KR20200066464A - 구리 검출용 미생물 진단키트 및 이의 제조방법 - Google Patents

구리 검출용 미생물 진단키트 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고감도 및 선택성이 높은 구리 검출 미생물 진단키트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 구리와 특이적으로 결합하는 copA 유전자의 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 프로모터 유전자를 기반으로 한 형광단백질 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 구리이온 검출 미생물 진단키트의 제조방법, 및 상기 제조방법에 의해 제조된 진단키트에 관한 것이다.

Description

구리 검출용 미생물 진단키트 및 이의 제조방법 {A microorganism diagnostic kit for copper detection and the preparation method thereof}
본 발명은 고감도 및 선택성이 높은 구리 검출용 미생물 진단키트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 구리와 특이적으로 결합하는 copA 유전자의 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 프로모터 유전자를 기반으로 한 형광단백질 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 구리 검출용 미생물 진단키트의 제조방법, 및 상기 제조방법에 의해 제조된 진단키트에 관한 것이다.
구리는 식물 또는 동물 세포에서 필수적인 미량원소이며, 인체에 존재하는 필수 중금속 중에서 세번째로 풍부한 금속으로서, 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행한다. 철, 아연 등과 같이 작용하여 피부를 보호하거나 모발 피크먼트를 형성하거나, 뼈의 성장 등에 관여한다고 알려져 있다. 그러나 살아있는 세포에서 구리이온은 산소분자를 활성산소종으로 변환시켜 단백질, 핵산 및 지질의 손상을 유발시킨다. 특히, 인간이 구리가 결핍되거나 과잉이 되면, 여러가지 병이 유발될 수 있다. 실제로 구리의 과도한 양은 독성을 나타내며, 과도한 산화성 스트레스로 인하여 다양한 질환을 유발시킨다. 비정상적인 구리이온의 섭취로 유발되는 질병으로는 암, 심혈관 장애, 멘케스병, 윌슨병, 알츠하어머, 위장질환, 저혈당증, 난독증 및 유아간질환 등이 있으며, 이러한 질환들은 특히 여러 기관들 중에서도 주로 간과 신장에서의 구리이온의 축적에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다.
최근, 동물의 분뇨 등에 의해서 농경지 흙 속의 구리 농도가 증가하고 있다고 보고된 바 있다. 이렇게 흙 속에 축적된 구리는 먹이사슬에 의해 미생물, 동식물을 비롯하여 결국에는 인간에게 영향을 미칠 것으로 판단된다. 따라서 생체 시스템 및 환경 분야에서 잔류 구리이온을 검출하는 것은 매우 중요하다.
지금까지 구리이온을 검출하기 위해 다양한 화학센서, 금속 나노클러스터, 양자점, 나노로드, 비색법, 분광법 및 전압전류법 등이 개발되어왔다. 그러나 화학센서 및 나노클러스터는 다른 금속이온에 대한 교차활성도, 수용액에서의 낮은 용해도 및 느린 반응성 때문에 실제 응용에는 한계가 있다. 또한, 구리이온을 검출하기 위한 분광법과 전압-전류법은 분석하기 전에 복잡한 전처리 과정과 노동력을 필요로 한다.
따라서, 생체 시스템 및 환경 분야의 실제 적용을 위해서는, 높은 민감도와 선택성으로 신속하고 간편하게 구리 이온을 검출할 수 있는 구리이온 검출법의 개발이 요구된다.
본 발명자들은 고감도 및 선택성이 높은 구리이온 검출 미생물 진단키트 및 이의 제조방법을 개발하기 위해, 구리와 특이적으로 결합하는 프로모터 유전자, 상기 프로모터 유전자를 기반으로 한 형광단백질 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 고감도 및 선택성이 높은 구리이온 검출 미생물 진단키트의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 진단키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 copA 유전자의 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는, 유전자 컨스트럭트(gene construct)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 하기의 단계를 포함하는 구리 검출용 진단키트의 제조 방법을 제공하는 것이다:
(1) copA 유전자의 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제조하는 단계.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 하기의 단계를 포함하는 시료 내 구리 검출 방법을 제공하는 것이다:
(1) 피검시료를 구리 검출용 진단키트에 노출시키는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 진단키트를 통해 copA 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 copA 유전자 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는, 유전자 컨스트럭트(gene construct)를 제공한다.
본 발명의 "copA 유전자"는 Copper-exporting P-type ATPase로서 미생물에서 구리를 세포질(cytoplasm)로부터 주변세포질(periplasm)로 수송하는 역할을 하는 유전자이다.
상기 "세포질"은 세포 내부를 채우고 있는 균일하고 투명한 점액 형태의 물질이다. 세포핵을 제외한 세포액과 세포소기관으로 이루어진다. 상기 세포질은 세포의 모양 및 항상성을 유지하며, 세포소기관을 지탱하는 역할을 한다.
상기 "주변세포질"은 외막과 세포막 사이의 공간을 의미하고, 결합 단백질, 세포벽을 합성하고 분해하는 효소, 물질 수송 및 각종 대사에 관여하는 효소가 존재한다.
본 발명의 copA 유전자의 프로모터는 중합효소연쇄반응에 의해 특정 프라이머 쌍으로 증폭되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "프로모터"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 구체적으로는 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 사용한 E.coli 균주의 copA 유전자 프로모터일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 copA 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 서열번호 1의 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 copA 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 발명의 "리포터 유전자"는 유전자의 발현물질을 검출할 수 있는 유전자로서, 벡터(vector)에 연결되어 형질전환된 유전자가 발현되는지 육안으로 확인할 수 있도록 한다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 copA 유전자의 프로모터에 의해 발현되도록 작동가능하게 연결될 수 있다면 다양한 공지의 리포터 유전자들이 이용가능하며, GFP, 루시페라제(luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 생물발광(bioluminescence), β-갈락토시다제(β-galactosidase)로부터 선택되는 어느 하나의 리포터 유전자일 수 있고, 구체적으로 루시페라제일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 발현 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 "발현벡터"는 세포 내에서 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 상기 발현벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 발현벡터는 pBJY 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서는, In Fusion 방법(In-Fusion
Figure pat00001
HD Cloning Kit User Manual 참조)으로　luc 유전자 바로 위에 정제된 프로모터 DNA가 놓일 수 있도록 하여 copA:pBJY 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 3).
본 발명의 "형질전환체"는 본 발명의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 상기 발현벡터에 포함된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 세포를 의미한다.
