CN113249378A

CN113249378A - 检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用

Info

Publication number: CN113249378A
Application number: CN202110759625.6A
Authority: CN
Inventors: 徐晴晴; 姚永秀; 维诺·奈尔; 沈志强
Original assignee: Pebright Institute Of Animal Health Uk; Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Pebright Institute Of Animal Health Uk; Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明公开了RPA特异性引物对、单链DNA、crRNA片段以及CRISPR‑Cas13a检测体系及其在制备ALV相关诊断产品和疫苗中的应用。本发明可以在37℃恒温条件下对目的核酸进行RPA扩增，对仪器设备要求低，扩增的目的片段转录为RNA后被特异性的crRNA识别，进而被Cas13a切割，Cas13a的“附带切割”活性可以切割体系中的RNA报告分子，本发明的RPA反应时间在30 min左右，SHERLOCK反应时间在40 min左右，总体的检测时间低于2 h；本发明配合侧流层析试纸条的应用将检测结果可视化能实现ALV‑A/B/J的快速检测和鉴别诊断。

Description

检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用。

背景技术

禽白血病(avian leukosis，AL)是由反转录病毒科α肿瘤病毒属禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白血病病毒(avianleukosis virus，ALV)除了引起禽肿瘤性疾病以外还可以导致鸡生长缓慢，免疫抑制，产蛋量减少等症状，给养禽业造成巨大的损失。按照ALV的宿主范畴、囊膜糖蛋白特性、病毒干扰实验和其它分子生物学特点，当前ALV被分为了11个亚群。其中A-D、J和K亚群为外源性ALV。C、D亚群在野外很少见，E-I亚群为内源性ALV，而F-I亚群主要感染野生禽类。外源性ALV中，A、B和J亚群对鸡有明显的致病性，对养禽业生产的危害也较大。E亚群是鸡体内普遍存在的内源性ALV，这个亚群的病毒虽然是低致病性的病毒，鸡群感染后基本无临床表现，却可以干扰临床诊断上对于外源性ALV的检测。

禽反转录病毒基因组有共同的形式，由两条相同的单股、正链、线性RNA组成。单体长约7-11Kb，两分子的单体RNA在各自的5’端以氢键相连。ALV的基因结构为5′R-U5-gag-pol-env-U3-R-3′。其中gag基因编码p19、p12、p27和p15病毒核衣壳蛋白。p27蛋白是ALV的群特异性抗原有很多易于检测的表位，临床上多数试剂盒主要通过检测p27蛋白来确诊ALV。pol基因编码逆转录酶和整合酶，逆转录酶将病毒从RNA反转录为DNA，整合酶负责将前病毒DNA整合至宿主细胞染色体内。gap和pol这两种基因在ALV各亚群中序列高度保守且同源性高。gp85和gp37两种囊膜糖蛋白由env基因编码。gp85蛋白能识别宿主细胞膜上的特异性病毒受体，决定ALV的亚群特异性及中和活性。目前市场上暂无预防和治疗ALV的疫苗和药物，所以只能通过检测并淘汰所有ALV为阳性的鸡进行防控。国内外已经建立了多种ALV的检测方法，包括病毒分离、ELISA、IFA、免疫组织化学和PCR等，这些检测技术都有其适用性。但是都有检测流程繁琐且不方便，检测时间较长的缺点，最短的方法也需要半天时间才能得出结论，病毒分离更是长达1周，需要的设备较多，且检测人员需要有一定的技术支持和分子生物学知识。因此适合于田间应用的快速检测方法，对ALV的净化和防控有重要意义。

