CN103808943B - 一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法，是由酿酒酵母菌株细胞自噬相关蛋白Atg8的荧光标记、土壤水萃液的获取、酿酒酵母在营养丰富培养基和不同氮素量培养基的培养、模型的建立和土壤内可利用氮素的推算等步骤组成，其特征在于：不同可利用氮素的量会使得GFP-Atg8在液泡内的分布比例不同，据此建立标准模型和推算未知土壤内可利用氮素的量。该方法操作简单、成本低廉、可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。

Description

一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法
技术领域
本发明属于细胞生物学和土壤学领域，涉及一种新的土壤内可利用氮素的测定方法，更准确地说本发明涉及一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法。
背景技术
土壤养分参数(主要为氮、磷、钾及有机质含量)是土壤肥力的重要指标，反映了土壤供给作物生长的能力；其中氮素是作物最重要的结构物质，也是酶的主要成分，所以氮素对作物生理代谢和生长有重要作用。作物可利用的土壤内中主要氮素形式是铵态氮和硝态氮；氮素的不同形态会对作物生理代谢过程和生长产生不同的影响。目前公认的土壤内氮素营养诊断都是以实验室常规测试为主，取样、测定、数据分析等繁琐的过程需要耗费大量的人力、物力，且未考虑氮素营养的多寡对其内生物的影响。
细胞自噬(autophagy)是溶酶体(酵母中为液泡)参与的胞内物质代谢的过程，是真核生物维持细胞稳态和保持健康的一类亚细胞降解途径，在真核生物中是保守的。目前了解比较多的细胞自噬调控通路主要有两条：TOR(Targetofrapamycin)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K，Phosphoinositide3-kinase)通路，很多其他自噬途径都直接或间接通过这两条通路发挥作用；Tor是细胞自噬的负调控因子，能特异性的响应胞内氮素水平，在营养丰富的条件下，Tor激酶处于活性状态，此时细胞自噬受到抑制，而在营养缺乏或雷帕霉素处理等外界条件下，Tor激酶失活而自噬活性上升；在可利用氮素营养缺乏的条件下，细胞内相关物质会运往液泡进行降解，因而可以根据真核生物启动细胞自噬即自噬相关蛋白如Atg8运往液泡(或溶酶体)的情况来检测土壤内氮素水平。
目前国内外相关研究还未有涉及该方面的成果，因而利用荧光标记的自噬相关蛋白在一定培养时间内在液泡内的分布比例，可以有效的推测土壤内可利用氮素的水平。基于此，可以进行相关技术方法的改进和测试设备的研制，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
为了解决土壤内氮素营养多寡未考虑其内生物的问题，基于细胞自噬与氮素营养的关系，本发明的提供了一种新颖的测试土壤内氮素营养的方法，即：在一定培养时间内，酿酒酵母中GFP-Atg8在液泡内的分布比例来推算土壤内可利用氮素的量。
为解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
(1)酿酒酵母菌株Atg8蛋白的荧光标记和相应数量关系模型的建立：自噬相关蛋白Atg8被GFP标记酿酒酵母菌株的特征在于，可以通过荧光显微镜或者westem-blot等技术手段，方便的观察到Atg8的分布情况，当培养液中氮素营养缺乏时，GFP-Atg8会送往液泡降解；而在营养丰富的条件下，GFP-Atg8会弥散在细胞质中。在不同氮素水平下，GFP-Atg8进入液泡的比例有所不同，据此可建立氮素水平和Atg8进入液泡比例间的关系。
(2)所用菌株细胞的培养技术：酵母细胞在SD-Ura等培养基中培养至对数期OD600≈1.0时，取约30mL培养液经离心、洗涤后转入不同氮素水平的培养基中，在保证培养时间(＞2小时)相同的前提下，对细胞进行显微荧光拍照或者收集细胞进行western-blot，根据所得结果建立氮素水平与液泡内Atg8分布比例之间的关系模型；并根据土壤水萃液作为唯一氮源的培养基中酵母细胞液泡内的Atg8分布比例，推算土壤内可利用氮素的量。
本发明的有益效果是：一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法，操作简单、成本低廉、可真实反映生物对土壤内可利用氮素的响应情况。
附图说明
