CN2784420Y - 一种巢式pcr反应管 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种巢式PCR反应管。本实用新型所提供的巢式PCR反应管，包括管体和管盖，所述管盖的内侧面上还设有内管，所述内管上设有至少一个加样孔。本实用新型在PCR反应管的管盖上设有一个内管，而巢式PCR的第二轮PCR反应体系位于其中，进行完第一轮PCR扩增后再将置于内管中的第二轮反应体系通过离心、振动或其它方式进入到管体中进行第二轮PCR扩增，巧妙地实现了巢式PCR两轮扩增反应体系的物理隔离，避免了分步操作对PCR体系的污染，从而提高了巢式PCR反应的可靠性；而且还可以将巢式PCR的两轮反应体系分别制备成干剂预先存放于反应管中，可以方便试剂的运输、保存。本实用新型结构简单，可以广泛应用于各种巢式PCR反应。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种巢式PCR反应管。
背景技术
常规PCR技术具有较高的检测灵敏度，但是当待检测样品中的目标核酸较少时，往往难以进行有效的检测，进行两轮扩增的巢式PCR由于检测灵敏度远高于常规PCR，应用更为广泛。对于巢式PCR，针对一种目标核酸一般有两套引物，其中一套引物称为外引物，在第一轮扩增时加入，模板为待检测样品中所提取出的核酸；另一套引物称为内引物，在第二轮扩增时加入，模板为第一轮扩增的产物。目前，通常使用的巢式PCR扩增方法需要在第一轮扩增结束后，开启第一轮反应管的管盖，从第一轮反应体系转移一部分PCR产物到第二轮的体系中，这一操作过程极易导致交叉污染和残留污染，导致假阳性结果并最终降低结果的可信度。
降低或者消除污染的常用方法是将巢式PCR两管反应整合成单管反应，已有多种方式可以实现这一整合。一种方式是在引物设计时使得外引物的退火温度远高于内引物的退火温度，两套引物同处于一种反应体系中，在PCR反应时先采用较高的温度进行外引物的扩增，然后采用较低的退火温度进行内引物的扩增(LIop P.A.et al.，2000，Appl.Environ.Microbiol.66：2071-2078；Mathis A.R.et al.，1997，J.Clin.Microbiol.35：1691-1695，EP0519338A1)。但是外引物在进行第二轮扩增反应时有可能发生作用，进而导致非特异性扩增产生，降低PCR结果的可信度。另一种方式是将第一轮的反应体系与第二轮的反应体系在单个反应管中通过物理隔离来实现，已有的报道包括：将第二轮反应的体系置于Tip头中来实现隔离(Almos A.et al.，1999，Nucleic Acids Res.27：1564-1565)；在第二轮反应体系中添加海藻糖，然后干燥第二轮体系并将其黏附于反应管的盖顶(WolffC.D.1995，PCR methods Appl.4：376-379)；将巢式PCR第二轮反应体系存于0.375％的琼脂糖凝胶中，置于反应管的顶部，并在顶部有一制冷装置以保证在第一步反应过程中第二轮体系所受的影响最小(US5,556,773)。但是，通过Tip头来实现的单管巢式PCR不但会增加操作的复杂度而且还可能引入其它污染，另外，通用Tip头的长度均超过PCR反应管的内腔高度而不能直接置于内腔；而用海藻糖或琼脂糖将第二轮反应体系直接置于盖顶上的方式，由于盖顶与海藻糖或琼脂糖相互作用力较弱，在进行PCR操作时第二轮反应体系易于提前部分或全部掉入反应管，从而导致PCR扩增失败。
发明创造内容
本实用新型的目的是提供一种结构简单、使用方便的巢式PCR反应管。
本实用新型所提供的巢式PCR反应管，包括管体和管盖，所述管盖的内侧面上还设有内管，所述内管上设有至少一个加样孔。
巢式PCR扩增反应的第一轮反应体系加于管体，第二轮反应体系通过加样孔加于内管中。进行PCR扩增时，先进行第一轮PCR扩增，结束后将置于内管中的第二轮反应体系通过离心、振动或其它方式进入到管体中，再进行第二轮PCR扩增。
作为本实用新型的一种改进，在其内管上还设有至少一个排气孔，以方便内管中的第二轮反应体系进入到管体中。为了防止在加样过程中排气孔被液膜堵塞，所述排气孔的排气孔的边缘设有凸台。
内管通常呈筒状，加样孔和排气孔位于其底面；内管与管盖的连接方式有多种选择，如螺纹连接、环状卡扣连接、弹性卡扣连接或胶粘结等。
管体、内管可以选择聚丙烯、聚碳酸酯、有机玻璃、聚苯乙烯、ABS树脂、聚乙烯等材料制作，在进行PCR扩增时为消除材料对PCR可能的抑制，可以采用BSA和硅烷化进行预处理。
本实用新型在PCR反应管的管盖上套设一个内管，而巢式PCR的第二轮PCR反应体系位于其中。进行PCR扩增时，先进行第一轮PCR扩增，结束后将置于内管中的第二轮反应体系通过离心、振动或其它方式进入到管体中，再进行第二轮PCR扩增。本实用新型巧妙地实现了巢式PCR两轮扩增反应体系的物理隔离，避免了分步操作对PCR体系的污染，从而提高了巢式PCR反应的可靠性；而且还可以将巢式PCR的两轮反应体系分别制备成干剂预先存放于反应管中，可以方便试剂的运输、保存。本实用新型结构简单，可以广泛应用于各种巢式PCR反应。
