CN103229667A - 菌根菌剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菌根菌剂及其制备方法和用途。其中，制备菌根菌剂的方法包括：按照37.5～75ml：100g的比例，将灰树花菌液接入特定固体培养基中，并于25摄氏度下培养3周，以便获得菌根菌剂，其中，该特定固体培养基由重量比为7.5～6.5：1.25～1.75：1.25～1.75的草炭、蛭石和珍珠岩均匀混合而成。本发明的方法成本低、效率高、简单易行，适于工厂化大批量生产，并且制备获得的菌根菌剂，对板栗植株的侵染效果非常好，能够有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力。

Description

菌根菌剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及菌根菌剂及其制备方法和用途。

背景技术

目前，国内对菌剂产品的研究大都集中于松属树种菌剂产品的研究与开发，而对板栗菌剂的研究相对较少，常见的菌剂产品虽然可以侵染板栗，但是侵染率不高，而且多数菌剂产品的侵染效果随着长期应用菌种老化等问题的出现而逐渐降低。

因此，寻找到一种可以与板栗有良好共生关系，并可以在人工条件下大量培养的外生菌根真菌，制成菌剂应用于生产实践，意义重大。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效应用于板栗植株的菌根菌剂及其制备方法。

首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列探索和发现而完成的：

发明人于2011年5月至2012年9月，在河北省唐山市迁西地区，于多种不同地形的板栗林下采集真菌子实体，其中，只采集板栗根系形成的菌根与其菌丝相连的子实体，并将采集到的子实体，于冰盒内低温保存，及时带回实验室，经过多次人工分离、纯化后，得到一种新的板栗外生菌根真菌菌种。该菌种的子实体形态学初步鉴定结果为灰树花，对分离后的菌丝进行分子鉴定的结果进一步证实该与板栗具有良好共生关系的真菌为灰树花。

灰树花又名栗磨，其子实体具有食用和药用价值。目前，针对灰树花子实体培养的研究较多，然而利用灰树花的菌丝制作菌剂，并应用于板栗菌根化的研究，尚未见报道。

进一步，发明人通过多次试验，对灰树花人工大量培养的条件和利用灰树花制作菌根菌剂的方法进行了探索，从而筛选获得了最佳培养条件和菌根菌剂制备方法。此外，发明人还采用几种市售的菌剂（绵毛丝膜菌、红绒盖牛肝菌和美味牛肝菌）作为对照，将各种菌剂接种于当年生的板栗实生苗上，然后定期调查苗木的生长指标并测定其叶片净光合速率，调查菌根侵染率、苗木生物量指标及叶片矿质元素含量，进而通过数据比较和分析，以便验证本发明制备获得的菌根菌剂的实际应用效果。结果证明，相对于目前市售的菌剂，将本发明的菌根菌剂接种于板栗幼苗后，其在提高苗木的苗高、地径、地上、地下生物量、净光合速率和叶片中矿质元素N、P、K的含量方面的效果更加显著。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种制备菌根菌剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照37.5～75ml：100g的比例，将灰树花菌液接入特定固体培养基中，并于25摄氏度下培养3周，以便获得菌根菌剂，其中，所述特定固体培养基由重量比为7.5～6.5：1.25～1.75：1.25～1.75的草炭、蛭石和珍珠岩均匀混合而成。发明人惊奇地发现，本发明的方法成本低、效率高、简单易行，适于工厂化大批量生产，并且制备获得的菌根菌剂，对板栗植株的侵染效果非常好，且接种于板栗幼苗后，在提高苗木的苗高、地径、地上、地下生物量、净光合速率和叶片中矿质元素N、P、K的含量方面的效果显著，进而能够有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力。

另外，根据本发明上述实施例的制备菌根菌剂的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的一些实施例，所述灰树花菌液与所述特定固体培养基的比例为50ml：100g。由此，菌丝繁殖快、制备获得的菌根菌剂性状优良，对板栗植株的侵染效果更好。

根据本发明的一些实施例，在该特定固体培养基中，所述草炭、蛭石和珍珠岩的重量比为7：1.5：1.5。由此，能够使菌丝繁殖迅速、制备获得的菌根菌剂性状优良，对板栗植株的侵染效果更好。