有规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromicrepeats，CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中，其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的tracRNA(trans-activating CRISPR RNA)共同构成引导RNA(guide RNA，gRNA)，gRNA可引导核酸内切酶Cas蛋白(CRISPR associated protein)对噬菌体的基因片段进行切割，构成细菌的适应性免疫系统，但不存在于真核生物或病毒中。目前CRISPR/Cas系统分为2类，VI型和30多种亚型。在Cas蛋白和CRISPR RNA(crRNA)形成效应复合物时，1类系统(包括I型，III型和IV型)需要多个Cas蛋白，而2类系统(包括II型，V型和VI型)只需单个多结构域的Cas蛋白。Cas13属于2类CRISPR系统的VI型，只切割单链而不切割双链RNA，该系统可分为A～D 4种亚型。Cas13效应蛋白在识别靶RNA上的前间区序列侧翼位点(Protospacer flanking site，PFS)并与其结合的过程中可发生构象变化，导致由HEPN1和HEPN2结构域组成的催化位点活化。活化的Cas13a的HEPN催化位点位于蛋白质外表面，表现出HEPN-RNase活性，导致靶RNA在结合区域的外部被切割，并在切割完成后仍保持活性，继续切割其他非靶标RNA，即具有“附带切割”能力。

2017年，张峰等开发了特异性高灵敏度酶解报告基因解锁(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK)检测系统。在该系统中，目标模板首先经重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)(用于检测DNA靶标)或逆转录RPA(用于检测RNA靶标)为含有T7启动子的DNA模板，后经T7 RNA聚合酶逆转录，产物可作为Cas13a切割的靶标，在Cas13a对上述靶标特异性切割后激活“附带切割”功能，切割体系中单链RNA荧光报告探针能产生可被检测的荧光信号。相比先前的研究，PRA方法的引入显著提高了该方法的检测灵敏度。多个课题组进一步拓展了Cas13a在不同分子检测领域的实际应用。当前相关研究已经报道了CRISPR/Cas13a检测体系被用于寨卡病毒、登革热病毒、EB病毒、H7N9禽流感病毒、埃博拉病毒、致病细菌株及其耐药基因和SNP分型等多种靶标检测。基于CRISPR/Cas13a的方法在1-2h内便可肉眼观测病原体的检测及分型结果，结合其高灵敏度，使用SHERLOCK可快速检测病毒核酸，特别是在野外和欠缺医疗设备的地区。其快速、价廉、准确的特点非常适用于临床应用。

任何一项检测技术都不是完美的，CRISPR/Cas13a体系也不例外。基于Casl3a的检测需使用RNA荧光报告基团，其易受环境中RNA酶降解，可能出现假阳性结果。此外，单独使用Cas检测的灵敏度偏低，现有CRISPR检测方法均需扩增相应目标核酸以提高检测灵敏度。当前应用RPA来进行目标核酸的s4预扩增，其关键就是引物的设计。但RPA没有专用的设计软件，只能根据相关产品的说明书和指导手册来设计几对引物进行实验，筛选出能扩增出目的序列的引物。RPA引物的错配容忍性特别高，据相关文献报道在引物错配达到9个时仍可以扩增出序列。因此仅用RPA引物扩增出来的可能不是能进行鉴别诊断的目的片段。然而，CRISPR/Cas13a中的crRNA有高度的错配敏感性，仅能容忍一个碱基的错配，能对序列高度同源的病毒株进行区分，特别适合像ALV这种多亚群毒株的鉴别诊断。目前报道的CRISPR检测方法尚处于实验室开发阶段，在临床工作中的实际作用如何尚需进一步评估，以确保其具有良好的临床适用性。

发明内容

发明目的：本发明针对上述已有的ALV检测技术和方法存在操作繁杂、仪器设备昂贵、技术要求高、耗时长且不适于田间检测的缺点，提供了用于诊断ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段、CRISPR-Cas13a检s5测体系以及基于CRISPR-Cas13a的检测ALV-A/B/J的相关诊断产品和疫苗等，其具有很高的特异性和敏感性，能为ALV-A/B/J感染的诊断提供一个快速、简便、准确的检测方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了RPA特异性引物对，所述RPA特异性引物对选自如下一种或多种组合：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；或SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对；或SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。

其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对针对的是ALV-A亚群毒株；SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对针对的是ALV-B亚群毒株，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对针对的是ALV-J亚群毒株。

其中，本发明的上游引物的5’端含有被T7 RNA聚合酶识别的序列。

ALV-A-F(A6F)：(SEQ ID NO.1)

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAAACTGACCGGTTAGTCTCGTCAGCTGACT-3’，