附图说明
图1A为本实用新型巢式PCR反应管的结构示意图；
图1B为本实用新型巢式PCR反应管的整体示意图；
图2为带有一个加样孔和一个排气孔的内管图；
图3为带有一个加样孔和一个排气孔的内管图，其中排气孔有一个凸起的结构；
图4为带有一个加样孔和两个排气孔的内管图；
图5为内管底面为斜面的内管图；
图6为带有一个加样孔和多个排气孔的内管图；
图7为内管底面为锥面的内管图；
图8A为在管体和内管中加有液体PCR反应体系的巢式PCR反应管状态图；
图8B为巢式PCR反应管进行第一轮PCR扩增时状态图；
图8C为将内管中反应体系通过加样孔通过离心、振动或其它方式进入到管体中的示意图；
图8D为巢式PCR反应管进行第二轮PCR扩增时状态图；
图9为在管体和内管中加有固体PCR反应体系的巢式PCR反应管状态图；
具体实施方式
实施例1、巢式PCR反应管
如图1A和1B所示，本实用新型的巢式PCR反应管，包括管体1和管盖2，管盖2的内侧面上弹性卡扣(过盈)连接有内管7，内管7的底部设有一个加样孔8和一个排气孔9，使用时扣上管盖2，内管7即位于管体1中。
在上述实施例中，内管7与管盖2的连接方式是多样的，除了弹性卡扣连接外，还可以是螺纹连接、环状卡扣连接或胶粘结。加样孔和一个排气孔的数量也是多样的，可以根据实际情况进行选择，如图2所示的是内管7带有一个加样孔8和一个排气孔9的情况；图3所示的是内管7带有一个加样孔8和一个排气孔9，排气孔9的边缘设有凸台的情况；图4所示的是内管7带有一个加样孔8和两个排气孔9的情况；图5所示的是内管7的底面为斜面，带有一个加样孔8和一个排气孔9的情况；图6所示的是内管7带有一个加样孔8和多个排气孔9的情况；图7所示的是内管7的底面为锥面的情况(由底面的透视图可以看出)。
实施例2、应用巢式PCR反应管进行PCR扩增
一、本实用新型巢式PCR反应管进行PCR扩增的操作流程
如图8A所示，先在巢式PCR反应管的管体1中加入第一轮PCR反应体系3和用于覆盖反应体系的矿物油4，在内管7中加入第二轮PCR反应体系5；如图8B所示，然后将反应管盖上管盖2，置于PCR仪上进行巢式PCR第一轮扩增，若PCR仪的顶盖具有加热功能，则需要将顶盖的加热功能取消；如图8C所示，巢式PCR的第一轮扩增反应结束后，从PCR仪中取出反应管，通过离心、振动等方式使在内管7中的第二轮反应体系进入反应管的管体1；如图8D所示，将反应管重新置于PCR仪中，进行第二轮PCR扩增，扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳、DNA芯片杂交等方式即可以对扩增产物进行检测。
另外为了利于运输和保存，以及减少操作中的误差和污染，还可以如图9所示，在管体1和内管7中分别预先装入第一轮PCR反应体系3、第二轮PCR反应体系5的球形等固体干剂，使用时溶解，然后按照如上所述的方法进行PCR扩增。
二、本实用新型巢式PCR反应管进行SARS-Cov多重巢式RT-PCR
1、实验材料
化学试剂：一步法RT-PCR试剂盒(组份有：10×One Step RNA PCR Buffer，MgCl2(25mM)，dNTP Mixture(10mM)，RNase Inhibitor(40U/μl)，AMV RTase XL(5U/μl)，AMV-Optimized Taq(5U/μl))(大连TaKaRa)；Taq PCR Master Mixture(北京天为时代)；dUTP(100mM)(上海生工)；尿嘧啶糖苷酶UNG(美国Invitrogen)；DNA分子量参照DL2000(大连TaKaRa)；矿物油(Sigma)；灭菌水；灭菌DEPC-水。
仪器耗材：MJ Research PCR thermal cycler PTC200(MJ Research Inc.Miami，FL)；UVP Bioimaging System and analyzed with Labworks 4.0(UVP，Inc.，Upland，CA)；按图1安装好的巢式PCR反应管，并进行灭菌处理。
引物：所用PCR扩增引物如表1所示，均由上海生工生物工程公司合成，且经过DHPLC纯度测定以及紫外定量。
表1.所用PCR扩增引物
| 引物对 | 引物性质 | 统一名称 | 引物序列 | 目标区域 |
| SARS-CoVSet1 | 外引物 | PMSU_00002 | GCATCGTTGACTATGGTGTCCGATTCT | ORF1ab |
| PMSL_00001 | ACATCACAGCTTCTACACCCGTTAAGGT | ORF1ab | ||
| 内引物 | PMV_00023 | TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGCCGCTTGTCACAATGCCAATT | ORF1ab | |
| PMV_00024 | GGTTTCGGATGTTACAGCGTCATCACCAAGCTCGCCAACAGTT | ORF1ab | ||
