CN108330075B - 高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用，所述高产乙酸乙酯酵母的分类命名为异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2017048；将该酵母应用于机械化清香型小曲原酒生产中，其中酒体中的乙酸乙酯含量比生产对照组可提高47.36%，且生产出的小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型。

Description

高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用

技术领域

本发明涉及一种生物材料，属于生物工程技术领域，具体是高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用。

背景技术

酯类是一种具有芳香性气味的易挥发性化合物，多数具有水果香味，广泛存在于各香型白酒中，对于提升白酒的口感和品质具有重要的作用。乙酸乙酯作为一种常见酯类，是清香型白酒的主体呈香物质，对清香型小曲白酒风格的形成具有重要作用，决定着清香型白酒的质量分级。据文献报道，清香型白酒中乙酸乙酯的产生，是生香酵母以及酶催化作用形成的。且产酯能力较强的酵母有毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、球拟酵母等。

目前，清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量普遍较低，尚未达到一个理想的含量，导致清香型小曲白酒质量仍有很大的提升空间。分析原因在于白酒发酵过程中由于氧气的快速消耗，大多数与产酯有关的酵母代谢能力大幅减弱。同时，由于环境因子的胁迫，产酯酵母数量急剧下降，从而导致小曲白酒中乙酸乙酯含量不足。中国专利申请号为201710669627.X，公开了一株产乙酸乙酯的异常毕赤酵母及其应用，其中公开了将异常毕赤酵母P6在高粱醪液中发酵产乙酸乙酯的量达到2350.41mg/L，将异常毕赤酵母P6进行进一步的强化发酵，与不添加该菌株的对照相比，添加了异常毕赤酵母P6得到的强化发酵酒醅中乙酸乙酯的含量比对照提高了32.69%，酒醅中总酯的含量提高了28.22%，蒸馏酒原酒中总酯的含量提高了53.5%。实施例3中公开添加了异常毕赤酵母P6小试发酵酒醅中乙酸乙酯含量为44.37mg/kg，但该异常毕赤酵母P6只在实验室做了液态和固态小试发酵，尚未在车间大生产中进一步验证，无法获知其在大生产中的实验效果。而小试实验与大生产由于条件、环境的不同，实验结果往往出现差异。同时，鉴于机械化清香型小曲白酒生产中自动化程度高，参数严格特殊，特别是糖化料层高度偏高，散热性较差，对酵母耐热性要求更高。前期获得的一些高产酯酵母由于耐温差，不适合于机械化生产工艺，且异常毕赤酵母P6未见有耐温实验报道，其大生产实验效果有待进一步验证。因此，明确有效提升机械化清香型小曲白酒生产中乙酸乙酯含量的产酯酵母菌未见报道。为此，根据车间实际需求，借助目前实验室筛选条件，从自然界中尽快获得高产乙酸乙酯酵母并稳定应用于机械化清香型小曲白酒中，是提高清香型小曲白酒乙酸乙酯含量的一个重要途径，对于提升清香型白酒质量具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的就是为提高清香型小曲原酒机械化生产工艺过程中乙酸乙酯的含量而提供一株高产酯酵母，同时将该酵母应用于机械化小曲原酒生产工艺过程中，以提高小曲原酒中乙酸乙酯含量，改善原酒品质。

本发明提供的高产乙酸乙酯酵母，其分类命名为异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87，保藏于中国典型培养物保藏中心（以下简称Y87酵母），保藏日期为2017年2月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2017048。

1. Y87酵母的分离与筛选

1.1 培养基的制备

①WL琼脂培养基

储液A：称取磷酸二氢钾5.5g、氯化钾4.25g、氯化钙1.25g、硫酸镁1.25g，溶解后定容至400mL；

储液B：称取氯化铁0.25g、硫酸锰0.25g，溶解后定容至100mL；

储液C：称取0.44 g溴甲酚绿溶于10mL水和10mL酒精中；

酵母浸粉0.4%、蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、琼脂2%，储液A 40mL/1000mL、储液B 1mL/l000mL，用稀HCl调至pH=6.5，121℃灭菌20min后加储液C 1mL/1000mL，即得WL琼脂培养基。

②YPD琼脂培养基

葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L，pH自然，121℃灭菌20min后即得YPD琼脂培养基。

