CN111394348A - 污水中游离态dna的提取及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及污水处理技术领域，尤其涉及污水中游离态DNA的提取及检测方法。本发明提供的污水中游离态DNA的提取方法及定量检测方法，在提取过程中，以采用乙醇‑乙酸铵沉淀法浓缩分离滤液中游离态DNA，整个提取过程仅需1次沉淀和两次洗涤，过程操作简洁，且能够提高DNA的收率和纯度；而在检测步骤中，利用高灵敏性Picogreen荧光染料检测游离态DNA的浓度。本方法可有效屏蔽污水中常见盐类和有机物等污染物的干扰，为污水中痕量游离态DNA研究提供了灵敏、可靠的分析手段。

Description

污水中游离态DNA的提取及检测方法
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，尤其涉及污水中游离态DNA的提取及检测方法。
背景技术
游离态DNA因富含氮、磷等元素，被视作水环境中微生物的重要营养来源之一。大量研究报道了海水、湖水、河水和池塘水等自然水体中游离态DNA的存在，其浓度范围为pg/mL～ng/mL级。除了在各种水体中普遍检出游离态DNA外，也有研究证明水环境中游离态DNA能够被细菌自然转化，这说明游离态DNA也是水环境中基因水平转移的潜在载体。更为重要的是，最新研究发现自然水体(包括河水、井水、饮用水、湖泊水和水库等)中游离态DNA携带着高丰度的新兴污染物抗生素抗性基因。鉴于此，环境中游离态DNA越来越受到研究者的重视。
与自然水体不同，目前仍鲜见研究关注污水中的游离态DNA。最近，中国学者张衍等采用乙醇/乙酸钠浓缩-分光光度法首次考察了实际污水处理厂污水中的游离态DNA，结果显示进水、出水中游离态DNA分别为5.7±1.5ng/mL、1.6±1.7ng/mL。然而，该研究尚存一定局限：一方面，本团队验证性实验显示，采用乙醇+乙酸钠浓缩污水中游离态DNA会导致污水杂质与DNA发生共沉淀，影响游离态DNA准确定量；另一方面，该研究采用微量分光光度计对浓缩的游离态DNA进行测定，可能导致游离态DNA的定量数据偏差较大。该研究结果中，部分污水中游离态DNA浓度低至1ng/mL。即使浓缩1000倍(浓缩倍数不宜过大，否则共沉淀杂质过多)，其浓度也仅为1μg/mL，亦低于微量分光光度计的检出下限(2μg/mL)。
污水成分复杂，含有众多盐类、有机物等杂质，可能会干扰游离态DNA的高效分离和准确定量。此外，分离试剂、分离体系体积、分离温度等参数的选择也会严重影响污水中游离态DNA的分离效能，但目前未见污水中游离态DNA分离参数的优化研究。因此，要实现对污水中游离态DNA环境行为特征的全面解析，有必要系统地构建和优化游离态DNA的分离和定量检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供污水中游离态DNA的提取及检测方法，该方法可有效屏蔽污水中常见盐类和有机物等污染物的干扰，为污水中痕量游离态DNA研究提供了灵敏、可靠的分析手段。
本发明提供的污水中游离态DNA的提取方法，包括：
污水经过滤，滤液与乙酸铵溶液混合后，加入无水乙醇，0℃～4℃静置，离心取沉淀；所述沉淀以乙醇溶液清洗2次，获得污水游离态DNA。
本发明中，所述过滤采用0.22μm滤膜。0.22μm滤膜可以过滤掉污水中的微生物，因此以滤液进行提取获得的DNA为游离态DNA，不掺杂微生物内的DNA。
本发明中，所述乙酸铵溶液的浓度为6～8mol/L。一些实施例中，所述乙酸铵溶液的浓度为7.5mol/L。
本发明中，所述乙酸铵溶液与滤液的体积比为1∶2。
本发明中，所述无水乙醇与滤液的体积比为3∶1。
一些实施例中，所述无水乙醇为预冷的无水乙醇。所述预冷的温度为0～4℃，优选为4℃。一些实施例中，静置的温度为0℃，具体的，于冰上静置。
本发明中，所述静置的时间为1h。
本发明中，所述离心的条件为4℃、14000g、30min。
本发明中，所述乙醇溶液为0℃～4℃预冷的70vol％乙醇，每次清洗使用70vol％乙醇的体积为0.6～0.8mL。
一些具体实施例中，所述清洗包括：以4℃预冷70vol％乙醇重悬沉淀后，于4℃、14000g离心30min，取沉淀。
经两次洗涤后，所得DNA沉淀以无菌无酶水重悬。
