CN106800600B - 检测蜱传脑炎病毒感染的系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测蜱传脑炎病毒感染的系统。本发明所提供的检测蜱传脑炎病毒感染的系统，由蜱传脑炎病毒抗原和荧光素酶NanoLuc组成的融合蛋白以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂和/或仪器组成；所述融合蛋白为下述I1)或I2)的蛋白质：I1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；I2)在SEQ ID No.1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由I1)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的Nanoluc‑EIII和检测蜱传脑炎病毒感染的系统可以在37℃和室温下检测人的血清是否被蜱传脑炎病毒感染。

Description

检测蜱传脑炎病毒感染的系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域中检测蜱传脑炎病毒感染的系统。

背景技术

TBEV是经由蜱虫叮咬传播的一种病毒，可引起脑炎和脑膜炎，并可造成严重的神经系统后遗症。TBEV感染的诊断主要依靠血清学和病原核酸检测。TBEV的编码蛋白包括：C、PrM(M)、E、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS。

基于荧光素酶的免疫捕获系统(Luciferase immuno capture,Luc-IC)通过将检测抗原与荧光素酶重组表达，与待测样本孵育后，通过检测荧光素酶的强度确定待测样本中的抗体含量，具有快速、灵敏的特点和优势。Luc-IC检测系统的优势在于选择在哺乳动物细胞表达抗原，真核细胞表达的蛋白在空间构象、结构、功能方面与天然蛋白更接近，检测特异性高，且不需要蛋白的提取和纯化，方法简便；并且检测的时间更短，方法简便，已于操作。

海肾荧光素酶(Renilla luciferase,RLuc)报告基因，全长为936bp，在真核表达系统中表达产生的海肾荧光素酶，可以通过与海肾荧光素酶底物作用发出生物荧光来检测海肾荧光素酶活性，其检测的灵敏性极高，但目前所用的海肾荧光素酶不稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测人的血清是否被蜱传脑炎病毒感染。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测蜱传脑炎病毒感染的系统。

本发明所提供的检测蜱传脑炎病毒感染的系统，其名称为检测蜱传脑炎病毒感染的系统1，含有由蜱传脑炎病毒抗原和荧光素酶NanoLuc组成的融合蛋白；所述融合蛋白的名称为Nanoluc-EIII，是下述I1)或I2)的蛋白质：

I1)SEQ ID No.1所示的蛋白质；

I2)在SEQ ID No.1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由I1)衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由1-300个氨基酸组成，SEQ ID No.1的第208-300位氨基酸为蜱传脑炎病毒抗原的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第1-199位氨基酸为所述荧光素酶NanoLuc的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第200-207位氨基酸为连接肽的氨基酸序列。

本申请的检测蜱传脑炎病毒感染的系统1，包括利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒试剂和/或仪器。具体来说，检测蜱传脑炎病毒感染的系统1可由Nanoluc-EIII、LIPS Buffer、Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent、荧光素酶底物以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂和/或仪器组成。当然，检测蜱传脑炎病毒感染的系统1也可由Nanoluc-EIII与所述LIPS Buffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。检测蜱传脑炎病毒感染的系统1也可由Nanoluc-EIII、所述仪器与所述LIPS Buffer、是Protein A/G PLUS-AgroseImmunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。

所述LIPS Buffer由溶质和水组成，其中溶质的各组分及其浓度分别为：20mMTris,150mM NaCl,5mM MgCl₂和1％(质量百分比浓度)Triton-X-100。所述Protein A/GPLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent可为SANTA CRUZ产品，货号为sc2003。所述荧光素酶底物可为Promega公司产品，货号为N1110。所述仪器可为化学发光检测仪。所述化学发光检测仪具体可为promega的GLOMAX 20/20 LUMINOMETERER。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1也可为检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒。所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒可为荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒1。具体来说，所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒1可由Nanoluc-EIII、所述LIPSBuffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent、所述荧光素酶底物以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂组成。当然，所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒1也可由Nanoluc-EIII与所述LIPSBuffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1与所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒1的适用温度均可为22℃-37℃。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1与所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒1还包括记载下述内容的载体：以临床确诊的TBEV感染阴性人血清的荧光平均值与3倍标准差之和作为判断待测血清是否感染TBEV的参考值，如待测血清的荧光值大于或等于所述参考值，待测血清为TBEV感染血清，如待测血清的荧光值小于所述参考值，待测血清为未被TBEV感染血清。