ALV-A-R(A3R)：(SEQ ID NO.2)

5’-AACCTAACAGCTGTAGTTCAGGTGGCTCATCC-3’；

ALV-B-F(B3F)：(SEQ ID NO.3)

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTCTTGACTGACCCAGGGAGCAATCCTTTC-3’，

ALV-B-R(B3R)：(SEQ ID NO.4)

5’-GAGCAATTGTACAT CTCCCAAAATCTGTAG-3’；

ALV-J-F(J4F)：(SEQ ID NO.5)

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCATTTCTGACTGGGCACCCTGGGAAGGTGAGC-3’，

ALV-J-R(J4R)：(SEQ ID NO.6)

5’-TAACCACGCACACAAGTATCATTTGAAAGAAG-3’。

下划线部分为添加的T7启动子序列用于将后续扩增产物转录为被Cas13a检测的RNA。需要说明的是，本发明中RPA反应的模板可以是DNA也可以是RNA，当模板为RNA时，需使用针对RNA扩增的RPA酶预混液，以实现反转录功能。

本发明内容还包括一种单链DNA，所述单链DNA包含所述的RPA特异性引物对扩增后得到片段的部分碱基(28bp)，所述单链DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示。

其中，所述单链DNA还包括T7启动子序列与LwCas13a蛋白结合的锚定序列。

其中，所述单链DNA的核苷酸序列还如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.12所示。

本发明内容还包括crRNA片段，所述crRNA片段的序列如SEQ ID NO.13或SEQ IDNO.14或SEQ ID NO.15所示。

其中，所述SEQ ID NO.7所示的单链DNA是crRNA(SEQ ID NO.13)靶向的ALV-Agp85基因序列。

其中，所述SEQ ID NO.8所示的单链DNA是crRNA(SEQ ID NO.14)靶向的ALV-Bgp85基因序列。

其中，所述SEQ ID NO.9所示的单链DNA是crRNA(SEQ ID NO.15)靶向的ALV-Jgp85基因序列。

其中，序列如SEQ ID NO.13的crRNA由核苷酸序列为SEQ ID NO.10单链DNA模板进行体外转录而获得，针对的是ALV-A亚群毒株。

其中，序列如SEQ ID NO.14的crRNA由核苷酸序列为SEQ ID NO.11单链DNA模板进行体外转录而获得，针对的是ALV-B亚群毒株。

其中，序列如SEQ ID NO.15的crRNA由核苷酸序列为SEQ ID NO.12单链DNA模板进行体外转录而获得，针对的是ALV-J亚群毒株。

本发明内容还包括CRISPR-Cas13a检测体系，所述CRISPR-Cas13a检测体系包括所述的RPA特异性引物对、LwCas13a蛋白、报告分子和所述的crRNA片段。

其中，所述检测体系还包括RPA反应试剂；LwCas13a、报告分子和crRNA的反应试剂和侧流层析试纸条。

其中，所述RPA反应试剂包括RPA酶预混粉剂、TwistAmp Rehydration Buffer，无核酸酶的水，280mM MgOAc。

其中，所述LwCas13a、报告分子和crRNA的反应试剂包括无核酸酶的超纯水，HEPES(pH 6.8，1M)，MgCl2，rNTP solution mix，Murine RNase inhibitor(40U/μL)，T7RNApolymerase(5U/μL)。

其中，所述报告分子为RNA reporter，由6个U组成，其序列两端分别标记6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)。

本发明内容还包括所述的RPA特异性引物对、所述的crRNA片段或所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备检测ALV的试剂盒中的应用。

本发明内容还包括所述的RPA特异性引物对、所述的crRNA片段或所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备抗ALV-A/B/J产品中的应用。

本发明内容还包括所述的RPA特异性引物对、所述的crRNA片段或所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备ALV的疫苗中的应用。

