamHI으로 절단된, 활성화된 Ras 포함 플라스미드에 결찰되어 pHBV-Ras가 생성된다 (도 2). pEGSH (Stratagene, under license from SaIk Institute)의 엑디손 유래성 프로모터에 상응하는 서열은 구성물의 일부인 것이 바람직할 때, PCR 증폭에 의해 얻을 수 있고, BglII/BamHI으로 절단된, 우성 네거티브 Ras 포함 플라스미드에 결찰되어 pEcdys-Ras가 생성된다 (도 2).

엑디손 유래성 프로모터, 우성 네거티브 Ras 및 폴리A 첨가 부위를 포함하는 서열은 PCR에 의해 pEcdys-Ras로부터 증폭할 수 있다. 플라스미드 pLS-Ras는 PCR 증폭 생성물의 블런트 말단 결찰에 의해 암피실린 내성 유전자와 HBV 프로모터/인 핸서 사이가 SspI 소화에 의해 선형화된 pHBV-Ras로 구성된다.

(2) 세포 배양

인간 EG 셀 라인은 다른 EG 셀 라인에 대해 설명된 것과 같이 글루타민, 메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 포르스콜린 또는 LIF, 기본 섬유아세포 성장 인자 및 백혈병 억제 인자가 보충된 15% 녹아웃 혈청 대용물 (Invitrogen으로부터)인 KnockOut DMEM 중에서 마우스 STO 공급기 층에서 배양하였다 (미국 특허 5,690,926호; 5,670,372호, and 5,453,357호, de Miguel and Donovan, (2002) Meth. Enzymol. 365, 353-363). EG 셀라인으로부터의 특이한 셀라인의 분리는 pHBV-aRAS 를 ACTEG1 (만능 줄기세포인 인간 생식선 유래 줄기세포)에 일렉트로포레이션을 통해 형질전환함으로써 이루어질 수 있다. 콜로니를 Matrigel 플레이트상에서 G418 내성에 대해 선택한다. ACTEG-RAS는 앞으로의 연구를 위해 선택할 것이다.

분화를 유래하기 위하여, 세포를 Matrigel 코팅된 플레이트로부터 제거하고, 배양물을 방울방울 떨어뜨림으로써 응집체를 형성한다. 2일 후에, 배양체를 수집하고, 세포 배양에 대하여 코팅하지 않는 페트리 접시에 재-플레이트한다. 배양물을 매일 2회 새롭게 공급한다. 12일째에 EB를 수집하고, 5%의 규전된 우혈청이 포함된 Amphioxus Cell Technologies Med3을 포함한 소프트 한천 배지에 현탁한다. 1주일 이내에 콜로니를 한천 배지에서 볼 수 있다. 콜로니를 취하여 Med3, 5% 혈청에 분산시키고, 24웰 플레이트에 플레이트한다. 형질전환된 콜로니가 대부분의 배양체로부터 형성된다. 이들 콜로니는 알부민, cyp1A, cyp3A와 같은 간세포 분화의 마커에 대해서 포지티브였다.

집밀 배양물로부터의 배지를 인간 알부민 형성에 대하여 분석한다. 세포를 트립신으로 처리하고, 간세포 계수기를 사용하여 계수한다. 그런 다음 세포를 충분한 세포 배양 배지에 현탁하여, 현탁액 중의 세포 밀도가 대략 3 세포/ml이 되게 한다. 이 현탁액을 96-웰 플레이트에 웰 당 200㎕씩 일정액을 넣는다. 그 결과의 배양물은 웰 당 하나보다 적은 세포를 가질 것이다. 이런 방법으로 나타난 콜로니는 단일 세포로부터 발생된 것으로 알려진다. 이 클론성 집단은 나중에 균일한 유전적 배경을 가지는 것으로 확인된다.

이것과 동일한 클로닝 단계를 혼합 집단으로부터 특정 세포 유형의 세포를 분리하는 데 사용할 수 있다. 만약 소프트 한천 배지에서 발생한 콜로니가 혼합 계통의 것이라면, 상기에서 설명된 바와 같은 세포의 클로닝은 그것들은 개별적인 균일한 집단으로 나눌 것이다. 그런 다음에 이들 클론에 대해 다양한 메커니즘 중 어떠한 것에 의해서든지 관심의 세포 유형에 대해 조사할 수 있다. 통상적인 방법은 배양물 상층액에 공지의 분비된 단백질이 있는가를 측정하는 것이다. 예를 들어 간세포 콜로니에 대해 알부민을 측정할 수 있다. 특정 세포 유형을 확인하기 위한 다른 방법으로는 형태의 가시적인 조사, 그 세포 유형에 의해 생성된 단백질에 특이한 항체를 사용한 염색 또는 그 세포 유형에 의해 생성된 특이한 RNA의 측정이 있다.

(3) 유전자 전환 경합 라인의 제조

유전자 전환 경합 라인을 제조하기 위하여, ACTEG1 세포를 pERV3 (Stratagene Corp.)으로 형질전환하여 엑디손 수용체를 일렉트로포레이션을 사용하 여 삽입한다. 플라스미드 pERV3 (또는 Invitrogen의 pVgRXR)는 엑디손 민감성 프로모터의 발현에 필요한 하이브리드 엑디손 수용체를 코드화한다. 콜로니를 Matrigel 코팅된 플레이트 상에서 하이그로마이신 내성에 대해 선택할 것이다. 추가의 연구를 위해 ACTEG1-Hyg1을 선택한다. pVgRXR을 사용하는 경우에는 Matrigel 코팅된 플레이트상에서의 제오신 내성에 대해 콜로니를 선택할 수 있다. ACTEG1-Zeo1을 추가의 연구를 위해 선택한다. 형질전환 유전자를 폐쇄시킨 후 셀 라인의 아폽토시스를 설명할 수 있다 (Hilger, RA, et al., (2002) Onkologie 25, 511-518). 엑디손 프로모터 시스템은 우성 네거티브 생성물의 양이 달라지는 농도의 호르몬을 사용하여 조절되거나 적정될 수 있기 때문에 아폽토시스를 예방할 수 있다.

만약 pERV3을 사용했다면 ACTEG1-Hyg1은 일렉트로포레이션을 사용하여 pLS-Ras로 형질전환될 수 있다. G418에 대한 콜로니 내성을 선택하고 연장한다. ACTEG1-HygNeo를 선택한다. 만약 pVgRXR을 사용했다면 ACTEG1-Zeo1을 일렉트로포레이션을 사용하여 pLS-Ras로 형질전환할 수 있다. G418에 대한 콜로니 내성을 선택하고 연장한다. ACTEG1-ZeoNeo (AZN)를 선택한다.

분화를 유래하기 위하여, 세포를 Matrigel 코팅된 플레이트로부터 제거하고, 배양물을 방울방울 떨어뜨림으로써 응집체를 형성한다. 2일 후에, 배양체를 수집하고, 세포 배양에 대하여 코팅하지 않는 페트리 접시에 재-플레이트한다. 배양물을 매일 2회 새롭게 공급한다. 12일째에 EB를 수집하고, 5%의 규전된 우혈청이 포함된 Amphioxus Cell Technologies Med3을 포함한 소프트 한천 배지에 현탁한다. 1주일 이내에 콜로니를 한천 배지에서 볼 수 있다. 콜로니를 취하여 Med3, 5% 혈청에 분 산시키고, 24웰 플레이트에 플레이트한다.

