CN112760417B - 一种rap基因检测试剂盒、检测方法和应用及rap病毒检测试剂盒 - Google Patents
一种rap基因检测试剂盒、检测方法和应用及rap病毒检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒，属于基因扩增技术领域。本发明所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液。本发明所述试剂盒具有高检测特异性以及超高的灵敏性，检测高效且快速。
Description
技术领域
本发明涉及基因扩增技术领域，具体涉及一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒。
背景技术
重组酶介导的等温扩增(recombinase aided amplification，RAA)是一种新型的在37～39℃恒温扩增的分子诊断技术。RAA具有很高的扩增效率，30min甚至更短时间即可实现对目的片段的大量的扩增。但是RAA技术需要很长的探针(长度需要45～50bp)，导致设计探针难度较大。聚合酶链式反应(PCR)是一种目前被广泛用于诊断的核酸分子诊断技术，PCR衍生技术定量PCR(qPCR)是目前很多病原体核酸检测的金标准，但是灵敏度有待提高。巢式PCR(N-PCR)可以提高PCR检测灵敏度，但是N-PCR具有容易污染，耗费时间长等缺点。目前仍缺乏一种更高效的基因扩增方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒。本发明所述试剂盒具有高检测特异性以及超高的灵敏性，检测高效且快速。
本发明提供了一种RAP基因检测试剂盒，所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；
所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液。
优选的是，所述外引物对中，引物的长度分别为30～35bp。
优选的是，所述反应液包括独立包装的镁离子。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的RAP基因检测方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述试剂盒对待测模板进行检测，先进行重组酶介导的等温扩增反应，再进行实时荧光定量核酸扩增反应。
优选的是，所述RAP基因检测方法，包括以下步骤：
将外引物对、待测模板、重组酶介导的等温扩增反应液、镁离子和水混合，置于PCR管的管盖上；
将内引物对、探针、实时荧光定量核酸扩增反应液和水混合，置于PCR管的管底；
盖上管盖，采用重组酶介导的等温扩增反应条件进行扩增，离心，采用实时荧光定量核酸扩增反应条件进行扩增。
优选的是，所述重组酶介导的等温扩增反应条件包括39℃恒温反应10min。
优选的是，所述实时荧光定量核酸扩增反应条件包括：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，20个循环。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法在检测靶基因中的应用。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法的RAP病毒检测试剂盒，所述病毒包括腺病毒3型、腺病毒7型和呼吸道合胞病毒。
优选的是，当所述病毒为腺病毒3时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
当所述病毒为腺病毒7型时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
当所述病毒为呼吸道合胞病毒时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明提供了一种RAP基因检测试剂盒。本发明所述试剂盒将RAA和qPCR技术进行结合，发明了病毒核酸检测新方法，即RAP检测方法，本发明所述试剂盒在qPCR的基础上引入RAA反应体系，后续能够以物理隔绝策略实现在不开盖的情况下对病毒进行超灵敏、快速且准确的检测。本发明还提供了一种RAP基因检测方法，首先对标本进行等温扩增富集，再进行qPCR反应，本发明所述方法具有超高的灵敏度，检测限最高可达到单个拷贝/反应，比常规的qPCR敏感；另外，本发明方法从上机开始可在60min之内完成对标本的检测，比qPCR快速。
附图说明
图1为本发明提供的RAP进行检测的原理示意图；
图2为本发明提供的用于检测ADV3的RAP方法和常规qPCR方法的分析灵敏度(LOD)结果图，其中，A为RAP灵敏度图；B为RAP方法中qPCR的内引物测定的灵敏度图；
图3为本发明提供的用于检测ADV7的RAP方法和常规qPCR方法的分析灵敏度(LOD)结果图，其中，A为RAP灵敏度图；B为RAP方法中qPCR的内引物测定的灵敏度图；
图4为本发明提供的用于检测RSV的RAP方法和常规qPCR方法的分析灵敏度(LOD)结果图，其中，A为RAP灵敏度图；B为RAP方法中qPCR的内引物测定的灵敏度图。
具体实施方式
本发明提供了一种RAP基因检测试剂盒，所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；
所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液。
本发明所述试剂盒是结合RAA和qPCR技术优势开发的RAP(RecombinaseAidedPCR，RAP)技术检测试剂盒。试剂盒中所述引物探针包括上游内外引物、下游内外引物以及探针，即一对RAA引物、一对qPCR引物和探针。本发明根据RAA和PCR反应的温度不同，使得在同一管中RAA先反应，随后加热让RAA反应所需要的酶失活，进而进行后续的qPCR反应并检测。本发明所述试剂盒具有高检测特异性以及超高的灵敏性。
