KR101814610B1 - 트리클로산의 유무를 확인하기 위한 재조합 벡터, 형질전환 세포 및 트리클로산 검출용 바이오센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터에 물벼룩으로부터 추출한 트리클로산에 의해 발현이 감소하는 단백질인 2-도메인 헤모글로빈의 프로모터를 삽입하여 제작한 재조합 벡터, 재조합 벡터가 형질 도입된 형질전환세포, 상기 동물세포가 트리클로산에 노출되었을 때 녹색 형광 단백질 발현량을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 트리클로산 검출용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로 본 발명을 통해 독성물질인 트리클로산의 존재 여부를 확인할 수 있는 생물학적 지표를 개발함으로써 환경문제의 해결 가능성을 제시하였다.

Description

트리클로산의 유무를 확인하기 위한 재조합 벡터, 형질전환 세포 및 트리클로산 검출용 바이오센서{A recombinant vector for indicating, transgenic cell transformed by the recombinant vector and Biosensor detecting triclosan}

본 발명은 트리클로산의 유무를 확인하기 위한 재조합 벡터 및 이로부터 형질 전환된 동물세포에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터에 물벼룩으로부터 추출한 트리클로산에 의해 발현이 감소하는 단백질인 2-도메인 헤모글로빈의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 녹색형광 발현을 확인할 수 있도록 형질 전환된 동물세포, 상기 동물세포가 트리클로산에 노출되었을 때 녹색 형광 단백질 발현량을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 트리클로산 검출용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.

사람들의 삶의 질이 향상되고 경제적으로 풍족해 짐에 따라 개인위생에 대한 관심이 생겨났고, 질병과 세균으로부터 몸을 보호하고자 다양한 항균제가 개발되어 왔다. 트리클로산은 1972년부터 사용된 가장 오래된 항생물질이자 항진균제로 치약, 비누, 세제, 구강청결제, 핸드로션, 샴푸, 로션, 치약 등 많은 개인위생용품에 사용되었다. 그뿐만 아니라 화장품, 옷, 카펫, 의류, 장난감 등 다수의 생활용품에도 첨가되었다. 하지만 최근 국제적으로 트리클로산이 부작용을 일으킬 수 있다는 연구결과가 발표되면서 미국 FDA와 캐나다 보건부는 인체에 미칠 잠재적 위험에 대해 조사를 착수하였고 트리클로산 사용을 금지하는 방안을 검토하는 중이다. 최근 연구에서 트리클로산의 동물실험 결과 근육의 수축을 방해하는 것으로 나타났으며 수돗물에 함유된 염소와 반응해 클로로포름 및 다이옥신으로 변형돼 발암, 내분비계 장애 등 독성을 유발하는 것으로 알려졌다. 미국 FDA에 의하면 사람의 소변과 혈액, 모유뿐만 아니라 해조류에서 돌고래에 이르기까지 각종 수생생물에서도 감지되고 있다. 미루어보아 수중 환경에 트리클로산의 존재를 예상할 수 있다. 생태계 전반에서의 수중 환경의 오염은 인간뿐만 아니라 다양한 생물체에도 오염을 유발하기 때문에 매우 중요하게 여겨진다.

기존에 트리클로산을 검출하는 방법에는 화학적 분석 방법이 있다. 이 방법은 분석하는데 시간이 오래 걸리게 되어 독성 오염에 대한 즉각적인 처리가 어렵고 사용되는 기기가 전문적인 기술을 요구하게 되어 많은 비용을 필요로 하게 되어 실질적으로 광범위한 이용에 한계가 있다.

따라서, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 트리클로산의 존재 여부를 확인할 수 있는 생물학적 지표에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.

이를 해결하기 위해 본 발명자는 환경적 민감도가 높아 독성 연구에 주로 사용되는 물벼룩에서 트리클로산에 반응하는 단백질 중 하나인 2-도메인 헤모글로빈의 단백질을 생성하는 프로모터를 추출하여 녹색 형광 단백질을 포함하는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 이 재조합 벡터를 동물세포에 형질주입하고 형질전환된 동물세포를 이용해 트리클로산에 반응하여 녹색 형광 발현을 감소하는 것을 관찰하였다. 즉, 본 발명으로부터 독성 물질인 트리클로산의 존재 여부를 확인할 수 있는 생물학적 지표를 개발하였으며 형광 발현 정도를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및 상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 제공하고자 한다.
본 발명은 (a) 제1항의 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 동물세포 및 시료를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 동물세포 또는 시료에서 형광 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 트리클로산의 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 동물세포를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서를 제공한다.

