CN103134844B

CN103134844B - 一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法

Info

Publication number: CN103134844B
Application number: CN201310034237.7A
Authority: CN
Inventors: 汪承润; 卢韫; 徐向华; 姜传军; 王勤英; 李志啸
Original assignee: Huainan Normal University
Current assignee: Huainan Normal University
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103134844A

Abstract

本发明涉及一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法，是将发芽的蚕豆种子悬浮培养于用自来水梯度稀释的待测废水溶液中，2周后切取根尖，置于蛋白酶K溶液，抽真空。分离根尖细胞核，应用单细胞凝胶电泳（SCGE）技术分离DNA断片。应用荧光显微镜拍摄彗星图片，应用CometScore image-analysis system测定彗星尾长和尾矩，再应用SPASS软件进行统计分析。本发明的检测方法通过抽真空能够促进蛋白酶K渗入根尖分生组织细胞核，加速DNA交联蛋白质的降解，从而解除DNA-蛋白质交联作用对DNA断片的阻滞作用，便于揭示和准确评价待测废水诱导DNA断裂和损伤的真实水平。

Description

一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法

技术领域

本发明涉及一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法，具体地说是一种基于复杂成分工业废水诱导蚕豆根尖细胞真实DNA损伤水平的Hormesis剂量-效应评价该污染介质遗传毒性的技术。

背景技术

近年来，随着工业的飞速发展，工业废水不断产生，其污染成分也日趋复杂。由于化学分析方法不可能分析出复杂污染介质中的所有污染成分，更不能对复合污染物长期暴露诱导的潜在的生物毒性进行准确预测和评估。近年来，环境科学与生态毒理学工作者已经着手从污染物的形态、生物有效性和生态毒性之间的关系开展环境污染的监测与评价。人们进一步认识到，传统的毒理学方法（致死率、生长率和生物量等）已经不能敏感地反应污染物的生态毒性，而分子生态毒理学诊断技术不仅能够综合反映污染物的整体毒理学效应，而且能够发挥早期预警作用，已成为国际生态环境安全领域的研究和应用的热点之一（Tarazona et al.,2000；孙铁珩等,2002；Wang et al.,2010a,b）。

大量研究结果表明，污染物均能够诱导植物体的遗传毒性（Zaka et al.,2002;Wang et al.,2012）。因此，通过检测植物体暴露后的遗传损伤即可揭示单一或复合污染介质潜在的遗传毒性效应。美国环境保护局（US-EPA）已经证实植物遗传毒性分析是环境污染监测的有效手段之一（Yi and Meng,2002；Zaka et al.,2002）。单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)是近30年来发展起来的一种可用于检测单个细胞DNA链断裂和损伤的新技术，与传统的DNA损伤检测方法(贺福初和夏寿萱,1986)比较,具有简便、快速、灵敏、样品量少和无需放射性标记等优点，已广泛应用于研究和评价污染物对人、动物和植物细胞的遗传毒性（Chatterjee et al.，2000；Barker and Weinfeld，2005；Roldán-Arjona et al.，2009）。然而，进一步研究发现，当污染物增加到一定浓度后，细胞核内的DNA断片与蛋白质发生了交联作用，阻碍了电泳过程中DNA断片向阳极的迁移，导致彗尾缩短（Merk et al.,2000;Barker andWeinfeld,2005;Kuykendall et al.,2006;Wang et al.,2012），从而掩蔽了污染物的真实毒性，因而导致对实际污染水平的错误评价。近年来，虽然SCGE技术已应用于诊断污染物诱导植物细胞的DNA损伤水平，而如何将植物细胞DNA-蛋白质交联的SCGE技术应用于监测和评价工业废水等复杂污染介质生物毒性的研究却鲜见报道。

大量研究结果表明，污染物诱导的生物效应既非传统的线性阈值模型,也非线性非阈值模型，而是“U”或“J”型剂量-效应曲线（Calabrese and Baldwin,2003,2008;Wang et al.,2010a,b）。这就是梯度浓度污染物可能诱导的Hormesis剂量效应曲线。传统的生物监测手段忽略了待测污染介质诱导生物体的Hormesis效应，只是凭借分析待测污染介质与对照组之间生物毒性的显著性变化来判断该污染物的毒性大小，往往导致错误的评价。因此，将植物细胞DNA-蛋白质交联的SCGE监测技术与Hormesis效应联合起来即可最大程度地揭示污染物，尤其是复杂污染介质诱导植物细胞DNA的真实的损伤水平，进而用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的大小。因此，本发明的废水监测和评价方法具有重要的理论意义和应用指导价值。

