CN115521944B - 一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法及其应用，涉及生物技术领域，针对现有的无法很好的提取乙酸乙酯的问题。现提出如下方案，其包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水；本发明还提供了一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，包括如下制备步骤：步骤一:将粉末状的青霉菌发酵物加入10倍量的甲醇中常温浸提24h，期间充分搅拌多次，回流提取3次，温度60℃，过滤，合并滤液。本发明的优点在于：乙酸乙酯提取操作简便、效率高、成本低廉，用于促进植物细胞的增殖效果佳，更为生物源的植物生长调节剂的开发提供了具有开发前景的物质。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法及其应用。
背景技术
生物技术是应用生物学、化学和工程学的基本原理，利用生物体(包括微生物，动物细胞和植物细胞)或其组成部分(细胞器和酶)来生产有用物质，或为人类提供某种服务的技术，近些年来，随着现代生物技术突飞猛进地发展，包括基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程以及生化工程所取得的成果，利用生物转化特点生产化工产品，特别是用一般化工手段难以得到的新产品，改变现有工艺，解决长期被困扰的能源危机和环境污染两大棘手问题，愈来愈受到人们的关注，且有的已付诸现实。
青霉菌发酵物是工业生产青霉素后的副产物，主要由发酵残余物、代谢物和菌丝体组成，化学分析表明其中90％为有机物质、2.3％游离氨基酸、7％N、2％K和1％P。以色列等国家利用300℃高温处理降解残留的青霉素和灭活药渣后，制成一种非常优良的有机肥，不但肥效好还可以改善土壤状况；国内的华药集团利用药渣二次发酵制成肥料使用；鲁抗集团则将这种发酵物添加豆粕，高温干燥制成饲料、钓鱼饵料等出口日本。研究发现，在大田在基质中拌入青霉菌发酵物后，播种烟草品种红花大金元后，幼苗的株高、茎直径、最大叶面积、最大根长、幼苗鲜重、地上部份干重和根干重都显著提高；在烟草品K326的育苗基质中拌入青霉菌发酵物，能显著提高烟苗的成苗率、缩短成苗天数并增加11.65％的烟叶产量。此外，土壤中加入一定量的青霉菌发酵物，还能显著增加棉花的株高、鲜重和干重，促进黄瓜和番茄的生长等。
目前，青霉菌发酵物应用存在的问题是，青霉菌发酵物是工业生产的副产物，其质量不稳定，有效成分的比例各批次都有较大的差异，在使用中往往造成施用效果差异较大，影响青霉菌发酵物的开发利用，因此分离提取青霉菌发酵物中的活性成分是高效利用青霉菌发酵物的有效途径。
植物的生长通常涉及植物细胞的扩张、分裂和分化，在细胞水平上，它主要是细胞内含物积累引起的细胞质量、体积或数量的增加，表现为细胞生物量增加、原生质体体积的扩张和分裂后细胞数量的增多，是一个由量变引起质变的不可逆过程。通常学者会过测定细胞干重的变化，来表示细胞生物量积累的变化，并反映细胞的生长情况。
因此，如何更好的提取乙酸乙酯是本领域技术人员目前需要解决的技术问题。
发明内容
(一)发明目的
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法及其应用，以实现更好提取乙酸乙酯的目的。
(二)技术方案
为达到上述技术目的，本发明提供了一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物：
其包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水。
本发明还提供了一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，包括如下制备步骤：
步骤一:将粉末状的青霉菌发酵物加入10倍量的浓度为95％的甲醇中常温浸提20h-25h，期间充分搅拌多次，回流提取3次，温度60℃，过滤，合并滤液，滤液置旋转蒸发仪减压浓缩，干燥后得到青霉菌发酵物甲醇总提取物的浸膏；
步骤二:在所得浸膏中加入2-5倍的蒸馏水溶液，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸馏水萃取3次，合并滤液，减压浓缩，真空干燥，得到相应溶剂部位的提取物，收集乙酸乙酯部分提取物，封口放置在干燥器中备用；
步骤三:将步骤二中加入乙酸乙酯后的混合液移入大型层析柱静置10h-15h，待溶液分层后，分离乙酸乙酯层、乳化层和水层，弃乳化层，得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯相装入旋蒸瓶，40℃水浴锅，减压浓缩，真空干燥，最后收集乙酸乙酯提取物。
优选的，所述甲醇中常温浸提24h最佳。
优选的，所述乙酸乙酯提取物在促进植物细胞分裂的最适浓度是10ug/ml。
优选的，所述大型层析柱静置12h最佳。
本发明还提供了一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的应用，所述乙酸乙酯提取物应用于促进植物细胞的增殖和生物源的植物生长调节剂的开发。