进一步地，每个RPA的反应体积为10μL。每管RPA酶预混粉剂可以配置4个反应。具体方法为向一个反应管内加入含以下浓度的以下组分：3μL上游引物(10μM)，3μL下游引物(10μM)，30μL TwistAmp Rehydration Buffer，6μL无核酸酶的水。移液器轻微吹吸混匀，取30μL溶解一管RPA酶预混粉剂，用同一个枪头将溶解后的酶溶液吸回至原反应管中，再向该反应管中加入3μL 280mM MgOAc，轻微吹打混匀后分装为9μL/管，再分别加入1μL的DNA模板。反应条件为37℃，30min。

进一步地，每个LwCas13a检测体系的体积为10μl，含以下浓度的以下组分：无核酸酶的超纯水6.25μL，HEPES(pH 6.8，1M)0.25μL，MgCl₂(1M)0.1μL，rNTP solution mix(25mM)0.4μL，LwCas13a(63.3μg/mL)1.0μL，Murine RNase inhibitor(40U/μL)0.5μL，T7RNApolymerase(5U/μL)0.25μL，crRNA(10ng/μL)0.5μL，RNAreporter (100μM)0.1μL。反应条件为37℃，40min。

进一步地，将侧流层析试纸条(TwistDx产品，Milenia HybriDetect 1)插入LwCas13a反应产物中，静置观察2分钟。试纸条显色后包括三种情况：出现上下两条带(阳性)；只出现上面一条带(阳性)；只出现下面一条带(阴性)。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明提供了一种用于检测ALV-A/B/J核酸的特异性引物对、crRNA、CRISPR-Cas13a检测体系、检测试剂盒以及SHERLOCK方法，本发明可以在37℃恒温条件下对目的核酸进行RPA扩增，对仪器设备要求低，扩增后的目的片段转录为RNA后被特异性的crRNA识别，进而被Cas13a切割，Cas13a的“附带切割”活性可以切割体系中的RNA报告分子，检测用的试纸条上面标记有能够与Biotin结合的链霉亲和素，以及用于捕获与胶体金偶联的抗FAM的一抗的捕获线(图1)。当观察到试纸条显示有两条带或只在上面有一条带时，表明检测结果为阳性。检测结果反映了RNA报告分子是否被切割，从而证明待测样本中是否有目的基因的存在。RPA反应时间在30min左右，SHERLOCK反应时间在40min左右，总体的检测时间低于2h；本发明配合侧流层析试纸条的应用将检测结果可视化。本发明建立的SHERLOCK方法可以用于基层单位，普通实验室或在临床上进行ALV-A/B/J的快速检测和鉴别诊断。

附图说明

图1为本发明的技术原理图。主要的过程包括前病毒DNA提取，RPA扩增，Cas13a检测和试纸条显色。

图2为本发明的Cas13a蛋白表达和纯化的SDS-PAGE电泳图。(a)蛋白表达的确定。1：未加IPTG诱导的菌液；2：IPTG诱导后的菌液；(b)蛋白的纯化。1：裂解后的菌液；2：裂解后的细菌沉淀；3：Strep-Tactin柱子结合后的流串液；4：SUMO蛋白酶切割前的Strep-Tactin柱子；5：SUMO蛋白酶切割后的洗脱液；6：SUMO蛋白酶切割后的柱子；7：阳离子交换层析纯化后浓缩的蛋白样品；8：尺寸排阻色谱层析纯化后的蛋白。

图3为本发明在检测其他病原时未出现交叉反应。反应条件为RPA扩增37℃30min，Cas13a检测37℃ 40min。a：ALV-A的特异性检测；b：ALV-B的特异性检测；c：ALV-J的特异性检测。1：RAV-1前病毒DNA；2：RAV-2前病毒DNA；3：RAV-49前病毒DNA；4：RAV-50前病毒DNA；5：HPRS-103前病毒DNA；6：RAV-60前病毒DNA；7：CVI988 DNA；8：REV前病毒DNA，T：检测线；C：控制线。

图4ALV-A的检测灵敏度为50copies/test，ALV-B的检测灵敏度为50copies/test，ALV-J的检测灵敏度为50copies/test。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1检测ALV-A/B/J的CRISPR-Cas13a体系的建立