본 발명은 (a) 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및 상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동가능 하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터를 형질전환된 동물세포를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공하고자 한다.

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그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 본 발명은 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및 상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터는 서열번호 4, 6 또는 7의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 형광 단백질은 녹색형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)일 수 있다.
상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터는 트리클로산에 의하여 형광 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 제공한다.
본 발명은 (a) 제1항의 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 동물세포 및 시료를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 동물세포 또는 시료에서 형광 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 트리클로산의 검출방법을 제공한다.
상기 검출방법은 (d) 상기 형광 단백질의 발현이 감소할 경우, 트리클로산이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 동물세포를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 (a) 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및 상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동가능 하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

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본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 트리클로산에 의해 단백질의 발현양이 감소하는 물벼룩의 2-도메인 헤모글로빈 프로모터와 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 벡터에 의하여 제조된 형질 도입 동물세포를 이용하여 트리클로산에 의한 단백질의 발현양을 통해 트리클로산의 유무를 평가하고자 한다.

또한, 본 발명을 통해 트리클로산 검출용 바이오센서를 제작하여 수중에 존재하는 트리클로산의 감지가 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 프로모터는 유전자의 유전정보를 지니고 있고 DNA염기서열 앞부분에 위치하는 전사조절인자이고 트리클로산에 반응하는 HB2의 앞부분에 프로모터를 표시한 그림이다.
도 2는 프로모터 검색 프로그램을 통해 HB2의 앞부분에 프로모터 후보군을 나타낸 그림이다.
도 3은 프로모터 후보군을 바탕으로 안정적으로 작동할 수 있게 프로모터 부분을 설계한 도면이다.
도 4는 pBabe-GFP를 벡터로 재조합 플라스미드를 제작하기 위한 도면이다.
도 5는 (a)대조군과 각각 재조합 플라스미드 (b)MBTL-HY1, (c)MBTL-HY2, (d)MBTL-HY3를 형질 주입한 헤라셀의 형광 비교 도면이다.
도 6은 재조합 플라스미드 MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3가 형질주입된 헤라 셀의 사멸에 영향을 미치지 않을 정도의 다양한 농도의 트리클로산을 처리하였을 때 형광 발현 차이를 비교한 그래프이다.
도 7은 재조합 플라스미드 MBTL-HY3의 형광 발현이 트리클로산에 특이적으로 반응하는 것을 확인하기 위해 독성을 가진 여러 화학물을 이용해 형광 발현의 차이가 나는지 관찰한 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 화학적 분석방법의 문제점에 관해 지금까지 트리클로산을 검출하는 방법에 대한 많은 연구가 계속되고 있음에도 불구하고 독성 오염에 대한 즉각적인 처리 및 전문적 기술요구로 인해 적은 비용과 실질적으로 광범위하게 이용할 수 있는 방법이 개발되지 않아 이에 대한 생물학적 분석방법 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 독성 물질인 트리클로산의 존재 여부를 확인할 수 있는 생물학적 지표의 개발 및 형광 발현 정도를 확인함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 독성 오염에 대한 즉각적인 처리 및 적은 비용이 요구됨으로써 트리클로산의 존재 여부 확인을 실질적으로 광범위하게 이용할 수 있도록 한다.

본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 pBabe에 대한 GFP를 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 유전자가 포함된 벡터는 pbabe-GFP로서, 세포에 이 GFP를 암호화하고 있는 DNA나 mRNA가 존재할 경우 GFP 단백질이 세포 내에서 합성되어 강한 형광을 발하며 발현 정도를 조사하고 싶은 유전자에 GFP를 암호화하는 서열을 연결하면 실제 조사하길 원하는 유전자가 발현하는 장소에서 GFP가 형광을 발현하게 되므로, 유전자의 발현을 조사하는데 많이 사용한다. 특히 관찰이 용이하고 독성을 지니고 있지 않다는 장점으로 인해, 유전자의 발현의 유무와 장소, 시간 측정 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.