上述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1中，Nanoluc-EIII的制备方法，可包括下述S1)和S2)的步骤：

S1)将Nanoluc-EIII的编码基因导入真核细胞中，得到重组细胞；

S2)培养所述重组细胞，使所述Nanoluc-EIII的编码基因表达，得到所述融合蛋白；

所述Nanoluc-EIII的编码基因为如下C1)或C2)或C3)所示的核酸分子：

C1)序列表中SEQ ID No.2所示的核酸分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同功能蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同功能蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，SEQ ID No.2由1-900个核苷酸组成，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。SEQ ID No.2的第622-900位核苷酸编码SEQ ID No.1的第208-300位氨基酸所示的蜱传脑炎病毒抗原；SEQ ID No.2的第1-597位核苷酸编码SEQ ID No.1的第1-199位氨基酸所示的NanoLuc；SEQ ID No.2的第598-621位核苷酸编码SEQ ID No.1的第200-207位氨基酸所示的连接肽。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1中，所述真核细胞可为cos7细胞。

上述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1中，所述培养进行4-60小时。

上述检测蜱传脑炎病毒感染的系统1盒中，所述4-60小时可为48小时。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述Nanoluc-EIII表达方法。

为解决上述技术问题，本发明还提供了Nanoluc-EIII。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与Nanoluc-EIII相关的生物材料。

本发明所提供的与Nanoluc-EIII相关的生物材料，为下述E1)至E21)中的任一种：

E1)编码Nanoluc-EIII的核酸分子；

E2)Nanoluc-EIII的编码基因；

E3)含有E2)所述基因的表达盒；

E4)含有E2)所述基因的重组载体；

E5)含有E3)所述表达盒的重组载体；

E6)含有E2)所述基因的重组微生物；

E7)含有E3)所述表达盒的重组微生物；

E8)含有E4)所述重组载体的重组微生物；

E9)含有E5)所述重组载体的重组微生物；

E10)含有E2)所述基因的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E11)含有E3)所述表达盒的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E12)含有E4)所述重组载体的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E13)含有E5)所述重组载体的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E14)含有E2)所述基因的转基因植物组织或转基因动物组织；

E15)含有E3)所述表达盒的转基因植物组织或转基因动物组织；

E16)含有E4)所述重组载体的转基因植物组织或转基因动物组织；

E17)含有E5)所述重组载体的转基因植物组织或转基因动物组织；

E18)含有E2)所述基因的转基因植物器官或转基因动物器官；

E19)含有E3)所述表达盒的转基因植物器官或转基因动物器官；

E20)含有E4)所述重组载体的转基因植物器官或转基因动物器官；

E21)含有E5)所述重组载体的转基因植物器官或转基因动物器官。

上述生物材料中，E1)所述核酸分子具体可为如下C1)或C2)或C3)所示的核酸分子：

C1)序列表中SEQ ID No.2所示的核酸分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同功能蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同功能蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质且具有相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，E3)所述的含有Nanoluc-EIII的编码基因的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达Nanoluc-EIII的DNA，该DNA不但可包括启动Nanoluc-EIII的编码基因转录的启动子，还可包括终止Nanoluc-EIII的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有Nanoluc-EIII的编码基因的表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。

上述生物材料中，所述细胞系可为cos7细胞系。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、所述转基因动物细胞细胞系、所述转基因植物组织、所述转基因动物组织、所述转基因植物器官和所述转基因动物器官均不包括繁殖材料。

在本发明的一个实施方式中，Nanoluc-EIII的编码基因基因通过含有Nanoluc-EIII的编码基因的表达盒的重组载体导入cos7细胞中。

所述含有Nanoluc-EIII的编码基因的表达盒的重组载体为将载体pcDNA3.1(+)的NheI和XhoI识别位点之间的序列替换为SEQ ID No.2所示的DNA片段(保持pcDNA3.1(+)的其他序列不变)，得到重组载体pcDNA3.1-Nanoluc-EIII，pcDNA3.1-Nanoluc-EIII表达SEQID No.1所示的Nanoluc-EIII。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测蜱传脑炎病毒感染的系统。