一些具体实施例中，本发明所述的污水中游离态DNA的提取方法，包括：
污水经0.22μm滤膜过滤，取滤液，1/2体积的7.5mol/L乙酸铵溶液，颠倒混匀后，加入与滤液等体积的4℃预冷无水乙醇，再次颠倒混匀后，于冰上静置1h；4℃、14000g离心30min后，取沉淀以4℃预冷的70vol％乙醇重悬后，于4℃、14000g、离心10min，再次取沉淀以4℃预冷的70vol％乙醇重悬后，于4℃、14000g、离心10min，沉淀即为污水中游离态DNA。提取获得的污水中游离态DNA以150～200μL无菌无酶水溶解、保存。
本发明还提供了一种污水中游离态DNA的定量检测方法，采用本发明所述的提取方法提取污水游离态DNA，与PicoGreen工作液混合，在激发波长480nm，发射波长520nm下测定荧光强度值。
本发明中，污水游离态DNA与PicoGreen工作液混合的体积比为1∶1。混合后的体系中，PicoGreen荧光染料终浓度为0.8μM；
一些具体实施例中，所述PicoGreen荧光染料工作液体积为50μL。
本发明中，采用外标法确定游离态DNA的浓度。
所述外标法中，DNA标准曲线的绘制以λDNA为标准品，具体包括：
以TE缓冲液配制浓度为200ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、2ng/mL、1ng/mL和0.2ng/mL的λDNA标准工作液；
各浓度λDNA标准工作液与等体积的PicoGreen工作液混匀(至PicoGreen终浓度为0.8μM)、避光孵育2～5min后，在激发波长480nm，发射波长520nm下测定荧光强度值，以λDNA标准工作液的浓度为横坐标，以其对应的荧光强度值(扣除TE缓冲液空白对照)为纵坐标，绘制DNA定量标准曲线。
本发明提供的污水中游离态DNA的提取方法及定量检测方法，在提取过程中，以采用乙醇-乙酸铵沉淀法浓缩分离滤液中游离态DNA。整个提取过程仅需1次沉淀和两次洗涤，过程操作简洁，且能够提高游离态DNA的回收率和纯度，而在检测步骤中，利用高灵敏性Picogreen荧光染料检测游离态DNA的浓度。本方法可有效屏蔽污水中常见盐类和有机物等污染物的干扰，为污水中痕量游离态DNA研究提供了灵敏、可靠的分析手段。
附图说明
图1是乙醇-乙酸铵、乙醇-乙酸钠和乙醇浓缩游离态DNA的效果，其中A-A-E、S-A-E和E分别表示乙醇-乙酸铵、乙醇-乙酸钠和乙醇；
图2是DNA定量标准曲线；
图3是污水厂进水和出水中游离态DNA的浓度。
具体实施方式
本发明提供了污水中游离态DNA的提取及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
一些实施例中，本发明所述方法的的检测步骤包括：
(1)样品预处理
取实际污水厂中污水样品，采用滤膜进行过滤。取滤液保存于冰箱，待用于后续检测。
(2)游离态DNA的分离
采用乙醇-乙酸铵沉淀法浓缩分离滤液中游离态DNA，具体步骤为：
①取步骤(1)中滤液，置于离心管A中。加入乙酸铵，颠倒混匀。加入预冷无水乙醇，再次颠倒混匀后，于冰上静置；
②离心后，小心移除上清液。往离心管A加入预冷乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至新的离心管B中；
③离心管B离心后，小心移除上清液。再次向离心管A加入预冷乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至离心管B中；
④离心管B离心后，小心移除上清液。加入适量体积无菌无酶水，即获得浓缩的游离态DNA溶液。
(3)游离态DNA的定量检测
采用PicoGreen荧光染料检测试剂盒测定污水中游离态DNA的浓度，具体步骤为：
①取λDNA标准储备液至TE缓冲液，依次进行梯度稀释，配成A和B系列DNA标准工作液；
②吸取步骤①中DNA标准工作液至96孔板。采用TE缓冲液作为空白对照；
③往步骤②标准工作液中加入PicoGreen荧光染料工作液。混匀后，避光、室温接种；
④利用多功能酶标仪测定步骤③DNA标准工作液的荧光强度值；
⑤以DNA标准曲线工作液浓度为横坐标，以其对应的荧光强度值(扣除TE缓冲液空白对照)为纵坐标，绘制DNA定量标准曲线；
⑥用步骤(2)-④中浓缩的游离态DNA样品替代步骤(3)-②中标准工作液，按步骤(3)-②～⑤测定样品荧光强度值。查阅步骤⑤中DNA定量标准曲线，获取游离态DNA的浓度。