또한, 상기 프로모터는 물벼룩으로부터 추출한 트리클로산에 의해 발현이 감소하는 단백질인 2-도메인 헤모글로빈의 프로모터로서, 구체적으로 본 발명의 실시예 1-4에서 나타난 바와 같이, 현재 2-도메인 헤모글로빈의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 대해 밝혀진 바가 없으므로 promoter predictor 프로그램을 이용하여 프로모터의 3가지 후보군(HB-F1, HB-F2, HB-F3)을 두고 프로모터를 설계하였음을 알 수 있다(실시예 1-4 및 도 3참조).

상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 발현 벡터는 pBabe-GFP일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질주입된 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계 공지된 방법을 사용하여 컴피넌트 세포(E.coli BL21)에 도입할 수 있다. 컴피넌트 세포로의 형질전환(transformation)은 바람직하게는 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

형질전환된 컴피턴트 세포에서 얻은 재조합 플라스미드 DNA는 형질주입 (transfection)을 통해 숙주세포 내부로 도입하는 한다. 일반적으로 대상 세포가 세포막과 핵막을 갖는 동물세포라는 점에서 박테리아의 형질전환 (Transformation)과 구분된다.

DNA나 RNA등의 핵산은 모두 강한 음전하를 띤 고분자 생체 분자이다. 박테리아의 형질전환과 마찬가지로 동물세포에서 외부 핵산을 세포 내부로 유입시키기 위해서는 음전하를 띠고 있는 세포막을 통과해야 한다는 문제가 발생한다.

이를 해결하기 위해 생물학적, 화학적, 또는 물리적인 방법을 사용한다. 세포에 화학, 물리적 처리를 함으로서 전기적 반발력을 완화시키거나 전기 자극법 (electroporation), 미세 주입법 (micro-injection)등을 사용해서 직접 세포 내부로 DNA를 넣어주기도 한다. 아데노바이러스나 레트로바이러스와 같이 동물세포에 감염하는 바이러스를 이용하기도 한다.

동물세포 내로 외부 DNA를 transfection시키는 방법은 다양하며 현재도 활발하게 개발되고 있는 분야이다, 일반적으로 transfection 효율이나 세포에 대한 독성, 생리학적 부작용, 실험 방법의 용이성 등이 중요하게 고려되는 요소들이다. 사용하는 세포의 종류나 실험의 목적에 따라 최적의 방법을 선택해서 사용해야 한다.

숙주세포로는 상기 세포는 동물세포이며, 상기 동물세포는 HeLa cell인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 동물세포를 형질 주입하는 단계; 및 녹색 형광 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 트리클로산 유무 확인방법을 제공한다.

녹색 형광 단백질의 발현량 측정함으로써 수중환경에의 트리클로산 존재를 예상할 수 있는 생물학적 지표가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포가 트리클로산에 노출되었을 때 녹색형광 단백질의 발현량을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 트리클로산 검출용 바이오센서를 제공한다. 상기한 구성에 의하면, 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 마이크로수준으로 저렴하게 분석할 수 있는 이점이 있다. 상기 세포는 동물세포인 것이 바람직하며, 상기 동물세포는 HeLa cell인 것이 적합하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 녹색형광 단백질의 발현량을 측정하는 수단은 모든 광측정기구를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 삽입유전자를 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 자르는 단계; 녹색 형광 단백질 유전자를 갖는 발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계; 및 상기 삽입유전자와 발현벡터를 클로닝하여 동물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

먼저 트리클로산에 특이적으로 반응하는 유전자를 규명하고 얻기 위하여 독성 연구에 주로 사용되는 물벼룩의 유전자를 분리한 다음 중합효소 연쇄반응을 이용하여 독성 관련 유전자 부위를 증폭시켜 클로닝하였다. 구체적으로 상기 삽입유전자는 2-도메인 헤모글로빈 프로모터로서, 2-도메인 헤모글로빈 단백질 정보는 NCBI를 이용해 조사하였으며, 현재까지 상기 헤모글로빈의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 대해 밝혀진 바가 없어 promoter predictor 프로그램을 이용하여 상기 프로모터의 3가지 후보군을 두고 프로모터를 설계하였다.

pBabe-GFP의 프로모터인 SV40 site를 제한효소 BamHⅠ및 HindⅢ를 이용하여 제거하고 상기의 2-도메인 헤모글로빈 단백질의 프로모터 3가지 후보군을 삽입하여 재조합 벡터를 만들었다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있으며, 특정 방법에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1> 독성에 민감하게 반응하는 수생생물인 물벼룩(daphnia magna)에 트리클로산을 처리하였을 때 단백질의 변화 분석

