CN111850174A

CN111850174A - 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

Info

Publication number: CN111850174A
Application number: CN202010791195.1A
Authority: CN
Inventors: 孙秀莲; 郭学双; 崔若茗
Original assignee: Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2020-10-30
Also published as: CN117987599A

Abstract

本发明提供了一种检测2019‑nCov的CRISPR试剂及其在制备检测2019‑nCov的试剂盒中的用途，所述CRISPR试剂包括RPA扩增引物对及对应的crRNA。本发明基于CRISPR分子诊断技术，通过RPA‑CRISPR的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019‑nCov进行检测。

Description

一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，特别是涉及一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其在制备检测2019-nCov的试剂盒中的用途等。

背景技术

冠状病毒是一个大型RNA病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。2019新型冠状病毒(2019-nCov)，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2，可以导致2019新型冠状病毒病(COVID-2019)，该病毒从2019新型冠状病毒病的患者中被分离、确认，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，简称为新型冠状病毒(nCov)。人感染了2019新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭等，甚至死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，而其传染性比流感、SARS却要高很多，所以对2019新型冠状病毒的尽早诊断对治疗与防控有重要意义。

目前国家药品监督管理局共批准2019新型冠状病毒核酸检测试剂11个，抗体检测试剂8个。病毒抗体检测试剂检测的样本是血清，目标产物是机体对病毒产生的抗体，但是抗体一般在患者恢复期才大量产生，时效性差，无法作为病毒感染的早期诊断，对传染性极高的新型冠状病毒的诊断和防控毫无意义。但是病毒核酸检测要求的敏感性和特异性很高。核酸检测可检测呼吸道标本(鼻拭子、咽拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸，且可区分流感病毒亚型。而现有技术中，核酸检测试剂盒通常为荧光定量PCR检测与测序检测方法。然而，这些技术仍具有诸多不足之处：1.PCR技术需要精确的温度系统控制，在一些不发达地区无法实现；2.检测灵敏度和特异性仍需进一步提高；3.PCR技术只能用于DNA片段检测，RNA片段需要提前加入一步逆转录的过程，操作复杂，而且开管操作容易造成样品污染。可见，这些检测方法对实验仪器，检测人员，检测场所有限制，因此一种检测方便快速的2019新型冠状病毒检测试剂在目前疫情情况下显得尤为重要。

聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在恒定温度下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量PCR(QPCR)检测方式，其并没有实质性的灵敏度提升。

Cas蛋白是来源于古菌和细菌的利用CRISPR-Cas系统抵御外源DNA浸染的蛋白，包括Cas9，Cpf1，C2c1，C2c2(Cas13a)等，它们都是由向导RNA介导的切割目标DNA的DNA核酸内切酶。Cas9和Cpf1已成功开发为重要的基因编辑工具，它们可作为开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的巧妙工具。Cas13a是VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白。Cas13a蛋白在crRNA的引导下，靶向目标序列后可启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入BIOTIN与FAM标记的RNA报告分子,正常情况下完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的报告分子可以被检测到。但目前并未将该技术应用到对2019-nCov的检测。

发明内容

本发明发现，基于CRISPR分子诊断技术，通过RPA-CRISPR的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019-nCov进行检测。因此，

本发明提供一种检测2019-nCov的CRISPR试剂，其中，所述CRISPR试剂包括RPA扩增引物对及对应的crRNA。

优选的，所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为RPA扩增引物对的扩增序列。

优选的，所述引物对扩增2019-nCov的核酸序列。更优选的，所述2019-nCov的核酸序列包括核酸蛋白N和/或棘突糖蛋白S的转录核酸。更优选的，所述2019新型冠状病毒核酸蛋白N的转录核酸序列如SEQ ID No：3或6所示，和/或所述棘突糖蛋白S的转录核酸序列如SEQ ID No：9、12或15任意一个或者多个所示。

优选的，所述引物对包含SEQ ID No：1和2；SEQ ID No：4和5，SEQ ID No,7和8；SEQID No：10和11；或者SEQ ID No：13和14任意引物对，更优选的，所述引物对如SEQ ID No：1和2；SEQ ID No：4和5，SEQ ID No,7和8；SEQ ID No：10和11；或者SEQ ID No：13和14任意一对或多对引物对所示。

优选的，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别。更为优选的，所述锚定序列包含富含尿嘧啶的茎环结构。

优选的，所述锚定序列如SEQ ID No：21、47和48任意所示。

优选的，所述Cas蛋白为Cas13a蛋白，Cas13a蛋白可以来自不同细菌，包括Leptotrichia shahii(LshCas13a)，Leptotrichia buccalis(LbuCas13a)，Leptotrichiawadei(LwCas13a)等。更为优选的，所述Cas13a蛋白为LwCas13a或LbuCas13a。