优选的，所述乙酸乙酯提取物应用于促进植物细胞增殖。
优选的，所述乙酸乙酯提取物应用于诱导植物细胞分裂相关基因。
从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：
1：本发明提供的一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物，不仅提供了一种促进植物细胞生长的物质，还对工业生产的废弃物进行了再利用，具有良好的开发应用前景。
2：本发明提供的一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物，乙酸乙酯提取物明显促进BY-2细胞增殖，并且乙酸乙酯提取物能使烟草幼苗根pCNT103、CdkB1和NtCesA-1a基因上调表达，加快细胞周期进程，从而促进细胞的分裂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为乙酸乙酯提取物诱导生长素诱导基因pCNT103的表达。
图2为乙酸乙酯提取物诱导细胞周期蛋白依赖性激酶基因CdkB1的表达示意图。
图3为乙酸乙酯提取物诱导纤维素合成酶基因NtCesA-1a的表达示意图。
图4为青霉菌发酵物不同溶剂部位提取物提取率的测定结果示意图。
图5为乙酸乙酯提取物促进BY-2细胞干重增长率示意图。
图6为细胞分裂相关基因的引物设计示意图。
具体实施方式
下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。应当理解，在所有这些附图中，相同或相似的附图标记指示相同的或相似的零件及特征。各个附图仅示意性地表示了本公开的实施方式的构思和原理，并不一定示出了本公开各个实施方式的具体尺寸及其比例。在特定的附图中的特定部分可能采用夸张的方式来图示本公开的实施方式的相关细节或结构。
参照图1-6：
实施例一
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物，包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水。
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，包括以下步骤：
1.将青霉菌发酵物在100℃的烘箱中烘干至恒重，称取12kg青霉菌发酵物，加入10倍量的95％甲醇常温浸提20h-25h，期间充分搅拌多次，过滤除渣，重复萃取2次，合并滤液，在旋转蒸发仪上60℃减压浓缩，干燥后获得6kg甲醇总提取物浸膏；
2.甲醇总提取物浸膏加入25L蒸馏水溶液，过滤除渣，加等体积石油醚充分混匀，将混合液置于层析柱中，常温静置4h，溶液分层后，分离水相和石油醚相，再水相中加入等体积的石油醚，重复萃取2次，得到水相萃取液A和石油醚相，合并石油醚相，装入旋蒸瓶，于35℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到石油醚提取物；
3.将2中的水相萃取液A中加入等体积的乙酸乙酯，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置10h-15h，溶液分层后，分离乙酸乙酯层、乳化层和水层，弃乳化层，得乙酸乙酯相和水相，重复操作2次，得到水相萃取液B和乙酸乙酯相，合并乙酸乙酯相，装入旋蒸瓶，于40℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到乙酸乙酯相提取物，其中乙酸乙酯相提取物简称为EACE；
4.在3水相萃取液B中加入等体积的正丁醇，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置8h，溶液分层后，分离水相和正丁醇相，再水相中加入等体积的正丁醇，重复萃取2次，得到水相萃取液C和正丁醇相，合并正丁醇相，于65℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到正丁醇提取物；
5.将水相萃取液C减压浓缩后获得最后的剩余水相提取物。
实施例二
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物，包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水。
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，包括以下步骤：
1.将青霉菌发酵物在100℃的烘箱中烘干至恒重，称取12kg青霉菌发酵物，加入10倍量的95％甲醇常温浸提20h，期间充分搅拌多次，过滤除渣，重复萃取2次，合并滤液，在旋转蒸发仪上60℃减压浓缩，干燥后获得6kg甲醇总提取物浸膏；
2.甲醇总提取物浸膏加入25L蒸馏水溶液，过滤除渣，加等体积石油醚充分混匀，将混合液置于层析柱中，常温静置4h，溶液分层后，分离水相和石油醚相，再水相中加入等体积的石油醚，重复萃取2次，得到水相萃取液A和石油醚相，合并石油醚相，装入旋蒸瓶，于35℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到石油醚提取物；