根据本发明的实施例，每1000g该特定固体培养基中包含25g红糖。这是因为，红糖能够为菌丝提供大量的其繁殖所需的碳源，以及维生素和微量元素，从而能够加速其繁殖。

根据本发明的实施例，所述灰树花菌液是通过以下步骤获得的：将所述灰树花菌进行活化；以及将经过活化的灰树花菌进行液体培养，以便获得所述灰树花菌液。由此，获得的菌液活性非常高，接种于所述特定固体培养基后繁殖迅速，制备获得的菌根菌剂性状优良，对板栗植株的侵染效果好。。

其中，根据本发明的实施例，将灰树花菌进行活化的方法不受特别限制，只要能够有效活化菌种，获得繁殖力优越的菌种即可。根据本发明的一些实施例，通过平板培养实现所述活化。由此，方法简单，易于操作，菌种活性效果好。

根据本发明的一些具体实施例，将经过活化的灰树花菌进行液体培养，进一步包括：取直径0.65cm圆形等质的经过活化的灰树花菌菌片15个，加入装有25ml MMN液体培养基的三角瓶中，之后放入摇床内培养，设置温度25℃，转速140R/min，暗培养12d。由此，培养获得的灰树花菌液活性非常高，接种于所述特定固体培养基后繁殖迅速，制备获得的菌根菌剂性状优良，对板栗植株的侵染效果好。

根据本发明的实施例，通过上述方法制备获得的菌根菌剂，每克菌根菌剂中含有孢子1×10¹¹。由此，培养获得的灰树花菌液活性非常高，接种于所述特定固体培养基后繁殖迅速，制备获得的菌根菌剂性状优良，对板栗植株的侵染效果好。

根据本发明的一个具体示例，本发明的制备菌根菌剂的方法包括以下步骤：

首先，将灰树花进行平板培养活化。

接着，取直径0.65cm圆形等质的经过活化的灰树花菌菌片15个，加入装有25ml MMN液体培养基的三角瓶中，之后放入摇床内培养，设置温度25℃，转速140R/min，暗培养12d，以便获得灰树花菌液。

然后，取50ml灰树花菌液接入装有100g含有草炭：蛭石：珍珠岩=7：1.5：1.5的特定固体培养基以及2.5g红糖的培养瓶中，于25℃下培养三周（21d），以便获得菌根菌剂。

根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种菌根菌剂。根据本发明的实施例，该菌根菌剂是通过前面所述的方法制备获得的。根据本发明的实施例，本发明的菌根菌剂对板栗植株的侵染效果非常好，且接种于板栗幼苗后，在提高苗木的苗高、地径、地上、地下生物量、净光合速率和叶片中矿质元素N、P、K的含量方面的效果显著，进而能够有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力。

根据本发明的再一方面，本发明还提出了前面所述的菌根菌剂，在提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力中的用途。根据本发明的实施例，该用途的实现方法并不受特别限制，只要保证菌根菌剂能够有效侵染板栗植株即可。

进一步，本发明提出了一种提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力的方法。根据本发明的实施例，该方法包括选自下列步骤的至少之一：向所述板栗植株幼苗的培养基质中添加前面所述的本发明的菌根菌剂；以及利用该菌根菌剂接种所述板栗植株。发明人惊奇地发现，利用该方法，采用本发明的菌根菌剂，能够有效地提高板栗植株的苗高、地径、地上、地下生物量、净光合速率和叶片中矿质元素N、P、K的含量方面，进而能够有效提高板栗植株的抗干旱及抗病虫害能力。

其中，需要说明的是，在本文中所采用的术语“培养基质”并不受特别限制。当采用传统方法培养板栗植株幼苗时，该培养基质即为普通土壤；当利用市售的营养土培养板栗植株幼苗时，所述培养基质即为该营养土；当采用无土栽培方法培养板栗植株幼苗时，该培养基质则其所采用的无土的培养基质。由此，无论采用何种培养基质进行板栗植株培养，均可以有效地提高板栗植株的苗高、地径、地上、地下生物量等，进而能够有效提高板栗植株的抗干旱及抗病虫害能力。

根据本发明的实施例，将所述菌根菌剂接种于所述板栗植株根部，优选发达的侧根。根据本发明的一些具体示例，本发明的菌根菌剂尤其适用于板栗幼苗。其中，需要说明的是，用于接种的板栗幼苗，需要有发达的侧根，从而易于菌根菌剂侵染。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