Cas13a的激活需要锚定序列、向导序列、靶序列的共同参与，即，当向导序列靶向到RNA目标时，与至少20个碱基的crRNA的锚定序列共同作用，通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a的一系列构象变化转入一种酶促激活状态。而Cas13a蛋白一旦激活，它将结合并切割其他的RNA，而不管它们是否与crRNA的靶向序列同源。这一点与其他Cas蛋白截然不同，这也是选择Cas13a作为该功能蛋白的原因。

优选的，所述向导序列为核酸蛋白N或者棘突糖蛋白S相匹配的序列，优选的，向导序列为核酸蛋白N相匹配的序列，更优选的，所述向导序列匹配的靶向序列包括SEQ ID No：3、6、9、12和/或15任意一个或者多个序列。

优选的，所述向导序列如SEQ ID No：22-26任意序列所示。

优选的，所述crRNA为上述锚定序列和上述向导序列任意的组合，例如SEQ ID No：21与SEQ ID No：22-26任意序列的组合；SEQ ID No：47与SEQ ID No：22-26任意序列的组合；SEQ ID No：48与SEQ ID No：22-26任意序列的组合。

更为优选的，所述crRNA序列如SEQ ID No：16-20的任意序列中所示，进一步优选的，所述crRNA序列如SEQ ID No：17中所示。

优选的，所述CRISPR试剂还包括RNA报告探针，所述RNA报告探针为随机单链RNA分子，一端带有一个荧光素基团，一端带有生物素基团。优选的，所述RNA报告探针为polyU，更优选的，一端以生物素BIOTIN标记，一端以FAM标记。进一步优选的，所述RNA报告探针如FAM-UUUUUUUUUUUUUU-Bio所示。

在一个具体实施方式中，所述CRISPR试剂包括如SEQ ID No：1和2所示的RPA扩增引物对和如SEQ ID No：16所示的crRNA。

在一个具体实施方式中，所述CRISPR试剂包括如SEQ ID No：4和5所示的RPA扩增引物对和如SEQ ID No：17所示的crRNA。

在一个具体实施方式中，所述CRISPR试剂包括如SEQ ID No：7和8所示的RPA扩增引物对和如SEQ ID No:18所示的crRNA。

在一个具体实施方式中，所述CRISPR试剂包括如SEQ ID No：10和11所示的RPA扩增引物对和如SEQ ID No:19所示的crRNA。

在一个具体实施方式中，所述CRISPR试剂包括如SEQ ID No：13和14所示的RPA扩增引物对和如SEQ ID No:20所示的crRNA。

本发明还提供一种上述任意CRISPR试剂在制备检测2019-nCov的试剂盒中的用途。

本发明还提供一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述任意CRISPR试剂。

本发明还提供一种胶体金检测试剂条，其中，所述胶体金检测试剂条包括：(1)带有抗荧光素的抗体的胶体金颗粒；(2)孵育有抗生物素的抗体的Control带；(3)孵育有荧光素二抗的Test带。

当RPA反应未扩增到目的RNA靶序列时，结合有胶体金颗粒的探针与Control带结合，TEST不显色；当RPA反应扩增到目的RNA靶序列，CRISPR试剂会对报告探针进行切割，结合有胶体金颗粒的探针荧光素基团暴露与TEST带上荧光素二抗结合，从而test带显色，同时Control带亦显色。

本发明还提供一种利用上述任意CRISPR试剂检测2019-nCov的方法，所述方法包括：

(1)处理样本：将盛放样本的EP管置于干式恒温金属浴，50℃，20分钟，95℃，5分钟；

(2)RPA引物对扩增病毒核酸：反应条件：42℃，至少5分钟；

(3)利用含对应的crRNA的检测液对扩增的核酸进行CRISPR反应：反应条件37℃，20分钟；

(4)加入上样液，进行胶体金检测：读取检测结果。

优选的，报告分子的检测通过胶体金检测试纸来实现，完整的报告分子在试纸条上只出现C带，但是游离的报告分子在试纸条上出现C带和T带。胶体金试纸条的检测一般5分钟即可出现明显的检测结果。

优选的，所述RPA引物对最低浓度为400nM。

优选的，所述RNA报告探针最低浓度为300nM。

优选的，所述Cas13a蛋白最低浓度为50nM。

优选的，所述方法不是诊断方法。所述方法可用于各种研究或者流行病学调查等。所述样本并非来源于患者，例如，所述样本可以来源于水、土壤、空气、食物、各种物体表面等。

综上，本发明针对2019-nCov的核酸序列设计引物试剂，优化反应体系，通过RPA-CRISPR联合，在1小时之内得出检测结果。这样我们的试剂盒可以实现无专业技术人员，在任一相对稳定环境，只需要一个恒温装置，一个小时之内即可得出检测结果。