③高粱汁培养基

高粱粉碎后加入水，所述水的体积为高粱重量的4倍，100℃蒸煮20min，冷却后加入糖化酶、淀粉酶，置于60℃烘箱中糖化24h后，测得糖度为10度，过滤，上层清液即为高粱汁培养基。

1.2 菌株的分离和筛选

将四川宜宾六尺巷酒业提供的大曲样品用粉碎机粉碎后，制成粉状备用。称取曲粉5g，放入盛有95mL无菌水并带有玻璃珠的250mL三角瓶中，200r/min振摇30min，使曲粉与水充分混合，制成菌悬液。用1mL移液枪从三角瓶中吸取1mL菌悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，制成10^-1稀释度的曲粉溶液，按照同样的方法以此类推分别制成10^-2、10^-3和10^-4稀释度的曲粉溶液。然后分别从10^-1、10^-2、10^-3和10^-4稀释度试管中吸取0.2mL曲粉溶液放入制备好的无菌WL培养皿中，每个梯度设置两个平行样品，用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，然后平放于试验台上20~30min，使菌液渗入培养基表层内，然后将平板倒置于30℃培养箱中培养。培养24~48h后，用无菌接种环把平板上的单个菌落挑出，划线接种于另一个空白YPD平板上，继续培养，经过2~3次平板划线后得到初步纯化的菌落转入YPD斜面试管低温保存。

1.2.1 菌株的初筛

把纯菌落接种在盛有10mL YPD液态培养基的无菌试管种，30℃摇床震荡培养两天后用移液枪吸取0.4mL菌液接种于盛有50mL高粱汁培养基的带有发酵栓的三角瓶中，每株菌接种两个发酵栓作为平行样品，对照样为市售高产酵母以及空白高粱汁培养基不接种任何菌液，30℃生化培养箱恒温培养，每隔24h小心振荡发酵栓并称重，当失重小于0.2g时，停止培养，记录发酵前后发酵栓失重，将培养后的发酵液离心、过滤后取上层清亮的发酵液5mL，装入15mL顶空进样瓶，再加3g氯化钠，采用顶空气相色谱法测定乙酸乙酯含量。色谱条件为：Agilent 780A气相色谱仪，检测器FID，CP-WAX毛细管色谱柱（50m*0.2μm*0.25mm）。升温程序：柱温40℃保持8min，以5℃/min升至150℃。进样口温度250℃，检测器温度260℃，空气、氢气流速比300:30，载气为氮气，分流比30:1，柱流量1.0mL/min，进样方式：自动进样器。检测结果见下表1。

表1 酵母在高粱汁液体培养基中发酵能力

注：“—”为未检出；

上表中的Y0是目前市场上使用较多的酵母，小试中乙酸乙酯的浓度为113mg/100mL。从上表1可知，菌株Y87产乙酸乙酯的能力最强，小试达到了113mg/100mL。与目前实际生产中相比，乙酸乙酯含量提高一倍多，同时远远高于优级酒的标准（优级酒乙酸乙酯指标≥50mg/100mL）。且Y87酵母产乙酸乙酯效果明显高于市售产酯酵母Y0，因此菌株Y87初步判定为我们筛选的目的菌株。

1.2.2 菌株的复筛

将目标菌株制备成麸皮种具体步骤如下：已灭菌的200mL YPD液态培养基接种酵母纯培养物，30℃，150rpm培养24h后作为种子液，接种至灭过菌的麸皮培养基中，30℃培养36h，将麸皮培养物35℃下干燥6-8h，即为麸皮酵母纯种。并将酵母麸皮种配成混合曲，以市售酵母、成品混合曲为对照曲，在无菌实验室模拟白酒大生产工艺条件，具体操作工艺流程：泡粮（60℃，20h）、初蒸（121℃，30min）、焖粮（60℃，1h）、复蒸（115℃，15min）、撒曲（1%）、糖化（24h）、发酵（7d）。其中蒸粮结束后，熟粮应完全透心，一致性好，水分在55%左右；发酵时称取糖化醅500g与配糟（配糟采用车间大生产蒸馏后的鲜糟）按1:1比例混匀后入瓶，瓶塞上装有2.5mol/L硫酸密封，在培养箱中30℃发酵7d。发酵结束后，采用固态蒸馏，接取100mL馏液经气相色谱检测乙酸乙酯含量，检测结果如下：

