BR112012019814B1 - método de determinação de um indicador da taxa metabólica de uma população celular - Google Patents

Abstract

método de determinação de um indicador da taxa metabólica de uma população celular descreve-se e reivindica-se um novo sistema para monitorar a taxa metabólica de uma população celular em um processo industrial; a presente pedido de patente de invenção inclui a obtenção de uma amostra da população celular e o início de uma reação entre um componente metabólico da população celular e um biorrepórter; a reação produz um sinal metabólico detectável, que é medido e analisado para determinar uma taxa metabólica da população celular; em configurações preferidas, um controlador é operável para fornecer informações a um usuário e/ou automatizar várias etapas do presente pedido de patente de invenção.

Description

MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR.

CAMPO DE APLICAÇÃO [001] O presente pedido de patente de invenção refere-se, geralmente, a um método para determinar a taxa metabólica de populações celulares. Mais especificamente, o presente pedido de patente de invenção refere-se a um sistema e método para determinar a taxa metabólica de populações celulares por meio de um sinal gerado por uma reação de biorrepórteres. O presente pedido de patente de invenção tem particular relevância a sistemas e métodos que são manuais, semiautomatizados ou totalmente automatizados. HISTÓRICO [002] Os processos biológicos aparecem em muitos cenários industriais diferentes. Por exemplo, processos de fermentação permeiam as indústrias de biocombustíveis, farmacêutica, biotecnologia, alimentos e bebidas. O tratamento de águas residuais é ainda outro cenário industrial onde os processos microbiológicos desempenham um papel importante.

[003] Os principais indicadores de desempenho de bioprocessos industriais, tais como a concentração final do produto, a eficiência do processo e o rendimento, são fortemente influenciados pelas taxas metabólicas das populações celulares em todo o processo industrial (por exemplo, fermentação e tratamento de águas residuais). Na maioria dos bioprocessos industriais, no entanto, somente os parâmetros ambientais, como a temperatura e o pH, são monitorados devido à falta de uma maneira rápida e simples de medir as atividades metabólicas que são diretamente

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 21/75

2/48 responsáveis por criar o produto desejado. Como resultado, a maioria dos processos é operada sem informações adequadas sobre o estado fisiológico de catalisadores biológicos utilizados no processo.

[004] Gerenciar corretamente as populações celulares é, geralmente, reconhecido como sendo um dos componentes mais desafiadores de um processo industrial ou bioprocesso. Práticas de gestão inconsistentes ou imprecisas impactam negativamente a consistência e a eficiência do processo. No entanto, o método padrão de análise da população celular por métodos como a microscopia de luz e a coloração para determinação da viabilidade apresenta inúmeras dificuldades e limitações em um cenário de produção industrial. Essas dificuldades incluem a variabilidade inerente dos resultados coletados por pessoas diferentes devido a fatores como a natureza subjetiva de discriminar as células a partir de partículas nãovivas e classificar as células como vivas ou mo r t a s com base em uma mancha colorida aplicada às células.

Ainda outra limitação é que o método de microscopia que tem apenas dois níveis de classificação das células: vivas ou mortas. Esse sistema binário falha em capturar a realidade biológica de que as células existem ao longo de. uma escala contínua de vivas a mortas e sua posição exata ao longo desta continuidade é determinada por uma infinidade de fatores.

[005]

Inúmeros exemplos de métodos para quantificar as concentrações celulares podem ser encontrados na técnica anterior.

Por exemplo, as Patentes dos EUA N^os

5.445.946 e

7.527.924 revelam métodos e/ou dispositivos para

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 22/75

3/48 quantificação celular utilizando a fluorescência. A Publicação do Pedido de Patente dos EUA 2004/0157211 revela métodos e/ou dispositivos para quantificação celular utilizando a microscopia digital. A maior desvantagem dessas invenções é que elas fornecem apenas meios alternativos de quantificação de populações celulares, e não um meio de medir as taxas metabólicas de populações celulares. Para medir taxas metabólicas, historicamente tem sido necessário utilizar um método de quantificar a produção de dióxido de carbono e/ou consumo de oxigênio pelas populações celulares utilizando instrumentos como o respirômetro, manômetro ou fermontagraph, (Vide, por exemplo, Water Sci Technol. 2007;55(10):l-9. “Avaliação respirométrica das características de biodegradação das armadilhas científicas de águas residuais). Esses instrumentos, entretanto, são difíceis de serem operados e mantidos, parcialmente devido às complexidades da medição de gases, que são fortemente influenciados pela temperatura, pressão e interações com outras matérias.

[006] Assim, existe uma necessidade constante de métodos melhorados de análise de populações celulares em cenários industriais. Em particular, há uma necessidade de métodos e sistemas capazes de determinar as taxas metabólicas das populações celulares, em oposição à concentração das populações celulares, reduzindo, também, a variabilidade inerente e as dificuldades associadas com as práticas atuais de gestão de populações celulares em processos industriais.

RESUMO

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 23/75

4/48 [007] O presente pedido de patente de invenção fornece, assim, um método para medir a taxa metabólica de uma população celular. Em um aspecto, o método compreende fornecer um controlador operável para rastrear as alterações de um parâmetro. Em uma configuração, o parâmetro é o peso e o controlador está em comunicação com um dispositivo gravimétrico e é operável para rastrear os pesos da amostra, o biorrepórter, e/ou os aditivos e/ou alterações no peso da matéria, mantida dentro de um recipiente, causadas pela adição dos mesmos. Em outra configuração, o parâmetro é o volume e o controlador está em comunicação com um dispositivo gravimétrico e é operável para rastrear os volumes da amostra, o biorrepórter, e/ou os aditivos e/ou alterações no volume da matéria dentro do recipiente causadas pela adição dos mesmos. Um detector de sinal também está em comunicação com o controlador e é operável para detectar um sinal metabólico da população celular. O método utiliza, ainda, um recipiente capaz de manter ou estar associado com pelo menos os seguintes itens: (i) uma amostra da população celular ou compreendendo a população celular, (ii) um biorrepórter que seja capaz de direta ou indiretamente gerar o sinal de metabólico, e (iii) o detector de sinal. A amostra e o biorrepórter são combinados no recipiente adicionando ao recipiente, em qualquer ordem, inclusive em fases, a amostra e o biorrepórter. Um ou mais aditivos também podem ser adicionados ao recipiente a qualquer momento durante a implementação do método. O método também inclui opcionalmente o acompanhamento de alterações no parâmetro a qualquer momento durante a implementação do método e, opcionalmente, o registro essas alterações. O

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 24/75

5/48 sinal metabólico é detectado com o detector de sinal e, opcionalmente, registrado, bem como a taxa metabólica sendo determinada e, opcionalmente, registrada com base no sinal metabólico detectado. Qualquer acompanhamento ou registro do parâmetro, do sinal metabólico e/ou da taxa metabólica pode ocorrer uma ou mais vezes (por exemplo, em um ou mais pontos de tempo). Alternativamente, esse acompanhamento ou registro pode ocorrer continuamente.

[008] Em outro aspecto, o presente pedido de patente de invenção fornece um sistema operável para determinar uma taxa metabólica de uma população celular. O sistema compreende (i) um controlador; (ii) um dispositivo gravimétrico opcional em comunicação com o controlador e/ou um dispositivo volumétrico opcional em comunicação com o controlador; (iii) um meio de coletar uma amostra da população celular ou contendo a população celular; (iv) um biorrepórter capaz de reagir com um componente metabólico da população celular na amostra para gerar um sinal metabólico; (v) um detector de sinal operável para detectar o sinal metabólico e em comunicação com o controlador; (vi) um recipiente capaz de manter ou estar associado com pelo menos os seguintes itens: (a) a amostra de população celular ou compreendendo a população celular, (b) o biorrepórter, e (c) o detector de sinal; e (vii) uma interface do usuário em comunicação com o controlador.

[009] É uma vantagem do presente pedido de patente de invenção fornecer um sistema eficiente e um método para medir a taxa metabólica de uma população celular em um processo industrial.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 25/75

6/48

É outra vantagem do presente pedido de patente de totalmente invenção fornecer um sistema semiautomatizado ou automatizado e um método para analisar a taxa metabólica de uma população celular em um processo industrial.

Uma vantagem adicional do presente pedido de patente de invenção é fornecer um sistema e método não sujeitos a erros de preparação da amostra devido aos gases e material particulado carregados, ou outros fatores presentes na amostra, que geram diluições volumétricas imprecisas.

Outra vantagem do presente pedido de patente de invenção é oferecer melhoras na preparação da amostra na forma de um método automatizado e de autocorreção, implementado em uma interface do usuário que elimina a variabilidade do operador nas práticas de preparação da amostra.

uma vantagem adicional do presente pedido de patente de invenção oferecer um sistema e método para a determinação, por meio de uma reação química com um biorrepórter, uma taxa metabólica de uma população celular em um processo industrial.

Uma vantagem adicional do presente pedido de patente de invenção é determinar taxas metabólicas de populações celulares em um curto período de tempo, como menos de dez minutos e, de preferência, menos de três minutos.

[015]

Outra vantagem do presente pedido de patente de invenção é oferecer um sistema e método precisos de determinação de uma taxa metabólica de uma população

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 26/75

7/48 celular a partir de um processo industrial, onde o sistema e o método são resistentes à variação de temperatura, turbidez e sinais de fundo na amostra medida.

[016] Outra vantagem do presente pedido de patente de invenção é oferecer um sistema e método que sejam capazes de transmitir os resultados da taxa metabólica em tempo real para outros sistemas de informação dentro de uma planta de processamento industrial, como bases de dados e sistemas de controle.

