CN108624517B - 耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途 - Google Patents

耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种新的耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途。针对酿酒行业中较高的糖浓度或较高的乙醇浓度会抑制酵母的发酵，需要分离一株耐糖耐乙醇的酵母来提高乙醇产量的问题，本发明提供了一种耐糖耐乙醇酿酒酵母新菌株，该菌株已在CGMCC中心保藏，保藏号为CGMCC No.14069。本发明酿酒酵母能耐受35％的糖和18％的乙醇，是一株耐高浓度糖和高浓度乙醇的产乙醇酵母新菌株，本发明为有效提高高浓度糖发酵的原料利用率，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

Description

耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种新的耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途。
背景技术
目前，酒类产品种类较多，以食物、药材为原料，通过酵母发酵制得的果酒、露酒越来越受到消费者的青睐。我们研究结果表明，较高的糖浓度能保证微生物长期持续发酵，从而使原料中活性物质在发酵过程中充分释放到发酵液中，同时也会生成丰富微量香味物质，大幅提高原料利用率和产品质量。通常，酵母不能耐受较高的糖浓度，若糖浓度过大，酵母发酵会受到严重抑制，有的酵母虽然能耐受高浓度糖发酵生产乙醇，但是当乙醇达到一定浓度，也会受到抑制。因此筛选既能耐高浓度糖，又能耐高浓度乙醇的酵母来提高产品质量就显得尤为重要。目前有文献报道的酵母最高能耐受25％糖浓度，耐受15％乙醇浓度，在耐糖耐乙醇方面还有很大的提升空间。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：酿酒行业中较高的糖浓度或较高的乙醇浓度会抑制酵母的发酵，需要分离一株耐糖耐乙醇的酵母来提高乙醇产量的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种耐高浓度糖和高浓度乙醇的产乙醇酿酒酵母，该酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.14069。保藏时间为2017年04月24日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
其中，上述酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:1酿酒酵母的ITS核苷酸序列
attccccgttacccgttgaaaccatggtaggccactatcctaccatcgaaagttgatagggcagaaatttgaatgaaccatcgccagcacaaggccatgcgattcgaaaagttattatgaatcatcaaagagtccgaagacattgattttttatctaataaatacatctcttccaaagggtcgagattttaagcatgtattagctctagaattaccacagttataccatgtagtaaagaaactatcaaataaacgataactgatttaatgagccattcgcagtttcactgtataaattgcttatacttagacatgcatggcttaatctttgagacaagcatatgatactcatgtttgccgctctgatggtgcggaaaaaactgctccatgaagcaaactgtccgggcaaatcctttcacgctcgggaagctttgtgaaagcccttctttcaacccatctttgcaacgaaaaaaaaaaaaatgaaaaataaaaagaccaaatagtaaatagtaacttacatacattagtaaatggtacactcttacacactatcatcctcatcg。
具体的，该耐高浓度糖和高浓度乙醇的产乙醇酿酒酵母的液态发酵条件为：采用麦芽汁培养基，pH＝6～7；发酵温度为25～30℃，优选为28℃。
具体的，该耐高浓度糖和高浓度乙醇的产乙醇酿酒酵母的糖耐受浓度为≤35％，乙醇耐受浓度为≤18％。
本发明还提供了一种上述耐糖耐乙醇的酿酒酵母在0-35％糖浓度，0-18％乙醇浓度条件下酿酒的用途。
本发明的酿酒酵母菌株的形态学特征为：菌体呈椭圆形，出芽生殖；菌落呈乳白色、表面光滑、湿润、不透明。生物学特征为：能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖或麦芽糖；氮源(硝酸盐)同化阴性；类淀粉化合物形成阴性；产酯阳性；产酸阳性；尿素分解阴性。
本发明的有益效果在于：本发明首次分离鉴定了一株耐糖耐乙醇的产乙醇酿酒酵母，该酿酒酵母能耐受35％的糖和18％的乙醇，是一株耐高浓度糖和高浓度乙醇的新菌株，本发明为有效提高高浓度糖发酵的原料利用率，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。
本发明提供的酿酒酵母于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.14069，生物学分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
附图说明
图1所示为实施例3的酿酒酵母新菌株电镜扫描图；
图2所示为实施例4中的酿酒酵母新菌株与活性干酵母在高糖浓度条件下的发酵结果，正方形为本发明酿酒酵母新菌株，三角形为活性干酵母，黑色代表残糖，白色代表酒度。
