CN102220421B - 一种通过dna定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法。该方法针对产毒蓝藻，通过检测其藻细胞中的DNA含量，并根据DNA含量与胞内藻毒素产量之间的相关性关系进行计算，以实现藻毒素的定量。本发明提供的方法简单、便捷和经济，可操作性与重复性强，可同时获得蓝藻细胞DNA含量与藻毒素含量。

Description

一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法
一、技术领域
本发明属于环境微生物领域,具体涉及一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法。
二、背景技术
近年来,我国太湖、巢湖、滇池、玄武湖、东湖等内陆淡水湖泊均多次发生了蓝藻水华,对人们的生活和工农业生产造成了严重的影响,这主要是由于蓝藻细胞破损释放的一系列次生代谢物导致的。随着水体富营养化程度的日益加重,微囊藻毒素对人体健康的危害逐渐引起了广泛的关注,探测高效、灵敏、经济的藻毒素监测技术成为一项亟待解决的问题。
许多研究表明,一个生长旺盛的微囊藻或鱼腥藻,大部分的代谢产物（高达98%）在细胞内部。对于拟柱胞藻（Cylindrospermopsis）,其胞内藻毒素可能高达50%。因此对产毒藻类胞内藻毒素的快速高效的定量检测能够有效评估及防治细胞破损导致的藻毒素危害。
水体中最常见的微囊藻毒素是MC-RR、MC-YR、MC-LR（L、R、Y分别为亮氨酸、精氨酸和酪氨酸）,其中MC-LR毒性大于MC-RR、MC-YR。世界卫生组织（WHO）饮用水标准规定,MC-LR的含量不得超过1.0μg/L。
目前水体中MC的检测方法主要有生物毒理学法、化学分析法、免疫检测法等,其中以高效液相色谱（HPLC）化学分析法应用最为普遍。此方法具有准确、灵敏、样品要求量少、重现性好,并且能够同时分析出不同的异构体等特点,是了解藻类毒素化学性质甚至结构的重要手段,也是环境监测不可或缺的支撑技术。尽管如此,HPLC方法仍存在许多不利于其普遍利用的缺点,其对大型仪器设备的依赖,对高纯度标准样品的制备,以及对具有专门操作技术人员的需要,均限制了该方法在普通实验室的普及应用。
三、发明内容
针对以上问题,本发明的目的是提供一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法。该方法与其它鉴定方法相比更加简单、便捷和经济,可操作性与重复性强,可同时获得蓝藻细胞内部DNA含量与藻毒素含量。
本发明的技术方案是：根据蓝藻细胞中藻毒素的合成由其产毒基因控制,该产毒基因在蓝藻细胞总基因中所占比例一定,因此通过蓝藻细胞总DNA含量的测定,可以间接实现某种成熟蓝藻细胞中藻毒素产量的定量。
本发明的定量检测方法是针对产毒蓝藻,该门藻在温度25℃,光照2000lux条件下培养于BG11培养液中,对数生长期可达到细胞密度107～108个/ml。
本发明可以通过以下方式得以实现：
通过检测蓝藻细胞中的DNA含量,并根据蓝藻中DNA含量与其胞内藻毒素产量之间的相关性关系进行计算,以实现蓝藻藻毒素的定量,该方法的步骤包括：
（1）利用E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit试剂盒提取蓝藻细胞中总DNA,最终提取液50μl,提取后,用NanoDrop ND-100分光光度计在260nm波长下检测DNA浓度；
（2）蓝藻胞内藻毒素用SiliaPrep C18SPE小柱进行提取：首先样品经过用10ml甲醇和20ml水预先活化的小柱进行富集,然后用20ml水及20ml10%和20%的甲醇分别进行洗涤,再用10ml甲醇将藻毒素进行洗脱；
（3）溶出的MC-甲醇溶液通过旋转蒸发仪蒸发至微量,甲醇定容至1ml,将定容后的样品用0.22μm的水系玻璃纤维滤膜过滤,滤液装入液相瓶,采用HPLC法实现藻毒素产量的测定；藻毒素检测的色谱条件为：色谱柱温度：30℃,流动相：甲醇：水（含0.1%TFA）=80:20,流速：1ml/min,检测器：紫外可见光检测器波长238nm；
（4）建立蓝藻细胞中的DNA含量与其胞内藻毒素含量之间的线性关系,并计算线性方程,根据该线性方程实现通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素的含量。
本发明方法的突出特点是：实验操作过程简单,避免了液相色谱等技术中每次样品检测前都必须的冗杂的前处理过程,耗时短且适用于批量处理；本发明所需仪器设备装备于多数微生物实验室,试剂耗材易于购买且经济性较好；本发明可以同时获得细胞内DNA和藻毒素含量,并通过二者细胞内含量水平的相关性,以DNA作为评价MC含量的基础指标更为准确合理。
四、附图说明
附图1微囊藻毒素MC-LR标准品的液相色谱图
附图2未破碎体系(a)及破碎体系(b)中藻毒素提取物的色谱图
附图3胞内藻毒素MC-LR含量与DNA含量间的相关性
五、具体实施方式
本发明为了便于同时实现完整细胞中DNA含量与破碎细胞中藻毒素MC-LR含量的测定,设计了包含完整细胞和破碎细胞两种组分的实验体系。体系中,破碎细胞在-20℃冻融破碎获得,破碎前细胞密度为10.9×107个/mL,破碎后细胞密度降至4.85×107个/mL,然后通过离心获得破碎细胞的上清液,即6.05×107个/mL细胞产生的细胞裂解液。为了使体系中完整细胞与破碎细胞按比例配比,将原始藻液稀释5倍,与破碎细胞上清液按照0:3.0,0.5:2.5,1.0:2.0,1.5:1.5,2.0:1.0,2.5:0.5,3.0:0的比率进行配比,配比体系依次编号1-7,总体积为3ml,所含完整细胞与破碎细胞的密度分别为2.18×107和2.017×107个/mL。
通过微量分光光度法测得该7个体系中完整细胞的DNA含量（表1）分别为0,1.606,3.505,4.595,6.205,8.704,9.713μg/ml。通过液相色谱-紫外检测法,以各浓度藻毒素MC-LR标准品做标准曲线来定性和定量分析样品体系中的MC-LR含量,如图1所示,MC-LR色谱峰的保留时间大约在5.0min,且其标准曲线方程为：y=1.50836x+0.12743(r=0.99868)。未破碎体系及破碎体系中藻毒素提取物的色谱图如图2所示。根据图1中的标准曲线,再通过图2中背景值的扣除换算,测得该7个体系中破碎细胞的MC-LR浓度（表2）分别为3.750,3.060,2.280,1.888,1.250,0.625,0μg/ml。
表1不同破碎体系中铜绿微囊藻FACHB-905的DNA含量
体系 1 2 3 4 5 6 7
完整细胞(×107) 0 1.090 2.180 3.270 4.360 5.450 6.540
DNA含量(μg/ml) 0 1.606 3.505 4.595 6.205 8.704 9.713
表2不同破碎体系中铜绿微囊藻FACHB-905的胞内藻毒素MC-LR含量
体系 1 2 3 4 5 6 7
破碎细胞(×107) 6.051 5.043 4.034 3.026 2.017 1.009 0
MC-LR浓度(μg/ml) 3.750 3.060 2.280 1.888 1.250 0.625 0
根据细胞密度的递增,建立蓝藻FACHB-905细胞中DNA与胞内藻毒素MC-LR含量之间的相关性如图3所示,二者之间存在良好的线性相关性,其线性方程为：Y=0.40029X+0.01946(R=0.99594)。通过该线性方程计算得知,当蓝藻FACHB-905中DNA含量为1μg/ml时,其胞内藻毒素含量可达0.42μg/ml。

