CN104535551B - 一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法，是由酿酒酵母菌株细胞自噬相关蛋白Atg8的荧光标记、土壤水萃液的获取、酿酒酵母在营养丰富培养基和不同氮素量培养基的培养、模型的建立和土壤内可利用氮素的推算等步骤组成，其特征在于：一定浓度的酿酒酵母细胞耗尽培养基中的可利用氮素，从而启动细胞自噬，并将GFP标记的Atg8完全运往液泡进行降解的时长会因氮素量的不同而不同，据此可以建立标准模型和推算未知土壤内可利用氮素的量。该方法操作简单、成本低廉、可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。

Description

一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测 方法

技术领域

本发明属于细胞生物学和土壤学领域，涉及一种新的土壤内可利用氮素的测定方法，更准确地说本发明涉及一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法。

背景技术

土壤养分参数(主要为氮、磷、钾及有机质含量)是土壤肥力的重要指标，反映了土壤供给作物生长的能力；其中氮素是作物最重要的结构物质，也是酶的主要成分，所以氮素对作物生理代谢和生长有重要作用。作物可利用的土壤内中主要氮素形式是铵态氮和硝态氮；氮素的不同形态会对作物生理代谢过程和生长产生不同的影响。目前公认的土壤内氮素营养诊断都是以实验室常规测试为主，取样、测定、数据分析等繁琐的过程需要耗费大量的人力、物力，且未考虑氮素营养的多寡对其内生物的影响。

细胞自噬(autophagy)是溶酶体(酵母中为液泡)参与的胞内物质代谢的过程，是真核生物维持细胞稳态和保持健康的一类亚细胞降解途径，在真核生物中是保守的。目前了解比较多的细胞自噬调控通路主要有两条：TOR(Target ofrapamycin)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K，Phosphoinositide 3-kinase)通路，很多其他自噬途径都直接或间接通过这两条通路发挥作用；Tor是细胞自噬的负调控因子，能特异性的响应胞内氮素水平，在营养丰富的条件下，Tor激酶处于活性状态，此时细胞自噬受到抑制，而在营养缺乏等外界条件下，Tor激酶失活而自噬活性上升；在可利用氮素营养缺乏的条件下，细胞内相关物质会运往液泡进行降解，因而可以根据真核生物模式生物酿酒酵母耗尽培养基中的可利用氮素，并且启动细胞自噬，从而将自噬相关蛋白如Atg8运往液泡的时间长短来建立模型和检测土壤内氮素水平。

目前国内外相关研究还未有涉及该方面的成果，因而利用荧光标记的自噬相关蛋白完全进入液泡的时长，可以有效的推测土壤内可利用氮素的水平。基于此，可以进行相关技术方法的改进和测试设备的研制，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

为了解决土壤内氮素营养多寡未考虑其内生物的问题，基于细胞自噬与氮素营养的关系，本发明提供了一种新颖的测试土壤内氮素营养的方法，即：在一定培养基中，一定浓度的酿酒酵母细胞耗尽可利用氮素并启动细胞自噬，从而导致GFP-Atg8完全进入液泡，根据这个过程的时长来推算土壤内可利用氮素的量。

为解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)酿酒酵母菌株Atg8蛋白的荧光标记和相应数量关系模型的建立：自噬相关蛋白Atg8被GFP标记酿酒酵母菌株的特征在于，可以通过荧光显微镜方便观察到Atg8的分布情况，当培养液中氮素营养缺乏时，GFP-Atg8会送往液泡降解；而在营养丰富的条件下，GFP-Atg8会弥散在细胞质中。在不同氮素水平下，一定浓度的酵母细胞耗尽培养液中的氮素从而启动细胞自噬所用的时间会有所不同，据此可建立氮素水平与GFP-Atg8降解为分离的GFP和Atg8时长之间的关系。

(2)所用菌株细胞的培养技术：酵母细胞在SD-Ura等培养基中培养至对数期OD₆₀₀≈1.0时，取约30mL培养液经离心、洗涤后转入不同氮素水平的培养基中，并开始记录时间，对培养不同时长的细胞进行显微荧光拍照，根据所得结果建立氮素水平与GFP-Atg8完全转入液泡的时长之间的关系模型；并根据土壤水萃液作为唯一氮源的培养基中酵母细胞相应的时长，推算土壤内可利用氮素的量。

