CN104914237A - 一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法 - Google Patents

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孙向武
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Abstract

本发明公开了一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，属于生物毒性识别领域。其步骤为：先选择受试物，然后配置内分泌干扰液，并对受试体进行染毒处理，提取转基因母鼠体内细胞以及胚胎细胞，最后采用单细胞分子电泳技术，对细胞进行检测。本发明通过将处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为受试体，并采用单细胞分子电泳对母鼠及其子代细胞进行检测，具有简便、快速、灵敏、样品量少和无需放射性标记等优点，解决了传统的毒理学方法不能敏感反应出废水中内分泌干扰物的遗传毒性问题，可广泛应用于研究和评价污染物对人、动物和植物细胞的遗传毒性。

Description

一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法
技术领域
本发明涉及生物毒性识别领域，具体涉及一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法。
背景技术
化工废水中内分泌干扰物具有很强的遗传毒性，其是一种外源性干扰内分泌系统的化学物质，指环境中存在的能干扰人类或动物内分泌系统诸环节并导致异常效应的物质，它们通过摄入、积累等各种途径，并不直接作为有毒物质给生物体带来异常影响，而是类似雌激素作用于有机体，使其遗传物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上受到各种损伤，即使数量极少，也能让生物体的内分泌失衡，出现种种异常现象。这类物质会导致动物体和人体生殖器障碍、行为异常、生殖能力下降、幼体死亡、甚至灭绝。内分泌干扰物的遗传毒性对男性生殖系统影响最大，主要表现为男性雌性化，引起各种形式的雌性生殖系统发展障碍，精子数目减少乃至无精，睾丸肿瘤，性欲降低和不育症，对女性生殖系统具体表现为女孩青春期提前，子宫内膜异位发病率增加，月经周期改变等。人体妊娠时接触废水中内分泌干扰物会对子代产生有害效应，其子代生殖器癌症发病率无论男女均有增加。因此，不论是从保护水环境生态系统还是保障我们人类自身的身体健康和生命安全，建立一种短期、快速、有效的化工废水中内分泌干扰遗传毒性的识别方法是非常重要的。
传统的识别化工废水中内分泌干扰遗传毒性的方法有发光细菌法、体外微核识别法、试管法、双核法等，这些方法都能识别出化工废水中内分泌干扰遗传毒性，但步骤繁琐，实际操作难度较大，不能敏感反应出废水中内分泌干扰物的遗传毒性问题。
发明内容
本发明针对化工废水中内分泌干扰遗传毒性识别不灵敏的问题，提出了单细胞分子电泳法，解决了传统的毒理学方法不能敏感反应出废水中内分泌干扰物的遗传毒性问题，可广泛应用于研究和评价污染物对人、动物和植物细胞的遗传毒性。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
(1)筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为试验对象，并对转基因母鼠进行繁殖建系；
(2)提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为1.0％-3.0％；
(3)将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下，存活1-3天；
(4)提取转基因母鼠体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，待检测；
(5)采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，分析其DNA损伤程度，并绘制彗星尾图谱，对试验结果进行分析。
本发明与其它方法相比，有益之处在于：
本发明提供了一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，通过将处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为受试体，并置于配置好的含有浓度梯度的内分泌干扰液中培养1-3天，然后采用单细胞分子电泳对母鼠及其子代细胞进行检测，最后通过分析，识别出化工废水中内分泌干扰遗传毒性，具有简便、快速、灵敏、样品量少和无需放射性标记等优点，解决了传统的毒理学方法不能敏感反应出废水中内分泌干扰物的遗传毒性问题，可广泛应用于研究和评价污染物对人、动物和植物细胞的遗传毒性。
具体实施方式
一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，其步骤包括：
(1)选择受试物：筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为试验对象，并对转基因母鼠进行繁殖建系；
(2)配置内分泌干扰液：提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为1.0％-3.0％；
