CN102250780A - 赛道威毕赤酵母及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种赛道威毕赤酵母及其用途，属于酿酒技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种产酯能力更高的生香酵母。本发明生香酵母菌株是由四川剑南春集团有限责任公司的酒曲中分离得到的赛道威毕赤酵母新菌株，该菌株已于2011年05月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)，保藏号为CGMCC No.4865。本发明赛道威毕赤酵母新菌株的产值能力可以达到500mg/100ml左右，远高于目前的生香酵母的产酯能力。本发明为乙酸乙酯、乙酸乙酯酯化酶和高品质白酒的生产提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。

Description

赛道威毕赤酵母及其用途
技术领域
本发明涉及一种赛道威毕赤酵母及其用途，属于酿酒技术领域。
背景技术
生香酵母简单的说是指在生长、繁殖过程中能产生芳香气味物质的酵母，这些香味物质主要是酯类，因此，生香酵母又称为产酯酵母。目前报道的生香酵母主要有产膜酵母和假丝酵母，其中大部份是异常汉逊酵母和少量球拟酵母属，它们是中国白酒酯香主要产生菌，因此从酒曲中分离筛选出生香酵母对中国传统固态发酵白酒的生产具有重大的现实意义。
我国是白酒生产大国，随着菌种筛选、诱变等技术的成熟，我国各地区先后筛选出了上千种产酯量较高的菌株或菌种。一般来说，产酯性能优异的生香酵母的产酯量可以达到200mg/100ml左右，如：张晓娟等，西南菌种站部分酿酒增香酵母产酯性能初探，《四川食品与发酵》，2007年第3期公开了几种产酯性能较高的菌株，其菌株的产酯量最高可以达到230.2mg/100ml。
由于生香酵母的重要意义，虽然目前已经筛选得到产酯量200mg/100ml左右的菌株，人们还是希望通过改进筛选或诱变等方法得到产酯量更高的生香酵母，这也是本领域研究人员的长期追求。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种产酯能力更高的生香酵母。
本发明生香酵母菌株是由四川剑南春集团有限责任公司的酒曲中分离得到的赛道威毕赤酵母新菌株，该菌株已于2011年05月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，分类命名为赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)，保藏号为CGMCC No.4865。
本发明赛道威毕赤酵母新菌株通过下述方法筛选得到：
1、取1～2克酒曲(由四川剑南春集团有限责任公司提供)到50ml麦芽汁三角瓶中，于26℃摇床(200rpm/min)培养48小时，再取1ml接种到麦芽汁试管中培养，经过3次的转接培养即可。
麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至5°Bé，加入一定量乳酸，于115℃灭菌20min备用。
2、取上述方法培养的酵母液，按10倍梯度稀释到10-6，取稀释度为10-4、10-5、10-6各0.2ml的溶液，分别涂布于5°Bé麦芽汁培养基平板，26℃培养48小时。
3、挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，然后选择不同类型的酵母菌落分别接于麦芽汁固体斜面培养基上，于26℃培养48小时。
4、取不同类型的酵母菌株，分别于26℃麦芽汁培养基培养7天，测定各发酵液中酯含量，筛选产酯含量最高的菌株。
5、酵母菌鉴定
利用美国Biolog公司全自动微生物鉴定仪，Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。
测试步骤：
①、在BUY培养基上，26℃培养待鉴定的酵母菌(即产酯含量最高的菌株)。
②、样品准备及观察特征，利用湿法制备(水片法)或革兰氏染色来确认待鉴定菌株是酵母菌。
③、接种准备
以装有空白无菌水玻璃管调100％T透光率，用标准比浊管校正，制备特定浓度菌悬液，调为47％T，接种到YT微平板，每孔100ul菌悬液。
④、微平板培养
于26℃培养鉴定板，将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果。
经鉴定，筛选得到的产酯含量最高的菌株为赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)新菌株，其信息包括：产酯能力500mg/100ml左右，该菌株的淀粉化合物实验为阴性，该菌株不产生脲酶，该菌株的碳源同化实验结果如表1所示。
表1本发明赛道威毕赤酵母新菌株的碳源同化实验结果
  乙酸   甲酸   丙酸   琥珀酸   琥珀酸甲酯   L-天冬氨酸
  +   +   +   +   -   +
  D-纤维二糖   龙胆二糖   麦芽糖   麦芽三糖   D-松三糖   D-蜜二糖
  +   +   +   +   + -
  吐温80   杏甘   山梨醇   木糖醇   L-山梨糖  D-核糖
  -   +   +   -   -  +
  松二糖   反丁烯二酸   L-苹果酸   熊果苷   磺琥珀酸  水杨苷
  +   +   +   +   -  +