집밀 배양물로부터의 배지를 인간 알부민 형성에 대하여 분석한다. 콜로니는 포지티브여야 한다. 여러 배양물을 선택하고, 제한 희석을 통하여 96웰 플레이트에 클론한다. 셀라인 ACTHep1부터 ACTHep6까지 75cm² 플레이트에서 집밀도로 성장하였고, 그것을 트립신으로 처리한 후 속도 조절 냉동기에서 냉동한 후, 증기 상태의 액체 질소에 보관하였다.

ACTHep1-6을 추가로 특성 확인한다. 각기의 바이알을 녹이고, 상기에서 설명한 바와 같이 Med3, 5% 혈청에 플레이트한다. 세포가 팽창하고, 그런 다음 96웰 플레이트에 웰 당 10,000세포의 밀도로 플레이트한다. 그것을 밤새 인큐베이션한 후, 배지를 10μM 포나스테롬 A가 첨가된 Med3, 5% 혈청으로 바꾼다. 세포는 다음 24시간에 걸쳐 성장을 중지하고 하위집밀 밀도에서 정지해야 한다. 핵이 두드러진 간세포의 주사위뼈 모양을 가지는 세포를 선택한다. 그것들의 간세포로서의 정체성을 알부민 생성, 에톡시레소루핀의 레소루핀으로의 대사 (cyp1A 활성), 및 테스토스테론으로부터 6 베타 히드록시테스토스테론의 형성(cyp3A 활성)에 의해 확인한다 (Kelly, JH, Sussman, NL (2000) J. Biomol. Scr. 5, 249-253).

실시예 2 - CRE / lox 재조합의 역전을 사용하는 인간 간세포 셀 라인의 확인

활성화된 형질전환 유전자의 조직 특이적 발현과 이어지는 Cre 재조합효소 절제를 사용한 인간 간세포 셀 라인을 확인한다. 인간 생식선 유래 줄기세포를 활성화된 H-RAS 유전자를 유래하고, loxP 부위가 양 옆에 있는 인간 B형 간염 바이러 스 프로모터/인핸서를 포함하는 구성물로 형질전환한다. 간세포 계통의 셀라인을 상기에서 설명한 바와 같이 분리한다. 세포를 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드로 형질전환하여 활성화된 발암유전자를 절제한다. Cre-재조합효소 처리한 세포는 분할을 멈추고 분화된 간세포의 마커, 예컨대 알부민 생성, cyp1 및 cyp3 발현을 나타내야 한다.

a) 방법

(1) 플라스미드

위에서 설명한 간세포 특이적 선택 플라스미드, pHBV-aRas를 합성 loxP 올리고머 (SEQ ID NO:5 및 6)의 삽입에 의해 ploxHBV-aRas의 구성에 사용한다. SspI을 사용하여 암피실린 내성 유전자와 HBV 프로모터/인핸서 사이에서 pHBV-aRas를 선형화한다. 올리고머 5' ATT ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA T 3' (SEQ ID NO:5)을 그 안에 결찰시켜서 5' 쪽에 SspI 부위를 재구성한다. 그런 다음 이 플라스미드를 BbsI으로 선형화하고, 올리고머 5' ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TGA AGA C 3' (SEQ ID NO:6)을 그 안에 결찰시켜서 3' 쪽에 BbsI 부위를 재구성한다. 그 결과 생성되는 플라스미드, ploxHBV-aRas를 도 4에 도시한다.

(2) 세포 배양

인간 EG 셀라인 ACTEG-1을 위에서 설명한 것과 같이 배양한다. 플라스미드 ploxHBV-aRas를 일렉트로포레이션을 사용하여 ACTEG-1에 형질전환하고, G418 내성을 사용하여 선택한다.

간세포 콜로니를 분화 후에 위에서 설명한 바와 같이 분리하고, 소프트 한천 배지에서 선택한다. 셀라인 Heplox1부터 Heplox6까지를 팽창시키고 냉동한다.

Heplox1은 팽창할 수 있다. 세포를 Med3, 5% 규정된 우혈청에서 10,000세포/cm²의 밀도로 플레이트한다. CMV 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소 유전자를 포함하는 플라스미드 pBS185를 일렉트로포레이션에 의해 HepLOX1에 도입한다. 2일 동안 전체 세포는 분할을 중지해야 한다. 배양물을 알부민 생성, cyp1A 및 yp3A 활성에 대해 상기와 같이 분석한다.

ploxHBV-aRas의 절제는 100% 효과적인 것 같지는 않다. 배양 시간에 따라 절제된 형질전환 플라스미드를 갖지 않는 콜로니가 나타나게 된다. 다른 방법, 예컨대 간시클로비어에서의 이차 선택을 사용하여 절제된 세포를 100% 선택할 수 있다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자는 인간 세포에서 간시클로비어에 민감성을 부여한다. 만약 HSV-TK 유전자가 원래의 선택 플라스미드에 포함되었다면 플라스미드를 보유하는 세포는 간시클로비어가 존재할 때 죽을 것이다. CRE 재조합효소를 사용하여 형질전환을 역전시키고, 간시클로비어 중에서 배양함으로써, ploxHBV-aRas가 결실되어 있는 세포들만이 생존하였다. 형질전환은 가역적이다. 검토해야 할 특성은 하위집밀 밀도에서 세포의 정지, 간에 특징적인 특이적 발현의 증폭이다. PCNA 및 BrdU 염색을 통한 세포 분할의 측정; 알부민 ELISA, 에톡시레소루핀 대사, 디벤질플루오레신 대사가 일어날 수 있다.

실시예 3 - 온도 민감성 형질전환 유전자를 사용하는 인간 간세포 셀라인의 확인

조직 특이적 프로모터와 온도 민감성 형질전환 유전자의 발현을 사용하여 인간 간세포 셀 라인을 확인할 수 있다. 인간 생식선 유래 만능 줄기세포를 온도 민감성, 활성화된 RAS 유전자 (SEQ ID NO:7)를 유래하는 인간 B형 간염 바이러스 프로모터를 포함하는 플라스미드로 형질전환한다 (DeClue et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3132-3138). 배양체를 37℃에서 12일 동안 분화시킨 후, 콜로니를 소프트 한천 배지에 분산시키고 32℃에서 인큐베이션한다. 간세포 계통의 세포들을 위에서 설명한 바와 같이 분리한다. 이들 세포의 배양물을 다시 플레이트하고 39℃로 옮겼을 때 그것들은 분할을 정지하고 인간 간세포의 마커, 예컨대 알부민, cyp1A 및 cyp3A를 발현한다.

a) 방법

(1) 플라스미드

aRAS의 세린39를 올리고뉴클레오티드 특정 돌연변이생성에 의해 Cys39로 돌연변이화한다 (Promega). 활성화된 RAS를 pHBV-aRAS로부터 EcoRI에 의해 절제하고, 선택가능한 플라스미드 pALTER1에 하위클론한다. 올리고뉴클레오티드 5'-GAATACGACCCCACTATAGAGGATTGCTACCGGAAGCAGGTGGTCATTGAT-3'을 사용하여 세린 39를 시스테인 39로 바꾼다 (SEQ ID NO:8). 항생물질 선택을 통하여 적절한 플라스미드를 취하고, 삽입물을 가로질러 서열화하여 정확성을 확인한다. 새롭게 tsaRAS로 명명한 돌연변이된 aRAS를 EcoRI을 사용하여 pALTER 플라스미드로부터 절제하고, 그것을 EcoRI으로 절단된 pHBV-aRAS에 삽입하여 pHBV-tsaRAS를 제조한다.

