CN1428434A - 一种检测微囊藻产毒的方法 - Google Patents
一种检测微囊藻产毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1428434A CN1428434A CN 02139280 CN02139280A CN1428434A CN 1428434 A CN1428434 A CN 1428434A CN 02139280 CN02139280 CN 02139280 CN 02139280 A CN02139280 A CN 02139280A CN 1428434 A CN1428434 A CN 1428434A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tox1p
- primer
- tox2p
- fragment
- microcystis aeruginosa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测微囊藻产毒的方法，该方法根据微囊藻毒素合成酶基因mcyB仅存在于产毒微囊藻的原理，用mcyB序列设计出特异引物TOX1P/1M和TOX2P/2M，利用全细胞PCR，通过样品的制备、引物的合成、PCR反应、电泳检测来确定微囊藻是否产毒。本发明检测时间短、重现性好、灵敏度和准确性高，所需仪器设备和试剂相对简单，可大批量快速鉴别培养物或自然水样中的微囊藻是否产毒。
Description
技术领域：
本发明涉及蓝藻中的微囊藻，更具体涉及检测微囊藻是否产毒的方法。
背景技术：
由于江河湖泊中的水体富营养化日益加剧，水体中的藻类水华频繁爆发，已经成为水环境污染的严重问题。蓝藻水华不仅影响水体的生态功能，影响景观水体的旅游价值。更严重的是，一些蓝藻水华产生的毒素会直接或间接地影响人类的健康，长期饮用含蓝藻毒素的水源有诱发肝癌的危险。
我国湖泊等水体发生的蓝藻水华绝大多数为微囊藻水华。在微囊藻中，有些种类产微囊藻毒素，有些则不产生微囊藻毒素。即使在同一种类中，也有产毒和非产毒株系之分，如铜绿微囊藻Microcystisaeruginosa。
传统的微囊藻分类主要以形态学特征为依据，如群体大小、形态和胶鞘有无等。大量的研究表明，上述作为分类依据的形态学特征在不同种类之间并没有显著的差别，并且，即便是同一种类，这些特征也会随其生长环境的变动而产生差异。由于上述原因，使得微囊藻种间水平的鉴别显得尤为困难。通过形态学分类的方法无法鉴别微囊藻是否产生毒素。
现有检测产毒微囊藻的分子生物学方法如下：抽提待检测藻样的总DNA，然后以总DNA作为模板。由于微囊藻毒素合成酶基因mcyB仅存在于产毒微囊藻中，根据mcyB序列设计出特异引物TOX1P/1M和TOX2P/2M。用TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，通过PCR的方法特异性地扩增出产毒微囊藻中mcyB的某些片段，从而鉴定微囊藻样品是否产毒。
该方法的不足之处在于：抽提细胞的总DNA耗时长、效率低、样品需要量较大，且抽提DNA所用的去污剂很难完全去除，影响PCR检测的准确性和重现性；另一方面，抽提总DNA需要的试剂、仪器设备复杂，无法用于现场水华样品的直接检测，使得其应用范围受到限制。
发明内容：
本发明的目的是提供一种检测微囊藻产毒的方法。该方法利用全细胞DNA聚合酶链式扩增反应(PCR)的方法来检测微囊藻是否产毒，检测所需时间短、重现性好、准确性高，所需仪器设备和试剂相对简单，可大批量快速鉴别培养物或自然水样中的微囊藻是否产毒。
为了达到上述目的，本发明按下列步骤顺序进行：
1、取含有0.1～5毫克微囊藻的藻液，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去除上清液；
2、加入1～5毫升无菌的去离子水，充分混匀，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去上清；
3、将步骤2重复3～5次，再加入1～5毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；
4、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：
TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’
TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’
TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’
TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’
5、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M 20pmol；热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；如果总体积为20～100微升，上述相关试剂用量按相应比例扩大；
6、用DNA聚合酶链式扩增反应(PCR)仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性93～96℃，1分钟，循环数30个(92～96℃，15～25秒；55～57℃，25～40秒；72℃，50～60秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；
7、将步骤5中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤5相同，重复步骤6的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；
8、选取确定产毒的微囊藻扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果微囊藻样品中扩增的特异性片段与阳性对照中特异性片段在同一条直线上，则表明该片段与阳性对照的大小一致，是产毒微囊藻。
上述产毒微囊藻中，引物对TOX1P/1M扩增的片段约为1300bp，引物对TOX2P/2M扩增的片段约为350bp。
全细胞PCR与常规PCR的区别为，在全细胞PCR中加入一定量的BSA。在PCR反应的起始变性阶段，温度达到95℃，使得部分藻细胞的DNA释放出来，作为PCR反应的模板。如果没有BSA，DNA可能会被核酸酶(DNase)降解，BSA有稳定反应的作用，防止DNA的降解，从而使反应顺利进行。全细胞PCR不需要复杂的反应程序或要求特殊的热循环仪。另外，BSA价格低廉，且用量很小。
本发明与现有技术相比具有以下优点：1、对材料的要求不高，无论以实验室培养物、自然水样或以干藻粉等作为材料都可获得较好的扩增效果，因此，可直接应用于野外样品的检测；2、省去了抽提DNA等烦琐的步骤，操作较为简单易行，省时省力；3、成本低廉，对操作和仪器的要求不高，检测通量大；4、检测所需时间短、重现性好、灵敏度和准确性高、结果直观，为及时预报自然水体中的产毒微囊藻提供了灵敏、可靠的技术。
具体实施方式1：
1、取含有1毫克Microcystis wesenbergii 908(韦氏微囊藻908)的藻液，用5000转/分钟离心5分钟，去除上清液；
2、加入2毫升无菌的去离子水，充分混匀，用5000转/分钟离心5分钟，去上清；
3、将步骤2重复3次，再加入2毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；
4、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：
TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’
TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’
TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’
TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’
5、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M 20pmol；热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；
6、用DNA聚合酶链式扩增反应仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性96℃，1分钟，循环数30个(94℃，15秒；57℃，25秒；72℃，60秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；
7、将步骤5中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤5相同，重复步骤6的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；