下面进一步给出附加技术条件：
在步骤(1)中，所述污水取自于实际污水厂的进水和出水；所述污水置于灭菌棕色玻璃瓶中，并采用冰袋运输至实验室；所述进水和出水体积为大于10mL；所述过滤滤膜孔径为0.22μm；所述冰箱温度设置为-20℃。
在步骤(2)中，其子步骤①所述滤液体积为8mL；离心管A体积为50mL；乙酸铵浓度为7.5M；乙酸铵体积为4mL；无水乙醇体积为24mL；无水乙醇预冷温度为4℃；冰浴时间为1h。在子步骤②中，所述离心条件为：4℃、14000g、30min。在子步骤②和③中，所述乙醇预冷温度为4℃，乙醇溶液浓度为70vol％；乙醇溶液的体积为0.6～0.8mL；离心管B体积为2mL。在子步骤③和④中，所述离心条件为：4℃、14000g、10min。在子步骤④中，所述无菌无酶水体积为150～200μL。
在步骤(3)中，其子步骤①所述λDNA标准储备液浓度为100μg/mL；A系列DNA标准工作液配制中λDNA标准储备液体积为10μL；所述A系列DNA标准工作液浓度为2000、200、20、2ng/mL；所述B系列DNA标准工作液配制中λDNA标准储备液体积为5μL；所述B系列DNA标准工作液浓度为1000、100、10、1ng/mL；所述TE缓冲液由10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA组成；所述TE缓冲液体积为490μL。
在步骤(3)中，其子步骤②所述DNA标准工作液体积为50μL；所述样品做3个平行。
在步骤(3)中，其子步骤③所述PicoGreen荧光染料工作液体积为50μL；所述PicoGreen荧光染料终浓度为0.8μM；所述接种时间为2～5min；
在步骤(3)中，其子步骤④所述多功能酶标仪设置的激发波长为～480nm，发射波长～520nm。
本发明明确了污水中游离态DNA的定量检测方法。通过对比乙醇-乙酸铵、乙醇-乙酸钠和乙醇三种游离态DNA浓缩法，发现乙醇-乙酸铵法可有效屏蔽污水中常见盐类和有机物等污染物对污水中游离态DNA分离的干扰(附图1)。此外，采用PicoGreen荧光染料检测试剂盒可灵敏、准确地测定污水中游离态DNA的浓度。荧光染料PicoGreen与双链DNA特异性结合，在氩激光的激发下发射高强度绿色荧光。通过检测荧光强度，可定量分析样品中的痕量DNA(检测下限低至25pg/mL)。本发明为污水中痕量游离态DNA的时空分布特性研究提供了灵敏、可靠的分析手段。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1污水游离态DNA的提取
1、污水样品前处理
从江苏省无锡市七座实际污水厂的进水和出水点取污水样品，置于灭菌棕色玻璃瓶中，并采用冰盒运输至实验室。采用0.22μm滤膜过滤污水，取滤液保存于-20℃冰箱。
2、游离态DNA的分离
(1)取步骤一中8mL滤液，置于50mL离心管中。加入4mL7.5M乙酸铵，颠倒混匀。加入24mL4℃预冷无水乙醇，再次颠倒混匀后，于冰上静置1h；
(2)于4℃、14000g、30min离心后，小心移除上清液。往离心管加入0.8mL4℃预冷70vol％乙醇。轻微混匀后，将乙醇/沉淀混合液转移至新的2mL离心管中；
(3)于4℃、14000g、30min离心后，小心移除上清液。再次向步骤(1)中50mL离心管加入0.8mL4℃预冷70vol％乙醇。轻微混匀后，再次将乙醇/沉淀混合液彻底转移至步骤(2)的2mL离心管中；
(4)于4℃、14000g、30min离心后，小心移除上清液。加入200μL无菌无酶水，即获得浓缩的游离态DNA溶液。
3、游离态DNA的定量检测
(1)用移液器吸取10μL λDNA标准储备液(100μg/mL)，加入490μL TE缓冲液，即得2000ng/mL DNA标准工作液。依次进行10倍梯度稀释，配成200ng/mL、20ng/mL、2ng/mL和0.2ng/mL的高浓度DNA标准工作液。
另取5μL λDNA标准储备液，加入495μL TE缓冲液，即得1000ng/mL DNA标准工作液。依次进行10倍稀释，配成100ng/mL、10ng/mL和1ng/mL DNA标准工作液。
(2)用移液器吸取50μL DNA标准工作液至96孔板中。采用TE缓冲液作为空白对照。所有样品至少做3个平行。
