CN109851677B

CN109851677B - 一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109851677B
Application number: CN201910141231.7A
Authority: CN
Inventors: 刘怀伟; 荀鲁盈; 李焕杰; 胡欣
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109851677A

Abstract

本发明涉及一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用。本发明中蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是基于绿色荧光蛋白基因定点突变改造而成的，还提供了该蛋白荧光探针的制备方法。本发明中蛋白荧光探针制备方法简单，选择性高，检测方法简单，检测限低，灵敏度高，抗干扰能力强，数据计算方便。本发明中特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针还可以实现活细胞和亚细胞器水平上的多硫化物的检测，细胞器定位准确，能够实时准确定量细胞器的多硫化物，为研究细胞内和细胞器内的多硫化物水平提供了有利的工具。

Description

一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

多硫化物(polysulfides,HS_nH,RS_nH,n≥2；RS_nR,n≥3)是近年来被发现的一类广泛存在于原核和真核细胞内的含硫化合物，在生理活动中起着很重要的作用，包括诱导Ca²⁺代谢流、肿瘤抑制因子磷酸化酶的调控、维持胞内的氧化还原状态等，也是线粒体功能的潜在调节因子。细胞内超过40％的蛋白通过自身的巯基化修饰参与胞内的代谢功能，而高水平的多硫化物既可以维持蛋白的过硫化修饰，又可以增强细胞的抗氧化作用。

中国专利文献CN107290323A公开了一种近红外荧光探针及其制备方法与应用技术，涉及一种新型的近红外荧光探针及其制备方法与在检测多硫化物中的应用，所述方法包括通过尼罗红衍生物与2-氟-4-硝基苯甲酸反应得到所述探针分子。该探针制备方法简单、结构稳定，通过荧光分光光度计可用于高选择性、高灵敏度、快速地检测二硫化钠。该近红外荧光探针为化学制剂，适宜于体外检测多硫化物，但是无法实时定量检测生物体内的多硫化物水平，又可能会对生物体造成不可逆的伤害。

目前对于多硫化物的研究进展相对缓慢，原因之一是没有合适的可以在细胞内定位并进行实时定量多硫化物水平的方法。因此构建高效、高选择性、高灵敏性和短时间响应定量检测多硫化物的方法是人们目前亟待解决的问题。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent proteins，GFP)是一类重要的指示蛋白，通过一定的激发光激发时可发射出绿色荧光以便于检测。通过基因工程，绿色荧光蛋白(GFP)基因能够稳定转化进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼(例如斑马鱼)，植物，苍蝇，甚至人等的哺乳动物细胞。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用。本发明通过定点突变改变绿色荧光蛋白roGFP氨基酸序列中两个半胱氨酸之间的距离获得蛋白荧光探针psGFP，使得该蛋白荧光探针能够特异性的检测多硫化物，并能够实现在细胞内不同细胞器的定位，实时的动态监测胞内多硫化物浓度水平的变化。

术语说明：

H₂S_n(HSSH)：多硫化物的一种，n≥2，n为整数。

roGFP：全称为redox sensitive versions of GFP，即氧化还原敏感的绿色荧光蛋白，为绿色荧光蛋白中的一种。

本发明的技术方案如下：

一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述蛋白荧光探针是基于绿色荧光蛋白roGFP基因定点突变而得，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，步骤如下：

(1)以绿色荧光蛋白基因为模板，定点突变构建得蛋白荧光探针的基因序列，去掉起始密码子atg后插入到表达载体pET30的多克隆位点上，获得N端带有6-his标签的蛋白荧光探针的表达载体pET30-psGFP；所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)获得的表达载体pET30-psGFP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组表达大肠杆菌；

(3)将步骤(2)获得的重组表达大肠杆菌进行培养，IPTG诱导表达蛋白荧光探针，并对重组表达大肠杆菌细胞进行裂解，利用his标签进行蛋白纯化，即得特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述绿色荧光蛋白为roGFP，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测体外多硫化物中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，方法如下：