(2) 세포 배양

인간 생식선 유래 만능 줄기세포 셀 라인 ACTEG-1을 위에서 설명한 바와 같이 배양한다. 플라스미드 pHBV-tasRAS를 일렉트로포레이션을 사용하여 형질전환하고 G418 내성 콜로니를 선택한다. 위에서 설명한 것처럼 분화시킨 후, 소프트 한천 배지 플레이트를 32℃에서 인큐베이션하여 형질전환된 인간 간세포 라인을 분리한다. ACTTSHep1부터 6까지를 분리하여 클론하고 냉동한다. ACTtsHep1을 추가의 특성확인을 위해 선택한다. 32℃에서 배양된 세포를 트립신으로 처리하고, 10,000세포/cm²으로 플레이팅한 후, 39℃에서 인큐베이션한다. 세포는 2일 이내에 분할을 멈추고, 하위집밀 밀도에서 정지하며, 알부민, cyp1A 및 cyp3A와 같은 인간 간세포의 마커를 발현한다.

다중 세포 유형을 가역성 형질전환 유전자의 조직 특이적 발현을 사용하여 선택한다. RAS 또는 다른 어떤 형질전환 유전자를 사용하여 다른 여러 세포 유형을 분리한다. 분리된 세포의 분석은 선택된 세포 유형의 특징적인 마커의 발현을 분석하는 것을 포함한다.

실시예 4 - 간 보조 장치의 토대를 형성하기 위한 중공 섬유 생체반응기에서의 본원에 개시된 간세포 라인들 중 하나의 배양

a) 방법

ACTHep1과 ACTtsHep1을 Amphioxus Cell Technologies 인간 간세포 라인 HepG2/C3A (Sussman et al, Hepatology 16, 60-65, 1992)의 배양에 대해 상기에서 설명한 것과 같이 중공 섬유 생체반응기에서 본질적으로 배양한다. 간단히 설명하 자면, 세포를 혈청 포함 배지를 사용하여 롤러 병에서 배양한다. 약 1g의세포를 포함하는 두 개의 병을 각각 트립신으로 처리하고, 50ml의 배지에 현탁한 다음, 중공 섬유 카트리지의 모세관 바깥쪽에 접종한다. 이들 카트리지를 자동 시스템, 예컨대 Cellex Maximizer 시스템에서 유지한다. 접종 후에 이들 카트리지를 혈청이 없고 인슐린을 포함한 배지에서 대략 2주 동안 배양하였고, 그 시간 동안 세포는 배양 공간을 채울 정도로 증식한다. 글루코스 소모와 알부민 생성을 매일 모니터한 결과, 하루에 약 12g의 글루코스를 소모하고 1g 이상의 인간 알부민이 생성된 시점이 피크였다 (Kelly, (1997) IVD Technology 3, 30-37).

HepG2/C3A를 이들 장치에 사용하여, 간 특이적 생화학을 복제하는 능력의 특성을 집중적으로 확인한다. ACTHep1과 ACTtsHep1 셀라인으로 채워진 장치에 대한 유사한 분석을 수행한다. 이들 연구는 성장 곡선 및 배지 소모율과 같은 기본을 사용하여 시작한다. 그것들이 종양 유래 라인과 얼마나 유사한지를 측정한다. 예를 들어 HepG2/C3A는 이들 장치에서 본질적으로 무한정 유지될 수 있다. 종양 유래 라인을 사용하면, 세포 죽음이 새로운 세포에 의해 대체되는 어떤 꾸준한 상태가 수립되는 것이 명백하다. 꾸준한 상태를 이루기 위해 필요한 ACTHep1 세포의 양을 측정하고, 세포가 형질전화되지 않고 전환 후에는 장치에서 무한하게 분할하지 않을 것이기 때문에 새로운 세포를 첨가한다. 이들 장치의 우레아 생성을 경유하는 암모니아 대사 능력, 리도카인, 카페인 및 미다졸람과 같은 약물의 대사 능력, 피루브산염 및 락트산염으로부터 글루코스를 합성하는 능력 및 알부민, 트란스페린 및 인자 IX와 같은 혈청 단백질 생성 능력을 측정한다.

실시예 5 - 독물학 시험에 사용하기 위한 다중 조직 유형을 포함하는 매치된 라인의 패널 제조

a) 방법

상기에서 제조한 플라스미드는 새로운 셀라인을 선택하기 위한 기초를 형성한다. 조직 특이적 프로모터/인핸서를 적절한 조직에 대하여 선택한 후 HBV 서열 대신 플라스미드로 스플라이싱한다. 표시될 수 있는 조직은 예컨대 간, 신장, 심장, 뇌, 근육 및 장이다. 다중 세포 유형, 예컨대 뇌가 포함되는 경우 여러 개의 라인, 예컨대 뉴런, 올리고 수지상 돌기, 등이 선택된다. 이들 셀라인의 각각은 위에서 설명한 바와 같이 동일한 만능 줄기세포, 예컨대 인간 EG 셀라인 ACTEG1으로부터 생성된다. 그러므로 세포 패널은 동일한 유전형을 가지며, 그것은 많은 장점을 제공한다.

실시예 6 - 시험관내 면역 시스템 ( IVIS )의 제조

단클론성 항체 기술 (MAB)은 25년도 더 전에 쾰러와 밀스타인에 의해 개발되었다 (Kohler and Milstein, (1975) Nature 256, 495-497). 그럼에도 불구하고, 여전히 상대적으로 소수의 MAB만이 치료적 용도에 사용된다. 그것의 주요 문제점은 마우스 단클론성 항체가 외래 물질로서 인식되어 치료제로서는 짧은 유용한 반감기를 갖는 것이다. 현재 시판되는 MAB는 항체 유전자에 인간 항체에서 발견되는 아미노산을 마우스에서 발견되는 아미노산 대신 치환한 돌연변이의 도입에 의해 "인간화된" 것이다.