상기 "형질전환"이란 유전자조작 기법을 사용하여 외부로부터 도입된 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 유전체에 의해 숙주세포(원핵 및 진핵생물, 동물세포 및 식물세포)의 유전형질이 변화되는 현상을 의미한다. 즉, 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, EAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환의 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 "숙주세포"는 외부로부터 목적 단백질의 유전자를 도입하는 대상이 되는 세포를 의미하는 것으로, 본 발명의 일 구현예에서 상기 숙주세포는 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 보다 구체적으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 에스케리키아 콜라이 K-12 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제공하는 것이다.
상기 "구리 검출용 진단키트"는 구리를 특이적으로 검출 가능하도록 제작된 키트로서, 본 발명의 구체적인 일 구현예에서 상기 진단키트는 구리 농도가 증가함이 따라 점진적으로 발광 정도가 증가하는 것을 확인하였고, 0.5 내지 5ppm의 감응력을 갖는 것을 확인하여, 구리에 대해 높은 민감도를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기의 단계를 포함하는 구리 검출용 진단키트의 제조 방법을 제공하는 것이다:
(1) copA 유전자의 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제조하는 단계.
상기 "copA 유전자", "프로모터", "리포터 유전자", "발현 벡터", "숙주세포", "형질전환체" 및 "구리 검출용 진단키트"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기의 단계를 포함하는 시료 내 구리 검출 방법을 제공하는 것이다:
(1) 피검시료를 구리 검출용 진단키트에 노출시키는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)의 진단키트를 통해 copA 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
분석대상인 구리는 표면에 흡착되거나, 액체 매질 중에 용해되어 있는 경우에 진단키트를 사용하여 측정할 수 있다. 입자에 부착되거나 수성 시료에 용해되어 있는 구리를 검출하기 위해 진단키트를 사용할 수 있으나, 일반적으로 액상에서 측정하는 것이 바람직하다. 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 진단키트가 기능을 할 수 있도록 수분을 이용할 수 있으면 된다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 에스키리키아 콜라이의 copA 유전자의 발현이 구리에서 특이적으로 높게 나타남을 확인하였고, copA 유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 정제된 프로모터 DNA와 pBJY 벡터를 연결하여 copA:pBJY 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 상기 재조합 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 야생형 균주 K-12에 형질전환하여 구리 검출용 형질전환체를 제조하였다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 상기 진단키트는 발광의 정량 분석에 따라 copA 유전자 발현이 구리 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, 상기 진단키트는 구리 농도가 증가함이 따라 점진적으로 발광 정도가 증가하는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6).
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에서, 상기 구리 검출용 진단키트는 0.5 내지 5ppm의 감응력을 갖는 것을 확인하여, 구리에 대해 높은 민감도를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명의 구리 검출용 진단키트는 구리에 매우 특이적이고 민감성이 높으므로, 본 발명의 서열번호 1 염기서열을 갖는 copA 유전자 프로모터가 포함된 유전자 컨스트럭트가 형질전환된 형질전환체는 고감도/특이적으로 센싱할 수 있는 구리 검출용 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 copA 유전자의 프로모터와 리포터 유전자인 luc(luciferase) 유전자를 포함하는 구리 검출용 진단키트는 특이성 및 민감도가 매우 뛰어나므로, 구리를 더욱 민감하고 정확하게 검출할 수 있다.
도 1은 구리 센싱 프로모터와 리포터 유전자를 발현벡터 pBJY에 연결한 재조합 플라스미드를 나타낸 도이다.
도 2는 copA 유전자 프로모터의 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 copA:pBJY 재조합 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 구리 센싱 재조합 대장균(Escherichia coli)에서 구리에 의해 형광을 발생시키는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 구리의 농도에 따른 발현 양상을 정량적으로 나타낸 도이다.
도 6은 구리의 농도에 따른 발광의 정도를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: copA 유전자의 프로모터 및 루시페라제(luciferase) 유전자를 포함하는 구리 검출용 진단키트의 제조
copA 유전자의 프로모터 및 루시페라제 유전자(luc)를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제조하기 위하여, 먼저 copA 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고(도 1), 이를 숙주세포에 형질전환하였다(도 4).
구체적으로, In Fusion 방법(In-Fusion
Figure pat00002
HD Cloning Kit User Manual)으로　luc 유전자 바로 위에 정제된 프로모터 DNA가 놓일 수 있도록 하여 copA:pBJY 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 3).
상기 재조합 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 야생형에 형질전환하여 구리 검출용 형질전환체를 제조하였다.
실시예 2: 진단키트의 구리 특이성 확인
본 발명의 진단키트의 구리 특이성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 형질전환체를 배양한 후, 수득된 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거한 다음 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포에 완충용액을 첨가하여 세포를 용해시키고, 용해된 세포 내 루시페라제 활성을 측정하였다.
그 결과, copA 유전자의 프로모터는 구리에만 매우 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다.
실시예 3: 진단키트의 구리 민감도 확인
본 발명의 진단키트의 구리에 대한 민감도를 확인하기 위하여, 진단키트의 구리 농도에 따른 발현 양상을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트는 구리 특이적으로 0.5 내지 5ppm 의 감응력에 도달하였다. 또한, 구리 농도의 증가에 따라 점진적으로 발광 강도가 증가하는 것을 확인하였다(도 6).
이를 통해, 낮은 구리 농도에서도 copA 의 발현이 증가하여, 구리에 대해 높은 민감도를 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 4. 진단키트의 구리 농도에 따른 발현 양상 확인
본 발명의 진단키트의 구리 농도에 따른 발현 양상을 확인하기 위해 진단키트에 구리를 처리하고, copA 의 발현 정도에 따라 재조합 대장균에서 형광을 나타내는 정도가 구리의 농도에 비례함을 육안으로 확인할 수 있었다(도 5).
이를 통해, 본 발명의 진단키트에서 copA 의 발현이 구리 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 copA 유전자의 프로모터와 리포터 유전자인 luc(luciferase) 유전자를 포함하는 구리 검출용 진단키트는 특이성 및 민감도가 매우 뛰어나므로, 구리를 더욱 민감하고 정확하게 검출할 수 있어 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> A microorganism diagnostic kit for copper detection and the preparation method thereof <130> KPA180894-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> E. coli, CopA promotersequence <400> 1 cggactttta cccgcctggt ttattaattt cttgaccttc cccttgctgg aaggtttaac 60 ctttatcaca gccagtcaaa actgtcttaa aggagtgttt t 101