将上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针与二巯基苏糖醇完全反应，脱盐后得还原态蛋白荧光探针，将还原态蛋白荧光探针与多硫化物样品混合反应后脱盐，采用荧光分光光度计对反应液中蛋白荧光探针的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。

进一步优选的，所述脱盐采用脱盐柱脱盐。

进一步优选的，所述混合反应的条件为冰浴反应30-50min。

进一步优选的，所述多硫化物样品为H₂S_n或谷胱甘肽过硫化物(GSSH)。

进一步优选的，所述多硫化物样品的检测浓度的10-170μM，所述反应液中蛋白荧光探针的工作浓度为0.01-0.1mg/mL。

上述特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测酿酒酵母体内多硫化物中的应用。

根据本发明优选的，所述应用为以下之一项或多项：

i.在检测酿酒酵母细胞质内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，获得在酿酒酵母细胞质中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母细胞质内多硫化物的检测；

ii.在检测酿酒酵母线粒体内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将线粒体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito；将酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，获得在酿酒酵母线粒体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母线粒体内多硫化物的检测；所述线粒体的定位信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

iii.在检测酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物中的应用，步骤如下：将上述蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将过氧化物酶体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL；将酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，获得在酿酒酵母过氧化物酶体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物的检测；所述氧化物酶体的定位信号肽SEQ ID NO.3所示。

进一步优选的，所述多硫化物的检测，方法如下：取诱导表达后的酿酒酵母培养液，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬得待检测样品，采用荧光分光光度计对待检测样品的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高，实时测定酿酒酵母体内多硫化物的水平。

进一步优选的，所述多硫化物的检测，方法如下：取诱导表达后的酿酒酵母培养液，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬，采用荧光显微镜观察酿酒酵母细胞绿色荧光的表达位置和表达强度，绿色荧光越强，说明多硫化物的浓度越高。

本发明中未详细说明的实验操作均按照本领域常规操作进行。

本发明的技术特点：

本发明通过定点突变，将绿色荧光蛋白roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸，改变了氨基酸序列中第147位半胱氨酸与另一半胱氨酸之间的距离，改造了绿色荧光蛋白发色基团的内部平衡，使得改造后的蛋白荧光探针psGFP只有在和多硫化物反应后才能形成三硫键，从而在激发光激发时发出特异性荧光。

本发明中蛋白荧光探针的检测机理如图1所示，改造前，绿色荧光蛋白roGFP与多硫化物和过氧化氢反应均可以生成二硫键，从而发出特异性荧光，不具有底物选择性；改造后，由于蛋白荧光探针psGFP活性位点的两个半胱氨酸的空间位置发生了改变，使得psGFP在和H₂O₂反应后不足以将两个半胱氨酸连接起来形成二硫键；只有当psGFP和多硫化物反应后，多硫化物将自身零价硫转移给半胱氨酸后，半胱氨酸可以通过借助外来的硫的作用形成三硫键，从而发出特异性荧光。

本发明的有益效果：

1.本发明中特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，制备方法简单，选择性高，检测方法简单，检测限低，灵敏度高，抗干扰能力强，数据计算方便。

2.本发明中特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针可以实现活细胞和亚细胞器水平上的多硫化物的检测，细胞器定位准确，能够实时准确定量细胞器的多硫化物，为研究细胞内和细胞器内的多硫化物水平提供了有利的工具，为多硫化物的研究进展提供了技术支持。

附图说明

图1是蛋白荧光探针psGFP和绿色荧光蛋白roGFP的检测反应机理对比示意图；

图中，a为psGFP与多硫化物和过氧化氢的反应原理示意图；b为roGFP与多硫化物和过氧化氢的反应原理示意图；

图2是实施例1中表达载体pET-psGFP的示意图；

图3是蛋白荧光探针(psGFP)的局部三维模型图；

图4是蛋白荧光探针(psGFP)对于不同样品的敏感性对比图；

图中，a为psGFP分别和H₂S_n、DTT和H₂O₂反应后的408/488的比值差异柱状图；b为psGFP分别和H₂S_n、DTT、GSSH和H₂O₂反应后的荧光光谱扫描曲线。