완전한 인간 단클론성 항체의 제조는 여러 문제들에 의해 방해를 받아왔다. 마우스 단클론성 항체는 항원을 마우스에 주사한 후 그것의 비장을 여러 날 후에 제거하여 마우스 골수종과 융합시켜서 불멸화한다. 그러나 항원을 인간에게 주사하는 것은 일반적으로 가능하지 않으며 시도했던 몇몇 경우에도 실패하였다. 또한 현재의 기술로는 인간의 비장을 제거하지 못하고, 따라서 말초 혈액 세포를 사용할 필요가 있다. 마지막으로 적당한 인간 골수종은 분리하기가 매우 어렵다.

IVIS는 이들 문제점을 시험관에 전체 인간 항체 생성 시스템을 옮겨놓음으로써 우회한다. 본원에서 논의된 바와 같은 줄기세포, 예컨대 만능 배아줄기세포 또는 EG 세포를 사용하여 출발하여 매치된 T 세포, B 세포 및 대식세포 라인을 개발할 수 있다. B 및 T 세포를 적절한 분화 단계에서 선택하여 항원으로 프라임한다. 세 개의 셀라인이 동일한 어버이 라인으로부터 개발될 것이기 때문에, 그것들은 동일한 유전적 배경을 가지며, 인간의 자체 면역 시스템과 정확히 유사하다. 세포는 상호간에 인식할 수 있고, B 세포 증식과 항체 합성을 자극하는 복잡하고 협력적인 방식으로 행동한다. 분리 과정이 조건적으로 B 세포를 불멸화하기 때문에 항체 생성 세포를 분리한 후 실험실로부터 생성 규모로, 어떠한 필요한 양으로 성장시킨다.

a) 방법

(1) 플라스미드

각각의 필요한 플라스미드를 활성화된 ras와 우성 네거티브 ras를 포함하는 pLS-RAS로부터 제조한다. B 세포를 선택하기 위하여 pB-RAS를 HBV 프로모터/인핸서를 먼저 BamHI을 사용하여 절제함으로써 구성한다. 인간 면역글로불린 중쇄 프로모 터를 그 부위에 결찰시켜서 pB-RAS를 형성한다. 유사한 구성물을 preT 세포 프로모터를 사용하여 제조함으로써 T 세포를 선택하고 (pT-RAS) 인간 CHI 3L1 유전자 프로모터를 사용하여 대식세포를 선택한다. B, T 및 대식세포 라인의 지시된 분화에 필요한 골수 간질 셀라인을 골수 간질 세포 항원 1 (BST1) 유전자로부터의 프로모터를 사용하여 선택한다.

(2) 골수 간질 세포 선택

BST1 프로모터를 Bam/BglII 절단된 pLS-RAS에 결찰하여 pBST-RAS를 제조한다. 이것을 ACTEG-1에 형질전환하고, 분화를 EB 형성을 통해 야기한다. 그 결과의 골수 간질 셀라인, ACT-BMST1은 EB 형성 후 5일 후에 발생하였고 (Kramer et al, Meth. Enzymol. 365, 251-268, 2003), BST1의 발현에 의해 특성확인된다.

(3) B 세포 선택

B 세포를 ACTEG-1으로부터 발달시킨다. 플라스미드 pB-RAS를 위에서 설명한 바와 같이 줄기세포 안에 형질전환한다. 형질전환된 줄기세포로부터의 B 세포 분화는 설명된 바와 같이 개시된다 (Cho, SK, Zuniga-Pflucker, JC Meth. Enzymol. 365, 158-169, 2003). 인간 ACT-BMST1을 마우스 OP9 간질 라인에 대해 치환한다. 인간 Ig 중쇄 프로모터를 B 세포에 대해 어떠한 발달 단계에서 선택한다. 여러 라인을 Ig 경쇄 생성에 대해 특성확인하여 적절한 발달 단계에 있는 B 세포를 분리한다.

(4) T 세포 선택

T 세포를 preT 세포 수용체의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 형질전환에 의하여 ACTEG-1으로부터 발달시킨다. 이 줄기세포 라인을 분리한 후, T 세포의 분화를 설명된 바와 같이 수행한다 (Schmitt et al. Nat. Immunol. 5, 410-417, 2004). ACT-BMST1을 마우스 OP9 간질 라인에 대해 치환한다. 성숙한 T 세포를 CD4 및 CD8 항원의 발현에 의해 특성확인한다.

(5) 대식세포 선택

인간 대식세포 라인을 ACTEG-1으로부터 ras를 유래하는 CHI 3L1 유전자에 대한 프로모터를 포함하는 플라스미드의 형질전환에 의해 발달시킨다. 대식세포 콜로니는 6일째의 배양체에서 풍부하다 (Kennedy and Keller, Meth. Enzymol. 365, 39- 59, 2003).

(6) 시험관내 면역 시스템

각각의 개별적인 라인을 클론하고, 특성확인한 후 냉동한다. 불멸화되고 매치된 B, T 및 대식세포 라인을 24웰 플레이트에서 매치된 ACT-BMST1 라인상에서 배양한다. 항원은 2주 동안 매 3일마다 신선한 세포 배양 배지와 함께 첨가한다. 그때 및 2주 후에 상층액을 효소 결합 면역분석에 의해 항원 특이적 항체의 존재에 대해 분석한다. 항체를 검출한 후 웰의 개별적 세포를 희석하고 클론한다. 일단 수립되면, 각 B 세포 클론으로부터 항체는 계속 생성된다. 적절한 항원을 발현하는 클론을 추가의 특성확인 또는 생성에 대해 냉동한다.

실시예 7 - 인간 배아 생식 셀라인 Hay1 의 수립

문헌에 규정된 기법을 사용하여 인간 EG 라인을 수립하였다 (Matsui, et al., (1992) Cell 70, 841-847). 간단히 설명하자면, 생식선을 10주 된 남성 태아 로부터 절개하여 트립신-EDTA를 사용하여 분리한 후, 빛을 조사한 STO 공급기 층 위에 플레이트하였다. 세포에 매일 비-필수 아미노산과 -메르캅토에탄올, 60ng/ml의 인간 줄기세포 인자 (SCF), 10ng/ml의 인간 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 10ng/ml의 인간 기본 섬유아세포 성장 인자 (FGF)가 보충된 DMEM, 15% 우태아혈청을 공급하였다. 5일째에 두 개의 플라스크 중 하나를 알칼리 포스파타제에 대해 염색하였다. 많은 포지티브 세포를 관찰하였다. 세포를 트립신-EDTA로 6일째에 계대하고, 새롭게 조사된 STO 층 위에서 1 내지 4개로 분리하였다. 이 과정을 반복하고, 각 계대마다 알칼리 포스파타제 염색도 수행하였다. 5계대 째에 여러 바이알의 세포를 DMEM, 15%의 우태아혈청, 10%의 디메틸술폭시드에 속도 조절 공급기를 사용하여 냉동하였다. 세포는 기본적으로 미토마이신 C 처리된 STO 층에 계대되어 있다.