发明内容

本发明所解决的技术问题是基于复杂成分工业废水诱导蚕豆根尖细胞实际DNA损伤水平的Hormesis效应和显著性分析来甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法。运用这种方法可以规避常规生物监测手段和评价方法对复杂成分工业废水潜在生物毒性的错误判断。这种诊断方法是将蚕豆根尖暴露于梯度稀释后的待测工业废水溶液，抽真空促进蛋白酶K渗透根尖细胞核和降解DNA交联蛋白，应用单细胞凝胶电泳（简称SCGE）技术检测DNA断片，测量彗星尾长和尾矩，与对照组比较，分析其显著性变化。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法，是将发芽的蚕豆根尖悬浮于待监测的废水，切取根尖，置于蛋白酶K溶液，抽真空；分离细胞核，进行单细胞凝胶电泳，拍摄彗星细胞图片，测量彗星尾长和尾矩，进行显著性分析。

本发明的方法，首先是将待检测废水应用自来水进行梯度稀释，检测各梯度浓度废水对蚕豆根尖细胞核的DNA损伤水平。

本发明的方法，其中所述蛋白酶K溶液浓度优选为100μg/mL，通过抽真空，加速蛋白酶K对细胞核的渗透和对DNA交联蛋白分子的降解。

本发明的方法，具体实施步骤包括：

（1）蚕豆种子的催芽和待测废水的梯度稀释；

（2）蚕豆根尖的污染暴露；

（3）根尖细胞核的分离和单细胞凝胶电泳；

（4）彗星尾长和尾矩的测定；

（5）显著性分析。

本发明的一种优选实施方式包括如下步骤：

（1）蚕豆种子的催芽培养：蚕豆种子经0.1%次氯酸钠溶液消毒后充分清洗，于23-25℃和75%相对湿度环境下催芽。种子发芽后转移至石英砂中继续培养，待根尖长至2cm时转移至待测废水溶液中悬浮培养，培养条件不变；

（2）蚕豆根尖暴露2周后，剪取1cm根尖，置于100μg/mL蛋白酶K溶液，室温下抽真空；

（3）清洗根尖，液氮速冻，解冻后用玻璃棒末端轻轻碾压根尖，用核提取液提取细胞核，50μm尼龙膜过滤，1000×g低温离心，收集细胞核；

（4）进行SCGE电泳，电泳结束后用0.1%（m/v）溴化乙锭（EB）染色5分钟，荧光显微镜下观察并拍摄彗星图片；

（5）应用CometScore image-analysis system测定彗星尾长和尾矩，应用SPASS软件进行统计分析。

其中步骤（1）中待测废水是应用自来水梯度稀释的工业废水溶液，以自来水作为对照；

其中步骤（2）中抽真空的条件为：0.09Mpa，3min/次，间歇3min，重复6次；

其中步骤（3）中核提取液为50mM Tris-HCl,10mM Na2EDTA,100mM NaCl,0.1%TritonX-100,pH7.4；

其中步骤（4）中SCGE电泳过程为：在载玻片上制备含有一定数量细胞核的胶板，52°C孵育0.5h；胶板转移至水平电泳槽，在预冷的中性电泳液中浸没30min后，在0.42V.cm^-1和50mA条件下电泳35min；应用中和液浸没胶板15min，再用无水乙醇浸没胶板10min。

本发明的创新性在于：

（1）将暴露于废水溶液的蚕豆根尖置于100μg/mL蛋白酶K溶液，室温下抽真空，促进蛋白酶K渗透根尖细胞核，加速DNA交联蛋白质的降解，通过SCGE电泳，揭示高浓度废水诱导细胞核DNA损伤的真实水平；

（2）应用自来水梯度稀释待测废水，在测定各剂量组根尖彗星尾长和尾矩的基础上，通过显著性分析，评价原废水实际遗传毒性的大小。

本发明的方法具有如下技术效果：

（1）能够比较准确地评价复杂成分工业废水生物毒性的大小

DNA-蛋白质交联是诊断污染物长期暴露所致生物毒性大小的重要分子标志物。本监测方法通过抽真空促进蛋白酶K渗透细胞核，加速了DNA交联蛋白质的降解，消弱或解除了DNA-蛋白质交联作用对彗星细胞DNA断片的阻滞作用，SCGE电泳后的彗星尾长和尾矩能够更加接近DNA的实际损伤水平。