图5是实施例2中表达载体YEPlac195–psGFP的示意图；

图6是实施例2中表达载体YEPlac195–psGFP–Mito的示意图；

图7是实施例2中表达载体YEPlac195–psGFP–SKL的示意图；

图8是酿酒酵母体内多硫化物的动态测定示意图；

图中，a为酿酒酵母培养过程中菌体的生长曲线图；b为酿酒酵母细胞质、线粒体、过氧化物酶体中多硫化物的动态浓度对比图；

图9是酿酒酵母体内多硫化物的分布示意图；

图中，a为酿酒酵母细胞质中多硫化物的分布情况；b为酿酒酵母线粒体的染色情况；c为酿酒酵母线粒体中多硫化物的分布情况；d为酿酒酵母过氧化物酶体的染色情况；e为酿酒酵母过氧化物酶体中多硫化物的分布情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。本发明中未详细说明的实验操作均按照本领域常规操作进行。

含roGFP基因的质粒、表达载体pET30、表达载体YEPlac195购自addgene公司；大肠杆菌BL21(DE3)购自ATCC公司；

二巯基苏糖醇(100g)购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司；双氧水H₂O₂(500mL)购自国药集团化学试剂有限公司；

多硫化物HSSH和GSSH为实验室自配。

多硫化物(polysulfides，HSSH，H₂S_n)配制方法：取100mL厌氧瓶，加入100mL去离子水，通氩气5min以除去液体中的氧气。迅速加入128mg硫粉(单质S，sulfur)和168mg硫氢化钠，迅速密封，将厌氧瓶放入37℃培养箱中温育，2-3天后待全部硫粉溶解完全后，加入6M盐酸调整pH约为9.3，得到了亮黄色透明的多硫化物的储存液，可放置入4℃冰箱中保存一个月。多硫化物可通过以硫代硫酸钠为标准的氰化物衍生的方法进行定量。

谷胱甘肽过硫化物(Glutathione persulfide，GSSH)配制的具体方法是：氧化型的谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和NaHS按照1：3的摩尔比进行称量，分别是122.5mg，33.64mg。配制10mM磷酸缓冲液，磷酸缓冲液中含有200mM NaCl和1mM EDTA，pH7.0，取10mL用氩气除氧10min后，加入GSSG和NaHS进行混合，继续通氩气20S，厌氧条件下，30℃反应30min，溶液变成淡黄色，可在厌氧瓶中于4℃冰箱中保存一个月。GSSH通过以硫代硫酸钠为标准的氰化物衍生的方法进行定量。

实施例1：特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备

一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，步骤如下：

(1)以绿色荧光蛋白roGFP基因(GeneBank登录号：AJ002682.1)为模板，定点突变构建得蛋白荧光探针的基因序列，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸；去掉起始密码子atg后插入到表达载体pET30的多克隆位点上，获得N端带有6-his标签的蛋白荧光探针的表达载体pET30-psGFP(图2)；所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(2)获得的重组表达大肠杆菌进行培养，挑一个单菌落在LB培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L)中37℃，200rpm过夜培养得培养液，将培养液按照体积百分比1％的接种量转接到新的100mLLB培养基中，30℃，200rpm培养4h，加入30μL0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)诱导表达蛋白荧光探针，20℃，160rpm继续培养，20h后收集菌体，弃上清，将收集到的菌体重悬于缓冲溶液(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)中，高压裂解，上Ni-柱收集目的蛋白，并利用his标签进行蛋白纯化，即得特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，记为psGFP(polysulfides-sensitve GFP)，蛋白荧光探针psGFP呈现荧光绿色。

蛋白荧光探针psGFP局部三维模型如图3所示，蛋白荧光探针的发色基团附近和表面有一对半胱氨酸残基。

实施例2：psGFP对不同样品中多硫化物的浓度检测

将实施例1制备得到的psGFP和二巯基苏糖醇(DTT)于冰上反应30min，使得psGFP反应完全，经测定，实施例1制备得到的psGFP的浓度为3mg/mL，上述二巯基苏糖醇的浓度为1mM；反应后的psGFP用脱盐柱脱盐，洗脱未结合的小分子，再次收集蛋白，即得还原态蛋白荧光探针。