图1是在氮素营养丰富条件和完全缺氮条件下GFP-Atg8分布的显微荧光照片图。
图2是不同氮素水平下GFP-Atg8转换为Atg8的western-blot示意图。
具体实施方式
(1)Atg8蛋白的荧光标记：利用酿酒酵母基因库关于Atg8的基因信息，设计上下游引物，对Atg8序列片段进行扩增；对扩增的产物和含GFP的载体进行酶切、纯化、连接等分子生物学操作，然后整合至所用的酿酒酵母基因组。
(2)土壤测试样品水萃液的获取：对所测试区域进行采样，经干燥、研磨、过筛等步骤，取1g待测土样，与10mL去离子水在摇床上100rpm振荡24h得到土壤水萃液，然后高速离心5min，取上清液，高温灭菌后备用。
(3)氮素水平与GFP-Atg8在液泡分布比例之间关系模型的建立：将自噬相关蛋白Atg8已被GFP荧光蛋白标记的酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至OD600≈1.0时，取30mL培养液经离心、无菌水洗涤后，转入不同氮素水平的液体培养基中，培养一定时间(＞2小时)后，取样，在一定曝光时间条件下，进行荧光观察，获得显微荧光照片，如附图1所示，在氮素营养丰富条件下(图1上面一行所示)，GFP-Atg8分布在细胞质中(如图1①所示)，而液泡内没有GFP-Atg8进入(如图1②所示)；而在氮素营养完全缺失的条件下(图1下面一行所示)，GFP-Atg8则由细胞质运往液泡(如图1③和④所示)；或者培养一段时间后，收集酵母细胞，进行western-blot，得到GFP-Atg8降解的情况图，如附图2所示，在氮素营养丰富的条件下(图2①所对应的一列)，主要是以GFP-Atg8(如图2④所对应)的形式存在，而在氮素营养完全缺失的条件下(图2③所对应的一列)，则主要以分离的GFP和Atg8的形式(如图2⑤所对应)存在，在其他氮素营养梯度下(如图2②所对应)，则分离形式的GFP和Atg8(即进入液泡部分)呈现一定的变化规律；根据显微荧光照片的亮度和面积的信息，可以得到Atg8在液泡内的分布量；或者根据western-blot结果，得到归一化的GFP-Atg8和Atg8的量的信息(用亮度和面积信息与加样对照G6PDH即图2⑥所对应条带进行比较)，计算Atg8进入液泡的情况；根据前述所得到的液泡内Atg8分布的比例和不同的氮素水平，可以建立二者之间的关系模型。
(4)测算样品的可利用氮素含量：以步骤(2)所获取的土壤水萃液作为唯一氮源，进行细胞的培养，培养条件完全同步骤(3)，得到显微荧光照片和western-blot结果，并通过计算得到Atg8在液泡内的分布比例；然后根据步骤(3)所建立的关系模型，计算所测试土壤样品的可利用氮素含量。
以上已以较佳实施公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种基于荧光蛋白分布比例的土壤内可利用氮素的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
（1）以GFP对酿酒酵母菌株细胞中的自噬蛋白Atg8进行荧光标记；
（2）土壤水萃液制备：收集1g待测土壤，与10mL去离子水在摇床上100rpm振荡24h得到土壤水萃液，然后高速离心5min，取上清液，高温灭菌后备用；
（3）氮素水平与GFP-Atg8在液泡分布比例之间关系模型的建立：
a.酵母细胞培养：将步骤（1）获得的酵母细胞在50mL液体SD-Ura培养基中培养至OD600≈1.0时，取30mL培养液经离心、无菌水洗涤后转入不同氮素水平的液体培养基中，培养时间>2小时；
b.对上述步骤a培养后的酵母细胞进行荧光观察，获得显微荧光照片，根据显微荧光照片的亮度和面积的信息，得到不同氮素水平下Atg8在液泡内的分布量；或者将步骤a培养后的酵母细胞收集，进行western-blot，得到GFP-Atg8降解的情况图，根据western-blot结果，用亮度和面积信息与加样对照G6PDH所对应条带进行比较，得到归一化的GFP-Atg8和Atg8的量的信息，计算Atg8进入液泡的情况；
c.根据上述步骤b获得的液泡内Atg8的分布比例和不同的氮素水平，建立二者之间的关系模型；
（4）测算样品的可利用氮素含量：以步骤（2）所获取的土壤水萃液作为唯一氮源，对步骤（1）荧光标记的酵母细胞进行培养，培养条件完全同步骤（3），得到显微荧光照片信息或western-blot结果，计算得到Atg8在液泡内的分布比例；根据步骤c所建立的关系模型，计算所测试土壤样品的可利用氮素含量。
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