本发明所提供的检测蜱传脑炎病毒感染的系统，其名称为检测蜱传脑炎病毒感染的系统2，含有所述的生物材料。

本申请的检测蜱传脑炎病毒感染的系统2，包括利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒试剂和/或仪器。具体来说，检测蜱传脑炎病毒感染的系统2可由所述生物材料、所述LIPS Buffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose ImmunoprecipitationReagent、所述荧光素酶底物以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂和/或仪器组成。当然，检测蜱传脑炎病毒感染的系统2也可由所述生物材料与所述LIPS Buffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。检测蜱传脑炎病毒感染的系统2也可由所述生物材料、所述仪器与所述LIPS Buffer、所述Protein A/G PLUS-AgroseImmunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。

所述仪器可为所述化学发光检测仪。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统2也可为检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒。所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒可为荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒2。具体来说，所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒2可由所述生物材料、所述LIPSBuffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent、所述荧光素酶底物以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂组成。当然，所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒2也可由所述生物材料与所述LIPSBuffer、所述Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和所述荧光素酶底物这三种中的三种、任两种或任一种组成。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统2与所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒2的适用温度均可为22℃-37℃。

所述检测蜱传脑炎病毒感染的系统2与所述检测蜱传脑炎病毒感染的试剂或试剂盒2还包括记载下述内容的载体：以临床确诊的TBEV感染阴性人血清的荧光平均值与3倍标准差之和作为判断待测血清是否感染TBEV的参考值，如待测血清的荧光值大于或等于所述参考值，待测血清为TBEV感染血清，如待测血清的荧光值小于所述参考值，待测血清为未被TBEV感染血清。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ⅰ-Ⅵ中任一应用：

Ⅰ、Nanoluc-EIII在制备检测蜱传脑炎病毒感染的荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒中的应用；

Ⅱ、Nanoluc-EIII在制备检测是否感染蜱传脑炎病毒的产品中的应用；

Ⅲ、所述生物材料在制备检测蜱传脑炎病毒感染的荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒中的应用；

Ⅳ、所述生物材料在制备检测是否感染蜱传脑炎病毒的产品中的应用；

Ⅴ、Nanoluc-EIII在检测是否感染蜱传脑炎病毒中的应用；

Ⅵ、所述生物材料在检测是否感染蜱传脑炎病毒中的应用。

上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。

为了使本发明的融合蛋白便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表所示的标签。

表、标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

实验证明，本发明的Nanoluc-EIII重组抗原在室温和37℃下均具有较好的稳定性。在37℃下，利用本发明的Nanoluc-EIII重组抗原和检测蜱传脑炎病毒感染的系统检测TBEV感染血清的真阳性率是100％，真阴性率是100％。本发明的Nanoluc-EIII和检测蜱传脑炎病毒感染的系统在37℃下具有高真阳性率和真阴性率。利用Rluc-EIII检测TBEV感染血清的真阳性率是42.11％，真阴性率是100％；利用本发明的Nanoluc-EIII和检测蜱传脑炎病毒感染的系统检测TBEV感染血清的真阳性率与真阴性率分别高于利用Rluc-EIII检测TBEV感染血清的真阳性率。本发明的Nanoluc-EIII和检测蜱传脑炎病毒感染的系统可以在37℃和室温下检测人的血清是否被蜱传脑炎病毒感染。

附图说明

图1为Nanoluc-EIII与Rluc-EIII在不同的稀释倍数下的荧光强度。其中，A为Rluc-EIII在不同的稀释倍数下的荧光强度，B为Nanoluc-EIII在不同的稀释倍数下的荧光强度。

图2为Nanoluc-EIII与Rluc-EIII在不同的温度下的稳定性的检测结果。其中，A为Rluc-EIII在不同的温度下的稳定性的检测结果，B为Nanoluc-EIII在不同的温度下的稳定性的检测结果。