1-1. 단백체 분석을 위한 단백질 준비 및 이차 전기영동

물벼룩의 단백질을 추출하기 위해 미국 환경청의 지침에 따라 20일 동안 배양한 D. magna 10개체를 트리클로산에 노출시키기 24시간 전에 먹이를 제공하지 않았고, 이 후에 앞서 급성 독성 실험을 통해 얻은 트리클로산의 LC20(사망률 20%)에 해당하는 농도를 처리하고 24시간을 노출시켰다. 단백질 추출을 위해 에 24시간 노출시킨 D. magna 중 살아있는 개체를 1.5 ml 튜브에 수집하고 배양액을 모두 제거한 후, 각 튜브의 D. magna를 1? DPBS 버퍼로 2회 세척하였으며 200 ?l의 lysis 버퍼를 추가해준 뒤, 초음파 균질기를 이용하여 5초 On/ 5초 Off롤 35초간 균질화 시켰다. 균질화 된 D. magna를 13000rpm으로 4에서 10분간 원심분리를 한 뒤 상층액을 수거하였다. 추출한 D. magna의 전체 단백질을 이용하기 위해서는 2-D clean up kit(GE Healthcare Biosciences)를 이용하여 불순물을 정제하여 단백질 샘플을 준비하고 bradford assay를 통하여 단백질을 정량하였다. 단백질 샘플 50㎍을 350㎕ ET rehydration buffer (6M urea, 2M Thiourea, 0.5% (v/v) Triton X-100, 1% bromophenol blue dye), 10% (v/v) 1M dithiothreitol (DTT)와 0.5% (v/v) IPG buffer (pH 3-10)에 용해시켰다. 2차원 겔 전기영동의 과정 중 isoelectric focusing은 18cm linear immobilized pH gradient(IPG) strip, pH 3-10를 멀티 스트립 라인 틀에 넣고 단백질 샘플 mixture를 골고루 넣고 Bio-Rad PROTEAN IEF cell system을 이용해 진행되며 재수화 과정은 20oC, 50V/strip조건에서 12시간 동안 진행되었다. 12시간의 재수화 과정 후 500V (2시간), 1000V (30분), 2000V (30분), 4000V (30분)을 진행하고 8000V에서 70000Vhr이 될 때까지 반응하고 즉시 SDS-PAGE를 진행함. SDS-PAGE를 진행하기 전에 solution A (1% DTT, 1.5M Tris-HCl, pH 8.8 50mM, Urea 6M, Glycerol 30%(v/v), SDS 2%, bromophenol blue)에 스트립을 15분 반응시킨 후 solution B (2.5% Iodoacetamide, 1.5M Tris-HCl, pH 8.8 50mM, Urea 6M, Glycerol 30%(v/v), SDS 2%, bromophenol blue)에 15분 반응시켰다. 스트립을 12.5% SDS-PAGE gel의 맨위에 삽입하고 sealing gel (0.5% agarose, 0.2% bromophenol blue)로 보호하여 건조를 막아주었다. SDS-PAGE에200mV, 400mA의 전기를 6시간동안 영동시켰다. 전기영동이 끝난 gel을 고정(fixing solution (50% methanol, 12% acetic acid, 38% distilled water, 0.00053% formaldehyde))함. 2시간 동안 고정과정을 거치고 50% ethanol 용액에 20분동안 2차례 씻어 sensitizing solution (0.2g/L Na2S2O3)에 1분동안 반응하고 증류수로 3번 헹궜다. 은 염색을 위해 2g/L AgNO3의 용액에 30분 동안 반응시키고 염색된 gel 을 다시 증류수로 헹궈주고 developing solution (60g/L Na2CO3, 20ml of 0.2g/L Na2S2O3, 0.00053% formaldehyde)을 처리한 뒤 2~3분 반응시켜 spot이 발현되게 하고 stopping solution (50% methanol, 12% acetic acid, 38% distilled water)을 사용하여 반응을 멈추게 하였다.

1-2. 2DE gel의 단백질 발현 분석

은 염색이 된 2차원 전기영동 gel을 스캔하여 Progenesis software (Nonlinear Dynamic Co., UK)프로그램을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 물벼룩과 사멸률 20%인 농도의 triclosan에 노출시켜 얻은 gel spot을 비교하였을 때 같은 발현 혹은 다른 발현(발현 정도의 증가, 감소, 새롭게 생겨난 또는 사라진 spot)을 보이는 spot을 분석하였다.