(3)对受试体进行染毒处理：将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下，存活1-3天；
(4)提取细胞：提取转基因母鼠体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，待检测；
(5)细胞的检测：采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，分析其DNA损伤程度，并绘制彗星尾图谱，对试验结果进行分析。
所述的转基因母鼠，是以穿梭质粒pESnx为载体，将xy1E诱变靶基因植入母鼠体内；之所以选择处于妊娠期的母鼠，是为了进一步说明遗传毒性对于生物及其后代的影响。
所述的细胞悬浮液的配置方法为：(1)先制备小鼠细胞培养液，成分为：微量元素、促生长因子、无机盐、维生素和小鼠血浆等。(2)将母鼠体内细胞及胚胎细胞先剪碎，然后用分解酶处理成单个细胞。(3)然后把这些单个细胞放入小鼠细胞培养液中。(4)调节培养液的pH值为6.9，并放入适宜的环境下培养即可。
所述的单细胞凝胶电泳技术可以快速检测单细胞DNA的损伤，根据绘制的彗星尾图谱，可以检测到每1.903×10-41kg中0.09DNA的断裂。本方法能更加直观、准确的检测水质的遗传毒性，结果易于统一，重现性好，能够对水质污染状况做出精准判断。
下面通过三个具体事例来加以说明
实施例1
首先筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为受试体，并对转基因母鼠进行繁殖建系；然后提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为1.0％；将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下存活1天之后提取其体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，结果表明，此环境下彗星尾长和尾矩提高了93.3％，即化工废水中内分泌干扰遗传毒性为低。
实施例2
首先筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为受试体，并对转基因母鼠进行繁殖建系；然后提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为2.0％；将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下存活2天之后提取其体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，结果表明，此环境下彗星尾长和尾矩提高了96.4％，即化工废水中内分泌干扰遗传毒性为中。
实施例3
首先筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为受试体，并对转基因母鼠进行繁殖建系；然后提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为3.0％；将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下存活3天之后提取其体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，结果表明，此环境下彗星尾长和尾矩提高了99.8％，即化工废水中内分泌干扰遗传毒性为高。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域普通工程的技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，其步骤包括：
(1)选择受试物：筛选处于妊娠期的携带xy1E的转基因健康母鼠作为试验对象，并对转基因母鼠进行繁殖建系；
(2)配置内分泌干扰液：提取化工废水中内分泌干扰物并与自来水充分混合，内分泌干扰物的浓度比例为1.0％-3.0％；
(3)对受试体进行染毒处理：将转基因母鼠充分暴露在内分泌干扰液环境下，存活1-3天；
(4)提取细胞：提取转基因母鼠体内细胞以及胚胎细胞，分别置于细胞悬浮液中，待检测；
(5)细胞的检测：采用单细胞分子电泳技术，对细胞悬浮液中的母体细胞以及胚胎细胞进行检测，分析其DNA损伤程度，并绘制彗星尾图谱，对试验结果进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，其特征在于：所述的转基因母鼠，是以穿梭质粒pESnx为载体，将xy1E诱变靶基因植入母鼠体内；之所以选择处于妊娠期的母鼠，是为了进一步说明遗传毒性对于生物及其后代的影响。
3.根据权利要求1所述的一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，其特征在于：所述的细胞悬浮液的配置方法为：
(1)先制备小鼠细胞培养液，成分为：微量元素、促生长因子、无机盐、维生素和小鼠血浆等；
(2)将母鼠体内细胞及胚胎细胞先剪碎，然后用分解酶处理成单个细胞；
(3)然后把这些单个细胞放入小鼠细胞培养液中；
(4)调节培养液的pH值为6.9，并放入适宜的环境下培养即可。
4.根据权利要求1所述的一种化工废水中内分泌干扰遗传毒性试验识别方法，其特征在于：所述的单细胞分子电泳技术可以快速检测单细胞DNA的损伤，根据绘制的彗星尾图谱，可以检测到每1.903×10-41kg中0.09个DNA的断裂。
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