发明人于2011年5月至2012年9月，在河北省唐山市迁西地区，于多种不同地形的板栗林下采集真菌子实体，其中，只采集板栗根系形成的菌根与其菌丝相连的子实体，并将采集到的子实体，于冰盒内低温保存，及时带回实验室，经过多次人工分离、纯化后，得到一种新的板栗外生菌根真菌菌种。该菌种的子实体形态学初步鉴定结果为灰树花，对分离后的菌丝进行分子鉴定的结果进一步证实该与板栗具有良好共生关系的真菌为灰树花。

进一步，发明人在研究确定现阶段仍没有利用灰树花的菌丝制作菌剂并应用于板栗菌根化的报道后，设计进行了多次试验，以便对灰树花人工大量培养的条件和利用灰树花制作菌根菌剂的方法进行探索，以期筛选获得最佳培养条件和菌根菌剂制备方法。具体步骤如下：

1、确定灰树花菌液体培养的最适条件

方法：发明人以生长迅速期的灰树花真菌平板为材料，采用灭菌的打孔器在母菌落上取长势一致直径0.65cm的菌饼，放入装有25ml不含琼脂的MMN液体培养基的三角瓶中，在25℃，140R/min条件下培养进行暗培养。设三角瓶的菌饼接种量分别为5个、10个、15个，每个处理15瓶，定期（3d、6d、9d、12d、15d）测定每个接种量3瓶液体培养的菌丝干重。其中，采用细胞干重法(可参见《现代植物生理学实验指南》，1999，通过参照将其全文并入本文)测定菌液的生物量，将所有菌液过滤，菌丝体用蒸馏水充分洗涤，在常压下100℃干燥，然后用电子天平精确称重，以便获得各实验组获得的菌丝干重。

结果：发明人发现，接种量为15个直径0.65cm的菌饼时获得的菌丝干重，培养12天时菌丝状态最好。由此，发明人确定了灰树花菌液体培养的最佳为接种量15个直径为0.65cm的菌饼，最佳培养时间为12天。

具体地，本实施例确定的灰树花菌液体培养的最适条件为：取直径0.65cm圆形等质的经过活化的灰树花菌菌片15个，加入装有25ml MMN液体培养基的三角瓶中，之后放入摇床内培养，设置温度25℃，转速140R/min，暗培养12d。

2、确定菌根菌剂固体培养的最适条件

方法：于超净工作台内，按照表1中所示的9种处理方法，将前面获得的长势均一，培养效果良好的灰树花菌液，与灭过菌的不同配方的固体培养基（固体培养基配方及各处理的菌液接种量见表1）混合并置于培养瓶内，封口后，于25℃恒温培养箱内，培养三周，然后测定各种配方的培养基质所获得的菌丝化率。

表1

其中，菌丝化率测定方法为：于培养结束后，将培养瓶封口打开，将所有固体基质倒出，接着用电子天秤称量所有固体基质的重量，然后用镊子将己经菌丝化的基质挑取出来，置于电子天秤上进行称量。然后，按照下述公式计算各处理（即各种不同配方的固体培养基）获得的菌丝化率:

菌丝化率 $(\%)=\frac{\mathrm{Wt}}{W}\×100\%,$

其中：Wt表示己经菌丝化的基质重量；W表示固体基质总重。

结果：发明人发现处理5获得的菌丝化率最高。由此，发明人确定了菌根菌剂固体培养中的最佳固体培养基为草炭：蛭石：珍珠岩=7：1.5：1.5，菌液最佳接种量即灰树花菌液与固体培养基的最佳比例为50ml：100g。

具体地，本实施例确定的灰树花菌根菌剂固体培养的最适条件：将50ml灰树花菌液接入装有100g含有草炭：蛭石：珍珠岩=7：1.5：1.5的特定固体培养基以及2.5g红糖的培养瓶中，于25℃下培养三周（21d），以便获得菌根菌剂。

实施例2

本实施例以几种市售的菌剂（绵毛丝膜菌、红绒盖牛肝菌和美味牛肝菌）作为对照，按照以下步骤验证实施例1制备获得的本发明的菌根菌剂的实际应用效果：

首先，将各种菌剂接种于当年生的板栗实生苗的发达侧根处，然后定期调查苗木的生长指标并测定其叶片净光合速率，调查菌根侵染率、苗木生物量指标及叶片矿质元素含量，进而通过数据比较和分析，以便验证本发明制备获得的菌根菌剂的实际应用效果。