将上述还原态蛋白荧光探针分别与HSSH、H₂O₂样品冰浴反应30min，HSSH、H₂O₂样品的浓度均为100μM，脱盐柱脱盐后得反应产物，反应产物溶解于50mM Tris-HCl缓冲液中得待测样品，使得待测样品中psGFP的测定浓度为0.1mg/mL，采用荧光分光光度计对待测样品的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值(记为408/488)，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。

按照以上方法测定上述还原态蛋白荧光探针Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，对比psGFP对HSSH、DTT、H₂O₂样品的敏感性，结果如图4(a)所示，psGFP对HSSH具有专一的敏感性，相比较psGFP分别和DTT与H₂O₂的反应，HSSH的408/488比值明显升高。另外，psGFP与HSSH、DTT、H₂O₂、GSSH样品反应后的荧光光谱扫描曲线如图4(b)所示，结果显示，psGFP与HSSH样品的反应产物在Ex为408nm时Em510值高于其他样品，也表明了psGFP对HSSH具有专一的敏感性。

实施例3：psGFP对酿酒酵母体内多硫化物的浓度检测

制备酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的感受态：挑取酿酒酵母单菌落，加入到5mL YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)中30℃，220rpm过夜培养得培养液，将培养液转接到50mL新鲜YPD培养基中，待OD₆₀₀为0.8时，3000rpm，5min收集菌体，用冰浴的无菌水洗涤后，加入1mL无菌水重悬，制备成酿酒酵母的感受态细胞。

i.细胞质内多硫化物的浓度检测，步骤如下：

将实施例1构建得到的蛋白荧光探针的基因序列(SEQ ID NO.1)插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP(图5)；将酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP转化到上述制备得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的感受态细胞中，获得在酿酒酵母细胞质中定位的蛋白荧光探针psGFP，诱导表达后进行酿酒酵母细胞质内多硫化物的检测；

ii.线粒体内多硫化物的浓度检测，步骤如下：

将实施例1构建得到的蛋白荧光探针的基因序列(SEQ ID NO.1)插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将线粒体的定位信号肽(SEQ ID NO.2)插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito(图6)；将酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito转化到上述制备得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的感受态细胞中，获得在酿酒酵母线粒体中定位的蛋白荧光探针psGFP，诱导表达后进行酿酒酵母线粒体内多硫化物的检测；

iii.过氧化物酶体内多硫化物的浓度检测，步骤如下：

将实施例1构建得到的蛋白荧光探针的基因序列(SEQ ID NO.1)插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将过氧化物酶体的定位信号肽(SEQ ID NO.3)插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL(图7)；将酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL转化到上述制备得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的感受态细胞中，获得在酿酒酵母过氧化物酶体中定位的蛋白荧光探针psGFP，诱导表达后进行酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物的检测；

其中，上述转化的步骤为：配制鲑鱼精DNA2mg/mL，沸水浴中加热5min，然后置于冰上5min；配制50wt％PEG4000和1M醋酸锂，0.22μM滤膜过滤除菌；取240μL 50wt％PEG4000，36μL1M醋酸锂，50μL2mg/mL鲑鱼精DNA，10μL表达载体，24μL无菌水，混匀得转化体系；用转化体系重悬酿酒酵母感受态细胞，置于42℃孵育40min，然后12000rpm离心0.2min去上清；用1mL YPD培养基重悬菌体，30℃，200rpm恢复培养1h，然后在zeocin平板涂布100μL菌液，置于30℃培养箱静置培养；两天后挑取单克隆，提取基因组验证，筛选阳性克隆。

将上述含有psGFP的酿酒酵母按照常规方法培养，可随时取样，取200μL菌液样品，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬得待检测样品，采用荧光分光光度计对待检测样品的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。在酿酒酵母的培养过程中，菌体的生长曲线如图8(a)所示，在酿酒酵母细胞过表达细胞质、线粒体、过氧化物酶体定位的psGFP时，菌体生长差异不大，说明psGFP对酿酒酵母的生长没有毒副作用。对比酿酒酵母中不同培养时间和不同部位的多硫化物的浓度，结果如图8(b)所示，在培养5h时，酿酒酵母的细胞质、线粒体和过氧化物酶体的多硫化物浓度最高，其中细胞质和线粒体要略高于过氧化物酶体；在培养24h时，胞内的多硫化物浓度最低。