a) Hay1 의 특성

공급기 층이나 플라스틱 위에 있는 Hay1 세포는 둘 다 아래에서 설명되는 바와 같이 이주성 원시 생식 세포와 비슷한 신장된 세포로서 성장한다 (Shamblott et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 13726 - 13731; Turnpenny et al. (2003) Stem Cells 21, 598 - 609). Hay1은 턴페니 (Turnpenny)등에 의해 설명된 세포와 동일한 형태를 나타낸다. 알칼리 포스파타제 외에 세포는 SSEA-1, TRA 1-60 및 TRA 1-80에 대해서도 포지티브로 염색된다. 인간 EG 세포는 인간 ES 세포와는 달리 SSEA-1을 발현하는 것이 특징이다. 핵형과 다중-조직 종양 형성을 특정하는 것은 진행중이다. 공급기 또는 호르몬 보충이 없을 때 플라스틱에 부착되는 것을 낮추기 위해 전환될 때 그것들은 쉽게 포낭성 배양체를 형성한다. 이들 배양체가 조직 배 양 플라스틱에 다시 플레이트되면 세포는 극적으로 상이한 형태를 나타내고 알칼리성 포스파타제의 발현은 잃게 된다.

b) 규정된 조건에서 Hay1 의 배양

공급기 층의 사용은 다양한 용도에 대하여 줄기세포의 사용을 복잡하게 한다. 공급기 층의 사용은 표준 시험관내 독물학 분석에서 바탕값을 극적으로 상승시키는데, 예컨대 MTT 또는 레사주린이 감소되어 결과를 혼란스럽게 한다. Hay1은 기본적으로 규정된 조건하에서 성장한다. 표준 배지는 KO-DMEM, 15% KO-혈청 대체물, 글루타민, 비필수 아미노산, β-MeSH, 10ng/ml의 온코스타틴 M, 10ng/ml의 SCF 및 25ng/ml의 bFGF로 구성된다. 이 배지를 사용하여 Hay1은 계속해서 위에 열거한 마커를 발현하고, 대략 매 3일 내지 4일마다 배가된다. 이것은 그것들이 공급기 층에서 배가되는 것보다는 약간 느리다.

c) Hay1 은 Oct4 와 Nanog 를 발현한다

표면 마커와 알칼리성 포스파타제는 줄기세포에 대해서는 편리한 마커인 한편, 전사 인자 Oct4와 Nanog의 발현은 줄기세포의 기본적인 특징이라는 것이 명백하다 (Rodda et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 24731-24737; Chambers et al. (2003) Cell 113, 643-655). Hay1을 실시간 RT-QPCR을 사용하여 이들 인자의 발현에 대하여 조사하였다. 표준 규정 조건하에서 세포의 발현을 EB 형성을 통해 분화할 수 있는 세포에서의 발현과 비교하고, Weymouth's MAB, Ham's F12 및 William's E의 혼합물인 배지, Med3에서 배양하였다 (Kelly and Sussman, (2000) J. Biomol. Screen. 5, 249-254). 배지는 또한 5% 규정된 소혈청 (Hyclone)을 포함한다. 액틴 을 표준으로서 사용하였다. 그 결과는 Oct4와 Nanog 둘 다 Hay1에서 발현하고, 발현은 분화시에 극적으로 감소되는 것을 보여준다.

d) Hay1 은 성장에 대해 gp130 신호화에 의존한다

Hay1의 성장을 줄기세포 성장 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 다양한 조건하에서 조사하였다. 마우스 및 인간 EG 세포는 배양중의 성장을 위해 gp130 신호화의 공급원을 필요로 한다 (Shamblott et al. (1998); Koshimuzu et al. (1996) Development 122, 1235-1242). 각각의 3 펩티드 호르몬 인자 (Onc M, SCF, bFGF)를 개별적으로 배지로부터 제거하였는데, 각각은 약간씩 성장에 영향을 미쳤다. 그러나 온코스타틴 M의 제거는 배양물의 성장을 완전히 정지시켰고, 그것들은 수일 이내에 알칼리 포스파타제에 대해 네거티브가 되었다.

e) FGF 는 Oct4 와 Nanog 를 유래한다

배양물로부터의 FGF의 제거는 배양물의 성장에는 약간 부정적인 영향을, 형태에도 영향을 미쳤고, 세포는 더 편편해졌으며 접시위로 더 퍼졌다. 배양물을 FGF 철회후에 Oct4 및 Nanog 발현에 대하여 조사하였고, 발현의 극적인 감소를 관찰하였다. FGF의 대체는 Oct4 발현을 그것의 이전 수준으로 되돌려 놓았다. Oct4가 Nanog 발현을 조절하기 때문에 (Rodda et al. (2005)), Oct4의 유래는 또한 nanog를 상승시킬 것이며, 이것은 관찰되었다.

f) 제오신 민감성

frt 삽입물 라인의 수립을 위해, Hay1의 제오신에 대한 민감성을 시험하였다. 표준 적정 곡선은 효과적인 선택 농도는 75㎍/ml임을 나타냈다.

실시예 8 - 심근세포의 유래

a) frt 삽입 ( FI ) 셀라인 FI Hay1 의 생성

플라스미드 pFrt/lac/Zeo (Invitrogen)를 리포펙타민 2000을 사용하여 Hay1에 형질전환한다. 48시간 후에 내성 세포를 75㎍/ml의 제오신 (Invitrogen)을 포함하는 배지로 교환함으로써 선택한다. 비-내성 세포는 약 7일 내에 죽는다. 약 1×10^-5/㎍의 효능이 예상된다. 대략 10개의 개별적인 형질전환체를 선택하고 lacZ의 발현에 대하여 시험한다. 플라스미드의 복사물 수는 서던 블롯팅을 통하여 평가한다. 단일 삽입물을 가지는 형질전환체를 추가의 분석을 위해 선택한다. 분화중에 삽입물의 행동을 조사하기 위하여 세포를 EB 형성되게 한 후, Mde3, 5% 규정 소혈청에서 1주일 동안 배양한다. 그것을 lacZ 발현에 대해 재평가한다. Zeo 선택이 유지될 수 있기 때문에 모든 생존 세포는 lacZ 발현을 보유할 것으로 예상된다. 주변 DNA의 발현을 보장하기 위하여 삽입물에 대한 선택적인 압력을 유지하는 것은 다른 많은 연구에서 성공적으로 사용되었던 바와 같이 일반적인 방법이다 (Zweigerdt et al, (2001) Cytotherapy 5, 399-413; Liu et al. (2004) Stem Cells Dev. 13, 636-645; Schuldiner et al., (2003) Stem Cells 21, 257-265).