表2 小试发酵产酒性能比较

从表2的小试结果看，产乙酸乙酯方面，Y87比市售酵母组Y0以及对照组平均值分别提高了23.54%和79.48%，因此菌株Y87判定为我们筛选的目的菌株。

筛选到的编号为Y87酵母菌落特征为：奶油色，表面光滑，呈圆形突起，菌落较大，菌落直径d = 4mm，参见图1。

1.3 菌种鉴定

将筛选出的高产乙酸乙酯酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物扩增菌株的ITS序列，经凝胶电泳检测，接着进行测序对比，确定菌种的属种，结果是异常毕赤酵母。

测序结果参见后附的序列表。

由于酵母在白酒酿造生产过程中起主导作用，与此同时，酿造环境对酵母的生长及代谢有着十分重要的影响。在白酒酿造过程中，由于酒醅中乙醇浓度、含氧量、酸度、营养物质等不断变化，造成酵母所处环境也时刻发生变化，从而酵母的生存受到各种环境因素的制约。只有适应这些胁迫条件，菌株代谢活动才能顺利进行。为此，我们对Y87酵母菌株进行了一系列的耐受性试验，具体如下。

2. Y87酵母菌株耐受性试验

1）酵母的活化

挑取一环酵母菌体接种于装有10mL YPD液体培养基中，30°C静止培养3天后，取50μL菌液于下列各培养基中。

2）耐受性实验

a 耐温实验

配制YPD液体培养基，121°C灭菌20min，分别取2mL培养液于试管中，对应接种市售酵母Y0、生产酵母Y29和Y87酵母，分别在15°C、25°C、35°C、45°C、55°C进行培养3天，然后在波长为600nm处测菌的吸光度，试验结果见图2。

从图2可以看出，Y0、Y29、Y87三株酵母在25°C、35°C温度下均能很好的生长，说明此三株菌耐热性较好；在45°C下，Y0和Y29生长较差，而Y87生长依然较好，说明Y87耐热性更强。鉴于机械化清香型小曲原酒生产中糖化料层高度偏高，散热性较差，对酵母耐热性要求更高，而Y87耐热性较好，可作为优良产酯酵母应用于机械化清香型小曲原酒生产。

b 耐酒精实验

配制YPD液体培养基，121°C灭菌20min，然后加无水乙醇使培养基中酒精浓度分别为：3%、5%、7%、9%、11%（v/v），再分别取3 mL培养液于试管中，对应接种Y0、Y29、Y87三株酵母，30°C进行培养3天，然后利用酶标仪在600nm处测定菌浓度，试验结果见图3。

由于发酵过程产生的高浓度乙醇会对酵母细胞代谢带来毒害，使酵母停滞生长或死亡。从图3可知，随着乙醇浓度的增加，酵母的生长受到抑制，当乙醇浓度达到11%（v/v）时，酵母生长明显受抑制，由此说明酵母的最大耐乙醇浓度为11%。而小曲原酒发酵过程中酒醅乙醇浓度约为4%，因此Y87能够耐受发酵过程中乙醇含量的增加。

c 耐乳酸实验

配制YPD液体培养基，121°C灭菌20min，冷却加乳酸至不同的酸度(% v/v)：2 (pH=3.13)、4 (pH=2.89)、6 (pH=2.70)、8 (pH=2.52)、10 (pH=2.10)，再分别取3mL培养液于试管中，对应接种Y0、Y29、Y87三株酵母，30°C进行培养3天，然后利用酶标仪在600nm处测定菌浓度，试验结果见图4。

由于高浓度的酸类物质会降低酵母细胞的代谢速率，抑制或杀死细胞，从而影响发酵能力。从图4可知，当环境中的2.1<pH<3时，酵母生长缓慢，且随着乳酸浓度的增加，酵母大量死亡。而酒醅发酵过程中pH>3，说明3株酵母能够适应酒醅中酸度的增加。

综上所述，菌株Y87能适应机械化清香型小曲原酒酵母生长代谢的环境。

本发明的另一个目的就是提供上述高产乙酸乙酯酵母在机械化生产清香型小曲原酒中的应用，包括下述步骤：

（1）种曲和酵母培养基的制备

将早籼米浸泡8-10h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉和米糠，其中早籼米：早籼米粉：米糠的重量比为63:35:2，搅拌均匀后，接种安琪根霉，接种量为早籼米、米粉及米糠总重量的3.5-30%；再用手捏成直径为6-7cm的饼型曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距约为2-3cm，盖上竹垫；培养室温度控制在30-32℃，当曲坯品温升至35℃，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温将至25-28℃，然后将其在35℃下烘干，此曲坯即为种曲；