Claims (1)

1.一种通过DNA定量测定蓝藻胞内藻毒素含量的方法,其特征是：通过检测蓝藻细胞中的DNA含量,并根据蓝藻中DNA含量与其胞内藻毒素产量之间的相关性关系进行计算,以实现蓝藻藻毒素的定量,该方法的步骤包括：
（1）利用E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit试剂盒提取蓝藻细胞中总DNA,最终提取液50μl,提取后,用NanoDrop ND-100分光光度计在260nm波长下检测DNA浓度；
（2）蓝藻胞内藻毒素用SiliaPrep C18SPE小柱进行提取：首先样品经过用10ml甲醇和20ml水预先活化的小柱进行富集,然后用20ml水及20ml10%和20%的甲醇分别进行洗涤,再用10ml甲醇将藻毒素进行洗脱；
（3）溶出的MC-甲醇溶液通过旋转蒸发仪蒸发至微量,甲醇定容至1ml,将定容后的样品用0.22μm的水系玻璃纤维滤膜过滤,滤液装入液相瓶,采用HPLC法实现藻毒素产量的测定；藻毒素检测的色谱条件为：色谱柱温度：30℃,流动相：甲醇：水=80:20,水中含0.1%TFA,流速：1ml/min,检测器：紫外可见光检测器波长238nm；
（4）建立蓝藻细胞中的DNA含量与其胞内藻毒素含量之间的线性关系,并计算线性方程,根据该线性方程实现通过DNA定量获得蓝藻胞内藻毒素含量测定。
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