在本发明中，所述外引物对中，引物的长度优选分别为30～35bp。在本发明中，所述内引物对中，引物的长度优选分别为18～26bp。在本发明中，所述外引物对，即RAA引物优选按照RAA引物设计规则进行设计；所述内引物对，即qPCR引物优选按照qPCR相应的规则在RAA引物上截取或者外引物之间设计内引物，探针优选为taqman探针。本发明对所述引物的序列没有特殊的限制，采用RAA的设计规则和普通PCR的引物设计规则即可。但是对于引物尤其是外引物的长度有相应的限制。其中RAA引物因为长度较长，与常规的PCR引物相比增加了引物和模板的互补配对能力，提高了检测特异性，并且由于RAA较高的扩增效率提高了检测的灵敏度。
在本发明中，所述反应液优选包括qPCR反应液和RAA反应液。本发明对所述反应液的来源没有特殊限制，采用本领域所知的任一款镁离子与其他成分分开的市售产品即可。在本发明中，所述反应液包括独立包装的镁离子。RAA反应液中的镁离子的作用是启动RAA的反应，使其中相应的酶和引物等结合，然后实现目的片段的扩增。配置RAA反应液时需要将镁离子加到管帽上，以确保在闭管前无模板扩增并实现所有单元管的同时反应。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的RAP基因检测方法，包括以下步骤：
利用上述技术方案所述试剂盒对待测模板进行检测，先进行重组酶介导的等温扩增反应，再进行实时荧光定量核酸扩增反应。本发明重组酶介导的等温扩增反应温度与qPCR的反应温度相差很大，重组酶介导的等温扩增反应温度下qPCR反应体系内的热启动DNA聚合酶不被激活，在qPCR反应温度下，RAA反应所需的酶类将失活，仅发生相应的qPCR反应。
在本发明中，所述RAP基因检测方法，具体优选包括以下步骤：
将外引物对、待测模板、重组酶介导的等温扩增反应液、镁离子和水混合，置于PCR管的管盖上；
将内引物对、探针、实时荧光定量核酸扩增反应液和水混合，置于PCR管的管底；
盖上管盖，采用重组酶介导的等温扩增反应条件进行扩增，离心，采用实时荧光定量核酸扩增反应条件进行扩增。
在本发明中，所述内引物对和所述外引物对在进行反应时，各引物的终浓度优选为0.1～100μmol/L。在本发明中，所述重组酶介导的等温扩增反应条件优选包括39℃恒温反应10min。在本发明中，所述实时荧光定量核酸扩增反应条件优选包括：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，20个循环。
本发明所述RAP基因检测方法结合了RAA和qPCR技术的优势，实现单管闭管内先等温后变温的两次扩增，相比于RAA技术、qPCR技术和巢式PCR技术，RAP技术具有探针设计简单、扩增效率高、快速和灵敏度高的特点。
本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法在检测靶基因中的应用。本发明对所述检测的靶基因没有特殊的限制，可以是任何的病毒甚至细菌等。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法的RAP病毒检测试剂盒，所述病毒包括腺病毒3型(ADV3)、腺病毒7型(ADV7)和呼吸道合胞病毒(RSV)。本发明对所述检测的病毒种类没有特殊的限制，可以检测任何的病毒甚至细菌等病原体。
在本发明中，当所述病毒为腺病毒3时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1(ATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCC)和SEQ ID NO.2(TCAGTAGTGG TAATGTCTTTCCCAATTTGC)所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3(AGCTTACAATTCACTCGCTCC)和SEQ ID NO.4(TAGTGGTAATGTCTTTCCCAA)所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5(ACAATGCAGTAACTACCACCACAAAC)所示；
当所述病毒为腺病毒7型时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6(ACAAC GGGAG AAGAC AATGC CACCA CATAC AC)和SEQ ID NO.7(TCCAT CAATA TCAGT CCATGATTCT TCTCC)所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8(AG AAGAC AATGCCACCA CAT)和SEQ ID NO.9(GAC AATGC CACCA CATACAC)所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10(AAGACATTACTGCAGACAACAAGCC)所示；
当所述病毒为呼吸道合胞病毒时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.11(TCCYAATTGTATAGCATTCATAGGTGAAGGAGC)和SEQ ID NO.12(TTGCATCTGTAGCAGGAATGGTYAAATTYTCAC)所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13(TTGTATAGCATTCATAGGTG)和SEQ ID NO.14(TGTAGCAGGAATGGTYAAAT)所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15(TATTTACAGAAGTYTGAAAGATTGC)所示。