8、选取Microcystis sp.PCC7806(微囊藻属PCC7806)扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，Microcystiswesenbergii 908中扩增的特异性片段和Microcystis sp.PCC7806中扩增的特异性片段在同一条直线上，表明Microcystis wesenbergii 908是产毒微囊藻。
具体实施方式2：
1、取含有5毫克Microcystis aeruginosa 937(铜绿微囊藻937)的藻液，用4000转/分钟离心5分钟，去除上清液；
2、加入5毫升无菌的去离子水，充分混匀，用6000转/分钟离心5分钟，去上清；
3、将步骤2重复5次，再加入5毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；
4、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：
TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’
TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’
TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’
TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’
5、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M 20pmol；热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；
6、用DNA聚合酶链式扩增反应仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性96℃，1分钟，循环数30个(96℃，25秒；55℃，40秒；72℃，50秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；
7、将步骤5中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤5相同，重复步骤6的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；
8、选取Microcystis sp.PCC7806(微囊藻属PCC7806)扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，Microcystisaeruginosa 937中扩增的特异性片段和Microcystis sp.PCC7806中扩增的特异性片段在同一条直线上，表明Microcystis aeruginosa 937是产毒微囊藻。
具体实施方式3：
1、取含有3毫克Microcystis aeruginosa 912(铜绿微囊藻912)的藻液，用6000转/分钟离心5分钟，去除上清液；
2、加入3毫升无菌的去离子水，充分混匀，用5000转/分钟离心5分钟，去上清；
3、将步骤2重复4次，再加入3毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；
4、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：
TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’
TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’
TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’
TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’
5、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M 20pmol；热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；
6、用DNA聚合酶链式扩增反应仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性96℃，1分钟，循环数30个(95℃，20秒；56℃，30秒；72℃，55秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；
7、将步骤5中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤5相同，重复步骤6的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；
8、选取Microcystis sp.PCC7806扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，Microcystis aeruginosa 937中扩增的特异性片段和Microcystis sp.PCC7806中扩增的特异性片段不在同一条直线上，表明Microcystis aeruginosa 937不是产毒微囊藻。
Claims (1)
1、一种检测微囊藻产毒的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：
A、取含有0.1～5毫克微囊藻的藻液，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去除上清液；
B、加入1～5毫升无菌的去离子水，充分混匀，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去上清；
C、将步骤B重复3～5次，再加入1～5毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；
D、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：
TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’
TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’
TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’
TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’
E、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M 20pmol；热稳定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；
F、用DNA聚合酶链式扩增反应仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性93～96℃，1分钟，循环数30个(92～96℃，15～25秒；55～57℃，25～40秒；72℃，50～60秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；
G、将步骤E中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤E相同，重复步骤F的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；
H、选取确定产毒的微囊藻扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果微囊藻样品中扩增的特异性片段与阳性对照中特异性片段在同一条直线上，则表明该片段与阳性对照的大小一致，是产毒微囊藻。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02139280 CN1428434A (zh) | 2002-11-14 | 2002-11-14 | 一种检测微囊藻产毒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02139280 CN1428434A (zh) | 2002-11-14 | 2002-11-14 | 一种检测微囊藻产毒的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1428434A true CN1428434A (zh) | 2003-07-09 |
Family
ID=4750000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 02139280 Pending CN1428434A (zh) | 2002-11-14 | 2002-11-14 | 一种检测微囊藻产毒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1428434A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100387985C (zh) * | 2003-12-05 | 2008-05-14 | 浙江大学 | 水中痕量微囊藻毒素的检测方法 |
