CN102199653A

CN102199653A - 一种快速筛选、评价抗菌生物活性物质的方法

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Publication number: CN102199653A
Application number: CN2010101549681A
Authority: CN
Inventors: 刘平怀; 刘洋洋; 时杰; 杨勋; 郝宗娣; 陈德力; 汪春牛; 许琼情
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2010-03-28
Filing date: 2010-03-28
Publication date: 2011-09-28

Abstract

一种快速、评价筛选抗菌生物活性物质的方法，具体是一种联合加速溶剂萃取仪和微孔板刃天青显色法筛选抗菌生物活性物质的试验方法。它包括如下步骤：采用加速溶剂萃取仪制备生物活性物质；将生物活性物质和已知抗生素按浓度梯度加入到微孔板中，并在各孔中加入实验菌悬液；将微孔板置于适宜条件下孵化后加入刃天青溶液，混匀；用酶标仪测定微孔板各孔在600nm处的吸光值；由已知抗生素孔中吸光值和不同浓度的生物活性物质孔中的吸光值，求出待筛选生物活性物质的MIC值；进而对生物活性物质的抗菌活性进行评价。本发明快速、简便，可客观、准确得对生物活性物质的抗菌活性进行评价，从而使抗菌生物活性物质的高通量筛选成为可能。

Description

一种快速筛选、评价抗菌生物活性物质的方法

技术领域

本发明涉及一种快速筛选评价抗菌药物的方法，具体是一种通过快速溶剂萃取技术联合微孔板刃天青显色法快速筛选、评价抗菌生物活性物质的试验方法。用于生物医药领域。

背景技术

抗菌药物是现代医疗中不可缺少的一大类药品，临床应用十分广泛。但是，目前在应用这类药物时存在着许多问题，如毒副反应、变态反应、细菌耐药性的产生等，尤其是细菌耐药性的迅速上升，使得由这类病菌所致的严重感染没有有效的药物可供选用，对人类健康造成极大的威胁。由于生物活性物质的特殊性，细菌较少对生物活性物质产生耐药性。因此，研究和开发抗菌生物活性物质对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义。

近年来，从生物资源中寻找新的抗菌活性的药物成为目前研究中的一个热点。但由于生物资源庞大，其次生代谢物众多，采用传统的筛选方法从中筛选具有抗菌活性的物质(活性部位或活性成分)费时、低效并且成本很高。

快速溶剂萃取技术是一种在一定的温度(50℃～200℃)和压力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下用溶剂对固体或半固体样品进行萃取的方法。使用常规的溶剂、利用增加温度和提高压力提高萃取的效率，大大加快了萃取的时间并明显降低萃取溶剂的使用量，可以最大限度的对生物活性物质进行提取。

纸片琼脂扩散法(K-B试验)和试管肉汤稀释法作为常规的抗菌药物筛选方法难以适应大规模新型抗菌药物的筛选需要。此外，由于试管肉汤稀释法是根据肉眼观察试管内溶液是否变混浊，而大多数生物活性物质在试管培养液中呈现出较深颜色，给肉眼观察带来不便。刃天青是一种氧化还原指示剂，实验菌代谢过程中产生NADH等氢离子供体能使蓝色的刃天青变为红色。因此，根据刃天青颜色从青蓝-红紫-粉红的变化情况，可以判定反应体系中的实验菌的生长是否被被测样品抑制。颜色为蓝色就代表反应体系中的实验菌的生长被样品抑制，而为红色就说明反应体系中的实验菌的生长没有被样品抑制或抑制作用很小。

发明内容

本发明的目的在于针对现有抗菌药物筛选、评价技术中的不足和缺陷，提供一种借助加速溶剂萃取技术和微孔板刃天青显色法的试验方法，实现快速，简便、定量，而且客观、准确地对抗菌生物活性物质进行筛选与评价。

本发明所提供的快速筛选、评价抗菌生物活性物质的方法，包括如下步骤：

a)待筛选生物活性物质采用加速溶剂萃取技术制备；

b)将待筛选的生物活性物质和已知MIC值的抗生素按浓度梯度加入到微孔板中后，然后在各孔中加入已稀释好的实验菌菌悬液；

c)将微孔板置于适宜条件下孵化一定时间后，加入刃天青溶液，振荡培养1～3h；

d)用酶标仪测定微孔板各孔在600nm处的吸光值；

e)由已知MIC值的抗生素所对应孔中的吸光值和不同浓度的生物活性物质所对应孔中的吸光值，求出待筛选的生物活性物质的MIC值；

f)以步骤e所指生物活性物质的MIC值对生物活性物质的抗菌活性进行评价、比较与筛选。

本发明通过以下步骤作进一步的具体限定：

所述步骤a中生物活性物质是采用加速溶剂萃取仪制备，其过程包括准确称取干燥样品5～20g，装入34～100mL萃取池中，溶剂瓶中加入选好的提取溶剂，设定ASE提取参数(提取压力为10～20MPa，提取温度为30～180℃，提取时间5～40min，循环1～3次)，提取液干燥后得生物活性物质，步骤a中所用溶剂可以是水和有机溶剂，对提取液浓缩可以采用减压浓缩、真空冷冻干燥或喷雾干燥；