3.将2中的水相萃取液A中加入等体积的乙酸乙酯，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置10h，溶液分层后，分离乙酸乙酯层、乳化层和水层，弃乳化层，得乙酸乙酯相和水相，重复操作2次，得到水相萃取液B和乙酸乙酯相，合并乙酸乙酯相，装入旋蒸瓶，于40℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到乙酸乙酯相提取物，其中乙酸乙酯相提取物简称为EACE；
4.在3水相萃取液B中加入等体积的正丁醇，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置8h，溶液分层后，分离水相和正丁醇相，再水相中加入等体积的正丁醇，重复萃取2次，得到水相萃取液C和正丁醇相，合并正丁醇相，于65℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到正丁醇提取物；
5.将水相萃取液C减压浓缩后获得最后的剩余水相提取物。
实施例三
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物，包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水。
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，包括以下步骤：
1.将青霉菌发酵物在100℃的烘箱中烘干至恒重，称取12kg青霉菌发酵物，加入10倍量的95％甲醇常温浸提24h，期间充分搅拌多次，过滤除渣，重复萃取2次，合并滤液，在旋转蒸发仪上60℃减压浓缩，干燥后获得6kg甲醇总提取物浸膏；
2.甲醇总提取物浸膏加入25L蒸馏水溶液，过滤除渣，加等体积石油醚充分混匀，将混合液置于层析柱中，常温静置4h，溶液分层后，分离水相和石油醚相，再水相中加入等体积的石油醚，重复萃取2次，得到水相萃取液A和石油醚相，合并石油醚相，装入旋蒸瓶，于35℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到石油醚提取物；
3.将2中的水相萃取液A中加入等体积的乙酸乙酯，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置12h，溶液分层后，分离乙酸乙酯层、乳化层和水层，弃乳化层，得乙酸乙酯相和水相，重复操作2次，得到水相萃取液B和乙酸乙酯相，合并乙酸乙酯相，装入旋蒸瓶，于40℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到乙酸乙酯相提取物，其中乙酸乙酯相提取物简称为EACE；
4.在3水相萃取液B中加入等体积的正丁醇，充分搅拌混合均匀，混合液加入大型层析柱，静置8h，溶液分层后，分离水相和正丁醇相，再水相中加入等体积的正丁醇，重复萃取2次，得到水相萃取液C和正丁醇相，合并正丁醇相，于65℃、转速20-22rpm、压力-0.07Mpa的条件下，减压浓缩得到正丁醇提取物；
5.将水相萃取液C减压浓缩后获得最后的剩余水相提取物。
将实施例一到实施例三制备的一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物进行比较分析，最后得出实施例三加工得到乙酸乙酯提取物的提取效果最佳。
实施例四
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的应用，本发明提取的乙酸乙酯提取物在促进烟草BY-2细胞增殖中的应用包括以下内容：
1.使用分析天平分别准确称取5g的乙酸乙酯提取物，于超净台中，以少量有机溶剂二甲基亚砜溶解，再用无菌水定容至50mL，配制为100mg/mL的提取物母液；
2.BY-2细胞悬浮系的培养：超净台内，用镊子夹取2g培养基上长势良好的BY-2愈伤组织，接种到100mL的MS液体培养基中，黑暗中26℃、130rpm恒温振荡器中培养，7天后获得BY-2细胞母液，取20ml细胞BY-2细胞母液按体积比为1:10的比例接入新鲜的200ml的MS液体培养基中，黑暗中26℃、130rpm恒温振荡器中培养，7天后获得G1代BY-2细胞，以此类推，直至获得处于对数生长期的G3代BY-2细胞悬浮系，用于实验；
3.乙酸乙酯提取物处理BY-2细胞：将长势良好、分散均匀的同一瓶G3代细胞悬浮液，取3ml细胞按体积比为1:10的比例接入装有30mL的MS培养液的三角瓶中，黑暗中26℃、130rpm恒温振荡器中培养7天，分别向细胞悬浮液中加入一定量的乙酸乙酯提取物母液，直至三角瓶中提取物的终浓度分别为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml和50ug/ml，同时以添加相同体积的MS培养液作为对照组，每个处理10瓶细胞，每个处理设置3个重复，黑暗中26℃、130rpm恒温振荡器中培养7天后，测定提取物处理后的细胞干重；
4.细胞干重检测：将培养后的BY-2细胞悬浮液用真空泵抽除培养基，60℃烘干至恒重，称取烘干细胞的重量，用公式：细胞干重增长率％＝(处理组细胞干重-对照组细胞干重)/对照组细胞干重×100％。