通过本引物组，在只有RPA反应情况下，通过产物纯化，琼脂糖凝胶电泳可检出10拷贝的2019-nCov核酸量，大大提高了检测试剂的灵敏度。RPA-CRIPSR联合进一步提高反应的灵敏度。

同时，本发明的CRISPR试剂对2019-nCov具有高度特异性，不扩增其他冠状病毒，例如SARS和MERS等。

附图说明

后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：

图1：不同RPA引物进行RPA扩增后，凝胶电泳图；

图2：RPA反应不同时间扩增后，凝胶电泳图；

图3：RPA反应中使用不同引物浓度扩增后，凝胶电泳图；

图4：RPA反应中使用不同拷贝数的目的核酸扩增后，凝胶电泳图。

图5：使用不同浓度的探针LF-polyU进行胶体金显色结果。

图6：使用不同浓度的Cas13a蛋白，进行CRISPR反应后，胶体金检测结果。

图7：PCR鉴定结果。

图8：质粒酶切验证鉴定结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例所用原料，除特别说明外，均为市售购得。

实施例1：筛选用于检测2019-nCov的CRISPR试剂

筛选一组用于检测2019-nCov的CRISPR试剂，包括扩增引物对和crRNA；并且优化整个检测体系的试剂量，在最短时间得到最优检测结果。

实验方法：

一、通过RPA扩增，琼脂糖凝胶电泳筛选效率高的扩增引物对。

1、针对COVID-2019的核蛋白基因N设计了两对引物对：

(1)N1引物对：

RPA-N1F:gaaatTAATACGACTCACTATAgggAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATA(SEQID No：1)，其中，小写字母及之间的序列是T7序列，剩余序列是靶向序列的正向引物序列。

RPA-N1R:TTTCATCAGCCTTCTTCTTTTTGTCCTTTTTA(SEQ ID No：2)。

其靶向序列是：

AAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAA(SEQ ID No：3)

(2)N7引物对：

RPA-N7F：gaaatTAATACGACTCACTATAgggCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTC(SEQID No：4)。其中，小写字母及之间序列是T7序列，剩余序列是靶向序列的正向引物序列。

RPA-N7R：ATGTTTGTAATCAGTTCCTTGTCTGATTAGTT(SEQ ID No：5)

其靶向序列是：

CACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACAT(SEQ ID No：6)

2、针对COVID-2019的棘突糖蛋白S设计了三对引物：

(1)S2引物对：

RPA-S2F:gaaatTAATACGACTCACTATAgggTTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATA(SEQID No：7)，其中，小写字母及之间序列是T7序列，剩余序列是靶向序列的正向引物序列。

RPA-S2R:GTCAATTTCTTTTTGAATGTTTACAACTGAAG(SEQ ID No：8)

其靶向序列是：

TTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGAC(SEQ ID No：9)

(2)S5引物对：

RPA-S5F:gaaatTAATACGACTCACTATAgggTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCT(SEQID No：10)，其中，小写字母及之间序列是T7序列，剩余序列是靶向序列的正向引物序列。

RPA-S5R:TAAAGGAAAGTAACAATTAAAACCTTCAACAC(SEQ ID No：11)其靶向序列为：

TACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTA(SEQ ID No：12)

(3)S8引物对：

RPA-S8F:gaaatTAATACGACTCACTATAgggCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAG(SEQID No：13)，其中，小写字母及之间序列是T7序列，剩余序列是靶向序列的正向引物序列。

RPA-S8R:ATTTTATATACTGCTCATACTTTCCAAGTTCT(SEQ ID No：14)

其靶向序列为：

CATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAAT(SEQ ID No：15)

二、生产出与扩增引物对相对应的crRNA。

1、crRNA序列

(1)crRNA-N1

gaaatTAATACGACTCACTATAgggGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACggtgggaatgttttgtatgcgtcaatatgc(SEQ ID No：16)。

(2)crRNA-N7

gaaatTAATACGACTCACTATAgggGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACccttgggtttgttctggaccacgtctgc(SEQ ID No：17)。

(3)crRNA-S2

gaaatTAATACGACTCACTATAgggGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACcctaaatcaacatctggtgatgtatgattc(SEQ ID No：18)。

(4)crRNA-S5

gaaatTAATACGACTCACTATAgggGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACgtgtgctaccggcctgatagatttcagttg(SEQ ID No：19)。

(5)crRNA-S8

gaaatTAATACGACTCACTATAgggGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACcgatgagagattcatttaaattcttggcaacc(SEQ ID No：20)。