所述步骤b中已知MIC值的抗生素应根据实验菌的特点选择，选择对实验菌的生长具有良好抑制作用且能够通过常规的纸片琼脂扩散法或试管肉汤稀释法测出其对实验菌的最小抑制浓度(MIC值)的抗生素，如头孢他啶，青霉素、万古霉素等，步骤b所选的实验菌包括细菌和真菌，可以是标准菌株、临床分离菌株或耐药菌株，步骤b中将已知抗生素和待筛选的生物活性物质按照一定浓度梯度加入到微孔板中，每孔加1～20μL，然后各孔中加入100μL已稀释好的实验菌菌悬液，该菌悬液由处于对数生长期的实验菌菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准；

所述步骤c中孵化条件应根据所选实验菌的最适生长条件设定，然后加入10～50μL5％的刃天青溶液，该刃天青溶液用无菌水配制；

所述步骤d是用酶标仪测定微孔板的各孔在600nm处的吸光值；

本发明的原理是采用加速溶剂萃取技术快速高效地制备生物活性物质，并采用微孔板刃天青显色法快速筛选、评价数量庞大的生物活性物质的抗菌活性，具体是采用加速溶剂萃取技术制备生物活性物质，加快萃取的时间但可以最大限度的对生物活性物质进行提取；加入微孔板中的刃天青在600nm波长下有最大吸光值，在实验菌存在的情况下，刃天青被分解，孔中溶液在600nm处的吸光值降低，采用酶标仪可以快速检测含有生物活性物质的微孔板孔中刃天青的变化，从而计算出生物活性物质的最小抑制浓度(MIC值)，因此可快速、准确地对数量庞大的生物活性物质进行筛选与评价。

本发明所述的生物活性物质，它是用加速溶剂萃取技术由生物样品(如动物、植物、微生物)制得的粗提取物，但在实际操作过程中不应局限于粗提取物，它还可以是由粗提取物经过常规制备方法获得的单体化合物、活性组分和活性部位。

本发明提高了由生物样品制备生物活性物质的效率，还克服了常规的纸片琼脂扩散法(K-B试验)和试管肉汤稀释法作为抗菌药物筛选方法的不足，从而快速、简便、客观地对数量庞大的生物活性物质的抗菌作用进行筛选与评价，具体表现在：

a)本发明采用加速溶剂萃取技术制备生物活性物质，在最大限度的对生物活性物质进行提取的同时，加快了萃取的时间并明显降低萃取溶剂的使用量；

b)本发明采用微孔板为反应容器，具有用量少，平行度高的特点，添加药液和菌悬液可以采用多道微量加样器，然后采用酶标仪进行数据采集，具有快速、准确、重复性高的特点；

c)本发明采用刃天青为指示剂，如附图1，刃天青的全波长扫描图表明，刃天青在600nm处有最大吸光度；如附图2，刃天青被实验菌分解后，吸光度明显减少，因此，测定微孔板孔中刃天青的含量可以反应孔中药物对实验菌生长的抑制情况；

d)本发明所用的微孔板为市售的“U”型48～384孔的酶标板或细胞培养板，可以实现高通量筛选；

e)本发明可以直接得出不同生物活性物质的最小抑菌浓度，从而可对数量庞大的生物活性物质的抗菌活性进行比较、筛选。

由于本发明提供了快速、简便、客观的筛选和评价抗菌生物活性物质的方法，对数量庞大的生物活性物质抗菌作用的高通量筛选与评价成为可能。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明中刃天青溶液的全波长扫描图。

图2是本发明中刃天青被实验菌分解后的全波长扫描图。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实验材料

1、实验菌菌悬液

选择金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，临床分离菌株)为实验菌，将金黄色葡萄球菌接种于MH肉汤培养基中(称取21g MH肉汤粉末溶于1L蒸馏水中，调pH7.3，121℃灭菌20min)，37℃活化培养2次，每次活化培养时间为16h。然后接入至新MH肉汤培养基中，200rpm、37℃摇培9～12h至对数生长期。用MH肉汤培养基将菌悬液稀释至0.5麦氏比浊标准，待用。