1-3. MALDI-TOF 질량분석법

앞서 분석된 단백질을 이용하여 유해물질에 특이적으로 반응하는 단백질을 선정하였고, 선정한 단백질이 어떤 단백질인지 알아보기 위해서 KBSI(한국기초과학지원연구원, 대전)에 MALDI-TOF 질량분석법을 의뢰하였다.

1-4. 재조합 플라스미드 제작을 위한 프로모터 설계

앞서 의뢰한 MALDI-TOF 질량분석법으로 얻은 2-도메인 헤모글로빈 단백질 정보를 NCBI를 이용해 조사하였다.

프로모터는 유전자 DNA 중 RNA중합효소가 결합하여 전사를 시작하는데 필요한 부분으로 작동유전자에 포함하는 경우도 있다. 따라서 단백질의 발현과 연관성이 있는 유전자 서열인 프로모터에 대해 조사하기로 하였다. 2-도메인 헤모글로빈을 발현시키는 프로모터를 형광이 있는 유전자 서열의 앞에 접합시키면 2-도메인 헤모글로빈의 발현을 눈으로 확인할 수 있어 발현의 차이를 측정하는데 용이할 것으로 예측된다(도1, 2 참조).

2-도메인 헤모글로빈를 발현시키는 역할을 하는 프로모터의 서열을 알고자 하였으나, 현재 2-도메인 헤모글로빈의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 대해 밝혀진 바가 없어 2-도메인 헤모글로빈을 구성하는 유전자 서열의 앞부분을 조사하였다. promoter predictor 프로그램을 이용하여 프로모터의 3가지 후보군을 두고 프로모터를 설계하였다(도 3 참조).

<실시예 2> 재조합 벡터 (MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3)의 제조

2-1. 재조합 플라스미드 제작을 위한 DNA 추출

DNA 추출은 cell SV kit(Geneall Biotechnology co., LTD)를 사용하였고 미국 환경청의 지침에 따라 20일 동안 배양한 D. magna 10개체를 1.5ml 튜브에 넣고 배지를 완전히 제거한 후 300㎕의 AL버퍼를 넣고 65°C에 10분 동안 반응시키고 개체를 균질기로 잘게 부수고 다시 65°C에서 20분간 반응(이때 주기적으로 교반)하였다. 1.5㎕의 RNase(4mg/ml)를 첨가하고 37°C에서 25분간 반응하고 상온에 5분간 두고 100㎕의 PP버퍼를 추가하고 20초 동안 강하게 vortexing하고 얼음에 5분간 두었다. 14000g의 회전 속도로 1분간 원심분리하고 상층액을 300㎕ isopropanol을 넣어둔 새 1.5ml 튜브에 넣고 하얀 침전물이 눈에 보일 때까지 부드럽게 교반하였다. 다시 14000g의 회전 속도로 1분간 원심분리하고 상층액을 제거하고 70% 에탄올을 300㎕ 첨가 후 벽을 헹구는 느낌으로 교반해주고 한번 더 14000g의 회전 속도로 1분간 원심분리를 진행하고 pipet을 이용해 조심스럽게 에탄올을 제거하였다. 완전히 에탄올을 제거하기 위해 10~15분간 튜브를 말려주고 50㎕의 증류수를 첨가 후 65°C에 1시간동안 반응하면 DNA가 rehydrate된다.

2-2. PCR을 이용한 유전자 증폭

D. magna의 DNA에서 앞서 설계한 프로모터를 증폭시켜 얻기 위해 PCR과정을 거치는데 PCR에 사용될 프라이머를 제작하였고 하기 표1에 2-도메인 헤모글로빈 프로모터의 프라이머 서열과 작용하는 효소를 나타냈다.

프라이머	서열		제한효소	서열번호
Forward primer	F1	5’-CGTGGATCCGGCCATTTATCCAGCCAA-3’	BamHI	4
	F2	5’-ATCGGATCCAACGTAAACCTTAAGCAG-3’	BamHI	6
	F3	5’-GGCGGATCCAATCTAGTTGGCATTCAA-3’	BamHI	7
Reverse primer	R	5’-CCGAAGCTTGCTGCTAATTTCTTCTGA-3’	Hind	5

프로모터 HB-F1을 증폭시키기 위하여 PrimeSTAR HS 중합효소 0.5ul, 5x 버퍼 10ul, dNTP 4ul, gDNA 2ul, 프라이머 F1 1ul, 프라이머 R 1ul, 증류수 31.5ul를 섞은 후, 94에서 5분간 Pre-denaturation을 한 후, 94에서 30초간 Denatureation하고, 60에서 30초간 Anealing하며, 72에서 1분간 Extension하는 단계를 총 28회(cycle) 반복하고, 72에서 7분간 Denaturation하는 방법으로 수행하여 1336bp의 product를 얻었다.