传统的生物监测手段忽略了待测废水可能诱导生物体的Hormesis剂量-效应，往往只是凭借分析原废水溶液与对照组之间生物毒性的显著性差异来评价该废水的毒性大小。本监测方法应用自来水稀释待测工业废水，制备系列梯度稀释溶液，在比较各处理组与对照组之间的显著性变化的基础上诊断原废水实际遗传毒性的大小，避免了只检测原废水暴露组根尖细胞DNA损伤而导致的错误判断。

（2）具有简便、快捷、灵敏和易于推广等优点

DNA-蛋白质交联也可以应用荧光分光光度法进行检测，但必需荧光分光光度计之类的昂贵仪器，一般实验室很难开展此类研究工作。与荧光分光光度法比较，应用中性SCGE电泳技术，结合蛋白酶K对根尖组织细胞核的渗透处理和蛋白质的酶促降解作用，可以简便、快捷、灵敏地检测出梯度稀释废水诱导蚕豆根尖分生组织细胞核DNA的实际损伤水平。此外，该方法所需样品量少，重复性高，易于推广；只要具备荧光显微镜，在普通实验室即可开展检测工作。

附图说明

图1：梯度稀释的华润雪花啤酒（常州）有限公司污水诱导蚕豆根尖细胞核DNA损伤的SCGE电泳图（根尖在去离子水中抽真空）（50×）；

图2：梯度稀释的华润雪花啤酒（常州）有限公司污水诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤的彗星尾长(A)和尾矩(B)（根尖在去离子水中抽真空）；

图3：梯度稀释的华润雪花啤酒（常州）有限公司污水诱导蚕豆根尖细胞核DNA损伤的SCGE电泳图（根尖在蛋白酶K溶液中抽真空）（50×）；

图4：梯度稀释的华润雪花啤酒（常州）有限公司污水诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤的彗星尾长(A)和尾矩(B)（根尖在蛋白酶K溶液中抽真空）；

图5：梯度稀释的常州老三集团有限公司废水诱导蚕豆根尖细胞核DNA损伤的SCGE电泳图（根尖在蛋白酶K溶液中抽真空）（100×）；

图6：梯度稀释的常州老三集团有限公司废水诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤的彗星尾长(A)和尾矩(B)（根尖在蛋白酶K溶液中抽真空）（100×）。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：

本发明的方法包括如下检测步骤：

（1）蚕豆种子的催芽培养：普通蚕豆种子经0.1%次氯酸钠溶液消毒后充分清洗，于23-25℃和75%相对湿度环境下催芽，发芽后转移至石英砂中继续培养；

（2）根尖长至2cm左右时，悬浮培养于梯度稀释的待测废水溶液（稀释比例根据废水对根尖生长影响的预实验结果而定），以自来水作为空白对照；

（3）染毒2周后剪取1cm根尖。将废水处理组和空白对照组幼苗根尖均分成两大组，其中一组置于去离子水，另一组置于100μg/mL蛋白酶K溶液，室温下抽真空（0.09Mpa，3min/次，间歇3min，重复6次）；

（4）清洗根尖，液氮速冻，解冻后用玻璃棒末端轻轻碾压根尖，用核提取液（50mM Tris-HCl,10mM Na₂EDTA,100mM NaCl,0.1%TritonX-100,pH7.4）提取细胞核，50μm尼龙膜过滤，1000×g低温离心8min，收集细胞核；

（5）SCGE电泳：在载玻片上制备含有一定数量细胞核的胶板，52°C孵育0.5h；胶板转移至水平电泳槽，在预冷的中性电泳液（100mM Tris-HCl,300mM CH₃COONa,pH9.0）中浸没30min后，在0.42V.cm^-1和50mA条件下电泳35min；

（6）应用中和液（0.4M Tris-HCl,pH7.5）浸没胶板15min，再用无水乙醇浸没胶板10min，0.1%（m/v）EB染色5分钟，漂洗后晾干，在荧光显微镜下观察并拍摄彗星图片；