其中，上述序列中，小写字母及之间序列是T7序列，然后大写字母是锚定序列，接着后面小写是向导序列。

即，锚定序列如GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC(SEQ ID No：21)所示。

针对N1、N7、S2、S5和S8的向导序列分别如ggtgggaatgttttgtatgcgtcaatatgc(SEQID No：22)，ccttgggtttgttctggaccacgtctgc(SEQ ID No：23)，cctaaatcaacatctggtgatgtatgattc(SEQ ID No：24)，gtgtgctaccggcctgatagatttcagttg(SEQ ID No：25)；cgatgagagattcatttaaattcttggcaacc(SEQ ID No：26)所示。

2、生产步骤：

(1)退火

退火反应体系：

表1退火反应体系

Reagents	Volume
		CrRNA-F1	1μl
CrRNA-F2	1μl
		CrRNA--R1	1μl
CrRNA-R2	1μl
		buffer3.1	1μl
H<sub>2</sub>0	5μl
		Total	10μl

N1-CrRNA-F1:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG(SEQID No：27)

N1-CrRNA-F2:ACTAAAACGGTGGGAATGTTTTGTATGCGTCAATATGC(SEQ ID No：28)

N1-CrRNA-R1:GGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID No：29)

N1-CrRNA-R2:GCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTT(SEQID No：30)

N7-CrRNA-F1:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG(SEQID No：31)

N7-CrRNA-F2:ACTAAAACCCTTGGGTTTGTTCTGGACCACGTCTGC(SEQ ID No：32)

N7-CrRNA-R1:GGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID No：33)

N7-CrRNA-R2:GCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTT(SEQ IDNo：34)

S2-CrRNA-F1:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG(SEQID No：35)

S2-CrRNA-F2:ACTAAAACCCTAAATCAACATCTGGTGATGTATGATTC(SEQ ID No：36)

S2-CrRNA-R1:GGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID No：37)

S2-CrRNA-R2:GAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTT(SEQID No：38)

S5-CrRNA-F1:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG(SEQID No：39)

S5-CrRNA-F2:ACTAAAACGTGTGCTACCGGCCTGATAGATTTCAGTTG(SEQ ID No：40)

S5-CrRNA-R1:GGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID No：41)

S5-CrRNA-R2:CAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTT(SEQID No：42)

S8-CrRNA-F1:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG(SEQID No：43)

S8-CrRNA-F2:ACTAAAACCGATGAGAGATTCATTTAAATTCTTGGCAACC(SEQ ID No：44)S8-CrRNA-R1:GGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC(SEQ ID No：45)

S8-CrRNA-R2:GGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTT(SEQID No：46)

退火程序：98℃，3min，25℃依次升温，1℃/S，20min。

退火产物浓度测定：用分光光度计进行crDNA的DNA浓度测定，1.54μg/μl。

(2)转录

转录体系：

表2转录体系

转录条件：37℃过夜

(3)DNAseI消化体系

表3 DNAseI消化体系

试剂	体积
		DNaseI	2μl
DNaseI buffer(10x)	2μl
		crRNA	2μl
H<sub>2</sub>0	14μl

反应条件：37℃30min。

转录产物浓度测定：用分光光度计进行crRNA的RNA浓度测定，55μg/ml。

将crRNA加H₂0稀释到10ng/μl浓度备用。

三、体系优化确定用于2019-nCov的CRISPR试剂最简组合。

1、RPA引物的筛选

表4 RPA扩增体系

本实验使用模板是本公司自己生产的含有nCov-N，nCov-S的假病毒，简称为plent-N，plent-S(具体制备方法见实施例2)。

实验结果：如图1所示，实验组第1-5组均可见扩增条带，其中N7引物对(第2组)扩增条带明显，然后是N1(第1组)，S2(第3组)，S5(第4组)，S8(第5组)，阴性对照(第6组)没有扩增条带。

结论：相对于其他未显示的对照引物对，上述针对N1、N7、S2、S5、S8引物对都可以特异灵敏的扩增出nCov病毒，N7引物对效果最好。优选N7引物对进行下游实验。