本发明对上述引物和探针合成方法没有特殊限制，委托本领域所熟知的基因合成公司即可。本发明实施例中，所述的引物和探针均委托上海生物工程有限公司合成。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
来自河北省儿童医院的(50)份咽拭子标本和来自湖南省疾控的(403)咽拭子标本以及(103)份肺泡灌洗液标本。
利用表1中的ADV3、ADV7和RSV的引物和探针进行检测。按照表2和3配置体系，外引物的终浓度为0.4μmol/L，内引物及探针的终浓度为0.2μmol/L。RAA试剂盒为江苏齐天有限公司的基础法RAA扩增试剂盒，PCR试剂盒为ABI公司的Entrans qPCR Probe SetV2试剂盒。
表1检测三种病毒的引物和探针信息
表2和3系RAP的扩增体系。
表2 RAA基础试剂盒或RT-RAA基础试剂盒反应体系
表3 qPCR反应体系
从表2反应体系中取出10μl加于PCR管帽上，表3的PCR体系40μl(无镁离子)位于PCR管底。然后将整个反应体系放入6100恒温涡旋仪中39℃恒温反应10min，之后离心震荡混匀放置于PCR仪中反应，反应程序如表4，扩增仪器为伯乐CFX96 PCR仪器。
表4为RAP的后续PCR反应程序。
表4反应程序
由上述实施例可知，采用RAP方法对556份样本进行ADV3和ADV7及RSV的检测。其中101例为ADV3阳性(80例咽拭子标本和21例肺泡灌洗液标本)；152例为ADV7阳性(121例咽拭子标本和31例肺泡灌洗液标本)；45例为RSV阳性(45例咽拭子标本)。ADV3阳性率为18.17％，ADV7阳性率为27.34％，RSV阳性率为8.09％。RAP方法从上机开始可在60min之内完成对标本的检测。
对比例1
荧光定量PCR方法，利用RAP的内引物和探针对不同病毒标本做检测。内引物和探针的浓度为0.2μmol/L。采用ABI公司的Entrans qPCRProbe SetV2试剂盒进行扩增。扩增体系见表5，扩增程序见表6，扩增仪器为伯乐CFX96 PCR仪器。
表5为荧光定量PCR体系。
表5荧光定量PCR体系
表6为荧光定量PCR的程序
表6荧光定量PCR反应程序
由上述对比例1可知，采用qPCR方法对556份样本进行ADV3和ADV7及RSV的检测。其中78例为ADV3阳性(58例咽拭子标本和20例肺泡灌洗液标本)；120例为ADV7阳性(93例咽拭子标本和27例肺泡灌洗液标本)；30例为RSV阳性(30例咽拭子标本)。荧光定量PCR方法从上机开始在150min之内完成对标本的检测。RAP比qPCR多检测出23例ADV3，32例ADV7和15例RSV。RAP方法比qPCR检出率高，检测时间更短，可在60min内完成对标本的检测，检测快速且高效。
实施例2
采用本发明提供的试剂盒采用实施例1的方法收集19病毒样本进行区分鉴定，19种样本来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，鉴定结果见表7。由表7可知，RAP方法可以区分和鉴所列出的样本，没有观察到交叉反应。检测结果显示本发明方法只能特异性检测出ADV3，ADV7或RSV，并不与其他病毒发生交叉反应。
表7所述试剂盒的特异性检测分析
实施例3
根据Vector11.0软件比对分析，在ADV3和ADV7及RSV病毒的保守区设计特异性引物和探针，并合成相应的重组质粒(由北京擎科生物有限公司合成)。基于ADV3的保守序列Hexon基因，本发明首先提供一条用于检测ADV3的靶序列，其具有SEQ ID NO.16所示的序列(GATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCCTAAGGGCGCGCCCAATACATCTCAGTGGATAGTTACAACAAATGGGGACAATGCAGTAACTACCACCACAAACACATTTGGCATTGCTTCCATGAAGGGAGACAATATTACTAAAGAAGGTTTGCAAATTGGGAAAGACATTACCACTACTGAAGGAGAAGAAAAGCCCATTTATGCCG)或其特异性片段，该序列连接pUC57载体合成目的质粒；基于ADV7的保守序列Hexon基因，本发明首先提供一条用于检测ADV7的靶序列，其具有SEQ ID NO.17所示的序列(AAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTGGCTCCTAAGGGCGCGCCTAACACATCTCAGTGGATAGTTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCACATACACATTTGGCATTGCTTCCACGAAGGGAGACAATATTACTAAGGAAGGTTTAGAAATTGGGAAAGACATTACTGCAGACAACAAGCCCATTTATGCCGATAAAACATATCAGCCAGAGCCTCAAGTTGGAGAAGAATCATGGACTGATATTGATGGAACAAATGAAAAATTTGGAGGTAGAGCTCTTAAACCAGCTACTAAAATGAAGCCATGC)或其特异性片段，该序列连接pUC57载体合成目的质粒；基于RSV的全基因组序列，本发明首先提供一条用于检测RSV的靶序列，其具有SEQ ID NO.18所示的序列(TCCTAATTGTATAGCATTCATAGGTGAAGGAGCAGGGAATTTATTATTGCGTACAGTAGTGGAACTTCATCCTGATATAAGATATATTTACAGAAGTCTGAAAGATTGCAATGATCATAGTTTACCAATTGAGTTTTTAAGGCTGTACAATGGACATATCAACATTGATTATGGTGAAAATTTGACCATTCCTGCTACAGATGCAA)或其特异性片段，该序列连接pUC57载体合成目的质粒。质粒合成由北京擎科生物有限公司完成。将ADV3、ADV7和RSV重组质粒分别稀释成1*105、1*104、1*103、1*102、1*101、1*100，不同浓度的质粒作为不同的标本。利用实施例1中的ADV3、ADV7和RSV的引物和探针进行检测。按照表8和表9配置体系，外引物的终浓度为0.4μmol/L，内引物及探针的终浓度为0.2μmol/L。RAA试剂盒为江苏齐天有限公司的基础法RAA扩增试剂盒，PCR试剂盒为ABI公司的Entrans qPCR Probe Set V2试剂盒。反应程序如表10，扩增仪器为6100恒温涡旋仪和伯乐CFX96 PCR仪器。