实施例五
一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的应用，乙酸乙酯提取物在诱导烟草细胞分裂相关基因中的应用包括以下内容：
1.烟草栽培品种K326在温室播种于育苗基质中，待幼苗长出一对真叶后移至霍格兰培养液中，待烟苗长至4-5片叶时，在霍格兰培养液中加入一定体积的100mg/mL乙酸乙酯提取物母液直至终浓度为10μg/mL，对照组添加相同体积的霍格兰培养液，分别于加乙酸乙酯提取物后0h、2h、48h、12h、24h、48h、72h取烟草幼苗根系，液氮速冻，-80℃冰箱保存，用于荧光实时定量PCR实验；
2.荧光实时定量PCR实验：烟草幼苗根总RNA的提取采用试剂盒进行提取，用2ug的RNA试剂盒反转录合成cDNA，采用试剂盒检测生长素诱导基因pCNT103、细胞周期蛋白依赖性激酶基因CdkB1、纤维素合成酶基因NtCesA-1a在乙酸乙酯提取物处理不同时期的烟草幼苗根的表达，这些基因的表达均以烟草管家基因β-actin作为内参，以2-ΔΔCt方法计算，在Plus Real-Time PCR仪上进行cDNA的扩增，基因引物的序列根据GenBank中公布的基因序列，使用NCBI网站在线设计引物，并由擎科生物技术有限公司合成引物，引物详见图6。PCR条件为：95℃60s；然后进入40个循环：95℃10s，60℃34s；循环结束后95℃15s，60℃15s，95℃15s。
工作原理：乙酸乙酯提取物明显促进BY-2细胞增殖，与对照组相比，提取物浓度为2.5-10μg/mL时，细胞干重随提取物浓度的升高而增加，当提取物浓度为10μg/mL时，细胞干重增长率达108.12％，结果表明，乙酸乙酯提取物促进细胞增殖作用显著，并且最佳浓度10μg/mL。
乙酸乙酯提取物处理4h以后，如图1所示，烟草幼苗根的pCNT103基因表达量始终高于对照组，基因表达最高峰出现在48h是对照组表达量的7.4倍，72h时pCNT103基因表达量开始下降，但仍然高于对照组；CdkB1基因在对照组中0-8h表达量持续降低，12h时该基因的表达量恢复到0h水平，24-48h又开始下调，72h略有恢复，但仍然低于0h的水平，处理组0-8h先降低，在8h表达量开始上调，之后降低，在48h出现了表达量最高峰，之后迅速下降，如图2所示；NtCesA-1a基因在乙酸乙酯提取物处理8h表达量达到最大值，约为对照组的5.6倍，而对照组该基因的表达差异不大，只在72h略有下降，如图3所示；因此，乙酸乙酯提取物能使烟草幼苗根pCNT103、CdkB1和NtCesA-1a基因上调表达，加快细胞周期进程，从而促进细胞的分裂。
上文中参照优选的实施例详细描述了本公开所提出的方案的示范性实施方式，然而本领域技术人员可理解的是，在不背离本公开理念的前提下，可以对上述具体实施例做出多种变型和改型，且可以对本公开提出的各种技术特征、结构进行多种组合，而不超出本公开的保护范围，本公开的保护范围由所附的权利要求确定。
Claims (5)
1.一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，其特征在于，包括如下原料：经过100℃高温烘干的青霉菌发酵物，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，蒸馏水；
制备步骤包括：
步骤一:将粉末状的青霉菌发酵物加入10倍量的浓度为95％的甲醇中常温浸提20h-25h，期间充分搅拌多次，回流提取3次，温度60℃，过滤，合并滤液，滤液置旋转蒸发仪减压浓缩，干燥后得到青霉菌发酵物甲醇总提取物的浸膏；其中，青霉菌发酵物是工业生产青霉素后的副产物，主要由发酵残余物、代谢物和菌丝体组成，化学分析表明其中90％为有机物质、2.3％游离氨基酸、7％N、2％K和1％P；
步骤二:在所得浸膏中加入2-5倍的蒸馏水溶液，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和蒸馏水萃取3次，合并滤液，减压浓缩，真空干燥，得到相应溶剂部位的提取物，收集乙酸乙酯部分提取物，封口放置在干燥器中备用；
其中，将步骤二中加入乙酸乙酯后的混合液移入大型层析柱静置10h-15h，待溶液分层后，分离乙酸乙酯层、乳化层和水层，弃乳化层，得乙酸乙酯相，将乙酸乙酯相装入旋蒸瓶，40℃水浴锅，减压浓缩，真空干燥，最后收集乙酸乙酯提取物。
2.根据权利要求1所述的一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，其特征在于，所述甲醇中常温浸提24h最佳。
3.根据权利要求1所述的一种青霉菌发酵物乙酸乙酯提取物的制备方法，其特征在于，所述大型层析柱静置12h最佳。
4.根据权利要求1所述的方法制备得到提取物的应用，其特征在于，所述乙酸乙酯提取物应用于促进烟草细胞的增殖。
5.根据权利要求1所述的方法制备得到提取物的应用，其特征在于，所述乙酸乙酯提取物应用于诱导烟草细胞pCNT103、CdkB1和NtCesA-1a基因上调表达，加快细胞周期进程，从而促进细胞的分裂。
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