（7）应用CometScore image-analysis system测定彗星尾长和尾矩，应用SPASS软件进行统计分析。

实施例1：

发明人应用上述的发明方法检测了华润雪花啤酒（常州）有限公司污水诱导蚕豆根尖细胞的遗传毒性，据此评价了原污水的毒性。首先将原废水应用自来水稀释成梯度溶液：1×、2×、4×和8×。当根尖暴露于各稀释溶液2周后，切取各处理组根尖，分成两大组。其中一组应用去离子水抽滤，分离细胞核，SCGE电泳。结果表明，与自来水对照组比较，未稀释的1×处理组中，彗星尾长和尾矩未见显著性升高。稀释2和4倍后，彗星尾长和尾矩显著性增加。当稀释至8倍时，尾长和尾矩升高但不显著（图1和图2）。另一组根尖应用100μg/mL蛋白酶K溶液真空抽滤，分离细胞核，SCGE电泳。结果发现，彗星尾长和尾矩基本上随着污水稀释倍数的增加而趋于下降，而且未稀释的1×处理组彗星尾长和尾矩也发生显著性升高（图3和图4）。据此认为，原废水具有中等毒性。

实施例2：

发明人应用上述的发明方法检测了常州老三集团有限公司废水的毒性。蚕豆根尖悬浮培养于稀释1-5倍的废水溶液后，幼苗中毒死亡。根尖暴露于10-160倍的废水稀释溶液，2周后应用100μg/mL蛋白酶K溶液真空抽滤根尖，分离根尖细胞核，SCGE电泳。结果表明，10-80倍的废水稀释溶液均诱导了彗星尾长和尾矩显著性升高（图5和图6）。据此认为，原废水具有剧毒的毒性。

实施例3：

发明人应用上述的发明方法还检测和评价了武进双惠环境工程有限公司废水处理前后的毒性变化。蚕豆根尖悬浮培养于稀释1-10倍的进水(处理前)_和出水（处理后）溶液后，幼苗很快萎蔫死亡。当幼苗培养于稀释20-320倍的进水2周后，应用100μg/mL蛋白酶K溶液真空抽滤根尖，SCGE电泳。结果发现，稀释20-160倍的进水诱导了彗星尾长和尾矩显著性升高，而稀释320倍后未见显著性变化。与此同时，稀释20-320倍的出水均诱导了彗星尾长和尾矩显著性升高。据此认为，该公司废水处理前属于高毒，而处理后废水毒性升高，属于剧毒。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于甄别和评价复杂成分工业废水遗传毒性的方法，其特征在于：步骤包括：

(1)蚕豆种子的催芽培养：蚕豆种子用0.1％次氯酸钠溶液消毒，充分清洗后于23-25℃和75％相对湿度环境下催芽，发芽后转移至石英砂中继续培养；

(2)待根尖长至2cm时，悬浮培养于适宜浓度梯度的待监测废水稀释溶液，同时以自来水作为对照，培养条件同步骤(1)；

(3)培养2周后剪取1cm根尖；将暴露组和对照组根尖均置于100μg/mL蛋白酶K溶液，室温下抽真空；抽真空条件为：0.09Mpa，3min/次，间歇3min，重复6次；

(4)清洗根尖，液氮速冻，解冻后用玻璃棒末端轻轻碾压根尖，用核提取液提取细胞核，50μm尼龙膜过滤，1000×g低温离心8min，收集细胞核；核提取液为50mM Tris-HCl,10mM Na₂EDTA,100mM NaCl,0.1％TritonX-100,pH 7.4；

(5)单细胞凝胶电泳，溴化乙锭染色，荧光显微镜下观察和拍摄彗星细胞；

(6)测定彗星尾长和尾矩；

(7)绘制彗星尾长和尾矩的Hormesis剂量效应曲线，结合显著性分析方法，界定废水致毒的浓度范围。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中单细胞凝胶电泳步骤为：在载玻片上制备含有一定数量细胞核的胶板，52℃孵育0.5h；胶板转移至水平电泳槽，在预冷的中性电泳液中浸没30min后，在0.42V.cm^-1和50mA条件下电泳35min；先用中和缓冲液浸没胶板15min，再用无水乙醇浸没胶板10min，最后应用0.1％m/v溴化乙锭染色5分钟；荧光显微镜下观察和拍摄彗星细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中应用CometScoreimage-analysis system测定彗星尾长、尾矩，然后应用SPASS软件进行统计分析。