图3为NanoLuc-EIII重组抗原的LIPS检测结果。

图4为RLuc-EIII重组抗原的LIPS检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pcDNA3.1(+)为Invitrogen产品，货号为V790-20。

下述实施例中的cos7细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)，CRL-1651。

下述实施例中的LIPS Buffer由溶质和水组成，其中溶质的各组分及其浓度分别为：20mM Tris，150mM NaCl，5mM MgCl₂和1％(质量百分比浓度)Triton-X-100。

下述实施例中的临床确诊的TBEV感染阳性人血清的临床诊断依据为病人均出现免疫的森林脑炎症状(发热、头痛，并伴随有意识障碍等神经系统疾病)，有蜱虫叮咬史，并可从血液中检测到病毒核酸。临床确诊的TBEV感染阴性人血清均为无森林脑炎症状的体检患者或健康者的血清。

实施例1、融合蛋白Nanoluc-EIII可用于检测TBEV感染血清

本实施例提供了蜱传脑炎病毒EIII蛋白质和Nanoluc的融合蛋白在检测TBEV感染血清中的应用，将蜱传脑炎病毒EIII蛋白质和Nanoluc的融合蛋白命名为Nanoluc-EIII，Nanoluc-EIII为SEQ ID No.1所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID No.2所示。其中SEQ IDNo.1的第208-300位为蜱传脑炎病毒EIII蛋白质的序列，SEQ ID No.1的第1-199位为Nanoluc的序列，SEQ ID No.1的第200-207位为连接肽的序列。

1、Nanoluc-EIII的制备

1.1重组载体的构建

将pcDNA3.1(+)载体的NheI和XhoI识别位点之间的序列替换为蜱传脑炎病毒EIII蛋白质和Nanoluc的融合蛋白的编码基因(序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，保持pcDNA3.1(+)的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pcDNA3.1-Nanoluc-EIII，pcDNA3.1-Nanoluc-EIII表达SEQ ID No.1所示的融合蛋白。

将pcDNA3.1(+)载体的NheI和XhoI识别位点之间的序列替换为蜱传脑炎病毒EIII蛋白质和海肾荧光素酶的融合蛋白的编码基因(序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)，保持pcDNA3.1(+)的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pcDNA3.1-Rluc-EIII，pcDNA3.1-Rluc-EIII表达SEQ ID No.3所示的融合蛋白。

1.2Nanoluc-EIII的制备

(1)重组载体pcDNA3.1-Nanoluc-EIII转染cos7细胞并获得Nanoluc-EIII：

①将cos7细胞以10⁵个/孔接种于24孔细胞培养板中，每孔1ml DMEM细胞培养基，GIBCO)，于37℃、5％CO₂的条件下培养，观察细胞状态，在细胞生长密度达到约70％-80％时进行转染实验；

②取2μl的Lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于25μl的opti-MEM(GIBCO)中,混合均匀，室温放置5min；

③取步骤1.1重组载体pcDNA3.1-Nanoluc-EIII 0.5μg稀释于25μl的opti-MEM中，混合均匀；

④将步骤②和步骤③中的体系混合均匀，再室温静止25min，得到复合体系；

⑤将步骤①的培养好的细胞从恒温孵箱中取出，用PBS轻缓的洗涤两次后，将步骤④的复合体系按照每孔50μl的标准慢慢的加入到细胞培养板中(防止细胞脱落)，得到体系1；

⑥向步骤⑤的体系1中加450μl的opti-MEM，于37℃、5％CO₂的条件下培养48小时进行转染，得到含有重组载体pcDNA3.1-Nanoluc-EIII的重组细胞；

⑦直接收集转染的上清液，即得到含有Nanoluc-EIII抗原的溶液(重组抗原不需要纯化)，通过测定溶液中的荧光素酶活性确定确定蛋白的表达量。

按照步骤①-⑥的方法，将pcDNA3.1-Nanoluc-EIII替换为pcDNA3.1-Rluc-EIII，其他步骤均不变，得到转染后的体系，去除转染后的体系中的培养液，PBS轻缓的洗涤两次，得到转染pcDNA3.1(+)-Rluc-EIII的细胞；向细胞孔中加入100μl的Renilla LuciferaseAssay Lysis Buffer，室温震荡15min，得到含有Rluc-EIII抗原的细胞裂解液，重组抗原不需要纯化，通过测定溶液中的荧光素酶活性确定确定蛋白的表达量。。