1、RPA引物和crRNA的设计

从NCBI的Genbank数据库检索ALV-A/B/J的gp85基因核苷酸序列，通过序列比对和筛选，选择一段在相同亚群毒株的gp85基因中比较保守而与其它亚群ALV毒株差异性大的核酸序列作为目标区域。根据RPA试剂盒销售商TwistDx说明书手册中推荐的方法，针对ALV-A/B/J分别设计几对引物(表1)。在上游引物的5’端加入25bp的T7启动子序列(表1下划线部分)，使得RPA扩增的目的片段能转录为Cas13a的识别对象RNA。RPA扩增后得到的目的片段大小约为140-190bp，在目的片段区域选择28bp高度保守的crRNA靶向序列，且该靶向序列不与RPA的上下游引物重叠。

2、RPA的反应体系

RPA的反应体系为10μL/test，购买的

Basic kit中每管RPA酶预混粉剂可以配置4个反应，先计算好待测样品的数量，加上阳性对照和以水为模板的阴性对照来配置总的预混液，混匀后分装为9μL/管，再分别加入1μL PCR检测ALV-A/B/J为阳性的组织DNA。以一管RPA酶预混粉剂配置的4份反应的预混液为例来进行说明，向一个反应管内加入含以下浓度的以下组分：3μL上游引物(10μM)，3μL下游引物(10μM)，30μL TwistAmpRehydration Buffer(TwistDx，cat.no.TABAS03KIT)，6μL无核酸酶的水。移液器吹打混匀，取30μL预混液至一管RPA酶预混粉剂中，用同一个枪头将溶解后的酶溶液吸回至原反应管中，再向原反应管中加入3μLMgOAc(280mM)，轻微吹打混匀后分装为9μL/管，向每个反应管中分别加入1μL的DNA模板。置于水浴锅或PCR仪等能恒温的仪器中，37℃反应30min来快速扩增目的基因。

结果参见表1。由于RPA引物的错配容忍性高，导致内源性ALV gp85基因序列常常对RPA反应造成干扰。虽然gp85基因是ALV亚群分型的主要参考依据，各亚群毒株的gp85基因序列同源性差异也很大，但是本发明中Cas13a检测时利用的crRNA靶向序列只有28bp，内源性ALV的gp85基因中往往也含有同样的28bp序列。所以，筛选特异性的RPA引物能排除内源性ALV的干扰至关重要。筛选后得到的扩增ALV-A/B/J的特异性RPA引物分别为：A6F(SEQID NO.1)/A3R(SEQ ID NO.2)，B3F(SEQ ID NO.3)/B3R(SEQ ID NO.4)，J4F(SEQ ID NO.5)/J4R(SEQ ID NO.6)。

表1设计的扩增ALV-A/B/J的RPA引物

3、crRNA的体外转录

crRNA可以直接从生物公司合成，合成的产物纯度高，但是费用较高。比较经济的方法是设计单链的DNA序列通过体外转录来生产大量的crRNA。单链DNA序列(SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)的组成为：25bpT7启动子序列(GAAATTAATACGACTCACTATAGGG)+36bp与LwCas13a蛋白结合的锚定序列(GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC)+28bp目的基因靶向序列的反向互补序列(SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示序列的反向互补序列)这3个部分的反向互补序列。通过引物合成后退火及T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit转录crRNA，得到的crRNA利用Agencourt RNA Clean XP磁珠进行纯化，最终所得到的crRNA序列分别为：

ALV-A-crRNA：

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCGAUAAGUGAGGGUGGUGCUGUUGUCAG-3’；(SEQ ID NO.13)

ALV-B-crRNA：

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUACUGUAAACGGUUUCGAGGAGUUAGA-3’；(SEQ ID NO.14)

ALV-J-crRNA：

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAAGGGUGUCUUCUCCGGGUCUUUCUUG-3’(SEQ ID NO.15)

其中，第1-36位是用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；第37-64位分别为靶向ALV-A/B/J gp85基因靶序列(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9)的向导序列。测定RNA浓度后用无RNA酶的水调整为300ng/μL，分装为5μL/管冻存于-80℃备用。