称取糖蜜，加入85℃的热水，所述热水的体积为糖蜜重量的2倍，搅拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入溶液体积的0.1%的浓硫酸，搅匀静置12小时，将上层清液加至发酵罐中，并补水至糖蜜培养基的糖度为10BX-15BX；按质量比为2‰、1‰、1‰、1‰、2‰、10%称取硫酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硫酸镁、酵母浸粉和消泡剂并倒入发酵罐中，加水至罐容积的60-80%，开启搅拌使营养盐完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

（2）纯种麸皮酵母的制备

按照1g/100mL的比例称取麦芽浸粉，用水溶解后，分装至1000mL的三角瓶中，每瓶装液量500mL，灭菌备用；将保藏编号为CCTCC NO.M2017048的异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87试管纯培养物接入三角瓶中，30℃下 140rpm摇床培养20-36h；将培养Y87的三角瓶接入装有步骤（1）制备的酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的溶氧量45%、pH=3-5、转速为100-500rpm、温度35℃培养22h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃培养36h，干燥后制成纯种麸皮酵母；

（3）土曲的制备

将观音土粉碎后过14目筛，所述观音土产地为湖南临澧县，米糠过16目筛，将步骤（1）制备的种曲碾碎后过20目筛，先将种曲与米糠混合搅拌均匀，在加入膨润土搅匀，所述膨润土：米糠：种曲的重量比为75:25:1.4-1.8，得混合料；加水至混合料中，使混合料中的含水量为50%；搅匀后将混合料制成直径为7-8cm的球形曲坯，将制好的曲坯整齐摆放置于培养室内的培养箱中，在曲坯上铺竹垫，控制培养室的温度为28-30℃之间，培养16h后；检查培养箱内曲坯的温度，当曲坯品温升至30-35℃时，揭开竹垫，撑起培养箱；待曲坯品温降至室温时，将曲坯捡出，曲坯相互之间不能挤压，继续培养6天；培养结束后，将曲坯置于烘房内与35-40℃下烘干至含水量≤5%，即制得土曲；

（4）混合曲的制备

将步骤（2）制备的纯种麸皮酵母，步骤（3）制备的土曲，以及安琪根霉按照重量比为24:6:70混合均匀，制成混合曲；

（5）机械化清香型小曲原酒的制备

粳高粱经70-80℃水浸泡16-18h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮经摊凉机降温至22-26℃，采用加曲机按1%的接种量加入步骤（4）所制备的混合曲，经绞龙或翻耙将曲与粮食搅拌均匀，经板链输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制入箱温度为22-26℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化24h，按照粮糟比为1:1.6-1:1.8添加配糟，混匀后即得入池醅，入池醅温度为10-14℃，入池醅为2m³不锈钢槽车作为发酵容器，经叉车转运至恒温发酵间，发酵间温度为20-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得小曲原酒；经检测，小曲原酒中的乙酸乙酯平均含量为112mg/100mL。

本发明所生产出的小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型。

附图说明

图1是Y87酵母菌落宏观形态图；

图2是不同酵母在不同温度下的生长情况；

图3是不同酵母在不同乙醇浓度下的生长情况；

图4是不同酵母在不同酸性条件下的生长情况。

具体实施方式

实施例1

本实施例的高产乙酸乙酯酵母在机械化生产清香型小曲原酒中的应用，包括下述步骤：

（1）种曲和酵母培养基的制备

称取63kg早籼米浸泡9h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉35kg和米糠2kg，搅拌均匀后，接种20kg安琪根霉；再用手捏成直径为6-7cm的饼型曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距约为2-3cm，盖上竹垫；培养室温度控制在30-32℃，当曲坯品温升至35℃，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温将至25-28℃，然后将其在35℃下烘干，此曲坯即为种曲；

称取糖蜜50kg，加入85℃的热水100L，搅拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入0.1L的浓硫酸，搅匀静置12小时，将上层清液加至发酵罐中，并补水至糖蜜培养基的糖度为13BX；分别称取0.3kg硫酸铵、0.15kg尿素、0.15kg磷酸二氢铵、0.15kg硫酸镁、0.30kg酵母浸粉和1.50kg消泡剂并倒入发酵罐中，加水至罐容积的70%，开启搅拌使营养盐完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