2、按照下述方法进行抗原荧光强度的检测：

①取步骤1的含有Nanoluc-EIII抗原的溶液10μl放于1.7ml的EP管中；

②向步骤①的EP管中加入荧光素酶底物(Promega，Nano-Glo Luciferase AssaySystem，N1110)50μl，混合均匀；

③将步骤②的EP管置于化学发光检测仪(GLOMAX 20/20LUMINOMETERER)中，设置荧光检测的检测持续时间为10s，观察记录Nanoluc-EIII的荧光强度值。

按照步骤①-③的方法，将含有Nanoluc-EIII抗原溶液替换为将含有Nanoluc-EIII抗原溶液稀释不同倍数得到的稀释液，其他步骤均不变，观察记录Nanoluc-EIII的荧光强度值。

按照步骤①-③的方法，将含有Nanoluc-EIII抗原的溶液替换为含有Rluc-EIII抗原的细胞裂解液并将荧光素酶底物(Promega，Nano-Glo Luciferase Assay System，N1110)替换为Renilla Luciferase Assay Substrate(Promega)，其他步骤均不变，检测Rluc-EIII的荧光强度值。

按照步骤①-③的方法，将含有Nanoluc-EIII抗原的溶液替换为将含有Rluc-EIII抗原的细胞裂解液稀释不同倍数得到的稀释液，其他步骤均不变，观察记录Rluc-EIII的荧光强度值。

结果如图1与表1所示，结果显示，Nanoluc-EIII中的荧光素酶得到了正确表达，而且Nanoluc-EIII的荧光强度随稀释倍数的增加呈现良好的线性关系，该线性关系好于Rluc-EIII的荧光强度与稀释倍数的线性关系。

表1、Nanoluc-EIII与Rluc-EIII在不同的稀释倍数下的荧光强度

稀释倍数	Nanoluc-EIII的荧光强度值	稀释倍数	Rluc-EIII的荧光强度值
				1	1191384000	1	43526770
10	88569720	2	20858350
				10<sup>2</sup>	8800929	4	11716210
10<sup>3</sup>	1079492	8	6758698
				10<sup>4</sup>	123646	16	4487812
10<sup>5</sup>	13865	32	1790070
				10<sup>6</sup>	1555	64	904049
——	——	128	339117

3、按照下述方法检测NanoLuc-EIII的稳定性：

将步骤1的含有Nanoluc-EIII抗原的溶液分别在室温和37℃下分别放置10min，30min，1h，2h，4h，8h和16h，然后分别加入荧光素酶底物，检测荧光强度。

将步骤1的含有Rluc-EIII抗原的细胞裂解液分别在室温和37℃下分别放置10min，30min，1h，2h，4h，8h和16h，然后分别加入荧光素酶底物，检测荧光强度。

结果如表2和图2所示，结果显示，尽管在室温(22℃)下，两种荧光素酶的活性均较为稳定，放置16h小时以上酶活性丧失不超过10％，但在37℃条件下，Rluc-EIII的酶活性快速失活，10min以上即可降低50％，而Nanoluc-EIII的酶活性没有明显下降，表明Nanoluc-EIII在37℃下，具有更好的稳定性。

表2、NanoLuc-EIII在室温和37℃下的稳定性

4、利用NanoLuc-EIII检测TBEV感染血清的真阳性率和真阴性率

采用LIPS检测方法，评价Nanoluc-EIII和RLuc-EIII重组抗原的检测灵敏性和特异性，Nanoluc-EIII重组抗原在37℃条件下孵育，RLuc-EIII重组抗原在室温下进行孵育；检测标本选用19份临床确诊的TBEV感染阳性人血清样品和7份临床确诊的TBEV感染阴性人血清样品，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