2、最短RPA扩增时间的确定

选择N7引物对确定最短的RPA扩增时间。

表5：RPA不同时间扩增体系

	1	2	3
				Temperature	42℃	42℃	42℃
Time	5min	10min	15min

实验结果：如图2所示，RPA反应5min后即可观察到明显扩增条带。而表4中的其他四对引物对，也观察到了相似的结果。

3、体系中引物浓度的研究

表6：RPA不同引物浓度扩增体系

实验结果：如图3所示，引物含量在400nM(3号反应)，扩增条带明显。采用表4中的其他四对引物对，也观察到相同的结果。

4、RPA反应检出最低拷贝数实验

表7不同拷贝数扩增体系

实验结果：如图4所示，假病毒在10拷贝(条带1)时已经可以检测出目的条带。采用表4中的其他四对引物对，也观察到相同的结果。

5、最低剂量LF-polyU浓度的确定

使用benzonase作为阳性切割酶，设定不同浓度梯度LF-polyU(FAM-UUUUUUUUUUUUUU-Bio，300nM，30nM，3nM)。1：1μl Benzonase组；2：无benzonase，LF-polyU(300nM)组；3：无benzonase，LF-polyU(30nM)组；4：无benzonase，LF-polyU(3nM)组。

表8：不同浓度的探针切割体系

Reagents	1	2	3	4
					cleavage buffer	2μl	2μl	2μl	2μl
H<sub>2</sub>O	15.4μl	16.4μl	16.4μl	16.4μl
					RNAse inhibitor	1μl	1μl	1μl	1μl
LF-polyU	0.6μl(10μM)	0.6μl(10μM)	0.6μl(1μM)	0.6μl(0.1μM)
					Benzonase	1μl	0	0	0
total	20μl	20μl	20μl	20μl

实验结果：如图5所示，反应2即300nM LF-polyU使用浓度时，检测带没有条带，说明该探针使用浓度最低是300nM。反应3和反应4均能观察到C和T两个条带，即可以观察到假阳性条带，说明LF-polyU(30nM)使用浓度和LF-polyU(3nM)使用浓度偏低。

6、Cas13a蛋白浓度的研究

锚定序列根据Cas13a蛋白的来源不同，分为：针对LshCas13a的5’-GGCCACCCCAATATCGAAGGGGACTAAAAC-3’(SEQ ID No：47)，针对LbuCas13a的5’-GACCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAAC-3’(SEQ ID No：48)和针对LwCas13a的5’-GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC-3’(SEQ ID No：21)。

为确定不同浓度Cas13a蛋白对切割的影响，制定下述体系：

表9：不同浓度的Cas13a蛋白切割体系

Reagents	1	2	3	4
					Cleavage buffer	2μl	2μl	2μl	2μl
H<sub>2</sub>O	8.6μl	8.6μl	8.6μl	8.6μl
					MgCL<sub>2</sub>(120mM)	1μl	1μl	1μl	1μl
RNAse inhibitor	1μl	1μl	1μl	1μl
					LF-polyU(10μM)	1μl	1μl	1μl	1μl
LwCas13a	1μl(0.1μg/μl)	1μl(0.05μg/μl)	1μl(0.01μg/μl)	0μl
					crRNA(10ng/μl)	1μl	1μl	1μl	1μl
T7	1μl	1μl	1μl	1μl
					rNTPs	0.4μl	0.4μl	0.4μl	0.4μl
DTT	2μl	2μl	2μl	2μl
					RPA reaction	1μl	1μl	1μl	1μl
Total	20μl	20μl	20μl	20μl

实验结果：如图6所示，反应1能得到清晰的阳性条带，反应2，3，4无法得到清晰的阳性条带，所以LwCas13a蛋白的最低使用浓度是反应1所使用浓度，即50nM。

7、对SARS，MERS病毒扩增

本发明的检测体系，采用上述五对引物对(N1引物对、N7引物对、S2引物对、S5引物对、S8引物对)并不能扩增出SARS，MERS病毒序列，说明本发明的检测试剂对2019-nCov具有高度特异性。

实施例2：制备含有nCov-N，nCov-S的假病毒plent-N，plent-S

一、慢病毒载体的构建

1、引物设计

表10引物序列

2、实验流程

1)、PCR

收到引物后先瞬时离心，将引物干粉中加入(nmol数*10)μL H₂O，稀释成100μM的母液，再转入1.5mL离心管，稀释10倍成为PCR工作液。

PCR体系：(单位：μL)

表11：PCR体系

引物、模板对应如下：

表12：引物、模板

反应程序：

表13：反应程序

PCR反应结束后，取2μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离检测，若目的条带大小正确，利用DNA纯化试剂盒将PCR产物进行纯化。

2)、酶切

将PCR纯化产物进行酶切，酶切体系如下：

表14：酶切体系

加样混匀后置于37℃酶切1h，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段。

载体plent-ef1a-fh-cmv-puro做同样的酶切，胶回收载体。

3)、连接

回收目的基因酶切片段，将之与经过同样双酶切的载体连接，连接体系如下：

表15：连接体系

成分	体积
		目的片段	2～6μL
载体片段	2～4μL
		10×T4 Buffer	1μL
T4 DNA连接酶(10U/μL)	1μL
		Total	10μL