[017] Ainda outra vantagem do presente pedido de patente de invenção é oferecer um sistema e método com precisão adequada e uma alta relação de sinal-ruído para controlar, diagnosticar, ajustar, e/ou otimizar os processos industriais ou bioprocessos com base nas informações da taxa metabólica.

[018] Outra vantagem do presente pedido de patente de invenção é medir as taxas metabólicas com um baixo nível de erro aleatório, por exemplo, as medições devem, preferivelmente, ter um coeficiente de variação menor do que 10% e, mais preferivelmente, menor do que 5%.

[019] Outra vantagem é oferecer um sistema e método de medição das taxas metabólicas que sejam rápidos e paralelos de forma a atender às necessidades dos produtores industriais com muitos processos biológicos diferentes e simultâneos a serem controlados.

[020] É ainda outra vantagem do presente pedido de patente de invenção oferecer um sistema e método para detectar a taxa metabólica de uma população celular sem quantificar o número de células da população, direta ou indiretamente.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 27/75

8/48 [021] As informações acima descreveram muito amplamente os recursos e vantagens técnicas do presente pedido de patente de invenção para que a descrição detalhada do presente pedido de patente de invenção que se segue possa ser mais bem compreendida. Recursos e vantagens adicionais do presente pedido de patente de invenção serão descritos adiante para formar o objeto das reivindicações do presente pedido de patente de invenção. Aqueles com habilidade na técnica devem apreciar que a concepção e as configurações específicas reveladas possam ser facilmente utilizadas como base para modificar ou desenvolver outras configurações para realizar os mesmos propósitos do presente pedido de patente de invenção. Aqueles com habilidade na técnica também devem perceber que essas configurações equivalentes não fogem do espírito e do escopo do presente pedido de patente de invenção conforme estabelecido nas reivindicações anexas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [022] a figura 1 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo uma estação de tratamento de líquido manual e descrevendo os vários componentes presentes no sistema do presente pedido de patente de invenção e utilizados na implementação do método do presente pedido de patente de invenção;

[023] a figura 2 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo um controlador integrado e um dispositivo de pesagem com um conjunto de entrega de líquidos automatizado;

[024] a figura 3 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo uma unidade independente com coleta de amostras, manuseio de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 28/75

9/48

amostras, entrega	de	líquidos e	análise	de características
automatizados;
[025]	a	figura 4	ilustra	o desempenho	da
fermentação que	foi	monitorado	pelo	acompanhamento	da

formação cumulativa do produto (dióxido de carbono) ao longo do tempo, onde a taxa de formação do produto em qualquer

ponto durante a fermentação do	lote pode	ser	obtida pela
inclinação da curva	cumulativa	de	produto;
	[026]	a figura 5		ilustra	uma	configuração
do	presente pedido	de patente	de	invenção	onde	o indicador
de	taxa metabólica	e a taxa	de produção de	dióxido de
carbono estão fortemente correlacionados;
	[027]	a figura 6		ilustra	uma	configuração
do	presente pedido	de patente	de	invenção	que	efetivamente

produziu resultados consistentes entre diferentes operadores, detectores de sinais e processos de fermentação do lote;

[028] a figura 7 ilustra o desempenho da fermentação que foi monitorado pelo acompanhamento da formação cumulativa do produto (etanol) ao longo do tempo onde a taxa da formação do produto em qualquer ponto durante a fermentação do lote pode ser obtida pela inclinação da curva cumulativa do produto;

[029] a Figura 8 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção onde o indicador de taxa metabólica e a taxa de produção de etanol estão fortemente correlacionados;

[030] a figura 9 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção onde o indicador de taxa metabólica consistentemente previu a diminuição da

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 29/75

10/48 taxa metabólica durante a armazenagem a frio de uma população celular;

[031] a figura 10 mostra o efeito do uso de um algoritmo de correção de temperatura para corrigir eficazmente as taxas metabólicas; e [032] a figura 11 ilustra melhoras nas determinações da taxa metabólica com turbidez corrigida em comparação com as taxas metabólicas determinadas a partir de sinais metabólicos que não tinham sido corrigidos quanto à influência da turbidez.

DESCRIÇÃO DETALHADA [033] O presente pedido de patente de invenção revelado e reivindicado é um sistema robusto e preciso, e um método para a detecção e o monitoramento das taxas metabólicas de populações celulares em processos industriais.

Em comparação com os métodos praticados atualmente, o sistema e o método revelados melhoram a técnica de várias maneiras, conforme detalhado aqui. O resultado final das melhorias cumulativas é uma solução para determinações da taxa metabólica de uma população celular que é precisa e robusta, independentemente da técnica do operador e das propriedades da amostra, como turbidez, temperatura e sinal de fundo.

[034] O presente pedido de patente de invenção tem aplicação em qualquer cenário industrial onde as populações celulares são encontradas. Cenários industriais representativos tendo populações celulares tratáveis ao presente pedido de patente de invenção incluem a produção de biocombustíveis, vinhos, cervejas e bebidas alcoólicas; a preparação do fermento ativo e inativo para uso nas

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 30/75

11/48 indústrias de bebidas, combustíveis ou de panificação; produção de suplementos nutricionais, probióticos, extratos de levedura, antibióticos, proteínas recombinantes, etanol ou qualquer outro produto industrial de levedura; sistemas de tratamento de águas residuais; sistemas de crescimento das algas; sistemas de crescimento bacteriano; sistemas de processamento térmico: sistemas de resfriamento de água; lama ativada da industria de papel e celulose; outros sistemas; e qualquer combinação dos anteriores.

[035] Tipos de células exemplares incluem bactérias, archaea, protistas, animais microscópicos, fungos, plantas microscópicas, células animais e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas configurações, o presente pedido de patente de invenção também é aplicável a populações de extremófilos. Exemplos não limitantes de certos tipos de células são apresentados abaixo.

[036] As bactérias representadas incluem (finalidade industrial apresentada entre parênteses) Xanthamonas campestris (goma xantana); Pseudomonas elodea (goma gelana (E418)); Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus (exopolissacarídeo); Lactococcus lactis var. cremoris (exopolissacarídeo); Lactobacillus helveticus (exopolissacarídeo); Lactobacillus sake (exopolissacarídeo); Rhodopseudomonas capsulate (proteína de célula única); Corynebacterium glutamicum (L-lisina); Laminaria digitata (alginato); Ascophyllum nodosum (alginato); Fucus serratus (alginato); Cyamopsis tetragonolobus (goma guar); Ceratonia sliqua (goma de feijão de locustídeo (alfarroba)); Chondrus crispus (caragina); Gigartina stellata (caragina); Hypea muciformis (caragina); Geotrichum candidum (proteína de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 31/75

12/48 célula única); Zymomonas mobilis (etanol); Leuconostoc oenos (fermentação maloláctica); Clostridium spp. (vários); Escherichia coli (vários); outras bactérias; espécies e tipos celulares relacionados; semelhantes; e qualquer combinação dos anteriores.

[037] Leveduras representativas incluem (finalidade industrial apresentada entre parênteses) Saccharomyces cerevisiae (produção de cerveja, etanol, fabricação de vinho); Saccharomyces fructuum (panificação);

Saccharomyces inusitatus (panificação);

Saccharomyces exigus (panificação);

Candida krusei (panificação);

Candida steliata (panificação);

Candida milleri (panificação);

Candida utilis (panificação);

Torulopsis Candida (panificação);

Torulaspora delbrueckii (panificação);

Zygosaccharomyces rouxii (molho de soja, vinagre);

Zygosaccharomyces bailii (metabolismo ácido tartárico);

Kluyveromyces thermotolerans (massa congelada); Torulaspora pretoriensis (produção de cerveja); Schizosaccharomyces pombe (produção de bebidas fermentadas); Schizosaccharomyces malidevorans (produção de bebidas fermentadas); Aspergillus oryzae (saquê); Saccharomyces sake (saquê); Saccharomyces kefir (kefir); Candida kefyr (kefir); outras leveduras; espécies e tipos celulares relacionados; semelhantes; e qualquer combinação dos anteriores.

[038] Fungos representativos incluem (finalidade industrial apresentada entre parênteses) Aspergillus niger (enzimas, ácido cítrico, ácido glucônico); Sclerotium rolfsii (proteína de célula única); Polyporus sp. (proteína de célula única); Trichoderma sp. (proteína de célula única); Scytalidium acidophilum (proteína de célula

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 32/75

13/48 única); Aureobasidium pullalans (pululana); Sclerotium glucanicum (escleroglucana); outros fungos; espécies e tipos celulares relacionados; semelhantes; e qualquer combinação dos anteriores.

[039] Algas representativas incluem (finalidade industrial apresentada entre parênteses) Chlorella spec. (proteína de célula única); Spirulina spec. (proteína de célula única, nutracêuticos); outras algas; espécies e tipos celulares relacionados; semelhantes; e qualquer combinação dos anteriores.

[040] Em uma configuração preferida, o presente pedido de patente de invenção inclui um controlador operável para receber e processar informações e fornecer instruções a um usuário e/ou a vários componentes do sistema aqui descrito. O termo “controlador refere-se a um dispositivo eletrônico com componentes como processador, dispositivo de memória, meio de armazenamento digital, tubo de raios catódicos, mostrador de cristal líquido, mostrador de plasma, tela sensível ao toque ou outro monitor, e/ou outros componentes. Em uma configuração, o controlador inclui uma interface interativa que orienta o usuário, fornece informações ao usuário, ou fornece ao usuário informações sobre qualquer parte do método do presente pedido de patente de invenção. Essas informações podem incluir, por exemplo, a construção de modelos de calibração, coleta de dados, colocação da amostra, colocação do biorrepórter e de aditivos, gerenciamento de conjuntos de dados resultantes, etc.

[041] O controlador é, de preferência, operável para integração e/ou comunicação com um ou mais

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 33/75

14/48 circuitos integrados específicos da configuração, programas, instruções executáveis pelo computador ou algoritmos, um ou mais dispositivos com fio, dispositivos sem fio, e/ou um ou mais dispositivos mecânicos como controladores de líquidos, braços hidráulicos, servos ou outros dispositivos. Além disso, o controlador é operável para integrar loops de feedback, feed-forward ou preditivos resultantes das determinações da taxa metabólica do presente pedido de patente de invenção. Algumas ou todas as funções do sistema controlador podem servidor de rede, local, rede de área estar em um local para comunicação em ampla, rede sem fio, central, como um uma rede de área extranet, internet, ligações de microondas, ligações de infravermelho, outras semelhantes, e quaisquer combinações dessas ligações ou outras adequadas. Além disso, outros componentes, como um condicionador de sinal ou monitor de sistema, podem ser incluídos para facilitar a transmissão de sinal e algoritmos de processamento de sinal.

[042] Em uma configuração, o controlador é operável para implementar o método do presente pedido de patente de invenção de maneira semiautomatizada ou totalmente automatizada. Em outra configuração, o controlador é operável para implementar o método de maneira manual ou semimanual.

Exemplos destas variações do presente pedido de patente de invenção são apresentados abaixo, em referência às figuras.

[043] Um conjunto de dados coletado a partir de uma população celular em um processo industrial, por exemplo, pode incluir variáveis ou parâmetros do sistema, como o sinal do biorrepórter, o potencial de redução da

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 34/75

15/48 oxidação, pH, níveis de determinadas substâncias químicas ou íons (por exemplo, determinados empiricamente, automaticamente, fluorescentemente, eletroquimicamente, colorimetricamente, medidos diretamente, calculados, etc.), temperatura, turbidez, pressão, taxa de fluxo do processo, sólidos dissolvidos ou suspensos, etc.

Esses parâmetros do sistema são medidos normalmente com qualquer tipo de equipamento de medição/detecção/captura de dados adequado, como sensores de pH, analisadores de íons, sensores de temperatura, termopares, sensores de pressão, sondas de corrosão, e/ou qualquer método ou dispositivo adequado.

Dispositivos capazes de detectar ou perceber sinais colorimétricos, refratométricos, luminométricos, e/ou fluorométricos são de utilidade particular para o presente pedido de patente de invenção.

Esse equipamento de captura de dados está, de preferência, em comunicação com o controlador e, de acordo com configurações alternativas, pode ter funções avançadas (incluindo qualquer parte dos algoritmos de controle descritos neste documento) transmitidas pelo controlador.

dos parâmetros ou químicas, alarmes realizada rede com

A transmissão de dados sinais medidos para um utilizando fio ou sem de qualquer um usuário, bombas ou outros componentes do sistema é qualquer dispositivo adequado, como uma fio, cabo, linha de assinante digital, internet, etc. Qualquer padrão de interface apropriado, como uma interface de ethernet, interface sem fio (por exemplo, o IEEE 802.1 la/b/g/n, 802.16, Bluetooth, óptica, infravermelha, outra radiofrequência, qualquer outro método de transmissão de dados sem fio adequado e quaisquer

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 35/75

16/48 combinações dos itens anteriores), barramento serial universal, combinações rede telefônica, sistemas semelhantes, e dessas interfaces/conexões que podem ser utilizadas. Conforme utilizado aqui, o termo “rede abrange todos esses métodos de transmissão de dados. Qualquer um dos componentes, dispositivos, sensores, etc. aqui descritos podem ser conectados uns aos outros e/ou ao controlador utilizando a interface ou conexão descrita acima ou outra apropriada.

[045] Em uma configuração, a informação (coletivamente referindo-se a todas as entradas ou saídas geradas pelo método do presente pedido de patente de invenção) é recebida do sistema e arquivada. Em outra configuração, essa informação é processada de acordo com um calendário ou agenda. Em outra configuração, essa informação é imediatamente processada em tempo real/substancialmente em tempo real. Essa recepção em tempo real também pode incluir, por exemplo, a “transmissão de dados por meio de uma rede computadorizada.

[046] Com referência agora às figuras, deveser apreciar que as características estabelecidas em relação a quaisquer das configurações descritas nas figuras aqui podem ser aplicadas e implementadas em relação a quaisquer das outras configurações descritas em outras figuras ou aqui. A FIG. 1 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo uma estação de tratamento de líquido manual e descrevendo os vários componentes presentes no sistema do presente pedido de patente de invenção e utilizados na implementação do método do presente pedido de patente de invenção. Para obter medidas precisas,

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 36/75

17/48 o presente pedido de patente de invenção apresenta um método de preparação de amostra para medição combinando a amostra e os reagentes químicos necessários em um recipiente 130 no dispositivo de pesagem

120 que está em comunicação com controlador

110. O controlador 110 está ligado ao dispositivo de pesagem

120 e ao detector de sinal 140 por meio das ligações de comunicação115a e 115b. Em uma configuração, o controlador

110 é operável para fornecer um aviso a um usuário para colocar o recipiente 130 no dispositivo de pesagem 120.

Esse aviso pode ocorrer na forma de um aviso visível e/ou sonoro que o usuário segue. Esses avisos, de acordo com uma configuração, incluem uma determinada ordem de adição no recipiente 130.

Por exemplo, os avisos podem sugerir valores de peso alvo para cada componente com base em eventos anteriores. O dispositivo de pesagem 120, então, transmite ao controlador 110 quaisquer alterações de peso devido à adição de líquidos ao recipiente 130. O controlador 110 é operável, ainda, para fornecer um aviso para o usuário adicionar uma amostra da população celular coletada de um processo industrial. A amostra pode ser colocada no recipiente 130 utilizando qualquer meio adequado de transferência. Por exemplo, um método comum de transferência de uma amostra de líquido é pelo uso de uma pipeta ou de outro dispositivo operado por sucção.

[047] O termo “recipiente conforme utilizado nas figuras e aqui se refere a qualquer recipiente capaz de conter um volume de líquido e de ser pesado em um dispositivo de pesagem. Em algumas configurações, o recipiente ainda inclui um detector de sinal, um meio de controlar a temperatura do líquido mantido dentro do

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 37/75

18/48 recipiente, e/ou meios para agitar/misturar os líquidos mantidos dentro do recipiente.

Deve-se apreciar que quaisquer dos recipientes ou câmaras de líquido, recipientes, dispensadores, aqui descritos podem incluir um detector de sinal um mecanismo de controle de temperatura e/ou um mecanismo de agitação/mistura.

Durante a transferência da amostra para o recipiente 130, o dispositivo de pesagem 120 é operável para comunicar os dados do peso ao controlador

110 para acompanhar as alterações no peso do recipiente 130 devido à adição da amostra. Esse continuamente ou em um acompanhamento de peso pode ocorrer ou mais pontos de tempo durante a transferência da amostra. O controlador 110 é operável, ainda, para alertar o usuário para inserir o detector de sinal 140 no recipiente 130. Em outra configuração, o detector de sinal 140 é introduzido no recipiente 130 antes ou a qualquer momento durante a transferência da amostra para o recipiente 130. Em outra configuração, o detector de sinal 140 é colocado na parte externa do recipiente 130. Em outra configuração, o detector de sinal 140 é parte integrante do recipiente 130. Controlador de 110 é operável, ainda, para fornecer um aviso, por exemplo, visual ou sonoro, para que o usuário transfira o aditivo 150 (por exemplo, agente tamponante, agente modificador de pH, catalisador, coenzima, mineral, cossubstrato, e/ou qualquer outro aditivo necessário em conjunto com o biorrepórter 160) e/ou o biorrepórter 160. O dispositivo de pesagem 120 continua a comunicar os dados de alteração de peso para o controlador 110.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 38/75

19/48

Em algum ponto durante a combinação da amostra com o aditivo

150 e/ou com o biorrepórter 160, ocorre a reação que gera um sinal metabólico que é detectável pelo detector de sinal

140.

O sinal metabólico pode assumir a forma de, por exemplo, um sinal colorimétrico, refratométrico, luminométrico, fluorométrico ou qualquer combinação deles.

Para detectar o sinal, qualquer detector de sinal adequado

140 pode ser utilizado.

[050]

O termo “detector de sinal refere-se a qualquer dispositivo adequado capaz de detectar atividade metabólica, conforme descrito neste um sinal de documento.

Além disso, o detector de sinal pode ter a capacidade de detectar mais de um tipo de sinal. Por exemplo, um detector de sinal particular pode ter a capacidade de detectar mais de um comprimento de onda de um sinal colorimétrico, refratométrico, espectrofotométrico, luminométrico e/ou fluorométrico, ou pode ter a capacidade de detectar uma combinação desses sinais. Em outro exemplo, o detector de sinal pode ser capaz de detectar qualquer combinação dos sinais anteriores e, também, uma detecção e/ou medição de turbidez e/ou temperatura. Em outra configuração, o termo “detector de sinal significa uma combinação de uma pluralidade de detectores de sinal. Por exemplo, um detector de sinal pode compreender um fluorômetro e outro pode compreender um medidor de turbidez. Deve-se apreciar que o termo “detector de sinal pode compreender qualquer combinação dos detectores descritos. Além disso, o detector de sinal pode ser um componente separado ou pode ser combinado com, por exemplo, o recipiente e/ou dispositivo de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 39/75

20/48 medição como uma unidade integrada. Embora qualquer detector de sinal adequado possa ser utilizado, detectores de sinal fluorométrico exemplares são revelados nas Patentes dos EUA N^os 6.369.894, “Fluorômetro Modular; 6.670.617, “Fluorômetro de Espelho; e 7.095.500, “Fluorômetro de Célula Aberta de Ponta Intercambiável.

[051] A figura 2 ilustra uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo um conjunto integrado de controlador e dispositivo de pesagem 200 com um conjunto de bomba automatizado ou semiautomatizado 250. Na presente configuração, o controlador 210 é integrado com o dispositivo de pesagem 220 e inclui uma ligação de comunicação interna (não mostrada) para comunicação entre o controlador 210, o dispositivo de pesagem 220, e outros componentes do sistema. Conforme descrito acima em relação à figura 1 para o controlador 110, o controlador 210 é operável para fornecer avisos ou outros sinais para um usuário executar várias etapas do método do presente pedido de patente de invenção. Conforme exposto acima, o controlador 210 fornece um aviso visual ou sonoro para que um usuário coloque o recipiente 230 no dispositivo de

medição 220.	Alternativamente,	um	braço mecânico ou outro
dispositivo	(não	mostrado	) pode	col	ocar o recipiente 230	no
dispositivo	de	medição	220.	Em	outra alternativa,	o
dispositivo	de	medição	220 e	o	recipiente 230 são	uma

unidade integrada.

[052] A ligação de comunicação 215 envia sinais do detector de sinal 240 para o controlador 210. O detector de sinal 240 pode ser introduzido ou associado com o recipiente 230 a qualquer momento durante a adição da

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 40/75

21/48 combinação de componentes descritos ao recipiente 230. O dispositivo de medição 220, então, registra quaisquer alterações de peso devido à adição de líquidos ao recipiente 230. O controlador 210 é, ainda, operável para fornecer um aviso para que o usuário adicione uma amostra da população celular coletada de um processo industrial. Em outra configuração, um braço mecânico ou outro dispositivo auxilia na adição da amostra ao recipiente 230. Outros métodos comuns de transferência de uma amostra líquida, por exemplo, incluem o uso de uma pipeta ou de outro dispositivo operado por sucção. Durante a transferência da amostra para o recipiente de 230, o dispositivo de medição 220 é operável para comunicar dados de peso ao controlador 210 para acompanhar as alterações de peso do recipiente 230 devido a essa adição de amostra. Esse acompanhamento do peso pode ocorrer durante continuamente ou em um ou mais pontos de tempo a transferência da amostra. O controlador 210 é, ainda, operável para alertar o usuário para inserir o detector de sinal 240 no recipiente

230. Em outra configuração, o detector de sinal 240 é introduzido no recipiente 230 antes ou qualquer momento durante a transferência da amostra para o recipiente

230 seja manualmente pelo usuário ou automaticamente por meio de um braço mecânico ou de outro dispositivo (não mostrado). Em outra configuração, o detector de sinal 240 é colocado fora do recipiente 230.

Ainda em outra configuração, o detector de sinal 240 é parte integrante do recipiente 230.

[053]

O controlador 210 ainda é operável para fornecer um aviso, por exemplo, visual ou sonoro, para que o usuário acione a bomba 280 para transferir um aditivo (por

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 41/75

22/48 exemplo, agente tamponante, agente modificador de pH, catalisador, coenzima ou qualquer outro aditivo necessário em conjunto com o biorrepórter) do compartimento de aditivos 260 e/ou do compartimento de biorrepórteres 270 para entrega no recipiente 230 por meio dos bicos dispensadores 285a e 285b. Em outra configuração, um sistema automatizado, compreendendo um braço mecânico ou outro dispositivo aciona e/ou executa a entrega do aditivo e/ou do biorrepórter ao recipiente 230. Os tamanhos do compartimento de aditivos 260 e do compartimento de biorrepórteres 270 podem variar conforme necessário para uma determinada configuração. Em outras configurações, compartimentos de líquidos adicionais para componentes adicionais ou soluções de backup de aditivos ou biorrepórteres também podem ser incluídos. As tampas 270a e 270b destinam-se ao reabastecimento de quaisquer soluções.

[054] Em configurações adicionais, o conjunto da bomba 250 é totalmente manual, semiautomatizado ou totalmente automatizado. O conjunto da bomba 250 é, de acordo com uma configuração, totalmente manual onde um usuário inicia a ação de bombeamento em resposta aos avisos fornecidos pelo controlador 210. Em outra configuração, o conjunto 250 é semiautomatizado onde um usuário executa determinadas funções com base nos avisos fornecidas pelo controlador 210 e outras funções são automatizadas. Em uma configuração adicional, o conjunto 250 é totalmente automatizado e responde às instruções enviadas pelo controlador 210 para dispensar soluções no recipiente 230.

[055] Na figura 3, uma configuração do presente pedido de patente de invenção incluindo uma unidade

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 42/75

23/48 independente, tendo características de tratamento e análise de amostras é ilustrada e apresentada como a unidade móvel 300. Quaisquer das funções descritas abaixo para a unidade móvel 300 podem ser totalmente automatizadas ou semiautomatizadas. Diversos conduítes e outros canais para o fluxo de amostras, biorrepórteres, soluções, e substâncias semelhantes são mostrados em relação à unidade móvel 300. Deve-se apreciar que bombas, válvulas ou conduítes adicionais podem ser incluídos na unidade móvel 300 conforme o necessário para qualquer configuração particular. Mostrase o controlador 310 que, em comunicação com diversos outros componentes da unidade móvel 300, é operável para enviar instruções para realizar as várias funções descritas. O dispositivo de pesagem 320, o recipiente 330, e o detector de sinal 340 são mostrados como um componente essencialmente integrado. Deve-se apreciar que esses componentes podem ou não ser permanentemente afixados uns aos outros. Nessa configuração, o detector de sinal 340 é mostrado instalado dentro do recipiente 330. Em outras configurações, o detector de sinal 340 é instalado fora do recipiente 330.

[056]

A porta de coleta de amostra 303 pode ser diretamente conectada ou conectada por meio de uma linha de amostra (não mostrada) ao tanque do processo

302. O tanque do processo 302 pode ser um tanque de processo principal, um tanque de processo secundário ou qualquer linha de acesso apropriada (por exemplo, uma corrente lateral) para uma população celular em um processo industrial. Em uma configuração, a porta de coleta de amostra 303 inclui um mecanismo para criar um selo para evitar vazamentos antes, durante e depois do estabelecimento

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 43/75

24/48 de uma conexão com a linha de amostra 306 por meio da articulação 304. Em uma configuração, a articulação 304 inclui um meio para criar um canal de comunicação fluida entre a porta de coleta de amostra 303 e a linha de amostra 306 a fim de permitir que uma amostra da população celular entre na linha de amostra 306. A articulação 304 também pode incluir um meio de comunicação eletrônica para permitir a comunicação entre a porta de coleta 303 e a linha de amostra 306. A comunicação eletrônica pode ser realizada por quaisquer meios adequados, incluindo, por exemplo, almofadas condutoras na superfície de encaixe dos componentes, um ou mais conectores elétricos, dispositivos semelhantes, e suas combinações. Quando é feita uma conexão entre a porta de coleta de amostra e a linha de amostra 306, o controlador 310 é operável para enviar instruções para acionar uma amostra da população celular para ser coletada e enviada para o recipiente 330 através da linha de amostra 306 e da válvula 308.

[057] Em uma configuração, a unidade móvel 300 inclui os recipientes de reagentes 352, 354 e 356. Embora três recipientes de reagentes sejam mostrados na presente configuração, deve-se apreciar que qualquer número de recipientes de reagente pode ser utilizado. Cada um dos recipientes de reagentes pode ter sua própria válvula ou ter uma válvula combinada que está em comunicação fluida com mais de um dos recipientes de reagentes. Essa válvula combinada é mostrada como válvula 312 na FIG. 3. Os recipientes de reagentes podem abrigar qualquer componente de um biorrepórter e/ou aditivo conforme descrito neste documento. Os conduítes 318a e 318b proporcionam um

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 44/75

25/48 mecanismo para que as amostras, biorrepórteres, aditivos, etc. descarregados sejam descartados. Dependendo da configuração específica, qualquer uma das válvulas mostradas (por exemplo, 308, 312, 314) e outras válvulas que possam fazer parte da unidade móvel 300 atuam para fazer com que os líquidos viajem através dos conduítes 318a e 318b para o recipiente de resíduos 360. Outros conduítes também podem estar presentes na unidade móvel 300 conforme necessário para uma determinada configuração.

[058] Em uma configuração, a unidade móvel 300 inclui, ainda, o recipiente de solução de lavagem 362. Na FIG. 3, a válvula 314 é mostrada como operável para fazer com que a solução de lavagem contida no recipiente de solução de lavagem 362 seja extraída por meio do conduíte 318c. Conforme explicado acima em relação aos recipientes de reagentes, deve-se apreciar que qualquer número de recipientes de solução de lavagem pode ser utilizado. Além disso, cada um dos recipientes de solução de lavagem pode ter sua própria válvula ou ter uma válvula combinada que esteja em comunicação fluida com mais de um dos outros recipientes de solução de lavagem, conforme necessário para uma determinada configuração. As portas 364a e 364b estão em comunicação fluida com o recipiente de solução de lavagem 362 e com o recipiente de resíduos 360, respectivamente. A posição e o número dessas portas é exemplar e deve-se perceber que qualquer número de portas e o posicionamento das portas pode ser empregado conforme o necessário para uma determinada configuração. Soluções de lavagem representativas incluem água, soluções de detergentes suaves, ácidos fracos, substâncias semelhantes, outras

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 45/75

26/48 soluções conforme o necessário e qualquer combinação dessas soluções.

[059] Em uma configuração, a unidade móvel 300 pode ser conectada a um carrinho 370 tendo rodas 372a e 372b. O carrinho 370 pode ser, por exemplo, permanentemente moldado na ou afixado à unidade móvel 300 ou pode ser um componente separado no qual os componentes restantes da unidade móvel 300 são colocados para proporcionar mobilidade. Em uma configuração, a unidade móvel 300 compreende, ainda, um sistema de controle de navegação (não mostrado) operável para fazer com que a unidade móvel 300 se movimente automaticamente ou semiautomaticamente para vários locais em uma instalação industrial e analise amostras de

populações	celulares naquele	local. Esses	dispositivos
robóticos	móveis autônomos são	revelados,	por	exemplo,	na
Patente dos EUA No 7.024.278,	“Sistema	de	Controle	de
Navegação	para um Dispositivo	Robótico	e	ensinados	em

Guilherme,

N. D. e C. K. Avinash (2002), “Visão para

Navegação de Robôs Móveis:

Uma Pesquisa, IEEE Trans.

Pattern Anal. Mach. Intell. 24(2): 237-267.

[060] A ordem de adição de qualquer uma das soluções descritas (por exemplo, amostra de população celular, biorrepórter, aditivo) pode ocorrer em qualquer ordem conforme determinada pelo usuário e/ou controlador conforme aplicável a um determinado cenário industrial. Por exemplo, a amostra da população celular pode ser adicionada primeiramente, seguida pelo biorrepórter e quaisquer aditivos necessários, ou o biorrepórter/aditivos podem ser adicionados primeiro, seguidos pela amostra da população celular.

Conforme descrito neste documento, alterações no peso do

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 46/75

27/48 recipiente ao qual esses componentes são adicionados, assim como o sinal metabólico gerado podem ser acompanhados e/ou registrados em tempo real ou substancialmente em tempo real por meio da comunicação com o controlador.

[061] Embora o uso de um dispositivo de pesagem seja o método preferido de preparação de amostras, outros métodos adequados de preparação da amostra que não requerem um dispositivo de pesagem são previstos. Em uma configuração, a amostra pode ser preparada volumetricamente. Por exemplo, a amostra do processo, o biorrepórter, e qualquer outro aditivo necessário podem ser adicionados manualmente ao recipiente por meio de uma colher, uma pipeta de transferência, um conta-gotas de medicamentos, contando as gotas ou despejando. O recipiente também pode apresentar graduações ou zonas marcadas para indicar o volume aproximado pretendido para diferentes componentes. O recipiente pode ser um item comum de laboratório como um cilindro graduado, um béquer ou um tubo com linhas.

[062]

Em outra configuração, a amostra é preparada, no todo ou em parte, pela ação de bombeamento mecânico (manual, semiautomatizado ou totalmente automatizado). Uma ou várias bombas podem ser empregadas, e cada uma pode ser designada para bombear em diferentes taxas e/ou frequências para atender às proporções desejadas dos diferentes componentes na mistura final. A ação de bombeamento pode ser controlada por um programa que liga e desliga as bombas em intervalos precisamente programados a fim de atingir proporções precisas dos diferentes componentes. O controlador também pode receber feedback por meio de sensores de nível, sensores de peso, medidores de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 47/75

28/48 fluxo de massa, medidores de vazão volumétrica, outros sensores e/ou medidores ou qualquer combinação deles a fim de determinar quando as bombas devem ser ligadas e desligadas. Em outra configuração, a amostra do processo, o biorrepórter e quaisquer outros aditivos podem ser medidos preenchendo as seções vazias de tubos ou tubulação antes da mistura, ou no momento da mistura. Os vazios podem ser preenchidos por uma variedade de meios, por exemplo, manualmente por despejamento, pela ação da gravidade ou pela ação de pressão negativa ou positiva. Os vazios também podem ser uma amostra preparada do processo, biorrepórter e qualquer outro aditivo.

[063] O termo biorrepórter refere-se geralmente a qualquer molécula capaz de reagir com um componente inerentemente presente ou induzível na população celular do processo industrial para gerar um sinal metabólico detectável. Uma variedade de abordagens para gerar um sinal metabólico está disponível. A abordagem preferida é usar uma molécula repórter bioquímica que reaja com enzimas nativas para produzir um sinal detectável. O sinal gerado deve ser preferencialmente um sinal emissor de luz e, mais preferivelmente, um sinal emissor de luz fluorescente. Em configurações alternativas, o sinal gerado é detectável por meio de métodos, incluindo o colorimétrico, refratométrico, espectrofotométrico, luminométrico, fluorométrico, ou qualquer combinação deles.

[064] Em diferentes configurações, o biorrepórter pode assumir uma ou mais das seguintes formas: um reagente em uma solução; mais de um reagente em uma solução; mais de um reagente, cada reagente em uma solução

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 48/75

29/48 separada; um reagente em uma forma seca; mais de um reagente em uma forma seca; mais de um reagente, cada reagente em uma forma seca separada; formas semelhantes; e qualquer combinação delas.

[065] Em uma configuração preferida, o biorrepórter é uma molécula ou grupo de moléculas que pode reagir com um amplo conjunto de enzimas a fim de criar um sinal detectável em um curto espaço de tempo. Um amplo conjunto de enzimas também garante que o sinal se correlacione com a taxa metabólica geral da população celular, e que a abordagem seja viável para uso em uma ampla variedade de condições e taxas metabólicas. Em uma configuração, o conjunto de enzimas de reação é compartilhado quase que universalmente entre os diferentes organismos. Em outra configuração, o conjunto de enzimas de reação é espécie-específico ou tipo celular-específico para permitir a diferenciação entre essas espécies ou tipos celulares. Em uma configuração, o biorrepórter também deve ser capaz de penetrar as estruturas da parede celular e/ou membrana plasmática para acessar as enzimas citoplasmáticas. Em alguns casos, essa penetração pode ser auxiliada pelo uso de outros fatores, tais como detergentes. Em outras configurações, a amostra da população celular é submetida ao cisalhamento químico ou mecânico para lisar as células e o biorrepórter não precisaria ser capaz de tal penetração.

[066] Em uma configuração, o sinal gerado pela atividade metabólica da população celular, de preferência, está em conformidade com certos comportamentos esperados. Por exemplo, o sinal não deve apresentar uma duração de sinal extremamente curta, e não deve sofrer de dependência

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 49/75

30/48 grave do pH, temperatura, força iônica, etc. Os biorrepórteres eficazes incluem aquelas substâncias que são consistente e quimicamente reativas com componentes conhecidos na população celular e que não degradam significativamente com o tempo (ou seja, têm uma vida útil aceitável). Preferencialmente, a intensidade de sinal deve ser substancialmente proporcional à sua concentração e não significativamente reduzida ou de outra forma diminuída por outros componentes da população celular.

Além disso, o sinal gerado deve ser em comprimentos de onda controláveis (por exemplo , outros componentes da população celular não devem interferir com as propriedades de sinal naqueles comprimentos de onda) e comprimentos de onda de excitação/emissão (no caso de um sinal fluorescente) que estão separados de outros componentes fluorescentes que possam estar presentes.

[067] Biorrepórteres representativos capazes de serem convertidos em uma molécula que reaja para gerar um sinal fluorescente para uso no presente pedido de patente de invenção incluem derivados do ácido naftaleno dissulfônico; amino-metil cumarina; pireno; ácido tetrassulfônico pireno; 4-metilumbeliferil; corante amarelo Cascade Yellow™; fluoresceína; carboxifluoresceína; BODIPY® FL; BODIPY® TR; tetrametilrodamina 110; carboxi-rodamina; corante amarelo Lúcifer [Lucifer Yellow]; corante Hoechst 33342; sulforrodamina 110; corante Resorufina; naftafluoresceína; SNARF-1; corantes de cianina; substâncias semelhantes; outros fluoróforos; e qualquer combinação deles.

[068] Para gerar uma molécula de biorrepórter, as moléculas listadas acima ou outras moléculas florescentes

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 50/75

31/48 adequadas podem ser, por exemplo, derivatizadas com um grupo lábil adequado. O grupo lábil funciona como a porção enzimaticamente lábil da molécula do biorrepórter. O grupo lábil também funciona para alterar as propriedades fluorescentes da molécula fluorescente de forma que o biorrepórter esteja em um estado fluorescente quando complexado com o grupo lábil e em um segundo estado fluorescente quando o grupo lábil for clivado enzimaticamente a partir da molécula fluorescente do núcleo.

[069] Em outra configuração, uma configuração de biorrepórter adequada envolve a separação de uma molécula fluorescente e uma molécula redutora por um biopolímero curto de ácidos nucleicos, proteínas, carboidratos ou lipídios. Muitas enzimas celulares funcionam para degradar os biopolímeros. Em uma configuração, o biorrepórter é uma molécula de DNA em formato de grampo de cabelo com um fluoróforo internamente reduzido, a fluorescência da qual é restaurada com a degradação da molécula de DNA por enzimas nucleases presentes na população celular. Outra molécula biorrepórter adequada envolve a marcação de um biopolímero em alta densidade com uma molécula fluorescente que seja capaz de reduzir sua própria fluorescência em altas concentrações locais. Com a degradação do biopolímero, seriam liberados segmentos curtos que fluorescem.

[070] Deve-se apreciar que o conjunto de combinações possíveis entre os grupos lábeis e as moléculas nucleares fluorescentes, e entre os biopolímeros e os pares de fluoróforo/redutor, é extremamente grande e combinações adequadas podem ser determinadas por alguém com habilidade na técnica. Exemplos não-limitantes de certas químicas de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 51/75

32/48

biorrepórter que	são úteis dentro do contexto do presente
pedido de patente	de invenção são apresentados abaixo.
[071]	Químicas representativas de biorrepórter

incluem (amplas classes de enzimas-alvo são apresentadas entre parênteses) 4-metilumbeliferil glucopiranosida (glicosidase), 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil xilanosida

(glicosidase),

6,8-difluoro-4-metilumbeliferil

glucopiranosida (glicosidase), 4-(Trifluorometil)umbeliferil

galactopiranosida	(glicosidase), fluoresceína-di-B-D-
glucopiranosida	(glicosidase), fluoresceína-di-B-D-
galactopiranosida	(glicosidase), fosfato de naftalimida

fosfatase), 4-nitrofenil fosfato (fosfatase), 4-

metilumbeliferil	fosfato (fosfatase), 6,8-difluoro-4-
metilumbeliferil	fosfato (fosfatase), di-O-

fosfatidilfluoresceína (fosfatase), O-fosfatidilfluoresceína

(fosfatase),

di-O-acetil 5-clorometilfluoresceína

(lipase/esterase), di-O-acetilsulfofluoresceína (lipase/esterase), di-O-acetil-5- (6) carboxinaftofluoresceína (lipase/esterase), 6,8-difluoro-4-

metilumbeliferil	butirato (lipase/esterase),
metilumbeliferil	butirato (lipase/esterase), 4-

(Trifluorometil)umbeliferil butirato (lipase/esterase), diO-propionilfluoresceína (lipase/esterase), Opropionilfluoresceína (lipase/esterase), di-Obutirilfluoresceína (lipase/esterase), O-butirilfluoresceína (lípase/esterase), di-O-acetilfluoresceína (lipase/ esterase), O-acetilfluoresceína (lipase/esterase), acetato de resorufina (lipase/esterase), isobutiloxicarboniloxi de resorufina (lipase/esterase), 4-metilumbeliferil sulfato (sulfatase), 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil sulfato

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 52/75

33/48 (sulfatase), aminometilcumarina-L-leucina (protease), GliPro-aminometilcumarina (protease), resazurina (oxidorredutase), fluoróforo-polipeptídeo-redutor (glicosidase), fluoróforo-lipídio-redutor (lipase), fluoróforopolinueleotídeo-redutor (nuclease); outros biorrepórteres; substâncias semelhantes; e quaisquer combinações deles.

[072] Uma configuração exemplar do presente pedido de patente de invenção é a seguinte. No processo de preparação da amostra para a medição, no instante em que o biorrepórter entra em contato com a população celular, tem início uma reação bioquímica que produz um sinal de atividade metabólica. O presente pedido de patente de invenção emprega vários métodos para eliminar a variabilidade nas medições de taxa metabólica devido ao tempo de reação. Em primeiro lugar, o dispositivo controlador/de pesagem reúne registros automaticamente no momento exato em que a solução de biorrepórter entra em contato com a amostra da população celular. Essa era uma lacuna da técnica anterior, uma vez que o usuário era responsável tanto por misturar as soluções quanto por iniciar o temporizador. Em segundo lugar, o tempo de início de reação registrado pelo dispositivo controlador/de pesagem é utilizado pelo controlador/detector de sinal para medir automaticamente o sinal na amostra preparada em intervalos de tempo precisos de acordo com as instruções operadas pelo controlador. Removendo a responsabilidade de medição de tempo de um usuário humano e automatizando a responsabilidade por meio do dispositivo controlador/de pesagem e do controlador/detector de sinal, o presente pedido de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 53/75

34/48 patente de invenção efetivamente permite medições de taxa metabólica por meio de medição precisa do tempo de reação.

[073] Outra vantagem notável da configuração do detector de sinal-na-amostra do presente pedido de patente de invenção é que o progresso da reação pode ser monitorado continuamente do início até o final, o que seria difícil ou impossível na técnica anterior devido à necessidade de transferir a amostra de um dispositivo de controle de temperatura para o instrumento de detecção. Com um sistema de monitoramento contínuo da reação, é possível calcular a taxa de reação ao invés do desfecho da reação, conforme praticado na técnica anterior. Medir taxas de reação é mais reprodutível do que medir os desfechosda reação porque o cálculo da taxa leva em consideração os sinais de fundo variáveis presentes no início da reação,as diluições realizadas durante a preparação da amostra eas temperaturas de reação.

disso, determinados sinais, especialmente aqueles detectados difíceis ou impossíveis de medir por meios ópticos, são com precisão em amostras com turbidez ou propriedades de espalhamento de luz, a menos que o instrumento de detecção de sinal tenha um modelo de calibração associado que capture os efeitos da turbidez da amostra na potência do sinal. O presente pedido de patente de invenção pode empregar, por exemplo, um detector de sinal de canal duplo, onde um canal é desenhado para medir a fluorescência e o outro canal desenhado para medir a turbidez. Além disso, o presente pedido de patente de invenção pode utilizar um procedimento de software para construir e armazenar curvas de calibração que modelam a

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 54/75

35/48 resposta do detector de sinal para aumentar a turbidez da amostra do processo. Juntas, estas melhorias permitem a detecção precisa de sinais nas composições de amostra de diferentes turbidezes.

[075] Em muitas circunstâncias, o sistema e o método descritos exigirão calibração para garantir uma precisão contínua. Embora qualquer método adequado de calibração possa ser utilizado, deve-se perceber que a calibração dos instrumentos de detecção de sinal, em particular, é importante por várias razões. Primeiro, os instrumentos podem variar ao longo do tempo devido a flutuações internas nos mecanismos de detecção de sinal. Segundo, quando uma pluralidade de instrumentos é utilizada simultaneamente ou sequencialmente, a normalização de diferenças inerentes nas propriedades de detecção de sinal ajuda a produzir resultados consistentes. Terceiro, as propriedades das amostras que estão sendo medidas podem mudar ao longo do tempo. Por exemplo, com relação à detecção da fluorescência, muitos sistemas convencionais utilizam um método de calibração rápida de dois pontos. Esse método envolve a calibração medindo uma amostra em branco não contendo sinal fluorescente e, então, medindo uma segunda amostra contendo uma quantidade padrão de sinal fluorescente. Embora essa abordagem possa funcionar eficazmente para quantificar a fluorescência em amostras que contenham turbidez zero, a maioria das amostras de populações celulares encontradas em sistemas industriais possuem quantidades variáveis de turbidez. A turbidez afeta a detecção de sinais fluorescentes de maneiras imprevisíveis. Por exemplo, a matéria turva pode espalhar

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 55/75

36/48 luz fluorescente para longe, ou na direção do detector de sinal. Também, a matéria turva pode absorver luz de excitação e/ou emissão e impedir que ela excite as moléculas fluorogênicas ou que elas atinjam o detector de sinal. Por estas razões, é preferível calibrar contra uma mistura da amostra do processo e uma solução-padrão ao invés de calibrar contra uma solução-padrão.

[076] Uma abordagem exemplar para realizar essa calibração é construir uma primeira curva de calibração utilizando uma solução com fluorescência zero, e uma segunda curva utilizando uma solução com uma quantidade conhecida de fluorescência. Cada uma das curvas deve conter três ou mais medições feitas em diferentes proporções de amostra do processo misturada com as respectivas soluções. Ainda mais preferível é utilizar um fluxo de trabalho de calibração estruturado codificado em uma interface do usuário e preparar as amostras de calibração em uma balança digital (isto é, o dispositivo de medição de peso) em comunicação com um controlador. Dessa forma, é possível criar e armazenar vários modelos de amostras de diferentes composições, executar verificações de controle de qualidade, à medida que os modelos forem sendo construídos, e capturar outras informações como as informações de sólidos suspensos totais (SST) da amostra de calibração e utilizar essas informações para reportar o SST de uma amostra desconhecida, medida em algum ponto no futuro. Ainda, outra vantagem da abordagem preferida é que ela cria um espaço de calibração definido com relação à fluorescência e à turbidez, que é útil porque exemplos destinados à medição de taxa metabólica podem ser preparados com alguma flexibilidade na balança

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 56/75

37/48 digital e ainda ficar dentro do espaço do modelo de calibração.

[077] É bem sabido que a taxa metabólica de populações celulares é dependente da temperatura. Temperaturas mais altas geralmente produzirão maiores taxas metabólicas, a menos que a temperatura fique elevada demais para que as enzimas funcionem adequadamente. Ao contrário, temperaturas mais baixas geralmente resultam em taxas metabólicas reduzidas. Se a temperatura ficar muito baixa, no entanto, a taxa metabólica pode ser reduzida para fazer com que a quantidade de sinal metabólico produzido por meio da reação com o biorrepórter seja reduzida a um nível demasiadamente baixo para ser detectado com precisão pelo detector de sinal. Vários outros fatores se tornam importantes nessas circunstâncias (por exemplo, o sinal de fundo) e é, geralmente, preferível evitar taxas de medição quando o sinal metabólico for insuficiente. Em circunstâncias onde a variação de temperatura encontrada tem esse efeito, é preferível controlar a temperatura da amostra preparada dentro dos limites de temperatura. Embora essa abordagem ofereça a possibilidade de controle refinado, ela normalmente requer equipamentos especializados e cuidado atencioso do operador para garantir que o equipamento esteja funcionando corretamente. Por exemplo, um esquema de controle de temperatura eficaz pode envolver o uso de reagentes controlados pela temperatura, ou uma câmara ambiental controlada pela temperatura na qual as medições são realizadas, ou um recipiente equipado com um ou mais elementos de aquecimento. Se o clima do ambiente for frio o suficiente, ou se a população celular for pequena o

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 57/75

38/48 suficiente, pode ser necessário elevar artificialmente a temperatura da amostra preparada por meio de quaisquer meios necessários de controle de temperatura para gerar um sinal suficientemente elevado para detecção e cálculos da taxa precisos.

[078] A abordagem preferida é permitir que a temperatura flutue dentro dos limites da temperatura ambiente. Com essa abordagem, é importante medir a temperatura de cada reação e ter um fator de correção razoável para a taxa metabólica das células na amostra preparada para corrigir flutuações de temperatura. Essa informação seria, então, utilizada por um programa de software ou outro algoritmo no controlador para calcular todas as taxas metabólicas como se fossem coletadas em uma temperatura padrão. Ao adotar essa abordagem, o algoritmo de normalização de temperatura se tornará cada vez mais importante quando a temperatura medida estiver mais distante da temperatura do relato. Por esse motivo, a temperatura padrão para o relato de taxas metabólicas pode ser de 24°C (75°F) porque está próxima da temperatura ambiente média. No entanto, a temperatura de relato pode ser estabelecida em outros valores, se desejado.

[079] Tentativas anteriores de controlar a influência da temperatura sobre as reações biológicas envolveram o uso de várias estratégias para controlar a temperatura de reação. Esses métodos foram problemáticos porque o controle de temperatura era difícil de controlar, a diferença de temperatura entre a temperatura desejada e real era, geralmente, desconhecida, e porque o usuário era responsável por transferir a amostra de um dispositivo de

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 58/75

39/48 controle de temperatura ao instrumento de detecção de sinal. Para superar essas limitações e eliminar a variabilidade da medição que elas inerentemente introduzem, o presente pedido de patente de invenção avança o estado da técnica em várias frontes. Primeiro, o presente pedido de patente de invenção, por exemplo, pode utilizar uma abordagem de detector de sinal-na-amostra em oposição a uma abordagem de amostra-nacuveta-no-detector de sinal encontrada na técnica anterior. O presente pedido de patente de invenção também pode utilizar um detector de sinal com um termistor embutido, ou um termômetro digital. A abordagem de detector de sinal-naamostra e o termômetro embutido permitem a medição direta da temperatura da amostra durante a reação porque o detector de sinal não é separado da amostra por uma cuveta de plástico ou vidro. O método melhorado também pode utilizar os dados de temperatura de reação e um algoritmo de correção de temperatura para relatar a taxa metabólica em uma temperatura padronizada de cada vez. Como resultado, o usuário fica livre da responsabilidade de utilizar um dispositivo de controle de temperatura ou até mesmo de saber a temperatura da reação.

[080] Em algumas populações celulares, substâncias que interferem com as medições precisas do sinal metabólico podem estar presentes, ou quando a população celular for uma população mista de mais espécies. Nesses, casos, pode ser desejável aplicar filtração ou outro meio de separação (por exemplo, centrifugação, coagulação ou flutuação) antes ou depois da medição da taxa metabólica. A separação de substâncias que causam interferência ou a separação por espécie e/ou tamanho celular pode ser

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 59/75

40/48 desejável para produzir medições mais específicas e valiosas da taxa metabólica. Por exemplo, em uma população mista, determinadas espécies podem produzir uma enzima que previsivelmente reaja com o biorrepórter para produzir um sinal preciso para determinar a taxa metabólica e outras espécies podem produzir uma enzima que reduz o sinal ou inibe a reação. Além disso, pode ser desejável coletar uma amostra da população celular, separar um ou mais tipos ou espécies celulares (ou simplesmente separar todas as células) do meio presente no processo industrial e ressuspender as células em outra solução (por exemplo, tampão ou água) para aumentar a reação com o biorrepórter. Em outros casos, pode ser benéfico diluir a amostra obtida. Nessas configurações, o controlador seria ainda mais operável para corrigir quaisquer medições de acordo com a correção do fator de diluição.

[081] Outra melhoria significativa do presente pedido de patente de invenção em relação à técnica anterior se refere aos benefícios do uso de um programa de software de computador para realizar vários elementos do método. Em um nível básico, o software oferece o benefício de melhoria da exatidão e da redução dos erros atribuível à designação ao computador de tarefas que foram anteriormente designadas ao operador humano. Por exemplo, por não ter que transferir manualmente as informações da taxa metabólica do instrumento para um local de armazenamento permanente, como um livro de registros, uma planilha ou base de dados, a integridade das informações é preservada. O programa de software garante a confiabilidade do sistema, orientando o processo de medição desde a preparação de amostra, coleta de dados, cálculos

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 60/75

41/48 numéricos e arquivamento dos resultados. Esse sistema pode ser útil para melhorar as operações do processo, permitindo a comparação dos operadores, condições e até mesmo o desempenho entre as plantas dentro da mesma empresa. Em um nível mais elevado, o programa de software melhora a funcionalidade do sistema possibilitando funções que seriam difíceis a impossíveis utilizando métodos conhecidos da técnica anterior. Por exemplo, cada medição pode coletar > 100 pontos de dados e realizar > 50 cálculos antes de produzir a taxa metabólica final para aquela amostra. Além disso, a informação digital resultante da utilização de sistemas de medição operados por software permite, ainda, que mais valor seja derivado da medição. Por exemplo, agora é possível inserir dados da taxa metabólica em um algoritmo de controle com base no modelo destinado a monitorar e melhorar o estado do processo. Da mesma forma, os dados coletados com o sistema podem ser visualizados em tempo real por todas as partes interessadas, utilizando a conectividade por intranet, extranet ou internet.

[082] Utilizando quaisquer das configurações aqui descritas, ou quaisquer combinações de vários elementos dentro dessas configurações, o sinal metabólico detectado é analisado pelo controlador. O controlador é operável para executar um algoritmo, programa, instrução digital executável ou recursos semelhantes para determinar a taxa metabólica da população celular com base no sinal metabólico. A taxa metabólica é utilizada para implementar métodos de controle e/ou gestão da população celular (ou qualquer uma ou mais espécies dentro da população celular)

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 61/75

42/48 para qualquer propósito que seja o objetivo do processo industrial particular que esteja sendo testado.

[083] Um exemplo das etapas básicas implementadas por um controlador para o processamento de um sinal metabólico para produzir um indicador de taxa metabólica pode ser compreendido a partir dos seguintes eventos descritos. O método inclui uma primeira etapa de converter as unidades arbitrárias do sinal medido em unidades de concentração definida de sinal. Essa conversão é realizada por referência ao modelo de calibração, que define a quantidade de sinal esperada do detector de sinal ao medir soluções com concentrações conhecidas de sinal misturadas com proporções variáveis de amostra do processo a uma temperatura conhecida. O resultado desta primeira etapa é uma medida exata da concentração de sinal que representa a interferência da temperatura e da turbidez na potência do sinal. A conversão das unidades de sinal medido em unidades de concentração definida de sinal ocorre pelo menos duas vezes durante o processo de medição, embora não haja limite para o número de vezes que essas medições e conversões subsequentes podem ser realizadas.

[084] A segunda etapa do processamento de sinais metabólicos para produzir um indicador de taxa metabólica envolve o cálculo da magnitude da mudança da concentração de sinal entre o tempo de medição inicial e o tempo de medição final. A mudança na concentração do sinal é dividida pela mudança do tempo entre a medição inicial e a final para alcançar uma taxa média de mudança de sinal. No entanto, a fim de produzir um indicador de taxa metabólica pode ser necessário processar ainda mais os dados para

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 62/75

43/48 ajustar a influência da diluição da amostra e a temperatura da amostra. Assim, a terceira etapa pode ser multiplicar a taxa de alteração calculada para a amostra preparada pela magnitude da diluição utilizada para preparar a amostra. A magnitude da diluição pode ser determinada de acordo com as informações transmitidas do dispositivo de pesagem para o controlador durante a preparação da amostra. A quarta e última etapa pode ser ajustar a taxa metabólica para corresponder à diferença entre a temperatura real na qual a reação foi realizada e a temperatura padrão utilizada para o relato. Na prática, isso pode envolver a conversão da taxa metabólica medida na temperatura de reação real para a taxa metabólica que teria sido observada caso a reação tivesse sido realizada a uma temperatura diferente. A taxa metabólica a uma temperatura particular pode ser calculada utilizando uma equação matemática adequada (por exemplo, uma forma de dois pontos da equação de Arrhenius) e um fator de correção razoável se for conhecido para outra temperatura.

[085] A informação anterior pode ser mais bem compreendida por referência aos exemplos a seguir, que são apenas para fins ilustrativos e não destinados a limitar o escopo do presente pedido de patente de invenção.

[086] Exemplo 1 Taxa Metabólica da Formação de Dióxido de Carbono [087] Este exemplo demonstra que o indicador de taxa metabólica do presente pedido de patente de invenção se correlacionada com a taxa real de formação do produto (dióxido de carbono) durante a fermentação do lote. Uma fermentação de lote de mosto de milho liquefeito (32% de sólidos totais) foi realizada com levedura recém-propagada.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 63/75

44/48

O desempenho da fermentação foi monitorado pelo acompanhamento da formação cumulativa de produto ao longo do tempo com um analisador contínuo de gases de dióxido de carbono (FIG. 4) . A taxa de formação de produto em qualquer ponto durante a fermentação do lote pode ser obtida pela inclinação da curva cumulativa de produto. Conforme mostra a FIG. 5, a taxa de formação de produto e o indicador de taxa metabólica do presente pedido de patente de invenção mostrarão uma forte correlação utilizando o biorrepórter diO-propionilfluoresceína e um tampão com pH 7,6.