（2）纯种麸皮酵母的制备

称取麦芽浸粉20g，用2L水溶解后，分装至容积为1000mL的三角瓶中，每瓶装液量500mL，灭菌备用；将保藏编号为CCTCC NO.M2017048的异常毕赤酵母（Wickerhamomycesanomalus）Y87试管纯培养物接入三角瓶中，30℃下 140rpm摇床培养30h；将培养Y87的三角瓶接入装有步骤（1）制备的酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的溶氧量45%、pH=4、转速为300rpm、温度35℃培养22h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃培养36h，干燥后制成纯种麸皮酵母；

（3）土曲的制备

将观音土粉碎后过14目筛，所述观音土产地为湖南临澧县，米糠过16目筛，将步骤（1）制备的种曲碾碎后过20目筛，先将种曲与米糠混合搅拌均匀，在加入膨润土搅匀，所述膨润土：米糠：种曲的重量分别为150kg、50kg和3kg，得混合料；加水至混合料中，使混合料中的含水量为50%；搅匀后将混合料制成直径为7-8cm的球形曲坯，将制好的曲坯整齐摆放置于培养室内的培养箱中，在曲坯上铺竹垫，控制培养室的温度为28-30℃之间，培养16h后；检查培养箱内曲坯的温度，当曲坯品温升至30-35℃时，揭开竹垫，撑起培养箱；待曲坯品温降至室温时，将曲坯捡出，曲坯相互之间不能挤压，继续培养6天；培养结束后，将曲坯置于烘房内于35-40℃下烘干至含水量为4.2%，即制得土曲；

（4）混合曲的制备

称取步骤（2）制备的纯种麸皮酵母24kg，步骤（3）制备的土曲6kg，以及安琪根霉70kg混合均匀，制成混合曲；

（5）机械化清香型小曲原酒的制备

将1000kg粳高粱经75℃水浸泡17h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮经摊凉机降温至22-26℃，采用加曲机接种步骤（4）所制备的混合曲10kg，经绞龙或翻耙将曲与粮食搅拌均匀，经板链输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制入箱温度为22-26℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化24h，添加1700kg粮糟，混匀后即得入池醅，入池醅温度为10-14℃，入池醅为2m³不锈钢槽车作为发酵容器，经叉车转运至恒温发酵间，发酵间温度为20-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得小曲原酒；经检测，小曲原酒中的乙酸乙酯平均含量为112mg/100mL。

本公司现有的同期未使用该菌株的纯种新工艺混合曲产酒乙酸乙酯平均含量为76mg/100mL，本发明所提供的保藏编号为CCTCC NO.M2017048的异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87按实施例1的方法应用于机械化清香型小曲原酒的生产，与现有方法相比乙酸乙酯提高了47.36%，实现了本发明提高乙酸乙酯含量的目的。

本实施例生产出的小曲原酒清香纯正，入口绵甜，香味协调，尾净爽口，风格典型。

序列表

<110> 劲牌有限公司

<120> 高产乙酸乙酯酵母及其在机械化清香型小曲白酒中的应用

<141> 2018-04-27

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> DNA

<213> 异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87

<400> 1

atatcaaaaa agcggaggaa aagaaaccaa cagggattgc ctcagtaacg gcgagtgaag 60

cggcaaaagc tcaaatttga aatctagcac cttcggtgtt cgagttgtaa tttgaagatg 120

gtaaccttgg gtttggctct tgtctatgtt ccttggaaca ggacgtcata gagggtgaga 180

atcccgtctg atgagatgcc cattcctatg taaggtgcta tcgaagagtc gagttgtttg 240

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atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactt tgaaaagaga gtgaaaaagt 360

acgtgaaatt gttgaaaggg aagggcatta gatcagactt ggtgttttac gattatcttc 420

tcttcttgag ttgtgcactc gtatttcact gggccagcat cgattcggat ggcaagataa 480

tggcagttga atgtggcttc acttcggtgg agtgttatag cttctgctga tattgcctgt 540

ctggatcgag ggctgcgtct tttgactagg atgctggcgt aatgatctaa tgccgcccgt 600

cttgaaccac ggacca 616

Claims (2)