具体地：

1．侵染率评价

方法：

接种1个月后，用番红-淡绿染色法测定接种不同菌剂板栗幼苗的侵染率。具体地，用新鲜的胡萝卜夹住菌根，制作徒手切片，切下的材料粘在切片上，置于2%番红水溶液中，室温条件下染色24h，之后于37℃条件下染色2h，用蒸馏水清洗切片，之后用96%酒精分化30s，再滴入1%淡绿水溶液数滴染色5min。染色结束后，根部细胞核将被染成紫红色或鲜红，菌丝将被染成蓝绿色或绿色。然后，统计各板栗幼苗的总根数以及含有菌丝的根数，并按照以下公式计算侵染率：侵染率=侵染根数/全部根数×100%。

结果：

实施例1制备获得的灰树花菌根菌剂接种板栗苗后侵染率为：90.22%。通过对比可以得出本发明的灰树花菌根菌剂的侵染效果显著优于其他对照的侵染结果，将灰树花的侵染结果与现有研究中其他学者在相同条件下回接其相应的菌剂的研究结果进行对比，得出灰树花的侵染率不但高于石青莲论文“板栗菌根化容器育苗技术研究”（可参见：石青莲，板栗菌根化容器育苗技术研究[D].硕士学位论文.2004，北京林业大学，通过参照将其全文并入本文）和张波论文“板栗菌根化容器嫁接苗培育技术研究”（可参见：张波，板栗菌根化容器嫁接苗培育技术研究[D].硕士学位论文.2007，北京林业大学，通过参照将其全文并入本文）中公开的实验中常见的单一菌根菌侵染结果，而且高于牛晓丹论文“板栗菌根菌剂制作技术与芽苗嫁接成活机理研究”（牛晓丹，板栗菌根菌剂制作技术与芽苗嫁接成活机理研究[D].硕士学位论文.2009，北京林业大学，通过参照将其全文并入本文）中公开的实验中的绵毛丝膜菌和红绒盖牛肝菌混合菌剂的侵染结果，可见菌灰树花侵染板栗幼苗的能力非常强。

表2不同菌根真菌的侵染率统计结果

2．苗木质量对比

方法：

分别于2012年5月6日、8月16日和10月10日分三次定期，使用直尺测量苗木苗高，使用游标卡尺测量苗木地径，以便获得苗木的苗高地径动态数据。并于2012年10月10日测定苗木的地上和地下生物量：不同处理的板栗苗取样后清洗，烘干至恒重，用千分之一天平（德国赛多利斯（Sartorius），型号：BS323S）测量生物量。其中，地上生物量取样标准为：各组均选取5株具有代表性的板栗苗的地上部分，地下生物量取样标准为：各组均选取5株具有代表性的板栗苗的地下部分。

结果：

通过比较下表3和表4中的数值，可以得出接种灰树花后苗木的苗高和地径在不同生长时期都显著高于CK，同时发现，接种灰树花后的苗木的生长效果均好于其他常见菌根菌侵染的苗木。

第三次调查数据（2012年10月10日），接种灰树花的苗高与CK比较，提高了40.5%，接种灰树花的地径与CK比较，提高了27.6%。

表3板栗幼苗苗高动态调查结果

	灰树花	绵毛丝膜菌	红绒盖牛肝菌	CK（不接菌剂）
					苗高1（cm）	25.77	23.80	24.00	20.80
苗高2（cm）	38.3	34.78	36.22	29.91
					苗高3（cm）	46.74	39.38	41.74	33.26

表4板栗幼苗地径动态调查结果

	灰树花	绵毛丝膜菌	红绒盖牛肝菌	CK（不接菌剂）
					地径1（cm）	3.24	3.07	3.04	2.53
地径2（cm）	4.77	4.23	4.28	3.63
					地径3（cm）	5.78	5.03	5.23	4.53

通过比较下表5中的数值，可以得出接种灰树花后的苗木生物量显著高于CK，同时发现，接种灰树花后的苗木的生物量均明显大于其他常见菌根菌侵染的苗木。

接种灰树花的地上生物量与CK比较，提高了51.8%，接种灰树花的地下生物量与CK比较，提高了49.2%。总生物量提高了50.53%。

表5板栗幼苗生物量调查结果

	灰树花	绵毛丝膜菌	红绒盖牛肝菌	CK（无菌）
					地下（g）	6.819	5.419	6.213	4.569
地上（g）	7.034	5.428	6.323	4.634