| SARS-CoVSet2 | 外引物 | PMSU_00003 | GCTGCATTGGTTTGTTATATCGTTATGC | ORF1ab |
| PMSL_00002 | ATACAGAATACATAGATTGCTGTTATCC | ORF1ab | ||
| 内引物 | PMV_00031 | TCACTTGCTTCCGTTGAGGTAGCCAGCGTGGTGGTTCATACAA | ORF1ab | |
| PMV_00032 | GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTCCCGGCAGAAAGCTGTAAGCT | ORF1ab | ||
| SARS-CoVSet3 | 外引物 | PMSU_00006 | ATACAGAATACATAGATTGCTGTTATCC | N |
| PMSL_00005 | CACGTCTCCCAAATGCTTGAGTGACG | N | ||
| 内引物 | PMV_31007 | TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTC | N | |
| PMV_31012 | GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGCTTTTTAGATGCCTCAGCAGCA | N | ||
| SARS-CoVSet4 | 外引物 | PMSU_00005 | TTAAATGCACCGGCCACGGTTTG | S |
| PMSL_00003 | CCAGCTCCAATAGGAATGTCGCACTC | S | ||
| 内引物 | PMV_00045 | TCACTTGCTTCCGTTGAGGATGCACCGGCCACGGTTTGTG | S | |
| PMV_00046 | GGTTTCGGATGTTACAGCGTATGCGCCAAGCTGGTGTGAGTTGA | S | ||
| IC | 外引物 | PMV_00072 | ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG | Human G3PDH |
| PMV_00073 | TGGTGAAGACGCCAGTGGAC | Human G3PDH | ||
| 内引物 | PMV_40013 | TCACTTGCTTCCGTTGAGGCGTATTGGGCGCCTGGTCACGGTTTCGGATGTTACAGCGTCCAGCATCGCCCCACTTGAT | Human G3PDHHuman G3PDH | |
| PMV_40014 | ||||
| 通用引物 | PMV_10001 | TCACTTGCTTCCGTTGAGG | ||
| PMV_10002 | GGTTTCGGATGTTACAGCGT | |||
*IC：internal control
核酸模板：中国疾病预防控制中心(中国CDC)提供的从SARS-Cov VERO细胞培养上清中所获得的SARS-Cov基因组RNA，浓度为108copies/μL。
2、实验方法
1)PCR反应体系配制
分别按表2和表3配制第一轮和第二轮PCR反应体系。巢式PCR第一轮反应体系的最终体积为10μl，取7μl按表2配制的体系，加入3μl 106稀释的SARS-Cov基因组RNA，并在其上覆盖以20μl的矿物油；在安装于顶盖的内管2中通过加样孔加入40μl按表3配制的体系。
2)PCR扩增
盖上反应管的管盖2，按照表4的热循环程序进行进行第一轮PCR反应，设置PCR仪顶盖为不加热。第一轮热循环程序结束后，从PCR仪中取出PCR反应管，置于Eppendorf的台式离心机中6000rpm离心1分钟使得顶盖中的第二轮反应体系完全进入反应管的底部，将PCR反应管重新置于PCR仪中，按照表5的热循环程序进行第二轮PCR反应。
3)PCR结果电泳检测
采用0.5×TBE来配制1.2％的琼脂糖凝胶，胶中的EB的浓度为0.5μg/μL。PCR产物的上样量为每孔2μL，电泳的分子量参照为DL2000。电泳条件为100V，30分钟。电泳结果采用UVP生物成像系统来记录并且采用Labworks 4.0(UVP，Inc.，Upland，CA)来进行结果分析。电泳中，M道为DNA分子量参照DL2000，1-3道为单管多重巢式PCR的三个重复样品。实验中所进行的为5重PCR，由于最短的两个PCR产物长度接近，而最长的两个PCR产物长度亦接近，在常规的琼脂糖凝胶电泳上不容易区分，电泳条带应为3条。结果表明，本实用新型巢式PCR反应管可以有效地实现单管多重一步法RT-PCR，且具有高的可靠性。
表2.巢式PCR第一轮反应体系
| 反应物名称 | 10μl体系中应加入体积 | 终浓度 |
| 10×One Step RNA PCR Buffer | 1μl | 1× |
| MgCl2(25mM) | 2μl | 5mM |
| dNTP Mixture(10mM) | 1μl | 1mM |