混匀后微离心，22℃连接2h。

4)、转化

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于相应抗性的LB平板上进行筛选；

转化的具体步骤：

(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中

(2)待DH5a感受态细胞融化后，取1μL连接产物于20μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。

(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。

(4)向离心管中加入200μL的无菌的LB培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(5)涂布到相应抗性的固体培养基平皿中

(6)37℃培养箱中培养过夜。

5)、筛选阳性克隆及测序

挑取单菌落培养后，菌液PCR与提取质粒进行酶切鉴定阳性克隆，测序验证。

菌液PCR鉴定结果如图7所示，质粒酶切验证鉴定结果如图8所示，表明克隆成功。

分别用EF1A-SEQ01,myc-flag-r4加测，测序结果拼接序列plent-nCOV-N如SEQ IDNo：53所示，plent-nCOV-S如SEQ ID No：54所示。

二、慢病毒的包装病毒包装步骤：

Day1:10cmdish聚合度90％的HEK293T(每盘大约6x 107)细胞按1：1比例传盘至15cmdish，第二天细胞达到聚合度90％-95％(每盘大约1.5x 108)，培养基为Gibico高糖DMEM培养基(含10％FBS)。

Day2:

1、转染前2-3个小时换液(含10％FBS)

2、按照以下比例配置转染试剂。

表16转染试剂

Mix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min,后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm细胞培养皿中。(细胞达到聚合度90％，细胞过少会影响转染效率)

Day3:

6h-24h内更换新鲜培养基(含10％FBS)，观察转染效率并拍照。

Day5:

72h观察细胞状态并拍照。收取上清培养基，过0.45μm滤膜，上清培养基加入超速离心管(355642)中，配平后离心，25000rpm，4℃离心1.5h。弃上清，用1ml病毒保存液回溶混匀溶解过夜。

Day6：

收集病毒分装。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 宜明（苏州）细胞生物科技有限公司

<120> 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

<130> 1

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gaaattaata cgactcacta tagggaaatt tcaaagatca agtcattttg ctgaata 57

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tttcatcagc cttcttcttt ttgtcctttt ta 32

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc 60

accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat gaaa 104

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gaaattaata cgactcacta tagggcacta aagcatacaa tgtaacacaa gctttc 56

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

atgtttgtaa tcagttcctt gtctgattag tt 32

<210> 6

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg 60

aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat tacaaacat 109

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gaaattaata cgactcacta tagggttaga ctcattcaag gaggagttag ataaata 57

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

gtcaatttct ttttgaatgt ttacaactga ag 32

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ttagactcat tcaaggagga gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt 60

gatttaggtg acatctctgg cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac 120

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gaaattaata cgactcacta tagggtacct gtatagattg tttaggaagt ctaatct 57

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

taaaggaaag taacaattaa aaccttcaac ac 32

<210> 12

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact 60

gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt 120

ccttta 126

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

gaaattaata cgactcacta tagggcatta atgcttcagt tgtaaacatt caaaaag 57

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

attttatata ctgctcatac tttccaagtt ct 32

<210> 15

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatg aggttgccaa 60

gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga aagtatgagc agtatataaa 120

at 122

<210> 16

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag gggactaaaa 60

cggtgggaat gttttgtatg cgtcaatatg c 91

<210> 17

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag gggactaaaa 60

cccttgggtt tgttctggac cacgtctgc 89

<210> 18

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag gggactaaaa 60

ccctaaatca acatctggtg atgtatgatt c 91

<210> 19

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag gggactaaaa 60

cgtgtgctac cggcctgata gatttcagtt g 91

<210> 20

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag gggactaaaa 60

ccgatgagag attcatttaa attcttggca acc 93

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 36

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

ggtgggaatg ttttgtatgc gtcaatatgc 30

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

ccttgggttt gttctggacc acgtctgc 28

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

cctaaatcaa catctggtga tgtatgattc 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