2、海洋生物样品

7种生物样品分别为面包海星(Culcita novaeguineae)、梅氏长海胆(Echinometra mathaei)、白棘三列海胆(Tripnetistes gratilla)、秀丽节蛇尾(Ophiarthrum elegans)、青皮(Vaticamangachapoi)、厚藤(Ipomoea pescaprae)、海杧果(Cerbera manghas)，采自海南省万宁市神州半岛海域和三亚市西岛海域，用蒸馏水冲洗去泥沙，甩干，捣碎，冷冻干燥。

3、植物样品

海南萝芙木(Rauvolfia verticillata Lour.Baill.Var.hainanensis Tsiang)根、茎、叶采集于海南省乐东黎族自治县尖峰岭国家森林公园，催吐萝芙木(Rauwolfia vomitoria Afzel.exSpreng)根、茎、叶由海南省五指山市海南制药厂公司惠赠，所有植物样品去除泥沙后，于室内通风处自然阴干，粉碎，过20目筛。

实施例1：一种快速筛选评价抗菌药物的方法

根据预试验，选择头孢他啶作为实验菌的阳性对照抗生素，采用试管肉汤稀释法测定头孢他啶对该实验菌的MIC值为12.5mg/L。

取无菌96孔培养板，每孔中加入100μL菌悬液和5μL不同稀释度(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.380625mg/L)的头孢他啶样品溶液，模型对照孔加菌悬液和无菌水，空白对照孔加MH肉汤培养基和无菌水。37℃孵育18h后，加入50μL刃天青溶液，反应2h后，用酶标仪测定96孔板中各孔在刃天青最大吸收波长下(λmax＝600)的吸光值，结果测得头孢他啶MIC值所在孔的OD值为0.544。

以另外两种抗生素(对氨苄青霉素和去甲万古霉素)配制样品溶液，取无菌96孔培养板，每孔中加入100μL菌悬液和5μL不同稀释度的样品溶液，模型对照孔加菌悬液和无菌水，空白对照孔加MH肉汤培养基和无菌水。37℃孵育18h后，加入50μL刃天青溶液，反应2h后，用酶标仪测定96孔板中各孔在刃天青最大吸收波长下(λmax＝600)的吸光值，通过计算样品溶液孔中OD₆₀₀为0.544时样品的浓度，即可得不同样品对实验菌的最小抑制浓度(MIC值)，然后分别采用常量肉汤稀释法测定对氨苄青霉素和去甲万古霉素对实验菌的最小抑制浓度，从而对微孔板刃天青显色法的准确性进行验证实验。微孔板刃天青显色法与常量肉汤稀释法对实验菌生长抑制作用的比较见表I，结果表明，刃天青显色法所测定的结果与常量肉汤稀释法的结果非常相近，可以作为一种快速筛选评价药物的抗菌活性的方法。

表1微孔板刃天青显色法与常量肉汤稀释法对实验菌生长抑制作用的比较

实施例2：24种海洋生物活性物质抗菌活性的快速筛选与评价

准确称取生物样品冻干品5g，装入34mL萃取池中，萃取池底部提前加装纤维素滤片，依次以石油醚、乙酸乙酯、乙醇(体积分数95％)、甲醇、蒸馏水为提取溶剂，设定ASE提取参数(提取压力为10MPa，提取温度为120℃，提取时间10min，循环2次)，有机溶剂提取液45℃减压浓缩至干，水提取液真空冷冻干燥，制得24种生物活性物质。准确称取一定量的生物活性物质用少量20％二甲基亚砜(DMSO)溶解分散，离心取上清，用20％的DMSO溶液将样品倍比稀释，待用。

取无菌96孔培养板，每孔中加入100μL菌悬液和5μL样品溶液，样品溶液包括不同稀释度的头孢他啶和不同稀释度的生物活性物质，模型对照孔加菌悬液和无菌水，空白对照孔加MH肉汤培养基和无菌水。37℃孵育18h后，加入50μL刃天青溶液，反应2h后，用酶标仪测定96孔板中各孔在600nm处的吸光值，通过测定微孔板孔中刃天青的含量，考察孔中药物对实验菌生长的抑制情况。测得头孢他啶MIC值所在孔的OD值为0.544，通过计算其它样品溶液孔中OD₆₀₀为0.544时的生物活性物质浓度，即可得出不同生物活性物质的抗菌活性。采用加速溶剂萃取技术由7种生物样品制得的24种生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度(MIC值)见表2。

表2海洋生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度(

mg/mL)

其中，“——”代表未测定，“No”代表未检出抗菌活性或抗菌活性很弱。

比较表2中24种海洋生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度，可以发现海洋生物样品梅氏长海胆石油醚提取物、面包海星乙酸乙酯提取物、秀丽节蛇尾乙酸乙酯提取物和海滩植物厚藤石油醚提取物的抗菌活性较其他生物活性物质强。