| CN102220421A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-19 | 山东大学 | 一种通过dna定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法 |
| CN102242191A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-11-16 | 宁波大学 | 用于检测水体中微囊藻毒素的pcr引物及其应用 |
| CN101458223B (zh) * | 2008-12-26 | 2012-01-25 | 江南大学 | 一种微囊藻毒素-lr定量快速检测传感器的制备及应用 |
| CN1981195B (zh) * | 2004-03-17 | 2012-07-04 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 无干扰地分析糖疫苗 |
| CN104145025A (zh) * | 2011-11-09 | 2014-11-12 | 图尔库大学 | 用于检测微囊藻素生成性毒性蓝细菌的方法和引物 |
| CN108504764A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-09-07 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法 |
| CN110157725A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-23 | 武汉藻优生物科技有限公司 | 使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法及得到的产毒微藻 |
| CN113652472A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-16 | 壹健生物科技(苏州)有限公司 | 一种检测产毒微囊藻菌型的探针组合、芯片、试剂盒及方法 |
-
2002
- 2002-11-14 CN CN 02139280 patent/CN1428434A/zh active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100387985C (zh) * | 2003-12-05 | 2008-05-14 | 浙江大学 | 水中痕量微囊藻毒素的检测方法 |
| CN1981195B (zh) * | 2004-03-17 | 2012-07-04 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 无干扰地分析糖疫苗 |
| CN101458223B (zh) * | 2008-12-26 | 2012-01-25 | 江南大学 | 一种微囊藻毒素-lr定量快速检测传感器的制备及应用 |
| CN102242191A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-11-16 | 宁波大学 | 用于检测水体中微囊藻毒素的pcr引物及其应用 |
| CN102242191B (zh) * | 2011-04-25 | 2013-12-04 | 宁波大学 | 用于检测水体中微囊藻毒素的pcr引物组 |
| CN102220421A (zh) * | 2011-05-05 | 2011-10-19 | 山东大学 | 一种通过dna定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法 |
| CN102220421B (zh) * | 2011-05-05 | 2013-12-25 | 山东大学 | 一种通过dna定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法 |
| CN104145025A (zh) * | 2011-11-09 | 2014-11-12 | 图尔库大学 | 用于检测微囊藻素生成性毒性蓝细菌的方法和引物 |
| CN108504764A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-09-07 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法 |
| CN110157725A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-23 | 武汉藻优生物科技有限公司 | 使不产毒微藻产生微囊藻毒素的方法及得到的产毒微藻 |
| CN113652472A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-16 | 壹健生物科技(苏州)有限公司 | 一种检测产毒微囊藻菌型的探针组合、芯片、试剂盒及方法 |
| CN113652472B (zh) * | 2021-07-27 | 2022-07-26 | 壹健生物科技(苏州)有限公司 | 一种检测产毒微囊藻菌型的探针组合、芯片、试剂盒及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20180126383A1 (en) | Microorganism nucleic acid purification from host samples | |
| Rajendhran et al. | Strategies for accessing soil metagenome for desired applications | |
| WO2020207453A1 (zh) | 基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途 | |
| US11788119B2 (en) | Padlock probe detection method | |
| CN111855990B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用 | |
| WO2019136034A8 (en) | Loop-mediated isothermal amplification (lamp) based assay for detecting microbes | |
| CN102559868B (zh) | 一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法 | |
| CN112176035A (zh) | 一种新型crispr核酸检测方法及应用 | |
| CN1428434A (zh) | 一种检测微囊藻产毒的方法 | |
| CN108660191A (zh) | 一种基于编码微球反应器的数字化多重核酸检测方法 | |
| Tian et al. | A LAMP-based microfluidic module for rapid detection of pathogen in cryptococcal meningitis | |
| CN102329874B (zh) | 活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN114457195A (zh) | 基于lamp和crispr的病毒检测试剂盒和方法 | |
| CN102952876A (zh) | 一种产毒微囊藻特异性多重pcr检测方法及其试剂盒 | |
| CN101078028B (zh) | 一种两次bio-bar-code核酸检测技术 | |
| CN1155720C (zh) | 鉴别蓝藻的核酸分子探针和方法 | |
| CN110592269A (zh) | 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN1129670C (zh) | 银染的方法 | |
| KR900014593A (ko) | 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법 | |
| CN110747261A (zh) | 一种四环素类抗生素抗性基因tetX的特异性引物、检测方法和应用 | |
| CN1435492A (zh) | 一种非标记检测dna结合蛋白的芯片及其制备、应用方法 | |
| CN1644709A (zh) | 一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别dna鉴定方法及其检测试剂盒 | |
| CN107727618B (zh) | 生物芯片和特异性切割位点dna序列检测汞离子的方法 | |
| CN107192697A (zh) | 一种检测核酸外切酶i的荧光传感方法 | |
| CN111187814B (zh) | 一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |