CN109439582A - 亳菊内生巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亳菊内生巨大芽孢杆菌及其应用。该亳菊内生巨大芽孢杆菌为亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7，保藏编号为GDMCC No:60467。该菌株不仅能够解磷解钾分泌生长素，还能抑制病原菌生长，分解纤维素，并且具有很强的抗氧化活性。

Description

亳菊内生巨大芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种亳菊内生巨大芽孢杆菌及其应用。
背景技术
亳菊(Chrysanthemum morifolium cv.BoJu)为重要药用植物，菊科菊属，安徽道地药材，为我国传统中药材和保健茶饮。近年来，有不少地区因为连作、滥用化学农药和肥料、导致土壤基础肥力较低，养分不平衡，菊花在生长过程中表现出生长势下降、病虫害加剧进而导致产量和品质下降的现象，严重制约了药用菊花产业的发展。加之其资源过度开发，生态环境遭到破坏，我国第一大药都亳州地区药材产量锐减，亳州的道地药材如亳菊、亳芍等也受到影响。
内生菌(Endophyte)是一类在其生命周期某一阶段定殖于宿主植物内部，而不引起宿主植物感病的一类微生物。植物内生菌对植物生长的影响分别为促进、抑制、无作用。内生菌贯穿于植物的各个发育阶段，对药用植物的萌发、生长、代谢、应对胁迫、成熟与凋亡等阶段都产生重要影响，更是对药用植物品质的评价。内生菌是植物生长发育过程中很重要的部分，其生物学功能对植物的生长代谢与生物胁迫等方面产生极大的影响。近年来，因内生菌能够有效促进植物的成长和代谢而引起人们极大关注。特别是关于内生菌的共生理论，使内生菌对植物的应用迅速发展。
但是，目前还未有从亳菊中发现生物功能良好的内生巨大芽孢杆菌的报道。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BN7，该菌株不仅能够解磷解钾分泌生长素，还能抑制病原菌生长，分解纤维素，并且具有很强的抗氧化活性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7，保藏编号为 GDMCC No:60467。
本发明亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7的分子分类地位确定。本发明的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7的16S rRNA 基因序列如SEQID No.3所示。
本发明的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7与现有巨大芽孢杆菌相比：不仅具有解磷能力、解钾能力、产生长素能力，其中产生长素(IAA) 浓度约为对照组标准品的3倍；而且，还具有纤维素降解功能、很强的抗氧化活性；同时，还对玉米弯孢菌、黄瓜枯萎菌、小麦赤霉菌、串珠镰刀菌、茶叶轮斑菌、瓜炭疽具有抑制作用。
本发明的另一目的是提供上述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7作为拮抗菌在防治作物病害中的应用。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由玉米弯孢菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由黄瓜枯萎菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由小麦赤霉菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由串珠镰刀菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由茶叶轮斑菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由瓜炭疽感染引发的病害。
本发明的再一目的是提供一种上述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BN7作为纤维素降解菌在分解废弃纤维中的应用。
本发明的还一目的是提供一种上述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BN7作为发酵菌株在获得抗氧化剂中的应用。
本发明的又一目的是提供一种生物制剂，所述的生物制剂以上述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7和/或其代谢物为活性成分。
本发明提供的菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码 510075；本发明菌株的信息为：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7；保藏号为GDMCC No:60467；保藏日期为2018年10月29日。
附图说明
图1为实施例1中对照病原菌及其分别与BN7菌株对峙培养生长情况图；
图2为实施例1中菌株BN7过滤除菌发酵液对病原真菌的抑制作用图；
图3为实施例1中BN7菌株发酵液对病原菌的抑菌率图；
图4为实施例2中BN7解磷能力测定结果图；
图5为实施例2中BN7解钾能力测定结果图；
图6为实施例2中BN7分泌生长素IAA能力测定结果图；
图7为实施例3中BN7菌株在刚果红培养基上的水解效果；
图8为实施例3中纤维素酶活的测定结果图；
图9为实施例4中BN7对菊花苗期生长情况的影响图；
图10为实施例5中BN7形态图；
图11为实施例5中构建的系统发育树。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、内生菌BN7拮抗植物病原菌研究
本实施例利用从亳菊组织中分离出的BN7作为试验菌株，与6株导致作物严重病害的常见植物病原菌对峙培养，测其抑菌率，然后再利用BN7无菌发酵液与常见植物病原菌共培养，检测具有抑菌性的拮抗菌株的无菌发酵液是否有相同的抑菌效果。
1材料：
1.1供试菌株
内生菌BN7由阜阳师范学院微生物实验室保存。
1.2供试植物病原菌株
实验选用的供试植物病原菌，均为农业生产过程中常见的导致农作物严重减产的6种病原菌株，分别为玉米弯孢菌(Curvularia lunata)、黄瓜枯萎菌 (Fusariumoxysporum)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、串珠镰刀菌 (Fusariummoniliforme)、茶叶轮斑菌(Pestalotiopsis theae)、瓜炭疽 (Colletotrichumlagenarium)，保存于阜阳师范学院微生物实验室。
1.3培养基
(1)固体培养基：LB培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)；
(2)液体培养基：LB液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)；
2方法
2.1菌株活化
将从亳菊中分离出的内生菌BN7以及6种病原菌在LB和PDA平板培养基上进行活化。
2.2平板对峙培养法
待亳菊内生菌BN7及植物病原菌活化好后，用无菌打孔器(Φ5mm)在病原菌和亳菊内生菌BN7株边缘等距处取菌饼，再将它们对称放置于距平板中心15mm处，设置3个重复，以仅在中心接种病原菌的平板为对照，28℃培养3～ 5d，同时每天观察实验组和对照组病原菌生长速度，菌落之间是否有抑菌带出现及菌落边缘菌丝是否有稀疏和萎缩畸形等现象发生。待病原菌的菌落不再扩大，分别测量处理组和对照组病原菌的半径，并计算抑菌率。抑菌率＝[菌落半径 (CK)-菌落半径(处理)]/[菌落半径(CK)-2.5mm]×100％。
2.3 BN7菌株发酵液的抑菌效果
BN7发酵液制备：在超净工作台中取内生菌株的单菌落接种于200mL LB 液体培养基中，以37℃，160rpm振荡培养至对数期，制成一级发酵种子。将一级发酵种子以10％的接种量转接于200ml LB培养基中，以37℃，160rpm发酵 48h，6000rpm离心10min，收集上清液并分为两份，一份经微孔滤膜过滤器(0.20 μm)过滤除菌，另一份经高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，获得细菌发酵液。 2.4BN7发酵液平板涂布抑菌
(1)发酵液浓缩：取100ml无菌发酵产物经超滤系统浓缩，得到20ml浓缩液。
(2)含药平板的制备：分别取200μL过滤除菌发酵液和高压蒸汽灭菌发酵液涂布于PDA平板上，即为含药平板。
(3)菌丝抑制生长法：用直径为5mm的打孔器分别在在病原菌边缘等距位置打成大小一致的菌碟，挑取菌碟，分别接到含药平板中心，对照组用同样的方法将病原菌分别接种到的不含浓缩液的PDA平板中心，每组3个重复，于 28℃培养3d。然后分别测量处理组和对照组病原菌的半径，并计算抑菌率。
3结果与分析
3.1 BN7平板对峙抑制病原菌
对内生菌BN7抑制植物病原菌的初步结果显示抑菌性较强且具有广谱抑性。具体如图：图1左图为对照组病原菌的生长情况，图1右图是BN7菌株拮抗内生菌与病原菌的对峙情况。左图中，A：Curvularia lunata，B：Fusarium oxysporum，C：Fusarium graminearum，D：Fusarium moniliforme，E：Pestalotiopsis theae，F：Colletotrichum lagenarium。右图中，A：Curvularia lunata和BN7，B： Fusarium oxysporum和BN7，C：Fusariumgraminearum和BN7，D：Fusarium moniliforme和BN7，E：Pestalotiopsis theae和BN7，F：Colletotrichum lagenarium 和BN7。
3.2 BN7发酵产物的抑菌作用检测
通过对BN7发酵液微孔滤膜过滤除菌和高温蒸汽灭菌两种方式检测其对植物病原菌的抑菌效果，从而发现BN7抑菌活性强且具有广谱性的内生菌株。结果参见图2、图3。图2左图对照组病原菌的生长情况，图2右图菌株BN7过滤除菌发酵液对病原真菌的抑制作用。左图中，A：Curvularia lunata，B：Fusarium oxysporum，C：Fusarium graminearum，D：Fusarium moniliforme，E：Pestalotiopsis theae，F：Colletotrichum lagenarium。右图中，A：Curvularia lunata和BN7 fermented liquid，B：Fusarium oxysporum和BN7fermented liquid，C：Fusarium graminearum和BN7 fermented liquid，D：Fusariummoniliforme和BN7 fermented liquid，E：Pestalotiopsis theae和BN7 fermentedliquid，F：Colletotrichum lagenarium and BN7 fermented liquid。
4小结与讨论
本实施例对BN7发酵液通过微孔滤膜过滤除菌和高温蒸汽灭菌两种方式检测对植物病原菌的抑菌效果。过滤除菌与高温灭菌这两种方式的抑菌效果大体一致，一部分是过滤除菌的抑制作用较强，另一部分则是是高温蒸汽灭菌抑菌效果更好。BN7菌株发酵液对黄瓜枯萎菌、茶叶轮斑菌的抑菌率在50％左右，整体抑菌率在30％以上。
实施例2、BN7菌株促生功能研究
本实施例通过BN7溶磷、解钾及产植物生长素实验进行研究。
2.1材料
2.1.1供试菌株
内生菌BN7由阜阳师范学院微生物实验室提供。
2.1.2培养基
(1)菌株纯化常用培养基
LB培养基、LB液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)；
(2)解磷效果测定培养基
有机磷固体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，CaCO3 5，卵磷脂2，琼脂20，pH为7.0～7.5。
有机磷液体培养基(g/L)：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5g，卵磷脂2g，pH为7.0～7.5。(实验时用新鲜蛋黄液代替卵磷脂，每50mL加入新鲜蛋黄液3mL，蛋黄液与0.9％的生理盐水等比例配制。)
无机磷固体(液体)培养基(g/L)：葡萄糖10，(NH4)2SO4 0.5，NaCl 0.3，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，Ca3(PO4)2 5，琼脂20，pH为7.0～7.5，不加琼脂即为液体培养基。
(3)解钾效果测定培养基
解钾菌分离培养基(g/L)：蔗糖0.75，(NH4)2S04 0.15，Na2HP04O.30， MgS04 0.075，钾长石粉10，琼脂20，pH为7.0～7.5。
解钾液体发酵培养基(g/L)：蔗糖10，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO3 1.0， (NH4)2SO41.0，NaCl 0.1，酵母膏0.5，Na2HPO4 2.0，钾长石粉10，pH为7.4。
(4)分泌生长素IAA能力测定培养基
含有L-色氨酸的液体R2A培养基(g/L)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，酪蛋白氨基酸0.5，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，K2HPO4 0.3， MgSO4 7H2O 0.05，L-色氨酸0.5，pH为7.2±0.2。
2.1.3主要试剂
(1)解磷效果测定所需试剂
酒石酸锑钾溶液(0.5％)：称取0.5g酒石酸锑钾固体加入到100mL蒸馏水中，搅拌，混匀即可。
钼锑抗贮存液：浓硫酸153mL缓慢地倒入置有约400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌，冷却。10g钼酸铵溶解于约60℃的300mL蒸馏水中，冷却。然后将浓硫酸溶液倒入钼酸铵溶液中，再加入100mL0.5％酒石酸锑钾(KSB， C4H4O6·1/2H2O)溶液，最后用蒸馏水定容至1L，避光保存。
钼锑抗显色剂：1.5g抗坏血酸(C6H8O6，左旋)溶于100mL钼锑抗贮存液中。
(2)解钾效果测定所需试剂
四苯硼酸钠溶液：取15g溶于960mL水中，加4mL NaOH溶液(400g/L) 和20mL MgCl2溶液(100g/L)，搅拌15min，静置24小时后过滤。
(3)生长素测定所需试剂
Salkowski比色液：取50mL 35％HClO4与1mL 0.5mol/L FeCl3混合。
2.2方法
2.2.1 BN7解磷能力测定
(1)平板定性测定
将单菌落分别点种在解磷菌分离培养基上，37℃培养3d。观察透明圈产生的情况，测量并记录解磷透明圈直径(D)。
(2)定量测定可溶性磷的含量
采用钼锑抗比色法，测定BN7培养液中水溶性磷含量。用可见光分光光度计在波长720nm处测定吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。
磷标准曲线绘制：在容量瓶中分别加入相应体积的100mg/L的标准磷溶液，加2滴2，6一二硝基苯酚作指示剂，用稀硫酸和10％的NaOH溶液调节pH值，加铝锑抗显色剂5mL，定容至刻度，使标准磷浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、 0.8和1.0mg/L，摇匀，在室温下(25℃左右)反应30min后用紫外分光光度计在 720nm处比色，根据结果绘制标准曲线。
培养液中可溶磷含量的测定：将BN7接种到50mL有机磷(或无机磷)液体培养基中，以不接菌作对照，摇床转速为150r/min，28℃培养3d。培养液转移至无菌的50mL离心管中，采用数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎，破碎20min，使之释放出细胞内的有效磷，以4000r/min的转速离心20min后取2.5mL 上清液于50mL容量瓶中加2滴2，6-二硝基苯酚作指示剂，加一滴稀硫酸至反应液为无色，加钼锑抗显色剂5mL，定容，反应。用紫外分光光度计测定上清液于720nm处的OD值。根据标准曲线得出上清液中的有效磷含量。
2.2.2 BN7解钾能力测定
(1)平板定性测定
将BN7菌株接种到以钾长石为唯一钾源的解钾菌分离培养基上，放置于 37℃恒温培养箱中培养数天，且每天观察。能生长视为有解钾活性，称其相应的菌株为解钾菌。
(2)定量测定可溶性钾的含量
采用四苯硼钠法，进行供试菌株培养液中水溶性钾含量的测定，确定供试菌株的解钾能力。
钾标准曲线的绘制：分别吸取氯化钾标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL 于25mL容量瓶中，加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀，用移液管快速准确加入1mL四苯硼钠溶液，立即摇匀，放置15min后再次摇匀，于420nm波长进行比色，相应的标准溶液浓度为0、5、10、15、20、25、30mg/L氯化钾。以透光度为横坐标，钾浓度为纵坐标，绘成标准曲线。
对BN7进行液体培养：在250mL三角瓶中装50mL LB液体培养液，用接种环将KSB从斜面接种至培养液中过夜摇床培养作为种子液，将种子液按4％接种量接种到解钾液体发酵培养基，每菌株接种3瓶，设置一个E.coli作为阴性对照，每个处理设3次重复，设加等量灭活种子液的对照处理，于28℃、 160r/min培养7d。10000×g离心20min，取上清液，用四苯硼钠法测定钾含量，以高于对照钾含量为标准菌株进行复筛。
2.2.3 BN7分泌植物生长素能力测定
(1)定性测定植物生长素的分泌
将BN7菌株接种于50mL液体R2A培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复将三角瓶置于28℃摇床，转速为180r/min，培养4d后，取其菌悬液1mL滴置于试管中，同时加1mL比色液(Salkowski比色液:50mL 35％HClO4+1mL 0.5 mol/L FeCl3)，只在比色液中加入1mL 50mg/L的植物生长激素(IAA)作为对照将试管置室温下避光放置30min后观察其颜色变化颜色变粉红者为阳性，表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。
(2)定量测定植物生长素的分泌
对能够分泌IAA的BN7进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000r/min离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，采用分光光度法测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积菌悬液中细菌分泌IAA的量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备，IAA梯度稀释浓度为：0、2.5、5、 7.5、10、12.5、15、17.5mg/L。
2.3结果与分析
2.3.1 BN7解磷能力测定
结果参见图4及表1。
表1、BN7解磷能力测定
测定BN7培养液中水溶性磷含量。用紫外分光光度计在波长720nm处测定的吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。从解磷培养基平板来看，菌株BN7在无机磷和有机磷培养基平板上都呈现出明显的解磷圈，从而初步判断菌株BN7 具有一定的解磷能力；结果见图4(有机磷降解菌筛选平板见左图与无机磷降解菌株筛选平板见右图)。进而通过进一步的液体培养，定量分析BN7的解磷能力，发现整体上BN7对有机磷的溶解效果更好，结果见表1。
2.3.2 BN7解钾能力测定
表2、BN7解钾能力测定
菌株编号 平均OD值 钾含量mg/L
BN7 2.791 32.03
CK 0.834 9.66
将BN7接种到发酵培养基上，测定释钾效能，发现对照组大肠杆菌未见其生长，而所BN7菌株具有一定的分解钾长石的能力，说明具有解钾菌的特性；结果见图5(钾长石降解菌株平板依次为对照即见左图，BN7见右图)。从表中有效钾含量的数据看出BN7株解钾能力良好，而接种大肠杆菌的对照组为9.66 mg/L；结果见表2。
2.3.3 BN7分泌生长素IAA能力测定
表3、BN7分泌生长素的测定
菌株组别 颜色反应情况 IAA分泌量mg/L
BN7 深粉红 164.39
对照组 粉红 48.49
阴性对照组 白色 0.00
Salkowski比色法是通过氧化反应显色和比色反应分别对菌体发酵液中生长素IAA进行定性、定量测定。测定结果发现BN7具有分泌生长素IAA的能力，结果见图6。当颜色变粉红表示能够分泌IAA，颜色越深表示分泌能力越强，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。由实验结果可知菌株BN7分泌植物生长素IAA能力最强达164.39mg/L，结果见表3。
2.4小结与讨论
本实施例发现BN7菌株还具有解磷、解钾、分泌植物生长素等功能特性。解磷、解钾菌不仅可以活化作物根际土壤中被固定的磷素和钾素，菌种在植物根际繁殖代谢过程中还能分泌大量促生因子，提高根系活力。
实施例3、BN7降解纤维素、抗氧化功能研究
本实施例主要研究具有抑菌、促生效果的BN7降解纤维素和抗氧化能力。纤维素的资源化有助于解决能源危机，是当前研究的热点，利用微生物来处理纤维素是一种极为重要的手段，可减轻环境污染和能源再利用。药用植物是天然抗氧化物质的重要宝库，而植物内生菌能够产生与寄主植物相同或相似的活性代谢产物，这将给新物质的发现和利用通过了重要途径。
3.1材料
3.1.1供试菌株
将具有一定抑菌、促生功能的亳菊内生菌株BN7作为实验材料。
3.1.2培养基
(1)菌株纯化常用培养基
LB培养基、LB液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)；
(2)降解纤维素酶筛选培养基
羧甲基纤维素钠培养基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.1，KH2PO4 0.5，CaCl2 0.1， K2HPO42，CMC-Na 10，(NH4)2SO4 2，琼脂18，pH 7.0～7.4；
羧甲基纤维素酶活(CMCase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠1.5，CMC-Na 10，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0；
滤纸酶活(FPase)检测培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，氯化钠1.5，新华滤纸0.05，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.0。
3.1.3主要试剂
(1)纤维素酶活测定所需试剂
刚果红溶液(1mg/mL)：称取1g刚果红定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
氯化钠溶液(1mol/L)：称取58.5g氯化钠定容至1000mL，4℃冰箱保存备用。
缓冲溶液：配取50mL缓冲溶液以0.2mol/L醋酸钠溶液与0.2mol/L醋酸溶液分别量取35.2mL和14.8mL。
DNS试剂：称取6.3g3,5-二硝基水杨酸，21.0gNaOH于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解，以及500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，再加入5g 苯酚和5g无水亚硫酸钠，最后定容至1000mL，装入棕色试剂瓶中，保存一星期稳定后备用。
羧甲基纤维素钠底物溶液(0.5％)：5g羧甲基纤维素钠溶于1000mL缓冲溶液中，备用。
滤纸底物溶液：在2mL缓冲溶液中加入0.03g滤纸。
(2)抗氧化测定所需试剂
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)母液：精确称取0.00197gDPPH粉末，用无水乙醇溶解，定容至50mL容量瓶中，配制成DPPH母液，4℃避光保存，备用。
3.2实验方法
3.2.1内生菌株纤维素降解能力测定
(1)平板定性测定
将单菌落分别点种在羧甲基纤维素钠培养基上，37℃培养3d。用1mg/mL 刚果红染色15min，倾去染液，再加入lmol/L的氯化钠溶液漂洗，15min后倒掉氯化钠溶液，测透明圈的直径与菌落直径，通过透明圈直径与菌落直径比值的大小比较菌株纤维素降解能力的强弱。
(2)纤维素酶活的测定
DNS法测定葡萄糖吸光值，以OD540为横坐标、葡萄糖量(mg/mL)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y＝0.1776x+0.0056，R2＝0.9985。将抑菌率较高的菌株接种CMCase检测培养基及FPase检测培养基，于28℃、160 r/min分别振荡培养1、2、3、4、5、6、7d，5000r/min离心10min，取上清液分别检测CMC酶活及FPase酶活。酶活力单位的定义：以每毫升发酵上清液酶促反应30min释放1μg葡萄糖的量为一个酶活单位(U)。
CMCase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 1％CMC-Na溶液(以0.2mol/L pH 4.8的乙酸缓冲液配制)中，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，充分混匀后50℃酶促反应30min，取出后迅速加入DNS试剂3mL，置于沸水浴显色10min，流水冷却至室温，再用去离子水定容至25mL，摇匀，用对照管调零，测定540nm吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的量。
FPase测定：将1mL发酵上清液加入1mL 0.2mol/L pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并加入新华滤纸条(6cm×1cm)，滤纸条浸泡于液体中混匀，50℃酶促反应30min，以沸水灭活10min的发酵上清液为对照，DNS法测定还原糖生成量。
3.2.2 BN7抗氧化能力测定
(1)BN7株发酵产物的制备
摇瓶发酵法：取BN7菌株接种于100ml液体LB培养基中，以37℃，160rpm 振荡培养7d，于6000rpm离心10min，收集上清液，再经细菌过滤器(0.20μm) 过滤除菌，得无菌发酵产物。
(2)DPPH标准曲线的绘制
精确称取DPPH粉末0.00197g，无水乙醇溶解并定容至100mL，配制成 DPPH母液(0.05moL/L)，4℃避光保存备用。依次精确量取0.4、0.8、1.2、 1.6、2.0、2.4、3.2、4.0mL的DPPH母液，分别加无水乙醇至4.00mL，测517 nm处吸光值，以无水乙醇作为空白对照，绘制标准曲线图，得回归方程 y＝9.2956x+0.0043，R2＝0.9996，其中x为DPPH浓度，y为吸光值。
(3)自由基清除率测定
向2mL DPPH母液中加入1mL无菌发酵液和2mL无水乙醇，混匀，25℃水浴30min，以0.5mg/mL Vc为阳性对照测OD517。自由基清除率按以下公式计算：自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％，式中，A1是发酵液或Vc的吸光值，A2是背景溶液(发酵液或Vc)不加DPPH的吸光值，A3是空白对照(去离子水代替发酵液或Vc)的吸光值。
3.3结果与分析
3.3.1 BN7纤维素降解能力测定
(1)平板定性测定
表4纤维素降解菌透明圈直径与菌落直径比值
菌落编号 透明圈直径/菌落直径
BN7 2.17±0.582
BN7可在CMC-Na培养基上生长，经刚果红染色后产生明显的纤维素降解圈，结果见图7，培养4d后降解圈直径与菌落直径的比值见表4。
(2)纤维素酶活的测定
将菌株BN7在CMCase和FPase检测培养基中连续发酵培养1周，根据葡萄糖标准曲线计算发酵上清液的还原糖生成量并计算CMCase和FPase。结果见图8，菌株BN7发酵液上清的CMCase和FPase均呈先升后降的趋势，CMC 酶活在第4～6d在130.37U/mL以上，FPase在第3d达到最高为79.86U/mL。
表5、BN7菌株发酵液清除DPPH能力的测定
菌株编号 DPPH自由基清除率(％)
BN7 82.13
Vc 93.53
采用DPPH自由基清除定量检测的方法，样品与Vc浓度均为2mg/ml，以具有抑菌活性的亳菊内生菌株BN7的发酵液作为待测样品，通过DPPH法测其抗氧化活性，结果见表5。从表可以看出，对照组Vc对DPPH自由基的清除率为93.5％，BN7对DPPH自由基的清除率超过80％，显示了较强的抗氧化活性。 3.4小结与讨论
本实施例对具有抑菌促生作用的BN7菌株进行了纤维素降解和抗氧化功能特性检测。通过检测羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活来稳定反映纤维素酶活性，为检测纤维素酶活的常用方法。BN7菌株发酵不同时间上清液中纤维素酶活检测结果发现，菌株发酵3d左右时，纤维素酶活性达到最高，发酵5d左右时，菌株发酵上清液的纤维素酶活性逐渐降低，因此，在进一步研究时可以把发酵时间控制在三天左右即可。随着药用植物内生菌研究的深入，研究发现内生菌能够分泌与宿主植物相同或相似的天然生物活性物质，从植物内生菌的代谢产物中能够获得大量稳定高效的天然抗氧化剂，解决了只能从植物体中获取的难题，同时有助于保护珍贵药用资源。也促进了天然抗氧化剂的进一步发展。
实施例4、BN7对亳菊组培苗促生功能研究
本实施例研究目前仅限于对内生菌BN7本身的表征研究，将优化亳菊苗组培体系，将亳菊内生菌与无菌亳菊组培苗共培养，然后测定其生长及活性物质积累情况。
4.1材料
亳菊采集于安徽省阜阳市农科院亳菊种植园，内生菌BN7由阜阳师范学院微生物实验室提供。
4.2、方法
4.2.1组培苗繁殖
(1)愈伤组织诱导：剪取亳菊嫩梢或嫩茎，自来水冲洗20min后，在超净台上用70％的酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒40s后接入组培瓶中(1/2MS+琼脂10.0g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8)培养，温度21-26℃，相对湿度60-70％，光照时间12h，光照强度1500-2500lux(开灯)或200-500lux(不开灯)，培养30d。
(2)生根培养：将获得的愈伤组织苗切成1-2cm茎段，插入到生根培养基 (MS+琼脂10.0g/L+蔗糖30.0g/L,pH5.8)培养，温度21-26℃，相对湿度60-70％，光照时间12h，光照强度1500-2500lux(开灯)或200-500lux(不开灯)，培养30d。
4.2.2 BN7回接与初筛
将BN7以打孔器制得的菌片的形式回接同一时间培养，长势基本相同菊花组培苗共培养，每个菌重复10次，并设平行和对照，此即建立菊花的E+和E-群体。根据菊花长势、存活率对BN7对组培苗是否具有一定促生功能进行研究。
4.2.3测定BN7对菊花苗期生长情况的影响
BN7回接10棵苗四周后，逐步打开培养瓶口，取出叶片根部洗净培养基，对各处理组菊花苗生物量、叶片数、根数、根长和株高等生物学性状进行测定。统计的株高、主根长、根数，之后移入小花盆基质中，炼苗并测定各指标。不接菌组作对照(CK)。
4.2.3丙二醛(MDA)含量测定
采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，随机取各处理菊花叶片各0.5g(随机取叶，剪碎混合称量)，加10％TCA2ml研磨成浆，进一步加入TCA8ml充分研磨， 4000r/min离心10min，取上清液2ml，加0.6％TBA 2ml，100℃水浴煮沸15分钟，冷却离心；分别测定上清液在450nm和532nm处的吸光度，计算丙二醛(MDA) 的含量。
4.3结果与分析
4.3.1 BN7对菊花苗期生长情况的影响
参见图9以及表6、表7。BN7回接组培苗情况依次为对照不接菌(图9左图)、BN7(图9右图)，BN7菌株接入菊花组培苗，设置10个重复，培养四周，观察存活情况，发现其中BN7株菌回接后菊花存活率达100％，在接菌组植物的生长速度、叶片性状、株高、根数、主根长及鲜总重等方面具有比未接菌组具有明显优势的特征。依据苗生长情况：叶片性状、株高、根数、主根长及鲜总重，BN7菌株对亳菊组培苗具有促生长作用，并对其跟踪检测。
表6、BN7内生菌回接组培苗情况
表7、BN7处理对菊花炼苗前生长指标的影响
处理 鲜叶片数 株高(cm) 根长(cm) 根数
BJF10 27.5 9.35 13.1 18.1
CK 19.71 7.58 22.64 7.71
4.3.2 BN7接菌处理对菊花叶片MDA(丙二醛)含量的影响
对BN7接菌组菊花叶片MDA含量测定(表8)，结果显示，BN7略微降低了MDA含量，MDA含量的多少反映了细胞膜脂的过氧化程度以及对逆境反应的强弱，这表明接种内生真菌，增强其细胞膜的稳定性及抗逆境能力。
表8、BN7处理对菊花MDA含量的影响
CK组 BN7组
MDA(μmol/L) 1.361 1.101
4.4小结与讨论
目前，亳州菊花主产区在种植中遇到连作障碍，抗病性差，产量下降等问题，本实施例旨在探索内生菌BN7对菊花苗期生长状况的影响，以期望为解决菊花种植地出现的种植方面的问题提供参考。从试验情况看，BN7从生长量，生理指标，产量上对菊花产生了有利影响。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化产物之一，通常利用它作为膜脂过氧化程度的指标，BN7降低了MDA含量，这也很好的说明了内生菌BN7增强了植物细胞膜的稳定性，降低了膜脂过氧化程度。本实施例是针对解决菊花种植中出现的问题，寻找解决方案的初步试验，本实施例在一定程度上实现了预期目的。
实施例5、亳菊内生菌BN7的鉴定
本实施例利用形态学和分子生物学的方法对BN7菌株进行鉴定，确定BN7 的生物学特性及分类学位置等特征，为利用分离到的内生真菌进行生物防治奠定基础。
5.1材料
5.1.1亳菊内生菌菌株
亳菊内生菌BN7保存与阜阳师范学院微生物实验室。
5.1.2培养基
(1)固体培养基：LB培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)；
(2)液体培养基：LB液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)；
5.2方法
5.2.1形态学鉴定
(1)内生细菌菌落形态：涂布平板经24h培养后，通过肉眼观察并记录菌落大小、颜色、形状、边缘、透明度等特征。
(2)细菌革兰氏染色。
5.2.2分子生物学鉴定
5.2.2.1基因组DNA的提取
采用CTAB法提取内生菌BN7总DNA，取5mL细菌过夜培养液于14mL 离心管中5000rpm离心10min弃上清液。加0.95ml TE悬浮沉淀，加50μL10％ SDS，5μl蛋白酶K(20mg/mL)混匀37℃恒温保存1h。(阳性菌先加溶菌酶200ug/ml，50μL)加150μL 5mol/L NaCl混匀。加150μL CTAB/NaCl溶液，混匀65℃保温20min。用等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提5000rpm离心 10min，取上清液至1.5mL离心管中。用等体积氯仿/异戊醇(25﹕1)抽提5000rpm10min取上清液至1.5mL离心管中。加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，沉淀DNA。5000rpm 5min去上清，用0.5mL 70％乙醇漂洗，5000 rpm 5min去上清，空气干燥沉淀(使酒精挥发)溶解于70～80μL TE中。
5.2.2.2基因组DNA的电泳检测与PCR扩增
对内生菌BN7中提取的基因组DNA利用细菌的通用引物进行PCR扩增。
正向引物1(SEQ ID No.1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物2(SEQ ID No.2)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
5.2.3序列测定及分析
将克隆结果呈阳性的样品送至上海生工测序部进行其碱基序列的测序，将测序得到的碱基序列在NCBI上进行BLAST比对，将所比对的相似度结果与形态学鉴定进行结合分析，最后将菌株鉴定到属或种。
5.3结果与分析
5.3.1 BN7形态学鉴定
利用革兰氏染色法，借助光学显微镜分别对内生细菌个体形态和生长状态进行形态学鉴定。BN7在培养基上的生长情况与革兰氏染色法光学显微镜下形态见图10。BN7菌株的菌落形态(见图10左图)与革兰氏染色法光学显微镜下形态(图10右图)。根据图10可知：菌落光滑圆状或椭圆状，表面湿润、黏稠，易挑取，淡黄色，小而扁平，不透明，正反面颜色一致。
5.3.2 BN7分子生物学鉴定
菌株BN7巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)具体信息见表9。
表9、具有抑菌活性的内生菌的鉴定
菌株编号 基因登录号 相近种系 同源百分比 基于形态学鉴定
BN7 KU647238.1 Bacillus 99％ Bacillus megaterium
5.3.3 BN7系统发育树状图(见图11)
5.4小结与讨论
随着核酸序列分析技术被广泛应用在微生物的分类鉴定中，现在常用的微生物鉴定技术包括16S rRNA、18S rRNA、ITS和18S rRNA-ITS序列的分析。本实验通过细菌16SrRNA基因序列的分析，从而对其进行较为准确的分类鉴定。16S rRNA基因序列，如SEQ IDNo.3所示：
AGGGCGGCTAGCTCCTTACGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGA TTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGG TTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACG TGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCAC CACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGT CAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTG CGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTG CTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCG TTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCA GCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGC ATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCC AATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGC GCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTG GCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTC GTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGG CGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGA GTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCG TTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGT GATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAG CTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCG TCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGACTGCATGTAT
通过以上5个实施例可知：
(1)本发明以从亳州地区分离的内生菌BN7为研究对象，探究其对亳菊生长的促生作用。
(2)采用培养基平板对峙法，筛选分别对玉米弯孢菌、黄瓜枯萎菌、小麦赤霉菌、串珠镰刀菌、茶叶轮斑菌、瓜炭疽菌具有抑制作用的内生菌，发现BN7 对植物病原菌具有广谱抑菌作。进而BN7内生菌发酵液通过微孔滤膜过滤除菌和高温蒸汽灭菌两种方式检测对植物病原菌的抑菌效果。发现过滤除菌与高温灭菌这两种方式的抑菌效果大体一致，因此，推测起抑菌作用主要是由于某种化学物质引起的。
(3)结合培养基平板定性和内生菌发酵液定量，检测具有广谱抑菌作用的亳菊BN7进行了解磷、解钾、分泌植物生长素(IAA)等促生能力，结果发现，菌株BN7具有解磷、解钾能力，产生长素(IAA)的功能，其中产生长素(IAA) 的浓度约为对照组标准品的3倍。
(4)对具有抑菌促生作用的亳菊内生菌BN7进行了纤维素降解和抗氧化功能特性检测。通过检测羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活来稳定反映纤维素酶活性，采用DPPH自由基清除定量检测内生菌发酵液的抗氧化能力。结果表明， CMCase在第3d达到最高为170.37U/mL，FPase在第3d达到最高为80.33U/mL，对DPPH自由基的清除率与对照组Vc接近。
(5)本发明研究对内生菌BN7本身的表征研究基础上，内生菌BN7与亳菊苗组培体苗共培养，然后测定其生物量与生理指标，发现BN7从生长量，生理指标，产量上对菊花产生了有利影响。
(6)结合形态学和分子生物学的方法对的亳菊内生菌BN7进行鉴定，结果发现，BN7为巨大芽孢杆菌，可以得出在亳菊内生菌当中芽孢杆菌属为优势种属。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 阜阳师范学院
<120> 亳菊内生巨大芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1427
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 3
agggcggcta gctccttacg gttactccac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg 60
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120
actagcgatt ccagcttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggtt 180
ttatgggatt ggcttgacct cgcggtcttg cagccctttg taccatccat tgtagcacgt 240
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300
gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac taaatgctgg caactaagat caagggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420
ctgtcactct gtcccccgaa ggggaacgct ctatctctag agttgtcaga ggatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600
tgcgttagct gcagcactaa agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc atcgtttacg 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca 720
gttacagacc aaaaagccgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780
cgctacacgt ggaattccgc ttttctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840
ctccacggtt gagccgtggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gcgcgcttta 900
cgcccaataa ttccggataa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtacgag cagttactct cgtacttgtt 1020
cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctatgcatc gttgccttgg 1200
tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc accgcgggcc catctgtaag tgatagccga 1260
aaccatcttt caatcatctc ccatgaagga gaagatccta tccggtatta gcttcggttt 1320
cccgaagtta tcccagtctt acaggcaggt tgcccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
aacgtcatag aagcaagctt ctaatcagtt cgctcgactg catgtat 1427

Claims (10)

1.一种亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7，其特征在于，保藏编号为GDMCC No:60467。
2.权利要求1所述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7作为拮抗菌在防治作物病害中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由玉米弯孢菌、黄瓜枯萎菌感染引发的病害。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由小麦赤霉菌感染引发的病害。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由串珠镰刀菌感染引发的病害。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由茶叶轮斑菌感染引发的病害。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由瓜炭疽菌感染引发的病害。
8.权利要求1所述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7作为纤维素降解菌在分解废弃纤维中的应用。
9.权利要求1所述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7作为发酵菌株在获得抗氧化剂中的应用。
10.一种生物制剂，其特征在于，所述的生物制剂以权利要求1所述的亳菊内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BN7和/或其代谢物为活性成分。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499255A (zh) * 2019-08-09 2019-11-26 阜阳师范大学 亳菊内生镰刀菌及其应用
CN112226380A (zh) * 2020-08-12 2021-01-15 西北农林科技大学 一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635870A (zh) * 2016-09-27 2017-05-10 安徽瑞虎肥业有限公司 芽孢杆菌及其应用
CN108179115A (zh) * 2018-01-22 2018-06-19 阜阳师范学院 亳菊内生孢壳菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106635870A (zh) * 2016-09-27 2017-05-10 安徽瑞虎肥业有限公司 芽孢杆菌及其应用
CN108179115A (zh) * 2018-01-22 2018-06-19 阜阳师范学院 亳菊内生孢壳菌及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAVI R. PATEL ET AL.: "Alleviation of salt stress in germination of Vigna radiata L. by two halotolerant Bacilli sp. isolated from saline habitats of Gujarat", 《PLANT GROWTH REGUL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499255A (zh) * 2019-08-09 2019-11-26 阜阳师范大学 亳菊内生镰刀菌及其应用
CN112226380A (zh) * 2020-08-12 2021-01-15 西北农林科技大学 一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂
CN112226380B (zh) * 2020-08-12 2022-05-24 西北农林科技大学 一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂

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