| RNase Inhibitor(40U/μl) | 0.2μl | 0.8U/μl |
| AMV RTase XL(5U/μl) | 0.2μl | 0.1U/μl |
| AMV-Optimized Taq(5U/μl) | 0.2μl | 0.1U/μl |
| UNG(1U/μl) | 0.1μl | 0.01U/μl |
| PMSU_00002(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSL_00001(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSU_00003(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSL_00002(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSU_00006(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSL_00005(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSU_00005(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMSL_00003(10μM) | 0.1μl | 0.1μM |
| PMV_00072(10μM) | 0.05μl | 0.05μM |
| PMV_00073(10μM) | 0.05μl | 0.05μM |
| 灭菌DEPC-水 | 1.4μl | |
| Total | 7μl |
表3.巢式PCR第二轮反应体系
| 反应物名称 | 50μl体系中应加入体积 | 终浓度 |
| PCR Master Mixture(2×) | 25μl | 1× |
| PMV_10001(10μM) | 5μl | 1μM |
| PMV_10002(10μM) | 5μl | 1μM |
| MgCl2(25mM) | 2μl | - |
| dUTP(100mM) | 0.2μl | 400μM |
| PMV_00023(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_00024(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_00031(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_00032(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_31012(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_31007(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_00045(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_00046(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_40013(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| PMV_40014(80μM) | 0.125μl | 0.2μM |
| 灭菌水 | 1.55μl | |
| Total | 40μl |
表4.第一轮反应的热循环程序
50℃ 30min RT反应
37℃ 10min UNG处理
94℃ 10min 灭活RTase以及UNG，预变性
72℃ 10min
表5.第二轮反应的热循环程序
94℃ 3min 预变性
72℃ 10min
Claims (8)
1、一种巢式PCR反应管，包括管体和管盖，其特征在于：所述管盖的内侧面上还设有内管，所述内管上设有至少一个加样孔。
2、根据权利要求1所述的反应管，其特征在于：所述内管上还设有至少一个排气孔。
3、根据权利要求2所述的反应管，其特征在于：所述排气孔的排气孔的边缘设有凸台。
4、根据权利要求2所述的反应管，其特征在于：所述内管呈筒状，所述加样孔和排气孔位于所述内管底部。
5、根据权利要求1或2或3或4所述的反应管，其特征在于：所述内管与所述管盖的连接方式为螺纹连接。
6、根据权利要求1或2或3或4所述的反应管，其特征在于：所述内管与所述管盖的连接方式为环状卡扣连接。
7、根据权利要求1或2或3或4所述的反应管，其特征在于：所述内管与所述管盖的连接方式为弹性卡扣连接。
8、根据权利要求1或2或3或4所述的反应管，其特征在于：所述内管与所述管盖的连接方式为胶粘结。
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