gtgtgctacc ggcctgatag atttcagttg 30

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

cgatgagaga ttcatttaaa ttcttggcaa cc 32

<210> 27

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

actaaaacgg tgggaatgtt ttgtatgcgt caatatgc 38

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

ggggtagtct aaatccccta tagtgagtcg tattaatttc 40

<210> 30

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

gcatattgac gcatacaaaa cattcccacc gttttagtcc ccttcgtttt t 51

<210> 31

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

actaaaaccc ttgggtttgt tctggaccac gtctgc 36

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

ggggtagtct aaatccccta tagtgagtcg tattaatttc 40

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

gcagacgtgg tccagaacaa acccaagggt tttagtcccc ttcgttttt 49

<210> 35

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 36

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

actaaaaccc taaatcaaca tctggtgatg tatgattc 38

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

ggggtagtct aaatccccta tagtgagtcg tattaatttc 40

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

gaatcataca tcaccagatg ttgatttagg gttttagtcc ccttcgtttt t 51

<210> 39

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

actaaaacgt gtgctaccgg cctgatagat ttcagttg 38

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

ggggtagtct aaatccccta tagtgagtcg tattaatttc 40

<210> 42

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

caactgaaat ctatcaggcc ggtagcacac gttttagtcc ccttcgtttt t 51

<210> 43

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

gaaattaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

actaaaaccg atgagagatt catttaaatt cttggcaacc 40

<210> 45

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

ggggtagtct aaatccccta tagtgagtcg tattaatttc 40

<210> 46

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

ggttgccaag aatttaaatg aatctctcat cggttttagt ccccttcgtt ttt 53

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

ggccacccca atatcgaagg ggactaaaac 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