그런 다음 10개의 클론을 그것들의 삽입 부위에 대하여 평가한다. 이상적인 클론은 DNA를 게놈의 어떤 풍부한 또는 비기능적인 절편에 통합할 것이다. 마지막에 이것은 다소 주관적인 평가일 수 있는 반면, 나중에 분화된 클론의 분리를 간섭할 수 있을 기능성 유전자에 부위가 통합되지 않았다는 것은 중요하다. DNA를 세포 로부터 분리하고 삽입된 DNA를 어떤 주변 서열과 함께 플라스미드 구조에 의해 회수한 다음 서열화한다 (Organet al., (2004) BMC Cell Biology 5, 41). 통합 부위는 인간 서열 데이터베이스와 비교함으로써 측정한다.

b) 테트라사이클린 오퍼레이터 frt 삽입 셀라인 TOFI Hay1 의 생성

위에서 설명된 바와 같이 제조된 셀라인을 위에서 설명한 것처럼 리포펙타민을 사용하여 pcDNA6/TR^ⓒ (Invitrogen)으로 형질전환하고, 블라스티시딘 내성에 대해 선택한다. 이 플라스미드는 CMV 프로모터의 조절 하에 테트라사이클린 억제제를 발현한다. 다중 클론을 위에서 설명한 바와 같이 선택적인 압력하에 연속 발현에 대하여 평가한다. 위에서처럼, 삽입 부위는 추가의 평가를 위해 적절한 클론을 선택하는 것으로 평가할 수 있다.

frt 삽입 클로닝의 효능을 키트로 공급된 조절 플라스미드인 pcDNA5/Frt/TO/CAT를 사용하여 평가한다. 플라스미드 pcDNA5/Frt/TO (Invitrogen)은 나중의 선택 연구에 사용될 frt 표적화 플라스미드이다. 그것은 테트라사이클린 조절된 CMV 프로모터의 3' 바로 옆에 있는 클로닝 부위를 포함한다. 클로르암페니콜 아세틸 트란스페라제 (CAT)를 이 플라스미드에 삽입하여 대조표준으로 한다. 플라스미드 pcDNA5/Frt/TO/CAT를 TOFI Hay1 라인에 pOG44 (Invitogen)과 함께 공-형질전환하여 일시적으로 flp 재조합효소를 발현하게 한다. frt-CAT 플라스미드는 TOFI Hay1의 frt 삽입 부위를 표적으로 할 것이고, 재결합하고 통합할 것이다. 삽입물은 그것이 Zeo 내성은 파괴하지만 그것을 사용하여 하이그로마이신 내성을 운 반할 수 있도록 배열된다. 성공적으로 표적화된 클론은 하이그로마이신 및 블라스티시딘 내성이지만 Zeo에는 민감할 것이다.

frt 중재된 재조합의 효능을 pcDNA5/Frt/TO/CAT의 마이크로그램 당 얻어진 하이그로마이신 내성, 블라스티시딘 내성 클론의 수를 조사함으로써 평가한다. 삽입된 CAT 유전자의 발현의 효능을 상기에서 설명한 분화 프로토콜을 사용하여 평가한다. 프로토콜의 두 가지 변형을 수행하였는데, 하나는 전 과정을 통하여 테트라사이클린이 존재하고, 하나는 분화가 일어난 후에만 테트라사이클린을 첨가한다.

c) 선택자 플라스미드의 구성

선택자 플라스미드를 Invitrogen으로부터의 Multisite Gateway 3 단편 벡터 구성 시스템을 사용하여 구성한다 (Hartley et al., (2000) Genome Res. 10, 1788 - 1795). 이 시스템은 질서정연한 서열로 단편을 클론하고 재조합하기 위하여 부위 특이적 람다 인티그라제 및 단백질을 사용한다. 활성화된 ras 및 우성 네거티브 ras는 Upstate Biotechnology로부터 얻었다. 람다 인티그라제 부위를 통합하는 특이한 프라이머를 사용하여 a-ras와 dn-ras 서열을 증폭하였다. 그런 다음 이것들을 인티그라제 시스템을 사용하여 키트에서 특이한 플라스미드에 클론할 것이다.

인간 α-MHC 프로모터의 -454부터 +32까지의 서열은 고수준의 조직 특이적 발현을 지시하는 것으로 밝혀졌다 (Yamauchi-Takihara et al. (1989) Proc. Natl, Acad. Sci. 86, 3504-3508; Sucharov et al. (2004) Mol. Cell. Biol. 24, 8705-8715). 이 서열을 인티그라제 부위와 함께 Multisite Gateway 키트에서 세 번째 플라스미드에 클론한다. 그런 다음 이들 서열을 네 번째 플라스미드에서 재조합하여 유전자 순서가 "dn-ras-α-MHC 프로모터-a-ras"인 클론을 생성한다.

프로모터를 가로질러 dn-ras로부터 a-ras 유전자의 끝까지 연장되어 있는 서열을 PCR을 통하여 증폭하고, 토포이소메라제 클로닝을 사용하여 pcDNA5/Frt/TO에 클론함으로써 TOFI HaY1 부위에 frt 재조합 부위안에 삽입할 준비가 되어 있는 선택자 플라스미드를 생성한다. 이것을 심장 선택자 플라스미드로 명명한다.

d) 심장 선택성 줄기세포 라인의 생성

심장의 선택자 플라스미드를 TOFI Hay1에 pOG44와 함께 형질전환함으로써 일시적으로 flp 재조합효소를 발현한다. 상기에서 언급된 바와 같이, frt 부위 안으로의 재조합은 하이그로마이신 내성 유전자를 삽입시키고 제오신 내성을 파괴한다. 적절한 재조합체는 블라스티시딘 내성, 하이그로마이신 내성 및 Zeo 민감성이 될 것이다. 클론을 블라스티시딘/하이그로마이신에서 선택한 후 제오신 민감성에 대해 시험한다. 플라스미드 구조 및 서열화를 사용하여 정확한 DNA 서열이 구성되었는지를 증명한다. 이 세포는 유전자 순서가 "CNV 프로모터-TO 조절된 억제제-dn-ras-α-MHC 프로모터-a-ras"인 삽입물을 가지게 된다. 이 셀라인을 Hay1-cardio로 명명한다.

e) 심근세포 셀라인의 확인 및 클로닝

분화는 Hay1-cardio에서 하이그로마이신/블라스티시딘이 포함된 Med3, 5% 규정 소혈청에서 배양체를 형성함으로써 개시된다. 4일 후에 배양체를 조직 배양 플라스틱에 놓아 부착시키고 동일한 배지를 공급한다. 박동하는 세포의 패치는 대략 14일 후에 그러한 분화하는 Hay1을 나타낸다. 배양물을 박동하는 영역의 외관에 대 해 관찰하였지만, 심근세포의 ras 형질전환은 박동을 차단하는 것으로 밝혀졌다 (Engelmann et al. (1993) J. Mol. Cell. Cardiol. 25, 197-213). 선택자가 없는 TOFI Hay1의 매치된 배양물을 심장 분화의 개시의 표시자와 나란히 함께

심장 분화가 배양물에서 검출될 때 세포를 트립신으로 처리하고, 동일한 Med3 기초 배지를 구성하는 소프트 한천 배지에 놓는다. 다른 a-ras 형질전환된 라인을 사용한 대조 실험은 콜로니가 1주일 이내에 확인할 수 있어야 한다는 것을 시사한다. 콜로니를 골라서 신선한 배지에 분산시키고, 조직 배양 플라스틱에 다시 플레이팅한다. 세포를 심근세포 특이적 마커, 예컨대 확실한 α-MHC뿐만 아니라 a-ras의 발현에 대해서도 분석한다.

f) "정상" 심근세포로의 역전

배지에 1㎍/ml의 테트라사이클린을 첨가하면 테트라사이클린 억제제를 방출하고 dn-ras의 전사가 활성화된다. 예시적인 실험을 사용하여 dn-ras의 효과와 형질전환을 역전시키지만 세포를 죽이지 않거나 심장 기능을 파괴하지 않게 하기 위하여 배양물에 첨가될 적절한 양을 측정한다. 적절한 조절의 명백한 지시자는 배양물 내에서 동시에 일어나는 박동의 개시일 것이다.