将上述含有psGFP的酿酒酵母按照常规方法进行培养，可随时取样，取200μL菌液样品，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬，采用荧光显微镜观察酿酒酵母细胞绿色荧光的表达位置和表达强度，绿色荧光越强，说明多硫化物的浓度越高，结果如图9所示，具有定位作用的psGFP成功定位于细胞质、线粒体或过氧化物酶体上；通过对比绿色荧光的强度，可明显观察出细胞质、线粒体和过氧化物酶体中多硫化物的分布位置和表达强度。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针及其制备方法与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat tagcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactg ccacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtgcacat cctctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Leu Ser Ala Arg Ser Ala Ile Lys Arg Pro Ile Val Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ala Thr Val

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ser Lys Leu

1

Claims

1.一种特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针，其特征在于，所述蛋白荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该蛋白荧光探针是基于绿色荧光蛋白roGFP基因定点突变而得，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

2.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述绿色荧光蛋白为roGFP，所述定点突变是将roGFP氨基酸序列中第202位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第204位的半胱氨酸突变为丝氨酸。

4.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测体外多硫化物中的应用，方法如下：

将权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针与二巯基苏糖醇完全反应，脱盐后得还原态蛋白荧光探针，将还原态蛋白荧光探针与多硫化物样品混合反应后脱盐，采用荧光分光光度计对反应液中蛋白荧光探针的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法包括以下条件中的一项或多项：

1)所述脱盐采用脱盐柱脱盐；

2)所述混合反应的条件为冰浴反应30-50min；

3)所述多硫化物样品为H₂S_n或谷胱甘肽过硫化物；

4)所述多硫化物样品的检测浓度的10-170μM，所述反应液中蛋白荧光探针的工作浓度为0.01-0.1mg/mL。

6.权利要求1所述的特异性检测多硫化物的蛋白荧光探针在检测酿酒酵母体内多硫化物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为以下之一项或多项：

i.在检测酿酒酵母细胞质内多硫化物中的应用，步骤如下：将权利要求1所述的蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，获得在酿酒酵母细胞质中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母细胞质内多硫化物的检测；

ii.在检测酿酒酵母线粒体内多硫化物中的应用，步骤如下：将权利要求1所述的蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将线粒体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito；将酿酒酵母线粒体定位表达载体YEPlac195–psGFP–Mito转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，获得在酿酒酵母线粒体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母线粒体内多硫化物的检测；所述线粒体的定位信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

iii.在检测酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物中的应用，步骤如下：将权利要求1所述的蛋白荧光探针的基因序列插入到表达载体YEPlac195上，所述蛋白荧光探针的启动子是TEF1，构建得酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP；将过氧化物酶体的定位信号肽插入到上述酿酒酵母表达载体YEPlac195-psGFP的N端，得到酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL；将酿酒酵母过氧化物酶体定位表达载体YEPlac195–psGFP–SKL转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，获得在酿酒酵母过氧化物酶体中定位的蛋白荧光探针，诱导表达后进行酿酒酵母过氧化物酶体内多硫化物的检测；所述氧化物酶体的定位信号肽SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多硫化物的检测，方法如下：取诱导表达后的酿酒酵母培养液，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬得待检测样品，采用荧光分光光度计对待检测样品的荧光强度进行扫描，激发光谱Ex分别设定为408nm和488nm，发射光谱Em设定为510nm，记录两个不同激发光谱的Em510数据，并计算Ex为408nm时Em510和Ex为488nm时Em510的比值，比值越高，说明多硫化物的浓度越高，实时测定酿酒酵母体内多硫化物的水平。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多硫化物的检测，方法如下：取诱导表达后的酿酒酵母培养液，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤并重悬，采用荧光显微镜观察酿酒酵母细胞绿色荧光的表达位置和表达强度，绿色荧光越强，说明多硫化物的浓度越高。