프로모터 HB-F2와 HB-F3을 증폭시키기 위하여 Ex Taq 중합효소 0.2ul, 10x 버퍼 5ul, dNTP 4ul, gDNA 1ul, 프라이머 F 1ul, 프라이머 R 1ul, 증류수 37.8ul를 섞은 후, 94에서 5분간 Pre-denaturation을 한 후, 94에서 30초간 Denatureation하고, HB-F2는 65°C, HB-F3는 60°C의 온도로 30초간 Anealing하며, 72에서 1분간 Extension하는 단계를 총 28회(cycle) 반복하고, 72에서 7분간 Denaturation하는 방법으로 수행하여 HB-F2는 528bp, HB-F3는 218bp의 product를 얻었다.

2-2. 클로닝을 통하여 pbabe-GFP에 프로모터 삽입

GFP site를 포함하는 벡터인 pBabe-GFP의 프로모터인 SV40 site를 제한효소 BamH 및 Hind을 이용하여 제거하고 프로모터 site에 앞서 설계한 2-domain hemoglobin의 프로모터 후보군 3가지를 삽입하기로 하였다.

pbabe-GFP 벡터와 2-도메인 헤모글로빈의 프로모터 HB-F1, HB-F2, HB-F3의 PCR product를 제한효소 BamH와 Hind을 이용해 37°C에서 2시간동안 digestion을 하였다. 그 후, 4°C에서 overnight 조건으로 ligation 한 후 electrophoresis를 이용한 transformation을 진행하였다. Electrophoresis를 이용하기 위하여 ligation한 sample을 70% 에탄올과 100%에탄올을 이용하여 세척을 한 후, voltage를 1800V, resistor를 200?, capacitor를 25uF 로 설정하여 electrophoresis를 진행하였으며, E. coli BL21 (DE3) 내로 도입하였다. LB medium에 옮긴 후, 37°C에서 40분간 배양하고 ampicillin이 함유된 LB 배지에서 배양하여 단일 콜로니를 얻고, 재조합 된 벡터를 추출하였다. 재조합 된 벡터를 추출한 후 digestion으로 확인해 본 결과 각각 프로모터 HB-F1, HB-F2, HB-F3가 벡터에 잘 삽입됨을 확인하였고 이 벡터를 MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3이라고 명명한다(도4 참조).

2-3. 재조합 플라스미드 DNA 추출

재조합 플라스미드 DNA의 추출에는 plasmid SV kit(Geneall Biotechnology co., LTD)를 사용하였다. MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3이 형질전환된 대장균의 콜로니를 seed culture 16~21시간 동안 배양하여 OD600값이 4.0이 될 때까지 배양 하였다. 상기 배양 후, 원심분리를 통해 배양액을 제거하고 균주만 수득한 후, S1 버퍼를 250㎕넣어주고 뭉친 균주를 균일하게 풀어주며 반응시키고 새로운 1.5ml 튜브에 옮겨주었다. 250㎕의 S2 버퍼를 첨가해주고 4~6회 정도 교반하여 준 후 튜브 뚜껑을 열어 끈적하게 변했는지 확인하고 S3 버퍼를 350㎕넣고 충분히 교반하여 하얗게 변하는 것을 관찰하고 즉시 13000rpm으로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 SV column에 옮기고 13000rpm으로 30초 동안 원심분리한 뒤 액체를 버리고 AW 버퍼를 500㎕첨가하고 다시 13000rpm으로 30초 동안 원심분리 후 액체 제거하였다. 추가적으로 700㎕ 13000rpm으로 30초 동안 원심분리하고 액체를 제거하고 13000rpm으로 1분 더 원심분리 하였다. 마지막으로 50㎕의 증류수를 넣어주고 1분 반응 후 원심분리를 이용해 추출하였다.