4、LwCas13a蛋白的表达与纯化

转化质粒pC013-TwinStrep-SUMO-huLwCas13a(Addgene＃90097)至Rosetta 2(DE3)pLysS感受态细胞中。大量表达蛋白的反应条件为：0.5mM IPTG诱导，25℃摇床200rpm培养16h。纯化过程均在4℃下进行。离心收集菌体，超声破碎后收集蛋白上清，用0.45μm滤膜过滤。将上清加入Strep-Tactin树脂(50％；Qiagen；cat.no.30004)中进行结合，过柱洗掉未与树脂结合的蛋白，在树脂中加入SUMO酶(250U；Thermo FisherScientifific，cat.no.12588018)，4℃酶切过夜后得到去掉了标签的LwCas13a蛋白(图2，泳道5)。应用AKTA快速蛋白液相色谱系统(FPLC)将LwCas13a蛋白依次进行阳离子交换层析(图2，泳道7)和尺寸排阻色谱层析纯化(图2，泳道8)。实验过程中利用SDS-PAGE鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，确定纯化后得到的是LwCas13a蛋白。配置存储液(Tris-HCl pH＝7.50.05M，NaCl 0.6M，5％甘油，DTT 0.002M)将蛋白浓度调整为2mg/mL，分装为5μL/管存于-80℃备用。

5、报告分子

报告分子为序列两端分别标记了FAM和Biotin的6个U组成的单链RNA(/56-FAM/rUrUrUrUrUrU/3Bio/)。

6、基于Cas13a检测与侧流层析试纸条显色检测ALV-A/B/J

本发明采用Cas13a检测结合商品化试纸条(TwistDx，Milenia HybriDetect 1kit)进行ALV-A/B/J的检测。反应过程为，先用RPA引物对待测样本(病变组织、血液或泄殖腔棉拭子等)的DNA进行扩增(参见步骤2的RPA扩增体系和扩增条件)，再将扩增产物、crRNA、LwCas13a蛋白在含有报告分子的CRISPR-Cas13a体系中反应，其中，Cas13a检测的反应体系10μL/test，具体的组分和浓度要求按照表2来配制。数好待测样品的数量，加上阳性对照和以水为模板的阴性对照来配置总的预混液，混匀后分装为9μL/管，再分别加入1μL的RPA扩增产物作为模板。将反应管置于水浴锅或PCR仪等能恒温的仪器中，37℃反应40min。向各反应管中分别加入50μL HybriDetect 1 assay buffer(来自Milenia HybriDetect 1kit)，用移液器上下混匀几次，插入试纸条进行显色。

表2Cas13a反应体系

试纸条上划有能够与Biotin结合的链霉亲和素，以及用于捕获与胶体金偶联的抗5/6-羧基荧光素的一抗的捕获线。反应产物流经纳米金标抗FITC抗体时，体系中报告RNA的FAM端会标记上用于显色的纳米金。当流经链霉亲和素线时，若待测样本中含有ALV-A/B/J靶点，则crRNA、LwCas13a蛋白和RPA扩增产物转录的RNA形成复合体，且激活LwCas13a蛋白的RNA酶活性，使其能切割体系中的RNA分子(包括报告RNA)。当体系中所有的报告RNA全被部切断后，其FAM端不受生物素端的影响，会流过第一条线(C线)，当其到达第二条检测线(T线)时会被抗抗体捕捉而显色；当体系中的报告RNA只有一部分被切断时，C和T线都会显色。这两种情况都表明待测样本中有目的基因的存在，判定结果为阳性。(即当观察到试纸条显示有两条带或只在上面有一条带时，表明检测结果为阳性)。若待测样本中无ALV-A/B/J的靶点，则只有crRNA和LwCas13a蛋白形成复合体，不能激活LwCas13a蛋白的RNA酶活性，而无法切割报告RNA。当报告RNA未被剪切时，其生物素端会被拦截在链霉亲和素线上显色(C线)，从而没有报告RNA分子流过C线至第二条检测线显色。这种情况表明了检测结果为阴性(图1)。