本发明的有益效果是：一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法，操作简单、成本低廉，可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。

附图说明

图1是在细胞转入相同氮素水平不同时长条件下GFP-Atg8分布情况的显微荧光照片图。

图2是不同氮素水平相同时长条件下GFP-Atg8转换为Atg8的western-blot示意图。

具体实施方式

(1)Atg8蛋白的荧光标记：利用酿酒酵母基因库关于Atg8的基因信息，设计上下游引物，对Atg8序列片段进行扩增；对扩增的产物和含GFP的载体进行酶切、纯化、连接等分子生物学操作，然后整合至所用的酿酒酵母基因组。

(2)土壤测试样品水萃液的获取：对所测试区域进行采样，经干燥、研磨、过筛等步骤，取1g待测土样，与10mL去离子水在摇床上100rpm振荡24h得到土壤水萃液，然后高速离心5min，取上清液，高温灭菌后备用。

(3)氮素水平与GFP-Atg8转化为Atg8时长之间关系模型的建立：将自噬相关蛋白Atg8已被GFP荧光蛋白标记的酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至OD600≈1.0时，取30mL培养液经离心、无菌水洗涤后，转入不同氮素水平的液体培养基中，通过显微荧光观察确定GFP-Atg8完全运往液泡的时间。如附图1所示，在初始阶段，由于氮素营养丰富，GFP-Atg8分布在细胞质中(如图1①所示)，未有运往液泡的迹象；随着氮素营养的消耗，GFP-Atg8有向液泡集中的趋势(如图1②所示)；在氮素营养完全耗尽的条件下，酿酒酵母细胞启动细胞自噬，GFP-Atg8由细胞质运往液泡(如图1③所示)；据此可以得到氮素水平和GFP-Atg8完全运往液泡时长之间的关系模型。同样，在不同氮素水平相同时间条件下，GFP-Atg8与分离的GFP或Atg8间的比例也有所不同(如图2所示)，图2所示为加样对照；细胞在不同氮素水平的培养基中培养一定时间后，取样进行western-blot，可以得到氮素水平与GFP-Atg8分布状态的示意图(如图2)：在氮素营养丰富的条件下(图2⑥所对应的一列)，主要是以GFP-Atg8(如图2⑨所对应)的形式存在，而在氮素营养完全缺失的条件下(图2⑧所对应的一列)，则主要以分离的GFP或Atg8的形式(如图2⑩所对应)存在，在其他氮素营养梯度下(如图2⑦所对应)，则分离形式的GFP或Atg8(即进入液泡部分)呈现一定的变化规律；因而从显微荧光及western-blot的结果来看，培养基的氮素水平与GFP-Atg8完全降解为分离的GFP和Atg8的时长之间存在一定的关系模型。

(4)测算样品的可利用氮素含量：以步骤(2)所获取的土壤水萃液作为唯一氮源，进行细胞的培养，培养条件完全同步骤(3)，根据显微荧光观察得到GFP-Atg8完全进入液泡内的时长；然后根据步骤(3)所建立的关系模型，计算所测试土壤样品的可利用氮素含量。

以上已以较佳实施公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法，其特征在于：建立可利用氮素水平与酵母菌株细胞中荧光标记Atg8蛋白完全进入液泡的时长之间的关系；所述的关系是可利用氮素水平与GFP-Atg8进入液泡转化为分离的GFP和Atg8时长之间的关系；收集1g待测土壤，与10mL去离子水在摇床上100rpm振荡24h得到土壤水萃液，然后高速离心5min，取上清液，高温灭菌后备用；将自噬相关蛋白Atg8已被绿色荧光蛋白标记的酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至OD600≈1.0时，取30mL培养液经离心、无菌水洗涤后转入以无菌的上清液为唯一氮源的培养基中；分不同时间点，取样观察Atg8是否完全进入液泡，检测GFP-Atg8完全转为Atg8的时长；并根据所建立的关系推算土壤内可利用氮素的量。

2.根据权利要求1所述的一种基于Atg8完全进入液泡时长的土壤内可利用氮素的检测方法，其特征在于：所述的检测方法是利用所测试土壤水萃液作为唯一氮源，进行细胞培养，根据GFP-Atg8完全进入液泡降解为分离的GFP和Atg8的时长推算土壤内可利用氮素的含量。