具体实施方式
本发明提供了一种耐高浓度糖和高浓度乙醇的产乙醇酿酒酵母，该酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae于2017年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.14069，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明还提供了酿酒酵母在0-35％糖浓度，0-18％乙醇浓度条件下酿酒的用途。
本发明的菌株是从四川剑南春(集团)有限责任公司的酒曲中分离获得。
本发明酿酒酵母是一株耐糖耐乙醇的产乙醇酵母。本发明酿酒酵母能耐受35％的糖和18％的乙醇，是一株耐高浓度糖和高浓度乙醇的新菌株，本发明为有效提高高浓度糖发酵的原料利用率，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。
下面将通过实施例对本发明的酿酒酵母及其用途做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1菌株筛选
1、菌株的初筛
材料：四川剑南春(集团)有限责任公司酒曲。
①麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至6°Bé，加入一定量乳酸，于115℃灭菌20min备用。
②取10g酒曲于装有100mL无菌水并放有玻珠的250mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30min，静置。取上清液10mL到装有90mL麦芽汁的250mL三角瓶中，于揺床，200rpm/min，28℃培养24h。
③取上述方法培养的菌液，按10倍梯度稀释到10-6，取200μL稀释度为10-4、10-5、10-6的稀释液，分别涂布于6°Bé麦芽汁平板培养基，28℃培养48h。
④挑取平板上长出的典型酵母单菌落进行描述性记录，并同时制片镜检，然后选择不同类型的酵母菌株分别接于麦芽汁平板培养基上，于28℃培养48h。
⑤取不同类型的酵母菌株，分别接种于葡萄糖浓度为35％的100mL麦芽汁培养基，28℃培养24h，对菌液10倍梯度稀释，取200μL稀释度为10-3、10-4、10-5的液体，在葡萄糖浓度为35％的麦芽汁平板进行涂布，28℃培养48h，挑选长势较好的菌株。
⑥挑取平板上长出的典型酵母单菌落分别接于乙醇浓度为20％的100mL麦芽汁培养基，28℃培养24h，对菌液10倍梯度稀释，取200μL稀释度为10-3、10-4、10-5的液体，在葡萄糖浓度为35％的麦芽汁平板进行涂布，28℃培养48h，挑选长势较好的菌株。
2、菌株的复筛
将初筛菌株经活化后分别以5％接种量接种于含葡萄糖的液态发酵麦芽汁培养基95mL，葡萄糖最终浓度分别为20％、35％、50％，28℃培养72h，用液相色谱检测发酵液的乙醇浓度，以此筛选耐高浓度糖且产乙醇能力强的菌株，筛选结果如表1。
表1不同糖浓度条件下筛选酵母发酵结果
Figure BDA0001608066600000031
由表1可以看出，JM-2的耐糖能力和产乙醇能力最强。
将初筛菌株经活化后分别以5％接种量接种于含乙醇的6°Bé液态发酵麦芽汁培养基95mL，乙醇最终浓度分别为14％、16％、18％、20％，28℃培养72h，用液相色谱检测发酵液的乙醇浓度，以此筛选耐高浓度乙醇且产乙醇能力强的菌株。
表2不同乙醇浓度条件下筛选酵母发酵结果
Figure BDA0001608066600000041
由表2可以看出，JM-2的耐乙醇能力和产乙醇能力最强。
在复筛的三株菌株中，JM-2菌株耐受能力和产乙醇能力均较强，命名为JNC-008，并对其进行鉴定。
实施例2酵母菌株鉴定
利用美国Biolog公司全自动微生物鉴定仪，Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢情况，配合四唑类显色物质(如TTC、TV)，将反应底物固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化(吸光度)以及由于微生物生长造成的浊度差异(浊度)，与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果，如表3所示。
测试步骤如下：
①在BUY培养基上，26℃培养待鉴定的酵母菌。
②样品准备及观察特征，利用湿法制备(水片法)或革兰氏染色来确认待鉴定菌株是酵母菌。
③接种准备
以装有空白无菌水玻璃管调100％T透光率，用标准比浊管校正，制备特定浓度菌悬液，调为47％T，接种到YT微平板，每孔100μL菌悬液。
④微平板培养
于26℃培养鉴定板，将板放入一个密闭的塑料袋或其他盒中，加入浸湿的纸团或毛巾，用以保持湿度，避免在培养过程中使鉴定板中菌悬液因蒸发而减少影响结果。分别在24、48、72h进行读板，直到得到鉴定结果，如表4所示。
表3本发明酵母菌株的碳源利用及氧化实验结果
Figure BDA0001608066600000042
Figure BDA0001608066600000051
Figure BDA0001608066600000061
注：“+”为阳性，“－”为阴性。
表4本发明酵母菌株鉴定结果
英文名 参考中文名 可能性 相似性 位距
Saccharomyces cerevisiae 酿酒酵母 100％ 0.694 3.969
经鉴定，筛选得到的耐高浓度糖和高浓度乙醇菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)新菌株，其信息包括：耐糖浓度35％，耐乙醇浓度18％，该菌株的碳源利用及氧化实验结果如表3所示。
实施例3本发明酿酒酵母菌株的形态特征及生物学特性鉴定
1、菌落及菌体形态观察