3.净光合速率及叶片中矿质元素含量的对比

方法：

3.1光合测定方法

于2012年7月6日，从接种菌根菌和未接菌的板栗幼苗中分别选出具有代表性的植株和叶片，使用LI-6400便携式光合测量系统（美国LI-COR公司生产），天气晴朗时，测定叶片净光和速率。

3.2叶片中矿质元素含量测定方法

3.2.1样品制备

新鲜叶片取样后，于烘箱内烘干，粉碎机粉碎至粉末状，秤取粉末0.2g，加入消煮管，加入浓硫酸5ml，于高温炉内加热煮沸。调解消煮锅80v，有白烟从样品中冒出后，再调至150v，每10min，加入2%的H₂O₂溶液10滴，一直持续到溶液透明。取出消煮管，冷却后，加入到50ml容量瓶内，蒸馏水定容，以便获得待测液，备用。

3.2.2全磷的测定

5μg·g^-1磷(P)标准溶液：吸取10ml100μg·g^-1标准溶液于200ml容量瓶中，用水稀释至标度。

测定试剂：2mol/L NaOH溶液，0.5mol/LH₂SO₄溶液，0.2%2，4-二硝基酚指示剂，铝锑储存液（1%钼氨铵和2.8mol/L H₂SO₄混合溶液），铝锑抗显色剂需要随用随配，在铝锑储存液100ml中加入抗坏血酸1.5g，5μg·g^-1磷(P)标准溶液。

测定仪器：分光光度计；容量瓶(50ml)。

工作曲线的绘制：分别将0、1、2、3、4、5、6ml的磷(p)标准溶液加入到一系列50mL的容量瓶中，其它条件同待测液测定时一样，得出了磷标准系列溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μg·g^-1，以0μg·g^-1磷系列溶液对应吸收值为0，测定各标准系列溶液得吸收值，绘制工作曲线。

测定方法：将5ml待测液加入到容量瓶中（50ml），加水至20ml左右，加入2，4-二硝基酚指示剂1滴，用2mol/L NaOH溶液调到黄色，0.5mol/L H₂SO₄溶液调到淡黄色,加入铝锑抗试剂5ml，摇匀，蒸馏水定容，翻转摇匀。30min之后，开始比色，选波长700nm，空白溶液吸收值调零，测定样品吸收值。

结果计算:

全磷(p，%)=c×V×Ts/(m×10⁶)×100%

式中：C——吸收值读数，V——样品液体积（50ml），Ts=定容体积(m1)/测定时吸取体积(m1)，10⁶——1g=1μg×10⁶，m——烘干样质量（g）。

3.2.3全钾的测定

测试试剂——100μg·g^-1钾(K)标准溶液：取经105℃烘干的KCl0.1907g溶于水中，之后加入浓盐酸10ml，最后用蒸馏水定容至1L。

主要仪器：火焰光度计，容量瓶(50ml)

工作曲线的绘制：分别将0、1、2.5、5、10、20、30ml的钾标准溶液加入到一系列50mL的容量瓶中，其它条件同待测液测定时一样，得到0.2、5、10、20μg·g^-1标准溶液，以0μg·g^-1钾系列溶液对检流计值为0，然后直接用消煮待测液在火焰光度计上得到钾的检流计读数。

结果计算：全钾(K，%)=c×V×Ts/(m×10⁶)×100%。

式中：c——检流计读数，V——样品液体积（50ml），Ts=定容体积(m1)/测定时吸取体积(m1)，10⁶——1g=1μg×10⁶，m——烘干样质量（g）。

3.2.4全氮的测定

测定试剂：2%硼酸指示剂溶液，0.0200mol/L的Na₂B₄O₇标准溶液，lmol/L的HCl溶液，0.02mol/L的盐酸标准溶液，甲基红-嗅甲酚率混合指示剂，40%(m/V)NaOH溶液；

主要仪器：定氮蒸馏装置，锥形瓶(250ml)