  麦芽糖醇   D-氨葡萄胺   a-D-葡萄糖   D-半乳糖   D-阿洛酮糖  L-鼠李糖
  +   -   +   +   +  -
  L-谷氨酸   D-脯氨酸   D-葡萄糖酸   糊精   菊粉  γ-氨基丁酸
  +   +   -   +   +  +
  核糖醇   D-棉子糖   水苏糖   蔗糖   D-海藻糖  α-酮戊二酸
  +   +   +   +   +  +
  D-苷露醇   D-山梨醇   D-阿拉伯醇   D-木糖   丙三醇  2-酮葡萄酸
  +   +   +   +   +  -
  D-阿拉伯醇   b-甲基D-葡糖   N-乙酰基D-   I-赤藻糖醇   6-O-D-吡喃葡
  +   +   -   +   +
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
本发明还提供了含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于生产乙酸乙酯酯化酶中的用途。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于生产乙酸乙酯中的用途。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于白酒发酵生香中的用途。
本发明赛道威毕赤酵母新菌株的产值能力可以达到500mg/100ml左右，远高于目前的生香酵母的产酯能力(200mg/100ml左右)。本发明为乙酸乙酯、乙酸乙酯酯化酶和高品质白酒的生产提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为超高放大倍率视频显微镜观察的本发明赛道威毕赤酵母新菌株形态特征图。
具体实施方式
本发明生香酵母菌株是由四川剑南春集团有限责任公司的酒曲中分离得到的赛道威毕赤酵母新菌株，该菌株已于2011年05月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，分类命名为赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)，保藏号为CGMCC No.4865。
本发明赛道威毕赤酵母新菌株通过下述方法筛选得到：
1、取1～2克酒曲(由四川剑南春集团有限责任公司提供)到50ml麦芽汁三角瓶中，于26℃摇床(200rpm/min)培养48小时，再取1ml接种到麦芽汁试管中培养，经过3次的转接培养即可。
麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至5°Bé，加入一定量乳酸，于115℃灭菌20min备用。
2、取上述方法培养的酵母液，按10倍梯度稀释到10-6，取稀释度为10-4、10-5、10-6各0.2ml的溶液，分别涂布于5°Bé麦芽汁培养基平板，26℃培养48小时。
3、挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，然后选择不同类型的酵母菌落分别接于麦芽汁固体斜面培养基上，于26℃培养48小时。
4、取不同类型的酵母菌株，分别于26℃麦芽汁培养基培养7天，测定各发酵液中酯含量，筛选产酯含量最高的菌株。
5、酵母菌鉴定
利用美国Biolog公司全自动微生物鉴定仪，Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。
测试步骤：
①、在BUY培养基上，26℃培养待鉴定的酵母菌(即产酯含量最高的菌株)。
②、样品准备及观察特征，利用湿法制备(水片法)或革兰氏染色来确认待鉴定菌株是酵母菌。
③、接种准备
以装有空白无菌水玻璃管调100％T透光率，用标准比浊管校正，制备特定浓度菌悬液，调为47％T，接种到YT微平板，每孔100ul菌悬液。
④、微平板培养
于26℃培养鉴定板，将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果。
经鉴定，筛选得到的产酯含量最高的菌株为赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)新菌株，其信息包括：产酯能力500mg/100ml左右，该菌株的淀粉化合物实验为阴性，该菌株不产生脲酶，该菌株的碳源同化实验结果如表1所示。
本发明还提供了含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于生产乙酸乙酯酯化酶中的用途。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于生产乙酸乙酯中的用途。
本发明还提供了上述赛道威毕赤酵母新菌株和含有上述赛道威毕赤酵母新菌株的酒曲在用于白酒发酵生香中的用途。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1本发明赛道威毕赤酵母新菌株的筛选
1、取1～2克酒曲(由四川剑南春集团有限责任公司提供)到50ml麦芽汁三角瓶中，于26℃摇床(200rpm/min)培养48小时，再取1ml接种到麦芽汁试管中培养，经过3次的转接培养即可。
麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至5°Bé，加入一定量乳酸，于115℃灭菌20min备用。
2、取上述方法培养的酵母液，按10倍梯度稀释到10-6，取稀释度为10-4、10-5、10-6各0.2ml的溶液，分别涂布于5°Bé麦芽汁培养基平板，26℃培养48小时。