(1)取步骤1的含有Nanoluc-EIII抗原的溶液10μl(对应荧光值为1-10×10⁶)，血清标本0.2μl，加入到有89.8μl的LIPS Buffer的EP管中混合均匀，组成100μl的抗原抗体混合体系，置于37℃震荡孵育30min；

(2)取100μl的Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent：sc2003(SANTA CRUZ)原液，使用LIPS Buffer洗涤3次，向固体部分添加LIPS Buffer，最终混匀为100μl的凝珠体系；

(3)将步骤(1)孵育后的体系和步骤(2)中的凝珠体系混合均匀后，置于37℃下震荡孵育30min；

(4)孵育结束后，5000rpm离心去除上清，加入1ml的LIPS Buffer轻缓的洗涤，再5000rpm离心去除洗涤液，共洗涤3次后，再使用PBS洗涤1次，除去上清液体，得到得到琼脂糖凝珠沉淀；

(5)向步骤(4)的沉淀中加入50μl的荧光素酶底物(Promega，Nano-GloLuciferase Assay System，N1110)，放入化学发光检测仪，检测持续时间为10s，得到利用Nanoluc-EIII重组抗原在37℃下检测人血清样品的荧光强度值，并记录数据(表2和图3)。

按照上述方法，将含有Nanoluc-EIII抗原的溶液替换为含有Rluc-EIII抗原的细胞裂解液并将37℃替换为室温(22℃)，两次孵育时间均延长至1h(37℃更有利于抗原抗体的结合，因此Nanoluc-EIII重组抗原在37℃条件下两次孵育时间均较短，为30min，而Rluc-EIII重组抗原是在室温条件下孵育，因此两次孵育时间相应延长为1h)，其他步骤均不变，得到利用Rluc-EIII重组抗原在室温下检测人血清样品的荧光强度，并记录数据(表3和图4)。

表2、Nanoluc-EIII在37℃下检测各血清样本时的平均荧光强度及检测结果

注：“+”表示血清样本被判定为TBEV感染血清；“-”表示血清样本被判定为未被TBEV感染血清；“——”表示无该数据。

当LIPS反应的荧光值大于或等于7份阴性血清标本荧光平均值与3倍标准差之和(即2094.57)时，血清样本被判定为TBEV感染血清；当LIPS反应的荧光值小于阴性血清平均值与3倍标准差之和(即2094.57)时，血清样本被判定为未被TBEV感染血清。统计在37℃下利用NanoLuc-EIII重组抗原检测TBEV感染血清的真阳性率和真阴性率。真阳性率为临床确诊的TBEV感染阳性人血清采用NanoLuc-EIII检测结果为TBEV感染阳性血清的百分率；真阴性率为临床确诊的TBEV感染阴性人血清采用NanoLuc-EIII检测结果为TBEV感染阴性血清的百分率。

结果表明，在37℃下，利用NanoLuc-EIII从这19份临床确诊的TBEV感染阳性人血清样品中检测出19份TBEV感染的阳性人血清，真阳性率是100％；利用NanoLuc-EIII从这7份临床确诊的TBEV感染阴性人血清样品中检测出7份TBEV感染的临床阴性病人血清，真阴性率是100％。

表3、Rluc-EIII在室温下检测各血清样本时的平均荧光强度及检测结果

注：“+”表示血清样本被判定为TBEV感染血清；“-”表示血清样本被判定为未被TBEV感染血清；“——”表示无该数据。

当LIPS反应的荧光值大于或等于7份阴性血清标本荧光平均值与3倍标准差之和(即16951.05)时，血清样本被判定为TBEV感染血清；当LIPS反应的荧光值小于阴性血清平均值与3倍标准差之和(即16951.05)时，血清样本被判定为未被TBEV感染血清。统计Rluc-EIII检测TBEV感染血清的真阳性率和真阴性率。真阳性率为临床确诊的TBEV感染阳性人血清采用Rluc-EIII检测结果为TBEV感染阳性血清的百分率；真阴性率为临床确诊的TBEV感染阴性人血清采用Rluc-EIII检测结果为TBEV感染阴性血清的百分率。