实施例3：6种植物生物活性物质的抗菌活性比较

准确称取植物样品萝芙木根、茎、叶干品各5g，分别装入34mL萃取池中，萃取池底部提前加装纤维素滤片，以蒸馏水为提取溶剂，设定ASE提取参数(提取压力为10MPa，提取温度为120℃，提取时间10min，循环2次)，水提取液真空冷冻干燥，分别制得萝芙木根、茎、叶的生物活性物质。准确称取适量该生物活性物质用少量蒸馏水溶解并进行倍比稀释，待用。

取无菌96孔培养板，每孔中加入100μL菌悬液和5μL样品溶液，样品溶液包括不同稀释度的头孢他啶和不同稀释度的生物活性物质，模型对照孔加菌悬液和无菌水，空白对照孔加MH肉汤培养基和无菌水。37℃孵育18h后，加入50μL刃天青溶液，反应2h后，用酶标仪测定96孔板中各孔在600nm处的吸光值，通过测定微孔板孔中刃天青的含量，考察孔中药物对实验菌生长的抑制情况。测得头孢他啶MIC值所在孔的OD值为0.544，通过计算其它样品溶液孔中OD₆₀₀为0.544时生物活性物质的浓度，得出不同生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度。采用加速溶剂萃取技术由两种萝芙木根、茎、叶制得的6种生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度(MIC值)见表3。

表3植物生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度(mg/mL)

分析表3结果，6种植物生物活性物质对实验菌生长的最小抑制浓度，可以发现，海南萝芙木根的抗菌活性明显比其他5种生物活性强，对实验菌金黄色葡萄球菌生长的MIC值为11.151mg/mL。

Claims

1.一种快速筛选、评价抗菌生物活性物质的方法，其特征在于它是由下列步骤实现的：

a)待筛选生物活性物质采用加速溶剂萃取技术制备；

d)用酶标仪测定微孔板各孔在600nm处的吸光值；

2.根据权利要求1所述的快速筛选评价抗菌生物活性物质的方法，其特征是，通过以下步骤作进一步的限定：

a)所述步骤a中生物活性物质是采用加速溶剂萃取仪制备，其过程包括准确称取干燥样品5～20g，装入34～100mL萃取池中，溶剂瓶中加入选好的提取溶剂，设定ASE提取参数(提取压力为10～20MPa，提取温度为30～180℃，提取时间5～40min，循环1～3次)，提取液干燥后得生物活性物质，步骤a中所用溶剂可以是水和有机溶剂，对提取液浓缩可以采用减压浓缩干燥、真空冷冻干燥或喷雾干燥；

b)所述步骤b中已知MIC值的抗生素应根据实验菌的特点选择，选择对实验菌的生长具有良好抑制作用且能够通过常规的纸片琼脂扩散法或试管肉汤稀释法测出其对实验菌的最小抑制浓度(MIC值)的抗生素，如头孢他啶，青霉素、万古霉素等，步骤b所选的实验菌包括细菌和真菌，可以是标准菌株、临床分离菌株或耐药菌株，步骤b中将已知抗生素和待筛选的生物活性物质按照一定浓度梯度加入到微孔板中，每孔加1～20μL，然后各孔中加入100μL已稀释好的实验菌菌悬液，该菌悬液由处于对数生长期的实验菌菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准；

c)所述步骤c中孵化条件应根据所选实验菌的最适生长条件设定，然后加入10～50μL 5％的刃天青溶液，该刃天青溶液用无菌水配制；

d)所述步骤d是用酶标仪测定微孔板的各孔在600nm处的吸光值；

3.根据权利要求1或2所述的快速筛选抗菌生物活性物质的方法，其特征是，采用加速溶剂萃取技术快速、高效地制备生物活性物质，并联合微孔板刃天青显色法快速筛选、评价数量庞大的生物活性物质的抗菌活性。

4.根据权利要求3所述采用微孔板刃天青显色法快速筛选、评价数量庞大的生物活性物质的抗菌活性，其特征是，采用酶标仪快速检测含有生物活性物质的菌悬液中刃天青的变化，并汁算出生物活性物质对实验菌的最小抑制浓度(MIC值)，然后对数量庞大的生物活性物质的抗菌活性进行筛选与评价。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的生物活性物质，其特征在于它是用加速溶剂萃取技术由生物样品(如动物、植物、微生物)制得的粗提取物，但在实际操作过程中不应局限于粗提取物，它还可以是由该粗提取物经过常规制备方法获得的单体化合物、活性组分或活性部位。