참고문헌

SEQ ID NO:1은 인간 B형 간염 바이러스 코어 프로모터/인핸서이다. SEQ ID NO:2는 활성화된 H-RAS 유전자이다. SEQ ID NO:3은 엑디손 유래성 유전자 전환 프로모터이다. SEQ ID NO:4는 우성 네거티브 H-RAS 유전자이다. SEQ ID NO:5는 Cre-lox 부위를 구성하기 위해 사용된다. SEQ ID NO:6은 Cre-lox 부위를 구성하기 위해 사용된다. SEQ ID NO:7은 온도 민감성, 활성화된 RAS 유전자이다. SEQ ID NO:8은 활성화된 ras의 세린39를 시스테인39로 바꾸기 위한 올리고이다. SEQ ID NO:9는 -908부터 +14까지의 지방세포 인간 아디포넥틴 유전자 서열이다 (Iwaki, M., et al. Diabetes 52, 1655 - 1663, 2003). SEQ ID NO:10은 -137부터 -37까지의 인간 알파-1-항트립신 프로모터 서열이다. SEQ ID NO:11은 -434부터 +12까지의 인간 알부민 유전자 서열이다. SEQ ID NO:12는 -357부터 +40까지의 인간 미오신 경쇄 유전자 VLC1 서열이다 (Kurabayashi, M., el al. J. Biol.Chem. 265, 19271-19278, 1990). SEQ ID NO:13은 -176부터 +70까지와 -2140부터 -1894까지의 246bp를 포함하는 인간 로돕신 유전자 서열이다 (Nie, Z., et al. J. Biol.Chem. 271, 2667-2675, 1996). SEQ ID NO:14는 -547부터 +33까지의 인간 E 셀렉틴 유전자 서열이다 (Maxwell, IH, et al. Angiogenesis 6, 31-38, 2003). SEQ ID NO:15는 -279부터 +5까지와 상류 인핸서 서열이 포함된 인간 preT 세포 수용체 서열이다 (Reizis, B, P. Leder. J. Exp. Med., 194, 979-990, 2001). SEQ ID NO:16은 -308부터 +2까지의 인간 CHI 3L1 유전자이다 (Rehli, M., et al. J. Biol. Chem. 278, 44058-44067, 2003). SEQ ID NO:17은 -3.7kb로부터의 인간 우로모듈린 유전자 프로모터 서열이다 (Zbikowska, HM, et al. Biochem. J. 365, 7-11, 2002). SEQ ID NO:18은 -302부터 +320까지의 인간 글루타메이트 수용체 2 유전자 (GluR2) 서열이다 (Myers, SJ, et al. J. Neuroscience 18, 6723-6739, 1998). SEQ ID NO:19는 -296부터 +13까지의 인간 계면 단백질 A2 (SP-A2) 서열이다 (Young, PP, CR Mendelson Am. J. Physiol. 271, L287-289, 1996). SEQ ID NO:20은 -279로부터의 인간 인슐린 유전자 서열이다 (Boam, DS, et al. J. Biol. Chem. 265, 8285-8296, 1990). SEQ ID NO:21은 -978부터 +1까지의 인간 빠른 골격근 트로포닌 C 유전자 서열이다 (Gahlmann, R, L. Kedes J. Biol. Chem. 265, 12520-12528, 1990). SEQ ID NO:22는 1610부터 1810까지의 인간 B형 간염 바이러스 서열이다 (Gabriela Kramer, M., et al. Molecular Therapy 7, 375-385). SEQ ID NO:23은 B 세포 인간 면역글로불린 중쇄 프로모터이다 (Staudt, L.M., Lenardo, M.J. Ann. Rev. Immunol. 9, 373-398, 1991 Gene name: IGH@ Genbank: None). SEQ ID NO:24는 재조합 후 좌측 후방에 있는 서열인 Lox 서열이다. SEQ ID NO:25는 frt 서열이다. SEQ ID NO:26은 pEGSH로, 4829 bp이다. SEQ ID NO:27은 pERV3로, 8433 bp이다.

표 3

본 발명의 개시된 방법에 의해 특정 세포, 특정 조직의 세포, 특정 세포 유형 및/또는 특정 세포 계통의 세포들이 줄기세포로부터 얻어질 수 있고, 본 발명에 개시된 방법은 그것에 의하여 관심의 분화된 세포가 줄기세포 및 관심의 대상이 아닌 분화된 세포로부터 선택 또는 스크린될 수 있는 특징 또는 특성 (마커의 발현 또는 비-발현)을 제공하는 장점을 갖는다. 따라서 본 발명에 의해 다량의 분화된 세포를 얻을 수 있고, 그것을 인간을 대상으로 한 치료에 적용할 수 있다.

Claims (75)