结果表明，在室温下，利用Rluc-EIII从这19份临床确诊的TBEV感染阳性人血清样品中检测出8份TBEV感染的阳性人血清，真阳性率是42.11％；利用Rluc-EIII从这7份临床确诊的TBEV感染阴性人血清样品中检测出7份TBEV感染的临床阴性病人血清，真阴性率是100％。

结果表明，利用NanoLuc-EIII检测人血清比利用Rluc-EIII检测人血清具有更高的真阳性率与真阴性率，并且在37℃下利用NanoLuc-EIII检测人血清也具有很高的真阳性率与真阴性率。

Claims (11)

1.检测蜱传脑炎病毒感染的系统，由蜱传脑炎病毒抗原和荧光素酶NanoLuc组成的融合蛋白以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂和/或仪器组成；所述融合蛋白为SEQ ID No.1所示的蛋白质；

所述试剂为LIPS Buffer、Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和/或荧光素酶底物；

所述LIPS Buffer由溶质和水组成，其中溶质的各组分及其浓度分别为：20mM Tris,150mM NaCl,5mM MgCl₂和1％质量百分比浓度的Triton-X-100；

所述仪器为化学发光检测仪。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述融合蛋白由融合蛋白表达方法制备，所述融合蛋白表达方法包括下述S1)和S2)：

S1)将权利要求1所述的融合蛋白的编码基因导入真核细胞中，得到重组细胞；

S2)培养所述重组细胞，使所述编码基因表达，得到所述融合蛋白；

所述融合蛋白的编码基因为序列表中SEQ ID No.2所示的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于：所述培养进行4-60小时。

4.权利要求2或3所述系统中所述融合蛋白表达方法。

5.权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白。

6.与权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白相关的生物材料，为下述E1)至E21)中的任一种：

E1)编码权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白的核酸分子；

E2)权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白的编码基因；

E3)含有E2)所述基因的表达盒；

E4)含有E2)所述基因的重组载体；

E5)含有E3)所述表达盒的重组载体；

E6)含有E2)所述基因的重组微生物；

E7)含有E3)所述表达盒的重组微生物；

E8)含有E4)所述重组载体的重组微生物；

E9)含有E5)所述重组载体的重组微生物；

E10)含有E2)所述基因的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E11)含有E3)所述表达盒的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E12)含有E4)所述重组载体的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E13)含有E5)所述重组载体的转基因植物细胞系或转基因动物细胞系；

E14)含有E2)所述基因的转基因植物组织或转基因动物组织；

E15)含有E3)所述表达盒的转基因植物组织或转基因动物组织；

E16)含有E4)所述重组载体的转基因植物组织或转基因动物组织；

E17)含有E5)所述重组载体的转基因植物组织或转基因动物组织；

E18)含有E2)所述基因的转基因植物器官或转基因动物器官；

E19)含有E3)所述表达盒的转基因植物器官或转基因动物器官；

E20)含有E4)所述重组载体的转基因植物器官或转基因动物器官；

E21)含有E5)所述重组载体的转基因植物器官或转基因动物器官。

7.检测蜱传脑炎病毒感染的系统，由权利要求6所述的生物材料以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染蜱传脑炎病毒所需的其他试剂和/或仪器组成；

所述试剂为LIPS Buffer、Protein A/G PLUS-Agrose Immunoprecipitation Reagent和/或荧光素酶底物；

所述LIPS Buffer由溶质和水组成，其中溶质的各组分及其浓度分别为：20mM Tris,150mM NaCl,5mM MgCl₂和1％质量百分比浓度的Triton-X-100；

所述仪器为化学发光检测仪。

8.权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白在制备检测蜱传脑炎病毒感染的荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒中的应用。

9.权利要求1-3中任一所述系统中所述融合蛋白在制备检测是否感染蜱传脑炎病毒的产品中的应用。

10.权利要求6所述生物材料在制备检测蜱传脑炎病毒感染的荧光素酶免疫共沉淀试剂或试剂盒中的应用。

11.权利要求6所述生物材料在制备检测是否感染蜱传脑炎病毒的产品中的应用。

Images