划线接种活化的菌体在麦芽汁平板培养基上，28℃培养，观察菌落形态；用接种环蘸取少许菌体，于场发射环境扫描电子显微镜下观察菌体形态(见图1)。
观察结果如下：菌体呈椭圆形，出芽生殖；菌落呈乳白色、光滑、湿润、不透明。
2、糖类发酵实验
将12.5％的豆芽汁无糖基础液分装于含杜氏管的试管中，0.1MPa灭菌15min，测试的糖类(葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖)分别用无菌水配制成10％的溶液，煮沸15min，待冷却，用无菌移液管吸取一定量的糖液分装于杜氏管内的无糖基础液中，使糖浓度达到2％。将酵母菌种接于发酵管中，28℃培养，每天观察结果。
2、碳源同化实验
采用Biolog鉴定仪进行碳源利用实验，方法同酵母菌株鉴定方法。
3、氮源同化实验
取试管四支，加入5mL酵母无氮基础培养基(葡萄糖2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O0.05％，酵母膏0.02％，琼脂2％)，向其中两支加入硝酸盐，另外两支作为空白对照，115℃灭菌15min，制成斜面，将酵母接入到试管，置于28℃下培养一周，观察酵母生长情况。
4、类淀粉化合物形成的测定
向装有5mL产生类淀粉化合物的液体培养基((NH4)2SO4 0.5％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O 0.05％，CaCl2.2H2O 0.01％，NaCl 0.01％，酵母膏0.1％，葡萄糖3％，115℃灭菌20min)的50mL三角瓶中接入一环酵母，28℃培养三周，然后加入1～2滴路哥氏碘液，观察颜色变化。
5、产酯实验
向装有20mL产酯培养基(葡萄糖1g，10％豆芽汁20mL，115℃灭菌20min)的50mL三角瓶接入酵母，28℃培养5d。
6、产酸实验
将酵母接种于生酸培养基(葡萄糖5％，经灭菌的CaCO3 0.5％，酵母浸出液100mL，琼脂2％，间歇常压灭菌)平板上，28℃培养10d，观察结果。
7、尿素分解实验
将酵母接种于水解尿素斜面培养基(蛋白胨0.1％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.2％，酚红0.0012％，琼脂2％，pH＝6.8，每支试管加入2.7mL上述液体，灭菌后，向每管中加入0.3mL过滤灭菌的20％尿素溶液)，28℃培养，每天观察生长情况。
通过以上实验，筛选的酿酒酵母新菌株生物学特性总结如表5。
表5本发明酿酒酵母新菌株的生物学特性
Figure BDA0001608066600000071
注：“+”为阳性，“－”为阴性。
实施例4高浓度糖条件下发酵产乙醇能力对比试验
为了有效的对比分析本发明酿酒酵母新菌株耐受高浓度糖和发酵产乙醇能力，将该发明菌株同本实验室产乙醇能力较强的活性干酵母进行发酵对比。实验方案如下:
将筛选获得的酿酒酵母新菌株与活性干酵母菌株接种于麦芽汁平板培养基进行活化，然后接于100mL麦芽汁液体培养基进行预培养，分别以5％接种量接种于含葡萄糖的麦芽汁培养基190mL，葡萄糖最终浓度为35％，28℃培养72h，每隔24h取出一定量的发酵液，利用菲林试剂测定发酵液残糖浓度，同时用液相色谱检测发酵液的乙醇浓度。
发酵液乙醇浓度测定：取发酵液2mL，15000rpm/min，离心10min，用0.45μm的针头过滤器过滤上清液，液相色谱检测乙醇含量，检测结果如图2所示：
从图2可以看出：在35％糖浓度条件下，本发明酿酒酵母乙醇产量为17.6％，产乙醇能力明显优于活性干酵母。
序列表
<110> 四川剑南春（集团）有限责任公司
<120> 耐糖耐乙醇酿酒酵母及其用途
<130> A180182K（序）
<141> 2018-03-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attccccgtt acccgttgaa accatggtag gccactatcc taccatcgaa agttgatagg 60
gcagaaattt gaatgaacca tcgccagcac aaggccatgc gattcgaaaa gttattatga 120
atcatcaaag agtccgaaga cattgatttt ttatctaata aatacatctc ttccaaaggg 180
tcgagatttt aagcatgtat tagctctaga attaccacag ttataccatg tagtaaagaa 240
actatcaaat aaacgataac tgatttaatg agccattcgc agtttcactg tataaattgc 300
ttatacttag acatgcatgg cttaatcttt gagacaagca tatgatactc atgtttgccg 360
ctctgatggt gcggaaaaaa ctgctccatg aagcaaactg tccgggcaaa tcctttcacg 420
ctcgggaagc tttgtgaaag cccttctttc aacccatctt tgcaacgaaa aaaaaaaaaa 480
tgaaaaataa aaagaccaaa tagtaaatag taacttacat acattagtaa atggtacact 540
cttacacact atcatcctca tcg 563

Claims (2)

1.耐糖耐乙醇酿酒酵母，其特征在于：该酿酒酵母的保藏编号为CGMCC No.14069；所述酵母的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的耐糖耐乙醇酿酒酵母在0-35%糖浓度，0-18%乙醇浓度条件下酿酒的用途。
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