1.高产乙酸乙酯酵母，其分类命名为异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月20日，保藏编号为CCTCC NO：M2017048。

2.如权利要求1所述的高产乙酸乙酯酵母在机械化清香型小曲原酒生产中的应用，其特征在于包括下述步骤：

（1）种曲和酵母培养基的制备

将早籼米浸泡8-10h，磨浆，在米浆中加入过20目筛的早籼米粉和米糠，其中早籼米：早籼米粉：米糠的重量比为63:35:2，搅拌均匀后，接种安琪根霉，接种量为早籼米、米粉及米糠总重量的3.5-30%；再用手捏成直径为6-7cm的饼型曲坯，将曲坯排列于培养室内的木箱上，曲坯间距为2-3cm，盖上竹垫；培养室温度控制在30-32℃，当曲坯品温升至35℃，揭去竹垫子；继续培养至曲坯品温降 至25-28℃，然后将其在35℃下烘干，此曲坯即为种曲；

称取糖蜜，加入85℃的热水，所述热水的体积为糖蜜重量的2倍，搅拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入溶液体积的0.1%的浓硫酸，搅匀静置12h，将上层清液加至发酵罐中，并补水至糖蜜培养基的糖度为10BX-15BX；按质量比为2‰称取硫酸铵、1‰称取尿素、1‰称取磷酸二氢铵、1‰称取硫酸镁、2‰称取酵母浸粉和10%称取消泡剂并倒入发酵罐中，加水至罐容积的60-80%，开启搅拌使营养盐完全溶解，灭菌冷却，即得酵母培养基；

（2）纯种麸皮酵母的制备

按照1g/100mL的比例称取麦芽浸粉，用水溶解后，分装至1000mL的三角瓶中，每瓶装液量500mL，灭菌备用；将保藏编号为CCTCC NO.M2017048的异常毕赤酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y87试管纯培养物接入三角瓶中，30℃下 140rpm摇床培养20-36h；将培养Y87的三角瓶接入装有步骤（1）制备的酵母培养基的发酵罐中，设置发酵罐的溶氧量45%、pH=3-5、转速为100-500rpm、温度35℃培养22h，再接种到经过灭菌的麸皮培养基中，30℃培养36h，干燥后制成纯种麸皮酵母；

（3）土曲的制备

将观音土粉碎后过14目筛，所述观音土产地为湖南临澧县，米糠过16目筛，将步骤（1）制备的种曲碾碎后过20目筛，先将种曲与米糠混合搅拌均匀，在加入膨润土搅匀，所述膨润土：米糠：种曲的重量比为75:25:1.4-1.8，得混合料；加水至混合料中，使混合料中的含水量为50%；搅匀后将混合料制成直径为7-8cm的球形曲坯，将制好的曲坯整齐摆放置于培养室内的培养箱中，在曲坯上铺竹垫，控制培养室的温度为28-30℃之间，培养16h后；检查培养箱内曲坯的温度，当曲坯品温升至30-35℃时，揭开竹垫，撑起培养箱；待曲坯品温降至室温时，将曲坯捡出，曲坯相互之间不能挤压，继续培养6天；培养结束后，将曲坯置于烘房内与35-40℃下烘干至含水量≤5%，即制得土曲；

（4）混合曲的制备

将步骤（2）制备的纯种麸皮酵母，步骤（3）制备的土曲，以及安琪根霉按照重量比为24:6:70混合均匀，制成混合曲；

（5）机械化清香型小曲原酒的制备

粳高粱经70-80℃水浸泡16-18h后，采用球锅带压蒸粮，熟粮经摊凉机降温至22-26℃，采用加曲机按1%的接种量加入步骤（4）所制备的混合曲，经绞龙或翻耙将曲与粮食搅拌均匀，经板链输送至密封糖化间进行培菌糖化，控制入箱温度为22-26℃，上中下粮层温差不超过2℃，经培菌糖化24h，按照粮糟比为1:1.6-1:1.8添加配糟，混匀后即得入池醅，入池醅温度为10-14℃，入池醅为2m³不锈钢槽车作为发酵容器，经叉车转运至恒温发酵间，发酵间温度为20-23℃，发酵周期为15天，蒸馏，即得小曲原酒；经检测，小曲原酒中的乙酸乙酯平均含量为112mg/100mL。

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