3、挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，然后选择不同类型的酵母菌落分别接于麦芽汁固体斜面培养基上，于26℃培养48小时。
4、取不同类型的酵母菌，分别于26℃麦芽汁培养基培养7天，测定发酵液中酯含量，筛选出高产酯菌株。
产酯培养基：10°Bé麦芽汁1000ml，分装于250ml三角瓶中，每瓶100ml，115℃灭菌20min，灭菌后加入3ml乙醇，分别接入供试菌，26℃培养7天，测定发酵液中酯含量，筛选高产酯菌株。
酯化液酯类物质测定：在酯化液中加入60ml无水乙醇，水200ml，于蒸馏烧瓶中蒸馏酯化液，接馏出液100ml，用气相色谱检测乙酸乙酯含量。
检测结果为：产酯量最高的菌株的产酯量为500mg/100ml。
5、酵母菌鉴定
利用美国Biolog公司全自动微生物鉴定仪，Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。
测试步骤：
①、在BUY培养基(Biolog专用培养基)上，26℃培养待鉴定的酵母菌(即产酯量最高的酵母菌)，培养时间不超过48小时。
②、样品准备及观察特征，利用湿法制备(水片法)或革兰氏染色来确认待鉴定菌株是酵母菌，鉴定结果表明该菌株是酵母菌。
③、接种准备
以装有空白无菌水玻璃管调100％T透光率，用标准比浊管校正，制备特定浓度菌悬液，调为47％T，接种到YT微平板，每孔100ul菌悬液。
④、微平板培养
于26℃培养鉴定板，将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。培养鉴定板24，48或72h，直到得到鉴定结果(如表2所示)。
表2筛选的酵母菌鉴定结果
  英文名   参考中文名   可能性   相似性   位距
  Pichia sydowiorum   赛道威毕赤酵母   100％   0.724   4.19
试验例1本发明赛道威毕赤酵母新菌株的形态特征及生物学特性鉴定
1、用超高放大倍率(1750倍)视频显微镜观察生香能力强的酵母菌株形态特征(结果如图1所示)。
从图1可以看出，该菌株为椭圆形，以出芽方式繁殖。
2、菌株糖发酵实验
将本发明赛道威毕赤酵母新菌株接种到12.5％的豆芽汁中，(分别加20g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖)，置28℃下培养，每天观察产气情况，结果如表3所示。
表3本发明赛道威毕赤酵母新菌株糖发酵实验结果
 糖类   葡萄糖   蔗糖   乳糖
 Pichia sydowiorum(赛道威毕赤酵母)   +   +   +
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
3、菌株产类淀粉化合物测定实验
将本发明赛道威毕赤酵母新菌株接种于类淀粉化合物培养基斜面试管(产生类淀粉化合物培养基：(NH4)2SO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O 0.05％，葡萄糖1％，琼脂2.5％，115℃灭菌20min)，置28℃下培养1～2周，在表面上滴1～2滴路哥氏碘液。凡能产生类淀粉化合物的酵母，其生长的菌落周围便呈现出蓝色，为实验阳性。
实验结果表明：本发明赛道威毕赤酵母新菌株的淀粉化合物实验为阴性。
4、本发明赛道威毕赤酵母新菌株尿素分解实验
将酵母接种于解尿素琼脂斜面培养基上，置28℃下培养，每天观察生长情况，培养4～5天后，斜面上呈淡红色时表明该菌能产生脲酶，分解尿素。
实验结果表明：本发明赛道威毕赤酵母新菌株不产生脲酶。
5、本发明赛道威毕赤酵母新菌株碳源同化实验
试验结果如表1所示。
试验例2产酯能力对比试验
为了有效的对比分析本发明赛道威毕赤酵母新菌株酯化生香能力强弱，发明人在中国工业微生物菌种保藏中心购买了一株生香酵母，购买的生香酵母具体情况如表4所示：
表4购买的生香酵母信息
Figure BDA0000071426970000081
对比分析产酯效果，实验方案如下：
产酯培养基：10°Bé麦芽汁1000ml，分装于250ml三角瓶中，每瓶100ml，115℃灭菌20min，灭菌后加入3ml乙醇，分别接入供试菌，26℃培养7天，测定发酵液中酯含量。
酯化液酯类物质测定：在酯化液中加入60ml无水乙醇，水200ml，于蒸馏烧瓶中蒸馏酯化液，接馏出液100ml，用气相色谱检测乙酸乙酯含量，检测结果如表5所示：
表5产酯含量检测结果
Figure BDA0000071426970000082
从表5可以看出：本发明赛道威毕赤酵母的产酯能力明显优于购买的酵母菌的产酯能力。

Claims (5)

1.赛道威毕赤酵母(Pichia sydowiorum)，保藏号为CGMCC No.4865。
2.含有权利要求1所述的菌株的酒曲。
3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的酒曲在生产乙酸乙酯酯化酶中的用途。
4.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的酒曲在生产乙酸乙酯中的用途。
5.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的酒曲在白酒发酵中的用途。
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