<실시예 3> 재조합 동물세포의 형광 발현 확인

3-1. 형질주입을 통한 동물 세포의 형광 발현 확인

추출한 플라스미드 DNA의 형광 발현을 확인하기 위한 형질 전환 실험을 진행하고자 하였다. 이 실험에서 사용된 동물세포는 HeLa cell(인간의 자궁경부암 세포)은 증식이 빠르며 배양이 쉬운 암세포의 특성 때문에 실험에 사용하기 용이하다.

100? plate에 HeLa cell을 plate면적의 60~70%정도 키우고 24시간 절식하고 형질주입을 진행하였다. 형질주입은 solution A(DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium) 1㎖과 plasmid DNA 40㎍ 혼합)와 solution B(DMEM(Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium) 1㎖과 lipofectamin 40㎕ 혼합)를 20분 동안 반응 시키고 HeLa cell에 주입하였다. 3~6시간 간격으로 현미경으로 HeLa cell을 관찰하여 형질주입이 잘 진행되었는지 확인하고 형질주입이 확인되면 배지(DMEM8㎖, 5%NCS, penicillin)를 갈아주어 영양을 공급하여 주고 24시간 동안 추가 반응 후 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 형광 발현을 관찰하였다. MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3 중 MBTL-HY3에서의 형광 발현이 두드러지게 나타났음을 확인할 수 있었다. (도5 참고)

3-2. 트리클로산을 처리한 동물 세포의 형광 발현 확인

앞서 세 가지 서로 다른 프로모터을 가진 plasmid DNA를 형질주입된 헤라셀에 서로 다른 농도(1,1.5, 2, 2.3, 2.7ppm)의 트리클로산을 처리하고 24시간 배양하여 그 형광도를 측정하였다. 각각 농도 당 12개의 샘플에서 나온 값의 평균을 이용하여 그래프를 작성하였다. MBTL-HY1, MBTL-HY2, MBTL-HY3 중 MBTL-HY3에서 트리클로산 농도가 높아짐에 따라 형광이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 특히, MBTL-HY3의 경우 트리클로산의 농도가 0에서 2.7로 증가함에 따라 형광이 약 75% 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 바탕으로 MBTL-HY3가 트리클로산에 반응하는 것으로 판단하고 트리클로산에만 특정하게 반응하는지 확인하기 위해 여러 종류의 화학물질을 이용하였다(도6 참조).

3-3. 다양한 화학물질을 처리한 동물 세포의 형광 발현 확인

MBTL-HY3 plasmid DNA를 형질주입된 HeLa cell에 사멸에 영향을 주지 않는 정도의 서로 다른 농도의 caffeine(a), glyphosate(b), methidathion(c), Lead(II) acetate trihydrate(d)를 처리하고 24시간 배양하여 그 형광도를 측정하였다. 각각 농도 당 12개의 샘플에서 나온 값의 평균을 이용하여 그래프를 작성하였다. caffeine(a), glyphosate(b), methidathion(c), Lead(II) acetate trihydrate(d)를 처리한 경우 각각 relatively fluorescence unit(RFU)가 처리농도에 관계없이 25 내지 35사이의 값으로 형광 발현의 차이가 거의 없음을 확인할 수 있었다(도7 참조).