Claims (16)

  1. copA 유전자의 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는, 유전자 컨스트럭트(gene construct).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 copA 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인, 유전자 컨스트럭트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 형광을 유발하는 단백질의 유전자인 것인, 유전자 컨스트럭트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 luc 유전자인 것인, 유전자 컨스트럭트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터.
  6. 제5항의 발현 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 형질전환체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것인, 재조합 형질전환체.
  8. 제6항 또는 제7항의 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 구리 검출용 진단키트는 0.5 내지 5ppm의 감응력을 갖는 것인, 구리 검출용 진단키트.
  10. (1) copA 유전자의 프로모터와 상기 copA 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
    (2) 상기 단계 (1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 구리 검출용 진단키트를 제조하는 단계를 포함하는 구리 검출용 진단키트의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (1)의 리포터 유전자는 형광을 유발하는 단백질의 유전자인 것인, 구리 검출용 진단키트의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 단계 (1)의 리포터 유전자는 luc 유전자인 것인, 구리 검출용 진단키트의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 단계 (2)의 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것인, 구리 검출용 진단키트의 제조방법.
  14. (1) 피검시료를 제9항의 구리 검출용 진단키트에 노출시키는 단계; 및
    (2) 상기 단계 (1)의 진단키트를 통해 copA 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 구리 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 copA 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인, 구리 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 luc 유전자인 것인, 구리 검출 방법.
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KR20220110363A (ko) * 2021-01-29 2022-08-08 서울대학교산학협력단 붉은 곰팡이 유래 구리 반응성 프로모터, 이를 포함하는 재조합벡터 및 이를 이용한 단백질 생산방법

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