实施例2基于CRISPR-Cas13a检测ALV-A/B/J的方法的特异性和敏感性

1、特异性

分别以感染鸡的其他ALV亚群毒株(C、D、E)的前病毒DNA、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的前病毒DNA和鸡马立克氏病毒(MDV)的DNA为模板，按照实施例1中的方法配置RPA和Cas13a反应体系来验证本发明的特异性。如图3所示，只有ALV-A/B/J有“T”线为阳性；其它的核酸检测只有“C”线为阴性。结果表明，本发明具有很高的特异性与其它的鸡肿瘤病毒不存在交叉反应。

2、敏感性

分别用表3中ALV-A/B/J的特异性鉴别引物(H5/envA，H5/envB，H5/H7)扩增相应的序列并克隆至TA载体GEM-T-easy，将构建好的重组质粒作为标准品，测定其浓度分别为GEM-T-H5/envA 156ng/μL，GEM-T-H5/envB 187ng/μL，GEM-T-H5/H7 135ng/μL，然后用无RNA酶的水进行10倍系列的梯度稀释，拷贝数计算公式为：(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(DNA长度×660)＝copies/μL。得到的含有不同拷贝数的质粒溶液作为模板，按照实施例1中RPA的反应体系进行扩增，使质粒在RPA反应中的初始浓度分别为10⁷-10¹copies/test。分别取1μLRPA反应后的产物作为模板如表1所示按照实施例1的方法进行Cas13a检测。如图4所示，检测ALV-A/B/J的灵敏度分别为50copies/test，50copies/test，50copies/test。

表3ALV-A/B/J的特异性鉴别引物

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院、英国佩布赖特动物健康研究所

<120> 检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaattaata cgactcacta tagggaaact gaccggttag tctcgtcagc tgact 55

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacctaacag ctgtagttca ggtggctcat cc 32

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaattaata cgactcacta tagggctctt gactgaccca gggagcaatc ctttc 55

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcaattgt acatctccca aaatctgtag 30

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaattaata cgactcacta tagggcattt ctgactgggc accctgggaa ggtgagc 57

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaccacgca cacaagtatc atttgaaaga ag 32

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgacaacag caccaccctc acttatcg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctaactcct cgaaaccgtt tacagtag 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagaaagac ccggagaaga cacccttg 28

<210> 10

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgacaacag caccaccctc acttatcggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89

<210> 11

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctaactcct cgaaaccgtt tacagtaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89

<210> 12

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caagaaagac ccggagaaga cacccttggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60

aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89

<210> 13

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccgau aagugagggu ggugcuguug 60

ucag 64

<210> 14

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccuac uguaaacggu uucgaggagu 60

uaga 64

<210> 15

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccaag ggugucuucu ccgggucuuu 60

cuug 64

Claims

1.RPA特异性引物对，其特征在于，所述RPA特异性引物对选自如下一种或多种组合：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物对；或SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物对；或SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的引物对。

2.一种单链DNA，其特征在于，所述单链DNA包含了权利要求1所述的RPA特异性引物对扩增后片段的部分碱基，所述单链DNA核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA还包括T7启动子序列与LwCas13a蛋白结合的锚定序列。

4.根据权利要求2所述的单链DNA，其特征在于，所述单链DNA的基因核苷酸序列如SEQID NO. 10或SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 12所示。

5.crRNA片段，其特征在于，所述crRNA片段的序列如SEQ ID NO. 13或SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO.15所示。

6.CRISPR-Cas13a检测体系，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a检测体系包括权利要求1所述的RPA特异性引物对、LwCas13a蛋白、报告分子和权利要求5所述的crRNA片段。

7.根据权利要求6所述的CRISPR-Cas13a检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括RPA反应试剂、LwCas13a反应试剂和侧流层析试纸条。

8.权利要求1所述的RPA特异性引物对、权利要求5所述的crRNA片段或权利要求6或7所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备检测ALV的试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述的RPA特异性引物对、权利要求5所述的crRNA片段或权利要求6或7所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备抗ALV-A/B/J产品中的应用。

10.权利要求1所述的RPA特异性引物对、权利要求5所述的crRNA片段或权利要求6或7所述的CRISPR-Cas13a检测体系在制备ALV的疫苗中的应用。