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> A recombinant vector for indicating, transgenic cell transformed by the recombinant vector and Biosensor detecting triclosan <130> 1060571 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-domain hemoglobin promoter sequence for HB-F1 <400> 1 ggccatttat ccagccaaaa gtcacgtaac aacacaaatg ttgcctacgt gcacggcgtt 60 tcaaacaatt cctataaata ggggatgaat ccttgcagtg accatctggt ttggtttcag 120 aaagcaattc gaaaattcga acgcacgtta atcgaccatt ttttttattt cttaaatttg 180 tgtatgtgta acgcgtgtga tgaatgttat cgtctgtagc aaaaagtgaa ggtgttaagc 240 atgtgatcaa attcgcgctg tttcaatgcc tggcaacatc aatttcgatc cgttacgtac 300 acaaagatca tcgcacggaa ccaacggaaa tgagattttt ggaaccaatt aagttacaca 360 tttagttact tcaatacttg gcggtcttta attagaaatt tggaatctca aagatagttg 420 actattctga gacctgctgg gctaactgaa tacatttgtt aacagtgatt aacacaattg 480 ctaaactaaa ctgggaaaga ataccattgt caacaagtgg taggaactat taaaaaatat 540 catgaacctg ttctcaaaac atggaacaac aacaaaaagt ttgaaaacaa accagtgcaa 600 tatcaaatat tatttctgaa taatcaaatt actaattgac cgcttgagtt tggctaatga 660 cgcaacgaaa ttcatagatc atttttaagg ggcaatagca catcaaatga attgagcatt 720 caatccattg gagccgatgc taaaactcga tgcgcgcaag atcgtaaagg ccaccacaaa 780 acttaacggt agctcttaag aaaaacaaaa cgtaaacctt aagcagtagc cagcgtgtaa 840 aaacagctac gtgacagatg gcacgtatac caagagggca acgggatcaa acattgagat 900 aaagagtcaa aattcacatt acgtccaatg atcaacagtt caaaaggtta gatcctacag 960 tcaatttaga catccttcta cttaagggca aataagcgat ggcgtgaatc acgcaccgga 1020 ccgtatcgga cccaacgact gctacagacg caagataagc cccagatcga ctttcagtat 1080 gggttgatta aaaacaaaaa agaaaaccag ctggagtaaa tctagttggc attcaaagaa 1140 aaagaaatca cgatttcggg aaatgaatat caaatcacat tagtgaaatt cacaagtcac 1200 gtacaccaaa aacatgggca acatttacga ggaattggaa tcgtaacttg ttgaacctcg 1260 atccgtataa aaggatgtcc gtgtggatgg aagagcatca gttaaccgtc tgatattttc 1320 agaagaaatt agcagc 1336 <210> 2 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-domain hemoglobin promoter sequence for HB-F2 <400> 2 aacgtaaacc ttaagcagta gccagcgtgt aaaaacagct acgtgacaga tggcacgtat 60 accaagaggg caacgggatc aaacattgag ataaagagtc aaaattcaca ttacgtccaa 120 tgatcaacag ttcaaaaggt tagatcctac agtcaattta gacatccttc tacttaaggg 180 caaataagcg atggcgtgaa tcacgcaccg gaccgtatcg gacccaacga ctgctacaga 240 cgcaagataa gccccagatc gactttcagt atgggttgat taaaaacaaa aaagaaaacc 300 agctggagta aatctagttg gcattcaaag aaaaagaaat cacgatttcg ggaaatgaat 360 atcaaatcac attagtgaaa ttcacaagtc acgtacacca aaaacatggg caacatttac 420 gaggaattgg aatcgtaact tgttgaacct cgatccgtat aaaaggatgt ccgtgtggat 480 ggaagagcat cagttaaccg tctgatattt tcagaagaaa ttagcagc 528 <210> 3 <211> 218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-domain hemoglobin promoter sequence for HB-F3 <400> 3 aatctagttg gcattcaaag aaaaagaaat cacgatttcg ggaaatgaat atcaaatcac 60 attagtgaaa ttcacaagtc acgtacacca aaaacatggg caacatttac gaggaattgg 120 aatcgtaact tgttgaacct cgatccgtat aaaaggatgt ccgtgtggat ggaagagcat 180 cagttaaccg tctgatattt tcagaagaaa ttagcagc 218 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB-F1(forward primer) <400> 4 cgtggatccg gccatttatc cagccaa 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB-R(reverse primer) <400> 5 ccgaagcttg ctgctaattt cttctga 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB-F2(forward primer) <400> 6 atcggatcca acgtaaacct taagcag 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB-F3(forward primer) <400> 7 ggcggatcca atctagttgg cattcaa 27

Claims (9)

1. 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및
   상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 백터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터는 서열번호 4, 6 및 7의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택되는 포워드 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 5의 리버스 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하여 수득된 것을 특징으로 하는
   재조합 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 형광 단백질은 녹색형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)인 것을 특징으로 하는
   재조합 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터는 트리클로산에 의하여 형광 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
   재조합 벡터.
   
5. 제1항의 벡터로 형질전환된 동물세포.
   
6. (a) 제1항의 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환하는 단계;
   (b) 상기 형질전환된 동물세포 및 시료를 배양하는 단계; 및
   (c) 상기 동물세포 또는 시료에서 형광 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 트리클로산의 검출방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   (d) 상기 형광 단백질의 발현이 감소할 경우, 트리클로산이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
   트리클로산의 검출방법.
   
8. 제5항의 동물세포를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서.
   
9. (a) 2-도메인 헤모글로빈 프로모터; 및
   상기 2-도메인 헤모글로빈 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환시키는 단계; 를 포함하는 트리클로산 검출용 바이오센서의 제조방법.
   
   

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