表8和表9系RAP的扩增体系。
表8 RAA基础试剂盒或RT-RAA基础试剂盒反应体系
表9 qPCR反应体系
表10为RAP的反应程序。
表10反应程序
荧光定量PCR方法，利用RAP的内引物和探针对重组质粒做检测。内引物和探针的浓度为0.2μmol/L。采用ABI公司的Entrans qPCR Probe SetV2试剂盒进行扩增。扩增体系见表11，扩增程序见表12，扩增仪器为伯乐CFX96 PCR仪器。
表11为荧光定量PCR体系。
表11荧光定量PCR体系
表12为荧光定量PCR的程序。
表12荧光定量PCR反应程序
图2中的A、图3中的A、图4中的A分别是用于检测ADV3、ADV7和RSV检测的RAP方法的分析灵敏度(LOD)。扩增曲线分别表示浓度为105、104、103、102、101、100拷贝/反应。RAP的分析灵敏度使用连续10倍稀释的重组质粒进行评估。所述的RAP方法检测三种病毒的LOD都可达到10拷贝甚至单拷贝。图2中的B、图3中的B、图4中的B为RAP方法中使用常规内引物的常规qPCR法进行测定。扩增曲线表示LOD的105、104、103、102、101、100拷贝/反应。RAP的LOD达到1～10拷贝/反应，比常规qPCR更敏感。结合图2～图4和表13～表15对比荧光定量PCR和RAP方法的实验结果，相比之下RAP的实验灵敏度高出荧光定量PCR两到三个数量级。
表13为ADV3不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值。
表13 ADV3不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值
| 样本编号 | RAP | qPCR |
| 10<sup>5</sup> | 1.14 | 24.36 |
| 10<sup>4</sup> | 1.16 | 28.13 |
| 10<sup>3</sup> | 1.45 | 32.97 |
| 10<sup>2</sup> | 3.28 | — |
| 10<sup>1</sup> | 4.89 | — |
| 10<sup>0</sup> | 7.52 | — |
表14为ADV7不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值。
表14 ADV7不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值
| 样本编号 | RAP | qPCR |
| 10<sup>5</sup> | 1.02 | 24.46 |
| 10<sup>4</sup> | 1.23 | 28.21 |
| 10<sup>3</sup> | 1.35 | 32.15 |
| 10<sup>2</sup> | 1.68 | 37.24 |
| 10<sup>1</sup> | 2.89 | — |
| 10<sup>0</sup> | 12.56 | — |
表15为RSV不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值。
表15 RSV不同浓度的重组质粒RAP方法和qPCR方法的CT值
由上述实施例可知，采用RAP方法对所收集到的标本进行检测。RAP实验结果与商业试剂盒平行检测结果一致，证实了该方法具有很好的临床特异性和灵敏性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
江苏奇天基因生物科技有限公司
<120> 一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attccggcac agcttacaat tcactcgctc c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagtagtgg taatgtcttt cccaatttgc 30
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcttacaat tcactcgctc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagtggtaat gtctttccca a 21
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 32
<212> DNA
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<400> 6
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<210> 10
<211> 25
<212> DNA
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aagacattac tgcagacaac aagcc 25
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
tccyaattgt atagcattca taggtgaagg agc 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgcatctgt agcaggaatg gtyaaattyt cac 33