gaccacccca aaaatgaagg ggactaaaac 30

<210> 49

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 49

gagtgcgatc gccaccatgt ctgataatgg accccaaaat c 41

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 50

gcgtacgcgt ggcctgagtt gagtcagc 28

<210> 51

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 51

gagtgcgatc gccaccatgt ttgtttttct tgttttattg c 41

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 52

gcgtacgcgt tgtgtaatgt aatttgactc 30

<210> 53

<211> 1661

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 53

gatcggataa ccttattagt ggtggtggtg gtggtgctcg acgaatttat cgtcgtcatc 60

cttataatcc tcgagcggcc gcgtacgcgt ggcctgagtt gagtcagcac tgctcatgga 120

ttgttgcaat tgtttggaga aatcatccaa atctgcagca ggaagaagag tcacagtttg 180

ctgtttcttc tgtctctgcg gtaaggcttg agtttcatca gccttcttct ttttgtcctt 240

tttaggctct gttggtggga atgttttgta tgcgtcaata tgcttattca gcaaaatgac 300

ttgatctttg aaatttggat ctttgtcatc caatttgatg gcacctgtgt aggtcaacca 360

cgttcccgaa ggtgtgactt ccatgccaat gcgcgacatt ccgaagaacg ctgaagcgct 420

gggggcaaat tgtgcaattt gcggccaatg tttgtaatca gttccttgtc tgattagttc 480

ctggtcccca aaatttcctt gggtttgttc tggaccacgt ctgccgaaag cttgtgttac 540

attgtatgct ttagtggcag tacgtttttg ccgaggcttc ttagaagcct cagcagcaga 600

tttcttagtg acagtttggc cttgttgttg ttggccttta ccagacattt tgctctcaag 660

ctggttcaat ctgtcaagca gcagcaaagc aagagcagca tcaccgccat tgccagccat 720

tctagcagga gaagttcccc tactgctgcc tggagttgaa tttcttgaac tgttgcgact 780

acgtgatgag gaacgagaag aggcttgact gccgcctctg ctcccttctg cgtagaagcc 840

ttttggcaat gttgttcctt gaggaagttg tagcacgatt gcagcattgt tagcaggatt 900

gcgggtgcca atgtgatctt ttggtgtatt caaggctccc tcagttgcaa cccatatgat 960

gccgtctttg ttagcaccat agggaagtcc agcttctggc ccagttccta ggtagtagaa 1020

ataccatctt ggactgagat ctttcatttt accgtcacca ccacgaattc gtctggtagc 1080

tcttcggtag tagccaattt ggtcatctgg actgctattg gtgttaattg gaacgccttg 1140

tcctcgaggg aatttaaggt cttccttgcc atgttgagtg agagcggtga accaagacgc 1200

agtattattg ggtaaacctt ggggccgacg ttgttttgat cgcgccccac tgcgttctcc 1260

attctggtta ctgccagttg aatctgaggg tccaccaaac gtaatgcggg gtgcatttcg 1320

ctgattttgg ggtccattat cagacatggt ggcgatcgcg gcggcagatc tcctcggtac 1380

cggatcccga aacctcgagg ctagtctcgt gatcgataaa attttgaatt tttgtaattt 1440

gtttttgtaa ttctttagtt tgtatgtctg ttgctattat gtctactatt ctttcccctg 1500

cactgtaccc cccaatcccc ccttttcttt taaaagttaa ccgataccgt cgagattaat 1560

taaatttaaa tgtcgaaatt cctcacgaca cctgaaatgg aagaaaaaaa ctttgaacca 1620

ctgtctgagg cttgagaatg aaccaagatc caaactcaaa a 1661

<210> 54

<211> 4218

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 54

gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg 60

tgtcgtgagg aatttcgaca tttaaattta attaatctcg acggtatcgg ttaactttta 120

aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa 180

cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatc 240

acgagactag cctcgaggtt tcgggatccg gtaccgagga gatctgccgc cgcgatcgcc 300

accatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca 360

accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 420

gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 480

tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 540

gataaccctg tcctaccatt taatgatggt gtttattttg cttccactga gaagtctaac 600

ataataagag gctggatttt tggtactact ttagattcga agacccagtc cctacttatt 660

gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca 720

tttttgggtg tttattacca caaaaacaac aaaagttgga tggaaagtga gttcagagtt 780

tattctagtg cgaataattg cacttttgaa tatgtctctc agccttttct tatggacctt 840

gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt 900

tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt 960

ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa 1020

actttacttg ctttacatag aagttatttg actcctggtg attcttcttc aggttggaca 1080

gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat cttcaaccta ggacttttct attaaaatat 1140

aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca 1200

aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa aaaggaatct atcaaacttc taactttaga 1260

gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt cctaatatta caaacttgtg cccttttggt 1320

gaagttttta acgccaccag atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc 1380

aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat aattccgcat cattttccac ttttaagtgt 1440

tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca 1500

tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct 1560

gattataatt ataaattacc agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac 1620

aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct 1680

aatctcaaac cttttgagag agatatttca actgaaatct atcaggccgg tagcacacct 1740

tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc 1800

actaatggtg ttggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat 1860

gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc 1920

aatttcaact tcaatggttt aacaggcaca ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt 1980

ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt gctgacacta ctgatgctgt ccgtgatcca 2040

cagacacttg agattcttga cattacacca tgttcttttg gtggtgtcag tgttataaca 2100

ccaggaacaa atacttctaa ccaggttgct gttctttatc aggatgttaa ctgcacagaa 2160

gtccctgttg ctattcatgc agatcaactt actcctactt ggcgtgttta ttctacaggt 2220

tctaatgttt ttcaaacacg tgcaggctgt ttaatagggg ctgaacatgt caacaactca 2280

tatgagtgtg acatacccat tggtgcaggt atatgcgcta gttatcagac tcagactaat 2340

tctcctcggc gggcacgtag tgtagctagt caatccatca ttgcctacac tatgtcactt 2400

ggtgcagaaa attcagttgc ttactctaat aactctattg ccatacccac aaattttact 2460

attagtgtta ccacagaaat tctaccagtg tctatgacca agacatcagt agattgtaca 2520

atgtacattt gtggtgattc aactgaatgc agcaatcttt tgttgcaata tggcagtttt 2580

tgtacacaat taaaccgtgc tttaactgga atagctgttg aacaagacaa aaacacccaa 2640

gaagtttttg cacaagtcaa acaaatttac aaaacaccac caattaaaga ttttggtggt 2700

tttaattttt cacaaatatt accagatcca tcaaaaccaa gcaagaggtc atttattgaa 2760

gatctacttt tcaacaaagt gacacttgca gatgctggct tcatcaaaca atatggtgat 2820

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gaggattata aggatgacga cgataaattc gtcgagcacc accaccacca ccactaataa 4200

ggttatccga tccaccga 4218

Claims

1.一种检测2019-nCov的CRISPR试剂，其特征在于，所述CRISPR试剂包括RPA扩增引物对及对应的crRNA。

2.如权利要求1所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述向导序列与靶向序列相匹配，所述靶向序列为RPA扩增引物对的扩增序列。

3.如权利要求1所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述引物对扩增2019-nCov的核酸序列。

4.如权利要求3所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述2019-nCov的核酸序列包括核酸蛋白N和/或棘突糖蛋白S的转录核酸。

5.如权利要求2所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述锚定序列与Cas13a蛋白特异性识别。

6.如权利要求1所述的CRISPR试剂，其特征在于，所述CRISPR试剂还包括RNA报告探针。

7.一种根据权利要求1-6任一项所述的CRISPR试剂在制备检测2019-nCov的试剂盒中的用途。

8.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的CRISPR试剂。

9.一种胶体金检测试剂条，其中，所述胶体金检测试剂条包括：(1)带有抗荧光素的抗体的胶体金颗粒；(2)孵育有抗生物素的抗体的Control带；(3)孵育有荧光素二抗的Test带。

10.一种利用权利要求1-6任一项所述的CRISPR试剂检测2019-nCov的方法，所述方法包括：

(1)、处理样本；

(2)、RPA引物对扩增病毒核酸：

(3)、利用含对应的crRNA的检测液对扩增的核酸进行CRISPR反应；

(4)、加入上样液，进行胶体金检测：读取检测结果。