蒸馏方法：将15ml的2%硼酸指示剂溶液加入到250ml的锥形瓶内，置于定氮蒸馏装置冷凝器的承接管下，调解过口位置，大约在硼酸溶液上方3cm左右。在蒸馏装置上安装已装有消煮液的凯式瓶，打开泠凝水，之后在三通管加入40%NaOH溶液30ml，并将蒸汽夹打开，蒸馏速度控制在每分钟8ml，待锥形瓶溶液至1/4左右瓶时，在泠凝口使用pH试纸蒸馏液，观察是否出现碱性检测结果，如果没有，表明蒸馏结束，否则继续。将硼酸溶液中的氨吸收，通过滴定加入0.02mol/L盐酸标准溶液，颜色由蓝色到紫红色，此时记为终点，记录滴定的酸标准液的体积(V)。

结果计算：全氮(N，%)=(V-V₀)×c×0.014/m×100%。

式中：V——滴定样品用去盐酸标准溶液的体积（ml）；V₀——滴定试剂空白试验用去盐酸标准溶液的体积（ml）；C——盐酸标准溶液的浓度（mol/l）；m——烘干样品质量（g）；0.014——氮原子的摩尔质量（g/m mol）。

结果：

通过比较下表6中的数值，可以得出接种灰树花后的净光合速率显著高于CK，同时发现，接种灰树花后的苗木的净光合速率均明显大于其他常见菌根菌侵染的苗木。接种灰树花的净光合速率与CK比较，提高了102.8%。

表6净光合速率测定结果

	灰树花	绵毛丝膜菌	红绒盖牛肝菌	CK（不接菌）
					P（n）μmol·m-2·s-1	5.09	3.53	4.06	2.51

通过比较表7中的数值，可以得出接种灰树花后的N、P、K含量显著高于CK，同时发现，接种灰树花后苗木的叶片N、P、K含量均明显大于其他常见菌根菌侵染苗木的叶片。接种灰树花叶片中的氮元素含量与CK比较，增加吸收了61.7%，叶片中的磷元素含量与CK比较，增加吸收了57.9%。叶片中的钾元素含量与CK比较，增加吸收了43.1%。

表7叶片矿质元素含量

	灰树花	绵毛丝膜菌	红绒盖牛肝菌	CK（不接菌）
					N（g）	2.845	2.18	2.58	1.759
P（g）	0.1986	0.1772	0.1633	0.1258
					K（g）	0.9541	0.6854	0.8116	0.6668

综合上述实验的结果可知，本发明的灰树花菌根菌剂接种板栗幼苗后，可以显著的提高苗木的苗高、地径、地上、地下生物量、净光合速率和叶片中矿质元素N、P、K的含量，与常见的菌根菌（绵毛丝膜菌、红绒盖牛肝菌和美味牛肝菌）相比较，其侵染效果和上述各指标均超过常见菌，因此可以认为本发明利用灰树花制成的菌根菌剂，应用于板栗苗木菌根化，实际效果好于其他常见菌剂以及对照，可进一步大规模应用于板栗苗木菌根化培育的生产实践。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种制备菌根菌剂的方法，其特征在于，包括：

按照37.5～75ml：100g的比例，将灰树花菌液接入特定固体培养基中，并于25摄氏度下培养3周，以便获得菌根菌剂，

其中，

所述特定固体培养基由重量比为7.5～6.5：1.25～1.75：1.25～1.75的草炭、蛭石和珍珠岩均匀混合而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灰树花菌液与所述特定固体培养基的比例为50ml：100g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述草炭、蛭石和珍珠岩的重量比为7：1.5：1.5，

任选地，每1000g所述特定固体培养基中包含25g红糖。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灰树花菌液是通过以下步骤获得的：

将所述灰树花菌进行活化；以及

将经过活化的灰树花菌进行液体培养，以便获得所述灰树花菌液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过平板培养实现所述活化。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将经过活化的灰树花菌进行液体培养，进一步包括：

取直径0.65cm圆形等质的经过活化的灰树花菌菌片15个，加入装有25ml MMN液体培养基的三角瓶中，之后放入摇床内培养，设置温度25℃，转速140R/min，暗培养12d。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每克所述菌根菌剂中含有孢子1×10¹¹。

8.一种菌根菌剂，其是通过权利要求1-7任一项所述的方法制备获得的。

9.权利要求8所述的菌根菌剂，在提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力中的用途。

10.一种提高板栗植株抗干旱及抗病虫害能力的方法，其特征在于，包括选自下列步骤的至少之一：

向所述板栗植株幼苗的培养基质中添加权利要求8所述的菌根菌剂；以及

利用权利要求8所述的菌根菌剂接种所述板栗植株，

任选地，将所述菌根菌剂接种于所述板栗植株根部。