(3)加入50μL PicoGreen工作液(终浓度为0.8μM)。混匀后，避光、室温接种5min。
(4)利用多功能酶标仪，在激发波长～480nm，发射波长～520nm下测定荧光强度值。
(5)以DNA标准曲线工作液浓度为横坐标，以其对应的荧光强度值(扣除空白对照)为纵坐标，绘制DNA定量标准曲线(附图2)。
(6)取50μL步骤2-(4)中游离态DNA溶液至96孔板中，加入与50μL PicoGreen工作液混合(终浓度为0.8μM)。混匀后，避光、室温接种5min。按步骤(4)测定样品的荧光强度值。
(7)查阅步骤(5)中DNA定量标准曲线，根据样品的荧光强度值获取污水中游离态DNA的浓度。污水厂进水和出水中游离态DNA的浓度如附图3所示。结果发现，污水厂进水中游离态DNA浓度范围为0.1～733.4ng/mL，而污水厂出水中游离态DNA浓度范围则为0～18.5ng/mL。
对比例1污水游离态DNA的提取
本对比例与实施例1不同之处在于：在污水样品前处理阶段，仅取某一实际污水厂的进水样品(3个平行样)。此外，在游离态DNA的分离步骤中，向8mL滤液中加入3mL 3M乙酸钠，颠倒混匀。之后再加入22mL 4℃预冷无水乙醇。其他步骤同实施例1。获得的游离态DNA沉淀外观如附图1所示，其中，实施例1提取获得的DNA呈无色透明状；而本对比例1提取的DNA呈现褐色，表明提取获得的DNA中残留大量有机物等杂质。游离态DNA溶液的定量结果进一步显示，DNA检出浓度均值为1.1ng/mL(实施例1对应样品中游离态DNA浓度均值为4.4ng/mL)。
对比例2污水游离态DNA的提取
本对比例与实施例1不同之处在于：在污水样品前处理阶段，仅取某一实际污水厂的进水样品(3个平行样)。在游离态DNA的分离步骤中，直接往8mL滤液中加入16mL 4℃预冷无水乙醇。其他步骤同实施例1。获得的游离态DNA沉淀外观如附图1所示，其中，实施例1提取获得的DNA呈无色透明状；而本对比例2提取的DNA呈现白色，表明提取获得的DNA中残留大量盐等杂质。游离态DNA溶液的定量结果进一步显示，DNA检出浓度值为0.6ng/mL(实施例1对应样品中游离态DNA浓度均值为4.4ng/mL)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.污水中游离态DNA的提取方法，其特征在于，包括：
污水经过滤，滤液与乙酸铵溶液混合后，加入无水乙醇，0℃～4℃静置，离心取沉淀；所述沉淀以乙醇溶液清洗2次，获得污水游离态DNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸铵溶液的浓度为6～8mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸铵溶液与滤液的体积比为1∶2。
4.根据权利要求1～3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述无水乙醇与滤液的体积比为3∶1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述静置的时间为1h。
6.根据权利要求1～5任一项所述的提取方法，其特征在于，所述离心的条件为4℃、14000g、30min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇溶液为0℃～4℃预冷的70vol％乙醇，每次清洗使用70vol％乙醇溶液的体积为0.6～0.8mL。
8.一种污水中游离态DNA的定量检测方法，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的提取方法提取污水游离态DNA，与PicoGreen工作液混合，激发波长480nm，发射波长520nm下测定荧光强度值。
9.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，污水游离态DNA与PicoGreen工作液混合的体积比为1∶1。
10.根据权利要求8或9所述的定量检测方法，其特征在于，采用外标法确定游离态DNA的浓度。
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