1. 핵산 절편을 포함하는 만능 줄기세포로서, 상기 핵산 절편은 구조 P-I를 포함하고, 상기 P는 전사 조절 요소이며, I는 마커를 코드화하는 서열이고, 이때 마커는 형질전환제를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
2. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 절편이 이종성 핵산 절편인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
3. 제 1항에 있어서, 상기 핵산 절편이 외인성 핵산 절편인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
4. 제 1항에 있어서, 상기 마커가 이종성인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
5. 제 1항에 있어서, 상기 P와 I가 동일한 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
6. 제 1항에 있어서, 상기 P와 I가 상이한 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
7. 제 1항에 있어서, 상기 I가 이종성 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
8. 제 7항에 있어서, 상기 핵산 절편이 추가로 자살 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
9. 제 7항에 있어서, 상기 P가 조직 특이적 전사 조절 요소인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
10. 제 7항에 있어서, 상기 P가 세포 유형 특이적 전사 조절 요소인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
11. 제 7항에 있어서, 상기 P가 세포 계통 특이적 전사 조절 요소인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
12. 제 7항에 있어서, 상기 P가 세포 특이적 전사 조절 요소인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
13. 제 7항에 있어서, 상기 P가 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 것을 유발하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
14. 제 7항에 있어서, 상기 마커가 온도 수용성 불멸화 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
15. 제 7항에 있어서, 상기 형질전환 제제가 온도 수용성 제제인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
16. 제 7항에 있어서, 상기 I가 SV40 라지 T 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
17. 제 7항에 있어서, 상기 핵산 절편의 양 옆에 부위-특이적 절제 서열이 있는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
18. 제 7항에 있어서, 상기 I의 양 옆에 부위-특이적 절제 서열이 있는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
19. 제 7항에 있어서, 상기 P의 양 옆에 부위-특이적 절제 서열이 있는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
20. 제 7항에 있어서, 상기 핵산 절편이 추가로 X를 포함하고, 이 X는 부위-특이 적 절제 서열이며, X는 P-I의 양 옆에 있어서, 상기 핵산 절편이 구조 X-P-I-X를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
21. 제 20항에 있어서, 상기 핵산 절편이 X에서 절제되는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
22. 제 21항에 있어서, 상기 X가 loxP 부위인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
23. 제 7항의 줄기세포를, 전사 조절 요소가 활성화됨으로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 생성되는 분화된 세포.
24. 제 23항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 활성화되는 조건이 줄기세포가 분화되는 조거인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
25. 제 23항에 있어서, 상기 줄기세포가 전사 조절 요소가 활성화되는 조건하에서 분화하는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
26. 제 23항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 줄기세포가 자발적으로 배양체 세포로 분화할 수 있게 함으로써 활성화되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
27. 제 23항에 있어서, 상기 핵산 절편이 분화된 세포로부터 절제되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
28. 제 27항에 있어서, 상기 핵산 절편이 아데노바이러스-중재 부위-특이적 절제를 사용하여 절제되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
29. 제 27항에 있어서, 상기 핵산 절편이 재조합효소를 사용하여 절제되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
30. 제 29항에 있어서, 상기 재조합효소가 Cre인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
31. 제 27항에 있어서, 상기 핵산 절편의 절제가 핵산 분자의 재조합을 초래하고, 그것으로부터 핵산 절편이 절제되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
32. 제 23항에 있어서, 상기 I의 발현 효과가 역전되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
33. 제 32항에 있어서, 상기 I의 발현 효과가 분화된 세포의 형질전환이고, 상기 I의 발현 효과의 역전은 분화된 세포의 형질전환의 역전인 것을 특징으로 하는 분 화된 세포.
34. 제 32항에 있어서, 상기 I의 발현 효과는 우성 네거티브 형질전환제의 발현에 의해 역전되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
35. 제 32항에 있어서, 상기 I의 발현 효과는 핵산 절편의 절제에 의해 역전되는 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
36. 제 23항에 있어서, 상기 분화된 세포가 간세포인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
37. 제 23항에 있어서, 상기 분화된 세포가 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
38. 제 23항의 분화된 세포를 대상에게 도입시키는 것으로 이루어지는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 상기 분화된 세포가 대상에게 분화된 세포를 투여함으로서 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 38항에 있어서, 상기 분화된 세포가 대상에게 분화된 세포를 이식함으로 써 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 조성물을 독성에 대해 분석하는 방법으로서, 상기 방법이 제 23항의 분화된 세포와 함께 조성물을 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 독성 효과에 대하여 평가하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 화합물을 독성에 대해 분석하는 방법으로서, 상기 방법이 제 23항의 분화된 세포와 함께 화합물을 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 독성 효과에 대하여 평가하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 조성물을 세포에 미치는 관심의 효과에 대해 분석하는 방법으로서, 상기 방법이 제 23항의 분화된 세포와 함께 조성물을 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 관심의 효과에 대하여 평가하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 화합물을 세포에 미치는 관심의 효과에 대해 분석하는 방법으로서, 상기 방법이 제 23항의 분화된 세포와 함께 화합물을 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 관심의 효과에 대하여 평가하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법으로서, 상기 방법이

    제 7항의 줄기세포를, 전사 조절 요소가 활성화됨으로써 I가 우선적으로 또는 선택 적으로 발현되는 조건하에서 배양하고, 그로써 분화된 세포가 유래되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형의 유래 방법으로서, 상기 방법이

    제 7항의 줄기세포를, 전사 조절 요소가 활성화됨으로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양하고, 그로써 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형이 유래되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형의 유래 방법으로서, 상기 방법이

    줄기세포를, 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 이때 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 상기 마커는 형질전환제를 포함하고;

    줄기세포를, 전사 조절 요소가 활성화됨으로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 줄기세포 유래 조건성 불멸 세포 유형이 유래되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법으로서, 상기 방법이

    줄기세포를, 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 이때 P는 전사 조절 요소이고 I는 마커를 코드화하는 서열이며, 상기 마커는 형질전환제를 포함하고;

    줄기세포를, 전사 조절 요소가 활성화됨으로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 줄기세포로부터 분화된 세포가 유래되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 48항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 활성화되는 조건이 줄기세포가 분화하는 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 48항에 있어서, 상기 줄기세포가 전사 조절 요소가 활성화되는 조건하에서 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 48항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 줄기세포가 자발적으로 배양체로 분화할 수 있게 함으로써 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 I를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 I를 발현하는 세포의 순도를 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 53항에 있어서, 상기 순도를 증가시키는 단계가 클론성 또는 반-정제된 세포 집단을 생성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 핵산 절편을 절제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 분화된 세포를 클로닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 분화된 세포를 냉동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 관심의 유전자를 선택된 세포에 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
60. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로

    핵산 절편을 절제하는 단계; 및

    분화된 세포를 냉동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
61. 제 60항에 있어서, 상기 전에 핵산 절편을 포함하고 있는 핵산의 말단이 핵산 절편이 절제될 때 재결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
62. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 I를 발현하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
63. 제 62항에 있어서, 상기 방법이 추가로 I를 발현하는 배양된 세포를 클로닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
64. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 분화된 세포를 대상에게 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
65. 제 64항에 있어서, 상기 분화된 세포가 분화된 세포를 대상에게 투여함으로써 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
66. 제 64항에 있어서, 상기 분화된 세포가 분화된 세포를 대상에게 이식함으로써 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
67. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 조성물을 분화된 세포와 함께 인큐베 이션하는 단계와, 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
68. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 화합물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 독성 효과에 대해 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
69. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 조성물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
70. 제 48항에 있어서, 상기 방법이 추가로 화합물을 분화된 세포와 함께 인큐베이션하는 단계와, 분화된 세포를 관심의 효과에 대해 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
71. 줄기세포로부터 분화된 세포를 유래하는 방법으로서, 상기 방법이

    줄기세포를 구조 P-I를 포함하는 핵산 절편으로 형질전환하는 단계, 이때 P는 전사 조절 요소이고, I는 마커를 코드화하는 서열이며;

    줄기세포를 전사 조절 요소가 활성화되고, 그로써 I가 우선적으로 또는 선택적으로 발현되는 조건하에서 배양함으로써 분화된 세포가 유래되는 단계로 이루어 지며, 이때 전사 조절 요소가 활성화되는 조건은 줄기세포가 분화하는 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
72. 제 71항에 있어서, 상기 방법이 추가로 마커에 대해 스크리닝함으로써 분화된 세포를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
73. 제 71항에 있어서, 상기 방법이 추가로 마커를 발현하는 세포를 확인함으로써 분화된 세포를 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
74. 제 71항에 있어서, 상기 줄기세포가 전사 조절 요소가 활성화되는 조건하에서 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
75. 제 71항에 있어서, 상기 전사 조절 요소가 줄기세포가 자발적으로 배양체로 분화할 수 있게 함으로써 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.

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