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgtatagca ttcataggtg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtagcagga atggtyaaat 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatttacaga agtytgaaag attgc 25
<210> 16
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatagaggtc ctagcttcaa gccatattcc ggcacagctt acaattcact cgctcctaag 60
ggcgcgccca atacatctca gtggatagtt acaacaaatg gggacaatgc agtaactacc 120
accacaaaca catttggcat tgcttccatg aagggagaca atattactaa agaaggtttg 180
caaattggga aagacattac cactactgaa ggagaagaaa agcccattta tgccg 235
<210> 17
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aagccatatt ccggcacagc ttacaattca ctggctccta agggcgcgcc taacacatct 60
cagtggatag ttacaacggg agaagacaat gccaccacat acacatttgg cattgcttcc 120
acgaagggag acaatattac taaggaaggt ttagaaattg ggaaagacat tactgcagac 180
aacaagccca tttatgccga taaaacatat cagccagagc ctcaagttgg agaagaatca 240
tggactgata ttgatggaac aaatgaaaaa tttggaggta gagctcttaa accagctact 300
aaaatgaagc catgc 315
<210> 18
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcctaattgt atagcattca taggtgaagg agcagggaat ttattattgc gtacagtagt 60
ggaacttcat cctgatataa gatatattta cagaagtctg aaagattgca atgatcatag 120
tttaccaatt gagtttttaa ggctgtacaa tggacatatc aacattgatt atggtgaaaa 180
tttgaccatt cctgctacag atgcaa 206
Claims (9)
1.一种RAP基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；
所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液；
所述外引物对中，引物的长度分别为30~35bp；所述内引物对中，引物的长度分别为18~26bp；所述内引物对按照qPCR相应的规则在外引物上截取或者外引物之间设计内引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括独立包装的镁离子。
3.基于权利要求1或2所述试剂盒的非诊断目的的RAP基因检测方法，包括以下步骤：
利用权利要求1或2所述试剂盒对待测模板进行检测，先进行重组酶介导的等温扩增反应，再进行实时荧光定量核酸扩增反应。
4.根据权利要求3所述的RAP基因检测方法，其特征在于，所述RAP基因检测方法，包括以下步骤：
将外引物对、待测模板、重组酶介导的等温扩增反应液、镁离子和水混合，置于PCR管的管盖上；
将内引物对、探针、实时荧光定量核酸扩增反应液和水混合，置于PCR管的管底；
盖上管盖，采用重组酶介导的等温扩增反应条件进行扩增，离心，采用实时荧光定量核酸扩增反应条件进行扩增。
5.根据权利要求4所述的RAP基因检测方法，其特征在于，所述重组酶介导的等温扩增反应条件包括39℃恒温反应10min。
6.根据权利要求4所述的RAP基因检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量核酸扩增反应条件包括：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，20个循环。
7.权利要求1或2所述试剂盒或权利要求3~6任一项所述检测方法在检测靶基因中的应用，所述应用是非诊断目的。
8.一种基于权利要求1或2所述试剂盒或权利要求3~6任一项所述检测方法的RAP病毒检测试剂盒，其特征在于，所述病毒包括腺病毒3型、腺病毒7型和呼吸道合胞病毒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，当所述病毒为腺病毒3时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
当所述病毒为腺病毒7型时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
当所述病毒为呼吸道合胞病毒时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
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