Exemplo 2

Detectores de Sinal Independentes, Operadores e Fermentações de Lote [088] Este exemplo ilustra o desempenho consistente do indicador de taxa metabólica entre os diferentes operadores, detectores de sinal e fermentações de lote. Durante um período de um mês, cinco operadores diferentes coletaram um total de 300 medições da taxa metabólica com o sistema do presente pedido de patente de invenção utilizando o biorrepórter di-O-acetilfluoresceína e um tampão de pH 7,6 entre 25 fermentações de lote diferentes em uma planta industrial de etanol. Cada amostra foi testada uma vez com uma primeira unidade detectora de sinal e, então, retestada com uma segunda unidade detectora de sinal. Os detectores de sinal foram periodicamente calibrados contra uma mistura da amostra do processo e soluções padrão durante o estudo de um mês. Conforme mostra a FIG. 6, o método produziu resultados consistentes entre diferentes operadores, detectores de sinal e lotes.

Exemplo 3

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 64/75

45/48

Taxa Metabólica de Formação do Etanol [089] Neste exemplo demonstra-se que o indicador de taxa metabólica do presente pedido de patente de invenção se correlaciona com a taxa de formação de etanol durante a fermentação do lote. Uma fermentação de lote industrial mosto de milho liquefeito foi realizada com levedura recém-propagada. O desempenho da fermentação foi monitorado pelo acompanhando da formação cumulativa de produto ao longo do tempo por meio da análise intermitente por cromatografia líquida de alto desempenho (FIG. 7) . A taxa de formação de produto em qualquer ponto durante a fermentação do lote pode ser obtida pela inclinação da curva cumulativa de produto. Conforme mostra a FIG. 8, a taxa de formação de etanol e o indicador de taxa metabólica do presente pedido de patente de invenção utilizando o biorrepórter O-acetilfluoresceína e um tampão de pH 7,6 mostrarão uma forte correlação.

Exemplo 4

Redução de Taxa Metabólica de uma População Celular durante o Armazenamento [090] Em algumas circunstâncias, as populações celulares são adicionadas diretamente em um recipiente de fermentação de um ambiente de armazenamento. Essa prática é comum nas indústrias de produção de bebidas fermentadas e de panificação, bem como em alguns processos de etanol combustível onde ocorre a reciclagem celular. Essa situação também ocorre quando a etapa de propagação é ignorada e células na forma seca são despejadas diretamente em um recipiente de fermentação. Sob todas essas circunstâncias, é desejável saber quanta matéria celular deve ser adicionada.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 65/75

46/48

Este exemplo demonstra que o método do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizado para prever as taxas metabólicas decrescentes de uma população armazenada da bactéria Xanthamonas campestris utilizando o biorrepórter 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil butirato e um tampão de pH 7,6 (FIG. 9). Essa informação pode ser utilizada para determinar a quantidade de células a serem adicionadas ao próximo lote ao invés de fazer a adição com base na quantidade de sólidos ou na quantidade de células viáveis. Exemplo 5

Taxas Metabólicas Normalizadas pela Temperatura [091] Este exemplo demonstra que o sistema e o método do presente pedido de patente de invenção podem ser utilizados para normalizar efetivamente as taxas metabólicas medidas em diferentes temperaturas para uma população celular de algas medida ao longo de uma variação de temperaturas ambientes normais utilizando o biorrepórter acetato de resorufina e um tampão de pH 8,7 (FIG. 10). Exemplo 6

Taxas Metabólicas Corrigidas pela Turbidez [092] Este exemplo demonstra as taxas metabólicas efetivas corrigidas pela turbidez com o método e o sistema do presente pedido de patente de invenção. As taxas metabólicas para uma população celular de levedura foram medidas com o método e o sistema do presente pedido de patente de invenção utilizando o biorrepórter di-Oacetilfluoresceína e um tampão de pH 7,6 na presença de quantidades crescentes de turbidez com a contribuição de material não-celular em uma solução de extrato de cana de açúcar (FIG. 11). Um primeiro conjunto de medições foi feito

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 66/75

47/48 em referência a um modelo de calibração que foi construído na ausência de qualquer turbidez não-celular (dados não corrigidos).

Um segundo conjunto de determinações de taxa foi feito a partir das mesmas amostras, mas em referência aos modelos de calibração adequados construídos na presença de 0%, 50% ou 100% de turbidez relativa da amostra.

[093]

Todas as composições e métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Embora o presente pedido de patente de invenção possa ser aplicado de muitas formas diferentes, são descritas em detalhes neste documento configurações preferidas específicas do presente pedido de patente de invenção. A presente revelação é uma exemplificação dos princípios do presente pedido de patente de invenção e não se destina a limitar o presente pedido de patente de invenção às configurações particulares ilustradas.

[094]

Quaisquer variações em termos absolutos ou em termos aproximados são destinadas a abranger ambos, e quaisquer definições utilizadas aqui destinam-se a ser esclarecedoras e não limitantes. Muito embora as variações numéricas e parâmetros estabelecendo o amplo escopo do presente pedido de patente de invenção sejam aproximações, os valores numéricos estabelecidos em exemplos específicos são relatados o mais precisamente possível. Qualquer valor numérico, no entanto, inerentemente contém certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste.

Além disso, deve-se entender que todas as variações reveladas aqui abrangem

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 67/75

48/48 quaisquer e todas as subvariações (incluindo todos os valores inteiros e fracionários) incluídas nelas.

[095] Além disso, o presente pedido de patente de invenção abrange todas e quaisquer combinações possíveis de algumas ou de todas as várias configurações aqui descritas. Todas e quaisquer patentes, pedidos de patentes, trabalhos científicos e outras referências mencionadas nesse pedido, bem como quaisquer referências mencionadas estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Deve-se entender, também, que várias alterações e modificações às configurações presentemente preferidas descritas aqui serão aparentes àqueles com habilidade na técnica. Essas alterações e modificações podem ser feitas sem fugir do espírito e do escopo do presente pedido de patente de invenção e sem diminuir suas vantagens pretendidas. Pretende-se, portanto, que essas alterações e modificações sejam cobertas pelas reivindicações anexas.

Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 68/75

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, o método prevendo: a combinação de uma amostra, contendo uma população celular, e um biorrepórter selecionado de di-Opropionilfluoresceína, di-O-acetilfluoresceína, Oacetilfluoresceína, butirato de 6,8-difluoro-4metilumbeliferila e acetato de resorufina e um aditivo em um recipiente equipado com um dispositivo de detecção de parâmetros para detectar um parâmetro, o parâmetro prevendo o peso da amostra, volume da amostra/uma combinação respectiva, caracterizado por a combinação da amostra com o biorrepórter/aditivo provocar uma alteração no parâmetro detectado e constituir um ponto inicial de reação; a detecção da temperatura, turbidez e sinal metabólico da amostra no ponto inicial de reação, em que o sinal metabólico se correlaciona à conversão do biorrepórter pela população celular auma molécula capaz de gerar um sinal fluorescente detectável; a detecção da temperatura, turbidez e sinal metabólico da amostra em um ou mais pontos no tempo após o ponto inicial de reação; a normalização dos sinais metabólicos detectados quanto a diferenças na temperatura detectada, utilizando um algoritmo de normalização de temperatura, e turbidez detectada por calibração contra uma mistura da amostra e uma solução padrão no ponto inicial de reação e em um ou mais pontos no tempo após o ponto inicial de reação, fornecendo, assim, um sinal metabólico normalizado para o ponto inicial de reação e para cada um de um ou mais pontos no tempo; e a determinação do indicador da taxa metabólica da amostra com base nos sinais metabólicos

   Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 69/75
2. 2/4 normalizados, em que a taxa de conversão do biorrepórter pela população celular à molécula capaz de gerar o sinal fluorescente detectável se correlaciona à taxa de produção de dióxido de carbono/taxa de produção de etanol pela população celular.

   2. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a população celular ser selecionada a partir de bactérias, arqueobactérias, protistas, animais microscópicos, fungos, leveduras, plantas microscópicas, células animais e combinação dos anteriores.
3. 3. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a amostra da população celular ser obtida através de um amostrador manualmente operado.
4. 4. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a amostra contendo a população celular sofrer separação e ressuspensão.
5. 5. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por o método ser realizado através de um recipiente compreendendo a população celular, uma porta de coleta de amostras, uma linha de amostra e uma junção entre a porta de coleta de amostras e a linha de amostra, em que a junção inclui um meio para criar um canal de comunicação de fluido entre a porta de coleta de amostras e a linha de amostra, de modo a permitir que uma

   Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 70/75

   3/4 amostra da população celular seja arrastada para a linha de amostra, em que a porta de coleta de amostras está em comunicação com o recipiente e em que a linha de amostra está em comunicação com o recipiente através de uma válvula.
6. 6. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 5, caracterizado por o sinal metabólico ser detectado através de um fluorômetro localizado, pelo menos parcialmente, no interior do recipiente.
7. 7. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, prevendo, ainda, a combinação de um aditivo com a amostra contendo a população celular, o biorrepórter e/ou uma combinação respectiva, caracterizado por o aditivo provocar uma mudança noparâmetro quando combinado com a amostra, o biorrepórter/combinação respectiva, constituindo, assim, o ponto inicial de reação.
8. 8. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 7, caracterizado por o aditivo ser selecionado a partir de um agente tamponador, um agente modificador de pH, um catalisador, uma coenzima, um mineral, um cossubstrato e combinações respectivas.
9. 9. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 7, caracterizado por o aditivo ser um agente tamponador que tampona a amostra a um pH de aproximadamente 7,6.
10. 10. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a

    Petição 870190051217, de 31/05/2019, pág. 71/75

    4/4 reivindicação número 1, caracterizado por a amostra da população celular ser obtida através de um amostrador automaticamente operado.
11. 11. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a amostra da população celular ser obtida através de um aparelho de fluxo lateral.
12. 12. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE UM INDICADOR DA TAXA METABÓLICA DE UMA POPULAÇÃO CELULAR, de acordo com a reivindicação número 1, caracterizado por a amostra contendo a população celular ser diluída.